WO2007097120A1 - 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法 - Google Patents

細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007097120A1
WO2007097120A1 PCT/JP2007/000106 JP2007000106W WO2007097120A1 WO 2007097120 A1 WO2007097120 A1 WO 2007097120A1 JP 2007000106 W JP2007000106 W JP 2007000106W WO 2007097120 A1 WO2007097120 A1 WO 2007097120A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
cells
less
producing
container
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/000106
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Fujiko Ozawa
Takahisa Kusuura
Jun Shimada
Satoru Tanaka
Original Assignee
Scivax Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scivax Corporation filed Critical Scivax Corporation
Priority to US12/280,125 priority Critical patent/US7727759B2/en
Priority to KR1020087022920A priority patent/KR101362293B1/ko
Priority to JP2008501635A priority patent/JP4159103B2/ja
Priority to EP07713488.0A priority patent/EP1988152B1/en
Publication of WO2007097120A1 publication Critical patent/WO2007097120A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • Cell culture structure cell culture container, spheroid structure, spheroid container, and production method thereof
  • the present invention relates to a cell culture structure, a cell culture container, a structure with spheroids, a container with spheroids, and a method for producing them.
  • spheres which are three-dimensional tissues having functions equivalent to those in vivo
  • a plurality of single cells are seeded on a funnel whose bottom surface is a funnel, and the single cells are aggregated and divided on the bottom surface to cultivate the spheroid (Patent Document 1) or a predetermined polymer mixture.
  • Patent Document 1 There is a type in which spheroids are cultured on a honeycomb structure obtained by condensing water on the cast liquid surface and evaporating minute water droplets generated by the dew condensation (Patent Document 2).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6_3 2 7 4 6 2 (paragraph number 0 0 1 6, FIG. 1)
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 2 _ 3 3 5 9 4 9 (Page 3, Fig. 1)
  • the former does not have a scaffold of spheroids produced by culturing, and the spheroids are difficult to be fixed to a cell culture structure or a cell culture vessel. Therefore, when the medium is changed, the spheroids are lost along with the medium, or
  • the operation of exchanging the medium becomes very complicated and it becomes difficult to maintain a good culture environment.
  • multiple cells aggregate to form a sphere, even if we try to simulate the dynamics of cancer cells, the characteristics of the tumor formed by dividing one cancer cell in vivo and the sphere Since the nature of this is strictly different, there is a problem that the accuracy of the simulation is lowered.
  • the material used for the honeycomb structure is limited, the size of the honeycomb structure cannot be precisely controlled, and the structure has a shape other than the honeycomb structure whose planar shape is a circle.
  • problems such as difficulty in making.
  • it took a very long time to fabricate the honeycomb structure and there were also problems that the cost was high and it was not suitable for mass production.
  • the cells used are cells that can be evaluated even when multiple cells such as hepatocytes cooperate, and are formed by dividing from a single cell in vivo, such as cancer cells. There is no suggestion of evaluation of tumor simulations.
  • the cell culture structure of the present invention is characterized by having an uneven structure with an uneven width of 3 m or less.
  • another cell culture structure of the present invention is characterized in that the planar shape is polygonal and has a concavo-convex structure in which a plurality of cells having a minimum inner diameter of 3 Um or less are continuously provided. .
  • the cell preferably has a hexagonal shape in the planar direction.
  • the cell preferably has a maximum inner diameter of 3 m or less. Further, the width between the cells is preferably 3 m or less.
  • the cell culture structure is preferably in the form of a fillet.
  • the cell culture structure has a small area in the plane direction. It is preferable that the cell is formed to be larger than the area of the bottom surface of a vessel for culturing vesicles, for example, a multiwell plate.
  • the cell culture structure is preferably formed of one or more of polystyrene, polyimide, acrylic resin, cyclic olefin-based thermoplastic resin, aluminum oxide, glass, quartz glass, and silicon.
  • the method for producing a cell culture structure of the present invention is a method for producing a cell culture structure having a concavo-convex structure, and the width of the concavo-convex is 3 U m or less on a workpiece using nanoimprint technology.
  • the concavo-convex structure is formed.
  • another method for producing a cell culture structure according to the present invention is a method for producing a cell culture structure having a concavo-convex structure, and the shape to be processed has a large number of planar shapes using a nanoimprint technique.
  • the concavo-convex structure is characterized in that a plurality of cells having a rectangular shape and a minimum inner diameter of 3 jum or less are continuously formed.
  • the cell preferably has a hexagonal shape in the planar direction.
  • the cell preferably has a maximum inner diameter of 3 m or less.
  • the width between the cells is preferably 3 m or less.
  • the object to be processed is preferably in the shape of a fillet.
  • the processing object has a larger area in the plane direction than the area of the bottom surface of a vessel for culturing cells, for example, a multiwell plate.
  • the object to be processed is formed of one or more of polystyrene, polyimide, cyclic olefin-based thermoplastic resin, acrylic resin, aluminum oxide, glass, stone glass, and silicon.
  • the spheroid formed on the cell culture structure is fixed on the cell culture structure having the concavo-convex structure with an uneven width of 3 jum or less. It is characterized by that.
  • another structure with a spheroid of the present invention is a cell culture structure having a concavo-convex structure in which a plurality of cells having a polygonal shape in a planar direction and a minimum inner diameter of 3 jum or less are continuous. Further, the spheroid formed on the cell culture structure is fixed.
  • another structure with a spheroid of the present invention is a spheroid formed from cells having a number of temporary legs per unit length of 0.1 m or more on an uneven structure. The door is fixed.
  • the spheroid is cultured from cancer cells. Also
  • the spheres preferably have a diameter of 1 O jum or more.
  • the method for producing a structure with spheroids of the present invention includes a cell culture structure having a concavo-convex structure in which a plurality of cells having a planar shape of a polygon and a minimum inner diameter of 3 jum or less are continuously provided. Cells are seeded and cultured to form spheroids.
  • the method for producing a structure with a spheroid according to the present invention includes seeding and culturing cells on a cell culture structure having a concavo-convex structure with a concavo-convex width of 3 m or less to form a spheroid. It is characterized by.
  • the cell culture container of the present invention is a cell culture container for culturing cells, and has a concavo-convex structure with a concavo-convex width of 3 m or less.
  • another cell culture container of the present invention is a cell culture container for culturing cells, wherein a plurality of cells having a polygonal shape in a planar direction and a minimum inner diameter of 3 m or less are continuously provided. It is characterized by having an uneven structure.
  • the cell culture container of the present invention is a cell culture container for culturing cells, and has a cell culture structure having a concavo-convex structure and one or more holes. And a cylindrical member that can be coupled with the base plate as a bottom plate.
  • the cell culture container of the present invention is a cell culture container for culturing cells, a cell culture structure having an uneven structure, a cylindrical member having one or more holes, and the cell culture And a bottom plate for sandwiching the structure together with the cylindrical member.
  • the cell culture container of the present invention is a cell culture container for culturing cells by incorporating a cell culture structure having a concavo-convex structure, the tubular member having one or more holes, A bottom plate for sandwiching the cell culture structure together with the cylindrical member; It is characterized by providing.
  • the cell culture structure preferably has an uneven structure with an uneven width of 3 m or less. Further, it is preferable that the cell culture structure has a concavo-convex structure in which a plurality of cells having a polygonal shape in the planar direction and a minimum inner diameter of 3 jum or less are continuous. Moreover, it is preferable to provide a seal member that seals between the tubular member and the cell culture structure.
  • the cell preferably has a hexagonal shape in the planar direction.
  • the maximum inner diameter of the cell is preferably 3 m or less.
  • the width between the cells is 3 jum or less.
  • the method for producing a cell culture container of the present invention is characterized in that the above-described cell culture structure of the present invention is fixed to a container for culturing cells.
  • Another method for producing a cell culture container of the present invention is characterized in that an uneven structure having an uneven width of 3 jum or less is formed in a vessel for culturing cells.
  • the container for culturing cells has an uneven structure in which a plurality of cells having a polygonal shape in the planar direction and a minimum inner diameter of 3 m or less are continuously provided. It is characterized by forming a cell culture structure.
  • the method for producing a cell culture container of the present invention is characterized by fitting a cell culture structure having a concavo-convex structure and a cylindrical member having one or more holes.
  • the method for producing a cell culture container of the present invention includes a cell culture structure having a concavo-convex structure, a cylindrical member having one or more holes, and a bottom plate disposed at the bottom of the cylindrical member; It is characterized by being inserted between and fitted.
  • the cell culture structure is preferably the cell culture structure of the present invention. Moreover, it is preferable to form the concavo-convex structure using a nanoimprint technique.
  • the spheroid-equipped container of the present invention is characterized in that the spheroid cultured in the cell culture container is fixed to the above-described cell culture container of the present invention.
  • the method for producing a container with a spheroid of the present invention comprises the above-described cell culture of the present invention. It is characterized by seeding and culturing cells in a composition container.
  • a cell culture structure and a cell culture container in which the shape, size, and material of the microstructure are controlled can be manufactured.
  • a sphere suitable for drug screening evaluation can be easily and shortly made. It can be cultured at a low cost for a long time.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing an uneven structure of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic front view showing a microfabrication apparatus of the present invention.
  • FIG. 3 is a SEM photograph of a cell culture structure having a honeycomb structure of the present invention formed on a film having a film thickness of 4 Ojum.
  • FIG. 4 is a SEM photograph of a cell culture structure having a honeycomb structure of the present invention formed on a film having a film thickness of 4 Ojum.
  • FIG. 5 is a SEM photograph of a cell culture structure having a honeycomb structure of the present invention formed on a film having a thickness of 10 OjUm.
  • FIG. 6 is a SEM photograph of a cell culture structure having a honeycomb structure of the present invention formed on a film having a thickness of 10 OjUm.
  • FIG. 7 is a plan view showing a cell culture container of the present invention.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view as seen from the direction of arrows I—I in FIG.
  • FIG. 9 is a cross-sectional view showing another cell culture container of the present invention.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view showing still another cell culture container of the present invention.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view showing still another cell culture container of the present invention.
  • FIG. 12 Cell line U derived from human glioma cultured on the cell culture structure of the present invention
  • FIG. 13 is a photograph showing a Western plotting image comparing the spheres of the present invention with monolayers of HIF-1 and P-AMPK.
  • FIG. 14 is a table showing the relationship between plate efficiency and spheroid production rate of the cell culture structure of the present invention.
  • FIG. 15 is an optical micrograph (magnification: 100 ⁇ ) of a spheroid formed with a human head and neck cell line SQ 2 OB cells cultured on the cell culture structure of the present invention.
  • FIG. 16 is an optical micrograph (magnification: 200 ⁇ ) of spheroids formed with human colon cancer-derived cell line SW 4480 cells cultured on the cell culture structure of the present invention.
  • FIG. 17 is an optical micrograph (magnification 40 times) of a spheroid formed with a human colon cancer-derived cell line HT 29 cell cultured on the cell culture structure of the present invention.
  • FIG. 18 is a graph showing the relationship between the width of the unevenness of the uneven structure and the number of temporary feet.
  • the cell culture structure of the present invention has an uneven structure with an uneven width of 3 ⁇ m or less.
  • the width of the unevenness is, for example, 3 mm or less, 2 mm or less, 1 mm or less, 70 O nm or less, 500 nm or less, or 250 nm or less. This is preferable in that it can be grown.
  • the depth of the unevenness (the vertical dimension of the workpiece 200) is 10 nm or more, 100 nm or more, 200 nm or more, 500 nm or more, 1 m or more, 10 m or more, It is formed in various sizes such as 10 Om or more.
  • there are various aspect ratios of the unevenness such as 0.2 or more, 0.5 or more, 1 or more, 2 or more.
  • the concavo-convex structure may be a structure in which a plurality of cells having a polygonal shape in the planar direction and a minimum inner diameter of 3 m or less are continued. This prevents the cells from growing into a single-layer cell that has spread in the two-dimensional direction (planar direction), and can be grown into a three-dimensional spheroid.
  • the shape of the concavo-convex structure in the planar direction is preferably a regular polygon, and is preferably a regular triangle, square, or regular hexagon that can be formed isotropically continuously in the planar direction. This allows the spheres to grow on isotropically uniform structures.
  • the minimum inner diameter of the cells (preferably the maximum inner diameter) and the width of the line 202 between the cells are
  • the cell culture structure may have any shape, for example, for example, a film or a substrate (plate) can be used. Furthermore, any material may be used as long as it is non-toxic to cells. For example, “polystyrene”, “polyimide”, “cyclic olefin copolymer (
  • thermoplastic resins such as cyclic olefin polymers (COP) "," acrylic resins ",” other resins such as photo-curing resins and thermosetting resins "," metals such as aluminum oxide " Materials such as “glass”, “quartz glass”, and “silicon” can be used. Further, it is also possible to use a substrate body made of silicon, glass or the like on which a coating layer such as “resin”, “photoresist”, “metal such as aluminum oxide” is formed.
  • the film form means a film having a thickness of at least 1 mm or less. Also, from the viewpoint of ease of microscopic observation, it is preferable that the thickness is thin, less than 500 mm, less than 200 mm, less than 100 mm, less than 50 mm, and less than 40 mm. Various thicknesses can be used.
  • the size of the cell culture structure is preferably formed to be larger than the size of the bottom surface of a normal container such as a petri dish or dish, a multi-well plate, a flask, or a chamber slide.
  • a normal container such as a petri dish or dish, a multi-well plate, a flask, or a chamber slide.
  • a multi-well plate it is preferable to form a plate having a length of 70 to 9 Om m and a width of 100 to 130 mm.
  • the cell culture structure is in the form of a film, it is preferable that the cell culture structure is formed to be larger than the size of the bottom surface of each hole of the multi-well plate.
  • 96-hole multi-wall playboard it is better to make it about 7 mm or more.
  • FIG. 1 (c) the case where a groove 20 3 is formed between adjacent polygons 2 0 1 (squares) in FIG. 1 (b) is also included.
  • this groove the components of the medium at the time of culturing can be spread to every corner of the cell or sphere.
  • the cell culture structure manufacturing method uses nanoimprint technology that transfers the fine pattern (uneven structure) formed on the mold 100 by pressing the mold 100 against the workpiece 200 Can do.
  • Nanoimprint technology includes thermal imprint There are process technology and optical imprint process technology.
  • Fig. 2 shows the processing device 1 used in the thermal imprint process technology.
  • the processing apparatus 1 presses the mold 100 having a predetermined pattern and the workpiece 200 to transfer the pattern of the mold to the workpiece 200
  • a fine processing apparatus a mold holding unit 2 for holding a mold 100, a workpiece holding part 12 for holding a workpiece 200, and a mold 100 for the workpiece 200
  • Displacement means 5 capable of adjusting the relative position of the workpiece and the displacement speed for changing the position
  • position detection means 7 for detecting the relative position of the mold 1 0 0 with respect to the workpiece 2 0 0, and mold 1
  • Pressure detection means 8 for detecting the pressure between 0 0 and the workpiece 2 0 0
  • mold heating means 3 for heating the mold 1 0 0
  • mold cooling means 4 for cooling the mold 1 0 0
  • Die temperature detecting means 3 1 for detecting the temperature of 100, work object heating means 13 for heating the work object 200, and heating object cooling for cooling the work object 200
  • Means 14 and workpiece temperature detection means 1 3 1 for detecting the temperature of workpiece 20 0
  • the material of the mold 100 may be any material as long as the component does not adhere to the workpiece 200, for example, "metal such as nickel”, “ceramics", “glassy carbon” Carbon materials such as “Silicon”, etc. are used. Further, the mold 100 may be anything as long as it can press the workpiece 200 and can machine the workpiece 20 0, but one end surface (pattern surface 100 0 a ), A predetermined pattern of irregularities is formed. This pattern is an inversion of the uneven structure of the cell culture structure described above. This pattern can be formed by subjecting the pattern surface 100 a to precision machining.
  • an electroforming method such as a nickel plating method is formed on the surface of the silicon substrate or the like. It is also possible to apply a metal plating and peel the metal plating layer to form a pattern consisting of irregularities.
  • the material and manufacturing method of the mold 100 are not particularly limited as long as a fine pattern can be formed.
  • the width of the unevenness of this pattern is 3 m or less, 2 jU m or less, 1 jum or less, 70 nm or less, 500 nm or less, 25 5 It is formed in various sizes such as 0 nm or less.
  • the depth of the unevenness (the vertical dimension of the workpiece 200) is 10 nm or more, 100 nm or more, 2 00 ⁇ m or more, 500 nm or more, 1 mm or more. , 10 ⁇ m or more, or 100 ⁇ m or more.
  • the area occupied by this pattern is preferably 900 mm 2 or more, more preferably 2500 mm 2 or more. Since this mold is heated and cooled during molding, it is preferable to make it as thin as possible and reduce its heat capacity.
  • the mold holding unit 2 is fixed to the mold holding surface 2a holding the mold 100 so that the mold 100 is in surface contact with a fastener such as a screw clamp fitting. It is formed as possible.
  • the structure of the mold holding part 2 may be any structure as long as the mold 100 is held on the mold holding surface 2a. For example, electrostatic chucking or vacuum suction is applied to the mold holding surface 2a. It is also possible to adopt a structure for holding by adsorption.
  • the mold holding unit 2 includes a mold heating means 3 for heating the mold 100, for example, a carbon heater having very good responsiveness.
  • the carbon heater is controlled to supply current from a power source (not shown) by the control means 300, and can maintain the mold 100 at a predetermined constant temperature.
  • a heat transfer heater for example, a ceramic heater, a halogen heater, an IH heater, or the like can be used.
  • the mold holding unit 2 is provided with a mold cooling means 4 for cooling the mold 100.
  • a mold cooling means 4 for example, a cooling liquid such as water or oil, or a cooling gas such as air or inert gas is allowed to flow inside the mold holding part 2 formed of a metal having high thermal conductivity such as aluminum or copper.
  • a cooling channel that can cool the mold 100 Can.
  • the mold holding unit 2 is provided with mold temperature detection means 31 for detecting the temperature of the mold 100, for example, a thermocouple.
  • the mold temperature detection means 3 1 is electrically connected to the control means 3 0 0 and is formed so as to transmit the detected information relating to the temperature of the mold 1 0 0 to the control means 3 0 0. .
  • the workpiece holding unit 12 holds the workpiece 200 in a substantially horizontal state, and has a workpiece holding surface 12 a on the upper surface. It has a swage.
  • a large number of vacuum holes are formed in the workpiece holding surface 12 a, and negative pressure is applied to the vacuum holes from a negative pressure source (not shown).
  • the workpiece 2 is held on the workpiece holding surface 1 2 a by suction.
  • the structure of the workpiece holding part 1 2 may be any structure as long as it holds the workpiece 2 0 0 on the workpiece holding surface 1 2 a.
  • a fastener such as a clamp fitting It is of course possible to adopt a structure in which the workpiece is held on the workpiece holding surface 1 2 a or is held by adsorption by electrostatic adsorption.
  • a workpiece heating means 13 for heating the workpiece 20 that is held is provided below the holding stage, for example, a highly responsive carbon heater.
  • the carbon heater is controlled to supply current from a power source (not shown) by the control means 300, and can maintain the workpiece 200 on the holding stage at a predetermined constant temperature.
  • a heat transfer heater, a ceramic heater, a halogen heater, an IH heater, or the like can be used.
  • the workpiece holding section 12 can be provided with a workpiece cooling means 14 for cooling the workpiece 200.
  • the workpiece cooling means 14 includes, for example, a coolant such as water or oil, air, inert gas, etc. inside the workpiece holding part 12 formed of a metal having high thermal conductivity such as aluminum or copper. It is necessary to use a cooling flow path that can cool the workpiece 200 by flowing a cooling gas of You can.
  • the workpiece holding unit 12 is provided with a workpiece temperature detection means 13 1, for example, a thermocouple, for detecting the temperature of the workpiece 200.
  • the processing object temperature detection means 1 31 is electrically connected to the control means 3 0 0 so that the detected information on the temperature of the processing object 2 0 0 is transmitted to the control means 3 0 0. Is formed.
  • the displacing means 5 is composed of, for example, a ball screw 51 arranged in the vertical direction and an electric motor 52 that drives the ball screw 51 to rotate. Further, the lower end portion of the ball screw 51 and the upper surface of the mold holding portion 2 are connected via a pressing portion 53 and a bearing mechanism 54. Then, by rotating the ball screw 51 with the electric motor 52, the pressing portion 53 is formed on a plurality of, for example, four struts 56 provided between the base 50 and the upper base 55. It can be displaced in the contact / separation direction of the workpiece 100 and the workpiece 200 (hereinafter referred to as the Z direction).
  • the displacement means 5 is capable of adjusting the position of the mold 100 relative to the workpiece 200 with a displacement amount not more than the depth of the pattern of the mold 100.
  • the amount of displacement can be adjusted to 100 m or less, preferably 10 U m or less, more preferably 1 m or less, more preferably 100 nm or less, and further.
  • one that can be adjusted to 1 O nm or less, more preferably 1 nm or less is preferable.
  • the displacement means 5 is preferably capable of adjusting the displacement speed of the mold 100 with respect to the workpiece 200. Specifically, it can be adjusted within 10 O jU mZ seconds or less, preferably 10 seconds or less, more preferably 1 second or less, more preferably 1 00 n seconds or less, and even more preferably 1 On. It should be adjustable in seconds or less, more preferably 1 n mZ seconds or less. This is because the control means 3 0 0 controls the operation of the displacement means 5 based on the information detected by the pressure detection means 8 and adjusts the pressure between the mold 1 0 0 and the workpiece 2 0 0. Pressure detection It takes some time for the information detected by the output means 8 to be fed back to the displacement means 5. Therefore, if the displacement speed is too high, the information detected by the pressure detection means 8 is delayed in feeding back to the displacement means 5, and the actual pressure between the mold 100 and the workpiece 2 0 0 is accurately controlled. Because you wo n’t be able to
  • the displacement means 5 is composed of a ball screw and an electric motor as long as the relative displacement amount and displacement speed between the mold 100 and the workpiece 200 can be adjusted.
  • a piezoelectric element that can change the size (dimension) by adjusting the voltage or a magnetostrictor that can change the magnitude (dimension) by adjusting the magnetic field can be used.
  • a pole screw and an electric motor are applied to greatly displace the mold 100 and the workpiece 200, and a small amount of displacement between the mold 100 and the workpiece 200 is applied.
  • a piezoelectric element or a magnetostrictive element can be used.
  • the mold holder 2 that holds the mold 100 is moved up and down, so that the workpiece 5 held by the workpiece holding part 12 is opposed to the workpiece 200.
  • the pattern surface 100 a of the mold 100 a can be closely approached and pressed and separated.
  • the position detection means 7 is formed by, for example, a linear scale arranged in the mold holding unit 2. Using this linear scale, the distance between the workpiece 2 0 0 and the mold holder 2 is measured, and the relative position and displacement speed of the mold 1 0 0 with respect to the workpiece 2 0 0 are calculated from the measured values. Can be detected.
  • the position detection means 7 is electrically connected to the control means 300, and is configured to transmit information on the detected position and displacement speed of the mold 100.
  • the position detection means 7 is not limited to a linear scale, and various types can be used. For example, the position of the workpiece 200 is measured using a laser length measuring device provided on the mold holding unit 2 side, or a laser length measuring device provided on the processing object holding unit 12 side is used.
  • the position of the mold 100 may be measured. Further, it may be measured by calculation from the displacement amount of the displacement means 5 using an encoder provided in the electric motor.
  • the resolution of the position detection means 7 can be detected with a value that is at least smaller than the size of the pattern 100 in the depth direction (Z direction) or less than the amount of displacement that the displacement means 5 can adjust. Is preferred. Specifically, those that can be detected at 1 OO jU m or less are good, preferably 1 O jU m or less, more preferably 1 m or less, more preferably 100 nm or less, more preferably 1 O nm or less, more preferably 1 nm or less can be detected
  • the mold for the workpiece 2 0 0 can be selected according to the size of the pattern and the pressure between the mold 1 0 0 and the workpiece 2 0 0. Since the position of the 100 0 pattern surface 1 0 0 a can be precisely adjusted, the pattern transferability and releasability can be improved.
  • the pressure detection means 8 detects the pressure between the mold 100 and the workpiece 200, for example, the load between the mold 100 and the workpiece 200 A load cell to be measured can be used. As a result, if the load is measured and divided by the area of the pattern surface 100 a of the mold 100 a, the pressure between the mold 100 and the workpiece 200 can be detected. Further, the pressure detection means 8 is electrically connected to the control means 300 and is configured to transmit information regarding the detected pressure.
  • the control means 3 0 0 includes a position detection means 7, a pressure detection means 8, a mold temperature detection means 3
  • the displacement speed to be adjusted depends on the material and temperature of the workpiece 200. For example, it is better to adjust it at 100 seconds or less, preferably 10 milliseconds or less, more preferably 1 UL seconds or less, more preferably 10 00 n seconds or less, more preferably 1 On seconds or less, More preferably, it should be adjusted within 1 ns.
  • the actual pressure between the mold 100 and the workpiece 200 can be reliably adjusted to a predetermined value or less.
  • at least one of the mold heating means 3 and the workpiece heating means 1 3 is controlled to change the temperature of the molding surface 2 00 a of the workpiece 2 0 0 a. It is also possible to adjust the pressure between the mold 100 and the workpiece 200.
  • a method for producing a cell culture structure using the processing apparatus 1 is as follows.
  • the mold 100 and the workpiece 200 are heated to a predetermined temperature for molding.
  • the mold 100 is preferably heated to a temperature higher than the workpiece 200, more preferably, the mold. 1 0 0 is heated to a temperature higher than the softening temperature (glass transition point and melting point) at which the workpiece 2 0 0 softens, and the workpiece 2 0 0 is heated to its softening temperature (glass transition point and melting point). It is preferable to heat to a lower temperature.
  • the heating temperature depends on the material of the workpiece 200 and the material of the mold 100. For example, the softening temperature (Tg) + 20 at which the workpiece is softened. C or higher, softening temperature (T g) + 2 5. C or higher, softening temperature (T g) +
  • the mold 1 0 0 and the workpiece 2 0 0 are pressed with a preset pressure.
  • the pressure between the object 200 and the object 200 should be as small as possible as long as the pattern of the mold 100 can be transferred to the object 200.
  • 4 MPa or less preferably 2 MPa or less, more preferably 1.5 MPa or less, more preferably 1 MPa or less, more preferably 0.5 MPa or less, more preferably 0.25 MP. It should be less than a.
  • the pressure is pressed with a relatively lower pressure than before, so that the adhesion between the mold 100 and the workpiece 200 is not increased, and the mold can be easily released by preventing the collapse of the mold. Can do.
  • the displacement speed of the mold 100 relative to the workpiece 200 can be adjusted so that the pressure between the mold 100 and the workpiece 200 does not always exceed a preset pressure, for example, 4 MPa. Better to speed. More preferably, it is preferable to control and press the displacement amount of the mold 100 with respect to the workpiece 200.
  • the atmosphere of the mold 100 and the workpiece 200 is evacuated. Is preferred. In this case, it is only necessary to create a vacuum atmosphere before pattern transfer. Considering oxidation of the workpiece 200 or the like, it is preferable to create a vacuum atmosphere before heating the workpiece 200.
  • the degree of vacuum may be 40 Pa or less, for example.
  • the mold 100 and the workpiece 200 are cooled, and the temperature of the workpiece 200 is reduced to a glass transition temperature (or softening temperature) or lower.
  • the cooling temperature may be a softening temperature (T g) _5 ° C or lower, a softening temperature (T g) _45 ° C or lower, and a softening temperature (T g) _90 ° C or lower.
  • T g softening temperature
  • T g softening temperature
  • the mold 100 and the workpiece 200 are released, and the process of the fine processing method is completed.
  • the object of the transferred pattern is formed, it is preferably greater, for example, 9 OOmm 2 or more, more preferably it is 25 300 mm 2 or more in size .
  • the concavo-convex structure may be formed on the surface by other methods such as blasting, corona discharge, and etching. Also good.
  • the cell culture structure is preferably formed to have an uneven width of 3 jum or less, and preferably 2 jum or less, 1 ⁇ m or less, 700 nm or less, 500 nm or less, or 250 nm or less.
  • the size of the cell culture structure is larger than the size of the bottom of a normal container such as a dish or dish, a multiwell plate, a flask, or a chamber slide.
  • a normal container such as a dish or dish, a multiwell plate, a flask, or a chamber slide.
  • the cell culture structure is in the form of a sheet or film, it is preferable that the cell culture structure is formed to be larger than the size of the bottom surface of each hole of the multiwell plate.
  • a 96-hole multi-wall plate it is better to make it about 7 mm or more.
  • the cell culture vessel 210 of the present invention is a vessel for culturing cells, and has an uneven structure with an uneven width of 3 m or less formed in the container.
  • Any container can be used as long as it can cultivate cells. Examples thereof include a petri dish or dish for culturing, a multiwell plate, a flask, and a titanium slide.
  • the uneven structure may be formed by, for example, fixing the above-described cell culture structure of the present invention to at least a part of the container.
  • the cell culture container is a petri dish or a multi-wall plate, for example, as shown in FIGS. 7 and 8, a cylindrical member 2 1 2 having one or more holes 2 11 1; A plate-shaped cell culture structure 2 20 described above, or a cylindrical member 2 1 2 having one or more holes 2 1 1 and a sheet as shown in FIG.
  • the above-described cell culture structure 2 20 in the form of a film and the substrate 2 1 3 that sandwiches and integrates the cell culture structure 2 2 0 between the cylindrical members 2 1 2 may be configured. .
  • Non-toxic adhesives include, for example, Fallon Alpha (trade name) and the like, and at least the cylindrical member 2 1 2 and the cell culture structure 2 20 may be joined so as to be sealed.
  • At least the cylindrical member 2 1 2 or the cell culture structure 2 2 0 is heated and joined to near the glass transition temperature or the melting point.
  • ultrasonic vibration energy is converted into frictional heat, and at least one of the cylindrical member 2 1 2 and the cell culture structure 2 2 0 is bonded to the glass transition temperature or the melting point by using ultrasonic welding. It ’s fine.
  • a pattern on which a predetermined pattern is formed is pressed into a normal petri dish or multi-well plate container, and the same pattern as the above-described cell culture structure is transferred to the bottom surface of the container. You may do it.
  • a mold is used that is slightly smaller than the size of the hole 2 11 in the container, and the pattern is formed by inserting the mold into the hole while moving over the hole in the container.
  • a plurality of the stamp-shaped molds may be arranged and inserted into a plurality of holes to form a pattern in a lump.
  • a seal member 2 15 that seals between the cylindrical member 2 12 and the cell culture structure 2 2 for example, It is preferable to dispose a gasket made of silicon rubber or the like.
  • This gasket is a cylinder Of course, it may be formed integrally by applying silicon rubber or the like to the shaped member 21 2 or the cell culture structure 2 20.
  • the cells used here are mesenchymal cells, hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells, neurons, cardiomyocytes, glia cells, corneal epithelial cells, chondrocytes, osteoblasts, adipocytes, etc.
  • Normal cells cancer cell lines (eg, HepG2, HuH-7), immortalized cells (eg, HHY41, NKNT-3, Fa2N-4 strains), and chromosomal abnormalities
  • Abnormal cells such as cells can be used.
  • a medium used for the culture can be appropriately prepared and used by those skilled in the art according to the type of the target cell.
  • the cell culture structure and the cell culture container of the present invention both have a structure in which cells adhere to the surface thereof, so that the spheres produced by the culture are formed on the structure or container. .
  • the reason for this is considered to be that a large number of temporary limbs grow on the cell culture structure of the present invention to make a firm scaffold on the uneven structure.
  • a temporary foot of 0.1 m or more per unit length of the circumference is formed around the cell. Therefore, medium change during culturing for spheroid formation can be performed in the same manner as normal culture, and spheroids can be easily formed while changing medium.
  • the size of the spheroidal may be 1 O jum or more, preferably
  • 15 to 50 m is better, more preferably 20 to 40 m, and even more preferably 25 to 35 jum, but depending on the purpose of using the sphere, Larger spheres can be formed by repeated exchange and incubation. Noh.
  • the “size of spheroid” in the present invention refers to the major axis on a plane parallel to the cell culture structure or cell culture container, and can be accurately measured by observation with an optical microscope or observation with an electron microscope. .
  • the sphere obtained by such a method is mainly composed of clonal cells generated by the division of a single cell.
  • cancer cells that can be formed in a living body are not formed by aggregation of a plurality of cells as in the prior art sphere (the sphere described in Patent Document 1), but are formed by dividing a single cell. Therefore, in the present invention, it is possible to culture a sphere having properties closer to cancer cells that can be formed in a living body, and to perform screening with higher accuracy.
  • such a sphere has properties common to various tissues existing in the living body, and reproduces the tissue environment in the living body more than the monolayer culture.
  • the spheres obtained by the present invention are cultured on fine structures artificially controlled by various materials, so that the adhesion area to the solid phase on which the fine structures are formed is controlled.
  • the That is, the fixing area can be adjusted to less than 50%, preferably less than 40%, and more preferably less than 30% of the total surface area of the sphere.
  • the spheroid fixed to the solid phase in this way is a conventional non-fixed spheroid (a spheroid formed by flowing a medium in a spheroid flask formed in an agarose gel).
  • a cell adhesion factor, cell adhesion protein or cytoskeletal protein for the extracellular matrix is strongly expressed.
  • cell adhesion factor, cell adhesion protein, and cytoskeleton protein include integrins, cadherins, and actin. These are all known to be closely related to cell adhesion.
  • actin can be measured by the following method.
  • the cultured cells that form the spheroids are fixed, treated with a surfactant or the like, lysed, and further blocked with BSA (Bovine serum albumin) or the like.
  • BSA Bovine serum albumin
  • An anti-actin antibody or the like is bound to the sample thus prepared, and a secondary antibody or the like labeled with a labeling substance such as a fluorescent substance is bound to the bound antibody to detect the labeling substance or the like.
  • Actin can be measured by quantification.
  • the spheroid obtained by the present invention realizes an environment similar to that of tumors and tissues such as lack of oxygen and lack of nutrition.
  • high expression of proteins expressed in the state of lack of oxygen for example, HIF-1 protein, etc.
  • Phenomena observed in the state of lack of nutrition for example, increased phosphorylation of AMPK, etc .
  • phosphorylation of AMPK is enhanced, it is 1.5 times or more, preferably 2 times or more that in monolayer culture, more preferably Can be confirmed by the confirmation of an increase of more than 2.5 times.
  • Those skilled in the art can appropriately observe these by Western plotting using specific binding pairs (antibodies, receptors, etc.) and immunostaining.
  • the spheroids obtained by the present invention thus produced can be used for drug screening.
  • chemical substances, drugs, etc. can be added to the spheroids fixed to the cell culture substrate or cell culture vessel, and those having some effect on the cells forming the spheroids can be screened. .
  • the sphere of the present invention can also be used for differentiation of disease malignancy. That is, tissue fragments collected from a living body are dispersed into cells. Then, in the course of making the sphere of the present invention, the proliferative ability can be evaluated, or the presence or absence of free cells from the sphere can be evaluated to evaluate the cancer metastasis ability.
  • the sphere of the present invention can also be used for regenerative medicine. That is, by preparing the sphere of the present invention from cells collected from healthy tissue and injecting the sphere directly or indirectly into the relevant tissue of patients or animals requiring treatment, the function of the relevant tissue can be maintained. ⁇ Can be used for playback.
  • the sphere of the present invention can also be used for food function evaluation.
  • functional foods, active ingredients in foods, etc. are added to the spheroids adhering to the cell culture substrate or cell culture container to screen for those that have some effect on the cells that form the spheroids. can do.
  • the sphere of the present invention can also be used for safety evaluation of foods or drugs.
  • foods, drugs, etc. are added to the spheroids adhering to the cell culture substrate or cell culture container, and the morphological and biochemical changes of the cells forming the spheroids are verified. It is possible to evaluate the safety of substances.
  • transparent films with a glass transition temperature ⁇ softening temperature (T g) ⁇ of 13.6 ° C and a film thickness of 40 m and 10 0 m are made of cycloolefin polymer ( Zeon Corporation ZF 1 4) was used.
  • a micro molding apparatus (VX-2000N-US) manufactured by SCI VAX was used for evaluation of micro molding.
  • the mold has a pattern that can transfer the concavo-convex structure consisting of line and space when transferred to the workpiece, and a pattern that can transfer a regular hexagonal honeycomb structure (a pattern in which the honeycomb structure is reversed) Also have Two of these were used. Further, this mold was made of nickel, and a transferable area force ⁇ 5 Omm X 5 Omm (the outer shape of the mold was 55 mm X 55 mm): a square having an area of 2500 mm 2 was used.
  • the concavo-convex structure consisting of line and space has a concavo-convex depth of 1 mm and a concavo-convex width of 10 mm, 5 mm, 4 mm, 3 U 2 mm, 1 U 700 nm, 500 Eight types of nm regions were formed.
  • the honeycomb structure has a line width of 250 nm, a height of 380 nm (aspect ratio of about 1.5), and a maximum inner diameter of one cell (hexagon) of 2 jum (ie, line width). The maximum outer diameter including that is 2.5 ⁇ ).
  • the film with a film thickness of 40 m was cooled to the glass transition temperature deficiency temperature (T g) ⁇ -46 ° C (90 ° C) while keeping the mold pressure constant. After completion of cooling, the mold was released from the film at a speed of 1 O mZ seconds.
  • SEM scanning electron microscope
  • a pattern of uniform and good concavo-convex structure (line and space and honeycomb structure) without stretching or peeling was transferred over the entire transfer area.
  • Fig. 3 shows a planar photograph (magnification: 10,000 times) after transfer of a pattern composed of a honeycomb structure
  • Fig. 4 shows a photograph from the perspective (magnification: 5,000 times).
  • a film having unevenness can be produced by roughening the surface of a 3 mm-thick polystyrene plate by conventional blasting.
  • a polystyrene film having a film thickness of 4 Om can be roughened by a conventional corona discharge to produce a film with irregularities.
  • the cell culture structure (honeycomb structure) having a thickness of 4 Ojum manufactured in Example 1 was cut to a size of 1.5 cm square, and this was heat-sealed in a petri dish having a diameter of 3.5 cm.
  • the cell culture container of the present invention was prepared by fixing.
  • one MEM medium (10% fetal bovine serum, 20 mmo I / IH EP ES, 8 mmo I / I sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin, and A cell line U 251 cell derived from human glioma was seeded together with 2m I together with 0.03 I streptomycin.
  • This 37 ° C, 2% C0 2 in the atmosphere for 7 days (middle, the medium was replaced on day 6 eyes 3 days) is Sufuweroi de were cultured formed (see FIG. 1 2), the present invention A spheroided structure was formed.
  • HIF-1 protein using anti-HI F-1 Usagi polyclonal antibody: Santa Cruz Biotech Co., Ltd.
  • Phosphorylation of AMP K anti-AMP K Usagi polyclonal antibody: manufactured by Cell Signaling Technology Co., Ltd.
  • U 251 cells were used which were seeded at a similar cell density in a conventional polystyrene culture dish and cultured after changing the medium.
  • the results are shown in Figure 13.
  • the Western plot method was performed by the following method. First, 20 g of total protein extracted from cultured cells was electrophoresed on a pregel gel (ATT0 polyacrylamide gel G pager).
  • the cells were transferred to a PVDF membrane (ATTO clear blot ⁇ P membrane) with a blotting buffer (20 mM GI cyne / 25 mM TrisHC I / 20% Methano I, pH 8.0).
  • the PVDF membrane after transfer is blocked with 5% BSA TBST (20 mM Tris-HCI / 0.15 M NaCI / 0.1% Tween (trade name) 20, pH 8.0) solution, and then 1% BSA containing the primary antibody.
  • BSA TBST 20 mM Tris-HCI / 0.15 M NaCI / 0.1% Tween (trade name) 20, pH 8.0) solution, and then 1% BSA containing the primary antibody.
  • incubation was performed in a solution containing a secondary antibody for 1 hour.
  • detection was performed by chemiluminescence (GL / Amersham ECLplus).
  • the cultured spheroids have higher expression levels of HIF-1 protein than monolayer cells, and AMP K phosphorylation is more enhanced than monolayer cells. It can be seen that it exhibits properties that are closer to tissues in the body than monolayer cells. This indicates that the spheroids obtained by the present invention are useful for tests such as drug resistance and toxicity.
  • actin filaments were measured for the spheroids thus formed.
  • the actin filament was measured by the following method. First, the cultured cells are washed twice with PBS. Fix with 3% Folmaldehyde / PBS for 15 minutes and wash twice with PBS. Next, treat with 0.1% " ⁇ 0 ⁇ -100 /? 85 for 15 minutes and wash twice with BS. Then block with 1% BSA / PBS for 30 minutes and wash twice with PBS.
  • the plate efficiency is calculated as the ratio (%) of the number of colonies per unit area at the start of 3 days of cultivation to the number of cells seeded per unit area.
  • the spheroid production rate is the unit area The ratio of the number of spheroids formed per unit area when the culture started 7 days to the number of cells seeded per unit (%) And calculated.
  • Example 4 In the cell culture container of the present invention prepared in Example 4, one MEM medium (10% fetal bovine serum, 2 Ommo II HEPES, 8 mmo II sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin, and 0.03 I streptomycin 100 ml of a human head and neck cell line SQ 20 B cell was seeded together with 2 m I. This 37 ° C, 2% C0 2 in the atmosphere for 7 days Sufueroi de was (middle went medium change on day 3 and day 6) culture is formed (see FIG. 1 5), the present invention A structure with spheroids was formed.
  • MEM medium % fetal bovine serum, 2 Ommo II HEPES, 8 mmo II sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin, and 0.03 I streptomycin 100 ml of a human head and neck cell line SQ 20 B cell was seeded together with 2 m I. This 37 ° C, 2% C0 2 in the atmosphere for 7 days Sufueroi de was
  • Example 4 In the cell culture container of the present invention prepared in Example 4, one MEM medium (10% fetal bovine serum, 2 Ommo II HEPES, 8 mmo II sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin, and 0.03 I Streptomycin 100 ml of human colon cancer cell line SW480 cells were seeded together with 2m I. This 37 ° C, 2% C0 under 2 atmosphere for 7 days (middle, medium exchange was performed on day 3 and day 6) Sufuweroi de were cultured is formed (see FIG. 1 6), the present invention A structure with spheroids was formed.
  • MEM medium 10% fetal bovine serum, 2 Ommo II HEPES, 8 mmo II sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin, and 0.03 I Streptomycin 100 ml of human colon cancer cell line SW480 cells were seeded together with 2m I. This 37 ° C, 2% C0 under 2 atmosphere for 7 days (middle, medium exchange was performed on day 3 and day 6) Suf
  • the MEM medium (10% fetal bovine serum, 20 mmo I / IH EP ES, 8 mmo I / I sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin in the cell culture container of the present invention prepared in Example 4 , And 0.03 I containing streptomycin) 1 000 29 human colon cancer-derived HT 29 cells were seeded together with 2m I. This 37 ° C, 2% C0 2 in the atmosphere for 7 days Sufuweroi de was (middle went medium change on day 3 and day 6) culture is formed (see FIG. 1 7), the present invention A structure with spheroids was formed.
  • a cell culture structure having a thickness of 40 m manufactured in Example 1 (Line and Space) The cell culture vessel of the present invention was prepared by cutting the sample into a 1.5 cm square and fixing it in a sheath having a diameter of 3.5 cm by heat fusion.
  • one MEM medium (10% fetal calf serum, 2 Ommo II HEPES, 8 mmo II sodium bicarbonate, 42000 units I penicillin, and 0.03 I Streptomycin 1 000 normal liver cell lines were seeded with 2m I. This 37 ° C, 2% C0 Sufueroi de with pseudopodia were cultured for 8 hours under 2 atmosphere is formed in the cell culture structure.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　ナノインプリント技術等の微細加工技術を用いて凹凸の幅が３μｍ以下の凹凸構造を有する細胞培養構造体を形成する。また、この細胞培養構造体又はこれを組み込んだ細胞培養容器によって細胞を培養し、仮足を有するスフェロイドが形成されたスフェロイド付き構造体又はスフェロイド付き容器を得る。これにより、凹凸構造の形状や大きさ、材質が制御された細胞培養構造体、細胞培養容器を製造できる。また、たとえば薬剤のスクリーニング評価に適したスフェロイドを簡単かつ短時間、更に低コストで培養することができる。

Description

明 細 書
細胞培養構造体、 細胞培養容器、 スフエロィド付き構造体、 スフエ ロイド付き容器およびこれらの製造方法
技術分野
[0001 ] この発明は、 細胞培養構造体、 細胞培養容器、 スフエロィ ド付き構造体、 スフエロィ ド付き容器およびこれらの製造方法に関するものである。
背景技術
[0002] 今日、 創薬の開発において、 細胞培養技術によって培養した細胞が、 薬剤 の薬理活性評価や毒性試験のシミュレーターに利用されている。
[0003] しかしながら、 従来の細胞培養技術で培養した細胞は、 細胞が二次元方向 に広がった単層細胞であるため、 生体内と同等の三次元組織を構築すること ができず、 また、 細胞が体内で有している特異的な機能を長時間維持するこ とができず、 そのことに起因してシミュレーションの精度が担保できないと いう問題があった。
[0004] そこで近年、 生体内と同等の機能を有する三次元組織であるスフエロィ ド の培養が注目されている。 例えば、 底面がロート状のゥエルに複数の単一細 胞を播種し、 底面でこの単一細胞を凝集および***させてスフエロィ ドを培 養するもの （特許文献 1 ) や、 所定のポリマー混合物のキャスト液表面に水 を結露させ、 該結露により生じた微小水滴を蒸発させることにより得られる ハニカム構造体上でスフエロイ ドを培養するものがある （特許文献 2 ) 。
[0005] 特許文献 1 ：特開平 6 _ 3 2 7 4 6 2号公報 （段落番号 0 0 1 6、 図 1 )
特許文献 2：特開 2 0 0 2 _ 3 3 5 9 4 9号公報 （第 3頁、 図 1 )
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] しかしながら、 前者は、 培養によって生ずるスフヱロイ ドの足場がなく細 胞培養構造体又は細胞培養容器にスフエロィ ドが固定され難い。 そのため、 培地交換の際に、 スフエロイ ドが培地とともに失われてしまうか、 あるいは 、 培地交換の作業が極めて煩雑になり良好な培養環境を維持することが困難 になるという課題があった。 また、 複数の細胞が凝集してスフエロィ ドを形 成しているため、 仮に癌細胞の動態をシミュレーションしょうとしても、 生 体内で一つの癌細胞から***して形成された腫瘍の性質とスフエロィ ドの性 質とは、 厳密には異なるため、 シミュレーションの精度が落ちるという課題 もあった。
[0007] また、 後者は、 ハニカム構造体に使用する材料に制約があることや、 ハニ カム構造の大きさを精密に制御できないこと、 構造を平面方向の形状が円で あるハニカム構造以外の形状にすることが困難であること等の課題があった 。 また、 ハニカム構造を作製するのに非常に時間が掛かる他、 コストも高く 、 大量生産に向かないという課題もあった。 また、 用いられている細胞は、 肝細胞のような複数の細胞が協働していても評価可能な細胞であり、 癌細胞 のように、 生体内で一つの細胞から***して形成される腫瘍のシミュレーシ ョンの評価については示唆されていない。
[0008] そこで、 本発明は、 形状や大きさ、 材質が制御された細胞培養構造体、 細 胞培養容器、 スフエロィ ド付き構造体およびスフエロィ ド付き容器を提供す ることを目的とする。 また、 これらを簡単かつ短時間で安価に製造する製造 方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 上記目的を達成するために、 本発明の細胞培養構造体は、 凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造を有することを特徴とする。
[0010] また、 本発明の別の細胞培養構造体は、 平面方向の形状が多角形であると 共に最小内径が 3 U m以下のセルを複数連続した凹凸構造を有することを特 徵とする。
[001 1 ] この場合、 前記セルは、 平面方向の形状が六角形である方が好ましい。 ま た、 前記セルは、 最大内径が 3 m以下である方が好ましい。 また、 前記セ ル間の幅が 3 m以下である方が好ましい。 また、 細胞培養構造体は、 フィ ル厶状である方が好ましい。 また、 細胞培養構造体は、 平面方向の面積が細 胞を培養する容器、 例えばマルチウエルプレー卜の底面の面積よりも大きく 形成されている方が好ましい。 また、 細胞培養構造体は、 ポリスチレン、 ポ リイミ ド、 アクリル樹脂、 環状ォレフィン系熱可塑性樹脂、 酸化アルミニゥ ム、 ガラス、 石英ガラス、 シリコンのいずれか 1以上により形成されている 方が好ましい。
[0012] また、 本発明の細胞培養構造体の製造方法は、 凹凸構造を有する細胞培養 構造体の製造方法であって、 ナノインプリント技術を用いて、 加工対象物に 凹凸の幅が 3 U m以下の前記凹凸構造を形成することを特徴とする。
[0013] また、 本発明の別の細胞培養構造体の製造方法は、 凹凸構造を有する細胞 培養構造体の製造方法であって、 ナノインプリント技術を用いて、 加工対象 物に平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複 数連続した前記凹凸構造を形成することを特徴とする。
[0014] この場合、 前記セルは、 平面方向の形状が六角形である方が好ましい。 ま た、 前記セルは、 最大内径は 3 m以下である方が好ましい。 また、 前記セ ル間の幅が 3 m以下である方が好ましい。 また、 前記加工対象物は、 フィ ル厶状である方が好ましい。 また、 前記加工対象物は、 平面方向の面積が細 胞を培養する容器、 例えばマルチウエルプレー卜の底面の面積よりも大きい 方が好ましい。 また、 前記加工対象物は、 ポリスチレン、 ポリイミ ド、 環状 ォレフィン系熱可塑性樹脂、 アクリル樹脂、 酸化アルミニウム、 ガラス、 石 英ガラス、 シリコンのいずれか 1以上により形成されたものである方が好ま しい。
[0015] 本発明のスフエロイ ド付き構造体は、 凹凸の幅が 3 ju m以下の凹凸構造を 有する細胞培養構造体上に、 この細胞培養構造体上で形成されたスフエロイ ドが固定されていることを特徴とする。
[001 6] また、 本発明の別のスフエロィ ド付き構造体は、 平面方向の形状が多角形 であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複数連続した凹凸構造を有する 細胞培養構造体上に、 この細胞培養構造体上で形成されたスフエロイ ドが固 定されていることを特徴とする。 [001 7] また、 本発明の更に別のスフエロィ ド付き構造体は、 凹凸構造上に、 周囲 の単位長さ当たりの仮足の数が 0 . 1本 m以上である細胞から形成され たスフエロイ ドが固定されていることを特徴とする。
[0018] この場合、 前記スフエロィ ドは、 癌細胞から培養されたものである。 また
、 前記スフエロィ ドは、 直径が 1 O ju m以上の大きさである方が好ましい。
[0019] また、 本発明のスフエロィ ド付き構造体の製造方法は、 平面方向の形状が 多角形であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複数連続した凹凸構造を 有する細胞培養構造体上に細胞を播種すると共に培養し、 スフエロィ ドを形 成することを特徴とする。
[0020] また、 本発明のスフエロィ ド付き構造体の製造方法は、 凹凸の幅が 3 m 以下の凹凸構造を有する細胞培養構造体上に細胞を播種すると共に培養し、 スフエロィ ドを形成することを特徴とする。
[0021 ] また、 本発明の細胞培養容器は、 細胞を培養するための細胞培養容器であ つて、 凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造を有することを特徴とする。
[0022] また、 本発明の別の細胞培養容器は、 細胞を培養するための細胞培養容器 であって、 平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 m以下のセ ルを複数連続した凹凸構造を有することを特徴とする。
[0023] また、 本発明の細胞培養容器は、 細胞を培養するための細胞培養容器であ つて、 凹凸構造を有する細胞培養構造体と、 1以上の穴を有すると共に、 前 記細胞培養構造体を底板として結合可能な筒状部材と、 を具備することを特 徴とする。
[0024] また、 本発明の細胞培養容器は、 細胞を培養するための細胞培養容器であ つて、 凹凸構造を有する細胞培養構造体と、 1以上の穴を有する筒状部材と 、 前記細胞培養構造体を前記筒状部材と共に挟持する底板と、 を具備するこ とを特徴とする。
[0025] また、 本発明の細胞培養容器は、 凹凸構造を有する細胞培養構造体を組み 込んで細胞を培養するための細胞培養容器であって、 1以上の穴を有する筒 状部材と、 前記細胞培養構造体を前記筒状部材と共に挟持する底板と、 を具 備することを特徴とする。
[0026] この場合、 前記細胞培養構造体は、 凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造を有 する方が好ましい。 また、 前記細胞培養構造体は、 平面方向の形状が多角形 であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複数連続した凹凸構造を有する 方が好ましい。 また、 前記筒状部材と前記細胞培養構造体との間を密封する シール部材を具備する方が好ましい。 また、 前記セルは、 平面方向の形状が 六角形である方が好ましい。 前記セルの最大内径は 3 m以下である方が好 ましい。 また、 前記セル間の幅が 3 ju m以下である方が好ましい。
[0027] また、 本発明の細胞培養容器の製造方法は、 細胞を培養するための容器に 、 上述した本発明の細胞培養構造体を固着することを特徴とする。
[0028] また、 本発明の別の細胞培養容器の製造方法は、 細胞を培養するための容 器に、 凹凸の幅が 3 ju m以下の凹凸構造を形成することを特徴とする。
[0029] また、 本発明の細胞培養容器の製造方法は、 細胞を培養するための容器に 、 平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 m以下のセルを複数 連続した凹凸構造を有する細胞培養構造体を形成することを特徴とする。
[0030] また、 本発明の細胞培養容器の製造方法は、 凹凸構造を有する細胞培養構 造体と、 1以上の穴を有する筒状部材と、 を嵌合することを特徴とする。
[0031 ] また、 本発明の細胞培養容器の製造方法は、 凹凸構造を有する細胞培養構 造体を、 1以上の穴を有する筒状部材と、 前記筒状部材の底部に配置される 底板とで挟み込んで嵌合することを特徴とする。
[0032] この場合、 前記筒状部材と前記細胞培養構造体との間にシール部材を配置 する方が好ましい。 また、 前記細胞培養構造体は、 本発明の細胞培養構造体 である方が好ましい。 また、 前記凹凸構造は、 ナノインプリント技術を用い て形成する方が好ましい。
[0033] 本発明のスフエロイ ド付き容器は、 上述した本発明の細胞培養容器に、 こ の細胞培養容器内で培養したスフエロィ ドが固定されていることを特徴とす る。
[0034] 本発明のスフエロィ ド付き容器の製造方法は、 上述した本発明の細胞培養 構容器内に細胞を播種し培養することを特徴とする。
発明の効果
[0035] 本発明によれば、 微細構造の形状や大きさ、 材質が制御された細胞培養構 造体、 細胞培養容器を製造できるので、 たとえば薬剤のスクリーニング評価 に適したスフエロィ ドを簡単かつ短時間、 更に低コストで培養することがで さる。
図面の簡単な説明
[0036] [図 1]本発明の凹凸構造を示す説明図である。
[図 2]本発明の微細加工装置を示す概略正面図である。
[図 3]膜厚 4 Ojumのフィルムに形成した本発明のハニカム構造を有する細胞 培養構造体の S EM写真である。
[図 4]膜厚 4 Ojumのフィルムに形成した本発明のハニカム構造を有する細胞 培養構造体の S EM写真である。
[図 5]膜厚 1 0 OjUmのフィルムに形成した本発明のハニカム構造を有する細 胞培養構造体の S EM写真である。
[図 6]膜厚 1 0 OjUmのフィルムに形成した本発明のハニカム構造を有する細 胞培養構造体の S EM写真である。
[図 7]本発明の細胞培養容器を示す平面図である。
[図 8]図 1 0の I _ I線矢印方向から見た断面図である。
[図 9]本発明の別の細胞培養容器を示す断面図である。
[図 10]本発明の更に別の細胞培養容器を示す断面図である。
[図 11]本発明の更に別の細胞培養容器を示す断面図である。
[図 12]本発明の細胞培養構造体上で培養したヒトグリォーマ由来の細胞株 U
251細胞で形成されたスフエロイ ドの S EM写真である。
[図 13]本発明のスフエロィ ドと単層細胞の H I F— 1 ひ、 P— AMPKを比 較するウェスタンプロッティング像を示す写真である。
[図 14]本発明の細胞培養構造体の平板効率とスフエロィ ド生成率の関係を示 す表である。 [図 15]本発明の細胞培養構造体上で培養したヒト頭頸部由来の細胞株 S Q 2 O B細胞で形成されたスフエロイ ドの光学顕微鏡写真 （倍率 1 0 0倍） であ る。
[図 16]本発明の細胞培養構造体上で培養したヒト大腸癌由来の細胞株 S W 4 8 0細胞で形成されたスフエロイ ドの光学顕微鏡写真 （倍率 2 0 0倍） であ る。
[図 17]本発明の細胞培養構造体上で培養したヒト大腸癌由来の細胞株 H T 2 9細胞で形成されたスフエロイ ドの光学顕微鏡写真 （倍率 4 0倍） である。
[図 18]凹凸構造の凹凸の幅と仮足の数との関係を示すグラフである。
符号の説明
[0037] 1 0 0 型
2 0 0 加工対象物
2 0 1 多角形
2 0 2 線
2 0 3 溝
2 1 0 細胞培養容器
2 1 1 穴
2 1 2 筒状部材
2 1 3 基板
2 1 5 シール部材
2 2 0 細胞培養構造体
発明を実施するための最良の形態
[0038] 以下に、 本発明の実施の形態を図 1ないし図 1 4に基づいて詳細に説明す る。
< 1 >細胞培養構造体
本発明の細胞培養構造体は、 凹凸の幅が 3 u m以下の凹凸構造を有するも のである。
[0039] このように、 凹凸の幅を 3 ju m以下にすることで、 実施例 5に記載のよう に、 平板効率が同素材からなる平滑の細胞培養基材と比して高い細胞培養構 造体が得られる。 この理由としては、 実施例 1 0に記載のように、 凹凸構造 の幅が小さくなる程、 播種された細胞は多くの仮足を成長させるようになり 、 細胞培養構造体への接着性が向上するためであると考えられる。 ここで仮 足とは、 細胞質の一時的な突出で、 細胞の接着や遊走に際して形成されるも のである。 仮足は、 ガンの浸潤■転移にも関与している。 運動時には、 細胞 膜付近でァクチンの重合による繊維ができ、 この繊維がネットワークを形成 することで仮足ができる。
[0040] なお、 凹凸の幅は、 例えば、 3〃m以下、 2〃m以下、 1 〃 m以下、 70 O nm以下、 500 nm以下、 250 n m以下というように、 小さくなるほ ど仮足を成長させることができる点で好ましい。
[0041] また、 凹凸の深さ （加工対象物 200の垂直方向の寸法） は、 1 0 nm以 上、 1 00 nm以上、 200 nm以上、 500 n m以上、 1 m以上、 1 0 m以上、 1 0 O m以上等種々の大きさに形成される。 また、 この凹凸の アスペクト比としては、 0. 2以上、 0. 5以上、 1以上、 2以上等種々の ものがある。
[0042] また、 凹凸構造は、 図 1に示すように、 平面方向の形状が多角形であると 共に最小内径が 3 m以下のセルを複数連続した構造でも良い。 これにより 、 細胞が二次元方向 （平面方向） に広がった単層細胞に成長するのを阻害し 、 三次元状のスフエロイ ドに成長させることができる。 この際、 凹凸構造の 平面方向の形状は正多角形のものが良く、 更に平面方向へ等方的に連続して 形成できる正三角形、 正方形、 正六角形のものが好ましい。 これにより、 等 方的に均一な構造上でスフエロィ ドを成長させることができる。
[0043] また、 セルの最小内径 （好ましくは最大内径） やセル間の線 202の幅は
3 jU m以下、 2 jU m以下、 1 m以下、 700 n m以下、 500 n m以下、 250 nm以下というように、 小さくなるほど仮足を成長させることができ る点で好ましい。
[0044] また、 細胞培養構造体の形状としては、 どのようなものでも良いが、 例え ば、 フイルム状のものや基板状 （プレート状） のものを用いることができる 。 更に、 材質は、 細胞に対し無毒性のものであればどのようなものでも良く 、 例えば 「ポリスチレン」 、 「ポリイミ ド」 、 「環状ォレフィン共重合体 （
C O C ) や環状ォレフィン重合体 （C O P ) 等の環状ォレフィン系熱可塑性 樹脂」 、 「アクリル樹脂」 、 「光硬化性樹脂や熱硬化性樹脂等のその他の樹 脂」 、 「酸化アルミニウム等の金属」 、 「ガラス」 、 「石英ガラス」 、 「シ リコン」 等の材料を用いることができる。 また、 シリコンやガラス等からな る基板本体の表面に、 「樹脂」 、 「フォトレジスト」 、 「酸化アルミニウム などの金属」 等の被覆層が形成されたものを用いることもできる。
[0045] なお、 フィルム状とは、 その厚さが、 少なくとも 1 m m以下のものを指す 。 また、 顕微鏡観察のし易さの観点からは薄い方が好ましく、 5 0 0 ju m以 下、 2 0 0〃 m以下、 1 0 0〃m以下、 5 0〃 m以下、 4 0〃 m以下等、 種 々の厚さのものを用いることができる。
[0046] また、 細胞培養構造体の大きさは、 通常の容器、 例えばシャーレ又はディ ッシュ、 マルチウエルプレート、 フラスコ、 チェンバースライ ドの底面の大 きさ以上に形成される方が好ましい。 例えば、 マルチウエルプレートの場合 には、 縦 7 0 ~ 9 O m m、 横 1 0 0 ~ 1 3 0 m mに形成される方が良い。 ま た、 細胞培養構造体がフイルム状の場合には、 マルチウエルプレートの各穴 の底面の大きさ以上に形成される方が好ましい。 例えば、 9 6穴マルチゥェ ルプレー卜の場合には、 約 7 m m以上に形成する方が良い。
[0047] また、 図 1 ( c ) に示すように、 図 1 ( b ) の隣り合う多角形 2 0 1 (正 方形） 同士の間に溝 2 0 3が形成されているものも含まれる。 この溝により 、 培養時の培地の成分を細胞又はスフエロィ ドの隅々にまで行き渡らせるこ とができる。
[0048] 次に、 このような細胞培養構造体の製造方法について説明する。 細胞培養 構造体の製造方法には、 加工対象物 2 0 0に対し型 1 0 0を押圧して型 1 0 0に形成された微細なパターン （凹凸構造） を転写するナノインプリント技 術を用いることができる。 ナノインプリント技術には、 熱式のインプリント プロセス技術や光式のインプリントプロセス技術等がある。 図 2に熱式のィ ンプリントプロセス技術に用いる加工装置 1を示す。
[0049] 加工装置 1は、 図 2に示すように、 所定のパターンを有する型 1 0 0と加 ェ対象物 2 0 0とを押圧して、 型のパターンを加工対象物 2 0 0に転写する 微細加工装置であって、 型 1 0 0を保持する型保持部 2と、 加工対象物 2 0 0を保持する加工対象物保持部 1 2と、 加工対象物 2 0 0に対する型 1 0 0 の相対的な位置およびその位置を変化させる変位速度を調節可能な変位手段 5と、 加工対象物 2 0 0に対する型 1 0 0の相対的な位置を検出する位置検 出手段 7と、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の圧力を検出する圧力検出 手段 8と、 型 1 0 0を加熱する型加熱手段 3と、 型 1 0 0を冷却する型冷却 手段 4と、 型 1 0 0の温度を検出する型温度検出手段 3 1 と、 加工対象物 2 0 0を加熱する加工対象物加熱手段 1 3と、 加工対象物 2 0 0を冷却する加 ェ対象物冷却手段 1 4と、 加工対象物 2 0 0の温度を検出する加工対象物温 度検出手段 1 3 1 と、 位置検出手段 7、 圧力検出手段 8、 型温度検出手段 3 1および加工対象物温度検出手段 1 3 1の検出情報に基づいて、 変位手段 5 、 型加熱手段 3、 型冷却手段 4、 加工対象物加熱手段 1 3および加工対象物 冷却手段 1 4の作動を制御する制御手段 3 0 0と、 で主に構成される。
[0050] 型 1 0 0の材料は、 加工対象物 2 0 0にその成分が付着することがなけれ ばどのようなものでも良く、 例えば 「ニッケル等の金属」 、 「セラミックス 」 、 「ガラス状カーボン等の炭素素材」 、 「シリコン」 などが用いられる。 また、 型 1 0 0は、 加工対象物 2 0 0に押圧して加工対象物 2 0 0を加工し 得るものであればどのようなものでもよいが、 その一端面 （パターン面 1 0 0 a ) に、 凹凸からなる所定のパターンが形成されている。 このパターンは 、 上述した細胞培養構造体の凹凸構造を反転させたものである。 また、 この パターンは、 そのパターン面 1 0 0 aに精密機械加工を施すことで形成する ことができる。 また、 型 1 0 0の原盤となるシリコン基板等にエッチング等 の半導体微細加工技術によって所定の凹凸を形成した後、 このシリコン基板 等の表面に電気錶造（エレクトロフォーミング)法、 例えばニッケルメツキ法 によって金属メツキを施し、 この金属メツキ層を剥離して、 凹凸からなるパ ターンを形成することもできる。 もちろん型 1 0 0は、 微細パターンが形成 できるものであれば材質やその製造法が特に限定されるものではない。 この パターンの凹凸の幅は、 製造される細胞培養構造体の種類にもよるが、 3 m以下、 2 jU m以下、 1 ju m以下、 7 0 0 n m以下、 5 0 0 n m以下、 2 5 0 n m以下等種々の大きさに形成される。 更に、 この凹凸の深さ （加工対象 物 2 0 0の垂直方向の寸法） は、 1 0 n m以上、 1 0 0 n m以上、 2 0 0 η m以上、 5 0 0 n m以上、 1 〃 m以上、 1 0〃 m以上、 1 0 0〃 m以上等種 々の大きさに形成される。 また、 この凹凸のアスペクト比としては、 0 . 2 以上、 0 . 5以上、 1以上、 2以上等種々のものがある。 更に、 このパター ンが占める領域は、 9 0 0 m m 2以上、 更に好ましくは 2 5 0 0 m m 2以上の 大きさが良い。 なお、 この型は、 成型中に加熱■冷却されるため、 できる限 リ薄型化し、 その熱容量を小さくする方が好ましい。
[0051 ] 型保持部 2は、 図 2に示すように、 型 1 0 0を保持する型保持面 2 aに、 ねじゃクランプ金具等の締結具で型 1 0 0を面接触するように固定可能に形 成される。 なお、 型保持部 2の構造は、 型 1 0 0を型保持面 2 a上に保持す るものであればどのようなものでも良く、 例えば、 型保持面 2 aに静電吸着 や真空吸着により吸着保持する構造とすることも可能である。
[0052] また、 型保持部 2には、 型 1 0 0を加熱するための型加熱手段 3、 例えば 非常に応答性の良いカーボンヒータを備えている。 カーボンヒータは、 制御 手段 3 0 0によって図示しない電源からの電流供給を制御されており、 型 1 0 0を所定の一定温度に維持することができる。 なお、 ヒータとしては、 例 えば、 伝熱ヒータやセラミックヒータ、 ハロゲンヒータ、 I Hヒータ等を用 いることも可能である。
[0053] また、 型保持部 2には、 型 1 0 0を冷却する型冷却手段 4が設けられてい る。 型冷却手段 4としては、 例えばアルミニウムや銅等の熱伝導性の高い金 属で形成された型保持部 2の内部に水や油等の冷却液、 空気や不活性ガス等 の冷却気体を流すことで、 型 1 0 0を冷却することができる冷却流路を用い ることができる。
[0054] また、 型保持部 2には、 型 1 0 0の温度を検出する型温度検出手段 3 1、 例えば熱電対が設けられている。 また、 型温度検出手段 3 1は、 制御手段 3 0 0に電気的に接続されており、 検出した型 1 0 0の温度に関する情報を制 御手段 3 0 0に伝達するように形成されている。
[0055] 加工対象物保持部 1 2は、 図 2に示すように、 加工対象物 2 0 0を略水平 状態に保持するものであり、 上面に加工対象物保持面 1 2 aを有した保持ス 亍ージを備えている。
[0056] この保持ステージには、 加工対象物保持面 1 2 aに多数のバキューム孔（図 示せず)が形成されており、 このバキューム孔に図示しない負圧源から負圧を 作用させることで、 加工対象物保持面 1 2 a上に、 加工対象物 2 0 0を吸着 保持できる構成となっている。 なお、 加工対象物保持部 1 2の構造は、 加工 対象物 2 0 0を加工対象物保持面 1 2 aに保持するものであればどのような ものでも良く、 例えば、 クランプ金具等の締結具で加工対象物保持面 1 2 a に固定したり、 静電吸着で吸着保持したりする構造とすることも勿論可能で める。
[0057] また、 保持ステージの下部には保持した加工対象物 2 0 0を加熱するため の加工対象物加熱手段 1 3、 例えば非常に応答性の良いカーボンヒータを備 えている。 カーボンヒータは、 制御手段 3 0 0によって図示しない電源から の電流供給を制御されており、 保持ステージ上の加工対象物 2 0 0を所定の —定温度に維持することができる。 なお、 ヒータとしては、 例えば、 伝熱ヒ ータゃセラミックヒータ、 ハロゲンヒータ、 I Hヒータ等を用いることも可 能である。
[0058] また、 加工対象物保持部 1 2には、 加工対象物 2 0 0を冷却する加工対象 物冷却手段 1 4を設けることも可能である。 加工対象物冷却手段 1 4として は、 例えばアルミニウムや銅等の熱伝導性の高い金属で形成された加工対象 物保持部 1 2の内部に水や油等の冷却液、 空気や不活性ガス等の冷却気体を 流すことで、 加工対象物 2 0 0を冷却することができる冷却流路を用いるこ とができる。
[0059] また、 加工対象物保持部 1 2には、 加工対象物 2 0 0の温度を検出する加 ェ対象物温度検出手段 1 3 1、 例えば熱電対が設けられている。 また、 加工 対象物温度検出手段 1 3 1は、 制御手段 3 0 0に電気的に接続されており、 検出した加工対象物 2 0 0の温度に関する情報を制御手段 3 0 0に伝達する ように形成されている。
[0060] 変位手段 5は、 図 2に示すように、 例えば、 垂直方向に配置されたボール ネジ 5 1 と、 このボールネジ 5 1を回転駆動させる電気モータ 5 2とから構 成されている。 また、 ボールネジ 5 1の下端部と型保持部 2の上面は、 押圧 部 5 3、 ベアリング機構 5 4を介して連結されている。 そして、 ボールネジ 5 1を電気モータ 5 2で回転駆動することで、 基台 5 0と上部ベース 5 5と の間に設けられた複数例えば 4本の支柱 5 6に対し、 押圧部 5 3を型 1 0 0 と加工対象物 2 0 0の接離方向 （以下、 Z方向と称する） に変位させること ができる。 なお、 電気モータ 5 2としては、 直流モータ、 交流モータ、 ステ ッビングモータ、 サーポモータ等、 種々のものを用いることができる。 ここ で、 変位手段 5は、 加工対象物 2 0 0に対する型 1 0 0の位置を、 型 1 0 0 のパターンの深さ以下の変位量で調節できる方が好ましい。 具体的には、 変 位量を 1 0 0 m以下で調節することができるものが良く、 好ましくは 1 0 U m以下、 更に好ましくは 1 m以下、 更に好ましくは 1 0 0 n m以下、 更 に好ましくは 1 O n m以下、 更に好ましくは 1 n m以下で調節できるものが 好ましい。
[0061 ] また、 変位手段 5は、 加工対象物 2 0 0に対する型 1 0 0の変位速度を調 節できるものが好ましい。 具体的には、 1 0 O jU mZ秒以下で調節できるも のが良く、 好ましくは 1 0 秒以下、 更に好ましくは 1 秒以下、 更に好ましくは 1 0 0 n 秒以下、 更に好ましくは 1 O n 秒以下、 更 に好ましくは 1 n mZ秒以下で調節できるものが良い。 なぜなら、 制御手段 3 0 0は、 圧力検出手段 8が検出した情報に基づいて変位手段 5の作動を制 御し、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の圧力を調節しているが、 圧力検 出手段 8が検出した情報を変位手段 5にフィードバックするには、 多少の時 間が掛かる。 したがって、 変位速度が大き過ぎると圧力検出手段 8が検出し た情報を変位手段 5にフィードバックするのが遅れ、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の実際の圧力を正確に制御することができなくなるからである
[0062] なお、 ここでは、 変位手段 5を型保持部 2側に設ける場合について説明し たが、 加工対象物保持部 1 2側に設けることも勿論可能である。 また、 変位 手段 5としては、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との相対的な変位量や変位速 度を調節できるものであれば、 ボールねじと電気モータにより構成されるも のに限られず、 例えば、 電圧を調節して大きさ （寸法） を変化させることが できる圧電素子や磁界を調節して大きさ （寸法） を変化させることができる 磁歪素子を用いることもできる。 また、 ボールねじおよび電気モータと圧電 素子又は磁歪素子の両方を用いることも勿論可能である。 この場合には、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0を大きく変位させる際に、 ポールねじおよび電気 モータを適用し、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0を微小量変位させる際に、 圧 電素子又は磁歪素子を用いることができる。 更に、 油圧式のものや空圧式の もの等を用いることも勿論可能である。
[0063] 変位手段 5をこのように構成することによって、 型 1 0 0を保持する型保 持部 2を上下し、 加工対象物保持部 1 2に保持される加工対象物 2 0 0に対 し、 型 1 0 0のパターン面 1 0 0 aを精密に近接■押圧及び離間することが できる。
[0064] 位置検出手段 7は、 例えば、 型保持部 2に配置されたリニアスケールによ り形成される。 このリニアスケールを用いて、 加工対象物 2 0 0と型保持部 2との距離を測定し、 その値から加工対象物 2 0 0に対する型 1 0 0の相対 的な位置や変位速度を計算して検出することができる。 また、 位置検出手段 7は、 制御手段 3 0 0に電気的に接続されており、 検出した型 1 0 0の位置 や変位速度に関する情報を伝達するように形成されている。 なお、 位置検出 手段 7としては、 リニアスケールに限らず種々のものを用いることができ、 例えば、 型保持部 2側に設けられたレーザー測長機を用いて、 加工対象物 2 0 0の位置を測定するか、 加工対象物保持部 1 2側に設けられたレーザー測 長機を用いて、 型 1 0 0の位置を測定すればよい。 また、 電気モータに設け られたエンコーダを用いて、 変位手段 5の変位量から計算により測定するも のでもよい。 なお、 位置検出手段 7の分解能は、 少なくとも型 1 0 0のバタ ーンの深さ方向 （Z方向） の大きさ以下、 あるいは、 変位手段 5が調節でき る変位量以下の値で検出できるものが好ましい。 具体的には、 1 O O jU m以 下で検出することができるものが良く、 好ましくは 1 O jU m以下、 更に好ま しくは 1 m以下、 更に好ましくは 1 0 0 n m以下、 更に好ましくは 1 O n m以下、 更に好ましくは 1 n m以下で検出することができるものが好ましい
[0065] 位置検出手段 7をこのように構成することによって、 パターンの大きさや 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の圧力に応じて、 加工対象物 2 0 0に対 する型 1 0 0のパターン面 1 0 0 aの位置を精密に調節することができるの で、 パターンの転写性および離型性を向上することができる。
[0066] 圧力検出手段 8は、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の圧力を検出する もので、 例えば、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の荷重を測定するロー ドセルを用いることができる。 これにより、 荷重を測定し、 型 1 0 0のバタ ーン面 1 0 0 aの面積で割れば型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の圧力を 検出することができる。 また、 圧力検出手段 8は、 制御手段 3 0 0に電気的 に接続されており、 検出した圧力に関する情報を伝達するように形成されて いる。
[0067] 制御手段 3 0 0は、 位置検出手段 7、 圧力検出手段 8、 型温度検出手段 3
1および加工対象物温度検出手段 1 3 1の検出情報に基づいて、 変位手段 5 、 押圧手段 6、 型加熱手段 3、 型冷却手段 4、 加工対象物加熱手段 1 3およ び加工対象物冷却手段 1 4の作動を制御するもので、 例えばコンピュータを 用いることができる。
[0068] ここで、 調節する変位速度は、 加工対象物 2 0 0の材料や温度等にもよる 力 例えば、 1 0 0 秒以下で調節するのが良く、 好ましくは 1 0 m 秒以下、 更に好ましくは 1 UL 秒以下、 更に好ましくは 1 0 0 n 秒 以下、 更に好ましくは 1 O n 秒以下、 更に好ましくは 1 n 秒以下で 調節するのが良い。 これにより、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0の間の実際の 圧力を確実に予め設定した所定値以下に調節することができる。 なお、 圧力 検出手段 8の情報に基づいて型加熱手段 3および加工対象物加熱手段 1 3の 少なくともいずれか一方を制御し、 加工対象物 2 0 0の成型面 2 0 0 aの温 度を変化させて、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0との間の圧力を調節すること も可能である。
[0069] この加工装置 1を用いた細胞培養構造体の製造方法は以下の通りである。
[0070] まず、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0は、 成型するための所定の温度に加熱 される。 ここで、 加工対象物 2 0 0が基板等の比較的厚みのあるものの場合 には、 型 1 0 0は加工対象物 2 0 0より高い温度に加熱される方が好ましく 、 更に好ましくは、 型 1 0 0を加工対象物 2 0 0が軟化する軟化温度 （ガラ ス転移点や融点の温度） より高い温度に加熱し、 加工対象物 2 0 0はその軟 化温度 （ガラス転移点や融点の温度） より低い温度に加熱する方が好ましい 。 これにより、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0とを押圧した際に、 型 1 0 0か ら加工対象物 2 0 0に熱が伝達し、 加工対象物 2 0 0の表面近傍のみを軟化 させることができるので、 成型時に加工対象物 2 0 0が潰れる等の問題を回 避することができる。 一方、 加工対象物 2 0 0がフイルムやシートのように 比較的薄いものの場合には、 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0の温度を同じか同 程度の温度に加熱する。 これは、 熱が伝わり易く結局型 1 0 0と加工対象物
2 0 0が同じ温度になるためである。 加熱する温度は、 加工対象物 2 0 0の 材質や型 1 0 0の材質によるが、 例えば、 加工対象物が軟化する軟化温度 （ T g ) + 2 0。C以上、 軟化温度 （T g ) + 2 5。C以上、 軟化温度 （T g ) +
3 0 °C以上等にすれば良い。 勿論、 この温度に限定されるものではない。
[0071 ] 型 1 0 0と加工対象物 2 0 0とを所定温度に加熱した後、 型 1 0 0と加工 対象物 2 0 0とを予め設定した圧力で押圧する。 この際、 型 1 0 0と加工対 象物 200との間の圧力は、 型 1 00のパターンを加工対象物 200に転写 できる大きさの範囲で、 できる限り小さい圧力を用いる方が良い。 具体的に は、 4MP a以下、 好ましくは 2 M P a以下、 更に好ましくは 1. 5 M P a 以下、 更に好ましくは 1 MP a以下、 更に好ましくは、 0. 5MP a以下、 更に好ましくは 0. 25MP a以下にするのが良い。 これにより、 従来より も比較的小さい圧力で押圧するため、 型 1 00と加工対象物 200との間の 密着カを增加させることがなく、 型崩れ等を防止して離型を容易にすること ができる。
[0072] この場合、 加工対象物 200に対する型 1 00の変位速度は、 型 1 00と 加工対象物 200との間の圧力が予め設定した圧力、 例えば 4 M P aを常に 超えないように調節できる速度にする方が良い。 なお、 更に好ましくは、 加 ェ対象物 200に対する型 1 00の変位量を制御して押圧する方が好ましい
[0073] また、 型 1 00と加工対象物 200とを押圧し、 型 1 00のパターンを加 ェ対象物に転写する際には、 型 1 00と加工対象物 200の雰囲気を真空に する方が好ましい。 この場合、 パターンの転写前に真空雰囲気にすれば良い 力 加工対象物 200の酸化等を考慮すれば、 加工対象物 200の加熱前に 真空雰囲気にする方が好ましい。 真空度としては、 例えば 40 P a以下にす れば良い。
[0074] 次に、 型 1 00と加工対象物 200とを接触させたまま、 型 1 00と加工 対象物 200を冷却し、 加工対象物 200の温度をガラス転移温度 （または 軟化温度） 以下にする。 例えば、 冷却温度を軟化温度 （T g) _5°C以下、 軟化温度 （T g) _45°C以下、 軟化温度 （T g) _90°C以下等にすれば 良い。 勿論、 この温度に限定されるものではない。 また、 型 1 00と加工対 象物 200との間の圧力を保持したままで冷却しても良いし、 ゼロ近傍まで 減圧した後に冷却しても良い。
[0075] 最後に、 型 1 00と加工対象物 200とを離型して、 微細加工方法のプロ セスを終了する。 [0076] なお、 この場合、 転写されたパターンが形成されている加工対象物上の領 域は、 大きい方が好ましく、 例えば、 9 OOmm 2以上、 更に好ましくは 25 00mm2以上の大きさが良い。
[0077] これにより、 精密に形状を制御された、 非常に安価で、 大量生産に向く細 胞培養構造体、 すなわち、 凹凸の幅が 3 jum以下の凹凸構造を有する細胞培 養構造体を製造することができる。
[0078] なお、 細胞培養構造体の製造方法は、 ナノインプリント技術以外の方法を 用いても良く、 例えば、 ブラストやコロナ放電、 エッチング等の他の方法に より表面に凹凸構造を形成するようにしても良い。 この場合、 細胞培養構造 体は、 凹凸の幅を 3 jum以下に形成する方が良く、 好ましくは、 2jum以下 、 1 〃m以下、 700 nm以下、 500 n m以下、 250 n m以下に形成さ れる。
[0079] また、 この場合にも、 細胞培養構造体の大きさは、 通常の容器、 例えばシ ヤーレ又はディッシュ、 マルチウエルプレート、 フラスコ、 チェンバースラ ィ ドの底面の大きさ以上に形成される方が好ましい。 例えば、 マルチウエル プレー卜の場合には、 縦 70~9 Omm、 横 1 00~ 1 3 Ommに形成され る方が良い。 また、 細胞培養構造体がシート又はフイルム状の場合には、 マ ルチウエルプレー卜の各穴の底面の大きさ以上に形成される方が好ましい。 例えば、 96穴マルチウヱルプレー卜の場合には、 約 7 mm以上に形成する 方が良い。
< 2 >細胞培養容器
本発明の細胞培養容器 21 0は、 細胞を培養するための容器であって、 容 器内に凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造が形成されているものである。
[0080] 容器としては、 細胞を培養できるものであればどのようなものでも良く、 例えば、 培養用のシャーレ又はディッシュ、 マルチウエルプレート、 フラス コ、 チヱンバースライ ド等がある。
[0081] 凹凸構造は、 例えば、 容器内の少なくとも一部に上述した本発明の細胞培 養構造体を固着して形成すれば良い。 [0082] また、 細胞培養容器がシャーレやマルチウヱルプレートである場合には、 例えば、 図 7、 図 8に示すように、 1以上の穴 2 1 1を有する筒状部材 2 1 2と、 プレート状の上述した細胞培養構造体 2 2 0と、 で構成するか、 ある いは、 図 9に示すように、 1以上の穴 2 1 1を有する筒状部材 2 1 2と、 シ 一ト又はフィルム状の上述した細胞培養構造体 2 2 0と、 この細胞培養構造 体 2 2 0を筒状部材 2 1 2との間に挟み込んで一体化する基板 2 1 3と、 で 構成すれば良い。
[0083] この一体化する方法としては、 種々の方法を用いることができるが、 例え ば、 無毒性の接着剤を用いて接合したり、 熱融着で接合、 或いは吸着やねじ による螺合により接合したりすることができる。
[0084] 無毒性接着剤には、 ァロンアルファ （商標名） 等があり、 少なくとも筒状 部材 2 1 2と細胞培養構造体 2 2 0の間を密封するように接合すれば良い。
[0085] 熱融着の場合は、 少なくとも筒状部材 2 1 2又は細胞培養構造体 2 2 0を ガラス転移温度又は融点近くまで加熱して接合する。 例えば、 超音波による 振動エネルギーを摩擦熱に変換し、 少なくとも筒状部材 2 1 2又は細胞培養 構造体 2 2 0のいずれか一方をガラス転移温度又は融点まで加熱する超音波 溶着を用いて接合すれば良い。
[0086] また、 通常のシャーレやマルチウエルプレートの容器内に、 所定のパター ンが形成された型を押圧して、 容器内の底面等に上述した細胞培養構造体と 同様のパターンを転写するようにしても良い。 この場合、 型としては、 容器 の穴 2 1 1の大きさよりわずかに小さいハンコ状のものを用い、 型を容器の 穴の上を移動しながら穴の中に挿入してパターンを成型するか、 あるいは、 このハンコ状の型を複数並べて複数の穴の中に挿入し、 一括でパターンを成 型すれば良い。 もちろん、 上述したブラストやコロナ放電、 エッチング等の 他の技術を用いて凹凸構造を形成することも可能である。
[0087] また、 図 1 0、 図 1 1に示すように、 筒状部材 2 1 2と細胞培養構造体 2 2 0との間には、 これらの間を密封するシール部材 2 1 5、 例えばシリコン ゴム等からなるガスケットを配置する方が好ましい。 このガスケットは、 筒 状部材 2 1 2又は細胞培養構造体 2 2 0にシリコンゴム等を塗布して一体に 形成されるものでも勿論構わない。
< 3 >スフヱロイ ド付き構造体、 スフヱロイ ド付き容器
次に、 細胞培養構造体上又は細胞培養容器上で培養したスフエロィ ドを有 するスフエロィ ド付き構造体、 スフエロィ ド付き容器について説明する。
[0088] 上述した細胞培養構造体又は細胞培養容器上にスフエロィ ドにする細胞を 播種し、 培養することで細胞は、 ***を繰り返し、 三次元立体状のスフエロ ィ ドとなる。
[0089] ここで使用する細胞としては、 間葉系細胞、 肝細胞、 繊維芽細胞、 内皮細 胞、 神経細胞、 心筋細胞、 グリア細胞、 角膜上皮細胞、 軟骨細胞、 骨芽細胞 、 脂肪細胞等の正常な細胞や、 癌細胞由来細胞株 （例えば、 HepG2、 HuH-7) や、 ィモータライズ （不死化） された細胞 （例えば、 HHY41、 NKNT- 3、 Fa2N- 4 株等） 、 や染色体異常を有する細胞等の異常な細胞を用いることができる。 培養に使用する培地は、 かかる目的の細胞の種別に応じて当業者であれば適 宜調製して使用することができる。 なお、 本発明の細胞培養構造体および細 胞培養容器は、 いずれもその表面に細胞が固着する構造を有するため、 培養 により生じたスフエロィ ドはかかる構造体又は容器上に固着して形成される 。 この理由は、 本発明の細胞培養構造体上では、 非常に多くの仮足が成長し 、 凹凸構造にしっかりとした足場を作るためであると考えられる。 ここで、 本発明の細胞培養構造体上に単細胞を播種すると共に 8時間培養すると、 細 胞の周囲に、 周囲の単位長さ当たり 0 . 1本 m以上の仮足が形成される 。 従って、 スフエロィ ド形成のための培養に際する培地交換は、 通常の培養 と同様の手法で可能であり、 培地交換を行いながらスフエロィ ドを容易に形 成できる。
[0090] スフエロイ ドの大きさとしては、 1 O ju m以上あれば良いが、 好ましくは
1 5〜 5 0 mが良く、 更に好ましくは 2 0〜4 0 mが良く、 更に好まし くは 2 5〜3 5 ju mである方が良いが、 スフエロィ ドを使用する目的に応じ て培地交換と培養を繰り返してより大きなスフエロィ ドを形成することも可 能である。 なお、 本発明における 「スフエロイ ドの大きさ」 は、 細胞培養構 造体又は細胞培養容器と平行の平面上における長径を指称し、 光学顕微鏡観 察又は電子顕微鏡観察により正確に測定することができる。
[0091 ] このような方法により得られるスフエロィ ドは、 主に、 単一の細胞が*** することで生じたクローン細胞によって構成される。 通常、 生体内にできる 癌細胞は、 従来技術のスフエロィ ド （特許文献 1に記載のスフエロィ ド） の ように複数の細胞が凝集してなるものではなく、 単一細胞が***して形成さ れるため、 本発明では、 生体内にできる癌細胞に、 より近い性質のスフエロ ィ ドを培養することができ、 より確度の高いスクリーニングを行うことがで さる。
[0092] また、 かかるスフエロィ ドは生体内に存在する組織と様々な点で共通した 性質を有しており、 単層培養と比して、 より生体内の組織環境を再現してい る。
[0093] また、 本発明により得られるスフエロィ ドは、 様々な材質に人為的に制御 された微細構造上で培養されることにより、 この微細構造が形成された固相 への固着面積が制御される。 すなわち、 その固着面積を、 スフエロィ ドの全 表面積の 5 0 %未満、 好ましくは 4 0 %未満、 更に好ましくは 3 0 %未満に 調整することが可能である。
[0094] また、 このように固相へ固着したスフエロイ ドは、 従来の非固着型スフエ ロイ ド （ァガロースゲル内で成型されたスフエロイ ドゃフラスコ内で培地を 流動させて成型させたスフエロイ ド） と比して、 細胞外基質に対する細胞接 着因子、 細胞接着タンパク質又は細胞骨格タンパク質を強く発現しているこ とが好ましい。 かかる細胞接着因子■細胞接着タンパク質■細胞骨格タンパ ク質としては、 たとえばインテグリン、 カドヘリン、 ァクチンが例示される 。 これらはいずれも細胞接着に密接に関連していることが知られている。 生 体内の組織や腫瘍は、 その三次元構造を維持すべくかかる因子■タンパク質 を発現しているため、 これらを発現しているスフエロィ ドは特に生体内にお ける組織や腫瘍の特性を維持しているといえる。 本発明により得られるスフ ェロイ ドはかかる因子■タンパク質を、 従来のスフエロィ ドと比して強く発 現している。 これらの因子■タンパク質の発現量は、 たとえばこれらの因子 ■タンパク質に対する特異的結合対 （抗体、 レセプター、 レクチンなど当業 者であれば適宜選択して使用することができる） を利用した免疫染色、 ゥェ スタンプロッテイングなどで確認することができる。
[0095] 例えば、 ァクチンの測定は下記の方法によって行うことができる。
スフエロィ ドを形成する培養細胞を固定し、 界面活性剤等で処理を行い、 細胞を溶解させ、 更に BSA (Bov i ne serum a l ubum i n) 等でブロッキングする 。 この様にして調整したサンプルに、 抗ァクチン抗体等を結合させて、 結合 した抗体に対して例えば蛍光物質等の標識物質でラベルした二次抗体等を結 合させ、 この標識物質等を検出、 定量することでァクチンを測定できる。
[0096] また、 さらに本発明により得られるスフエロイ ドは、 たとえば酸素の欠乏 や、 栄養の不足といった腫瘍や組織と同様の環境を実現している。 このこと は、 たとえば酸素が不足した状態で発現するタンパク質 （たとえば H I F - 1 ひタンパク質等） の高発現 （タンパク質量で単層培養時の 1 . 5倍以上、 好ましくは 2倍以上の発現） や、 栄養が不足した状態で観察される現象 （た とえば A M P Kのリン酸化亢進等：たとえば A M P Kのリン酸化亢進であれ ば単層培養時の 1 . 5倍以上、 好ましくは 2倍以上、 より好ましくは 2 . 5 倍以上の亢進） を確認できることで裏付けられる。 これらはそれぞれに対す る特異的結合対 （抗体やレセプターなど） を使用したウェスタンプロット、 免疫染色などにより当業者であれば適宜観察することができる。
[0097] このようにして製造された本発明により得られるスフヱロイ ドは、 薬剤の スクリーニングのために使用することができる。 すなわち、 細胞培養基材又 は細胞培養容器に固着したスフエロィ ドに対して、 化学物質、 薬剤等を添加 し、 スフエロィ ドを形成する細胞に対して何らかの効果を有するものをスク リーニングすることができる。
[0098] また、 本発明のスフエロィ ドは、 疾病の悪性度鑑別のために使用すること もできる。 すなわち、 生体から採取した組織片ゃ腫瘍片を、 細胞毎に分散さ せた後、 本発明のスフエロィ ドとする課程において増殖能の評価を行ったり 、 或いはかかるスフエロィ ドからの遊離細胞の有無を評価することにより癌 転移能の評価をすることができる。
[0099] また、 本発明のスフエロィ ドは、 再生医療のために使用することもできる 。 すなわち、 健常な組織より採取した細胞より本発明のスフエロィ ドを調製 し、 かかるスフエロィ ドを患者や治療を要する動物の該当組織に直接的又は 間接的に注入することで、 該当組織の機能の維持■再生に使用することがで さる。
[0100] また、 本発明のスフエロィ ドは、 食品機能評価のために使用することもで きる。 すなわち、 細胞培養基材又は細胞培養容器に固着したスフエロィ ドに 対して、 機能性食品、 食品中の活性成分等を添加し、 スフエロィ ドを形成す る細胞に対して何らかの効果を有するものをスクリーニングすることができ る。
[0101 ] また、 本発明のスフエロィ ドは、 食品又は薬剤の安全性評価のために使用 することもできる。 すなわち、 細胞培養基材又は細胞培養容器に固着したス フエロイ ドに対して、 食品■薬剤等を添加し、 スフエロイ ドを形成する細胞 の形態的■生化学的変化を検証することで、 これらの物質の安全性評価をす ることができる。
[0102] 以下、 本発明を実施例により、 より具体的に説明するが、 本発明は実施例 に限定されるものではない。
実施例 1
[0103] 加工対象物としては、 ガラス転移温度 {軟化温度 （T g ) } が 1 3 6 °Cの シクロォレフインポリマーからなる膜厚 4 0 mおよび 1 0 0〃 mの透明な フィルム （日本ゼオン株式会社製： Z F 1 4 ) を用いた。
[0104] なお、 微細成型の評価には、 SC I VAX社製の微細成型装置 （VX-2000N-US) を 使用した。 金型は、 加工対象物に転写した際に、 ラインアンドスペースから なる凹凸構造を転写可能なパターンを有するものと、 正六角形のハニカム構 造を転写可能なパターン （ハニカム構造を反転させたパターン） を有するも のの二つを用いた。 また、 この金型は、 ニッケル製のもので、 転写可能領域 力《5 Omm X 5 Omm (金型の外形は 55 mm X 55 mm) ：面積が 250 0mm2の正方形であるものを用いた。 ラインアンドスペースからなる凹凸構 造は、 凹凸の深さが 1 〃 で、 凹凸の幅が、 1 0〃m、 5〃m、 4〃 m、 3 U 2〃m、 1 U 7 00 n m、 500 n mの 8種類の領域が形成され ているものとした。 また、 ハニカム構造は、 線幅が 250 n mでこの線の高 さが 3 80 n m (アスペクト比が約 1 . 5) 、 一つのセル （六角形） の最大 内径が 2 ju m (すなわち、 線幅も含めた最大外径が 2. 5 μ νη) とした。
[0105] 加工対象物をシリコン基板上に載置した後、 ガラス転移温度 {軟化温度 （ T g) } + 25°C ( 1 6 1 °C) に加熱し、 ガラス転移温度 {軟化温度 （T g ) } + 25°C ( 1 6 1 °C) に加熱した金型を 5 jU mZ秒の速度で該フィルム 表面に押し付け、 金型上部に取り付けた荷重センサーが 4500 N (圧力が 約 1 . 5M p a) に達したところで、 その荷重で 600秒間保持した。
[0106] その後、 膜厚 40 mのフイルムに対しては、 金型の圧力を一定に保持し ながら、 ガラス転移温度 欠化温度 （T g) } -46°C (90°C) まで冷却 し、 冷却完了後、 金型を 1 O mZ秒の速度でフイルムから離型した。 走査 型電子顕微鏡 （S EM) で観察したところ、 転写領域全面に伸びや剥離の無 い均一で良好な凹凸構造 （ラインアンドスペースおよびハニカム構造） のパ ターンが転写されていた。 ハニカム構造からなるパターンの転写後の平面写 真 （倍率： 1万倍） を図 3に、 斜視方向からの写真 （倍率： 5千倍） を図 4 に示す。
[0107] また、 膜厚が 1 O O jU mのフィルムに対しては、 金型の圧力を一定に保持 しながら、 ガラス転移温度 {軟化温度 （T g) } _ 5°C ( 1 3 1 °C) まで冷 却し、 冷却完了後、 金型を 1 O jU mZ秒の速度でフィルムから離型した。 走 査型電子顕微鏡 （S EM) で観察したところ、 転写領域全面に伸びや剥離の 無い均一で良好なハニカム構造のパターンが転写されていた。 転写後の平面 写真 （倍率： 1万倍） を図 5に、 斜視方向からの写真 （倍率： 2万倍） を図 6に示す。 実施例 2
[0108] 厚さ 3 mmのポリスチレン製プレートを常法のブラストにより表面を粗面 処理し、 凹凸を有するフィルムを作成することができる。
実施例 3
[0109] 膜厚 4 O mのポリスチレン製フイルムを常法のコロナ放電により表面を 粗面処理し、 凹凸を有するフィル厶を作成することができる。
実施例 4
[0110] 実施例 1で製造した厚さ 4 Ojumの細胞培養構造体 （ハニカム構造） を 1 . 5 cm角の大きさに切り取り、 これを直径が 3. 5 cmのシャーレ内に熱 融着により固定して本発明細胞培養容器を調製した。
実施例 5
[0111] 実施例 4で調製した本発明細胞培養容器内にひ一 MEM培地 （1 0%牛胎 児血清、 20mmo I / I H EP ES、 8mmo I / I炭酸水素ナトリウム 、 42000単位 Iペニシリン、 および 0. 03 Iストレブトマイシ ンを含む） 2m I とともにヒトグリオ一マ由来の細胞株 U 251細胞を 1 0 00個播種した。 これを 37°C、 2%C02の雰囲気下で 7日間 （途中、 3日 目と 6日目に培地交換を行った） 培養したところスフヱロイ ドが形成され （ 図 1 2参照） 、 本発明のスフエロィ ド付き構造体が形成された。
[0112] また、 このようにして形成されたスフエロイ ドについて、 ウェスタンプロ ット法により、 H I F— 1 タンパク質の発現量 （抗 H I F- 1ゥサギポリ クローナル抗体を使用：サンタクルーズバイオテック社製） 及び AMP Kの リン酸化 （抗 AMP Kゥサギポリクローナル抗体：セルシグナリングテクノ ロジ一社製） を培養開始 7日後に確認した。 対照としては、 従来のポリスチ レン製培養皿で同様の細胞密度で播種、 培地交換して培養した U 251細胞 を使用した。 この結果を図 1 3に示す。 なお、 ウェスタンプロット法は、 次 の方法により行った。 まず、 培養細胞より抽出した総蛋白質 20 gをプレキヤ ストゲル (ATT0製ポリアクリルアミ ドゲル Gパジヱル）で電気泳動を行った。 電 気泳動後に、 ブロッテイング緩衝液（20 mM G I yc i ne/25mMTr i sHC I /20%Methano I， pH 8.0)で PVDF膜 (ATTO製クリアブロット■ P膜）に転写を行った。 転写後 の PVDF膜を 5%BSA■ TBST (20 mM Tris-HCI/0.15 M NaCI/0.1 % Tween (商標名 ) 20, pH 8.0)溶液でブロッキングを行った後に、 1次抗体を含む 1%BSA■ TBST 溶液中で 1時間インキュベーションした。 TBST溶液で十分に洗浄後、 2次抗体 を含む溶液中で 1時間インキュベーションした。 十分に洗浄後、 化学発光法 (G L/Amersham製 ECLplus)で検出した。
[0113] この結果より、 培養されたスフエロイ ドは、 H I F— 1 タンパク質の発 現量が単層細胞よりも多く、 また、 単層細胞よりも AMP Kのリン酸化が亢 進していることから、 単層細胞よりも生体内の組織に近い性質を示すことが わかる。 このことは、 本発明により得られるスフヱロイ ドが、 薬剤耐性、 毒 性などの試験に有用であることを示している。
[0114] また、 このようにして形成されたスフエロイ ドについて、 ァクチンフイラ メントの測定を行った。 ァクチンフィラメントの測定は、 次の方法により行 つた。 まず、 培養細胞を PBSで 2回洗浄する。 3%Folmaldehyde/PBSで 15分間固 定して PBSで 2回洗浄する。 次に、 0.1%"^ 0^-100/?85で15分間処理を行ぃ BSで 2回洗浄する。 次に、 1%BSA/PBSで 30分間ブロッキングして 2回 PBSで洗 浄する。 次に、 1 g/ml抗マウスァクチンモノクローナル抗体/ 0.1%BSA/PBS中 で 1時間インキュベーション後、 PBSで 3回洗浄する。 次に、 1 g/mlAlexaFI our488/0.1%BSA/PBSで 1時間インキュベーション後、 PBSで 4回洗浄する。 最 後に、 glycerol/PBSで封入し蛍光顕微鏡で観察する。 その結果、 ァクチンフ イラメントの增加を確認できる。
[0115] なお、 上述の本発明スフエロィ ド付き構造体の調製に際し、 平板効率とス フエロイ ド生成率を測定した。 この結果を図 1 4に示す。
[0116] 平板効率は、 単位面積あたりに播種した細胞数に対する培養開始 3曰経過 時に単位面積あたりにコロニーを形成している数の割合 （％) として算出し 、 スフエロィ ド生成率は、 単位面積あたりに播種した細胞数に対する培養開 始 7日経過時に単位面積あたりに形成されたスフエロイ ド数の割合 （％) と して算出した。
実施例 6
[0117] 実施例 4で調製した本発明細胞培養容器内に 一 MEM培地 （1 0%牛胎 児血清、 2 Ommo I I H E P E S、 8 mmo I I炭酸水素ナトリゥム 、 42000単位 Iペニシリン、 および 0. 03 Iストレブトマイシ ンを含む） 2m I とともにヒト頭頸部由来の細胞株 SQ 20 B細胞を 1 00 0個播種した。 これを 37°C、 2%C02の雰囲気下で 7日間 （途中、 3日目 と 6日目に培地交換を行った） 培養したところスフエロイ ドが形成され （図 1 5参照） 、 本発明スフエロィ ド付き構造体が形成された。
[0118] 実施例 4で調製した本発明細胞培養容器内に 一 MEM培地 （1 0%牛胎 児血清、 2 Ommo I I H E P E S、 8 mmo I I炭酸水素ナトリゥム 、 42000単位 Iペニシリン、 および 0. 03 Iストレブトマイシ ンを含む） 2m I とともにヒト大腸癌由来の細胞株 SW480細胞を 1 00 0個播種した。 これを 37°C、 2%C02の雰囲気下で 7日間 （途中、 3日目 と 6日目に培地交換を行った） 培養したところスフヱロイ ドが形成され （図 1 6参照） 、 本発明スフエロィ ド付き構造体が形成された。
実施例 8
[0119] 実施例 4で調製した本発明細胞培養容器内にひ一 MEM培地 （1 0%牛胎 児血清、 20 mmo I / I H EP ES、 8 mmo I / I炭酸水素ナトリウム 、 42000単位 Iペニシリン、 および 0. 03 Iストレブトマイシ ンを含む） 2m I とともにヒト大腸癌由来の細胞株 H T 29細胞を 1 000 個播種した。 これを 37°C、 2%C02の雰囲気下で 7日間 （途中、 3日目と 6日目に培地交換を行った） 培養したところスフヱロイ ドが形成され （図 1 7参照） 、 本発明スフエロィ ド付き構造体が形成された。
実施例 9
[0120] 実施例 1で製造した厚さ 40 mの細胞培養構造体 （ラインアンドスべ一 ス） を 1. 5 cm角の大きさに切り取り、 これを直径が 3. 5 cmのシヤー レ内に熱融着により固定して本発明細胞培養容器を調製した。
実施例 10
[0121] 実施例 9で調製した本発明細胞培養容器内に 一 MEM培地 （1 0%牛胎 児血清、 2 Ommo I I H E P E S、 8 mmo I I炭酸水素ナトリゥム 、 42000単位 Iペニシリン、 および 0. 03 Iストレブトマイシ ンを含む） 2m I とともに正常肝細胞株を 1 000個播種した。 これを 37 °C、 2 %C02の雰囲気下で 8時間培養したところ仮足を有するスフエロィ ド が細胞培養構造体上に形成された。
[0122] また、 このようにして形成されたスフエロイ ドについて、 スフエロイ ドの 周囲の長さと、 スフエロィ ドの周囲に形成されている仮足の数を測定し、 周 囲の単位長さ （1 m) 当たりに対して成長している仮足の本数 （本 m ) を計測した。 この結果を表 1および図 1 8に示す。
[0123] ほ 1]
Figure imgf000030_0001
この結果より、 スフエロイ ドの仮足の数は、 ラインアンドスペースの凹凸 の幅の大きさが 3 m以下になると急激に増加していることがわかる。

Claims

請求の範囲
[I ] 凹凸の幅が 3 ju m以下の凹凸構造を有することを特徴とする細胞培養構造 体。
[2] 平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複数 連続した凹凸構造を有することを特徴とする細胞培養構造体。
[3] 前記セルは、 平面方向の形状が六角形であることを特徴とする請求項 2記 載の細胞培養構造体。
[4] 前記セルは、 最大内径が 3 m以下であることを特徴とする請求項 2記載 の細胞培養構造体。
[5] 前記セル間の幅が 3 m以下であることを特徴とする請求項 2記載の細胞 培養構造体。
[6] フイルム状であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞培養構造体
[7] 平面方向の面積が細胞を培養する容器の底面の面積よりも大きく形成され ていることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞培養構造体。
[8] 平面方向の面積がマルチウエルプレー卜の底面の面積よりも大きく形成さ れていることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞培養構造体。
[9] ポリスチレン、 ポリイミ ド、 アクリル樹脂、 環状ォレフィン系熱可塑性樹 脂、 酸化アルミニウム、 ガラス、 石英ガラス、 シリコンのいずれか 1以上に より形成されていることを特徴とする請求項 1又は 2記載の細胞培養構造体
[1 0] 凹凸構造を有する細胞培養構造体の製造方法であって、
ナノインプリント技術を用いて、 加工対象物に凹凸の幅が 3 ju m以下の前 記凹凸構造を形成することを特徴とする細胞培養構造体の製造方法。
[I I ] 凹凸構造を有する細胞培養構造体の製造方法であって、
ナノインプリント技術を用いて、 加工対象物に平面方向の形状が多角形で あると共に最小内径が 3 m以下のセルを複数連続した前記凹凸構造を形成 することを特徴とする細胞培養構造体の製造方法。 [12] 前記セルは、 平面方向の形状が六角形であることを特徴とする請求項 1 1 記載の細胞培養構造体の製造方法。
[13] 前記セルは、 最大内径は 3 m以下であることを特徴とする請求項 1 1記 載の細胞培養構造体の製造方法。
[14] 前記セル間の幅が 3 ju m以下であることを特徴とする請求項 1 1記載の細 胞培養構造体の製造方法。
[15] 前記加工対象物は、 フィルム状であることを特徴とする請求項 1 0又は 1
1記載の細胞培養構造体の製造方法。
[16] 前記加工対象物は、 平面方向の面積が細胞を培養する容器の底面の面積よ りも大きいことを特徴とする請求項 1 0又は 1 1記載の細胞培養構造体の製 造方法。
[17] 前記加工対象物は、 平面方向の面積がマルチウヱルプレー卜の底面の面積 よりも大きいことを特徴とする請求項 1 0又は 1 1記載の細胞培養構造体の 製造方法。
[18] 前記加工対象物は、 ポリスチレン、 ポリイミ ド、 環状ォレフィン系熱可塑 性樹脂、 アクリル樹脂、 酸化アルミニウム、 ガラス、 石英ガラス、 シリコン のいずれか 1以上により形成されたものであることを特徴とする請求項 1 0 又は 1 1記載の細胞培養構造体の製造方法。
[19] 凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造を有する細胞培養構造体上に、 この細胞 培養構造体上で形成されたスフエロイ ドが固定されていることを特徴とする スフエロィ ド付き構造体。
[20] 平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複数 連続した凹凸構造を有する細胞培養構造体上に、 この細胞培養構造体上で形 成されたスフエロィ ドが固定されていることを特徴とするスフエロィ ド付き 構造体。
[21 ] 凹凸構造上に、 周囲の単位長さ当たりの仮足の数が 0 . 1本/^ m以上で ある細胞から形成されたスフエロイ ドが固定されていることを特徴とするス フエロイ ド付き構造体。 [22] 前記スフエロィ ドは、 癌細胞から培養されたものであることを特徴とする 請求項 1 9ないし 2 1のいずれかに記載のスフエロィ ド付き構造体。
[23] 前記スフエロィ ドは、 直径が 1 O m以上の大きさであることを特徴とす る請求項 1 9ないし 2 1のいずれかに記載のスフエロィ ド付き構造体。
[24] 平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 ju m以下のセルを複数 連続した凹凸構造を有する細胞培養構造体上に細胞を播種すると共に培養し 、 スフエロィ ドを形成することを特徴とするスフエロィ ド付き構造体の製造 方法。
[25] 凹凸の幅が 3 U m以下の凹凸構造を有する細胞培養構造体上に細胞を播種 すると共に培養し、 スフエロィ ドを形成することを特徴とするスフエロィ ド 付き構造体の製造方法。
[26] 細胞を培養するための細胞培養容器であって、
凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造を有することを特徴とする細胞培養容器
[27] 細胞を培養するための細胞培養容器であって、
平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が 3 m以下のセルを複数 連続した凹凸構造を有することを特徴とする細胞培養容器。
[28] 細胞を培養するための細胞培養容器であって、
凹凸構造を有する細胞培養構造体と、
1以上の穴を有すると共に、 前記細胞培養構造体を底板として結合可能な 筒状部材と、
を具備することを特徴とする細胞培養容器。
[29] 細胞を培養するための細胞培養容器であって、
凹凸構造を有する細胞培養構造体と、
1以上の穴を有する筒状部材と、
前記細胞培養構造体を前記筒状部材と共に挟持する底板と、
を具備することを特徴とする細胞培養容器。
[30] 凹凸構造を有する細胞培養構造体を組み込んで細胞を培養するための細胞 培養容器であって、
1以上の穴を有する筒状部材と、
前記細胞培養構造体を前記筒状部材と共に挟持する底板と、
を具備することを特徴とする細胞培養容器。
[31 ] 前記細胞培養構造体は、 凹凸の幅が 3 ju m以下の凹凸構造を有することを 特徴とする請求項 2 8又は 2 9記載の細胞培養容器。
[32] 前記細胞培養構造体は、 平面方向の形状が多角形であると共に最小内径が
3 m以下のセルを複数連続した凹凸構造を有することを特徴とする請求項
2 8又は 2 9記載の細胞培養容器。
[33] 前記筒状部材と前記細胞培養構造体との間を密封するシール部材を具備す ることを特徴とする請求項 2 8ないし 3 0のいずれかに記載の細胞培養容器
[34] 前記セルは、 平面方向の形状が六角形であることを特徴とする請求項 3 2 記載の細胞培養容器。
[35] 前記セルの最大内径は 3 m以下であることを特徴とする請求項 3 2記載 の細胞培養容器。
[36] 前記セル間の幅が 3 m以下であることを特徴とする請求項 3 2記載の細 胞培養容器。
[37] 細胞を培養するための容器に、 請求項 1ないし 6のいずれかに記載の細胞 培養構造体を固着することを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
[38] 細胞を培養するための容器に、 凹凸の幅が 3 m以下の凹凸構造を形成す ることを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
[39] 細胞を培養するための容器に、 平面方向の形状が多角形であると共に最小 内径が 3 ju m以下のセルを複数連続した凹凸構造を有する細胞培養構造体を 形成することを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
[40] 凹凸構造を有する細胞培養構造体と、 1以上の穴を有する筒状部材と、 を 嵌合することを特徴とする細胞培養容器の製造方法。
[41 ] 凹凸構造を有する細胞培養構造体を、 1以上の穴を有する筒状部材と、 前 記筒状部材の底部に配置される底板とで挟み込んで嵌合することを特徴とす る細胞培養容器の製造方法。
[42] 前記筒状部材と前記細胞培養構造体との間にシール部材を配置することを 特徴とする請求項 4 0又は 4 1記載の細胞培養容器の製造方法。
[43] 前記細胞培養構造体は、 請求項 1ないし 6のいずれかに記載の細胞培養構 造体であることを特徴とする請求項 4 0記載の細胞培養容器の製造方法。
[44] 前記細胞培養構造体は、 請求項 1ないし 6のいずれかに記載の細胞培養構 造体であることを特徴とする請求項 4 1記載の細胞培養容器の製造方法。
[45] 前記凹凸構造は、 ナノインプリント技術を用いて形成することを特徴とす る請求項 3 8ないし 4 1のいずれかに記載の細胞培養容器の製造方法。
[46] 請求項 2 6ないし 2 9のいずれかに記載の細胞培養容器に、 この細胞培養 容器内で培養したスフヱロイ ドが固定されていることを特徴とするスフエロ ィ ド付き容器。
[47] 請求項 2 6ないし 2 9のいずれかに記載の細胞培養構容器内に細胞を播種 し培養することを特徴とするスフェロイ ド付き容器の製造方法。
PCT/JP2007/000106 2006-02-21 2007-02-21 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法 WO2007097120A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/280,125 US7727759B2 (en) 2006-02-21 2007-02-21 Structure for cell culture, cell culture vessel, structure with spheroid, vessel with spheroid, and manufacturing methods thereof
KR1020087022920A KR101362293B1 (ko) 2006-02-21 2007-02-21 세포배양구조체, 세포배양용기, 스페로이드를 갖는 구조체,스페로이드를 갖는 용기 및 이들의 제조방법
JP2008501635A JP4159103B2 (ja) 2006-02-21 2007-02-21 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法
EP07713488.0A EP1988152B1 (en) 2006-02-21 2007-02-21 Cell culture construct, cell culture container, construct having spheroid, container having spheroid and method of producing the same

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006043225 2006-02-21
JP2006043224 2006-02-21
JP2006-043225 2006-02-21
JP2006-043224 2006-02-21
JP2006340947 2006-12-19
JP2006-340947 2006-12-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007097120A1 true WO2007097120A1 (ja) 2007-08-30

Family

ID=38437167

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/000107 WO2007097121A1 (ja) 2006-02-21 2007-02-21 スフェロイドおよびスフェロイド群並びにこれらの製造方法
PCT/JP2007/000106 WO2007097120A1 (ja) 2006-02-21 2007-02-21 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2007/000107 WO2007097121A1 (ja) 2006-02-21 2007-02-21 スフェロイドおよびスフェロイド群並びにこれらの製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US7727759B2 (ja)
EP (1) EP1988152B1 (ja)
JP (2) JP5397934B2 (ja)
KR (1) KR101362293B1 (ja)
WO (2) WO2007097121A1 (ja)

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010017128A (ja) * 2008-07-10 2010-01-28 Toyota Central R&D Labs Inc 培養細胞のハンドリング体、その製造方法及びその利用
JP2010022366A (ja) * 2008-06-16 2010-02-04 Scivax Kk スフェロイド作製方法
JP2011019413A (ja) * 2009-07-14 2011-02-03 Scivax Kk 細胞剥離抑制器具及びこれを用いた培養容器、細胞剥離抑制方法
JP2011050295A (ja) * 2009-09-01 2011-03-17 Scivax Kk 細胞培養構造体、細胞培養容器及びこれらの製造方法
WO2013069490A1 (ja) * 2011-11-08 2013-05-16 大日本印刷株式会社 細胞培養容器の製造方法
JP2013099287A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd ボトル型の細胞培養容器及びその製造方法
JP2013099279A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 樹脂製細胞培養容器とその製造方法
JP2013099275A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 機能性フィルムを移送するための負圧吸着ヘッドとそれを用いた機能性フィルムの移送方法
JP2013099285A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 細胞培養容器の製造方法
JP2013102737A (ja) * 2011-11-15 2013-05-30 Covalent Materials Corp 細胞培養担体及びその製造方法
JP2013106529A (ja) * 2011-11-17 2013-06-06 Dainippon Printing Co Ltd 機能性フィルムの移送装置
JP2015008701A (ja) * 2013-07-01 2015-01-19 独立行政法人理化学研究所 分化転換制御方法および基板
JP2017181722A (ja) * 2016-03-30 2017-10-05 Jsr株式会社 ラインパターン、光制御部材および光学結像部材の製造方法
US9790465B2 (en) 2013-04-30 2017-10-17 Corning Incorporated Spheroid cell culture well article and methods thereof
JP2018512930A (ja) * 2015-03-26 2018-05-24 フラウンホファー ゲセルシャフト ツール フェールデルンク ダー アンゲヴァンテン フォルシュンク エー．ファオ． 人工デスメ膜
JP2018085978A (ja) * 2016-11-30 2018-06-07 旭硝子株式会社 培養容器
WO2020166279A1 (ja) * 2019-02-14 2020-08-20 王子ホールディングス株式会社 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法
US11345880B2 (en) 2017-07-14 2022-05-31 Corning Incorporated 3D cell culture vessels for manual or automatic media exchange
US11584906B2 (en) 2017-07-14 2023-02-21 Corning Incorporated Cell culture vessel for 3D culture and methods of culturing 3D cells
US11603515B2 (en) 2017-03-31 2023-03-14 National University Corporation Hokkaido University Cell culture substrate, cancer cell aggregate and method for manufacturing same using said substrate, and drug screening method using said cancer cell aggregate
US11613722B2 (en) 2014-10-29 2023-03-28 Corning Incorporated Perfusion bioreactor platform
US11661574B2 (en) 2018-07-13 2023-05-30 Corning Incorporated Fluidic devices including microplates with interconnected wells
US11732227B2 (en) 2018-07-13 2023-08-22 Corning Incorporated Cell culture vessels with stabilizer devices
US11767499B2 (en) 2017-07-14 2023-09-26 Corning Incorporated Cell culture vessel
US11857970B2 (en) 2017-07-14 2024-01-02 Corning Incorporated Cell culture vessel
US11912968B2 (en) 2018-07-13 2024-02-27 Corning Incorporated Microcavity dishes with sidewall including liquid medium delivery surface
US11976263B2 (en) 2014-10-29 2024-05-07 Corning Incorporated Cell culture insert

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100946643B1 (ko) * 2007-11-30 2010-03-09 코아스템(주) 세포배양장치 및 이를 구비한 대용량 자동화 세포배양기
JP4578517B2 (ja) * 2007-12-26 2010-11-10 Ｓｃｉｖａｘ株式会社 インプリント装置およびインプリント方法
KR101001296B1 (ko) * 2008-11-04 2010-12-14 한국전자통신연구원 3차원 신경회로망 구현장치
US20110189761A1 (en) * 2009-01-26 2011-08-04 Island Giant Development Llp Method for producing cell culture scaffold
JP2010188426A (ja) * 2009-01-26 2010-09-02 Emprie Technology Development LLC 清拭シート
JP4815496B2 (ja) 2009-01-26 2011-11-16 エンパイア テクノロジー ディベロップメント エルエルシー ナノポーラス表面を有する立体製品の製造方法
GB0903040D0 (en) * 2009-02-23 2009-04-08 Univ Glasgow Retention of a stem cell phenotype
JP4483994B1 (ja) * 2009-02-26 2010-06-16 株式会社豊田中央研究所 細胞培養担体及びその利用
JPWO2011052281A1 (ja) * 2009-10-30 2013-03-14 国立大学法人 東京大学 神経スフェロイドネットワークの構築方法
WO2011077894A1 (ja) * 2009-12-25 2011-06-30 Ｓｃｉｖａｘ株式会社 スフェロイド形成促進方法およびスフェロイド形成促進培地
JP5767481B2 (ja) * 2010-02-15 2015-08-19 丸善石油化学株式会社 機能性容器成形方法、成形用金型およびこれらを用いて製造した機能性容器
EP3443991A1 (en) * 2010-05-25 2019-02-20 Cook Biotech Incorporated Methods, substrates, and systems useful for cell seeding of medical grafts
WO2013042360A1 (ja) * 2011-09-20 2013-03-28 株式会社クラレ 接着性細胞の培養方法
CN104903726A (zh) * 2012-09-05 2015-09-09 Jsr株式会社 对细胞的上皮性维持起作用的物质的筛选方法
KR102234887B1 (ko) * 2013-04-19 2021-04-01 주식회사 에이엔케이 세포배양 기판
WO2015163043A1 (ja) 2014-04-22 2015-10-29 株式会社日本触媒 フッ素含有ポリマーを表面に含む細胞培養用基材
JP6420838B2 (ja) 2014-08-13 2018-11-07 三井化学株式会社 医療器具、細胞培養方法、フッ素含有環状オレフィンポリマーおよびフッ素含有環状オレフィンポリマー組成物
KR101647793B1 (ko) * 2014-09-02 2016-08-12 충남대학교산학협력단 온도 감응성 글리콜 키토산 유도체를 이용한 스페로이드 형성용 배양 용기 및 이를 이용한 스페로이드 형성 방법
WO2016158039A1 (ja) 2015-03-31 2016-10-06 三井化学株式会社 医療器具、フッ素含有環状オレフィンポリマー、フッ素含有環状オレフィンポリマー組成物、および細胞培養方法
KR101743231B1 (ko) 2015-09-18 2017-06-02 한국생명공학연구원 세포 스페로이드 배양기를 포함하는 세포 스페로이드 배양 시스템
WO2017059227A1 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 University Of Houston System Multi-use combined micro and nanowell plates
TW201730330A (zh) * 2016-01-20 2017-09-01 Soken Chemical & Engineering Co Ltd 細胞培養基板及其製造方法
EP4349972A3 (en) 2016-02-22 2024-05-29 Osaka University Method for producing three-dimensional cell tissue
JP6792777B2 (ja) 2016-02-22 2020-12-02 凸版印刷株式会社 スフェロイド形成促進方法
KR101800249B1 (ko) * 2016-12-23 2017-12-20 주식회사 티앤알바이오팹 세포 프린팅 조성물의 혼합 장치
JP6995476B2 (ja) * 2016-12-28 2022-01-14 デクセリアルズ株式会社 培養容器カバー、培養容器カバーの製造方法、及びカバー付き培養容器
KR101935989B1 (ko) 2017-01-18 2019-01-07 서강대학교산학협력단 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법
KR102038068B1 (ko) * 2017-06-28 2019-10-29 충남대학교산학협력단 세포배양용 용기의 제조방법 및 이를 이용한 세포배양 방법
KR101965900B1 (ko) * 2017-11-03 2019-04-05 한국화학연구원 스페로이드 형성 및 카운팅 기기 및 이의 제조 방법, 그리고 이를 이용한 스페로이드 배양 방법 및 계수 방법
JP6854500B2 (ja) * 2018-09-21 2021-04-07 シャープ株式会社 三次元培養法、三次元培養構造体、および三次元培養構造体の製造方法
JP2021148618A (ja) * 2020-03-19 2021-09-27 株式会社日本触媒 基材に接着されたスフェロイドを観察する方法
US11732232B2 (en) 2020-08-14 2023-08-22 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Biomimetic cell culture apparatus and cell culture system comprising the same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06327462A (ja) 1993-05-21 1994-11-29 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞凝集体の形成方法
JP2001157574A (ja) * 1999-11-30 2001-06-12 Terumo Corp ハニカム構造体およびその調製方法、ならびにその構造体を用いたフィルムおよび細胞培養基材
JP2002335949A (ja) 2001-05-22 2002-11-26 Inst Of Physical & Chemical Res ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法
JP2005027598A (ja) * 2003-07-09 2005-02-03 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 細胞培養チップ及び培養器、それらを用いた細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4132379A1 (de) * 1991-09-28 1993-04-08 Kernforschungsz Karlsruhe Substrat fuer zellkulturen und kultur von zellen oder zellaggregaten
WO1999047922A2 (en) * 1998-03-18 1999-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Vascularized perfused microtissue/micro-organ arrays
JP4294425B2 (ja) * 2003-09-10 2009-07-15 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 細胞培養プレート
JP2006223672A (ja) * 2005-02-18 2006-08-31 Sii Nanotechnology Inc 生体組織構造を模倣したナノバイオデバイス
WO2006093207A1 (ja) * 2005-03-02 2006-09-08 National University Corporation Hokkaido University 細胞の分化／増殖を制御するための基材

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06327462A (ja) 1993-05-21 1994-11-29 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞凝集体の形成方法
JP2001157574A (ja) * 1999-11-30 2001-06-12 Terumo Corp ハニカム構造体およびその調製方法、ならびにその構造体を用いたフィルムおよび細胞培養基材
JP2002335949A (ja) 2001-05-22 2002-11-26 Inst Of Physical & Chemical Res ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法
JP2005027598A (ja) * 2003-07-09 2005-02-03 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 細胞培養チップ及び培養器、それらを用いた細胞培養方法、球状細胞組織体を担持させた細胞担持モジュール、球状細胞組織体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ITO Y. ET AL.: "Nano Imprint Gijutsu no Bio Technology eno Oyo", BIO INDUSTRY, vol. 21, no. 11, 12 October 2004 (2004-10-12), pages 28 - 36, XP003017277 *
NOMURA S. ET AL.: "Nanopillar sheets as a new type of cell culture dish: detailed study of HeLa cells cultured on nanopillar sheets", J. ARTIF. ORGANS, vol. 9, no. 2, June 2006 (2006-06-01), pages 90 - 96, XP019385839 *
See also references of EP1988152A4

Cited By (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010022366A (ja) * 2008-06-16 2010-02-04 Scivax Kk スフェロイド作製方法
JP2010017128A (ja) * 2008-07-10 2010-01-28 Toyota Central R&D Labs Inc 培養細胞のハンドリング体、その製造方法及びその利用
JP2011019413A (ja) * 2009-07-14 2011-02-03 Scivax Kk 細胞剥離抑制器具及びこれを用いた培養容器、細胞剥離抑制方法
JP2011050295A (ja) * 2009-09-01 2011-03-17 Scivax Kk 細胞培養構造体、細胞培養容器及びこれらの製造方法
JP2013099275A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 機能性フィルムを移送するための負圧吸着ヘッドとそれを用いた機能性フィルムの移送方法
US9587219B2 (en) 2011-11-08 2017-03-07 Dai Nippon Printing Co., Ltd. Method for producing cell culture vessel
JP2013099279A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 樹脂製細胞培養容器とその製造方法
JP2013099278A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 細胞培養容器の製造方法
JP2013099287A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd ボトル型の細胞培養容器及びその製造方法
JP2013099285A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Dainippon Printing Co Ltd 細胞培養容器の製造方法
WO2013069490A1 (ja) * 2011-11-08 2013-05-16 大日本印刷株式会社 細胞培養容器の製造方法
JP2013102737A (ja) * 2011-11-15 2013-05-30 Covalent Materials Corp 細胞培養担体及びその製造方法
JP2013106529A (ja) * 2011-11-17 2013-06-06 Dainippon Printing Co Ltd 機能性フィルムの移送装置
US11441121B2 (en) 2013-04-30 2022-09-13 Corning Incorporated Spheroid cell culture article and methods thereof
US9790465B2 (en) 2013-04-30 2017-10-17 Corning Incorporated Spheroid cell culture well article and methods thereof
JP2015008701A (ja) * 2013-07-01 2015-01-19 独立行政法人理化学研究所 分化転換制御方法および基板
US11976263B2 (en) 2014-10-29 2024-05-07 Corning Incorporated Cell culture insert
US11613722B2 (en) 2014-10-29 2023-03-28 Corning Incorporated Perfusion bioreactor platform
JP2018512930A (ja) * 2015-03-26 2018-05-24 フラウンホファー ゲセルシャフト ツール フェールデルンク ダー アンゲヴァンテン フォルシュンク エー．ファオ． 人工デスメ膜
US11504225B2 (en) 2015-03-26 2022-11-22 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Artificial Descemet construct
JP2017181722A (ja) * 2016-03-30 2017-10-05 Jsr株式会社 ラインパターン、光制御部材および光学結像部材の製造方法
JP2018085978A (ja) * 2016-11-30 2018-06-07 旭硝子株式会社 培養容器
US11603515B2 (en) 2017-03-31 2023-03-14 National University Corporation Hokkaido University Cell culture substrate, cancer cell aggregate and method for manufacturing same using said substrate, and drug screening method using said cancer cell aggregate
US11584906B2 (en) 2017-07-14 2023-02-21 Corning Incorporated Cell culture vessel for 3D culture and methods of culturing 3D cells
US11767499B2 (en) 2017-07-14 2023-09-26 Corning Incorporated Cell culture vessel
US11857970B2 (en) 2017-07-14 2024-01-02 Corning Incorporated Cell culture vessel
US11970682B2 (en) 2017-07-14 2024-04-30 Corning Incorporated 3D cell culture vessels for manual or automatic media exchange
US11345880B2 (en) 2017-07-14 2022-05-31 Corning Incorporated 3D cell culture vessels for manual or automatic media exchange
US11661574B2 (en) 2018-07-13 2023-05-30 Corning Incorporated Fluidic devices including microplates with interconnected wells
US11732227B2 (en) 2018-07-13 2023-08-22 Corning Incorporated Cell culture vessels with stabilizer devices
US11912968B2 (en) 2018-07-13 2024-02-27 Corning Incorporated Microcavity dishes with sidewall including liquid medium delivery surface
JP7180698B2 (ja) 2019-02-14 2022-11-30 王子ホールディングス株式会社 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法
JPWO2020166279A1 (ja) * 2019-02-14 2021-10-07 王子ホールディングス株式会社 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法
WO2020166279A1 (ja) * 2019-02-14 2020-08-20 王子ホールディングス株式会社 細胞シート形成部材、基材、および、細胞シート形成部材の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007097121A1 (ja) 2009-07-09
EP1988152B1 (en) 2016-11-23
WO2007097121A1 (ja) 2007-08-30
US7727759B2 (en) 2010-06-01
KR20090004879A (ko) 2009-01-12
US20090246872A1 (en) 2009-10-01
KR101362293B1 (ko) 2014-02-12
JP5397934B2 (ja) 2014-01-22
EP1988152A1 (en) 2008-11-05
JP4159103B2 (ja) 2008-10-01
JPWO2007097120A1 (ja) 2009-07-09
EP1988152A4 (en) 2010-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007097120A1 (ja) 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法
Ramón-Azcón et al. Gelatin methacrylate as a promising hydrogel for 3D microscale organization and proliferation of dielectrophoretically patterned cells
Lin et al. Dielectrophoresis based‐cell patterning for tissue engineering
Bucaro et al. Fine-tuning the degree of stem cell polarization and alignment on ordered arrays of high-aspect-ratio nanopillars
Nawroth et al. Automated fabrication of photopatterned gelatin hydrogels for organ-on-chips applications
Wang et al. Efficient capture of cancer cells by their replicated surfaces reveals multiscale topographic interactions coupled with molecular recognition
Pasirayi et al. Microfluidic bioreactors for cell culturing: a review
Kumar Microfluidic devices in nanotechnology: applications
CN103421691B (zh) 一种基于微流体构图技术的单细胞阵列培养玻璃芯片及其制备方法
JP2008054521A (ja) 細胞培養処理装置及び細胞培養処理方法
Sun et al. A novel three-dimensional microfluidic platform for on chip multicellular tumor spheroid formation and culture
CN104039951B (zh) 用于引导细胞迁移的装置和实施这种装置的引导方法
JP2012249547A (ja) 細胞培養用基材及びその製造方法
Pensabene et al. Ultrathin polymer membranes with patterned, micrometric pores for organs-on-chips
Yang et al. Recent advance in cell patterning techniques: Approaches, applications and future prospects
Farshidfar et al. The feasible application of microfluidic tissue/organ-on-a-chip as an impersonator of oral tissues and organs: a direction for future research
Agarwal et al. Dielectrophoresis-based devices for cell patterning
Homhuan et al. Single-cell electroporation using proton beam fabricated biochips
Xu et al. Force-sensing micropillar arrays for cell mechanics and mechanobiology
JP5894732B2 (ja) 細胞培養基材の評価方法
Ziółkowska et al. Novel designs and technologies for cell engineering
JP6326915B2 (ja) 細胞培養基材
Cai et al. Recent advances in optically induced di-electrophoresis and its biomedical applications
US9939353B2 (en) Apparatus for cell observation and method for cell collection using the same
Ahmed et al. Rapid prototyping of PMMA-based microfluidic spheroid-on-a-chip models using micromilling and vapour-assisted thermal bonding

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008501635

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2007713488

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007713488

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020087022920

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12280125

Country of ref document: US