TW201730330A - 細胞培養基板及其製造方法 - Google Patents

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Kaoru Suda
Keisuke Nimiya
Takahide Mizawa
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Soken Chemical & Engineering Co Ltd
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Abstract

提供一種細胞培養基板及其製造方法。可以用容易得到的材料簡便地製作，且可以以高的存活率培養均勻細胞塊的複合圖案培養基板。根據本發明的幾個方式，提供一種細胞培養基板，該細胞培養基板具有粘接性部位和非粘接性部位，所述粘接性部位和所述非粘接性部位具有凹凸形狀，所述非粘接性部位對純水的接觸角比所述粘接性部位大。

Description

細胞培養基板及其製造方法
本發明涉及細胞培養基板及其製造方法。
通常在醫藥品開發的現場對培養成三維形狀的細胞塊(spheroid)投入藥劑並測量對該藥物的代謝能力的篩選檢查已是眾所周知。為了提高該代謝檢查的效率，近年來希望採用能簡便地準備的培養容器，以高的存活率培養均勻的細胞塊。在細胞塊培養用容器中，像專利文獻1中公開的那樣，作為培養基板，使用具有對於細胞的粘接區域和阻擋區域的基板等。
【先行技術文獻】
專利文獻
專利文獻1：日本特開2007-269973號公報
雖然能培養比較均勻的細胞塊，但是，具有能用於粘接區域或者阻擋區域的性質的樹脂是特殊的，受限的(專利文獻1)。合成這樣的特殊的樹脂是 困難的，需要的時間長，成本高。
本發明的幾個方式正是鑒於這樣的情況而提出的，目的在於提供可以用容易得到的材料簡便地製作，而且可以以高的存活率培養均勻細胞塊的細胞培養基板。
根據本發明的幾個方式，提供一種細胞培養基板，該細胞培養基板具有粘接性部位和非粘接性部位，所述粘接性部位和所述非粘接性部位具有凹凸形狀，所述非粘接性部位對純水的接觸角比所述粘接性部位大。
本發明的發明人發現，即使在使用了容易得到的材料的情況下，如果使用包括具有凹凸形狀的粘接性部位和具有與粘接性部位不同的凹凸形狀的疏水性高的非粘接性部位的細胞培養基板，也可以以高的存活率培養均勻細胞塊，從而完成了本發明。
以下例示本發明的各種實施方式。以下示出的實施方式可以相互組合。
優選地，所述粘接性部位的凹凸形狀的間距P1比所述非粘接性部位的凹凸形狀的間距P2大。
優選地，所述間距P1和所述間距P2的比P1/P2為2以上。
優選地，所述粘接性部位的至少一部分被間隔部隔開；所述非粘接性部位形成在所述間隔部上。
優選地，所述非粘接性部位具有多個柱狀凸部；形成所述非粘接性部位的柱狀凸部的間距是50~2000nm；所述非粘接性部位的柱狀凸部的上表面的面積是1600nm2~4μm2；相鄰的兩個柱狀凸部之間的間隙G2在10~1960nm的範圍內。
優選地，所述粘接性部位和所述非粘接性部位由同樣的材料構成。
根據本發明的另一觀點，提供一種所述細胞培養基板的製造方法，包括：對塗敷在基材上的光硬化性樹脂組成物照射啟動能量射線而使其硬化，形成所述粘接性部位和所述非粘接性部位的凹凸形狀的步骤。
優選地，使用模具通過納米印記法形成所述粘接性部位和所述非粘接性部位的凹凸形狀。
1‧‧‧細胞培養基板
3‧‧‧粘接性部位
5‧‧‧非粘接性部位
19‧‧‧間隔部
29‧‧‧啟動能量射線
P1‧‧‧粘接性部位的凹凸形狀的間距
P2‧‧‧非粘接性部位的凹凸形狀的間距
G2‧‧‧相鄰的兩個柱狀凸部之間的間隙
圖1示出本發明的一實施方式的細胞培養基板1，(a)是俯視圖，(b)是A-A剖視圖，(c)是示出另一實施方式的凹凸形狀與(b)的情況相反轉的圖案的剖視圖。
圖2是示出本發明的一實施方式的粘接性部位3的圖1(b)中的區域X的放大圖，(a)是俯視圖，(b)是B-B剖視圖。
圖3是示出本發明的一實施方式的非粘接性部位5的圖1(b)中的區域Y的放大圖，(a)是俯視圖，(b)是C-C剖視圖。
圖4是本發明的一實施方式的細胞培養基板1的剖視圖，(a)示出有間隔 部19時的例子，(b)示出沒有間隔部時的例子。
圖5示出設置了遮光部21的透明基材23，(a)是俯視圖，(b)是D-D剖視圖。(c)~(e)示出遮光圖案3的形成方法的其他例子。
圖6是示出本發明的第1被轉印樹脂層形成步骤的剖視圖。
圖7是示出本發明的粘接性部位樹脂層形成步骤的剖視圖。
圖8是示出本發明的複合樹脂層形成步骤的剖視圖。
圖9是樣品1~4的SEM圖像(a)~(d)。
以下，參照圖1~圖4具體地說明本發明的優選的實施方式。
1、細胞培養基板
像圖1(b)所示的那樣，本發明的一實施方式的細胞培養基板1包括基材7和在基材7的至少一面上的樹脂層9，樹脂層9具有粘接性部位3和非粘接性部位5。圖1(b)所示的粘接性部位3和非粘接性部位5的凹凸形狀可以是僅僅把粘接性部位3和非粘接性部位5中的某一個的凹凸反轉得到的形狀，也可以是進一步把兩者的凹凸都反轉得到的像圖1(c)所示的那樣的形狀。
優選地，以包圍粘接性部位3的方式配置非粘接性部位5，分成粘接性部位3的區域和非粘接性部位5的區域。但是，不一定非要沒有間斷地包圍，也可以部分斷開。
粘接性部位3的區域的形狀不做特別限制，可以舉出圓形、多角形等，例如可以考慮形成像圖1(a)所示那樣的正方形的區域的實施方式。
另外，細胞培養基板1也可以像圖4(a)所示的那樣具有把粘接性部位的至少一部分隔開的間隔部19。另外，也可以像圖4(b)所示的那樣沒有間隔部19。為了使細胞在更換培養基時等時不從基材剝離，優選具有間隔部19。
<基材7>
基材7的材質不做特別限定，但是優選是樹脂基材、石英基材等的透明基材，從柔性的觀點出發樹脂基材是更加優選的。作為構成樹脂基材的樹脂，例如可以包含從由聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚酯、聚烯烴、聚醯亞胺、聚碸、聚醚碸，環狀聚烯烴和聚對苯二甲酸丁二醇酯構成的組中選擇的一種。另外，基材7優選是有柔性的膜狀，其厚度優選在25~500μm的範圍內。
<樹脂層9>
構成樹脂層9的樹脂不做特別限定，但是優選包含例如丙烯酸樹脂、甲基丙烯酸樹脂、苯乙烯樹脂、烯烴樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚酯樹脂、環氧樹脂、有機矽樹脂等比較容易得到、合成的廉價樹脂。粘接性部位3和非粘接性部位5的樹脂材料的種類也可以不同，但是，在種類相同時，更容易製作，效率高，因而是優選的。
<粘接性部位3>
像圖2所示的那樣，粘接性部位3具有由多個粘接性凸部11和粘接性凹部13構成的凹凸形狀。另外，也可以是把凸部和凹部反轉得到的形狀。
<粘接性凸部11和粘接性凹部13>
粘接性凸部11的形狀不做特別限制，可以舉出柱狀(圓柱狀、多角柱狀等)、錐臺、微透鏡等。關於粘接性凹部13的形狀，也不做特別限制，可以舉出對柱狀(圓柱狀、多角柱狀等)、錐臺、微透鏡狀等的形狀挖空得到的孔等。
形成粘接性凸部11或粘接性凹部13的間距P1，只要在具有對作為對象的細胞的粘接性的範圍內即可，例如為2~50μm，優選為5~20μm，更優選為7~15μm。如果間距P1太小，則細胞難以粘接。另外，如果間距P1太大，則細胞難以形成細胞塊。具體地，間距P1例如為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50μm，也可以是在此例示的數值的某兩個之間的範圍內。另外，由粘接性凸部11和粘接性凹部13構成的凹凸形狀既可以是規則的，也可以是不規則的，但是，從工作效率的觀點出發優選是規則的。在凹凸形狀規則地形成的情況下，把構成凹凸形狀的大量的凸部或凹部的前端間的距離作為“間距”，在凹凸形狀不規則地形成的情況下，把構成凹凸形狀的大量的凸部或凹部的頂端間的距離的平均值作為“間距”。
粘接性凸部11的高度H1不做特別限制，例如為1~20μm，優選為1~10μm，更優選為1~5μm。這是因為，如果太低，則細胞難以形成細胞塊。另外，如果太高，則粘接性凸部11容易倒塌。
所述粘接性部位的典型例子具有多個柱狀凸部。所述粘接性部位的柱狀凸部的上表面的面積只要在具有對作為對象的細胞的粘接性的範圍內即可，例如為1~2400μm2，優選為16~360μm2，更優選為36~196μm2。相鄰的兩個柱狀凸部之間的間隙G1只要是在具有對作為對象的細胞的粘接性的範圍內即可，例如為1~49μm，優選為4~19μm，更優選為6~14μm。
<非粘接性部位5>
像圖3所示的那樣，粘接性部位3具有由多個非粘接性凸部15和非粘接性凹部17構成的凹凸形狀。另外，也可以是把凸部和凹部反轉得到的形狀。
另外，非粘接性部位5對純水的接觸角不做特別限制，但是比粘接性部位3大。如果比粘接性部位3大，則細胞難以粘接到非粘接性部位5上，容易形成細胞塊。非粘接性部位5對純水的接觸角例如為90~180°，優選為105~180°，更優選為110~180°，最優選為115~180°。
<非粘接性凸部15和非粘接性凹部17>
非粘接性凸部15的形狀不做特別限制，可以舉出柱狀(圓柱狀、多角柱狀等)、錐臺、微透鏡等。關於非粘接性凹部17的形狀也不做特別限制，可 以舉出對柱狀(圓柱狀、多角柱狀等)、錐臺、微透鏡狀等的形狀挖空得到的孔等。
形成非粘接性凸部15或非粘接性凹部17的間距P2為50~2000nm，優選為100~1000nm，更優選為150~800nm。間距P2太小時，細胞不能識別凹凸，粘接性與非粘接性的識別消失。另外，如果間距P2太大，則細胞容易粘接。具體地，間距P2例如為50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000nm，也可以是在此例示的數值的某兩個之間的範圍內。另外，由非粘接性凸部15和非粘接性凹部17構成的凹凸形狀既可以是規則的，也可以是不規則的，但是，從工作效率的觀點出發優選是規則的。在凹凸形狀規則地形成時，把構成凹凸形狀的大量的凸部或凹部的頂端間的距離作為“間距”，在凹凸形狀不規則地形成時，把構成凹凸形狀的大量的凸部或凹部的頂端間的距離的平均值作為“間距”。
所述粘接性部位3的凹凸形狀的所述間距P1比所述非粘接性部位5的凹凸形狀的所述間距P2大。間距大，具有水的接觸角變小且對細胞的粘接性升高的傾向；而間距小，具有水的接觸角變大且對細胞的粘接性降低的傾向。因此，容易通過由間距小的凹凸形狀的部位包圍間距大的凹凸形狀的部位來製作細胞塊。所述間距P1和所述間距P2的比P1/P2優選為2以上，更優選為5以上，還更優選為10以上。如果P1/P2大，則有粘接性的差變大的傾向，從 細胞容易凝聚的角度看可以有效地培養細胞塊。P1/P2的上限不做特別規定，例如為200。
非粘接性凸部15的高度H2不做特別限制，例如為50~2000nm。高度H2優選為100~1000nm，更優選為150~800nm。這是因為，如果太低，則細胞容易粘接。另外，如果太高，則非粘接性凸部15容易倒塌。
所述非粘接性部位的典型例子具有多個柱狀凸部，更具體地說，具有多個圓柱狀的凸部。所述非粘接性部位的柱狀凸部的上表面的面積只要在對作為對象的細胞的粘接性低的範圍內即可，例如為1600nm2~4μm2。該面積優選為810nm2~1μm2，更優選為0.02~0.6μm2。相鄰的兩個柱狀凸部之間的間隙G2只要在對作為對象的細胞的粘接性低的範圍內即可，例如為10~1960nm。優選為60~960nm。更優選為110~760nm。
也可以以覆蓋非粘接性凸部15和非粘接性凹部17的方式設置含氟原子層。含氟原子層只要含有氟原子即可，對其厚度和構成沒有限定。通過設置含氟原子層，細胞變得難以粘接。含氟原子層優選包括有含氟基。含氟基的一個例子是全氟烴基，更具體地，是全氟烴基矽烷基。全氟烴基的碳原子數例如為1~10，更具體地，例如為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，也可以是在此例示的數值的某兩個之間的範圍內。優選地，含氟基與非粘接性凸部15和非粘接性凹部17或無機膜化學鍵合。通常，無機膜與樹脂層9的密接性高，含氟基容易對無機膜形成堅固的化學鍵，所以通過在非粘接性凸部15和非粘 接性凹部17與含氟原子層之間設置無機膜，把含氟原子層堅固地保持在非粘接性凸部15和非粘接性凹部17上。作為無機膜，可以舉出無機氧化膜、無機氮化膜、無機氮氧化膜等。作為構成無機膜的無機元素，可以舉出矽和鋁。無機膜例如是二氧化矽膜和氧化鋁膜。無機膜的厚度不做特別限定，例如為1~20nm。
含氟原子層，作為一個例子，可以通過在非粘接性凸部15和非粘接性凹部17上形成無機膜，使無機膜和含氟矽烷偶聯劑反應來形成。含氟矽烷偶聯劑是例如全氟烴基三烷氧基(甲氧基、乙氧基等)矽烷。如果不形成無機膜，即使使含氟矽烷偶聯劑對非粘接性凸部15和非粘接性凹部17作用也難以形成堅固的化學鍵，所以優選預先在非粘接性凸部15和非粘接性凹部17上形成無機膜。作為含氟矽烷偶聯劑的例子，可以舉出日本大金工業公司(Daikin Industries,Ltd.)製造的OPTOOLDSX。
<粘接性部位3的區域>
粘接性部位3的區域的面積只要根據培養的細胞的種類和細胞塊的使用目的適當地調整即可，沒有特別限制，例如為25~1000000μm2，優選為100~250000μm2，更優選為2500~40000μm2。在粘接性部位3的區域的形狀為正方形時，邊長為5~1000μm，優選為10~500μm，更優選為50~200μm。
<非粘接性部位5的區域>
如果與粘接性部位的區域相比非粘接性部位5的區域太大，則細胞移動到粘接性部位3的區域有困難，所以難以形成細胞塊。因而，非粘接性部位5的區域相對於粘接性部位3的區域和非粘接性部位5的區域的面積之和的比率例如優選為80%以下，更優選為50%以下，還更優選為25%以下。
<間隔部19>
像圖4(a)所示的那樣，在具有把粘接性部位3的至少一部分隔開的間隔部19時，優選地，間隔部19以包圍粘接性部位3的方式配置，形成粘接性部位3的區域。但是，不一定非要沒有間斷地包圍，也可以部分斷開。另外，粘接性部位3的區域的形狀不做特別限制，可以舉出圓形或四角形等的多角形等。優選地，非粘接性部位5形成在間隔部上。非粘接性部位5形成在間隔部的一部分上即可，優選地，至少以覆蓋間隔部19的上表面的大部分的方式形成。另外，非粘接性部位5也可以覆蓋間隔部19的整個表面。
間隔部19的高度H3不做特別限制，例如為5~100μm，優選為10~50μm，更優選為15~25μm。如果高度H3太低，則細胞容易因水流等而剝離。而如果高度H3太高，則供氧不能充分地進行，細胞的存活率降低。另外，像圖4(a)所示的那樣，高度H3是從粘接性凸部11的上端到包含非粘接性部位的間隔部的上端的高度。
2、細胞培養基板的製造方法
下面，用圖5~圖8說明細胞培養基板的製造方法。
本發明的一個實施方式的具有間隔部的細胞培養基板的製造方法包括非粘接性部位轉印用樹脂層形成步骤、粘接性部位樹脂層形成步骤和複合樹脂層形成步骤。
以下，更詳細地說明各步骤。
(1)非粘接性部位轉印用樹脂層形成步骤
(1-1)第1被轉印樹脂層形成步骤
首先，在像圖5(a)所示那樣的有遮光部21的透明基材23上，像圖6(a)所示的那樣，塗敷第1光硬化性樹脂組成物而形成第1被轉印樹脂層25。
<透明基材>
透明基材23由樹脂基材、石英基材、有機矽基材等的透明材料形成，對其材質不做特別限定，但是，優選是樹脂基材。這是因為，通過使用樹脂基材，可以利用本發明的方法得到期望的尺寸(大面積也可以)的細胞培養基板。作為構成樹脂基材的樹脂，可以包含例如從由聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚酯、聚烯烴、聚醯亞胺、聚碸、聚醚碸、環狀聚烯烴和聚對苯二甲酸丁二醇酯構成的組中選擇的一種。另外，透明基材23優選具有可撓性，在使用樹脂基材時，也可以把相同種類或不同種類的基材層疊，或者在樹脂基材上呈膜狀地層疊樹脂組成物。樹脂基材的厚度優選在25~500μm的範圍內。
設置在透明基材23上的遮光部21是在複合形狀形成步骤中用作掩模(mask)的圖案，像圖8(b)~(e)所示的那樣，在複合樹脂層45上形成與遮光部21相對應的粘接性部位3、間隔部19、間隔部上的非粘接性部位5。在圖8(b)所示的啟動能量射線照射步骤中，啟動能量射線29被遮光部21遮住的區域成為粘接性部位3。“啟動能量射線”是UV光、可見光、電子射線等的可以使光硬化性樹脂組成物硬化的能量射線的總稱。遮光部21的形狀不做特別限定，除了像圖5(a)所示那樣的正方形以外，也可以用五角形和六角形等的多角形、圓形等，與所希望的粘接性部位3的區域對應。
可以通過在利用濺射使遮光材料(例如鉻等的金屬材料)附著在透明基材23上之後進行構圖，或者用噴墨印刷或絲網印刷等的方法印刷遮光材料的圖案，形成遮光部21。遮光部21可以像圖5(b)~(c)所示的那樣，形成在透明基材23的塗敷第1光硬化性樹脂組成物的面23a上，也可以像圖5(d)所示的那樣，形成在透明基材23的背面23b上。另外，遮光部21可以像圖5(b)所示的那樣，形成為與透明基材23在同一個面上，也可以像圖5(c)所示的那樣在透明基材23的平坦面上形成，也可以像圖5(e)所示的那樣被埋設到透明基材23的內部。
<第1光硬化性樹脂組成物>
構成第1被轉印樹脂層25的第1光硬化性樹脂組成物含有單體和光引發劑，具有通過照射啟動能量射線而硬化的性質。
作為單體，可以舉出用來形成丙烯酸樹脂、甲基丙烯酸樹脂、苯乙烯樹脂、烯烴樹脂、聚碳酸酯樹脂、聚酯樹脂、環氧樹脂、有機矽樹脂等的光聚合性的單體，光聚合性的丙烯酸系單體和/或甲基丙烯酸系單體是優選的。
光引發劑是為了促進單體的聚合而添加的成分，相對於100質量份所述單體，含有0.1質量份以上的光引發劑是優選的。光引發劑的含量的上限不做特別規定，可以為例如相對於100質量份所述單體含有20質量份光引發劑。
本發明的第1光硬化性樹脂組成物能夠以不影響到第1光硬化性樹脂組成物的性質的範圍包含溶劑、聚合禁止劑、鏈轉移劑、防氧化劑、光敏化劑、填充劑、均化劑等的成分。
可以通過用公知的方法混合所述成分來製造第1光硬化性樹脂組成物。可以用旋塗、噴塗、棒刮塗、滴塗、模塗敷和縫塗敷等方法在透明基材23上塗敷第1光硬化性樹脂組成物而形成第1被轉印樹脂層25。
第1被轉印樹脂層25通常是透明樹脂層，其厚度為100nm~1mm，優選為5~500μm。如果形成這樣的厚度，容易進行壓印加工，而且可以形成非粘接性部位的反轉圖案。
(1-2)轉印和硬化步骤
然後，像圖6(a)~(c)所示的那樣，通過在把第1模27的第1圖案28按壓賦予第1被轉印樹脂層25的狀態下，通過第1模27向第1被轉印樹脂層25照射啟動能量射線29而形成轉印了第1圖案28的非粘接性部位轉印用樹脂層31。
第1模27具有第1圖案28。在本實施方式中，第1圖案28是所希望的非粘接性部位5的圖案。
第1模27用樹脂基材、石英基材、有機矽基材等的透明材料形成，可以用與透明基材23同樣的材質形成。
把第1模27按壓賦予第1被轉印樹脂層25的壓力只要是可以把第1圖案28的形狀轉印到第1被轉印樹脂層25上的壓力即可。
照射到第1被轉印樹脂層25的啟動能量射線29只要是以把第1被轉印樹脂層25充分硬化的程度的累計光量照射即可，累計光量例如為100~10000mJ/cm2。通過照射啟動能量射線29，第1被轉印樹脂層25被硬化，像圖6(c)所示的那樣，形成了反轉第1圖案28得到的第1反轉圖案32即所希望的非粘接性部位5的反轉圖案的非粘接性部位轉印用樹脂層31被形成。
(2)粘接性部位樹脂層形成步骤
(2-1)第2被轉印樹脂層形成步骤
首先，像圖7(a)所示的那樣，在基材7上塗敷第2光硬化性樹脂組成物而形成第2被轉印樹脂層33。
所述的第1光硬化性樹脂組成物的說明，只要不違反其主旨，也適合第2光硬化性樹脂組成物。第2光硬化性樹脂組成物的種類與第1光硬化性樹脂組成物既可以相同也可以不同。塗敷第2光硬化性樹脂組成物得到的第2被轉印樹脂層33通常是透明樹脂層，其厚度通常為1μm~1mm，優選為50μm~500μm。如果形成為這樣的厚度，容易進行壓印加工，而且可以形成粘接性部位。
(2-2)轉印和硬化步骤
然後，像圖7(b)~(d)所示的那樣，通過在把第2模35的第2圖案36按壓賦予第2被轉印樹脂層33的狀態下，向第2被轉印樹脂層33照射啟動能量射線而使第2被轉印樹脂層33硬化，從而形成粘接性部位樹脂層39。
第2模35具有第2圖案36。在本實施方式中，第2圖案36是所希望的粘接性部位3的反轉圖案。
在基材7為透明的情況下，也可以從基材側照射啟動能量射線29，第2模35也可以用樹脂基材、石英基材、有機矽基材等透明材料或金屬材料形成。
把第2模35按壓賦予第2被轉印樹脂層33的壓力只要是可以把第2圖案36的形狀轉印到第2被轉印樹脂層33上的壓力即可。
照射到第2被轉印樹脂層33的啟動能量射線29只要是以把第2被轉印樹脂層33充分硬化的程度的累計光量照射即可，累計光量例如為100~10000mJ/cm2。通過照射啟動能量射線29，第2被轉印樹脂層33被硬化，像圖7(d)所示的那樣，形成了第2圖案36被反轉的第2反轉圖案40即所希望的非粘接性部位5的粘接性部位樹脂層39被形成。
(3)複合樹脂層形成步骤
(3-1)第3被轉印樹脂層形成步骤
首先，像圖8(a)所示的那樣，在粘接性部位樹脂層39上塗敷第3光硬化性樹脂組成物而形成第3被轉印樹脂層41。
所述的第1光硬化性樹脂組成物的說明只要不違反其主旨也適合於第3光硬化性樹脂組成物。第3光硬化性樹脂組成物的種類與第1光硬化性樹脂組成物可以相同也可以不同，與第2光硬化性樹脂組成物可以相同也可以不同。塗敷第3光硬化性樹脂組成物而得到的第3被轉印樹脂層41通常是透明樹脂層，其厚度為10μm~1mm，優選為50μm~500μm。如果形成為這樣的厚度，則容易進行壓印加工，而且可以形成間隔部和非粘接性部位。
(3-2)轉印和硬化步骤
然後，像圖8(b)~(e)所示的那樣，通過把非粘接性部位轉印用樹脂層31作為模具按壓賦予第3被轉印樹脂層41的狀態下，向第3被轉印樹脂層41照射啟動能量射線，使第3被轉印樹脂層41硬化，從而形成複合樹脂層45。
把非粘接性部位轉印用樹脂層31按壓賦予第3被轉印樹脂層41的壓力只要是可以把非粘接性部位轉印用樹脂層31的形狀轉印到第3被轉印樹脂層41上的壓力即可。
從非粘接性部位轉印用樹脂層31向第3被轉印樹脂層41照射啟動能量射線29。
照射到第3被轉印樹脂層41的啟動能量射線29只要是以第3被轉印樹脂層41充分硬化的程度的累計光量照射即可，累計光量例如為100~10000mJ/cm2。通過照射啟動能量射線29，在沒被遮光部21遮住的區域，被埋入到粘接性部位樹脂層39的間隙的第3光硬化性樹脂組成物被硬化，並且被轉印了非粘接性部位轉印用樹脂層31的反轉圖案的第3被轉印樹脂層41被硬化而形成複合樹脂層45。在該步骤中，在第3光硬化性樹脂組成物被硬化的區域，形成圖8(e)所示的間隔部19和間隔部19上的非粘接性部位5。另一方面，在啟動能量射線29被遮光部21遮住而第3光硬化性樹脂組成物未被硬化的區域，粘接性部位3原樣保留。
然後，像圖8(d)~(e)所示的那樣，去掉非粘接性部位轉印用樹脂層31，用 溶劑去除殘留在粘接性部位3上的未硬化的第3光硬化性樹脂組成物42，得到圖8(e)所示的結構，從而完成細胞培養基板的製造。
如果使用在所述中形成的複合樹脂層45，則可以製作具有複合樹脂層45的反轉圖案的模具，如果使用它，就可以一次地製成具有與複合樹脂層45同樣的圖案的細胞培養基板。
另外，在沒有間隔部的情況下，通過使用具有粘接性部位3和非粘接性部位5的反轉圖案的模具，可以製造像圖4(b)所示那樣的細胞培養基板。
(實施例)
1、細胞培養基板樣品的製作
下面說明在細胞培養和藥物代謝評價中使用的細胞培養基板樣品的製作。
<光硬化性樹脂組成物的配製>
首先，按以下所示的比例配合光聚合性單體和光引發劑來配製光硬化性樹脂組成物。
光聚合性單體：
乙氧基化三羥甲基丙烷(trimethylolpropane-ethylene oxide)改性的三丙烯酸酯(大阪有機化學工業公司製造，品名：Viscoat #360)，50質量份
乙氧基化雙酚A(bisphenol A ethylene oxide)改性的丙烯酸酯(大阪有機化學工業公司製造，品名：Viscoat #700HV)，20質量份
三丙二醇二丙烯酸酯(tripropylene glycol diacrylate)(大阪有機化學工業公司製造，品名：Viscoat #310HP)，30質量份
光引發劑：
1-羥基環己基苯基甲酮(1-hydroxycyclohexyl phenyl ketone)(BASF日本公司製造，品名：Irgacure 184)，5質量份
<樣品的製作>
【樣品1】(實施例1)
(非粘接性部位轉印用樹脂層形成)
對像圖5所示那樣的將遮光部21設置為多個正方形的PET基材47，以棒刮塗方式塗敷所述配製的光硬化性樹脂組成物以形成10μm的厚度，以把所塗敷的樹脂面按壓到模具上的方式從上方用輥子對圓柱狀的納米柱(間距：150nm，高度：250nm，直徑：100nm)模具進行了層疊。然後，從模具側以累計光量500mJ/cm2進行UV照射，使光硬化性樹脂組成物硬化。把模具和樹脂硬化了的PET基材剝離，製成作為所述模具的反轉形狀的納米孔轉印樹脂層。
(粘接性部位樹脂層形成)
對PET基材，以棒刮塗方式塗敷所述配製的光硬化性樹脂組成物以形成10μm的厚度，以把所塗敷的樹脂面按壓到模具上的方式，從上方用輥子對六角柱狀(蜂巢)的納米孔(間距：12μm，深度：5μm，平行的兩邊的寬度：17μm)模具進行了層疊。然後，從PET基材側以累計光量500mJ/cm2進行UV照射，使光硬化性樹脂組成物硬化。把模具和樹脂硬化了的PET基材剝離，製成作為所述模具的反轉形狀的納米柱轉印樹脂層。
(複合樹脂層形成)
對納米柱轉印樹脂層，以棒刮塗方式塗敷所述配製的光硬化性樹脂組成物以形成10μm的厚度，作為模具使用納米孔轉印樹脂層，以把所塗敷的樹脂面按壓到納米孔轉印樹脂層上的方式，從上方用輥子對納米孔轉印樹脂層進行了層疊。然後，從納米柱轉印樹脂層以累計光量500mJ/cm2進行UV照射，使光硬化性樹脂組成物硬化。剝離納米孔轉印樹脂層和納米柱轉印樹脂層，用異丙醇去除殘留在納米柱轉印樹脂層上的未硬化的光硬化性樹脂組成物，製成細胞培養基板。
【樣品2】(比較例1)
在樣品1的複合樹脂層形成步骤，除了作為模具不使用納米柱轉印樹脂層，而是使用具有同樣的格子狀的遮光部21但是沒有凹凸形狀的平面的模具以外，以同樣的方式製成細胞培養基板。
【樣品3】(比較例2)
僅僅通過樣品1的粘接性部位樹脂層形成步骤製成細胞培養基板。
【樣品4】(比較例3)
對PET基材，以棒刮塗方式塗敷所述配製的光硬化性樹脂組成物以形成10μm的厚度，從PET基材側以累計光量500mJ/cm2進行UV照射，使光硬化性樹脂組成物硬化。
<樣品1的各部分的測量>
切除樣品1的一部分，用掃描電子顯微鏡(日本電子公司製造，型號：JSM-7800F)觀察形狀，用該顯微鏡附帶的軟體(PC-SMM)測量了各部分。將關於粘接性部位和非粘接性部位的結果示於表1，將關於間隔部的結果示於表2。另外，在樣品1中間隔部的上表面的面積與非粘接部位的區域的面積大體相等。
<水接觸角測量>
對得到的樣品1，用接觸角測量設備(dataphysics公司製造)，在25℃下，向該樣品1的粘接部和非粘接部的表面滴下0.5μl離子交換水，測量了水的接觸角(水接觸角)，分別為100°、115°。
2、細胞培養和藥物代謝
說明使用本發明的細胞培養基板的細胞培養和藥物代謝的結果。
<細胞培養方法>
在6孔盤(Thermo Fisher Scientific Inc製造)的底面上配置細胞培養基板，在70%乙醇中浸泡1小时。然後，用pH7.4的PBS(下同)清洗3次，乾燥。
然後，在DMEM(Thermo Fisher Scientific Inc製造)培養基中懸浮大鼠肝細胞，以1×105個細胞/孔，在孔盤上接種之後，在37℃、5% CO2條件下培養 了14天。在培養次日進行培養基更換，此後隔日進行。
<凝聚形狀>
為了調查細胞塊的形成，用SEM觀察了接種後14天後的凝聚形狀。將使用樣品1~4時的SEM圖像示於圖9(a)~(d)。
在樣品1中，在格子內形成凝聚為球狀的各凝聚體的大小接近且均勻的細胞塊。在樣品2中，雖然有某種程度的凝聚，但是跨著格子，說不上是球狀，而且大小也說不上均勻。不知道是不是因為與樣品1不同，在格子上沒有非粘接性部位導致的。在樣品3中，雖然發生了凝聚，但是，僅僅是多少帶著一點圓度，大小也各自大不相同。推測這是因為沒被非粘接性部位包圍，而且也沒有間隔部。在樣品4中，僅僅是薄薄地展開。
<藥物代謝評價>
在接種後1、7、14天後進行了藥物代謝評價。在1、7、14天後把培養基更換成誘導培養基(3-MC 0.333mM)，培育24小時。然後，更換成加溫到37℃的反應培養基(PBS 50ml，雙香豆素25μM，羧苯磺丙胺2mM，乙氧基試鹵靈20μM)，培育60分鐘後，用HCl把pH調整成7.4。向96孔的盤加入上清200μl、空白(未反應的反應培養基)200μl，用螢光盤讀數器測量了螢光量【530/590】。
將樣品1~4的藥物代謝評價示於表3。
在樣品1中，藥物代謝量多，推測是形成了細胞塊而且供氧充分地進行。在樣品2中，藥物代謝量比較多，但是比樣品1差。在樣品3中，藥物代謝量比樣品1少了3~4成左右。在樣品4中，藥物代謝量大大降低。

Claims (8)

  1. 一種細胞培養基板，具有粘接性部位和非粘接性部位，其中，所述粘接性部位和所述非粘接性部位具有凹凸形狀，所述非粘接性部位對純水的接觸角比所述粘接性部位大。
  2. 根據請求項1所述的細胞培養基板，其中，所述粘接性部位的凹凸形狀的間距P1比所述非粘接性部位的凹凸形狀的間距P2大。
  3. 根據請求項2所述的細胞培養基板，其中，所述間距P1與所述間距P2的比P1/P2為2以上。
  4. 根據請求項1~3中任一項所述的細胞培養基板，其中，所述粘接性部位的至少一部分被間隔部隔開；所述非粘接性部位形成在所述間隔部上。
  5. 根據請求項2~4中任一項所述的細胞培養基板，其中，所述非粘接性部位具有多個柱狀凸部；形成所述非粘接性部位的柱狀凸部的間距是50~2000nm；所述非粘接性部位的柱狀凸部的上表面面積是1600nm2~4μm2；相鄰的兩個柱狀凸部之間的間隙G2在10~1960nm的範圍內。
  6. 根據請求項1~5中任一項所述的細胞培養基板，其中，所述粘接性部位和所述非粘接性部位由同樣的材料構成。
  7. 根據請求項1~6中任一項所述的細胞培養基板的製造方法，其中，該製造方法包括以下步骤：對塗敷在基材上的光硬化性樹脂組成物照射啟動能量射線而使其硬化，形成 所述粘接性部位和所述非粘接性部位的凹凸形狀。
  8. 根據請求項7所述的細胞培養基板的製造方法，其中，使用模具通過納米壓印法形成所述粘接性部位和所述非粘接性部位的凹凸形狀。
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