TW201536308A

TW201536308A - 肌肉萎縮防止及／或肌肉合成促進劑

Info

Publication number: TW201536308A
Application number: TW103124806A
Authority: TW
Inventors: Yuko Ishida; Aiko Ohmachi; Yoshikazu Morita; Yuki Mizuno; Toshiya Kobayashi; Ken Katoh
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2013-07-19
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2015-10-01
Also published as: JP6279851B2; TWI686204B; WO2015008836A1; JP2015020979A

Abstract

一種肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，含有源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物作為有效成分的。所述肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，由於其防止肌肉量下降的效果或增加肌肉量的效果甚為顯著，係有用於肌少症或廢用性肌萎縮等各種肌肉疾病的預防或治療。

Description

肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑

本發明係有關於一種具有在生物體內防止肌肉萎縮、及/或促進肌肉合成的作用，而有用於肌少症或廢用性肌萎縮等各種肌肉疾病的預防或治療的肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑。本發明又有關於一種摻有肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑的肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲食品、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用營養組成物、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料。

近年來，日本人的平均壽命迫近80歲，迎向所謂約4人中即有1人為65歲以上的超高齡社會。隨之，運動器官病症的罹患率亦不斷增加；於2007年，日本整形外科學會為了推動國民以及醫師對於運動器官之健康維持・增進、照護的意識革新，而提出「運動障礙症候群(運動器官症候群, locomotive syndrome)」之新穎詞彙。運動障礙症候群係表示因運動器官的機能不全而使需照護狀態及需照護風險提高的狀態；運動器官總括包含骨骼・關節・韌帶、脊椎・脊髓、肌肉・肌腱、末梢神經等具有支撐身體並使其動作之作用的器官。作為此等運動器官中常見的代表性疾病及機能障礙，可列舉骨質疏鬆症或肌少症、退化性關節炎等。

肌少症係以進行性及全身性之骨骼肌肉量及骨骼肌力下降為特徵的症候群。肌少症在狹義上定義為隨年齡增長而發生者，而在廣義上意指各種原因所致之肌肉量與肌力的下降。在廣義之肌少症的情況，係將除年齡增長以外另無不明原因者分類為一次性(年齡增長性)肌少症、將可獲知年齡增長以外的1種以上原因者分類為二次性肌少症。二次性肌少症可大致區分為起因於活動量降低者、由疾病所引起者、因營養素攝取不足所致者此三種。換言之，二次性肌少症的患者不限於高齡者，例如因住院等而持續保持長期不使用肌肉狀態時所發生的廢用性肌萎縮亦被視為二次性肌少症的一種。肌少症的發病與進行係與骨骼肌肉蛋白質的代謝有關。骨骼肌肉的量係藉著肌肉蛋白質合成與肌肉蛋白質分解的平衡而調整，若此平衡遭破壞導致合成量低於分解量、或者分解量高於合成量時，便發生肌肉的萎縮而使肌肉量下降。在高齡者來說，因具有蛋白質之合成促進作用及分解抑制作用的生長賀爾蒙的分泌量下降、或具有蛋白質合成抑制作用的皮質類固醇(糖皮質素)的血中濃度上升等，導致合成量低於分解量，如此成為肌肉萎縮的原因。另一方面，以二次性肌少症而言，因缺乏對骨骼肌肉的運動刺激，致蛋白質合成下降的結果，分解量高於合成量，而發生肌肉萎縮。

為達肌少症等肌肉疾病的預防或改善，已確認運動方面之高強度的阻力訓練係屬有效。然，對於高齡者或病後的療養生活，積極實施高強度的運動對身體的負擔甚大，而且在實施時，亦需由專家給予適當的指導。因此，為達肌少症的預防或改善，即盼有一種從營養方面考量、對於基本體力或運動機能降低者也能輕易地實施的手段。作為對肌少症等肌肉疾病的預防或改善屬有效的具有改善肌肉機能之效果的食品成分，已有人揭示例如利用番茄紅素來抑制蛋白質分解(專利文獻1)、利用兒茶素類來抑制肌肉老化(專利文獻2)等。又，尚有人進行藉由攝取蛋白質或胺基酸來達成骨骼肌肉萎縮的預防及早期復原相關之研究。特別是，已知：牛乳中所含的乳清蛋白質，相較於大豆蛋白質，涉及肌肉合成的支鏈胺基酸(branched-chain amino acids；BCAA)含量較高，且NPU(Net Protein Utilization；淨蛋白質利用率)亦較高；日本特開2011-160757所記載之乳清蛋白質水解物可促進蛋白質的合成，而持續利用於作為運動時之肌肉的增強及復原用的補給品。然而，由於此等成分的有效攝取量偏多，除了在日常攝取中會造成負擔外，在應用於飲食品時，亦有此等成分特有的風味或者呈色可能對飲食品的官能性造成不良影響等問題。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2004-59518號公報 [專利文獻2]日本特開2008-63321號公報 [專利文獻3]日本特開2011-160757號公報

[發明所欲解決之課題]

本發明係以提供一種具有可抑制生物體內之肌肉的萎縮、及/或可促進肌肉的合成之作用且有效攝取量相比於傳統產品為少量的肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑以及摻有肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑的肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲食品、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用營養組成物、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料為課題。 [解決課題之手段]

本發明人等為解決上述課題而致力進行研究的結果發現，透過同時攝取源自乳汁之鹼性蛋白質級分或其分解物與乳清蛋白質水解物，則有優良的肌肉的萎縮防止及/或合成促進效果，終至完成本發明。

即，本發明係根據以下構成： (1)一種肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其係以源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物為有效成分。 (2)如(1)之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物係對源自乳汁之鹼性蛋白質級分以蛋白質水解酵素實施處理而得。 (3)如(2)之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述蛋白質水解酵素係選自於由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜酶構成之群組中的至少1種以上。 (4)如(1)至(3)中任一項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述源自乳汁之鹼性蛋白質級分在其胺基酸組成中係含有15重量%以上之鹼性胺基酸。 (5)如(1)至(3)中任一項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述源自乳汁之鹼性蛋白質級分，係使乳汁或源自乳汁之原料與陽離子交換樹脂接觸而使鹼性蛋白質吸附，並將吸附於樹脂的級分在鹽濃度0.1M~1.0M的溶出液中溶出所得的級分。 (6)如(1)之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述乳清蛋白質水解物其分解率為25%以上。 (7)如(1)之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述乳清蛋白質水解物係具有以下特徵： (A)分子量為10kDa以下、主峰為200Da~3kDa； (B)ALP(平均胜肽鏈長)為2~8； (C)游離胺基酸含量為20%以下； (D)抗原性為β-乳球蛋白的抗原性的1/10,000以下。 (8)如(1)之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述乳清蛋白質水解物係將乳清蛋白質在pH6~pH10、50℃~70℃使用耐熱性之蛋白質水解酵素一面使其熱變性一面進行酵素分解，並對所得反應液加熱使酵素去活化而得。 (9)如(1)之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，前述乳清蛋白質水解物係將乳清蛋白質在pH6~pH10、20℃~55℃使用蛋白質水解酵素進行酵素分解；將所得反應液升溫至50℃~70℃，並在pH6~pH10、50℃~70℃使用耐熱性之蛋白質水解酵素一面使未分解之乳清蛋白質熱變性一面進行酵素分解；對反應液加熱使酵素去活化而得。 (10)一種肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲食品、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用營養組成物、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料，其係含有如(1)至(9)中任一項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑。 (11)一種防止肌肉萎縮及/或促進肌肉合成之方法，其係透過按每日同時分別攝取5mg以上與10mg以上的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物。 [發明之效果]

本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑係具有在生物體內抑制肌肉的萎縮、及/或促進肌肉的合成之效果，有用於肌少症或廢用性肌萎縮等各種肌肉疾病的預防或治療。

本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑的特徵在於，以源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物(以下亦稱為「源自乳汁之鹼性蛋白質級分等」)、與乳清蛋白質水解物為有效成分。本發明中所使用的源自乳汁之鹼性蛋白質級分係獲取自牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等哺乳類的乳汁，且，本發明中所使用的源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物可對源自乳汁之鹼性蛋白質級分以蛋白質水解酵素實施處理而得。此外，在本說明書中，「A及B」係指A,B兩者；「A或B」係指A、B中任一者；「A及/或B」則指A、B中任一者、或A,B兩者。

該源自乳汁之鹼性蛋白質級分係具有以下性質： 1)根據十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)，係由分子量3,000~80,000之範圍的數種蛋白質構成； 2)95重量%以上為蛋白質，並包含其他少量之脂肪、灰分； 3)蛋白質係主要由乳鐵蛋白及乳過氧化酶構成； 4)蛋白質之胺基酸組成係含有15重量%以上之賴胺酸、組胺酸、精胺酸等鹼性胺基酸。

此種源自乳汁之鹼性蛋白質級分可例如藉由使脫脂乳或乳清等乳原料與陽離子交換樹脂接觸而使鹼性蛋白質吸附，並將吸附於該樹脂的鹼性蛋白質級分在0.1M~1M之鹽濃度的溶出液中溶出，回收該溶出級分，再利用逆滲透(RO)膜或電透析(ED)法等進行脫鹽及濃縮，並視需求加以乾燥而得。再者，作為獲得本發明之源自乳汁之鹼性蛋白質級分的方法，已知有：使乳汁或源自乳汁之原料與陽離子交換體接觸而使鹼性蛋白質吸附後，將吸附於該陽離子交換體的鹼性蛋白質級分，在超過pH5、超過離子強度0.5的溶出液中溶出而得之方法(日本特開平5-202098號公報)；使用海藻酸膠體而得之方法(日本特開昭61-246198號公報)；使用無機多孔性粒子，自乳清獲取之方法(日本特開平1-86839號公報)；使用硫酸酯化合物，自乳汁獲取之方法(日本特開昭63-255300號公報)等，在本發明中，可使用以此類方法所得到的源自乳汁之鹼性蛋白質級分。再者，源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物係具有與源自乳汁之鹼性蛋白質級分同樣的胺基酸組成，可對以上述方法所得的源自乳汁之鹼性蛋白質級分以蛋白質水解酵素實施處理而以平均分子量4,000以下的源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物獲得。此外，作為蛋白質分解酵素，除可使用市售之Protease A「Amano」SD(商品名)、THERMOASE PC10F(商品名)、PROTIN SD-AY10(商品名)等食品・工業用蛋白酶劑外，尚可列舉胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜酶等酵素。又，亦可將此等蛋白質水解酵素適當組合使用。

本發明中所使用的乳清蛋白質水解物可利用如日本特開平4-112753所記載的方法而得。在此方法中，係藉由(B)使乳清蛋白質處於pH6~pH10、50℃~70℃，並對其添加耐熱性之蛋白質水解酵素一面使其熱變性一面進行酵素分解；(C)對其加熱使酵素去活化而得。此外，就上述之(B)步驟前的(A)步驟而言，若將乳清蛋白質在pH6~pH10、20℃~55℃使用蛋白質水解酵素進行酵素分解後，對所得反應液在未予冷卻下立即以上述之(B)步驟進行酵素分解，則可進一步提高產率。又，亦可將如上述所調製的乳清蛋白質水解物，以選自分級分子量1kDa~20kDa，較佳為2kDa~10kDa之超過濾(UF)膜及/或分級分子量100Da~500Da，較佳為150Da~300Da之微過濾(MF)膜的方法加以濃縮。透過此類膜處理，使乳清蛋白質水解物的平均分子量成為300Da~500Da，由此可進一步減輕苦味，並提升透明性。

利用日本特開平4-112753所記載的方法來調製乳清蛋白質水解物時，係將前述乳清蛋白質調整為pH6~pH10，惟通常乳清蛋白質為此範圍之pH，因此無需特別進行pH的調整。必要時，則使用鹽酸、檸檬酸及乳酸等酸溶液或者苛性鈉、氫氧化鈣及磷酸鈉等鹼溶液來調成pH6~pH10。加熱係於50℃~70℃進行，惟，耐熱性之蛋白質水解酵素，相比於在此溫度添加，自加熱前添加而進行酵素分解由產率方面而言係較佳。又，一般的蛋白酶的最佳溫度為40℃以下，而耐熱性之蛋白質水解酵素的最佳溫度為45℃以上。作為耐熱性之蛋白質水解酵素，只要為以習知具有此種最佳溫度的耐熱性之蛋白質水解酵素而為人所知者則可無特殊限制地使用。作為此類耐熱性之蛋白質水解酵素，可列示木瓜酶、Protease S(商品名)、Proleather(商品名)、THERMOASE(商品名)、Alcalase(商品名)、PROTIN A(商品名)等。耐熱性之蛋白質水解酵素較佳為在80℃加熱30分鐘後殘留活性為約10%或更高者。又，比起單獨使用，併用多種酵素較為有效。反應較佳進行30分鐘~10小時左右。最終，對反應液加熱使酵素去活化。酵素的去活化可對反應液在100℃以上加熱10秒以上來進行。

其後，將反應液離心分離並回收上清液，再將上清液乾燥而製成粉末製品。此外，離心分離時所生成的沉澱物，比起上清液其低過敏原化程度較小，故將其去除為佳，惟理當亦可將反應液直接乾燥使用。所得乳清蛋白質水解物的APL(平均胜肽鏈長)可利用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)法等方法來測定。又，乳清蛋白質水解物的分子量分布可利用High performance size exclusion chromatography(HPSEC,高效尺寸篩除層析)法等方法來測定，其游離胺基酸含量則可用75%乙醇等萃取出游離胺基酸，再利用胺基酸分析裝置等來測定。再者，乳清蛋白質水解物的分解率可利用對游離之胺基進行修飾後加以測定的鄰酞醛(OPA)法等來測定。此外，乳清蛋白質水解物的分解率較佳為25%以上。

乳清蛋白質水解物較佳為具有以下特徵： (A)分子量為10kDa以下、主峰為200Da~3kDa； (B)ALP(平均胜肽鏈長)為2~8； (C)游離胺基酸含量為20%以下； (D)抗原性為β-乳球蛋白的抗原性的1/10,000以下。

此外，本發明之乳清蛋白質係指由牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等哺乳類的乳汁所調製的乳清、其凝集物、粉末、或者精製蛋白質，使其進行酵素反應時係以水溶液狀態使用。

本發明之源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物可以一併攝取，而直接作為本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑使用，惟亦可視需求，依循常用方法製劑化成粉末劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑、飲料劑等。

在本發明中，將作為有效成分的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物製劑化或者對飲食品等添加時，添加方法、配合方法等無特殊限制，例如，為了在溶液中予以添加、摻混，只要將源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物懸浮或者溶解於去離子水並攪拌混合後，予以製劑化、或者調製成飲食品或飼料之形態使用即可。作為攪拌混合之條件，只要使源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物均勻地混合即可，亦可使用ULTRA DISPERSER或TK HOMO MIXER等進行攪拌混合。又，該組成物的溶液，為了容易製劑化、或者容易使用於飲食品或飼料，可視需求以RO膜等進行濃縮、或進行冷凍乾燥而使用。在本發明中，可實施醫藥品、飲食品或飼料之製造通常使用的殺菌處理，若為粉末狀時，亦可實施乾熱殺菌。據以上所述，本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑可作成液狀、凝膠狀、粉末狀、顆粒狀等各式形態，又，亦可在製劑化後摻混於營養劑或優格、乳飲料、鬆餅等飲食品或營養組成物。

本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑除含有源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物作為有效成分外，於製劑化之際，尚可採用通常使用的填充劑、增量劑、黏結劑、崩解劑、界面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑。作為賦形劑，可使用例如蔗糖、乳糖、澱粉、結晶性纖維素、甘露醇、輕質矽酸酐、鋁酸鎂、合成矽酸鋁、偏矽酸鎂鋁、碳酸鈣、碳酸氫鈉、磷酸氫鈣、羧甲基纖維素鈣等的1種或組合使用2種以上。又，在本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑中，亦可併用安定劑或糖類、脂質、食品香料、維生素、礦物質、類黃酮、多酚等，於調製飲食品或飼料之際，可適當將此等摻混使用。再者，還可與顯示改善其他肌肉機能之效果的成分，例如番茄紅素或兒茶素類、支鏈胺基酸(branched-chain amino acids；BCAA)、大豆蛋白質等一併使用。

就本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，如後述試驗例所示，藉由使小鼠或大鼠，同時經口攝取依每1kg體重為5mg以上的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、依每1kg體重為10mg以上的乳清蛋白質水解物，在生物體內可防止肌肉的萎縮、及/或促進肌肉的合成。實驗動物的攝取量，以血中藥物濃度計，由於係相當於成人一人的攝取量(中島光好(1993), 「第8卷藥效評定」, 廣川書店, 2-18頁)，故通常透過按成人每人每日，同時分別攝取5mg以上與10mg以上的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物，可望獲得對於生物體內之肌肉萎縮，尤為肌少症或廢用性肌萎縮等的預防或治療效果。因此，只要將源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物予以製劑化或者摻混於飲食品等，以便可確保其所需量即可。舉例來說，為了按成人每人每日，同時分別攝取5mg以上與10mg以上的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物，雖視醫藥、飲食品、飼料形態而定，惟，作為最終製品，相對於總質量，只要使其含有0.00025%~1%(重量/重量)的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與0.005%~50%(重量/重量)，較佳為0.5%~25%(重量/重量)的乳清蛋白質水解物即可。

上述之「同時攝取」，除了使源自乳汁之鹼性蛋白質級分等與乳清蛋白質水解物均勻混合後進行攝取的情況以外，亦包含例如在分別單獨經製劑化的源自乳汁之鹼性蛋白質級分等及乳清蛋白質水解物中，攝取任一者後隨即攝取另一者的情況、或兩者並行攝取的情況。基於可有效獲得肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進觀點，較佳為使源自乳汁之鹼性蛋白質級分等與乳清蛋白質水解物均勻混合後進行攝取。

上述之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑其防止肌肉量下降的效果或增加肌肉量的效果甚為顯著。因此，係有用於運動器官之機能不全所引起的運動障礙症候群的預防或治療。運動器官係包含例如骨骼・關節・韌帶、脊椎・脊髓、肌肉・肌腱、末梢神經等具有支撐身體並使其動作之作用的器官。作為此等運動器官中常見的代表性疾病及機能障礙，可列舉骨質疏鬆症或肌少症、退化性關節炎等。作為本發明之其他形態，茲提供一種將以源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物為有效成分的肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑應用於肌肉疾病患者的肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑之使用方法。又提供一種肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑之製造的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物之使用方法。

以下示出本發明之實施例及試驗例加以詳細說明，惟此等僅只為例示，本發明不受此等任何限定。【實施例1】

將填充有400g陽離子交換樹脂(磺化CHITO PEARL；富士紡織股份有限公司製)的管柱(直徑5cm×高30cm)以去離子水充分清洗後，對該管柱以流速25ml/min流通未殺菌脫脂乳40公升(pH6.7)。通液後，將該管柱以去離子水充分清洗，使用含0.98M氯化鈉的0.02M碳酸緩衝液(pH7.0)將吸附於樹脂的鹼性蛋白質級分溶出。重複此操作10次，對該溶出液利用逆滲透(RO)膜進行脫鹽、濃縮後，予以冷凍乾燥而得到210g之粉末狀的源自乳汁之鹼性蛋白質級分(實施例品1)。針對所得源自乳汁之鹼性蛋白質級分，利用月桂基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)進行測定的結果，分子量係分布於3,000~80,000之範圍，成分組成係如表1所示。又，使用6N鹽酸以110℃、24小時予以水解後，利用胺基酸分析裝置(L-8500型；日立製作所製)分析其胺基酸組成的結果，如表2所示含有15重量%以上之鹼性胺基酸。進而，利用ELISA法分析其蛋白質組成的結果，如表3所示，含有40%以上之乳鐵蛋白及乳過氧化酶。

【實施例2】

將填充有30kg陽離子交換樹脂(SP TOYOPEARL；TOSOH股份有限公司製)的管柱(直徑100cm×高10cm)以去離子水充分清洗後，對該管柱以流速10公升/min流通經121℃加熱殺菌30秒的乾酪乳清3t(pH6.2)。通液後，將該管柱以去離子水充分清洗，使用含0.9M氯化鈉的0.1M檸檬酸緩衝液(pH5.7)將吸附於樹脂的鹼性蛋白質級分溶出。其後，對該溶出液利用電透析(ED)法進行脫鹽、濃縮後，予以冷凍乾燥而得到183g之粉末狀的源自乳汁之鹼性蛋白質級分(實施例品2)。【實施例3】

將50g實施例1中所得之源自乳汁之鹼性蛋白質級分溶解於10公升蒸餾水後，添加1%胰酶(SIGMA公司製)，於37℃使其反應2小時。反應後，於80℃實施加熱處理10分鐘使酵素去活化後，予以冷凍乾燥而得到48.3g之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物(實施例品3)。【實施例4】

將120g實施例2中所得之源自乳汁之鹼性蛋白質級分溶解於1.8公升純水後，予以保持於45℃並添加20g之Protease A「Amano」SD(Amano Enzyme公司製)，使其反應2小時。於80℃加熱10分鐘使酵素去活化後，予以冷凍乾燥而得到95g之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物(實施例品4)。【實施例5】

對1L乳清蛋白質10%水溶液，依每1g乳清蛋白質添加50U木瓜酶、150UProleather(Amano Enzyme公司製)，予以調整為pH8，並於55℃以6小時一面使乳清蛋白質變性一面進行酵素分解。對反應液於100℃加熱15秒以上使酵素去活化。其後，將反應液離心分離，回收上清液，將其乾燥而得到乳清蛋白質水解物(實施例品5)。所得乳清蛋白質水解物的分子量分布為10kDa以下、主峰為1.3kDa、APL為7.2、相對於所有構成成分的游離胺基酸含量為18.9%。利用Inhibition ELISA法測定對β-乳球蛋白的抗原性下降的結果為1/10,000以下，分解率為28%、產率(將酵素反應液離心分離，上清液之乾燥重量與饋入量之乾燥重量的比率(%))為80.3%、苦味度為2。又，使用6N鹽酸以110℃、24小時予以水解後，利用胺基酸分析裝置(L-8500型；日立製作所製)分析胺基酸組成的結果，可知為如表4所示之胺基酸組成。【實施例6】

對1L乳清蛋白質10%水溶液，依每1g乳清蛋白質添加50U木瓜酶、150UProleather(Amano Enzyme公司製)，在pH8、50℃進行酵素分解3小時。將其升溫至55℃，於此溫度維持3小時，一面使蛋白質變性一面進行蛋白質的酵素分解。其後，對反應液於100℃加熱15秒以上使酵素去活化。對該反應液以分級分子量10kDa之UF膜(STC公司製)及分級分子量300Da之MF膜(STC公司製)進行處理，回收濃縮液級分，將其乾燥而得到乳清蛋白質水解物(實施例品6)。所得乳清蛋白質水解物的分子量分布為10kDa以下、主峰為500Da、APL為3.0、相對於所有構成成分的游離胺基酸含量為15.2%。利用Inhibition ELISA法測定對β-乳球蛋白的抗原性下降的結果為1/10,000以下，分解率為32%、產率為65.4%、苦味度為2。【實施例7】

利用日本特開平4-69315號公報所報導的方法來調製乳清蛋白質的水解物。將120g乳清蛋白質溶解於1,800ml純水，以1M苛性鈉溶液將pH調整為7.0。接著，於60℃加熱10分鐘進行殺菌，予以保持於45℃並添加20g之Amano A(Amano Enzyme公司製)，使其反應2小時。於80℃加熱10分鐘使酵素去活化。其後，將反應液冷凍乾燥而得到乳清蛋白質水解物(實施例品7)。所得乳清蛋白質水解物的分子量分布為14kDa以下、主峰為3.1kDa、APL為17.2、相對於所有構成成分的游離胺基酸含量為13.2%。利用Inhibition ELISA法測定對β-乳球蛋白的抗原性下降的結果為1/5,000以下，分解率為18%、產率為80.6%、苦味度為2。【實施例8】

利用日本特開平4-69315號公報所報導的方法來調製乳清蛋白質的水解物。將120g乳清蛋白質溶解於1,800ml純水，以1M苛性鈉溶液將pH調整為7.0。接著，於60℃加熱10分鐘進行殺菌，予以保持於45℃並添加20g之Amano A(Amano Enzyme公司製)，使其反應8小時。於80℃加熱10分鐘使酵素去活化。其後，將反應液冷凍乾燥而得到乳清蛋白質水解物(實施例品8)。所得乳清蛋白質水解物的分子量分布為10kDa以下、主峰為1.8kDa、APL為10.0、相對於所有構成成分的游離胺基酸含量為19.3%。利用Inhibition ELISA法測定對β-乳球蛋白的抗原性下降的結果為1/10,000以下，分解率為25%、產率為80.6%、苦味度為2。

［試驗例1］ (肌肉量下降防止試驗) 使用實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5、7之乳清蛋白質水解物，來評定肌肉量下降防止效果。作為實驗動物，係使用20週大之SAM-P系雌小鼠。為了平準小鼠的體重，而予以分作：投予生理食鹽水之群(A群)；按小鼠每1kg體重投予5mg實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分之群(B群)；按小鼠每1kg體重投予10mg實施例5之乳清蛋白質水解物之群(C群)；按小鼠每1kg體重投予10mg實施例7之乳清蛋白質水解物之群(D群)；按小鼠每1kg體重投予15mg實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分之群(E群)；按小鼠每1kg體重投予15mg實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(F群)；按小鼠每1kg體重投予15mg實施例品7之乳清蛋白質水解物之群(G群)；及按小鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(H群)；按小鼠每1kg體重同時分別投予各10mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(I群)；按小鼠每1kg體重同時分別投予10mg與15mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(J群)；按小鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品7之乳清蛋白質水解物之群(K群)此11試驗群(每群各10隻)，按每日1次以餵食管經口投予實驗試料，餵養至45週大。此外，分別將實施例品1、5、7及實施例品1與5的混合物、實施例品1與7的混合物懸浮於生理食鹽水，對B~I群經口投予。試驗結束時，在戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉下，自小鼠的右後肢摘出伸趾長肌(EDL)、脛骨前肌(TA)、比目魚肌(SOL)、腓肚肌(GAS)，測定各種肌肉的重量，以每單位體重的相對重量(mg/100g體重)算出。將其結果示於表5。

※值表示平均值±標準差。 ※表示利用Tukey-Kramer法進行顯著性檢定，不同的字母間有顯著差異。(n＝10、p＜0.05)。

由表5之結果，每單位體重的相對肌肉重量，對於伸趾長肌、脛骨前肌、比目魚肌及腓肚肌任一者，在按小鼠每1kg體重投予5mg或15mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分之群(B群、E群)；按小鼠每1kg體重投予10mg或15mg的實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(C群、F群)；按小鼠每1kg體重投予10mg或15mg的實施例品7之乳清蛋白質水解物之群(D群、G群)；及按小鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5、7之乳清蛋白質水解物之群(H群、K群)；按小鼠每1kg體重同時分別投予各10mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(I群)；按小鼠每1kg體重同時分別投予10mg與15mg的實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5之乳清蛋白質水解物之群(J群)中，相較於對照群(A群)，均顯著較高。又，透過同時投予實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品5、7之乳清蛋白質水解物，比起個別單獨投予的群，每單位體重的伸趾長肌、脛骨前肌、比目魚肌及腓肚肌的相對肌肉重量均顯著增加。由於用於試驗的SAM-P系小鼠為促進老化之小鼠，在對照群中隨著老化，肌肉萎縮而肌肉量降低，然而在同時攝取本發明之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與乳清蛋白質水解物時，比起個別單獨攝取的情形，可知相對肌肉重量加乘性地增加。又，顯然該效果在按小鼠每1kg體重同時分別攝取5mg與10mg、10mg與10mg、10mg與15mg的源自乳汁之鹼性蛋白質級分與乳清蛋白質水解物時亦可看出。

［試驗例2］ (肌肉合成評定試驗) 使用實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6、8之乳清蛋白質水解物，來評定肌肉合成效果。作為實驗動物，係使用6週大的Wistar系雌大鼠。為了平準大鼠其各群的體重，而予以分作：未進行尾部懸吊而按一般方式餵養之群(A群)；在尾部懸吊後的復原期間投予生理食鹽水之群(B群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重投予5mg實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物之群(C群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重投予10mg實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(D群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重投予10mg實施例品8之乳清蛋白質水解物之群(E群)；及在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(F群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重同時分別投予各10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(G群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重同時分別投予10mg與15mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(H群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品8之乳清蛋白質水解物之群(I群)；在尾部懸吊後的復原期間按大鼠每1kg體重投予120mg乳清蛋白質分離物(WPI, Fonterra公司製)之群(J群)此10試驗群(每群各10隻)。分群後，A群在一般餵養用飼籠內持續餵養，其餘9群則藉由尾部懸吊使後肢成為非荷重狀態而餵養1週。尾部懸吊結束後，將所有的群移至一般餵養用飼籠內並設定復原時間，對各群按每日1次，以餵食管經口投予前述實驗試料而餵養1週。此外，對A群以相當於尾部懸吊群之復原期間的時間(1週)，按每日1次以餵食管經口投予生理食鹽水。又，實施例品4、6、8、實施例品4與6的混合物、實施例品4與8的混合物及WPI係分別懸浮於生理食鹽水後進行經口投予。試驗結束後，在戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉下摘出下腿骨骼肌肉(比目魚肌：SOL)，測定肌肉重量，並算出每單位體重的相對肌肉重量(mg/100g體重)。將其結果示於表6。

由表6之結果，每單位體重的比目魚肌重量，在經過尾部懸吊且投予過生理食鹽水之B群，比起一般餵養之A群顯著較低。然，在按大鼠每1kg體重分別單獨投予5mg、10mg、10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、實施例品6之乳清蛋白質水解物、實施例品8之乳清蛋白質水解物之群(C群、D群、E群)；及按大鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(F群)；按大鼠每1kg體重同時分別投予各10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(G群)；按大鼠每1kg體重同時分別投予10mg與15mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物之群(H群)；按大鼠每1kg體重同時分別投予5mg與10mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品8之乳清蛋白質水解物之群(I群)中，相較於B群，每單位體重的比目魚肌重量顯著增加。又，在同時投予實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6、8之乳清蛋白質水解物之群(F群、G群、H群、I群)中，比起個別單獨投予的群，每單位體重的比目魚肌重量顯著較高，其值與一般餵養之A群同等。因此，在同時攝取本發明之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物時，比起個別單獨攝取的情形，可知肌肉量加乘性地增加。又，顯然該效果在按大鼠每1kg體重同時分別攝取5mg與10mg的源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與乳清蛋白質水解物時亦可看出。另一方面，對於按大鼠每1kg體重投予120mg WPI之H群的每單位體重的比目魚肌重量，未看出與投予生理食鹽水之B群的差異。【實施例9】

(肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用錠劑的調製) 以表7所示摻混量混合原料後，利用常用方法成型、打錠成1g而製成肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用錠劑。此外，1g之該錠劑中含有10mg實施例品1之源自乳汁之鹼性蛋白質級分、20mg實施例品5之乳清蛋白質水解物。

【實施例10】

(肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用營養組成物的調製) 將125g實施例品3之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與250g實施例品6之乳清蛋白質水解物溶解於4,625g之去離子水，予以加熱至50℃後，利用TK HOMO MIXER(TK ROBO MICS；特殊機化工業公司製)，以6,000rpm攪拌混合30分鐘，而得到分別含有125g/5kg、250g/5kg的實施例品3之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物的溶液。對5.0kg該溶液混合表8之原料，予以填充至200ml之蒸煮袋，並利用殺菌釜滅菌機(第1種壓力容器；TYPE：RCS-4CRTGN；日阪製作所製)以121℃、20分鐘進行殺菌，製成50kg之本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用液狀營養組成物。此外，該肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用液狀營養組成物中，每100g分別含有250mg、500mg的實施例品3之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品6之乳清蛋白質水解物。

【實施例11】

(肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲料的調製) 將300g脫脂奶粉溶解於402.5g之去離子水後，將2.5g實施例品2之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與5g實施例品8之乳清蛋白質水解物溶解，予以加熱至50℃後，利用ULTRA DISPERSER(ULTRA-TURRAX T-25；IKA JAPAN公司製)，以9,500rpm攪拌混合30分鐘。添加表9之原料後，予以填充至100ml之玻璃瓶，以95℃、15分鐘進行殺菌後予以密封，而調製成本發明之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲料10瓶(內容量100ml)。此外，該肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲料中，每100ml分別含有250mg、500mg的實施例品2之源自乳汁之鹼性蛋白質級分與實施例品8之乳清蛋白質水解物。

【實施例12】

(犬用肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料的調製) 將5kg實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與10kg實施例品7之乳清蛋白質水解物溶解於85kg之去離子水，予以加熱至50℃後，利用TK HOMO MIXER(MARK II 160型；特殊機化工業公司製)，以3,600rpm攪拌混合40分鐘而得到分別含有5g/100g、10g/100g的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品7之乳清蛋白質水解物的溶液。對10kg溶液摻混表10之原料，以120℃、4分鐘進行殺菌，製成本發明之犬用肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料100kg。此外，該犬用肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料中，每100g分別含有500mg、1000mg的實施例品4之源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物與實施例品7之乳清蛋白質水解物。

無

Claims

一種肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其特徵為以源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物為有效成分。
如申請專利範圍第1項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物係對源自乳汁之鹼性蛋白質級分以蛋白質水解酵素實施處理而得。
如申請專利範圍第2項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該蛋白質水解酵素係選自於由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶、木瓜酶構成之群組中的至少1種以上。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該源自乳汁之鹼性蛋白質級分在其胺基酸組成中係含有15重量%以上之鹼性胺基酸。
如申請專利範圍第1至3項中任一項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該源自乳汁之鹼性蛋白質級分，係使乳汁或源自乳汁之原料與陽離子交換樹脂接觸而使鹼性蛋白質吸附並將吸附於該樹脂的級分在鹽濃度0.1M~1.0M的溶出液中溶出所得的級分。
如申請專利範圍第1項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該乳清蛋白質水解物其分解率為25%以上。
如申請專利範圍第1項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該乳清蛋白質水解物係具有以下特徵： (A)分子量為10kDa以下、主峰為200Da~3kDa； (B)ALP(平均胜肽鏈長)為2~8； (C)游離胺基酸含量為20%以下； (D)抗原性為β-乳球蛋白的抗原性的1/10,000以下。
如申請專利範圍第1項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該乳清蛋白質水解物係將乳清蛋白質在pH6~pH10、50℃~70℃使用耐熱性之蛋白質水解酵素一面使其熱變性一面進行酵素分解，並對所得反應液加熱使酵素去活化而得。
如申請專利範圍第1項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑，其中，該乳清蛋白質水解物係將乳清蛋白質在pH6~pH10、20℃~55℃使用蛋白質水解酵素進行酵素分解；將所得反應液升溫至50℃~70℃，並在pH6~pH10、50℃~70℃使用耐熱性之蛋白質水解酵素一面使未分解之乳清蛋白質熱變性一面進行酵素分解；對該反應液加熱使該酵素去活化而得。
一種肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飲食品、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用營養組成物、肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進用飼料，其特徵為含有如申請專利範圍第1至9項中任一項之肌肉萎縮防止及/或肌肉合成促進劑。
一種防止肌肉萎縮及/或促進肌肉合成之方法，其特徵為按每日同時分別攝取5mg以上與10mg以上的源自乳汁之鹼性蛋白質級分及/或源自乳汁之鹼性蛋白質級分分解物、與乳清蛋白質水解物。