WO2024038839A1 - 糸状菌を用いた免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの製造方法 - Google Patents

糸状菌を用いた免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの製造方法 Download PDF

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WO2024038839A1
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immunoglobulin
filamentous fungus
multimeric
iga
genome
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礼子 新藏
潤一 丸山
凌霄 兪
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国立大学法人 東京大学
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing immunoglobulin or multimeric immunoglobulin using a filamentous fungus, a filamentous fungus that can be used in the above production method, and a method for producing the filamentous fungus.
  • transgenic animals, mammalian cell cultures, or plants have been used for the production of useful proteins such as antibodies.
  • transgenic animals and mammalian cell cultures carry the risk of being contaminated with viruses, prions, and the like.
  • Aspergillus oryzae a type of filamentous fungus, has been used for a long time in the production of traditional Japanese brewed products such as sake, soy sauce, and miso, and has been recognized as a national fungus by the Brewing Society of Japan. (Non-patent Document 1: Kitamoto, 2002).
  • A. oryzae has excellent protein secretion ability, and in fact, A. oryzae has excellent protein secretion ability.
  • Useful proteins have been produced using A.
  • Non-patent document 2 Ito et al., 2007; Non-patent document 3: Nakajima et al., 2006; Non-patent document 4: Tsuchiya et al., 1992, Non- Patent Document 5: Tsuchiya et al., 1994).
  • WHO World Health Organization
  • FEO Food and Agriculture Organization
  • A. oryzae is recognized as a highly safe bacterium (Non-Patent Document 6: Barbesgaard et al., 1992), and is also used in the production of enzyme preparations and metabolic compounds for foods, chemical products, and medical products.
  • the heterologous proteins produced by filamentous fungi include crystalline cellulose relaxing proteins derived from heterogeneous filamentous fungi (Non-Patent Document 7: Chen et al. (2010) Appl Environ Microbiol, Patent Document 1: JP 2009-207368A); Plant -derived taste training proteins (Non -Patent Documents 3: NAKAJIMA ET Al. Wide range such as 099776) Contains protein. Aspergillus niger, which is a type of filamentous fungus, and A. It has also been attempted to produce antibody molecules (immunoglobulins) such as IgG using A. oryzae (Patent Document 4, WO2003/089614, Non-Patent Document 8: Huynh et al. (2020), Fungal Biol. Biotechnol ).
  • Immunoglobulins are classified into five types, IgG, IgA, IgM, IgD, and IgE, depending on the structure of their heavy chain constant regions, and each type has different chemical properties.
  • IgM and IgA immunoglobulins are known to function in a monomeric or multimeric state in vivo. Globulin in the multimeric state is called multimeric immunoglobulin.
  • the present disclosure provides a method for producing immunoglobulins or multimeric immunoglobulins using filamentous fungi.
  • the present disclosure provides a filamentous fungus that can be used in the above production method or a method for producing the filamentous fungus.
  • the present disclosure provides a method for producing multimeric immunoglobulins using a filamentous fungus containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome.
  • the present disclosure provides a filamentous fungus characterized by containing a nucleic acid fragment encoding a mammalian immunoglobulin in its genome and producing a multimeric mammalian immunoglobulin.
  • the present disclosure provides a method for producing a filamentous fungus encoding an immunoglobulin in its genome, the method comprising inserting a nucleic acid sequence encoding the immunoglobulin into the genome of the filamentous fungus to be modified.
  • a method for producing a modified filamentous fungus is provided.
  • the present disclosure provides a filamentous fungus characterized by containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome and producing immunoglobulin.
  • this disclosure provides: [Item 1] providing a filamentous fungus containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome; A method for producing multimeric immunoglobulin, comprising the steps of culturing the filamentous fungus; and separating multimeric immunoglobulin in a culture medium from other culture medium components.
  • [Item 2] 2. The method according to item 1, wherein the filamentous fungus contains two or more copies of a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome.
  • [Item 3] 3. The method according to item 1 or 2, wherein the two or more copies of the immunoglobulin-encoding nucleic acid fragment are inserted into a single region of the filamentous fungal genome.
  • the method according to item 1, wherein the immunoglobulin is IgA or IgM, which has a bacterial growth inhibiting effect.
  • the immunoglobulin is IgA or IgM, which has a bacterial growth inhibiting effect.
  • the heavy chain lacks part or all of the C-terminal tailpiece.
  • a filamentous fungus containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome which is used in the method according to item 1 or 2.
  • [Item 7] A multimeric immunoglobulin produced by the method according to item 1 or 2 or a filamentous fungus containing a multimeric immunoglobulin.
  • [Item 8] A composition comprising a multimeric immunoglobulin produced by the method according to item 1 or 2 or a filamentous fungus containing the multimeric immunoglobulin.
  • [Item 9] A step of preparing a filamentous fungus to be modified; inserting two or more copies of a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin into the filamentous fungus to be modified by a single-step genome modification operation; and the genome-modified filamentous fungus into which the nucleic acid fragment has been inserted is placed in a culture medium.
  • a method for producing a filamentous mycelium containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome comprising a step of confirming that the multimeric immunoglobulin is secreted by the A method for producing a filamentous mycelium containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome.
  • the present disclosure has the advantage of providing a method for producing immunoglobulins or multimeric immunoglobulins using filamentous fungi.
  • the present disclosure has the effect of providing a filamentous fungus that can be used in the above production method or a method for producing the filamentous fungus.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co) for producing W27 IgA antibody as a dimer.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of the genome editing plasmid pRGE-gwAup for introducing the expression cassette of the W27 IgA antibody.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Western analysis of the culture supernatant of a dimeric IgA antibody producing strain and its concentrated sample.
  • FIG. 4 is a diagram showing the base sequence of W27 IgA H of the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co) for producing W27 IgA antibody as a dimer.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the structure of the genome editing plasmid pRGE-gwAup for
  • FIG. 5 is a diagram showing the amino acid sequence of W27 IgA H of the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co).
  • FIG. 6 is a diagram showing the base sequence of W27 IgA L of the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co).
  • FIG. 7 is a diagram showing the amino acid sequence of W27 IgA L of the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co).
  • FIG. 8 is a diagram showing the base sequence of W27 IgA J of the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co).
  • FIG. 9 is a diagram showing the amino acid sequence of W27 IgA J of the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing the structure of donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co) for producing W27 IgA antibody in the form of a pentamer.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of Western analysis of the culture supernatant of a pentameric IgA antibody producing strain and its concentrated sample.
  • FIG. 12 is a diagram showing the base sequence of W27 IgA H of the donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co).
  • FIG. 13 is a diagram showing the amino acid sequence of W27 IgA H of the donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co).
  • FIG. 14 is a diagram showing the base sequence of W27 IgA L of the donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co).
  • FIG. 15 is a diagram showing the amino acid sequence of W27 IgA L of the donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of examining the effects of the structure of the IgA H chain C-terminal region and the structure of the linker on multimer formation.
  • Figure 17 shows purified multimeric W27 IgA secreted from dimer-expressing modified Aspergillus aspergillus and dimer-expressing modified CHO cells in a reduced state (left) and a non-reduced state (right). It is a figure showing the results of PAGE and CBB staining.
  • Figure 18 shows purified multimeric W27 IgA secreted from pentamer-expressing modified Aspergillus aspergillus and pentamer-expressing modified CHO cells, which was subjected to SDS-PAGE in a non-reducing state and stained with CBB. It is a figure showing a result.
  • FIG. 19 is a diagram confirming the binding ability of multimeric W27 IgA secreted from dimer-expressing modified Aspergillus aspergillus and dimer-expressing modified CHO cells to E. coli.
  • Figure 20 shows the effects of multimeric W27 IgA secreted from pentamer-expressing modified Aspergillus aspergillus, pentamer-expressing modified CHO cells, dimer-expressing modified Aspergillus aspergillus, and dimer-expressing modified CHO cell into E. coli. It is a diagram confirming the bonding force.
  • FIG. 21 is a diagram confirming the E.
  • FIG. 22 shows C. This is a diagram confirming the inhibitory effect on C. difficile proliferation.
  • the inventors of the present disclosure attempted to produce multimeric immunoglobulin using filamentous fungi based on existing knowledge, but unlike monomeric immunoglobulin, it was difficult to produce multimeric immunoglobulin, especially However, it has been impossible to produce multimeric immunoglobulin by secreting it into the cell culture medium and isolating it, which retains physiological activity.
  • the inventors of the present disclosure surprisingly found that by culturing a filamentous fungus that has a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on its genome, a multimeric immune system that retains physiological activity was produced. It has been unexpectedly discovered that globulins are secreted into the cell culture medium and can be isolated and exploited for their biological activity.
  • filamentous fungi that have a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on their genome have two or more copies of the nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on their genome.
  • compositions that "contains" A may include, in addition to only A, another component, B.
  • “separate” has the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains, and includes, for example, selectively obtaining a specific component from a mixed composition, This means excluding other ingredients.
  • “separate” may have the same meaning as “isolate,” “purify,” “enrich,” and “concentrate” when immunoglobulin is separated from a culture medium. be.
  • protein refers to a substance composed of a polypeptide in which amino acids are linked by peptide bonds.
  • a protein when referred to as a protein, its molecular weight is not particularly limited. Therefore, the term “protein” as used herein includes the meanings of polypeptide and peptide.
  • the present disclosure provides a method for producing immunoglobulins using a filamentous fungus that includes a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome.
  • the method of producing immunoglobulin of the present disclosure includes: preparing a filamentous fungus containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome; a step of culturing the filamentous fungus; Separating the immunoglobulin in the culture medium from other culture medium components.
  • the filamentous fungus that encodes an immunoglobulin in its genome and is used in the method of producing an immunoglobulin of the present disclosure is typically produced by the method for producing a modified filamentous fungus that produces multimeric mammalian immunoglobulin described below. You can use whatever you want.
  • the type of immunoglobulin produced by the method of the present disclosure is not particularly limited, and can be selected from, for example, IgG, IgA, IgM, IgD, or IgE.
  • the immunoglobulin is IgA or IgM.
  • the obtained immunoglobulin has physiological activity, such as antigen-binding activity.
  • the immunoglobulin is IgA or IgM that has physiological activity, such as antigen-binding activity.
  • conditions for culturing filamentous fungi such as medium composition, culture temperature, medium pH, and shaking conditions, can be determined by those skilled in the art based on known techniques. can be adjusted and optimized as desired. By optimizing these conditions, it is possible to improve the yield, yield, quality, etc. of immunoglobulin, and also to produce immunoglobulin having desired properties such as stability.
  • the pH of the medium for culturing filamentous fungi can be adjusted to any pH between 4 and 11.
  • the pH of the medium is selected from the range of 4.0-11.0, 4.5-10.0, 5.0-9.0, 5.5-8.5 or 6.0-8.0. It will be done.
  • the pH of the medium is 5.0 or higher, 5.5 or higher, 6.0 or higher, 6.5 or higher, 7.0 or higher, 7.5 or higher, 8.0 or higher, 8.5 or higher, 9.
  • 0 or more and 9.5 or more and 11.0 or less, 10.5 or less, 10.0 or less, 9.5 or less, 9.0 or less, 8.5 or less, 8.0 or less, 7.5 or less , 7.0 or less, 6.5 or less, 6.0 or less, 5.5 or less, and 5.0 or less, or any combination of these upper and lower limits.
  • immunoglobulins produced by the bacterial cells are separated. It can be separated according to standard methods. Since the filamentous fungi used in the method for producing immunoglobulins of the present disclosure typically secrete and produce immunoglobulins outside the cells, treatments such as destroying the cells for isolation and purification of immunoglobulins are not necessary. Not required. In a preferred embodiment, the method for producing immunoglobulin of the present disclosure does not include a treatment that destroys bacterial cells.
  • the filamentous fungi used in the method for producing immunoglobulins of the present disclosure may produce immunoglobulins within their cells.
  • Filamentous fungi containing immunoglobulins within their bodies are suitable for oral administration.
  • the cells may or may not be destroyed before administration.
  • the operation of separating immunoblobulin from the culture medium can be performed using various methods commonly used for separating proteins in the technical field of the present disclosure. For example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ethanol precipitation, reversed phase HPLC, chromatography on silica or with cation exchange resins such as DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation. , gel filtration, etc. can be used alone or in combination.
  • the immunoglobulin produced by the method of the present disclosure may be of various organisms.
  • it may be an immunoglobulin of humans, non-human primates, mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows, pigs, horses, deer, boars, sheep, goats, camels, etc.
  • the immunoglobulin is a human immunoglobulin.
  • the immunoglobulin produced by the method of the present disclosure may have a natural amino acid sequence in the heavy chain or light chain, or may have a mutation relative to the natural type. Such mutations include amino acid additions, deletions, and substitutions, and include N-terminal or C-terminal truncation. Such mutations can adjust the properties of the produced immunoglobulin, such as its antigen-binding ability and stability.
  • the present disclosure provides a method for producing multimeric immunoglobulins using a filamentous fungus that includes a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome.
  • the method of producing the multimeric immunoglobulin of the present disclosure includes: preparing a filamentous fungus containing a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin in its genome; a step of culturing the filamentous fungus; separating multimeric immunoglobulins in the culture medium from other culture medium components.
  • the filamentous fungus encoding an immunoglobulin in its genome which is used in the method for producing a multimeric immunoglobulin of the present disclosure, is typically produced by the method for producing a modified filamentous fungus that produces immunoglobulins, which will be described below. things can be used.
  • conditions for culturing filamentous fungi such as medium composition, culture temperature, medium pH, and shaking conditions, can be determined using techniques known to those skilled in the art. can be arbitrarily adjusted and optimized based on By optimizing these conditions, it is possible to improve the yield, yield, quality, etc. of immunoglobulin, and also to produce immunoglobulin having desired properties such as stability.
  • the pH of the medium in which the filamentous fungi are cultured can be adjusted to any pH between 4 and 11.
  • the pH of the medium is selected from the range of 4.0-11.0, 4.5-10.0, 5.0-9.0, 5.5-8.5, 6.0-8.0. be able to.
  • the pH of the medium is 5.0 or higher, 5.5 or higher, 6.0 or higher, 6.5 or higher, 7.0 or higher, 7.5 or higher, 8.0 or higher, 8.5 or higher, 9.
  • 0 or more and 9.5 or more and 11.0 or less, 10.5 or less, 10.0 or less, 9.5 or less, 9.0 or less, 8.5 or less, 8.0 or less, 7.5 or less , 7.0 or less, 6.5 or less, 6.0 or less, 5.5 or less, and 5.0 or less, or any combination of these upper and lower limits.
  • multimeric immunoglobulins secreted and produced outside the bacterial cells are separated according to a standard method. be able to. Since the filamentous fungi used in the method for producing multimeric immunoglobulins of the present disclosure typically secrete and produce multimeric immunoglobulins outside of the cells, treatment such as destroying the cells is not essential. In a preferred embodiment, the method of producing a multimeric immunoglobulin of the present disclosure does not include a treatment that destroys bacterial cells.
  • the operation of separating multimeric immunoblobulin from the culture medium can be performed using various methods commonly used for separating proteins in the technical field of the present disclosure. For example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, ethanol precipitation, reversed phase HPLC, chromatography on silica or with cation exchange resins such as DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE, ammonium sulfate precipitation. , gel filtration, etc. can be used alone or in combination.
  • the multimeric form of the isolated immunoglobulin can be confirmed using various methods commonly used in the technical field of the present disclosure. For example, by analyzing immunoglobulin separated from a culture medium using non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), it can be confirmed that the immunoglobulin is a multimer.
  • SDS-PAGE non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • the multimeric immunoglobulin produced by the method of the present disclosure may be immunoglobulin from various organisms.
  • it may be an immunoglobulin of humans, non-human primates, mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows, pigs, horses, deer, boars, sheep, goats, camels, etc.
  • the multimeric immunoglobulin is preferably IgA or IgM.
  • the multimeric immunoglobulin produced by the method of the present disclosure may have a natural amino acid sequence in the heavy chain or light chain, or may have a mutation relative to the natural type. Such mutations include amino acid additions, deletions, and substitutions, and include N-terminal or C-terminal truncation. In one embodiment, an immunoglobulin heavy chain lacking part or all of the C-terminal tailpiece can be used. Such mutations can adjust the properties of the produced multimeric immunoglobulin, such as its multimer-forming ability, antigen-binding ability, and stability.
  • Multimeric immunoglobulins produced by the methods of the present disclosure may include heterologous amino acid sequences to promote multimerization.
  • a heterologous amino acid sequence for example, an amino acid sequence forming a coiled-coil domain can be used.
  • the heterologous amino acid sequence is of cartilage oligomeric matrix protein (COMP), mannose binding protein A, coiled-coil serine-rich protein 1, polypeptide release factor 2, SNAP-25, SNARE, Lac repressor, or apolipoprotein E. You can use one derived from any of them.
  • the heterologous amino acid sequence for promoting multimerization can be, for example, the coiled-coil assembly domain of cartilage oligomer matrix protein (COMP) described in Japanese Patent Publication No. 2016-512309.
  • the heterologous amino acid sequence can be fused to the N-terminus or C-terminus, preferably the C-terminus, of the immunoglobulin protein.
  • a variety of linker sequences can be used in the fusion as long as the desired physiological function of the multimeric immunoglobulin is not lost, but it is not necessary.
  • a linker consisting of the amino acid sequence SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDAS or a linker consisting of the amino acid sequence SSADDAAADAAAADDAAADDAAADAS can be used.
  • the heterologous sequence linker or linker to facilitate multimerization can be fused to the truncated N-terminus or C-terminus of the immunoglobulin.
  • the present disclosure provides a method for producing immunoglobulin or multimeric immunoglobulin, which contains a nucleic acid fragment encoding a mammalian immunoglobulin in its genome, and Provided is a modified filamentous fungus characterized by producing.
  • the modified filamentous fungus can be used in the above-mentioned (method for producing immunoglobulin) or (method for producing multimeric immunoglobulin) of the present disclosure, and can produce immunoglobulin or multimeric immunoglobulin inside or outside the microbial cell. produce or secrete.
  • the modified filamentous fungus that is characterized by producing the multimeric immunoglobulin of the present disclosure typically has two or more copies of the immunoglobulin-encoding nucleic acid fragment on its genome.
  • the modified filamentous fungus of the present disclosure has 2 or more copies, 3 or more copies, 4 or more copies, 5 or more copies, 6 or more copies, 7 or more copies, 8 or more copies of a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on its genome. , 9 or more copies, 10 or more copies.
  • the greater the number of copies of the immunoglobulin-encoding nucleic acid sequence contained on the genome the easier it is to obtain a modified filamentous fungus that more efficiently produces or secretes multimeric immunoglobulin.
  • Filamentous fungi that produce dimeric immunoglobulins have, for example, 2 or more copies, 3 or more copies, 4 or more copies, 5 or more copies, 6 or more copies, 7 or more copies, 8 copies or more of a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on their genome. Have at least 9 copies, 10 or more copies.
  • Filamentous fungi that produce trimeric immunoglobulins have, for example, 3 or more copies, 4 or more copies, 5 or more copies, 6 or more copies, 7 or more copies, 8 or more copies, or 9 copies of a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on their genome. I have more than 10 copies.
  • a filamentous fungus that produces pentameric immunoglobulin has, for example, 5 or more copies, 6 or more copies, 7 or more copies, 8 or more copies, 9 or more copies, 10 or more copies of a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin on its genome. ing. Nucleic acid fragments encoding immunoglobulins are inserted or substituted within a single region or multiple regions on the genome. Typically, immunoglobulin-encoding nucleic acid fragments are inserted into or substituted for a single region on the genome.
  • a single region on the genome means one continuous region on the genome of the filamentous fungus. In one embodiment, a single region on the genome has a size of, for example, about one genetic locus. For example, a single region on the genome has a size of about 3 to 12 kbp, but is not particularly limited.
  • the modified filamentous fungus characterized by producing the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin of the present disclosure is produced by culturing a filamentous fungus that has undergone genome modification treatment, and then producing the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin inside the fungus or in the culture medium. It can be obtained by identifying the filamentous fungi that produce or secrete it.
  • the multimeric immunoglobulin secreted by the filamentous fungus subjected to genome modification treatment is in a multimeric form using various methods commonly used in the technical field of the present disclosure. For example, by analyzing immunoglobulin separated from the culture medium using non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), it can be confirmed that the multimeric immunoglobulin is a multimer. .
  • genome modification technology gene editing technology
  • various methods commonly used in the technical field of the present disclosure can be used.
  • the CRISPR-Cas system meganuclease (MN), zinc finger nuclease (ZFN), transcription activation-like effector nuclease (TALEN), and the like can be utilized.
  • MN meganuclease
  • ZFN zinc finger nuclease
  • TALEN transcription activation-like effector nuclease
  • the modified filamentous fungus can be It is possible to obtain a genome-modified filamentous fungus in which no plasmid for genome modification remains.
  • the genome-modified filamentous fungus according to the present disclosure can be produced by modifying the genome of a conventionally known filamentous fungus.
  • the filamentous fungi to be modified are not particularly limited.
  • Non-limiting examples of filamentous fungi that can be used include Aspergillus aculeatus, Aspergillus luchuensis, Aspergillus caesiellus, Aspergillus candidus, Aspergillus carneus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus, Aspergillus ficherianus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatu s, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger , Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus penicilloides, Aspergillus restrictic tus, Asper
  • Trichoderma catoptron Trichoderma cremeum, Trichoderma ceramicum, Trichoderma cerinum, Trichoderma chloro sporum, Trichoderma chromospermum, Trichoderma cinnamomeum, Trichoderma citrinaviride, Trichoderma crassum, Trichoderma cremeum, Trichoderma dingleyeae, Trichoderma dorotheae, Trichoderma effusum, Trichoderma erinaceum, Trichoderma estonicu m, Trichoderma fertile, Trichoderma gelatinosus, Trichoderma ghanense, Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum, Trichoderma helicum, Trichoderma hoderma intricatum, Trichoderma konilangbra, Trichoderma koningii, Trichoderma koningiopsis, Trichoderma longibrachiatu m, Trichoderma longipile, Trichoderma minutisporum, Trichoderma oblongisporum, Tricho
  • MA 3642 Trichoderma sp. PPRI 3559, Trichoderma spirale, Trichoderma stramineum, Trichoderma strigosum, Trichoderma stromaticum, Trichoderma surrotundum, Trichoderma taiwanense, Trichoderma thailandicum, Trichoderma thelephoricola, Trichoderma theobromicola, Tri Trichoderms such as Trichoderma tomentosum, Trichoderma velutinum, Trichoderma virens, Trichoderma viride and Trichoderma viridescens genus a filamentous fungi , Rhizomucor filamentous fungi such as Rhizomucor pusillus and Rhizomucor miehei, and Penicilli such as Penicillium notatum and Penicillium chrysogenum.
  • filamentous fungi of the genus Rhizopus examples include filamentous fungi of the genus Rhizopus, filamentous fungi of the genus Rhizopus such as Rhizopus oryzae, Acremonium cellulolyticus, Humicola grisea, and Thermoaseus aurantiacus. Not limited. In particular, it is preferable to modify filamentous fungi of the genus Aspergillus, and it is especially preferable to modify Aspergillus oryzae.
  • the filamentous fungus to be modified may be a wild strain or a mutant strain into which various mutations have been introduced.
  • a mutant strain with a disrupted intravacuolar acid protease gene described in WO2007/099776 a mutant strain with reduced function of an autophagy-related gene disclosed in JP2012-179011, etc. It's okay.
  • the modified filamentous fungus of the present disclosure can be a filamentous fungus that has undergone another modification in addition to the modification that introduces a nucleic acid sequence encoding an immunoglobulin into the genome.
  • modifications such as disruption of the intravacuolar acidic protease gene as described in WO2007/099776 and reduction of the function of autophagy-related genes as disclosed in JP-A-2012-179011 can be made.
  • the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin encoded by the nucleic acid fragment contained in the genome of the modified filamentous fungus of the present disclosure may be the immunoglobulin of various organisms.
  • it may be an immunoglobulin of humans, non-human primates, mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows, pigs, horses, deer, boars, sheep, goats, camels, etc.
  • the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin is preferably IgA or IgM.
  • the present disclosure provides a method for producing a filamentous fungus encoding an immunoglobulin in its genome, the method comprising inserting a nucleic acid sequence encoding the immunoglobulin into the genome of a filamentous fungus to be modified.
  • the method for producing a modified filamentous fungus of the present disclosure typically includes the steps of preparing a filamentous fungus to be modified; A step of inserting a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin into the genome of a filamentous fungus to be modified by a single-step genome modification operation; or confirming that the multimeric immunoglobulin is secreted.
  • a single-step genome modification operation does not include an operation of transducing a filamentous fungus with a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin more than once.
  • a single-step genome modification procedure involves transducing a filamentous fungus with a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin and identifying the transduced fungus using a negative or positive marker. Including process.
  • the method for producing a modified filamentous fungus of the present disclosure includes the step of inserting a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin into the genome of a filamentous fungus to be modified by a single-step genome modification operation, It may also involve modification operations. For example, when producing a modified filamentous fungus containing two or more copies of a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin, two or more copies of the nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin are produced in the genome of the filamentous fungus to be modified by a single-step genome modification operation.
  • a single step genome modification procedure may involve transducing one copy of the immunoglobulin-encoding nucleic acid fragment.
  • any other genome modification manipulations beneficial to the production of immunoglobulins may be involved.
  • the genetic structure of the filamentous fungus can be modified by a method other than genome modification.
  • a heterologous gene may be transduced by a plasmid.
  • the method for producing a modified filamentous fungus of the present disclosure includes additional genome modification or other modification, it may include a combination of multiple genome modification or modification steps, and the step may include a nucleic acid fragment encoding an immunoglobulin. , before or after the step of inserting into the genome of the filamentous fungus to be modified, or both.
  • the filamentous fungus prepared in the method for producing the modified filamentous fungus of the present disclosure is not particularly limited.
  • the various filamentous fungi mentioned above as targets for genome modification in can be used.
  • the genome modification operation used in the method for producing the modified filamentous fungus of the present disclosure is not particularly limited.
  • various genome modification techniques mentioned above modified filamentous fungus characterized by producing immunoglobulin or multimeric immunoglobulin can be used.
  • vectors or nucleic acid constructs commonly used in the technical field of the present disclosure can be used as vectors or nucleic acid constructs used in the genome modification operations included in the method for producing modified filamentous fungi of the present disclosure.
  • a vector having a selectable marker gene, a cloning site, and a control region (promoter and terminator) disclosed in JP-A No. 2012-179011 can be used.
  • the A. nidulans-derived DNA fragment AMA1 which enables autonomous replication of plasmids, as disclosed in JP 2018-191551, and high expression significantly worsen growth.
  • a vector containing a DNA fragment designed to allow high expression of the Aoace2 gene under specific conditions can be suitably used.
  • the step of confirming that the genome-modified filamentous fungus into which the nucleic acid fragment has been inserted, which is included in the method for producing a modified filamentous fungus of the present disclosure, secretes multimeric immunoglobulin into the culture medium is a technical field of the present disclosure. This can be confirmed using various commonly used methods. For example, by analyzing immunoglobulin separated from a culture medium using non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), it can be confirmed that the immunoglobulin is a multimer.
  • SDS-PAGE non-reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin produced by the modified filamentous fungus of the present invention can be provided as a composition containing purified globulin, as well as a composition containing the modified filamentous fungus itself expressing the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin. , a composition containing a part or whole of a culture solution of a modified filamentous fungus expressing immunoglobulin or multimeric immunoglobulin, or a composition containing a part or whole of the culture solution and the modified filamentous fungus. can.
  • the composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition, a food composition, a feed composition, etc., but is not limited thereto.
  • the compositions of the invention include pharmaceutical compositions, food compositions, and feed compositions, each of which comprises a material composition used to manufacture the final product.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is used for the prevention or treatment of diseases or disorders by utilizing the effects of immunoglobulins or multimeric immunoglobulins produced by modified filamentous fungi.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises C. used for the treatment of diseases associated with B. difficile bacteria.
  • C. Diseases associated with C. difficile bacteria include, but are not particularly limited to, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, allergies, asthma, obesity, autoimmune diseases, neonatal necrotizing enterocolitis, etc. Inflammatory bowel disease is preferred.
  • Such a pharmaceutical composition according to the present invention only needs to contain an effective amount of the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin produced by the modified filamentous fungus according to the present invention, for example, in 100% by weight of the pharmaceutical composition.
  • the type of disease to be treated, the dosage form, the administration method, the subject to be administered, the degree of symptoms of the subject to be administered, and It can be set as appropriate, taking into account the degree of effect exerted by administration.
  • an effective amount means the amount of the multimeric immunoglobulin produced by the modified filamentous fungus of the present invention that exerts the desired physiological effect in a living body.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive together with the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin produced using the modified filamentous fungus according to the present invention.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or excipients include any carriers, diluents, excipients, suspending agents, lubricants, adjuvants, vehicles, delivery systems, emulsifiers, disintegrants, absorbents, preservatives, It means a surfactant, a coloring agent, a flavoring agent, or a sweetener, and any known one may be used.
  • Individuals to be administered in this way are not particularly limited, but include, for example, humans, mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows, pigs, and birds such as chickens. .
  • the dosage and administration method of the pharmaceutical composition vary depending on the type of intestinal disease that the individual to be administered suffers from, gender, species, age, general condition, severity of the disease, degree of desired effect, etc. Yes, it is.
  • the dosage may normally be appropriately set within the range of 0.001 to 100 mg/kg/day.
  • the administration method is not particularly limited, but it is preferable to administer directly to the gastrointestinal tract, and examples of such administration methods include oral administration, nasal administration, transmucosal administration, and enteral administration.
  • enteral administration is not limited to administration through the anus, but also includes administration through a tube or the like inserted into the digestive tract from outside the individual, such as through a gastrostomy.
  • the position where the digestive tract is inserted is not limited to the intestine, but includes the esophagus, stomach, small intestine (including duodenum, jejunum, ileum, etc.), large intestine (including cecum, colon, rectum, etc.), and the like.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered in the above amount once a day, or may be administered in divided doses several times a day. Further, the administration interval may be daily, every other day, every week, every other week, every 2 to 3 weeks, every month, every other month, or every 2 to 3 months, as long as it has a therapeutic effect on the above-mentioned diseases.
  • the food composition or feed composition according to the present invention contains the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin produced by the modified filamentous fungus according to the present invention.
  • the food composition according to the present invention can be used in any form that is ingested as food, such as general foods, foods for specified health uses including foods for conditionally specified health uses, nutritional supplements, functional foods, and foods for patients. include. By using such a food composition or feed composition, it is possible to utilize the physiological activity of the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin produced by the modified filamentous fungus according to the present invention.
  • the food composition can be provided as a food composition labeled as for intestinal regulation, intestinal environment improvement, intestinal environment optimization, intestinal putrefaction prevention, etc.
  • the blending ratio of immunoglobulin or multimeric immunoglobulin produced by modified filamentous fungi in such food compositions or feed compositions is not particularly limited, and may vary depending on the form, use, etc. of the food composition or feed composition. It may be adjusted as appropriate. Usually, the amount may be about 0.001 to 99% by weight based on the total amount of the composition.
  • the intake amount of the food composition or feed composition according to the present invention is not particularly limited, and can be set depending on the desired effect, the degree of the desired effect, and other conditions.
  • the amount of the immunoglobulin or multimeric immunoglobulin according to the present invention is usually about 0.001 to 100 mg/kg/day, which is taken once to several times a day. You may.
  • the specific form of the above-mentioned food composition is not particularly limited, but includes, for example, beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, lactic acid drinks, and milk drinks; frozen desserts such as ice cream, ice sherbet, and shaved ice.
  • Confectionery such as candy, candies, gum, chocolate, tablets, snacks, biscuits, jellies, jams, creams, baked goods; Noodles such as soba, udon, hazelnut, Chinese noodles, instant noodles; Kamaboko, ham, sausage, etc.
  • Dairy products such as processed milk and fermented milk
  • Fats and oil processed foods such as salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening, whipped cream, and dressings
  • Seasonings such as sauces and sauces
  • Soup Examples include stews, salads, side dishes, furikake, pickles, bread, and cereals.
  • forms such as powders, granules, capsules, troches, tablets, syrups, etc. can be mentioned.
  • the food composition or feed composition according to the present invention is provided as a composition containing purified globulin, as well as a composition containing a modified filamentous fungus itself expressing immunoglobulin or multimeric immunoglobulin, or a composition containing modified filamentous fungus itself expressing immunoglobulin or multimeric immunoglobulin.
  • the present invention can be provided as a composition containing part or all of a culture solution of a modified filamentous fungus that expresses immunoglobulin, or a composition containing part or all of the culture solution and the modified filamentous fungus.
  • the food composition or feed composition of the present invention is provided as a composition produced through a filamentous fungus cultivation process, preferably a fermentation process.
  • the culture or fermented product may be used as a food composition as it is, or a part of the fermented product purified may be used as a food composition.
  • a solid component containing filamentous fungi can be filtered from a culture or fermented product to provide a liquid composition.
  • Such a composition can contain the filamentous fungus itself, a part of the filamentous fungus, an extract of the filamentous fungus, a component serving as a medium for the filamentous fungus, or a mixture thereof.
  • Non-limiting examples of such food compositions include mirin, sake, amazake, miso, soy sauce, salt koji, rice koji, soy sauce koji, barley koji, soybean koji, koji natto, sake lees fish koji: fish sauce Including ragi (Indonesian), ketchup (Indonesian miso, no tomato), sauce: hishi-shujo, moromi, mochi-koji, soy-koji, jeonggukjang, bonito flakes, and other miscellaneous knots.
  • the feed composition of the present invention can be provided as a feed composition labeled for intestinal regulation, intestinal environment improvement, intestinal environment optimization, intestinal rot prevention, etc. for various animals.
  • the specific form of the feed composition described above is not particularly limited, but for example, as long as the effect of the feed composition according to the present invention described above is not impaired, it may be mixed with a normal feed, or added to a normal feed as necessary.
  • the feed composition may be prepared by mixing the feed composition with ingredients that can be added to the feed, or the feed composition itself may be used as the feed.
  • the pomace used in the production of various filamentous fungi-fermented foods can be mixed into feed.
  • the genome editing plasmid pRGE-gwAup (Fig. 2), which expresses sgRNA that performs double-strand DNA cleavage targeting upstream of the wA gene, was developed by Katayama et al. [Appl. Environ. Microbiol. , 85: e01896-18, 2019].
  • the DNA fragment containing the sgRNA coding sequence and the U6 terminator was ligated to ppAsATC9a2 cut with SmaI to create pRGE-gRT6.
  • the U6 promoter was connected to pRGE-gRT6 cut with SmaI to create pRGE-gwAup.
  • donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co) was prepared as follows. First, the plasmid pwAup-DN H+LlinkerSmaI (co) was constructed. A DNA fragment consisting of the amyB promoter, the signal sequence of AmyB, and the coding region of the H chain of W27 IgA was amplified.
  • a DNA fragment consisting of the amyB terminator, the amyB promoter, the signal sequence of AmyB, the coding region of the W27 IgA L chain, and the amyB terminator was amplified, and at the same time a linker sequence and a SmaI cleavage site were also introduced at the 3' end of the amyB terminator.
  • These two DNA fragments were connected to plasmid pwAup-DN cut with SmaI using the In-Fusion HD cloning kit to create pwAup-DN H+LlinkerSmaI (co).
  • Plasmid pwAup-DN H+L+J (co) was constructed.
  • a DNA fragment consisting of the amyB promoter, the signal sequence of AmyB, the coding region of the W27 IgA J chain, and the amyB terminator was amplified.
  • This DNA was connected to plasmid pwAup-DN H+Llinker SmaI (co) cut with SmaI using the In-Fusion HD cloning kit to create pwAup-DN H+L+J (co).
  • donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co) was prepared as follows.
  • the signal sequence of AmyB and the coding region of the H chain and C-terminal linker of W27 IgA were amplified.
  • a DNA fragment consisting of part of the linker sequence, COMP domain, amyB terminator, amyB promoter, AmyB signal sequence, and W27 IgA L chain coding region was amplified.
  • the lysine residue originally contained in the linker connecting the H chain and COMP domain was replaced with alanine.
  • These two DNA fragments were ligated with the SmaI-cut plasmid pwAupADN using the In-Fusion HD cloning kit and pwAup-DN HAAComp+L ( co) was prepared.
  • IgA production and ammonium sulfate precipitation To produce IgA antibodies, 5x DPY medium (10% Dextrin, 5% Hipolypeptone, 2.5% Yeast extract, 0.5% K2HPO4 , 0.05% MgSO4.7H2O , pH 8 .0) or DPY medium (2% Dextrin, 1% Hipolypeptone, 0.5% Yeast extract, 0.5% K 2 HPO 4 , 0.05% MgSO 4.7H 2 O, pH 8.0). did. Conidia of the IgA-producing strain were inoculated into a liquid medium at 1 ⁇ 10 7 conidia per 100 mL, and cultured with shaking at 150 rpm at 30° C. for 8 days. The culture supernatant was collected by filtration with Miracloth (Merck Millipore). The amount of IgA produced in the culture medium of the transformants was analyzed by ELISA assay or Western analysis.
  • Concentration of produced IgA by ammonium sulfate precipitation was performed as follows. The culture supernatant obtained by filtration using Miracloth (Merck Millipore) was incubated at 10,000 x g, 4°C, for 10 minutes when cultured in 5x DPY medium, and at 3,500 rpm (2,150 x g), centrifuged at 4°C for 10 minutes, and collected the supernatant. The pH was adjusted by adding 1/10 volume of 10 ⁇ PBS buffer, and when culturing in 5 ⁇ DPY medium, the mixture was further diluted 5 times with PBS buffer.
  • the purified antibody was quantified by ELISA method. Details of the antibody quantification method are as follows. First, Anti-goat-mouse IgA (Southern Biotech: 1040-01) was diluted to 2 ⁇ g/ml with 0.05 M Na 2 CO 3 and added to C96MaxiSorp Nunc-Immuno Plate (Thermo Fisher) (hereinafter EL). ISA plate and 50 ⁇ l/well of the solution was added to each well of the sample, and the mixture was solidified overnight at 4°C.
  • EL C96MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
  • PBS-BSA bovine serum albumin
  • plate washer After washing the plate three times with PBS using a Vaccu-Pette/96 multiwell pipetter (Sigma-Aldrich) (hereinafter referred to as plate washer), add 150 ⁇ l of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) (Wako) (PBS-BSA). / well and allowed to stand overnight at 4°C for blocking.
  • BSA bovine serum albumin
  • a series of antibody solutions were prepared in 96-well plates. The dilution series of the antibody solution is 1:1 (x1, where x1/100 and x1/1000 of the purified antibody are x1), 3x (x1/3), 10x (x1/10), and 30x (x1/30).
  • serial dilutions were prepared using PBS-BSA. After completely removing PBS-BSA from the plate, serially diluted solutions were added at 50 ⁇ l/well and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed three times with PBS (PBS-T) containing 0.05% Tween 20 (Chem Cruz) using a plate washer, and then the secondary antibody Alkaline Phosphatase (ALP)-conjugated danti-goat mouseIgA (Southern Bio Tech: 1040 -04) was diluted in PBS-BSA to a final concentration of 0.5 ⁇ g/ml, added at 50 ⁇ l/well, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • PBS-T PBS-T
  • Tween 20 0.05% Tween 20
  • ALP Alkaline Phosphatase
  • E. coli ELISA for E. coli was performed.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ or BW38092 and its mutants, all K12 strains
  • was aerobically cultured in LB medium) at 37° C. overnight and collected by centrifugation.
  • the bacteria were suspended in 0.05M Na 2 CO 3 buffer and coated on an ELISA plate (overnight at 4° C.).
  • each antibody dilution series was prepared and added to a 96-well plate, and reacted at room temperature for about 1 hour. Thereafter, the plate was washed with PBS supplemented with 0.05% Tween 20, and the secondary antibody Alkaline Phosphatase (ALP)-conjugated anti-goat mouse IgA (Southern Biotech: 1040-04) was added to PBS-BSA. Concentration 0.5 ⁇ g The solution was diluted to 50 ⁇ l/well, added at 50 ⁇ l/well, and left to react at room temperature for 1 hour.
  • ALP Alkaline Phosphatase
  • E. coli and C. difficile bacterial growth inhibition test (anaerobic) Escherichia coli was cultured anaerobically in LB medium (overnight at 37°C). All subsequent operations were performed in an anaerobic chamber. The culture solution was centrifuged to collect bacteria, and then washed with LB medium. After diluting the bacterial solution 10 times with culture medium, add SYTO24 (Invitrogen) and counting beads included in the Cell Viability Kit (Becton Dickinson), and count the number of SYTO24-positive viable bacteria by flow cytometry (measurement under aerobic conditions). Calculated from comparison with counting beads. Bacteria were diluted with LB medium to 300 cells/5 ⁇ l.
  • Example 1 Preparation of dimeric IgA producing strain A.
  • IgA dimers are composed of H chain, L chain, and J chain.
  • A. Codon modifications were made based on the codon usage frequency of tef1, one of the genes with the highest expression level in S. oryzae.
  • A. The protein was designed to be transferred to the endoplasmic reticulum and secreted after translation by ligating a sequence encoding the signal sequence of ⁇ -amylase AmyB, which is secreted in the highest amount in A. oryzae.
  • the promoter and terminator used were those of the amyB gene (Fig. 1).
  • W27 IgA RS_H000_L001
  • the above sequence contains a mouse-derived signal sequence, but the W27 IgA used for genome modification of filamentous fungi in this example contains a signal sequence of ⁇ -amylase AmyB, as shown below.
  • Cassettes expressing the H chain, L chain, and J chain of the W27 IgA antibody were connected in tandem.
  • Such an expression cassette was designed to be inserted into the wA gene locus by homologous recombination by placing it inside the upstream region of the pigment synthesis gene wA and the ORF internal region, and the donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co) was produced ( Figure 1).
  • the NS1D1- ⁇ P10 strain was transformed using the aforementioned donor DNA plasmid pwAup-DN H+L+J (co) for dimeric IgA expression and the genome editing plasmid pRGE-gwAup.
  • pwAup-DN H+L+J (co) for dimeric IgA expression
  • pRGE-gwAup for dimeric IgA expression
  • pRGE-gwAup the genome editing plasmid pRGE-gwAup.
  • the obtained transformed strain was analyzed for the copy number and production amount of the expression cassette of dimeric IgA, and the strain with a large copy number and high production amount was named "H+L+J (co) #1", and the following Used for production experiments.
  • the dimeric IgA producing strain "H+L+J(co) #1" was inoculated into a liquid medium, and after culturing for 8 days, the culture supernatant was collected and concentrated approximately 10 times by ammonium sulfate precipitation. As a result of Western analysis, H chain, L chain, and J chain were detected in the culture supernatant and concentrated sample, and their production in the culture solution was confirmed (FIG. 3).
  • Example 2 Production of pentamer IgA production strain
  • the COMP domain was used.
  • the COMP (cartilage oligomeric matrix protein) domain is a coiled-coil domain derived from cartilage oligomeric matrix protein and is used to induce pentamer formation.
  • A Gene modification technology using genome editing technology CRISPR/Cas9 system in S. oryzae [Katayama et al. , Appl. Environ. Microbiol. , 85:e01896-18, 2019].
  • the COMP domain was fused to the C-terminal side of the H chain of the W27 IgA antibody, and a cassette for expression together with the L chain was connected in tandem.
  • the NS1D1- ⁇ P10 strain was transformed using the prepared donor DNA plasmid pwAup-DN HAAComp+L (co) and the genome editing plasmid pRGE-gwAup.
  • the obtained transformed strain was analyzed for the copy number and production amount of the pentameric IgA expression cassette, and the strain with a large copy number and high production amount was named "HAAComp+L (co) #1" and the following Used for production experiments.
  • Pentameric IgA producing strain "HAAComp+L (co) #1” was inoculated into a liquid medium, and after 8 days of culture, the culture supernatant was collected and concentrated approximately 10 times by ammonium sulfate precipitation. As a result of Western analysis, H chain and L chain were detected in the culture supernatant and concentrated sample, and their production in the culture solution was confirmed (FIG. 11).
  • Example 3 Influence of composition of IgA fusion protein
  • a fusion protein with a COMP sequence added to the C-terminus of the IgA H chain the influence of the composition of the IgA H chain C-terminal region and linker composition on multimer formation was examined. did. Genome-modified CHO cells were produced using a nucleic acid construct encoding IgA having a natural L chain and a fusion protein having the following structure as the H chain, and the state of multimerization of secreted IgA was investigated.
  • Example 4 Binding properties of multimeric immunoglobulin produced using genome-modified filamentous fungi The binding ability of multimeric W27 IgA secreted from Aspergillus oryzae and CHO cells to Escherichia coli was confirmed. In addition, as described in International Publication No. 2014/142084, W27 IgA antibody expressed in mammalian cells is known to bind to E. coli. Multimerized W27 IgA secreted from Aspergillus oryzae and CHO cells was purified and the ability of these multimeric IgAs to bind E. coli was tested.
  • the multimeric IgA used was subjected to SDS-PAGE in a reduced state (left) and in a non-reduced state, and the results of CBB staining are shown in FIGS. 17 and 18.
  • the modified koji strain expressing dimeric IgA Koji HLJ#1
  • the modified koji strain expressing pentamer IgA Koji HAA COMP+L#1)
  • expression of multimeric IgA was confirmed. It should be noted that the IgA antibody produced by Aspergillus oryzae showed a tendency for the band to spread on SDS-PAGE in a non-reduced state.
  • FIG. 19 shows the test results confirming the binding of the multimeric IgA (KojiHLJ#1) obtained from the modified koji strain expressing dimeric IgA "H+L+J (co) #1" to the E. coli BW38029 strain. Shown below. Similarly, FIG.
  • Multimeric IgA expressed in modified CHO cells (CHO W27 dimer), multimeric IgA expressed from modified koji strain "H+L+J (co) #1” expressing dimeric IgA (Koji HLJ# obtained in two separate trials) 1-No.1 and Koji HLJ#1-No.2), as well as a negative control ( Figure 20).
  • the multimeric antibodies obtained from the modified koji strain "HAAComp+L(co) #1" expressing pentameric IgA were obtained from the modified koji strain "H+L+J(co) #1” expressing dimeric IgA. It was confirmed that the antibody had stronger binding properties than the obtained multimeric antibody.
  • LB plate E. coli medium plate
  • the multimeric IgA antibody secreted from the modified koji strain expressing multimeric IgA exhibits a growth-inhibiting effect on E. coli, similar to the multimeric IgA antibody secreted from CHO cells. confirmed.
  • a negative control containing no antibody, multimeric W27 IgA expressed in dimeric IgA-expressing modified CHO cells, and W27 IgG antibody expressed in CHO cells were used.
  • Dimeric IgA antibody (KojiHLJ#1) obtained from Aspergillus oryzae is similar to multimeric W27 IgA expressed in dimeric IgA-expressing modified CHO cells. It showed an inhibitory effect on the growth of P. difficile.
  • the W27IgG antibody expressed in CHO cells showed almost no such growth-inhibiting effect.
  • IgA antibodies secreted from Aspergillus oryzae are similar to IgA antibodies secreted from CHO cells. It was confirmed that the present invention has a growth-inhibitory effect on P. difficile.
  • the multimeric IgA antibody secreted from the modified koji strain expressing multimeric IgA has excellent physiological activity similar to that of the multimeric IgA antibody secreted from CHO cells. .

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Abstract

本開示は、糸状菌を用いて免疫グロブリンを製造する方法、上記製造方法に利用し得る糸状菌、および当該糸状菌を製造する方法に関する。より具体的には、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を用いて、免疫グロブリンを製造する方法、ゲノム中に哺乳類免疫グロブリンをコードする核酸断片を含有し、哺乳類免疫グロブリンを製造することを特徴とする糸状菌、および、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする糸状菌を製造する方法であって、前記免疫グロブリンをコードする核酸配列（典型的には２コピー以上）を、改変対象の糸状菌のゲノムに挿入することを含む、改変糸状菌を製造する方法に関する。

Description

糸状菌を用いた免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの製造方法
　本開示は、糸状菌を用いて免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造する方法、上記製造方法に利用し得る糸状菌、および当該糸状菌を製造する方法に関する。
　これまで、抗体などの有益なタンパク質の製造のために、トランスジェニック動物、哺乳類細胞培養、又は植物などが使用されている。しかしながら、トランスジェニック動物及び哺乳類細胞培養は、ウイルスやプリオンなどに汚染されるというリスクを有する。また、上記動物、動物細胞又は植物を用いた生産システムにおいて規模を拡大することは困難であり、遺伝子組換え植物では、組換えタンパク質の生産に約１０ヶ月を要し、一方、哺乳類細胞培養では、約３ヶ月を要する。
　糸状菌の一種である麹菌（アスペルギルス・オリゼ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）は日本酒、醤油、味噌といった日本における伝統的醸造製品の製造に古くから用いられてきた糸状菌であり、日本醸造学会により国菌として認定されている微生物である（非特許文献１：Ｋｉｔａｍｏｔｏ，　２００２）。Ａ．ｏｒｙｚａｅは優れたタンパク質分泌能力を有しており、実際にＡ．ｏｒｙｚａｅを用いて有用なタンパク質が生産されている（非特許文献２：Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２００７；　非特許文献３：Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６；　非特許文献４：Ｔｓｕｃｈｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２，　非特許文献５：Ｔｓｕｃｈｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）。また、世界保健機関　（ＷＨＯ）　および国際食糧農業機関　（ＦＡＯ）　によりＡ．ｏｒｙｚａｅは安全性の高い菌として認められており（非特許文献６：Ｂａｒｂｅｓｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）、食品・化成品・医療品向けの酵素剤および代謝化合物の生産にも利用されている。
　糸状菌によって産生される異種タンパク質には、異種糸状菌由来の結晶セルロース緩和タンパク質（非特許文献７：Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　（２０１０）　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、特許文献１：特開２００９－２０７３６８号公報）、植物由来の味覚修飾タンパク質（非特許文献３：Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．　（２００６）　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、特許文献２：ＷＯ２００５／０７３３７２号公報）、ヒトリゾチームタンパク質（特許文献３：ＷＯ２００７／０９９７７６号公報）など広範なタンパク質が含まれる。糸状菌の一種であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒおよびＡ．ｏｒｙｚａｅを用いてＩｇＧなどの抗体分子（免疫グロブリン）を産生することも試みられている（特許文献４、ＷＯ２００３／０８９６１４号公報、非特許文献８：Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ．　（２０２０）、Ｆｕｎｇａｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）。
　免疫グロブリンは重鎖定常領域の構造の相違によってＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類に分類され、それぞれ化学的特性が異なっている。特に、ＩｇＭ、ＩｇＡ免疫グロブリンは生体内で単量体の状態又は多量体の状態で機能することが知られている。当該多量体の状態のグロブリンは多量体免疫グロブリンと呼ばれる。
特開２００９－２０７３６８号公報 ＷＯ２００５／０７３３７２号公報 ＷＯ２００７／０９９７７６号公報 ＷＯ２００３／０８９６１４号公報
Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｋｉｔａｍｏｔｏ，　Ａｄｖ　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００２），５１：１２９－１５３ Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　２００７．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ（２００７），３６０：４０７－４１１ Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００６），７２：３７１６－３７２３ Ｔｓｕｃｈｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２），３８：１０９－１１４ Ｔｓｕｃｈｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９４），　５８：８９５－８９９ Ｂａｒｂｅｓｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２），３６：５６９－５７２ ：Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１０），７６（８）：２５５６－２５６１． ：Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ．（２０２０）Ｆｕｎｇａｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０２０）７：７　ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ４０６９４－０２０－０００９８－ｗ
　本開示は、糸状菌を用いて免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造する方法を提供する。別の態様において、本開示は上記製造方法に利用し得る糸状菌または当該糸状菌を製造する方法を提供する。
　本開示の発明者らが鋭意研究を進めた結果、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を有する糸状菌を培養することで、生理活性、例えば細菌増殖抑制活性等を保持した免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンが産生されること、および当該免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンが細胞培養培地中に分泌されること、並びに、産生された免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを分離してその生理活性を利用し得ることを予想外にも見出した。
　当該知見に基づいて、本開示は一態様において、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を用いて、多量体免疫グロブリンを製造する方法を提供する。
　また、本開示は別の態様において、ゲノム中に哺乳類免疫グロブリンをコードする核酸断片を含有し、多量体哺乳類免疫グロブリンを製造することを特徴とする、糸状菌を提供する。
　また、本開示は別の態様において、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする糸状菌を製造する方法であって、前記免疫グロブリンをコードする核酸配列を、改変対象の糸状菌のゲノムに挿入することを含む、改変糸状菌を製造する方法を提供する。
　また、本開示は別の態様において、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含有し、免疫グロブリンを製造することを特徴とする糸状菌を提供する。
　より具体的には、本開示は以下を提供する。
[項目１]
　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を準備する工程；
　前記糸状菌を培養する工程；および
　培養培地中の多量体免疫グロブリンを他の培養培地成分から分離する工程を含む、多量体免疫グロブリンを製造する方法。
[項目２]
　前記糸状菌がゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を２コピー以上含有することを特徴とする、項目１に記載の方法。
[項目３]
　前記２コピー以上の免疫グロブリンをコードする核酸断片が、糸状菌ゲノムの単一領域に挿入されている、項目１または２に記載の方法。
[項目４]
　前記免疫グロブリンが、細菌増殖抑制作用を有するＩｇＡまたはＩｇＭである、項目１に記載の方法。
[項目５]
　前記免疫グロブリンにおいて、重鎖がC末端テールピースの一部または全部領域を欠く項目１に記載の方法。
[項目６]
　項目１または２に記載の方法で用いられる、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌。
[項目７]
　項目１または２に記載の方法で製造された多量体免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを含む糸状菌。
[項目８]
　項目１または２に記載の方法で製造された多量体免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを含む糸状菌を含む組成物。
[項目９]
　改変対象の糸状菌を準備する工程；
　単一段階のゲノム改変操作によって、免疫グロブリンをコードする核酸断片の２コピー以上を、前記改変対象の糸状菌に挿入する工程；および
　前記核酸断片の挿入されたゲノム改変糸状菌が、培養培地中に多量体免疫グロブリンを分泌することを確認する工程を含む、
　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌糸状菌を製造する方法。
[項目１０]
　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を２コピー以上含む遺伝子改変糸状菌であって、多量体免疫グロブリンを産生することができる、糸状菌。
[項目１１]
　前記免疫グロブリンが、ＩｇＡまたはＩｇＭである、項目１０に記載の糸状菌。
[項目１２]
　項目１０または１１に記載の糸状菌を含む、組成物。
[項目１３]
　項目１０または１１に記載の糸状菌の培養上清を含む、組成物。
　本開示は、糸状菌を用いて免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造する方法を提供するという効果を有する。別の態様において、本開示は上記製造方法に利用し得る糸状菌または当該糸状菌を製造する方法を提供するという効果を有する。
図１は、Ｗ２７　ＩｇＡ抗体を２量体で生産するためのドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）の構成を示す模式図である。 図２はＷ２７　ＩｇＡ抗体の発現カセットを導入するためのゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐの構成を示す模式図である。 図３は、２量体ＩｇＡ抗体生産株の培養上清およびその濃縮サンプルのウエスタン解析の結果を示す図である。 図４は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｈの塩基配列を示す図である。 図５は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｈのアミノ酸配列を示す図である。 図６は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｌの塩基配列を示す図である。 図７は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｌのアミノ酸配列を示す図である。 図８は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｊの塩基配列を示す図である。 図９は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｊのアミノ酸配列を示す図である。 図１０は、Ｗ２７　ＩｇＡ抗体を５量体で生産するためのドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）の構成を示す模式図である。 図１１は、５量体ＩｇＡ抗体生産株の培養上清およびその濃縮サンプルのウエスタン解析結果を示す図である。 図１２は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｈの塩基配列を示す図である。 図１３は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｈのアミノ酸配列を示す図である。 図１４は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｌの塩基配列を示す図である。 図１５は、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）のＷ２７　ＩｇＡ　Ｌのアミノ酸配列を示す図である。 図１６は、ＩｇＡのＨ鎖Ｃ末端領域の構成およびリンカーの構成が多量体形成に与える影響を検討した結果を示す図である。 図１７は、２量体発現化改変麹菌および２量体発現化改変ＣＨＯ細胞から分泌された多量体Ｗ２７　ＩｇＡについて、精製したものを還元状態（左）および非還元状態（右）にてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色を行った結果を示す図である。 図１８は、５量体発現化改変麹菌および５量体発現化改変ＣＨＯ細胞から分泌された多量体Ｗ２７　ＩｇＡについて、精製したものを非還元状態にてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色を行った結果を示す図である。 図１９は、２量体発現化改変麹菌および２量体発現化改変ＣＨＯ細胞から分泌された多量体Ｗ２７　ＩｇＡについて、大腸菌への結合力を確認した図である。 図２０は、５量体発現化改変麹菌、５量体発現化改変ＣＨＯ細胞、２量体発現化改変麹菌、２量体発現化改変ＣＨＯ細胞から分泌された多量体Ｗ２７　ＩｇＡについて、大腸菌への結合力を確認した図である。 図２１は、２量体発現化改変麹菌および２量体発現化改変ＣＨＯ細胞から分泌された多量体Ｗ２７　ＩｇＡについて、大腸菌増殖抑制効果を確認した図である。 図２２は、２量体発現化改変麹菌および２量体発現化改変ＣＨＯ細胞から分泌された多量体Ｗ２７　ＩｇＡについて、Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ増殖抑制効果を確認した図である。
　本開示の発明者らは、既存の知見に基づいて糸状菌を用いて多量体免疫グロブリンを製造することを試みたが、単量体免疫グロブリンと異なり、多量体免疫グロブリンを製造すること、特に、生理活性を保持した多量体免疫グロブリンを細胞培地中に分泌させ、これを単離することで多量体免疫グロブリンを製造することは不可能であった。本開示の発明者らは、独自の試行錯誤を試みた結果、驚くべきことに、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を有する糸状菌を培養することで、生理活性を保持した多量体免疫グロブリンが細胞培養培地中に分泌され、これを分離してその生理活性を利用し得ることを予想外にも見出した。典型的にはゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を有する糸状菌は、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を２コピー以上有している。
（定義）
　本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
　他に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、全て、本発明が属する技術分野の当業者により通常に理解されているものと同じ意味を有する。
　本明細書において、数値ｘに関連して、「約」という用語を用いる場合、当該値は例えば、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％の範囲内で変動し得ることを意味する。
　本明細書において、「含む」という用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常に理解されているものと同じ意味であるが、例えば「含む」ことおよび「からなる」を内包し、具体的には、Ａを「含む」組成物は、Ａのみを含む場合に加えて、他の構成要素、Ｂを含むこともある。
　本明細書において「分離する」とは、本発明が属する技術分野の当業者により通常に理解されているものと同じ意味であるが、例えば混合組成物から特定の成分を選択的に取得し、他の成分を排除することを意味する。本明細書において、免疫グロブリンを培養培地から分離するような場合、「分離する」は「単離する」、「精製する」、「富化する」、「濃縮する」と同じ意味を有することがある。
　本明細書において「タンパク質」とは、アミノ酸がペプチド結合により連結したポリペプチドにより構成される物質をいう。本明細書においてタンパク質という場合にはその分子量は特に限定されない。したがって、本明細書においてタンパク質という場合は、ポリペプチドおよびペプチドの意味をも包含する。
（免疫グロブリンを製造する方法）
　本開示は一態様において、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を用いて、免疫グロブリンを製造する方法を提供する。
　本開示の免疫グロブリンを製造する方法は、
　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を準備する工程、
　前記糸状菌を培養する工程、
　培養培地中の免疫グロブリンを他の培養培地成分から分離する工程
　を含む。
　本開示の免疫グロブリンを製造する方法において使用される、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする糸状菌として、典型的には後述する多量体哺乳類免疫グロブリンを製造する改変糸状菌を製造する方法によって製造されるものを使用することができる。本開示の方法で製造される免疫グロブリンの種類は特に限定されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥから選択することができる。ある好ましい態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＡまたはＩｇＭである。ある好ましい態様では、得られる免疫グロブリンは、生理活性、例えば抗原への結合活性を有する。ある好ましい態様では、免疫グロブリンは、生理活性、例えば抗原への結合活性を有するＩｇＡまたはＩｇＭである。
　本開示の免疫グロブリンを製造する方法の、糸状菌を培養する工程において、糸状菌を培養する条件、例えば培地の組成、培養温度、培地ｐＨ、振とう条件は、当業者が公知の技術に基づいて任意に調節および最適化することができる。これら条件を最適化することで、免疫グロブリンの収量、収率、品質などを向上させることができる他、安定性などにおいて所望の特性を有する免疫グロブリンを製造することができる。
　一態様において、糸状菌を培養する培地のｐＨは、４～１１の間の任意のｐＨで調節することが可能である。好ましくは、培地のｐＨは４．０～１１．０、４．５～１０．０、５．０～９．０、５．５～８．５または６．０～８．０の範囲から選ばれる。一態様において、培地のｐＨは５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上、７．５以上、８．０以上、８．５以上、９．０以上および、９．５以上、並びに、１１．０以下、１０．５以下、１０．０以下、９．５以下、９．０以下、８．５以下、８．０以下、７．５以下、７．０以下、６．５以下、６．０以下、５．５以下および５．０以下、またはこれら上限および下限の任意の組み合わせの範囲に設定することができる。
　本開示の免疫グロブリンを製造する方法において、培養培地中の免疫グロブリンを他の培養培地成分から分離する工程では、菌体により（菌体内にまたは好ましくは菌体外に）生産された免疫グロブリンを定法に従って分離することができる。本開示の免疫グロブリンを製造する方法において使用される糸状菌は典型的には免疫グロブリンを菌体外に分泌生産するため、免疫グロブリンの単離および精製のために菌体を破壊するといった処理は必須ではない。好ましい態様において、本開示の免疫グロブリンを製造する方法は、菌体を破壊する処理を含まない。本開示の免疫グロブリンを製造する方法において使用される糸状菌は免疫グロブリンを菌体内に生産してもよい。免疫グロブリンを菌体内に含む糸状菌は、経口投与に適する。免疫グロブリンを菌体内に含む糸状菌は、経口投与する場合には、投与前に菌体を破壊してもよいが、破壊しなくてもよい。
　培養培地から免疫ブロブリンを分離する操作は、本開示の技術分野においてタンパク質を分離するために一般的に利用される各種方法を用いて実施できる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニュウム沈殿法、ゲルろ過等の手法を単独で又は組み合わせて使用できる。
　本開示の方法で製造される免疫グロブリンは、様々な生物の免疫グロブリンであってよい。例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等の免疫グロブリンであってもよい。ある好ましい態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。 
　本開示の方法で製造される免疫グロブリンは重鎖又は軽鎖に天然型のアミノ酸配列を有してもよく、天然型に対する変異を有するものであってもよい。当該変異はアミノ酸の追加、削除、置換を含み、N末端またはC末端の短縮を含む。当該変異により、製造される免疫グロブリンの抗原結合能、安定性などの特性を調整することができる。
（多量体免疫グロブリンを製造する方法）
　本開示は一態様において、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を用いて、多量体免疫グロブリンを製造する方法を提供する。
　本開示の多量体免疫グロブリンを製造する方法は、
　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を準備する工程、
　前記糸状菌を培養する工程、
　培養培地中の多量体免疫グロブリンを他の培養培地成分から分離する工程
　を含む。
　本開示の多量体免疫グロブリンを製造する方法において使用される、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする糸状菌として、典型的には後述する免疫グロブリンを製造する改変糸状菌を製造する方法によって製造されるものを使用することができる。
　本開示の多量体免疫グロブリンを製造する方法の、糸状菌を培養する工程において、糸状菌を培養する条件、例えば培地の組成、培養温度、培地ｐＨ、振とう条件は、当業者が公知の技術に基づいて任意に調節および最適化することができる。これら条件を最適化することで、免疫グロブリンの収量、収率、品質などを向上させることができる他、安定性などにおいて所望の特性を有する免疫グロブリンを製造することができる。
　一態様において、糸状菌を培養する培地のｐＨは、４～１１の間の任意のｐＨで調節す
ることが可能である。好ましくは、培地のｐＨは４．０～１１．０、４．５～１０．０、５．０～９．０、５．５～８．５、６．０～８．０の範囲から選ぶことができる。一態様において、培地のｐＨは５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上、７．５以上、８．０以上、８．５以上、９．０以上および、９．５以上、並びに、１１．０以下、１０．５以下、１０．０以下、９．５以下、９．０以下、８．５以下、８．０以下、７．５以下、７．０以下、６．５以下、６．０以下、５．５以下および５．０以下、またはこれら上限および下限の任意の組み合わせの範囲に設定することができる。
　本開示の多量体免疫グロブリンを製造する方法において、培養培地中の多量体免疫グロブリンを他の培養培地成分から分離する工程では、菌体外に分泌生産された多量体免疫グロブリンを定法に従って分離することができる。本開示の多量体免疫グロブリンを製造する方法において使用される糸状菌は典型的には多量体免疫グロブリンを菌体外に分泌生産するため、菌体を破壊するといった処理は必須ではない。好ましい態様において、本開示の多量体免疫グロブリンを製造する方法は、菌体を破壊する処理を含まない。
　培養培地から多量体免疫ブロブリンを分離する操作は、本開示の技術分野においてタンパク質を分離するために一般的に利用される各種方法を用いて実施できる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニュウム沈殿法、ゲルろ過等の手法を単独で又は組み合わせて使用できる。
　分離された免疫グロブリンが多量体形態であることは、本開示の技術分野に一般的に使用される各種方法を用いて確認できる。例えば、培養培地から分離された免疫グロブリンを、非還元状態のドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にて解析することにより、当該免疫グロブリンが多量体であることを確認できる。
　本開示の方法で製造される多量体免疫グロブリンは、様々な生物の免疫グロブリンであってよい。例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等の免疫グロブリンであってもよい。多量体免疫グロブリンは、好ましくはＩｇＡまたはＩｇＭである。
　本開示の方法で製造される多量体免疫グロブリンは重鎖又は軽鎖に天然型のアミノ酸配列を有してもよく、天然型に対する変異を有するものであってもよい。当該変異はアミノ酸の追加、削除、置換を含み、N末端またはC末端の短縮を含む。一態様において、免疫グロブリンの重鎖として、Ｃ末端のテールピースの一部または全部を欠くものを使用することができる。当該変異により、製造される多量体免疫グロブリンの多量体形成能、抗原結合能、安定性などの特性を調整することができる。
　本開示の方法で製造される、多量体免疫グロブリンは多量体化を促進するための異種アミノ酸配列を含んでもよい。このような異種アミノ酸配列として、例えばコイルドコイルドメインを形成するアミノ酸配列を利用することができる。一態様において、当該異種アミノ酸配列は、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ－２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサー、またはアポリポタンパク質Ｅのうちのいずれかに由来するものを利用することができる。好ましい態様において、多量体化を促進するための異種アミノ酸配列として、例えば特表２０１６―５１２３０９に記載される軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）のコイルドコイル集合ドメインすることができる。当該異種アミノ酸配列は、免疫グロブリンタンパク質のN末端またはC末端、好ましくはＣ末端に融合させることができる。当該融合には多量体免疫グロブリンの所望の生理機能を喪失しない限り様々なリンカー配列を使用することができるが、使用しなくてもよい。一態様において、アミノ酸配列ＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＡＳからなるリンカーあるいは、アミノ酸配列ＳＳＡＤＤＡＡＡＤＡＡＡＡＤＤＡＡＡＤＤＡＡＡＤＡＳからなるリンカーを使用することができる。一態様において、当該多量体化を促進するための異種配列リンカーまたはリンカーは、免疫グロブリンの短縮されたN末端またはC末端に融合することができる。
（免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造することを特徴とする改変糸状菌）　本開示は別の態様において、ゲノム中に哺乳類免疫グロブリンをコードする核酸断片を含有し、免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造することを特徴とする改変糸状菌を提供する。当該改変糸状菌は、上記本開示の（免疫グロブリンを製造する方法）または（多量体免疫グロブリンを製造する方法）に使用することができ、菌体内または菌体外に免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを産生または分泌する。
　本開示の多量体免疫グロブリンを製造することを特徴とする改変糸状菌は、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸断片を典型的には２コピー以上有している。一態様において、本開示の改変糸状菌は、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を２コピー以上、３コピー以上、４コピー以上、５コピー以上、６コピー以上、７コピー以上、８コピー以上、９コピー以上、１０コピー以上有している。ゲノム上に含まれる、免疫グロブリンをコードする核酸配列のコピー数が多いほど、より効率的に多量体免疫グロブリンを産生または分泌する改変糸状菌を取得することが容易である。二量体免疫グロブリンを産生する糸状菌は、例えば、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を２コピー以上、３コピー以上、４コピー以上、５コピー以上、６コピー以上、７コピー以上、８コピー以上、９コピー以上、１０コピー以上有している。三量体免疫グロブリンを産生する糸状菌は、例えば、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を３コピー以上、４コピー以上、５コピー以上、６コピー以上、７コピー以上、８コピー以上、９コピー以上、１０コピー以上有している。五量体免疫グロブリンを産生する糸状菌は、例えば、ゲノム上に免疫グロブリンをコードする核酸配列を５コピー以上、６コピー以上、７コピー以上、８コピー以上、９コピー以上、１０コピー以上有している。免疫グロブリンをコードする核酸断片は、ゲノム上の単一領域又は複数の領域内に挿入又は置換される。典型的には、免疫グロブリンをコードする核酸断片はゲノム上の単一領域に挿入または置換される。ゲノム上の単一領域とは、当該糸状菌ゲノム上の一つの連続した領域を意味する。一態様において、ゲノム上の単一領域は、例えば１遺伝子座程度の大きさを有する。例えば、ゲノム上の単一領域は、３～１２ｋｂｐ程度の大きさを有するが、特に限定されない。
　本開示の免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造することを特徴とする改変糸状菌は、ゲノム改変処理を行った糸状菌を培養し、菌体内または培養培地中に免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを産生または分泌する糸状菌を同定することで取得することができる。
　ゲノム改変処理を行った糸状菌が分泌する多量体免疫グロブリンが多量体形態であることは、本開示の技術分野で一般的に使用される各種方法を用いて確認できる。例えば、培養培地から分離された免疫グロブリンを、非還元状態のドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にて解析することにより、当該多量体免疫グロブリンが多量体であることを確認できる。
　本開示のゲノム改変糸状菌を製造するために使用するゲノム改変技術（ゲノム編集技術）には、本開示の技術分野に一般的に使用される各種方法を利用することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、メガヌクレアーゼ（ＭＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などを利用することができる。一態様において、改変後の糸状菌内にゲノム改変用のプラスミドが残存しない改変技術を用いることが好ましい。例えば、特開２０１８－１９１５５１に開示される、多段階による多重変異株作成用のゲノム編集プラスミドを単一段階の変異操作または多段階の変異操作に利用することで、改変後の糸状菌内にゲノム改変用のプラスミドが残存しないゲノム改変糸状菌を得ることができる。
　本開示に係るゲノム改変糸状菌は、従来公知の糸状菌のゲノムを改変することで作製できる。改変対象とする糸状菌としては特に限定されない。使用できる糸状菌の非限定的な例として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｅｓｉｅｌｌｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｎｄｉｄｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｒｎｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｄｅｆｌｅｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓｔｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ等のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ　ｖａｒ．　ａｅｑｕａｔｏｒｉａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ　ｖａｒ．　Ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃａｔｏｐｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｅｒａｍｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｅｒｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｒａｓｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｃｒｅｍｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｄｏｒｏｔｈｅａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｅｆｆｕｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｅｒｉｎａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｆｅｒｔｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｇｈａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｍａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈｅｌｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｏｐｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｏｓｓｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｉｎｕｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐ．　ＭＡ　３６４２、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐ．　ＰＰＲＩ　３５５９、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐｉｒａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｉｃｏｌｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ等のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属糸状菌、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ等のＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ属糸状菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎｏｔａｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ等のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属糸状菌、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ等のＲｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｇｒｉｓｅａ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｅｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓを挙げることができるがこれらに限定されない。特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌を改変対象とすることが好ましく、中でもＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅを改変対象とすることが好ましい。
　また、改変対象とする糸状菌は、野生株でも良く、各種の変異が導入された変異株でも良い。例えば、ＷＯ２００７／０９９７７６号公報に記載される、液胞内酸性プロテアーゼ遺伝子を破壊した変異株、特開２０１２－１７９０１１号公報に開示されるオートファジー関連遺伝子の機能を低減させた変異株などを用いてもよい。
　別の態様において、本開示の改変糸状菌として、免疫グロブリンをコードする核酸配列をゲノムに導入する改変に加えて別の改変を加えた糸状菌を用いることができる。例えば、ＷＯ２００７／０９９７７６号公報に記載される、液胞内酸性プロテアーゼ遺伝子の破壊、特開２０１２－１７９０１１号公報に開示されるオートファジー関連遺伝子の機能低減といった改変を加えることができる。
　本開示の改変糸状菌のゲノムに含まれる核酸断片がコードする免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンは、様々な生物の免疫グロブリンであってよい。例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、イノシシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等の免疫グロブリンであってもよい。免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンは、好ましくはＩｇＡまたはＩｇＭである。
（免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを産生する改変糸状菌を製造する方法）
　本開示は一態様において、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする糸状菌を製造する方法であって、前記免疫グロブリンをコードする核酸配列を、改変対象の糸状菌のゲノムに挿入することを含む、免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを産生する改変糸状菌を製造する方法を提供する。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法は、典型的には
　改変対象の糸状菌を準備する工程；
　単一段階のゲノム改変操作によって、免疫グロブリンをコードする核酸断片を、改変対象の糸状菌のゲノムに挿入する工程；および
　前記核酸断片の挿入されたゲノム改変糸状菌が、培養培地中に免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを分泌することを確認する工程を含む。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法において、単一段階のゲノム改変操作とは、免疫グロブリンをコードする核酸断片を糸状菌に形質導入する操作を２回以上含まないことを意味する。典型的には、単一段階のゲノム改変操作は、免疫グロブリンをコードする核酸断片を糸状菌に形質導入する工程、および、形質導入された糸状菌をネガティブマーカーまたはポジティブマーカを利用して同定する工程を含む。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法は、単一段階のゲノム改変操作によって、免疫グロブリンをコードする核酸断片を改変対象の糸状菌のゲノムに挿入する工程を含んでいる限り、さらに追加のゲノム改変操作を伴ってもよい。例えば、免疫グロブリンをコードする核酸断片を２コピー以上含む改変糸状菌を製造する場合、単一段階のゲノム改変操作によって、免疫グロブリンをコードする核酸断片の２コピー以上を改変対象の糸状菌のゲノムに挿入する工程に加えて、単一段階のゲノム改変操作によって、免疫グロブリンをコードする核酸断片を１コピー形質導入する工程を伴ってもよい。一態様において、免疫グロブリンの産生に有益な他の任意のゲノム改変操作を伴ってもよい。
　一態様において、本開示の改変糸状菌を製造する方法において、ゲノム改変以外の方法で糸状菌の遺伝子構成を修飾することができる。例えば、プラスミドによって異種遺伝子を形質導入してもよい。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法において、追加のゲノム改変または他の修飾を含む場合、当該ゲノム改変または修飾工程を複数組み合わせて含んでもよく、当該工程は、免疫グロブリンをコードする核酸断片を、改変対象の糸状菌のゲノムに挿入する工程の前、もしくは後あるいはその両方であってもよい。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法において準備される糸状菌は特に限定されない。例えば、上記（免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造することを特徴とする改変糸状菌）においてゲノム改変対象として言及した各種糸状菌を用いることができる。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法において使用するゲノム改変操作は特に限定されない。例えば、上記（免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを製造することを特徴とする改変糸状菌）において言及した各種ゲノム改変技術を用いることができる。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法に含まれるゲノム改変操作に用いられるベクターまたは核酸構築物として、本開示の技術分野で一般的に使用される各種ベクターまたは核酸構築物を使用することができる。例えば、特開2012-179011に開示される選択可能マーカー遺伝子、クローニング部位及び制御領域（プロモーター及びターミネーター）を有するベクターを用いることができる。一態様において、ゲノム改変操作に　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合、特開２０１８－１９１５５１に開示される、プラスミドの自律複製を可能とするA. nidulans由来のDNA断片AMA1および高発現により生育を著しく悪化させるAoace2遺伝子を特定の条件で高発現できるよう設計したDNA断片を含むベクターを好適に使用することができる。
　本開示の改変糸状菌を製造する方法に含まれる、前記核酸断片の挿入されたゲノム改変糸状菌が、培養培地中に多量体免疫グロブリンを分泌することを確認する工程は、本開示の技術分野で一般的に使用される各種方法を用いて確認できる。例えば、培養培地から分離された免疫グロブリンを、非還元状態のドデシルナトリウム硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にて解析することにより、当該免疫グロブリンが多量体であることを確認できる。
（組成物）
　本発明の改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンは、精製したグロブリンを含む組成物として提供される他、免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを発現する改変糸状菌自体を含む組成物、免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを発現する改変糸状菌の培養液の一部または全体を含む組成物、または、前記改変糸状菌と培養液の一部もしくは全体を含む組成物として提供することができる。本発明の組成物は、好ましくは医薬組成物、食品組成物、飼料組成物などの形態で提供されるが、これらに限定されない。一態様において、本発明の組成物は医薬組成物、食品組成物および飼料組成物は、それぞれ最終的な製品を製造するために用いられる材料組成物を含む。
（医薬組成物）
　本発明に係る医薬組成物は、改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの効果を利用して、疾患または障害の予防または治療に用いられる。
　一態様において、本発明に係る医薬組成物は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する疾患の治療のために使用される。
　Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌と関連する疾患とは、特に限定はされないが、例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、肥満、自己免疫疾患、新生児壊死性腸炎等が挙げられ、中でも炎症性腸疾患が好ましい。
　このような本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの有効量を含んでいればよく、例えば、医薬組成物１００重量％中の本発明に係る抗体の含有割合が０．００１～９９．９９重量％の範囲になるように、対象とする疾患の種類、剤型、投与方法、投与対象、投与対象者の症状の度合い、並びに投与によって発揮される効果の程度等を勘案して、適宜設定することができる。
　本明細書にて使用する用語「有効量」とは、本発明に係る改変糸状菌で製造される多量体免疫グロブリンが生体において所望の生理効果を奏する量を意味する。
　本発明に係る医薬組成物には、本発明に係る本発明に係る改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンと共に、薬学的に許容可能な担体或いは添加物を配合しても良い。薬学的に許容可能な担体或いは添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、または甘味料を意味し、公知のものを採用すればよい。
　この様な投与対象となる個体は、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ等の哺乳類、ニワトリなどの鳥類等が挙げられる。
　当該医薬組成物の投与量並びに投与方法は、投与対象となる個体が罹患する腸内疾患の種類、性別、種、年齢、全身状態、疾患の重篤度、所望する効果の程度等に区々ではある。投与量としては、通常は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で適宜設定すればよい。
　また、投与方法については、特に限定はされないが、消化管に直接投与することが好ましく、このような投与方法として、例えば経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経腸投与等が挙げられる。
　なお、経腸投与とは、肛門を介した投与には限られず、例えば胃瘻等の様に個体外からチューブ等を消化管に挿入して、それを経由した投与も含まれる。消化管を挿入する位置は腸に限らず、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸等を含む。）、大腸（盲腸、結腸、直腸等を含む。）等が挙げられる。
　なお、このような本発明に係る医薬組成物の投与は、上記の量を１日に１度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、上記疾患に対する治療効果を有する範囲において、投与間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、２～３週毎、毎月、隔月または２～３ヶ月毎でもよい。
（食品組成物および飼料組成物）
　本発明に係る食品組成物または飼料組成物は、本発明に係る改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを含む。本発明に係る食品組成物は、一般の食品の他、条件付き特定保健用食品を含む特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等、食品として摂取されるあらゆる形態を包含する。この様な食品組成物または飼料組成物を使用することによって、本発明に係る改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの備える生理活性を利用することができる。食品組成物は、整腸用、腸内環境改善用、腸内環境最適化用、腸内腐敗防止用等と表示された食品組成物として提供することができる。
　この様な食品組成物または飼料組成物における改変糸状菌で製造される免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの配合割合は特に限定はされず、食品組成物または飼料組成物の形態、用途等に応じて適宜調整すればよい。通常は組成物の総量に対して、０．００１～９９重量％程度とすればよい。
　本発明に係る食品組成物または飼料組成物の摂取量は特に限定はされず、目的とする効果、その目的とする度合い、並びにその他の諸条件などに応じて設定することができる。例えば、本発明に係る免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンの量に換算して、通常は０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／日程度とすればよく、これを１日１回～数回に分けて摂取してもよい。
　上述の食品組成物の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、乳飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺等の麺類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物、パン、シリアル等を例示できる。また、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、トローチ、タブレット、シロップ等の形態が挙げられる。
　本発明に係る食品組成物または飼料組成物は、精製したグロブリンを含む組成物として提供される他、免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを発現する改変糸状菌自体を含む組成物、免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを発現する改変糸状菌の培養液の一部または全体を含む組成物、または、前記改変糸状菌と培養液の一部もしくは全体を含む組成物として提供することができる。一態様において、本発明の食品組成物または飼料組成物は、糸状菌の培養過程、好ましくは発酵過程を経て製造される組成物として提供される。このような場合、培養物あるいは醸造発酵物をそのまま食品組成物としてもよく、醸造発酵物の一部を精製したものを食品組成物としてもよい。例えば、培養物あるいは醸造発酵物から糸状菌を含む固形成分をろ過して液体組成物として提供することができる。このような組成物は、糸状菌自体、糸状菌の一部、糸状菌の抽出物、糸状菌の培地となる成分、あるいはこれらの混合物を含むことができる。このような食品組成物の非限定的な例は、みりん、酒、甘酒、味噌、醤油、塩麹、米麹、醤油麹、麦麹、豆麹、麹納豆、酒粕魚麹：魚醤のもと、ラギ（インドネシア）、ケチャップ（インドネシアの味噌、トマトは一切なし）、醤：ひしお酒醸、醪糟、餅麹、撒麹、チョングッチャン、鰹節およびその他の雑節等を含む。
　本発明の飼料組成物は、各種動物に対する整腸用、腸内環境改善用、腸内環境最適化用、腸内腐敗防止用等と表示された飼料組成物として提供することができる。
　上述の飼料組成物の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば上述した本発明に係る飼料組成物が発揮する効果が損なわれない限りにおいて、通常の飼料に混合、又は必要に応じて通常の飼料に配合可能な成分と共に混合して飼料組成物とすればよく、飼料組成物そのものを飼料としてもよい。例えば、各種糸状菌発酵食品の製造に用いた搾りかす配合して飼料とすることができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは例示に過ぎず本開示を限定するものではない。
　方法と材料
１．ＤＮＡ操作方法
　ＤＮＡ操作には大腸菌ＤＨ５αを使用した。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ　ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を使用した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤクローニングキット（ＴａＫａＲａ）をプラスミド作製に使用した。プラスミドはアルカリＳＤＳ法により抽出した。塩基配列は、ファスマック株式会社での受託により解析を行った。
２．ｗＡ遺伝子への遺伝子導入のためのゲノム編集プラスミドの作製
　ｗＡ遺伝子の上流を標的として二本鎖ＤＮＡ切断を行うｓｇＲＮＡを発現するゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐ（図２）は、Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．［Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］に記載のとおり作製した。ｓｇＲＮＡコード配列とＵ６ターミネーターを含むＤＮＡ断片を、ＳｍａＩで切断したｐｐＡｓＡＴＣ９ａ２と接続し、ｐＲＧＥ－ｇＲＴ６を作製した。Ｕ６プロモーターは、ＳｍａＩで切断したｐＲＧＥ－ｇＲＴ６と接続して、ｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐを作製した。
３．プラスミドの作製方法
　２量体ＩｇＡの生産株取得の形質転換のために、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）（図１）を以下のとおり作製した。
　最初に、プラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋ＬｌｉｎｋｅｒＳｍａＩ（ｃｏ）を構築した。ａｍｙＢプロモーター、ＡｍｙＢのシグナル配列とＷ２７　ＩｇＡのＨ鎖のコード領域からなるＤＮＡ断片を増幅した。ａｍｙＢターミネーター、ａｍｙＢプロモーター、ＡｍｙＢのシグナル配列とＷ２７　ＩｇＡのＬ鎖のコード領域、およびａｍｙＢターミネーターからなるＤＮＡ断片を増幅し、同時にリンカー配列とＳｍａＩ切断部位もａｍｙＢターミネーターの３’末端に導入した。これらの２つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤクローニングキットを使用してＳｍａＩで切断したプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮと接続し、ｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋ＬｌｉｎｋｅｒＳｍａＩ（ｃｏ）を作製した。
　続いて、プラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）を構築した。ａｍｙＢプロモーター、ＡｍｙＢのシグナル配列とＷ２７　ＩｇＡのＪ鎖のコード領域、およびａｍｙＢターミネーターからなるＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤクローニングキットを使用してＳｍａＩで切断したプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋ＬｌｉｎｋｅｒＳｍａＩ（ｃｏ）と接続し、ｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）を作製した。
　５量体ＩｇＡ発現ＤＮＡの生産株取得の形質転換のために、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）（図１０）を、以下のとおり作製した。
　ＡｍｙＢのシグナル配列とＷ２７　ＩｇＡのＨ鎖およびＣ末側のリンカーのコード領域を増幅した。リンカー配列の一部、ＣＯＭＰドメイン、ａｍｙＢターミネーター、ａｍｙＢプロモーター、ＡｍｙＢのシグナル配列およびＷ２７　ＩｇＡのＬ鎖のコード領域からなるＤＮＡ断片を増幅した。これらのＤＮＡ断片の増幅の際に、Ｈ鎖とＣＯＭＰドメインをつなぐリンカーにもともと含まれていたリジン残基をアラニンに置換した。これら２つのＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤクローニングキットを使用してＳｍａＩで切断したプラスミドｐｗＡｕｐＡＤＮと接続し、ｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（
ｃｏ）を作製した。
４．Ａ．ｏｒｙｚａｅの形質転換によるＩｇＡ生産株の取得
　２量体ＩｇＡの生産株取得のための形質転換には、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）（図１）およびゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐ（図２）を用いた。５量体ＩｇＡの生産株取得のための形質転換には、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）（図１０およびゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐ（図２）を用いた。形質転換の宿主として、プロテアーゼ遺伝子１０重破壊株ＮＳｌＤ１－ΔＰ１０　［Ｙｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　８９：７４７－７５９，　２０１１］を使用した。Ａ．ｏｒｙｚａｅの形質転換は、既報［Ｍａｒｕｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　７６５：４４７－４５６，２０１１］の方法に従い行った。
５．Ｗ２７　ＩｇＡの生産と硫安沈殿　
　ＩｇＡ抗体を生産するために、５×ＤＰＹ培地（１０％　Ｄｅｘｔｒｉｎ，　５％　Ｈｉｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，　２．５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　０．５％　Ｋ２ＨＰＯ４，０．０５％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，ｐＨ　８．０）、またはＤＰＹ培地（２％　Ｄｅｘｔｒｉｎ，１％　Ｈｉｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ，０．５％　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％　Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，ｐＨ　８．０）を使用した。ＩｇＡ生産株の分生子を１００ｍＬあたり１×１０７個となるように液体培地に植菌して、３０℃で８日間１５０ｒｐｍで振とう培養を行った。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過することにより培養上清を回収した。形質転換体の培養液へのＩｇＡ生産量は、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタン解析により解析した。
６．生産したＩｇＡの硫安沈殿による濃縮
　生産したＩｇＡの硫安沈殿による濃縮は以下のとおり行った。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたろ過により得た培養上清について、５×ＤＰＹ培地による培養では１００００×ｇ，４℃，１０分間、ＤＰＹ培地を使用した場合は３，５００　ｒｐｍ（２，１５０×ｇ），４℃，１０分間で遠心して、その上清を回収した。１／１０容量の１０×ＰＢＳバッファーを加えてｐＨを調整し、５×ＤＰＹ　培地による培養ではさらにＰＢＳバッファーで５倍に希釈した。１　Ｌあたり３９０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加して６０％飽和で、混合物を穏やかに攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。その後、１０，０００×ｇ，４℃，２０分間遠心して沈殿を得て、少量の６０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液を加えて１０，０００×ｇ，４℃，１０分間遠心により洗浄した。沈殿をＰＢＳバッファーで溶解し、１４，０００ＭＷＣＯ透析膜（和光純薬工業）を使用してＰＢＳバッファーで２４時間透析した。途中でＰＢＳバッファーを２回交換した。透析後、５×ＤＰＹ培地による培養では１５，０００ｒｐｍ（２０，６２０×ｇ），４℃，１０分間、ＤＰＹ培地を使用した場合は３，５００ｒｐｍ（２，１５０×ｇ），４℃，１０分間遠心し、その上清を３．０μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍのフィルターで順次ろ過した。
７．Ｗ２７　ＩｇＡのウエスタン解析
　生産したＩｇＡが含まれるサンプルのウエスタン解析は、以下の抗体を使用して行った。
　Ｈ鎖の検出には、抗Ｈ鎖抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ－ＵＮＬＢ（Ｃａｔ．Ｎｏ．　１０４０－０１，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、および二次抗体Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／（Ｈ＆Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡ００００１－４，Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を使用した。
　Ｌ鎖の検出には、抗Ｌ鎖抗体Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　Ｋａｐｐａ－ＵＮＬＢ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０５０－０１，ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、および二次抗体Ｒａｂｂｉｔ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）／（Ｈ＆Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡ００００１－４，Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を使用した。
　Ｊ鎖の検出には、抗Ｊ鎖抗体Ｉｇ　Ｊ　ｃｈａｉｎ（Ｍ－１５９）（Ｃａｔ．Ｎｏ．ｓｃ－６６９２９，Ｓａｎｔａ　Ｃｕｒｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および二次抗体Ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ，　ＨＲＰ－ｌｉｎｋｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７０７４，Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。
８．モノクローナルIgA抗体の定量と非還元SDS-PAGE
　精製した抗体の定量は、ＥＬＩＳＡ法で行った。抗体の定量方法の詳細は以下の通りである。まず、Ａｎｔｉ－ｇｏａｔ－ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：１０４０－０１）を２μｇ／ｍｌになるように０．０５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３で希釈して、Ｃ９６ＭａｘｉＳｏｒｐ　Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）（以下ＥＬＩＳＡプレートとする）の各ｗｅｌｌに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、一晩４℃で固相化させた。Ｖａｃｃｕ－Ｐｅｔｔｅ／９６ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ　ｐｉｐｅｔｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（以下プレートウォッシャー）を用いて、ＰＢＳによりプレートを３回洗浄後、１％　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　（ＢＳＡ）（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－ＢＳＡ）を１５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えて、４℃で一晩静置してブロッキングを行った。抗体液の系列を９６穴プレートで作成した。抗体液の希釈系列は、等倍（ｘ１、精製抗体のｘ１／１００とｘ１／１０００をｘ１とする）、３倍（ｘ１／３）、１０倍（ｘ１／１０）、３０倍（ｘ１／３０）、１００倍（ｘ１／１００）、３００倍（ｘ１／３００）、１０００倍（ｘ１／１０００）、３０００倍（ｘ１／３０００）で、ＰＢＳ－ＢＳＡを用いて段階希釈液を作成した。プレートからＰＢＳ－ＢＳＡを完全に取り除いた後、段階希釈液を５０μｌ／ｗｅｌｌとなるように加えて室温で１時間静置して反応させた。
　次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０（Ｃｈｅｍ　Ｃｒｕｚ）を含むＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）によりプレートウォッシャーで３回プレートを洗浄した後、２次抗体Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ｍｏｕｓｅＩｇＡ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：　１０４０－０４）をＰＢＳ－ＢＳＡに、終濃度０．５　μｇ／ｍｌとなるように希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温で１時間静置して反応させた。ＰＢＳ－Ｔによりプレートウォッシャーで３回プレートを洗浄後、５ｍｌの炭酸バッファー（６．５ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３、１８．５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３）に１Ｍ　ＭｇＣｌ２　１０μｌとＳｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）１錠を加えた基質溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌで加えた。室温で遮光して静置後、十分に発色していることを目視で確認して、ＴｒｉＳｔａｒ２　ＬＢ９４２（ＢＥＲＴＨＯＬＤ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用してｏｐｔｉｃａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ（Ｏ．Ｄ．）４０５ｎｍの吸光度を測定した。
　上記とは別に２量体抗体が産生されているかどうかを非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認した。サンプル調製は、抗体（５μｇ）に３×Ｎａｔｉｖｅ　ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ６．８、３０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０１５％　Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　ｂｌｕｅ）を加えた。ＷＩＤＥ　ＲＡＮＧＥ　Ｇｅｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（４×）ｆｏｒＰＡＧＥ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）を用いた６％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを用いて泳動後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色を行った。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは２－ＭＥ添加のｂｕｆｆｅｒをサンプルに加えたのちに９５℃で１０分間変性後に非還元と同じ６％のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを用いて泳動後、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）染色を行った。
９．大腸菌に対する精製ＩｇＡ抗体の結合力の解析
　大腸菌に対する精製ＩｇＡ抗体の結合力を比較するために、大腸菌に対するＥＬＩＳＡを行った。大腸菌（ＤＨ５αもしくはＢＷ３８０９２及びその変異体、いずれもＫ１２株）について３７℃好気培養（ＬＢ培地）を一晩行い、遠心分離により集めた。ＰＢＳで菌体を洗浄後０．０５Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３バッファーに細菌を懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした（４℃一晩）。上記の精製ＩｇＡ抗体定量ＥＬＩＳＡと同様に１％ＢＳＡ添加ＰＢＳによるブロッキング後に、９６穴プレート中の各抗体希釈系列を作製して加え、室温で約１時間反応させた。その後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０添加ＰＢＳで洗浄し、２次抗体Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ：　１０４０－０４）をＰＢＳ－ＢＳＡに、終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌで加え、室温で１時間静置して反応させた。ＰＢＳ－Ｔによりプレートウォッシャーで３回プレートを洗浄後、Ａｌｋａｌｉ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｔａｂｌｅｔ（Ｓｉｇｍａ）を使用して上記と同様に発色反応を行った。十分な反応のために、発色後のＥＬＩＳＡプレートを４度で一晩反応させ、ＴｒｉＳｔａｒ２　ＬＢ９４２（ＢＥＲＴＨＯＬＤ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用し、ＯＤ４０５　ｎｍを測定した。
１０．大腸菌およびＣ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌増殖抑制試験（嫌気）
　大腸菌をＬＢ培地（一晩３７℃）で嫌気培養した。以後のすべての操作は嫌気チャンバー内で行った。培養液を遠心分離し、細菌を集菌後、ＬＢ培地で洗浄を行った。細菌液を培養液で１０倍に希釈後に、ＳＹＴＯ２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＣｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｋｉｔ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に含まれるＣｏｕｎｔｉｎｇ　ｂｅａｄｓを加え、フローサイトメトリー（測定は好気下）によりＳＹＴＯ２４陽性の生細菌数をＣｏｕｎｔｉｎｇ　ｂｅａｄｓとの比較から算出した。ＬＢ培地で細菌が３００ｃｅｌｌｓ／５μｌになるように希釈した。エッペンチューブに細菌希釈液５μｌ加え、さらに嫌気化したＰＢＳ、または嫌気化した精製した抗体を２５μｌ加え、さらにＬＢ培地を３０μｌ加え３７℃嫌気で静置培養した（抗体最終濃度は０．４２ｍｇ／ｍｌ）。その後、２０時間に細菌液を希釈してＬＢ　ｐｌａｔｅに播種し、一晩３７℃で嫌気培養した。次の日にコロニー数を計測して生細菌数を測定した。
　上記大腸菌に対する試験と同様に、Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　１０，０００細胞を、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株（ＫｏｊｉＨＬＪ＃１）から得られた多量体Ｗ２７　ＩｇＡ抗体（４１７ｍｇ／ｍｌ）とともに３７度で２０時間嫌気培養した後、大腸菌用培地プレート（ＬＢ　ｐｌａｔｅ）に播種し、コロニー数を計測した。
実施例１：２量体ＩｇＡの生産株の作製
　Ａ．ｏｒｙｚａｅにおいて、Ｗ２７　ＩｇＡ抗体を２量体で生産することを試みた。ＩｇＡの２量体は、Ｈ鎖、Ｌ鎖、およびＪ鎖によって構成される。それぞれをコードする遺伝子について、Ａ．ｏｒｙｚａｅでもっとも発現量が高い遺伝子の１つｔｅｆ１のコドン使用頻度をもとにして、コドン改変を行った。これらに対して、Ａ．ｏｒｙｚａｅでもっとも分泌量が多いα－アミラーゼＡｍｙＢのシグナル配列をコードする配列を連結して、翻訳後に小胞体に移行して分泌されるように設計した。プロモーターとターミネーターは、ａｍｙＢ遺伝子のものを使用した（図１）。
　遺伝子導入には、Ａ．ｏｒｙｚａｅにおけるゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる遺伝子改変技術［Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］を利用した。ＩｇＡ抗体として、国際公開２０１４／１４２０８４号に記載されるＷ２７抗体および特願２０２１－１１０４２１情報に基づいて、Ｗ２７抗体のＣＨＯ細胞産生リコンビナントＩｇＡであって、軽鎖にプロテインＬ結合のための変異を導入したＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１を用いた。ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を以下に示す。以下、実施例１～４において、ＲＳ＿Ｈ０００＿Ｌ００１を「Ｗ２７　ＩｇＡ」と記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　なお、上記配列はマウス由来のシグナル配列を含んでいるが、本実施例において糸状菌のゲノム改変に使用したW２７　ＩｇＡは、以下に示すように、α-アミラーゼAmyBのシグナル配列を含んでいる。
　Ｗ２７　ＩｇＡ抗体のＨ鎖、Ｌ鎖、およびＪ鎖を発現するカセットをタンデムに接続した。このような発現カセットを、色素合成遺伝子ｗＡの上流領域とＯＲＦ内部領域の内側に位置することで、ｗＡ遺伝子座に相同組換えで挿入されるように設計して、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）を作製した（図１）。
　ｗＡ遺伝子上流を標的として二本鎖ＤＮＡ切断を行うｓｇＲＮＡを発現するために、ゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐ　［Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］を使用した（図２）。
　Ａ．ｏｒｙｚａｅの形質転換の宿主として、プロテアーゼ遺伝子１０重破壊株であるＮＳｌＤ１－ΔＰ１０　［Ｙｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　８９：７４７－７５９，　２０１１］を使用した。この株を使用することで、ヒト由来リゾチームおよびウシ由来キモシン［Ｙｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　８９：７４７－７５９，　２０１１］、ヒト由来ＩｇＧ抗体［Ｈｕｙｎｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｕｎｇａｌ　Ｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：７，２０２０］について生産量が増加することが示されている。
　前述の２量体ＩｇＡ発現用のドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）、およびゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐを用いて、ＮＳｌＤ１－ΔＰ１０株を形質転換した。この際、既報［Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］にもとづき、ゲノム編集プラスミドに対するドナーＤＮＡプラスミドの使用量を増やすことで、発現カセットが多コピー導入された形質転換体が取得されやすいようにした。取得した形質転換株について、２量体ＩｇＡの発現カセットのコピー数と生産量を解析して、コピー数が多く生産量が高かった株を「Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）　＃１」と命名し、以降の生産実験に使用した。
　２量体ＩｇＡ生産株「Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）　＃１」を液体培地に植菌し、８日間培養ののち培養上清を回収して、硫安沈殿により約１０倍に濃縮した。ウエスタン解析を行った結果、Ｈ鎖、Ｌ鎖およびＪ鎖は培養上清および濃縮サンプルで検出され、それぞれ培養液への生産が確認された（図３）。
　プラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）に含まれるＷ２７　ＩｇＡ　Ｈ（重鎖）、Ｗ２７　ＩｇＡ　Ｌ（軽鎖）およびＷ２７　ＩｇＡ　Ｊ（Ｊ鎖）の塩基配列およびアミノ酸配列を、図４～９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002

Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
実施例２：５量体ＩｇＡの生産株の作製
　Ｗ２７　ＩｇＡ抗体を５量体で生産するために、ＣＯＭＰドメインを使用した。ＣＯＭＰ　（ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　ｍａｔｒｉｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ドメインは、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質由来のコイルドコイルドメインであり、５量体形成の誘導に使用されている。
　遺伝子導入には、Ａ．　ｏｒｙｚａｅにおけるゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる遺伝子改変技術［Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］を利用した。Ｗ２７　ＩｇＡ抗体のＨ鎖のＣ末側にＣＯＭＰドメインを融合して、Ｌ鎖とともに発現するためのカセットをタンデムに接続した。この際、Ｈ鎖とＣＯＭＰドメインをつなぐリンカーにもともと含まれていたリジン残基をアラニンに置換した。プロモーターとターミネーターは、ａｍｙＢ遺伝子のものを使用したこのような発現カセットを、色素合成遺伝子ｗＡの上流領域とＯＲＦ内部領域の内側に位置することで、ｗＡ遺伝子座に相同組換えで挿入されるように設計して、ドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）を作製した（図１０）。ｗＡ遺伝子上流を標的として二本鎖ＤＮＡ切断を行うｓｇＲＮＡを発現するために、ゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐ　［Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］を使用した。
　作製したドナーＤＮＡプラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）とゲノム編集プラスミドｐＲＧＥ－ｇｗＡｕｐを用いて、ＮＳｌＤ１－ΔＰ１０株を形質転換した。この際、既報［Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　８５：ｅ０１８９６－１８，　２０１９］にもとづき、ゲノム編集プラスミドに対するドナーＤＮＡプラスミドの使用量を増やすことで、発現カセットが多コピー導入された形質転換体が取得されやすいようにした。取得した形質転換株について、５量体ＩｇＡの発現カセットのコピー数と生産量を解析して、コピー数が多く生産量が高かった株を「ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）　＃１」と命名し、以降の生産実験に使用した。
　５量体ＩｇＡ生産株「ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）　＃１」を液体培地に植菌し、８日間培養ののち培養上清を回収して、硫安沈殿により約１０倍に濃縮した。ウエスタン解析を行った結果、Ｈ鎖およびＬ鎖は培養上清および濃縮サンプルで検出され、それぞれ培養液への生産が確認された（図１１）。
　プラスミドｐｗＡｕｐ－ＤＮ　ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）に含まれるＷ２７　ＩｇＡ　Ｈ（重鎖）およびＷ２７　ＩｇＡ　Ｌ（軽鎖）の塩基配列およびアミノ酸配列を、図１２～１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
実施例３：ＩｇＡ融合タンパク質の構成の影響
　ＩｇＡのＨ鎖のＣ末端にＣＯＭＰ配列を追加した融合タンパク質について、ＩｇＡのＨ鎖Ｃ末端領域の構成およびリンカーの構成が多量体形成に与える影響を検討した。
　天然のＬ鎖および以下の構成を有する融合タンパク質をＨ鎖とするＩｇＡをコードする核酸構築物を用いてゲノム改変ＣＨＯ細胞を作製し、分泌されたＩｇＡの多量体形成状態について検討した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　図１６に示すように、ＩｇＡのＨ鎖Ｃ末端領域の構成およびリンカーの構成はＩｇＡの多量体形成に影響し得ることが確認された。特に、リンカーを用いずにＣＯＭＰ配列を結合したＨ鎖を用いた場合、特に、ＩｇＡのテールピース領域を一部削除してＣＯＭＰ配列を結合したＨ鎖を用いた場合に、より多量体として産生されるＩｇＡの割合が多くなることが観察された。
実施例４：ゲノム改変糸状菌で製造された多量体免疫グロブリンの結合特性
　麹菌及びＣＨＯ細胞から分泌された多量体化されたＷ２７　ＩｇＡについて、大腸菌に対する結合力を確認した。なお、国際公開２０１４／１４２０８４号に記載するように、哺乳類細胞で発現したＷ２７　ＩｇＡ抗体は大腸菌に結合することが知られている。麹菌及びＣＨＯ細胞から分泌された多量体化されたＷ２７　ＩｇＡを精製して、これらの多量体ＩｇＡによる大腸菌結合能を試験した。使用した多量体ＩｇＡを還元状態（左）および非還元状態でＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ＣＢＢ染色した結果を図１７、１８に示す。非還元状態のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果に示されるように、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株（Ｋｏｊｉ　ＨＬＪ＃１）（図１７）および５量体ＩｇＡ発現化改変麹株（Ｋｏｊｉ　ＨＡＡ　ＣＯＭＰ＋Ｌ＃１）（図１８）のいずれからも、多量体ＩｇＡの発現が確認された。なお、麹菌で産生したＩｇＡ抗体は非還元状態のＳＤＳ－ＰＡＧＥ上でバンドが広がる傾向がみられた。
　大腸菌に対する結合力を測定した結果、図１９～２０に示すように、麹菌から分泌された多量体ＩｇＡ抗体は、ＣＨＯ細胞から分泌された多量体ＩｇＡ抗体と同様に、ＳＨＭＴタンパク質を発現する大腸菌に対して結合することが確認された。
　より具体的には、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株「Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）　＃１」から取得した多量体ＩｇＡ（ＫｏｊｉＨＬＪ＃１）について上記大腸菌ＢＷ３８０２９株との結合を確認した試験結果を図１９に示す。
　同様に、５量体ＩｇＡ発現化改変麹株「ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）　＃１」から取得した多量体抗体（Ｋｏｊｉ　ＨＡＡＣＯＭＰ＃１）について大腸菌ＢＷ３８０２９株との結合を確認した試験結果を図２０に示す。比較のために、ＩｇＡ重鎖のＣ末端テールピースを一部欠損した状態でＣＯＭＰ配列を追加した５量体ＩｇＡ発現化改変ＣＨＯ細胞から取得した多量体ＩｇＡ（ＣＨＯ　Ｗ２７ｎｏｔａｉｌＣＯＭＰ）、２量体ＩｇＡ発現化改変ＣＨＯ細胞で発現した多量体ＩｇＡ（ＣＨＯ　Ｗ２７ｄｉｍｅｒ）、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株「Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）　＃１」から発現した多量体ＩｇＡ（２回の別試行により得たＫｏｊｉ　ＨＬＪ＃１－Ｎｏ．１およびＫｏｊｉ　ＨＬＪ＃１－Ｎｏ．２を用いた）、並びに陰性対照を用いた（図２０）。
　図２０に示すように、５量体ＩｇＡ発現化改変麹株「ＨＡＡＣｏｍｐ＋Ｌ（ｃｏ）　＃１」から取得した多量体抗体は、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株「Ｈ＋Ｌ＋Ｊ（ｃｏ）　＃１」から取得した多量体抗体に比して、より強い結合性を有することが確認された。
実施例５：ゲノム改変糸状菌で製造された多量体免疫グロブリンの生理活性
　（５－１）ゲノム改変糸状菌で製造された多量体ＩｇＡについて、ＳＨＭＴを発現する大腸菌に対する増殖抑制効果を検証した。
　具体的には、大腸菌（ＢＷ３８０２９株にＳＨＭＴ　ＶｅｎｕｓＨｉｓ融合遺伝子をノックインしたもの）３００細胞を、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株（ＫｏｊｉＨＬＪ＃１）から得られた多量体抗体（４１７ｍｇ／ｍｌ）とともに３７度で２０時間嫌気培養した後、大腸菌用培地プレート（ＬＢ　ｐｌａｔｅ）に播種し、コロニー数を計測した（ｎ＝３）。結果を図２１に示す。比較として、抗体を含まない陰性対照、２量体ＩｇＡ発現化改変ＣＨＯ細胞で発現した多量体ＩｇＡ、およびＣＨＯ細胞で発現した　Ｗ２７　ＩｇＧ抗体を用いた。
　２量体ＩｇＡ発現化改変麹株（ＫｏｊｉＨＬＪ＃１）から取得した多量体Ｗ２７ＩｇＡは、２量体ＩｇＡ発現化改変ＣＨＯ細胞で発現した多量体Ｗ２７　ＩｇＡと同様に、ＳＨＭＴを発現する大腸菌に対して増殖抑制効果を示した。一方、ＣＨＯ細胞で発現したＷ２７　ＩｇＧ抗体は、このような増殖抑制効果をほとんど示さなかった。
　上記データが示すように、多量体ＩｇＡ発現化改変麹株から分泌された多量体ＩｇＡ抗体は、ＣＨＯ細胞から分泌された多量体ＩｇＡ抗体と同様に、大腸菌に対して増殖抑制効果を示すことが確認された。
　（５－２）ゲノム改変糸状菌で製造された多量体ＩｇＡについて、Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する増殖抑制試験を行った。
　具体的には、上記大腸菌に対する試験と同様に、Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　１０，０００細胞を、２量体ＩｇＡ発現化改変麹株（ＫｏｊｉＨＬＪ＃１）から得られた多量体Ｗ２７　ＩｇＡ抗体（４１７ｍｇ／ｍｌ）とともに３７度で２０時間嫌気培養した後、大腸菌用培地プレート（ＬＢ　ｐｌａｔｅ）に播種し、コロニー数を計測した（ｎ＝３）。結果を図２２に示す。比較として、抗体を含まない陰性対照、２量体ＩｇＡ発現化改変ＣＨＯ細胞で発現した多量体Ｗ２７　ＩｇＡ、およびＣＨＯ細胞で発現したＷ２７　ＩｇＧ抗体を用いた。　麹菌から得られた２量体ＩｇＡ抗体（ＫｏｊｉＨＬＪ＃１）は、２量体ＩｇＡ発現化改変ＣＨＯ細胞で発現した多量体Ｗ２７　ＩｇＡと同様に、Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して増殖抑制効果を示した。一方、ＣＨＯ細胞で発現したＷ２７ＩｇＧ抗体は、このような増殖抑制効果をほとんど示さなかった。
　上記データが示すように、麹菌から分泌されたＩｇＡ抗体は、ＣＨＯ細胞から分泌されたＩｇＡ抗体と同様に、Ｃ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して増殖抑制効果を示すことが確認された。
　以上の結果から、多量体ＩｇＡ発現化改変麹株から分泌された多量体ＩｇＡ抗体は、ＣＨＯ細胞から分泌された多量体ＩｇＡ抗体と同様の、優れた生理活性を備えていることが確認された。
（参考文献）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011

Claims (13)

  1. 　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌を準備する工程；
    　前記糸状菌を培養する工程；および
    　培養培地中の多量体免疫グロブリンを他の培養培地成分から分離する工程を含む、多量体免疫グロブリンを製造する方法。
  2. 　前記糸状菌がゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を２コピー以上含有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記２コピー以上の免疫グロブリンをコードする核酸断片が、糸状菌ゲノムの単一領域に挿入されている、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記免疫グロブリンが、細菌増殖抑制作用を有するＩｇＡまたはＩｇＭである、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記免疫グロブリンにおいて、重鎖がC末端テールピースの一部または全部領域を欠く請求項１に記載の方法。
  6. 　請求項１または２に記載の方法で用いられる、ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌。
  7. 　請求項１または２に記載の方法で製造された多量体免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを含む糸状菌。
  8. 　請求項１または２に記載の方法で製造された多量体免疫グロブリンまたは多量体免疫グロブリンを含む糸状菌を含む組成物。
  9. 　改変対象の糸状菌を準備する工程；
    　単一段階のゲノム改変操作によって、免疫グロブリンをコードする核酸断片の２コピー以上を、前記改変対象の糸状菌に挿入する工程；および
    　前記核酸断片の挿入されたゲノム改変糸状菌が、培養培地中に多量体免疫グロブリンを分泌することを確認する工程を含む、
    　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を含む糸状菌糸状菌を製造する方法。
  10. 　ゲノム中に免疫グロブリンをコードする核酸断片を２コピー以上含む遺伝子改変糸状菌であって、多量体免疫グロブリンを産生することができる、糸状菌。
  11. 　前記免疫グロブリンが、ＩｇＡまたはＩｇＭである、請求項１０に記載の糸状菌。
  12. 　請求項１０または１１に記載の糸状菌を含む、組成物。
  13. 　請求項１０または１１に記載の糸状菌の培養上清を含む、組成物。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008081031A2 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 Novozymes A/S Methods of increasing the production yield of a secreted antibody in a filamentous fungus by overexpression of the chaperone bip
WO2014030750A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
WO2014030728A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 FcγRIIb特異的Fc領域改変体
JP2016518333A (ja) * 2013-03-15 2016-06-23 ジェンザイム・コーポレーション 抗ｃｄ５２抗体
JP2021500930A (ja) * 2017-11-01 2021-01-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｃｏｍｐボディ−多価標的結合物質

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008081031A2 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 Novozymes A/S Methods of increasing the production yield of a secreted antibody in a filamentous fungus by overexpression of the chaperone bip
WO2014030750A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
WO2014030728A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 FcγRIIb特異的Fc領域改変体
JP2016518333A (ja) * 2013-03-15 2016-06-23 ジェンザイム・コーポレーション 抗ｃｄ５２抗体
JP2021500930A (ja) * 2017-11-01 2021-01-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｃｏｍｐボディ−多価標的結合物質

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUYNH HUNG HIEP, MORITA NAOKI, SAKAMOTO TOSHIHIRO, KATAYAMA TAKUYA, MIYAKAWA TAKUYA, TANOKURA MASARU, CHIBA YASUNORI, SHINKURA REI: "Functional production of human antibody by the filamentous fungus Aspergillus oryzae", FUNGAL BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 7, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), XP093081929, DOI: 10.1186/s40694-020-00098-w *
WARD MICHAEL ET AL: "Characterization of humanized antibodies secreted by Aspergillus niger.", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 70, no. 5, 1 May 2004 (2004-05-01), US , pages 2567 - 2576, XP002436555, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.70.5.2567-2576.2004 *

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