TW201434858A - 針對ｅｐｏ之抗體之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抑制EPO之組合物及方法。本發明提供結合至EPO且能夠抑制EPO依賴性細胞增殖及/或EPO依賴性細胞信號傳導之抗體及其抗原結合片段。

Description

針對EPO之抗體之組合物及方法
糖尿病性視網膜病變(DR)為患有糖尿病之患者中最常見之併發症。糖尿病黃斑水腫(DME)可發生於DR之任何階段，且為患有DR之患者之視力損失的主要原因。據報導，在隨訪10年之後，DME之發病率如下：1型糖尿病為20.1%、2型胰島素依賴型糖尿病為25.4%，及2型非胰島素依賴型糖尿病為13.9%(Klein等人(1995)Ophthalmology 102,7-16)。ETDRS試驗((1985)Photocoagulation for Diabetic Macular Edema-Early Treatment Diabetic-Retinopathy Study Report.1.Archives of Ophthalmology 103,1796-1806)(一種DR之開拓性研究)展示，儘管進行雷射光凝療法3年會使DME眼睛之中度視覺損失之風險降低約50%，但僅少數眼睛視力增加，且一些眼睛即使在密集治療之後仍繼續經歷視力損失。近年來，藥物療法及眼睛藥物傳遞之進展已展示DME治療之前景。RESTORE研究(DME之兩個關鍵III期試驗之一(Mitchell等人(2011)Ophthalmology 118,615-625))展示，Lucentis ®優於雷射單一療法。最佳矯正視力(BCVA)之平均變化為主要的臨床終點，其在Lucentis ®組中顯著提高(Lucentis ®組之+6.1個字母相對於雷射組之+0.8個字母；p<0.0001)。在VEGF Trap-Eye(Regeneron Inc.NY,USA)及Ozurdex®(***玻璃體內植入物；Allergan Inc.,CA,USA)之情況下，已展示類似有益的作用(Do等人 (2011)Ophthalmology 118,1819-1826；Haller等人(2010)Archives of Ophthalmology 128,289-296)。然而，16%經Ozurdex治療之眼睛出現眼內壓升高，此為一種青光眼風險。
儘管有此等針對DME之新的治療選擇，但仍未實質上滿足醫學需求。在Lucentis ®關鍵試驗中約25%眼睛在治療12個月之後視力無任何增加，且約50%眼睛之視力保持為20/40或更糟。全基因組關聯研究指示，就紅血球生成素(Epo)啟動子多形現象(T)而言為同種接合之糖尿病患者具有發展增殖性DR之2.17倍較高風險(Tong等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105,6998-7003)。有趣的是，與具有G對偶基因之人相比，具有Epo之T啟動子對偶基因之人的Epo玻璃體濃度高約7.5倍(Tong等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105,6998-7003)。
仍需要開發針對糖尿病性視網膜病變(特定言之DME)之有效治療以替代或補充當前治療。
本發明係關於抗體或抗原結合片段，如本文所述其結合Epo及/或達貝泊汀(Darbepoietin)。
本文所述之經分離抗體或抗原結合片段以小於或等於100pM之KD結合Epo及/或達貝泊汀。舉例而言，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段可結合至人類Epo及/或達貝泊汀，其KD小於或等於50pM，小於或等於40pM，小於或等於35pM，小於或等於30pM，小於或等於25pM，小於或等於20pM，小於或等於15pM，小於或等於14pM，小於或等於13pM，小於或等於12pM，小於或等於11pM，小於或等於10pM。更特定言之，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合人類Epo，其KD小於或等於35pM(如藉由Biacore所量測)，或小於或等於6pM(如藉由溶液平衡滴定(SET)所量測)。更特定 言之，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合達貝泊汀，其KD小於或等於24pM(如藉由Biacore所量測)，或小於或等於4pM(如藉由SET所量測)。
本發明係關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合至人類、獼猴、小鼠及/或大鼠Epo。本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合包含選自人類Epo螺旋D及環A-B之胺基酸之構形抗原決定基。本發明進一步關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合包含選自人類Epo螺旋D、環A-B及螺旋A之胺基酸之構形抗原決定基。在本發明之特定態樣中，經分離抗體或其抗原結合片段可結合至Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)。在其他態樣中，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段可結合環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)。在其他態樣中，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段可結合環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)及螺旋A(人類Epo之胺基酸4至26；SEQ ID NO：86)。在本發明之另外態樣中，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段可結合Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)及環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)。在本發明之又另外態樣中，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段可結合Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)及螺旋A(人類Epo之胺基酸4至26；SEQ ID NO：86)。在本發明之又另外態樣中，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段可結合Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)、環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)及螺旋A(人類Epo之胺基酸4至26；SEQ ID NO：86)。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合Epo上包含人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下胺基酸殘基之構形抗原決定基： Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Glu159及Arg162。本發明另外關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合Epo上包含人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下胺基酸殘基之構形抗原決定基：Ser9、Gln13、Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Gly158、Glu159及Arg162。本發明又另外關於一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其結合Epo上包含人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下胺基酸殘基之構形抗原決定基：Glu23、Asp43、Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Arg131、Arg143、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Glu159及Arg162。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合Epo，且另外與如表1中所述之抗體競爭結合。本發明亦進一步關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合與如表1中所述之抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合Epo，且其等電點(pI)大於8.2，大於8.3，大於8.4，大於8.5或大於9.0。
本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合獼猴Epo、小鼠Epo及/或大鼠Epo，其KD小於或等於100pM，小於或等於80pM，小於或等於70pM，小於或等於60pM，小於或等於50pM，小於或等於40pM，小於或等於35pM，小於或等於30pM，小於或等於25pM，小於或等於20pM，小於或等於15pM，小於或等於10pM，小於或等於5pM，小於或等於4pM，小於或等於3pM，小於或等於2pM，小於或等於1pM。更特定言之，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合獼猴Epo、小鼠Epo及/或大鼠Epo，其KD小於或等於80pM (如藉由Biacore所量測)，或小於或等於40pM(如藉由SET所量測)。更特定言之，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合獼猴Epo，其KD小於或等於80pM(如藉由Biacore所量測)，或小於或等於8pM(如藉由SET所量測)。更特定言之，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合小鼠Epo，其KD小於或等於45pM(如藉由Biacore所量測)，或小於或等於37pM(如藉由SET所量測)。更特定言之，本文所述之經分離抗體或抗原結合片段亦可結合大鼠Epo，其KD小於或等於57pM(如藉由Biacore所量測)，或小於或等於13pM(如藉由SET所量測)。
本文所述之經分離抗體及抗原結合片段之結合親和力可藉由SET測定。SET方法為此項技術中已知，且以下進一步詳細描述。或者，本文所述之經分離抗體或片段之結合親和力可藉由Biacore分析測定。Biacore動力學分析方法為此項技術中已知，且以下進一步詳細描述。
本文所述之經分離抗體及抗原結合片段可用於抑制Epo依賴性細胞增殖，其IC50小於或等於350pM，小於或等於300pM，小於或等於250pM，小於或等於200pM，小於或等於190pM，小於或等於180pM，小於或等於175pM，小於或等於170pM，小於或等於160pM，小於或等於150pM，小於或等於125pM，小於或等於115pM，小於或等於110pM，小於或等於100pM，小於或等於90pM，或小於或等於80pM。更特定言之，如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段可抑制Epo依賴性細胞增殖，如藉由活體外Ba/F3-EpoR細胞增殖分析所量測，其IC50小於或等於338pM，小於或等於183pM，小於或等於175pM，小於或等於174pM，小於或等於145pM，小於或等於112pM，小於或等於89pM，或小於或等於74pM。
本文所述之經分離抗體及抗原結合片段可用於抑制B細胞中Epo 依賴性細胞增殖。更特定言之，本文所述之經分離抗體及抗原結合片段可用於抑制小鼠B細胞中Epo依賴性細胞增殖。舉例而言，經分離抗體或其抗原結合片段可抑制Epo依賴性細胞增殖，如藉由活體外Ba/F3-EpoR細胞增殖分析所量測，其IC50小於或等於350pM，小於或等於300pM，小於或等於250pM，小於或等於200pM，小於或等於175pM，小於或等於150pM，小於或等於125pM，小於或等於115pM，小於或等於110pM，小於或等於100pM，小於或等於90pM，或小於或等於80pM。更特定言之，如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段可抑制Epo依賴性細胞增殖，如活體外Ba/F3-EpoR細胞增殖分析所量測，其IC50小於或等於338pM，小於或等於174pM，小於或等於112pM，或小於或等於74pM。
本文所述之經分離抗體及抗原結合片段可用於抑制人類B細胞中Epo依賴性細胞增殖。舉例而言，經分離抗體或其抗原結合片段可抑制Epo依賴性細胞增殖，如藉由活體外F36E細胞增殖分析所量測，其IC50小於或等於200pM，小於或等於190pM，小於或等於180pM，小於或等於170pM，小於或等於160pM，小於或等於150pM，小於或等於125pM，小於或等於100pM，或小於或等於90pM。更特定言之，如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段可抑制Epo依賴性細胞增殖，如藉由活體外F36E細胞增殖分析所量測，其IC50小於或等於183pM，小於或等於175pM，小於或等於145pM，或小於或等於89pM。
經分離抗體或其抗原結合片段亦可阻斷Epo結合至Epo受體及/或防止Epo結合至細胞表面。
本發明之另一態樣包括經分離抗體或其抗原結合片段，其特異性結合至人類、獼猴、小鼠及/或大鼠Epo。在另一態樣中，經分離抗體或抗原結合片段與表1中所描述之抗體或抗原結合片段競爭結合。
如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、人類或人類化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段，或ScFv片段，及/或IgG同型。
如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段亦可包括構架，其中胺基酸已自對應的人類VH或VL生殖系序列取代至抗體構架中。
本發明之另一態樣包括經分離抗體或其抗原結合片段，其具有表1中所述之Fab之完整重鏈及輕鏈序列。更特定言之，經分離抗體或其抗原結合片段可具有Fab NVS1、NVS2、NVS3或NVS4之重鏈及輕鏈序列。
本發明之又一態樣包括經分離抗體或其抗原結合片段，其具有表1中所述之Fab之重鏈及輕鏈可變域序列。更特定言之，經分離抗體或其抗原結合片段可具有Fab NVS1(分別為SEQ ID NO 13及14)、NVS2(分別為SEQ ID NO 33及34)、NVS3(分別為SEQ ID NO 53及54)或NVS4(分別為SEQ ID NO73及74)之重鏈及輕鏈可變域序列。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：1、21、41及61組成之群的重鏈CDR1；選自由SEQ ID NO：2、22、42及62組成之群的重鏈CDR2；及選自由SEQ ID NO：3、23、43及63組成之群的重鏈CDR3，其中經分離抗體或其抗原結合片段結合至人類Epo。在另一態樣中，該經分離抗體或其抗原結合片段進一步包括選自由SEQ ID NO：4、24、44及64組成之群的輕鏈CDR1；選自由SEQ ID NO：5、25、45及65組成之群的輕鏈CDR2；及選自由SEQ ID NO：6、26、46及66組成之群的輕鏈CDR3。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：4、24、44及64組成之群的輕鏈CDR1；選自由SEQ ID NO：5、25、45及65組成之群的輕鏈CDR2；及選自由SEQ ID NO：6、26、46及66組成之群的輕鏈CDR3，其中經分離抗體或其抗原結合片 段結合至人類Epo。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其結合具有HCDR1、HCDR2、HCDR3及LCDR1、LCDR2、LCDR3之Epo，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3包含SEQ ID NO：1、2、3，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：4、5、6；或HCDR1、HCDR2、HCDR3包含SEQ ID NO：21、22、23，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：24、25、26；或HCDR1、HCDR2、HCDR3包含SEQ ID NO：41、42、43，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：44、45、46；或HCDR1、HCDR2、HCDR3包含SEQ ID NO：61、62、63，且LCDR1、LCDR2、LCDR3包含SEQ ID NO：64、65、66。
本發明亦關於一種抗體或抗原結合片段，如由Chothia定義，其具有SEQ ID NO：13、33、53或73之可變重鏈之HCDR1、HCDR2及HCDR3，及SEQ ID NO：14、34、54或74之可變輕鏈之LCDR1、LCDR2及LCDR3。在本發明之另一態樣中，如由Kabat定義，抗體或抗原結合片段可具有SEQ ID NO：13、33、53或73之重鏈可變域序列之HCDR1、HCDR2及HCDR3，及SEQ ID NO：14、34、54或74之輕鏈可變域序列之LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明之一個態樣中，經分離抗體或其抗原結合片段包括選自由SEQ ID NO：13、33、53及73組成之群的重鏈可變域(VH)序列。經分離抗體或抗原結合片段進一步可包含輕鏈可變域(VL)序列，其中重鏈可變域與輕鏈可變域組合以形成Epo之抗原結合位點。特定言之，輕鏈可變域序列可選自SEQ ID NO：14、34、54及74，其中該經分離抗體或其抗原結合片段結合Epo。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：14、34、54及74組成之群的輕鏈可變域序列，其中該經分離抗體或其抗原結合片段結合至人類Epo。經分離之抗體或抗原 結合片段可進一步包含重鏈可變域序列，其中輕鏈可變域與重鏈可變域組合以形成Epo之抗原結合位點。
特定言之，結合Epo之經分離抗體或其抗原結合片段可具有重鏈及輕鏈可變域，該等重鏈及輕鏈可變域分別包含SEQ ID NO：13及14、33及34、53及54、或73及74之序列。
本發明進一步關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包括與選自由SEQ ID NO：13、33、53及73組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之重鏈可變域，其中該抗體結合至Epo。在一個態樣中，經分離抗體或其抗原結合片段亦包括與選自由SEQ ID NO：14、34、54及74組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈可變域。在本發明之另一態樣中，如由Kabat定義且如表1中所述，經分離抗體或抗原結合片段具有HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3。亦預期，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3可由Chothia定義且如表1中所述。
本發明亦關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其具有與選自由SEQ ID NO：14、34、54及74組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈可變域，其中該抗體結合Epo。
在本發明之另一態樣中，結合至Epo之經分離抗體或其抗原結合片段可具有包含SEQ ID NO：15、35、55或75之序列之重鏈。經分離抗體亦可包括輕鏈，該輕鏈可與重鏈組合以形成人類Epo之抗原結合位點。特定言之，輕鏈可具有包含SEQ ID NO：16、36、56或76之序列。特定言之，結合Epo之經分離抗體或其抗原結合片段可具有分別包含SEQ ID NO：15及16；35及36；55及56；或75及76之序列之重鏈 及輕鏈。
本發明又進一步關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包括與選自由SEQ ID NO：15、35、55及75組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之重鏈，其中該抗體結合至Epo。在一個態樣中，經分離抗體或其抗原結合片段亦包括與選自由SEQ ID NO：16、36、56及76組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈。
本發明又進一步關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包括與選自由SEQ ID NO：16、36、56及76組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈，其中該抗體結合Epo。
如本文所述，本發明亦關於包含經分離抗體或其抗原結合片段之組合物。以及，與醫藥學上可接受之載劑組合之抗體組合物。特定言之，本發明進一步包括醫藥組合物，其包含表1之抗體或其抗原結合片段，諸如抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於醫藥組合物，其包含表1之經分離抗體或其抗原結合片段中之兩者或兩者以上之組合。
本發明亦關於一種經分離核酸序列，其編碼具有選自SEQ ID NO：13、33、53及73之序列之可變重鏈。特定言之，核酸具有與選自由SEQ ID NO：17、37、57及77組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在本發明之另一態樣中，序列為SEQ ID NO：17、37、57或77。
本發明亦關於一種經分離核酸序列，其編碼具有選自SEQ ID NO：14、34、54及74之序列之可變輕鏈。特定言之，核酸具有與選自由SEQ ID NO：18、38、58及78組成之群的序列具有至少80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列。在本發明之另一態樣中，序列為SEQ ID NO：18、38、58或78。
本發明亦關於一種經分離核酸，其包含編碼多肽之序列，該多肽包括與選自由SEQ ID NO：18、38、58及78組成之群的序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈可變域。
本發明亦關於一種載體，其包括本文所述之核酸分子中之一或多者。
本發明亦關於一種經分離宿主細胞，其包括本文所述之核酸分子或載體中之一或多者。本發明亦關於一種經分離宿主細胞，其包括編碼上文所述之抗體之重鏈的重組DNA序列，及編碼上文所述之抗體之輕鏈的第二重組DNA序列，其中該等DNA序列可操作地連接於啟動子且能夠表現於宿主細胞中。預期，抗體可為人類單株抗體。亦預期，宿主細胞為非人類哺乳動物細胞，例如CHO細胞。
本發明亦關於一種抑制Epo依賴性細胞增殖之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸(例如接觸個體中之Epo)的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。在一個態樣中，該方法包含使細胞(例如包含Epo之細胞)與包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸。本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制個體中之Epo依賴性細胞增殖。預期，細胞為人類細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。
本發明亦關於一種抑制Epo依賴性細胞信號傳導之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸的步驟，以防止Epo與細胞表面上之受體相互作 用。在一個態樣中，該方法包含使包含Epo之細胞與包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸。本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制個體中之Epo依賴性細胞信號傳導。預期，細胞為人類細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。
本發明亦關於一種抑制Epo依賴性細胞增殖或信號傳導之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸的步驟，以防止Epo與細胞表面上之受體相互作用。預期，細胞為B細胞。預期，細胞為人類細胞。
本發明亦關於一種抑制Epo結合至Epo受體之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸(例如接觸個體中之Epo)的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制Epo結合至個體之細胞上之Epo受體；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。預期，細胞為人類細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。
本發明又進一步關於一種抑制Epo結合至細胞之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸(例如個體中)的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。在一個態樣中，該方法包含使細胞(例如包含Epo之細胞)與包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸。本發明又進一步關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制Epo結合至個體中之細 胞。在一個態樣中，預期，細胞為人類細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。
本發明亦關於一種治療個體之黃斑水腫之方法，其中該方法包括向個體投與有效量之包含本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物，其用以治療個體之黃斑水腫。在一個態樣中，黃斑水腫與視網膜血管疾病相關。預期，與黃斑水腫相關之視網膜血管疾病可包括糖尿病性視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、增殖性糖尿病性視網膜病變、非增殖性糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性、視網膜靜脈阻塞、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管或早產兒視網膜病變。亦預期，個體為人類。
本發明亦關於一種治療個體之與視網膜血管疾病相關之病狀或病症之方法，其中該方法包括向個體投與有效量之包含本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物，其用以治療個體之與視網膜血管疾病相關之病狀或病症。在一個態樣中，預期，與視網膜血管疾病相關之病狀或病症為糖尿病性視網膜病變。在另一態樣中，預期，病狀或病症為年齡相關之黃斑變性。又進一步預期，與視網膜血管疾病相關之病狀或病症可為視網膜靜脈阻塞、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管或早產兒視網膜病變。亦預期，個體為人類。
本發明亦關於一種治療個體之與糖尿病性視網膜病變相關之病狀或病症之方法，其中該方法包括向個體投與有效量之包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文 所述之抗體或其抗原結合片段之組合物，其用以治療個體之與糖尿病性視網膜病變相關之病狀或病症。預期，個體為人類。
本發明亦關於一種治療個體之與黃斑水腫相關之病狀或病症之方法，其中該方法包括向個體投與有效量之包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物，其用以治療個體之與黃斑水腫相關之病狀或病症。進一步預期，與黃斑水腫相關之病狀或病症為糖尿病黃斑水腫。進一步預期，個體為人類。
本發明亦關於一種治療個體之增殖性糖尿病性視網膜病變之方法，其中該方法包括向個體投與有效量之包含本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物的步驟；特定言之，組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段之組合物，其用以治療個體之增殖性糖尿病性視網膜病變。進一步預期，將組合物投與個體之眼睛，其中該組合物在眼中減少視網膜靜脈擴張，減少血管滲漏及/或增加血流量。進一步預期，個體為人類。
前述經分離抗體或其抗原結合片段中之任一者可為單株抗體或其抗原結合片段。
定義
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語皆具有與通常由一般熟習本發明所屬之技術者所瞭解之含義相同之含義。
如本文所使用之術語「抗體」意謂全抗體及任何抗原結合片段(亦即，「抗原結合部分」)或其單鏈。全抗體為醣蛋白，其包含藉由二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(本文中簡化為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域 (CH1、CH2及CH3)。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中簡化為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域(CL)。VH及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插有稱為構架區(FR)之較保守區。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列之3個CDR及4個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)的宿主組織或因子結合。
如本文所使用之術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指保留與給定抗原(例如紅血球生成素：Epo)特異性結合之能力之完整抗體的一或多個片段。抗體之抗原結合功能可藉由完整抗體之片段進行。涵蓋於術語抗體之抗原結合部分或抗原結合片段內之結合片段的實例包括Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2片段，包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；Fd片段，其由VH及CH1域組成；Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH域組成；單域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341：544-546)，其由VH域或VL域組成；及經分離互補決定區(CDR)。
此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)由獨立基因編碼，然而其可使用重組方法由人工肽連接子接合，該連接子能夠使其製造成VL及VH區成對以形成單價分子之單蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如Bird等人，1988 Science 242：423-426；及Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此類單鏈抗體包括結合抗體之部分或片段之一或多種抗原。此等抗體片段使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式來就效用對片段進行篩檢。
抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體(maxibody)、微型抗體、胞內抗體(intrabody)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、 v-NAR及雙-scFv中(參見例如，Hollinger及Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗體之抗原結合部分可接枝至基於諸如III型纖維結合蛋白(Fn3)之多肽之骨架中(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽單株抗體)。
抗原結合片段可併入包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)之單鏈分子中，該等Fv區段連同互補輕鏈多肽形成一對抗原結合區(Zapata等人，1995 Protein Eng.8(10)：1057-1062；及美國專利第5,641,870號)。
如本文所使用之術語「親和力」係指在單一抗原位點處抗體與抗原之間的相互作用強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由弱非共價力與抗原在多個位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。如本文所使用之術語抗體或其抗原結合片段(例如：Fab片段)之「高親和力」通常用於指抗體或抗原結合片段之KD為10-9M或10-9M以下。
術語「胺基酸」係指天然產生及合成之胺基酸，以及胺基酸類似物及以類似於天然產生之胺基酸的方式起作用之胺基酸模擬物。天然產生之胺基酸為由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之胺基酸，例如，羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然產生之胺基酸相同之基本化學結構(亦即，與氫、羧基、胺基及R基結合之α碳)之化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然產生之胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構，但以與天然產生之胺基酸類似之方式起作用的化合物。
如本文所使用之術語「結合特異性」係指個別抗體結合位點與僅一個抗原決定子反應之能力。
短語與抗體(例如Epo結合抗體)「特異性(或選擇性)結合」係指決定蛋白質及其他生物製劑之異質群體中存在同源抗原(例如人類Epo或獼猴Epo)之結合反應。本文中短語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」可與術語「特異性結合抗原之抗體」互換使用。
術語「與視網膜血管疾病相關之病狀或病症」係指視網膜變性或變得功能異常之病狀、病症或疾病。此包括糖尿病性視網膜病變(DR)、糖尿病黃斑水腫(DME)、增殖性糖尿病性視網膜病變(PDR)、非增殖性糖尿病性視網膜病變(NPDR)、年齡相關之黃斑變性(AMD)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管或早產兒視網膜病變。可藉由Epo抑制來治療之視網膜血管疾病之解剖學特徵包括黃斑水腫、靜脈擴張、血管迂曲、如藉由螢光素血管攝影術所量測之血管滲漏、視網膜出血及微血管異常(例如微動脈瘤、棉絮狀斑點、IRMA)、毛細管壓降、白細胞黏附、視網膜缺血、視神經盤之新血管生成、後極之新血管生成、虹膜新血管生成、視網膜內出血、玻璃體出血、黃斑瘢痕、視網膜下纖維化及視網膜纖維化。
術語「與糖尿病性視網膜病變相關之病狀或病症」係指由於糖尿病(1型或2型)對視網膜血管分佈、視網膜代謝、視網膜色素上皮、血液視網膜障壁，或晚期糖基化終點產物(AGE)、醛醣還原酶活性、糖基化血色素及蛋白激酶C之眼睛含量之作用，而視網膜變性或變得功能異常之病狀。患有糖尿病性視網膜病變之患者之視覺損失可為視網膜缺血、黃斑水腫、血管滲漏、玻璃體出血，或較高葡萄糖含量對視網膜神經元之直接作用之結果。可藉由Epo抑制來治療之糖尿病性視網膜病變之解剖學特徵包括微動脈瘤、棉絮狀斑點、靜脈擴張、黃斑水腫、視網膜內微血管異常(IRMA)、視網膜內出血、血管增殖、盤之新血管生成、虹膜紅變及視網膜缺血。「糖尿病黃斑水腫」發生 在患有糖尿病性視網膜病變之個體中，且可發生在疾病之任何階段。
術語「與黃斑水腫相關之病狀或病症」係指由於視網膜血管滲漏液(「黃斑水腫」)而發生斑點腫脹或變厚之病狀或病症。黃斑水腫發生在視網膜血管疾病中，且常常為視網膜血管疾病之併發症。與黃斑水腫相關之特定病狀或病症包括糖尿病性視網膜病變、糖尿病黃斑水腫、增殖性糖尿病性視網膜病變、非增殖性糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性、視網膜靜脈阻塞、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管或早產兒視網膜病變。可藉由眼底鏡檢查、光學相干斷層攝影術及提高視力來確定利用EPO抑制之黃斑水腫治療。
術語「嵌合抗體」為抗體分子，其中(a)恆定區或其部分經改變、替換或交換以使得抗原結合位點(可變區)與不同或經改變之類別、效應官能基及/或物種，或賦予嵌合抗體(例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等)新特性之完全不同分子之恆定區連接；或(b)可變區或其部分用具有不同或經改變之抗原特異性之可變區改變、替換或交換。舉例而言，小鼠抗體可藉由用來自人類免疫球蛋白之恆定區替換其恆定區來修飾。由於用人恆定區替換，故嵌合抗體可保留其識別抗原之特異性，同時如與初始小鼠抗體相比，其在人類中之抗原性降低。
術語「Epo蛋白質」或「Epo抗原」或「EPO」或「Epo」可互換使用，且係指不同物種中之紅血球生成素蛋白質。舉例而言，人類Epo具有如表1中所陳述之序列：SEQ ID NO：81。來自其他物種之Epo蛋白質之實例在表1中提供，SEQ ID NO：82、83、84或85。人類、獼猴、小鼠、大鼠及兔Epo之蛋白質序列為公開可獲得的且描述於表1中。人類Epo亦可經過糖基化(hyperglycosylate)。過糖基化之Epo亦在此項技術中已知為「達貝泊汀」，且可獲自包括LEK Pharmacuetical之多個來源。
術語「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列兩者。相對於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼相同或基本上相同之胺基酸序列之核酸，或核酸不編碼胺基酸序列成基本上相同之序列。由於遺傳密碼之簡併，大量功能上相同之核酸編碼任何給定蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU皆編碼胺基酸丙胺酸。由此，在丙胺酸藉由密碼子指定之每一位置上，密碼子可在不改變經編碼之多肽的情況下變成所描述之對應密碼子中的任一者。該等核酸變異為「寂靜變異」，其為一種經保守修飾之變異。本文中編碼多肽之每一核酸序列亦描述核酸之每種可能的寂靜變異。熟習此項技術者應認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG之外)可經修飾以產生功能上相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之各寂靜變異隱含於各所述序列中。
就多肽序列而言，「經保守修飾之變異體」包括對多肽序列之個別取代、缺失或添加，其導致用化學上相似胺基酸取代胺基酸。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表為在此項技術中所熟知。該等經保守修飾之變異體為本發明之多晶型變異體、種間同系物及對偶基因外且不排除本發明之多晶型變異體、種間同系物及對偶基因。以下八組含有彼此為保守取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)***酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如，Creighton,Proteins(1984))。在一些實施例中，術語「保守序列修飾」用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。
術語「抗原決定基」意謂能夠與抗體特異性結合之蛋白決定 子。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成，且通常具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。構形抗原決定基與非構形抗原決定基之區別在於在變性溶劑存在下與前者而非後者之結合會喪失。
如本文所使用之術語「人類抗體」意欲包括具有構架區及CDR區均來源於人類來源序列之可變區的抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於該等人類序列(例如人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變形式)。本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變所引入之突變)。
術語「人類單株抗體」係指呈現單一結合特異性之抗體，其具有構架區及CDR區均來源於人類序列之可變區。在一個實施例中，人類單株抗體由融合瘤產生，該等融合瘤包括(i)獲自基因組包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之轉殖基因非人類動物(例如轉殖基因小鼠)之B細胞(ii)與永生化細胞融合。
「人類化」抗體為保留非人類抗體之反應性同時在人類中具較低免疫原性之抗體。舉例而言，此可藉由保留非人類CDR區且用其人類對應部分(亦即恆定區以及可變區之構架部分)替換抗體之剩餘部分來達成。參見例如，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855,1984；Morrison及Oi,Adv.Immunol.,44：65-92,1988；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.,28：489-498,1991；及Padlan,Molec.Immun.,31：169-217,1994。人類工程化技術之其他實例包括(但不限於)US 5,766,886中所揭示之Xoma技術。
在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情況下，術語「一致」或100%百分比「一致性，」係指相同的兩個或兩個以上序列或子序列。當如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由手動對準及目測所 量測在比較窗口或指定區域上就最大對應進行比較及對準時，若兩個序列具有所規定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即在所規定區域上或當未規定時在整個序列上具60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性)，則兩個序列為「實質上一致」。一致性視情況存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域上，或更佳在長度為100至500個或1000個或更多聚核苷酸(或20、50、200個或更多胺基酸)之區域上。
為進行序列比較，通常一個序列充當參考序列，測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入至電腦中，指定子序列座標(必要時)，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。隨後序列比較演算法基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
如本文所使用之「比較窗口」包括對選自由20至600、通常約50至約200，更通常約100至約150組成之群的鄰近位置數目中的任一者之區段的參考，其中在兩個序列經最佳對準之後，序列可與具有相同鄰近位置數目之參考序列比較。用於比較之序列對準之方法在此項技術中已熟知。用於比較之序列最佳對準可例如藉由Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源演算法，藉由Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443,1970之同源比對演算法，藉由Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之相似性搜索方法，藉由此等演算法(威斯康辛遺傳學軟體套件(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)中之GAP,BESTFIT,FASTA及TFASTA)之電腦化實施，或藉由手動對準及目測(參見例如，Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(Ringbou編，2003))進行。
適用於測定序列一致性及序列相似性百分比之演算法之兩個實 例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，Nuc.Acids Res.25：3389-3402,1977及Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410,1990中。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法涉及首先藉由識別查詢序列中長度W之短字組來鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字組在與資料庫序列中相同長度之字組比對時匹配或滿足某一正值臨界分數T。T係指鄰近字組分數閾值(Altschul等人，前述)。此等最初鄰近字組碰撞(word hit)充當啟始搜尋之種子以發現含有其之較長HSP。字組碰撞沿各序列以兩個方向延伸，直至累積對準分數可增加。就核苷酸序列而言，累積分數使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(失配殘基之罰分；始終<0)計算。就胺基酸序列而言，計分矩陣用於計算累積分數。字組碰撞在各方向中之延伸在以下情況時中斷：累積比對分數自其達成之最大值降低量X；累積分數由於一或多個負得分殘基比對之累積而變成0或0以下；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X確定比對之敏感性及速度。BLASTN程式(就核苷酸序列)使用以下作為預設值：字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N=-4及比較兩股。就胺基酸序列而言，BLASTP程式使用以下作為預設值：字長為3，及期望值(E)為10，且BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915,1989)採用以下作為預設值：對準(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4及比較兩股。
BLAST演算法亦在兩個序列之間進行相似性之統計分析(參見例如，Karlin及Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787,1993)。由BLAST演算法提供之一個相似性量度為最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間會偶然發生匹配的概率指標。舉例而言，若在測試核酸與參考核酸之比較中最小和概率小於約0.2， 更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列類似。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,1988)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)使用PAM120權重殘基表(weight residue table)(空隙長度罰分為12且空隙罰分為4)來測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,1970)演算法(其已併入GCG軟體套件(在全球資訊網上在gcg.com下可獲得)中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。
除以上所指示之序列一致性百分比之外，兩個核酸序列或多肽實質上一致之另一指示為如下所述由第一核酸編碼之多肽與針對由第二核酸編碼之多肽所產生之抗體具有免疫交叉反應性。由此，舉例而言，若兩個肽之不同之處僅在於保守取代，則多肽通常實質上與第二多肽一致。兩個核酸序列為實質上一致之另一指示為如下所述兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列實質上一致之又一指示為可使用同一引子來擴增序列。
術語「抑制Epo依賴性細胞增殖」係指抗Epo抗體干擾由Epo刺激及/或誘導之細胞活化(例如細胞信號傳導)、複製及/或增殖之能力。特定言之，「抑制」係指相對於對照，在與如本文所述之抗Epo抗體或其片段接觸之後個體之Epo依賴性細胞增殖或其他參數(例如Epo依賴性細胞信號傳導、血管生成)在統計學上顯著降低(亦即p<0.05)。如本文所使用之「抑制Epo依賴性細胞增殖」亦可指在用本文所述之抗Epo抗體治療之後，診斷患有與如下文所述之視網膜血管疾病相關之病狀或病症的患者之視覺功能或視網膜解剖學的臨床相關改進。
如本文所使用之「抑制Epo依賴性細胞信號傳導」係指本文所述 之抗Epo抗體在由Epo刺激或誘導之細胞內信號傳導途徑之活化方面產生統計學上顯著(亦即p<0.05)降低之能力。
術語「經分離抗體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體之抗體(例如，特異性結合Epo之經分離抗體實質上不含特異性結合除Epo以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合Epo之經分離抗體對其他抗原可具有交叉反應性。另外，經分離抗體可實質上不含其他細胞材料及/或化學品。
術語「同型」係指由重鏈恆定區基因提供之抗體類別(例如，IgM、IgE、IgG(諸如IgG1或IgG4))。同型亦包括此等類別中之一者之經修飾形式，其中已進行修飾以改變Fc功能，例如以增加或減少效應功能或與Fc受體之結合。同型亦指由輕鏈恆定區提供之抗體類別(例如κ、λ)。
如本文所使用之術語「Kassoc」或「Ka」意欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而如本文所使用之術語「Kdis」或「Kd」意欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所使用之術語「KD」意欲指解離常數，其獲自Kd與Ka之比(亦即Kd/Ka)，且表示為莫耳濃度(M)。抗體之KD值可使用此項技術中公認之方法測定。測定抗體之KD之方法包括使用諸如Biacore®系統之生物感測器系統來量測表面電漿子共振，或藉由溶液平衡滴定(SET)來量測溶液中之親和力。
如本文所使用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單分子組合物之抗體分子之製劑。單株抗體組合物展示對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
術語「核酸」在本文中與術語「聚核苷酸」互換使用，且係指呈單股或雙股形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有合成的、天然產生的及非天然產生的已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鍵之核酸，其具有與參考核酸類似之結合特性，且 其以類似於參考核苷酸之方式代謝。該等類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指明，否則特定核酸序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列，以及經明確指示之序列。特定言之，如下詳述，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選擇之(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌核苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081,1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608,1985；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98,1994)。
術語「可操作地連接」係指兩個或兩個以上聚核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。典型地，術語係指轉錄調節序列與經轉錄序列之功能關係。舉例而言，若啟動子或強化子序列在適當宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則啟動子或強化子序列可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接於轉錄序列之啟動子轉錄調節序列實體鄰接經轉錄序列，亦即其為順式作用。然而，諸如強化子之一些轉錄調節序列不必實體鄰接或緊密接近編碼序列，其增強該等編碼序列之轉錄。
如本文所使用之術語「經最佳化」意謂核苷酸序列經改變以使用較佳在產生細胞或生物體，通常真核細胞，例如畢赤酵母(Pichia)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞中之密碼子編碼胺基酸序列。經最佳化核苷酸序列經工程化以完全或儘可能多地保留最初由起始核苷酸序列編碼之胺基酸序列，其亦被稱為「親本」序列。本文中之經最佳化序列已經工程化以具有在哺乳動物細胞中較佳之密碼子。然而，本文中亦預想此等序列在其他真核細胞或原核細胞中之經最佳化表現。由經最佳化之核苷酸序列編碼之胺基酸序列亦稱為經最佳 化。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，以指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然產生之胺基酸之人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及適用於天然產生之胺基酸聚合物及非天然產生之胺基酸聚合物。除非另外指明，否則特定多肽序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體。
如本文所使用之術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離之抗體；由經轉型以表現人類抗體之宿主細胞(例如由轉染瘤)分離之抗體；由重組組合人類抗體庫分離之抗體；及藉由涉及剪接所有或一部分人類免疫球蛋白基因、序列至其他DNA序列的任何其他方式而製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體具有構架及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或，當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，為活體內體細胞突變誘發)，且由此該等重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為可能並不天然存在於人類活體內抗體生殖系抗體庫(repertoire)內之序列，儘管其來源於人類生殖系VH及VL序列且與其相關。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指已引入重組表現載體之細胞。應理解，該等術語意欲不僅指特定個體細胞，而且指此類細胞之後代。因為在後代中因突變或環境影響可發生某些改變，所以該子代可能實際上不與親本細胞一致，但仍包括於如本文所使用之術語「宿主細胞」之範疇內。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物(例如：哺乳動物及非哺乳動物)，諸如非人類靈長類動物(例如 獼猴)、綿羊、狗、母牛、雞、兩棲動物及爬蟲。除有所指示之時，術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。如本文所使用之術語「獼猴(cyno)」或「獼猴(cynomolgus)」係指獼猴(cynomolgus monkey)(食蟹猴(Macaca fascicularis))。
如本文所使用之術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」任何疾病或病症(例如視網膜血管疾病、糖尿病性視網膜病變、黃斑水腫)在一個實施例中係指減輕疾病或病症(亦即，使疾病或其至少一種臨床症狀之發展減緩或停滯或減少)。在另一實施例中，「治療」係指緩解或減輕至少一個生理參數，包括患者可能無法辨別之生理參數。在又一實施例中，「治療」係指在身體上(例如穩定可辨別之症狀)、生理上(例如穩定生理參數)或在兩方面調節疾病或病症。在又一實施例中，「治療」係指預防或延遲疾病或病症之發作或發展或進展。「預防」在與本文所述之適應症(包括與視網膜血管疾病相關之病狀或病症、與糖尿病性視網膜病變相關之病狀或病症及/或與黃斑水腫相關之病狀或病症)相關時意謂預防或減緩處於如下文所述視覺功能、視網膜解剖學、視網膜血管疾病參數、糖尿病性視網膜病變疾病參數及/或黃斑水腫疾病參數惡化風險中之患者之該惡化的任何措施。更特定言之，與視網膜血管疾病相關之病狀或病症、與糖尿病性視網膜病變相關之病狀或病症及/或與黃斑水腫相關之病狀或病症的「治療」意謂會引起或預期引起視覺功能及/或視網膜解剖學改進或維持的任何措施。評估疾病之治療及/或預防之方法為此項技術中已知且描述於下文中。
術語「載體」意欲指能夠輸送其已連接之另一聚核苷酸之聚核苷酸分子。一類載體為「質體」，其係指其他DNA區段可接合於其中之環形雙股DNA環。另一類載體為病毒載體，諸如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中其他DNA區段可接合至病毒基因組中。某些載 體能夠在引入其之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入宿主細胞之後可整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因的表現。該等載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱「表現載體」)。一般而言，適用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用之載體形式，故「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括起等效作用之該等其他表達載體形式，諸如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
圖1. 展示EPO誘導中央視網膜中之血管擴張。
圖2. 展示抗EPO Fab中和家兔眼睛中之EPO。
圖3. 展示抗EPO Fab中和家兔眼睛中之EPO。
本發明係部分基於特異性結合至Epo之抗體分子之發現。本發明係關於完整IgG形式抗體以及其抗原結合片段，諸如Fab片段(例如參見抗體NVS1、NVS2、NVS3及NVS4)。
因此，本發明提供特異性結合至Epo(例如人類Epo、獼猴Epo、大鼠Epo及小鼠Epo)之抗體、醫藥組合物、製造方法及使用該等抗體及組合物之方法。
Epo抗體及抗原結合片段
本發明提供特異性結合至Epo之抗體。在一些實施例中，本發明提供特異性結合至人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo以及人類過糖基化Epo(達貝泊汀)之抗體。本發明之抗體包括(但不限於)如實例中所述經分離之人類單株抗體及Fab。
本發明提供特異性結合Epo蛋白質(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)之抗體，其中該等抗體包含具有SEQ ID NO：13、33、53或73之胺基酸序列之VH域。本發明亦提供特異性結合至Epo蛋白質之抗體，其中該等抗體包含具有列於下文表1中之VH CDR中之任一者之胺基酸序列的VH CDR。特定言之，本發明提供特異性結合至Epo蛋白質(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)之抗體，其中該等抗體包含(或者由以下組成)具有列於下文表1中之VH CDR中之任一者之胺基酸序列的一個、兩個、三個或三個以上VH CDR。
本發明提供特異性結合至Epo蛋白質之抗體，該等抗體包含具有SEQ ID NO：14、34、54或74之胺基酸序列之VL域。本發明亦提供特異性結合至Epo蛋白質(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)之抗體，該等抗體包含具有列於下文表1中之VL CDR中之任一者之胺基酸序列的VL CDR。特定言之，本發明提供特異性結合至Epo蛋白質(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)之抗體，該等抗體包含(或者由以下組成)具有列於下文表1中之VL CDR中之任一者之胺基酸序列的一個、兩個、三個或三個以上VL CDR。
本發明之其他抗體包括已突變但與表1中所描述之序列中所描繪之CDR區在CDR區方面具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括在與表1中所描述之序列中所描繪之CDR區相比時CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變之突變胺基酸序列。
本發明亦提供編碼特異性結合至Epo蛋白質(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)之抗體之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈的核酸序列。該等核酸序列可針對在哺乳動物細胞中之表現經最佳化(舉例而言，表1展示本發明之抗體之重鏈及輕鏈之經最佳化的核酸序列)。
表1 Epo抗體、Fab及Epo蛋白質之實例
本發明之其他抗體包括胺基酸或編碼該等胺基酸之核酸已突變但與表1中所述之序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%一致性的抗體。一些實施例包括當與表1中所描述之序列中所描繪之可變區相比時可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變但保留實質上相同之抗原結合活性的突變胺基酸序列。
由於此等抗體各可結合至Epo，故VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼該等胺基酸序列之核苷酸序列)可「經混合及匹配」，以產生本發明之其他Epo結合抗體。該等「經混合及匹配」之Epo結合抗體可使用此項技術中已知之結合分析(例如ELISAs及實例部分中所描述之其他分析)測試。當此等鏈經混合及匹配時，特定VH/VL配對之VH序列應以結構上類似之VH序列置換。同樣，特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應以結構上類似之全長重鏈序列置換。同樣，特定VH/VL配對之VL序列應以結構上類似之VL序列置換。同樣，特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應以結構上類似之全長輕鏈序列置換。因此，在一個態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合區，其具有：包含選自由SEQ ID NO：13、33、53及73組成之群的胺基酸序列之重鏈可變域，及包含選自由SEQ ID NO：14、34、54及74組成之群的胺基酸序列之輕鏈可變域，其中抗體特異性結合至Epo(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)。更特定言之，在某些態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原 結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：13及14之胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變域。在其他特定態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：33及34之胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變域。在又其他態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：53及54之胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變域。在又其他態樣中，本發明提供一種經分離之抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：73及74之胺基酸序列之重鏈可變域及輕鏈可變域。
在另一態樣中，本發明提供(i)經分離抗體，其具有：包含選自由SEQ ID NO：15、35、55及75組成之群已針對在哺乳動物細胞中之表現經最佳化之胺基酸序列的全長重鏈，及包含選自由SEQ ID NO：16、36、56及76組成之群已針對在哺乳動物細胞中之表現經最佳化之胺基酸序列的全長輕鏈；或(ii)功能蛋白，其包含其抗原結合部分。更特定言之，在某些態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：15及16之胺基酸序列之重鏈及輕鏈。在其他特定態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：35及36之胺基酸序列之重鏈及輕鏈。在又其他態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：55及56之胺基酸序列之重鏈及輕鏈。在又其他態樣中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合區，其具有分別包含選自SEQ ID NO：75及76之胺基酸序列之重鏈及輕鏈。
如本文所使用之術語「互補決定區，」及「CDR，」係指賦予抗原特異性及結合親和力之抗體可變區內的胺基酸序列。一般而言，各重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且各輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
給定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用多種熟知方案中的任一者容易地確定，該等方案包括由Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案)、Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)所描述之方案。
舉例而言，根據Kabat，將重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31至35(HCDR1)、50至65(HCDR2)及95至102(HCDR3)；且將輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24至34(LCDR1)、50至56(LCDR2)及89至97(LCDR3)。根據Chothia，將VH中之CDR胺基酸編號為26至32(HCDR1)、52至56(HCDR2)及95至102(HCDR3)；且將VL中之胺基酸殘基編號為26至32(LCDR1)、50至52(LCDR2)及91至96(LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia兩者之CDR定義，CDR由人類VH中之胺基酸殘基26至35(HCDR1)、50至65(HCDR2)及95至102(HCDR3)及人類VL中之胺基酸殘基24至34(LCDR1)、50至56(LCDR2)及89至97(LCDR3)組成。
在另一態樣中，本發明提供Epo結合抗體，其包含如表1中所述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合。抗體之VH CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：1、21、41或61中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2、22、42或62中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：3、23、43或63中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：4、24、44或64中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：5、25、45或65中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：6、26、46或66中。此等CDR區使用Kabat系統描繪。
或者，如使用Chothia系統(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927- 948)所定義，抗體之VH CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：7、27、47或67中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：8、28、48或68中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：9、29、49或69中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：10、30、50或70中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：11、31、51或71中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：12、32、52或72中。
鑒於此等抗體中之每一者均可結合至Epo且抗原結合特異性主要由CDR1、2及3區提供，故VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可「經混合及匹配」(亦即，來自不同抗體之CDR可經混合及匹配，不過各抗體較佳含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3以產生本發明之其他Epo結合分子。該等「經混合及匹配」之Epo結合抗體可使用此項技術中已知之結合分析及實例中所描述之結合分析(例如ELISA、SET、Biacore)來測試。當VH CDR序列經混合及匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應用結構上類似之CDR序列置換。同樣，當VL CDR序列經混合及匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應用結構上類似之CDR序列置換。一般熟習此項技術者將易於顯而易知，新穎的VH及VL序列可藉由用來自本文中針對本發明之單株抗體所示之CDR序列之結構上類似之序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列而產生。除前述之外，在一個實施例中，本文所述之抗體之抗原結合片段可包含VH CDR1、2及3或VL CDR 1、2及3，其中片段以單可變域形式結合至Epo。
在本發明之某些實施例中，抗體或其抗原結合片段可具有表1中所述之Fab之重鏈及輕鏈序列。更特定言之，抗體或其抗原結合片段可具有Fab NVS1、NVS2、NVS3或NVS4之重鏈及輕鏈序列。
在本發明之其他實施例中，如Kabat所定義且如表1中所述，特異性結合Epo之抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2及輕鏈可變區CDR3。在本發明之其他實施例中，如Chothia所定義且如表1中所述，特異性結合Epo之抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2及輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：1之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：2之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：3之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：4之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：5之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：6之輕鏈可變區CDR3。在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：21之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：22之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：23之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：24之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：25之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：26之輕鏈可變區CDR3。在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：41之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：42之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：43之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：44之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：45之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：46之輕鏈可變區CDR3。在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：61之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：62之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：63之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：64之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：65之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：66之輕鏈可變區CDR3。
在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：8之重鏈可變區 CDR2；SEQ ID NO：9之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：10之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：11之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：12之輕鏈可變區CDR3。在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：27之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：28之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：29之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：30之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：31之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：32之輕鏈可變區CDR3。在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：47之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：48之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：49之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：50之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：51之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：52之輕鏈可變區CDR3。在另一特定實施例中，本發明包括特異性結合至Epo之抗體，其包含SEQ ID NO：67之重鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：68之重鏈可變區CDR2；SEQ ID NO：69之重鏈可變區CDR3；SEQ ID NO：70之輕鏈可變區CDR1；SEQ ID NO：71之輕鏈可變區CDR2；及SEQ ID NO：72之輕鏈可變區CDR3。
在某些實施例中，本發明包括如表1中所述之特異性結合至Epo之抗體或抗原結合片段。在一較佳實施例中，結合Epo之抗體或抗原結合片段為Fab NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。
如本文所使用，若人類抗體之可變區或全長鏈係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統，則該抗體包含作為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列的重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。該等系統包括以所關注抗原來使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，或以所關注抗原來篩檢在抗菌素上呈現之人類免疫球蛋白基因庫。因而，作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將該 人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列相比較，及選擇序列最接近(亦即最大一致性%)該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之產物或來源於其的人類抗體與該生殖系序列相比較可含有胺基酸差異，此係歸因於例如天然產生之體細胞突變或定點突變之意向引入。然而，在VH或VL構架區中，當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠生殖系序列)相比時，所選擇之人類抗體之胺基酸序列通常與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有識別人類抗體為人類之胺基酸殘基。在某些情況中，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%，或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%，或99%一致。重組人類抗體與由VH或VL構架區中人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比通常將呈現不超過10個胺基酸差異。在某些情況中，人類抗體與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比可呈現不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。人類生殖系免疫球蛋白基因之實例包括(但不限於)下文所述之可變域生殖系片段，以及DP47及DPK9。
同源抗體
在又一實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含與表1中所述之序列同源之胺基酸序列，且該抗體結合至Epo蛋白質(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)，且保留表1中所述之抗體之所需功能特性。
舉例而言，本發明提供一種經分離抗體或其功能抗原結合片段，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，其中重鏈可變域包含與選自由SEQ ID NO：13、33、53及73組成之群的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；輕鏈可變域 包含與選自由SEQ ID NO：14、34、54及74組成之群的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列；且抗體特異性結合至Epo(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)。在本發明之某些態樣中，如由Kabat所定義，重鏈及輕鏈序列進一步包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如分別為SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6；分別為SEQ ID NO：21、22、23、24、25及26；分別為SEQ ID NO：41、42、43、44、45及46；或分別為SEQ ID NO：61、62、63、64、65及66。在本發明之某些其他態樣中，如由Chothia所定義，重鏈及輕鏈序列進一步包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3序列，例如分別為SEQ ID NO：7、8、9、10、11及12；分別為SEQ ID NO：27、28、29、30、31及32；分別為SEQ ID NO：47、48、49、50、51及52；或分別為SEQ ID NO：67、68、69、70、71及72。
在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與闡述於表1中之序列80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他實施例中，除在不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置中之胺基酸取代之外，VH及/或VL胺基酸序列可相同。VH及VL區與表1中所述之抗體之VH及VL區具有較高(亦即80%或更大)一致性之抗體可藉由以下方式獲得：突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)分別編碼SEQ ID NO：13、33、53或73及SEQ ID NO：14、34、54或74之核酸分子，接著使用本文所述之功能分析針對所保留之功能測試所編碼經改變之抗體。
在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可與闡述於表1中之序列80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。全長重鏈及全長輕鏈與SEQ ID NO：15、35、55或75中的任一者之全長重鏈及SEQ ID NO：16、36、56或76中的任一者之全長輕鏈具 有較高(亦即80%或更大)一致性的抗體可藉由以下方式獲得：突變誘發(例如定點或PCR介導之突變誘發)編碼該等多肽之核酸分子，接著使用本文所述之功能分析針對所保留功能測試所編碼經改變之抗體。
在其他實施例中，全長重鏈及/或全長輕鏈核苷酸序列可與闡述於表1中之序列80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
在其他實施例中，重鏈之可變區及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可與闡述於表1中之序列80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。
如本文所使用，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共用之相同位置數的函數(亦即，一致性%=相同位置數/總位置數×100)，考慮為達成兩個序列之最佳比對所需要引入之空隙數及各空隙之長度。兩條序列之間的序列比較及百分一致性測定可使用如在以下非限制性實例中所述之數學演算法來達成。
另外或可替代地，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行搜尋以例如鑑別相關序列。舉例而言，該等搜尋可使用Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-10之BLAST程式(2.0版)進行。
具有保守修飾之抗體
在某些實施例中，本發明之抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列中之一或多者具有基於本文所述之抗體之特定胺基酸序列或其保守修飾，且其中該等抗體保留本發明之Epo結合抗體之所需功能特性。因此，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包含：包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中：重鏈可變區CDR1胺 基酸序列係選自由SEQ ID NO：1、21、41及61組成之群及其保守修飾；重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：2、22、42及62組成之群及其保守修飾；重鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：3、23、43及63組成之群及其保守修飾；輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：4、24、44及64組成之群及其保守修飾；輕鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：5、25、45及65組成之群及其保守修飾；CDR3胺基酸序列之輕鏈可變區係選自由SEQ ID NO：6、26、46及66組成之群及其保守修飾；且抗體或其抗原結合片段特異性結合至Epo。
在其他實施例中，本發明之抗體針對在哺乳動物細胞中之表現經最佳化，且具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中此等序列中之一或多者具有基於本文所述之抗體之特定胺基酸序列或其保守修飾，且其中該等抗體保留本發明之Epo結合抗體之所需功能特性。因此，本發明提供一種針對在哺乳動物細胞中之表現經最佳化之經分離抗體，其由全長重鏈及全長輕鏈組成，其中全長重鏈具有選自SEQ ID NO：15、35、55及75之群的胺基酸序列及其保守修飾；且全長輕鏈具有選自SEQ ID NO：16、36、56及76之群的胺基酸序列及其保守修飾；且抗體特異性結合至Epo(例如人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo)。
結合至同一抗原決定基之抗體
本發明提供結合至與表1中所述之Epo結合抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基的抗體。其他抗體可因此在Epo結合分析(諸如描述於實例中之結合分析)中基於其與本發明之其他抗體競爭(例如，以統計學顯著方式競爭性地抑制本發明之其他抗體的結合)之能力經鑑別。測試抗體抑制本發明之抗體與Epo蛋白質結合之能力表明，測試抗體可與該抗體競爭結合至Epo；根據非限制性理論，此類抗體可 結合至Epo蛋白質上與其競爭之抗體相同或相關(例如結構上類似或在空間上接近)之抗原決定基。在某一實施例中，結合至Epo上與本發明之抗體所結合之抗原決定基相同之抗原決定基的抗體為人類單株抗體。該等人類單株抗體可如本文所述製備及分離。如本文所使用，在等莫耳濃度競爭抗體存在下，當競爭抗體抑制本發明之抗體或抗原結合片段之Epo結合超過50%時，抗體「競爭」結合。
在其他實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段結合Epo之螺旋D域(Epo蛋白質之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)。在其他實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段結合Epo之螺旋A(Epo蛋白質之胺基酸4至26；SEQ ID NO：86)及環A-B(Epo蛋白質之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)。
在其他實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段結合至Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)。在其他實施例中，經分離抗體或抗原結合片段結合環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)。在其他實施例中，經分離抗體或抗原結合片段結合環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)及螺旋A(人類Epo之胺基酸4至26；SEQ ID NO：86)。在又其他實施例中，經分離抗體或抗原結合片段結合Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)及環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)。在其他實施例中，經分離抗體或抗原結合片段結合Epo之D螺旋域(人類Epo之胺基酸138至162；SEQ ID NO：88)、環A-B域(人類Epo之胺基酸27至55；SEQ ID NO：89)及螺旋A(人類Epo之胺基酸4至26；SEQ ID NO：86)。
在本發明之其他態樣中，經分離抗體或抗原結合片段結合包含位於人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下位置之胺基酸的抗原決定基：44至50、52、53、147、150、151、154、155、159及162。在本發明之 其他態樣中，經分離抗體或抗原結合片段結合包含位於人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下位置之胺基酸的抗原決定基：9、13、44至53、147、150、151、154、155、158、159及162。在本發明之其他態樣中，經分離抗體或抗原結合片段結合包含位於人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下位置之胺基酸的抗原決定基：23、43至50、52、53、131、143、147、150、151、154、155、159及162。在本發明之特定態樣中，經分離抗體或抗原結合片段結合包含人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下胺基酸的抗原決定基：Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala(在位置44至50處)、Lys-Arg(在位置52至53處)、Asn(在位置147處)、Arg-Gly(在位置150至151處)、Lys-Leu(在位置154至155處)、Glu(在位置159處)及Arg(在位置162處)。在本發明之其他特定態樣中，經分離抗體或抗原結合片段結合包含人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下胺基酸的抗原決定基：Ser(在位置9處)、Glu(在位置13處)、Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala(在位置44至50處)、Lys-Arg(在位置52至53處)、Asn(在位置147處)、Arg-Gly(在位置150至151處)、Lys-Leu(在位置154至155處)、Gly(在位置158處)、Glu(在位置159處)及Arg(在位置162處)。在本發明之又其他態樣中，經分離抗體或抗原結合片段結合包含人類Epo(SEQ ID NO.81)之以下胺基酸的抗原決定基：Glu(在位置23處)、Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala(在位置43至50處)、Lys-Arg(在位置52至53處)、Arg(在位置131處)、Arg(在位置143處)、Asn(在位置147處)、Arg-Gly(在位置150至151處)、Lys-Leu(在位置154至155處)、Glu(在位置159處)及Arg(在位置162處)。
本發明亦包括人類Epo上之構形抗原決定基，該抗原決定基包含胺基酸殘基Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Glu159及Arg162，其中結合至抗原決定基之抗體將抑制Epo結合至Epo受 體。亦預期，結合至本發明之抗原決定基之抗體將進一步抑制Epo依賴性細胞增殖。
本發明進一步包括人類Epo上之構形抗原決定基，該抗原決定基包含胺基酸殘基Ser9、Glu13、Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Gly158、Glu159及Arg162，其中結合至抗原決定基之抗體將抑制Epo結合至Epo受體。亦預期，結合至本發明之抗原決定基之抗體將進一步抑制Epo依賴性細胞增殖。
本發明又進一步包括人類Epo上之構形抗原決定基，該抗原決定基包含胺基酸殘基Glu23、Asp43、Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Arg131、Arg143、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Glu159及Arg162，其中結合至抗原決定基之抗體將抑制Epo結合至Epo受體。亦預期，結合至本發明之抗原決定基之抗體將進一步抑制Epo依賴性細胞增殖。
經工程化及修飾之抗體
此外，本發明之抗體可使用具有本文中所示之VH序列及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質將經修飾之抗體工程化來製備，該經修飾之抗體可具有與起始抗體不同之特性。可藉由修飾一或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內)之一或多個殘基來對抗體進行工程化。另外或可替代地，抗體可藉由修飾在恆定區內之殘基例如以改變該抗體之效應功能來工程化。
可進行之一種類型之可變區工程化為CDR接枝。抗體主要經由位於六個重鏈與輕鏈互補決定區(CDR)內之胺基酸殘基與標靶抗原相互作用。出於此原因，在個別抗體之間，CDR內之胺基酸序列比CDR外之序列差異更大。由於CDR序列造成大部分抗體抗原相互作用，故有 可能藉由構築表現載體而表現模擬特定天然產生之抗體之特性的重組抗體，該等表現載體包括接枝至來自具有不同特性之不同抗體之構架序列上的來自特定天然產生之抗體的CDR序列(參見例如，Riechmann,L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones,P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen,C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.,U.S.A.86：10029-10033；Winter之美國專利第5,225,539號，及Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
因此，本發明之另一實施例有關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有選自由SEQ ID NO：1、21、41及61組成之群的胺基酸序列之CDR1序列，具有選自由SEQ ID NO：2、22、42及62組成之群的胺基酸序列之CDR2序列，具有選自由SEQ ID NO：3、23、43及63組成之群的胺基酸序列之CDR3序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有分別具有選自由SEQ ID NO：4、24、44及64組成之群的胺基酸序列之CDR1序列，具有選自由SEQ ID NO：5、25、45及65組成之群的胺基酸序列之CDR2序列，及由選自由SEQ ID NO：6、26、46及66組成之群的胺基酸序列組成之CDR3序列。由此，該等抗體含有單株抗體之VH及VL CDR序列，但可能含有與此等抗體不同之構架序列。
或者，本發明之另一實施例有關於一種經分離抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含分別具有選自由SEQ ID NO：7、27、47及67組成之群的胺基酸序列之CDR1序列，具有選自由SEQ ID NO：8、28、48及68組成之群的胺基酸序列之CDR2序列，具有選自由SEQ ID NO：9、29、49及69組成之群的胺基酸序列之CDR3序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有分別具有選自由SEQ ID NO：10、30、50及70組成之群的胺基酸序列之CDR1序列，具有選 自由SEQ ID NO：11、31、51及71組成之群的胺基酸序列之CDR2序列，及由選自由SEQ ID NO：12、32、52及72組成之群的胺基酸序列組成之CDR3序列。由此，該等抗體含有單株抗體之VH及VL CDR序列，但可能含有與此等抗體不同之構架序列。
可自包括生殖系抗體基因序列之公開DNA資料庫或已出版文獻獲得該等構架序列。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可見於「VBase」人類生殖系序列資料庫(可在全球資訊網上mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase處獲得)以及Kabat,E.A.，等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號；Tomlinson,I.M.，等人，1992 J.Mol.Biol.227：776-798及Cox,J.P.L.等人，1994 Eur.J Immunol.24：827-836中；該等文獻中之各者的內容明確地以引用之方式併入本文中。
用於本發明之抗體中之構架序列之一實例為與由本發明之選定抗體所用之構架序列及/或由本發明之單株抗體所用之構架序列結構類似的構架序列(例如一致序列)。VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列可接枝至與產生構架序列之生殖系免疫球蛋白基因中所見的序列具有一致序列之構架區上，或CDR序列可接枝至與生殖系序列相比含有一或多個突變之構架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，使構架區內殘基突變有益於維持或增強抗體之抗原結合能力(參見例如，Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。可用作上面建立本文所述之抗體及抗原結合片段之骨架的構架包括(但不限於)VH1A、VH1B、VH3、Vk1、V12及Vk2。其他構架為此項技術中已知，且可見於例如基於全球資訊網在vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？&MMN_position=1：1處之vBase資料庫中。
因此，本發明之一實施例係關於經分離Epo結合抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：13、33、53及73組成之群的胺基酸序列或在該等序列之構架區中具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列，且進一步包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有選自由SEQ ID NO：14、34、54及74組成之群的胺基酸序列或在該等序列之構架區中具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
另一類可變區修飾為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變以進而改進所關注抗體之一或多種結合特性(例如親和力)，稱為「親和力成熟」。可進行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且對抗體結合或其他所關注功能特性之影響可以如本文中所述及實例中所提供之活體外或活體內分析來評估。可引入保守修飾(如上文所論述)。該等突變可為胺基酸取代、添加或缺失。另外，通常CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基得以改變。
因此，在另一實施例中，本發明提供經分離Epo結合抗體或其抗原結合片段，其由以下組成：重鏈可變區，該重鏈可變區具有VH CDR1區，其由選自具有SEQ ID NO：1、21、41及61之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：1、21、41或61相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列組成；VH CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：2、22、42及62組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2、22、42或62相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VH CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：3、23、43及63組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3、23、43或63相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取 代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR1區，其具有選自由SEQ ID NO：4、24、44及64組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：4、24、44或64相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：5、25、45及65組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：5、25、45或65相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；及VL CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：6、26、46及66組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：6、26、46或66相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
因此，在另一實施例中，本發明提供經分離Epo結合抗體或其抗原結合片段，其由以下組成：重鏈可變區，該重鏈可變區具有VH CDR1區，其由選自具有SEQ ID NO：7、27、47及67之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：7、27、47或67相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列組成；VH CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：8、28、48及68組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：8、28、48或68相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VH CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：9、29、49及69組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：9、29、49或69相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR1區，其具有選自由SEQ ID NO：10、30、50及70組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10、30、50或70相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；VL CDR2區，其具有選自由SEQ ID NO：11、31、51及71組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：11、31、51或71相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；及VL CDR3區，其具有選自由SEQ ID NO：12、 32、52及72組成之群的胺基酸序列或與SEQ ID NO：12、32、52或72相比具有一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
將抗原結合域接枝至替代構架或骨架中
可採用多種抗體/免疫球蛋白構架或骨架，只要所得多肽包括特異性結合至Epo之至少一個結合區即可。該等構架或骨架包括人類免疫球蛋白或其片段之5個主要個體基因型，且包括其他動物物種之免疫球蛋白(較佳具有人類化態樣)。單一重鏈抗體(諸如在駱駝中鑑別之單一重鏈抗體)在此方面尤其受關注。熟習此項技術者不斷地發現及開發新穎的構架、骨架及片段。
在一個態樣中，本發明有關於使用本發明之CDR可接枝至其上之非免疫球蛋白骨架來產生基於非免疫球蛋白之抗體。可採用已知或未來的非免疫球蛋白構架及骨架，只要其包含對標靶Epo蛋白質具有特異性之結合區即可。已知非免疫球蛋白構架或骨架包括(但不限於)纖維結合蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗體(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA及Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模組化免疫藥物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,Seattle,WA)、maxybody(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、蛋白A(Affibody AG,Sweden)及affilin(γ-晶體蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。
纖維結合蛋白骨架係基於III型纖維結合蛋白域(例如III型纖維結合蛋白之第十模組(10 Fn3域))。III型纖維結合蛋白域具有7條或8條分佈在兩個β摺疊之間的β股，其本身彼此相抵壓緊以形成該蛋白質之核心，且進一步含有將該等β股彼此連接且經溶劑暴露之環(與CDR類似)。在β摺疊夾層之各邊緣處存在至少三個該等環，其中該邊緣為該 蛋白質垂直於β股方向之邊界(參見US 6,818,418)。此等基於纖維結合蛋白之骨架不為免疫球蛋白，儘管總摺疊與包含駱駝(camel)及駱馬(llama)IgG中之完整抗原識別單元之最小功能抗體片段(重鏈之可變區)之總摺疊緊密相關。由於此結構，故非免疫球蛋白抗體模擬在本質上及親和力上與抗體之抗原結合特性類似之抗原結合特性。此等骨架可用於與活體內抗體之親和力成熟之過程類似之活體外環隨機化及改組策略中。此等基於纖維結合蛋白之分子可用作骨架，其中分子之環區可使用標準選殖技術用本發明之CDR置換。
錨蛋白技術係基於使用具有錨蛋白衍生之重複模組的蛋白質作為用於承載可變區之骨架，該等可變區可用於結合至不同標靶。錨蛋白重複模組為由兩個反平行α-螺旋及β轉角組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合主要藉由使用核糖體呈現來最佳化。
高親和性多聚體(Avimer)來源於含天然A域之蛋白質，諸如LRP-1。此等域本性上用於蛋白質-蛋白質相互作用，且人類有超過250種蛋白質係在結構上基於A域。高親和性多聚體由大量經由胺基酸連接子連接之不同「A域」單體(2至10個)組成。高親和性多聚體可使用描述在例如美國專利申請公開案第20040175756號、第20050053973號、第20050048512號及第20060008844號中之方法產生，其可結合至靶抗原。
親和抗體(Affibody)親和力配位體為由基於蛋白A之IgG結合域中之一者之骨架的三螺旋束組成之小型單純蛋白質。蛋白A為細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之表面蛋白質。此骨架域由58個胺基酸組成，隨機選擇其中13個胺基酸以產生具有大量配位體變異體之親和抗體庫(參見例如US 5,831,012)。親和抗體分子模擬抗體，與分子量為150kDa之抗體相比，其分子量為6kDa。與親和抗體分子之小尺寸無關，其結合位點仍與抗體之結合位點類似。
Anticalin為由Pieris ProteoLab AG公司開發之產品。其衍生自脂質運載蛋白，一大群小型且穩固之蛋白質，其通常與化學敏感或不溶化合物之生理輸送或儲存有關。若干種天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。該蛋白質架構與免疫球蛋白類似，其中高變環位於剛性構架之頂部。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成，其僅略大於單一免疫球蛋白域。組成結合袋之四個環之組展示顯著結構可塑性且帶有多個側鏈。該結合位點由此可在專屬過程中再形成從而以較高親和力及特異性識別不同形狀之指定標靶分子。脂質運載蛋白家族之一種蛋白質(大菜粉蝶(Pieris Brassicae)之後色膽素結合蛋白(BBP))已用於藉由誘變四個環之組來開發抗運載蛋白。描述抗運載蛋白之專利申請案之一個實例在PCT公開案第WO 1999/16873號中。
Affilin分子為小型非免疫球蛋白蛋白質，其經設計以對蛋白質及小分子具特異性親和力。新affilin分子可極快速地選自兩個庫，每一庫均基於不同人類衍生骨架蛋白質。Affilin分子並不展示與免疫球蛋白蛋白質的任何結構同源性。目前，採用兩種affilin骨架，其中之一者為γ結晶，人類結構眼晶體蛋白質，且另一者為「泛素」超家族蛋白質。兩種人類骨架均極小，展示高溫穩定性且幾乎抗pH值變化及變性劑。此高穩定性主要歸因於該等蛋白質之β摺疊結構擴大。γ結晶衍生蛋白質之實例描述於WO 2001/04144中，且「泛素樣」蛋白質之實例描述於WO 2004/106368中。
蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)為中等大小、環狀、肽樣分子(MW 1-2kDa)，模擬蛋白質之β髮夾二級結構，該主要二級結構涉及蛋白質-蛋白質相互作用。
本發明提供特異性結合至Epo蛋白質之完整人類抗體。與嵌合或人類化抗體相比，當向人類個體投與時，本發明之人類Epo結合抗體 之抗原性進一步減小。
駱駝科抗體(camelid antibody)
獲自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)及單峰駱駝(Camelus dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如駱馬物種(羊駝(Lama pacos)、大羊駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna)))獲得之抗體蛋白已關於尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性進行表徵。如自然界中所發現，來自此哺乳動物家族之某些IgG抗體缺少輕鏈，且由此在結構上不同於來自其他動物之抗體之具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214(1994年3月3日公開之WO 94/04678)。
駱駝科抗體中鑑別為VHH之區域(小型單可變域)可藉由遺傳工程化獲得，以產生對標靶具有高親和力之小型蛋白質，產生稱作「駱駝科奈米抗體」之來源於抗體之低分子量蛋白質。參見1998年6月2日頒佈之美國專利第5,759,808號；亦參見Stijlemans,B.等人，2004 J Biol Chem 279：1256-1261、Dumoulin,M.等人，2003 Nature 424：783-788、Pleschberger,M.等人2003 Bioconjugate Chem 14：440-448、Cortez-Retamozo,V.等人2002 Int J Cancer 89：456-62及Lauwereys,M.等人1998 EMBO J 17：3512-3520。駱駝科抗體及抗體片段之工程化庫為可購得的，例如購自Ablynx、Ghent、Belgium。如同其他非人類來源之抗體，駱駝科抗體之胺基酸序列可重組改變以得到更密切類似人類序列之序列，亦即，該奈米抗體可經「人類化」。由此，可進一步減小駱駝科抗體對人類之天然低抗原性。
駱駝科奈米抗體之分子量約為人類IgG分子之十分之一，且蛋白質之實體直徑僅為幾奈米。小尺寸之一種結果為駱駝科奈米抗體結合功能上不可為較大抗體蛋白所見之抗原位點之能力，亦即駱駝科奈米抗體適用作偵測使用經典免疫技術隱藏之抗原之試劑，且適用作可能 之治療劑。因此，小尺寸之又一結果為駱駝科奈米抗體可由於結合至標靶蛋白質之凹槽或狹窄間隙中之特定位點而具抑制作用，且因此可以與經典抗體之功能相比更接近經典低分子量藥物之功能的能力發揮作用。
低分子量及緊湊尺寸進一步使駱駝科奈米抗體極其熱穩定，對極端pH值及蛋白水解消化穩定，且具弱抗原性。另一結果為駱駝科奈米抗體易於自循環系統移至組織中，且甚至跨過血腦障壁且可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物跨過血腦障壁輸送。參見2004年8月19日公開之美國專利申請案20040161738。與對人類之低抗原性組合之此等特徵指示巨大治療潛力。此外，此等分子可在諸如大腸桿菌(E.coli)之原核細胞中完全表現，且表現為與噬菌體之融合蛋白且具功能性。
因此，本發明之特徵為一種對Epo具高親和力之駱駝科抗體或奈米抗體。在本文中某些實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體在駱駝科動物中天然產生，亦即，由駱駝科以Epo或其肽片段使用本文對於其他抗體描述之技術免疫接種之後而產生。或者，使Epo結合駱駝科奈米抗體工程化，亦即藉由如本文中之實例中所述以Epo作為標靶使用淘選程序例如自呈現經適當誘變之駱駝科奈米抗體蛋白質之噬菌體庫選擇而產生。經工程化之奈米抗體可進一步藉由遺傳工程化定製以使其在接受個體中之半衰期為45分鐘至2週。在一特定實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體藉由將本發明之人類抗體之重鏈或輕鏈之CDR序列接枝至奈米抗體或單一域抗體構架序列中來獲得，如WO 1994/004678中之實例所述。
雙特異性分子及多價抗體
在另一態樣中，本發明特徵為包含本發明之Epo結合抗體或其片段之雙特異性或多特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合區可衍生 或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配位體)，以產生與至少兩個不同結合位點或標靶分子結合之雙特異性分子。本發明之抗體可實際上衍生或連接至一個以上其他功能分子以產生結合至兩個以上不同結合位點及/或標靶分子之多特異性分子；亦意欲此類多特異性分子由如本文所使用之術語「雙特異性分子」所涵蓋。為了產生本發明之雙特異性分子，本發明之抗體可與諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬劑之一或多個其他結合分子功能上連接(例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或以其他方式)以得到雙特異性分子。
因此，本發明包括包含至少一個對Epo之第一結合特異性及對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性之雙特異性分子。舉例而言，第二標靶抗原決定基為不同於第一標靶抗原決定基之另一Epo抗原決定基。
此外，就雙特異性分子具多特異性之發明而言，除第一及第二標靶抗原決定基之外，該分子可另外包括第三結合特異性。
在一個實施例中，本發明之雙特異性分子包含作為結合特異性之至少一個抗體或其抗體片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv。如Ladner等人美國專利第4,946,778號中所述，抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，諸如Fv或單鏈結構。
雙功能抗體為二價雙特異性分子，其中VH及VL域在單一多肽鏈上表現，其由過短而不容許同一鏈上之兩個域之間配對的連接子連接。VH及VL域與另一鏈之互補域配對，進而產生兩個抗原結合位點(參見例如，Holliger等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak等人，1994 Structure 2：1121-1123)。雙功能抗體可藉由在同一細胞內以結構VHA-VLB及VHB-VLA(VH-VL組態)或VLA-VHB及VLB-VHA(VL-VH組態)表現兩條多肽鏈來產生。其中大多數可在細 菌中以可溶形式表現。單鏈雙功能抗體(scDb)藉由用具有約15個胺基酸殘基之連接子將兩條形成雙功能抗體之多肽鏈加以連接來產生(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(3-4)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36)。scDb可在細菌中以可溶性活性單體形式表現(參見Holliger及Winter,1997 Cancer Immunol.Immunother.,45(34)：128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology,2(1)：21-36；Pluckthun及Pack,1997 Immunotechnology,3(2)：83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng.,9(7)：617-21)。可將雙功能抗體與Fc融合以產生「雙-雙功能抗體」(參見Lu等人，2004 J.Biol.Chem.,279(4)：2856-65)。
可用於本發明之雙特異性分子中之其他抗體為鼠、嵌合及人類化單株抗體。
雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法將組分結合特異物結合來製備。舉例而言，雙特異性分子之各結合特異物可分別產生，且隨後彼此結合。當結合特異物為蛋白質或肽時，多種偶合劑或交聯劑可用於共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺酸基丁二醯亞胺酯(磺酸基-SMCC)(參見例如，Karpovsky等人，1984 J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人，1985 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括描述於Paulus,1985 Behring Ins.Mitt.第78期，118-132；Brennan等人，1985 Science 229：81-83)及Glennie 等人，1987 J.Immunol.139：2367-2375)中之方法。結合劑為SATA及磺酸基-SMCC，其均購自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
當結合特異物為抗體時，其可藉由兩條重鏈之C端鉸鏈區之硫氫 基鍵結來結合。在一特定實施例中，在結合之前，鉸鏈區經修飾以含有奇數個硫氫基殘基，例如一個。
或者，兩種結合特異物可在同一載體中編碼，且在同一宿主細胞中表現及組裝。此方法尤其適用於雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白質之情況。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號中。
雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由例如酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(REA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析來確認。此等分析中之每一者通常藉由採用對所關注之複合物具特異性之標記試劑(例如抗體)來偵測特別受關注之蛋白質-抗體複合物的存在。
在另一態樣中，本發明提供多價化合物，其包含本發明之抗體結合至Epo之至少兩個相同或不同抗原結合部分。抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵連接在一起。或者，已描述雙特異性分子之鍵聯方法。四價化合物可例如藉由本發明之抗體與結合至本發明之抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)之抗體之交聯抗體來獲得。
三聚域描述於例如Borean專利EP 1 012 280B1中。五聚模組描述於例如WO 1998/018943中。
具有延長之半衰期之抗體
本發明提供特異性結合至Epo蛋白質之抗體，其在活體內具有延 長之半衰期。
許多因素可影響蛋白質之活體內半衰期，例如腎臟過濾、肝中代謝、藉由蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原性反應(例如，利用抗體之蛋白質中和及利用巨噬細胞及樹突狀細胞之攝取)。多種策略可用於延長本發明之抗體之半衰期。舉例而言，藉由與聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體骨架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合配位體及碳水化合物盾(carbohydrate shield)化學鍵聯；藉由與結合至血清蛋白質之蛋白質(諸如白蛋白、IgG、FcRn)基因融合及傳遞；藉由與結合至血清蛋白質之其他結合部分(諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體、親和抗體及抗運載蛋白)偶合(以遺傳方式或以化學方式)；藉由與rPEG、白蛋白、白蛋白域、白蛋白結合蛋白質及Fc基因融合；或藉由併入至奈米載體、緩慢釋放調配物或醫學裝置中。
為了延長活體內抗體之血清循環，諸如高分子量聚乙二醇(PEG)之惰性聚合物分子可經由PEG與抗體之N端或C端位點特異性結合或經由存在於離胺酸殘基上之ε胺基連接至具有或不具有多功能連接子之抗體或其片段上。為了聚乙二醇化抗體，通常在使一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段之條件下，將抗體或其片段與PEG(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷化反應來進行。如本文所使用之術語「聚乙二醇」及「PEG」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之PEG之形式中的任一者，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體為無糖基化(aglycosylated)抗體。將使用使生物活性損失降至最低之線性或分支聚合物衍生作用。結合程度可由SDS-PAGE及質譜密切監測以確保PEG分子與抗體之適當結合。不反應之PEG可藉由尺 寸排阻或藉由離子交換層析與抗體-PEG結合物分離。PEG衍生抗體可針對結合活性以及活體內功效使用熟習此項技術者熟知之方法(例如藉由本文所述之免疫分析)來測試。用於聚乙二醇化蛋白質之方法為此項技術中已知，且可應用於本發明之抗體。參見例如，Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。
其他經修改之聚乙二醇化技術包括重組化學正交引導工程化技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之重組系統將化學上特定側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術能夠實現將超過30個新胺基酸併入大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞中之生物合成蛋白質中。tRNA在置放琥珀密碼子之任何位置將非原生胺基酸併入，將琥珀由終止密碼子轉化為發出併入化學上特定胺基酸之信號的密碼子。
重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於血清半衰期延長。此技術涉及將300至600個胺基酸非結構化蛋白質尾域以遺傳方式融合至現有醫藥蛋白質。由於此類非結構化蛋白質鏈之表觀分子量大於其實際分子量約15倍，故蛋白質之血清半衰期極大地增加。相比於需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化，此製造製程極大地簡化且產物為均質的。
另一技術為聚唾液酸化(polysialytion)，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)以延長有效壽命且改進治療性肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸之聚合物(一種糖)。當用於蛋白質及治療性肽藥物傳遞時，聚唾液酸在結合時提供保護性微環境。此提高治療性蛋白質在循環中之有效壽命，且防止其被免疫系統識別。PSA聚合物天然地發現於人體中。進化超過數百萬年之某些細菌採用其覆蓋壁。此等天然聚唾液酸化細菌隨後能夠憑藉分子擬態以阻止人體之防衛系統。PSA(天然之終極隱匿技術)可易於自此類細菌大量且以預定物理特徵產生。由於細菌PSA與人體中之PSA化學上一致，故即使當偶合於蛋白質時， 其完全不具免疫原性。
另一技術包括使用連接至抗體之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES為衍生自糯性玉米澱粉之經修飾之天然聚合物，且可由人體之酶代謝。通常投與HES溶液以替代血容量不足及改進血液之流變特性。抗體之羥乙基澱粉化藉由提高分子之穩定性以及藉由降低腎臟清除率來實現循環半衰期之延長，使得生物活性提高。根據改變不同參數，諸如HES之分子量，可定製各種各樣的HES抗體結合物。
亦可產生具有增加之活體內半衰期之抗體，將一或多個胺基酸修飾(亦即，取代、***或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳Fc或鉸鏈Fc域片段)中。參見例如，國際公開案第WO 98/23289號、國際公開案第WO 97/34631號及美國專利第6,277,375號。
此外，抗體可與白蛋白(例如人類血清白蛋白；HSA)結合以製造活體內更穩定之抗體或抗體片段或具有更長活體內半衰期。該等技術為此項技術中所熟知，參見例如，國際公開案第WO 93/15199號、第WO 93/15200號及第WO 01/77137號，及歐洲專利第EP0 413622號。此外，在如上所述之雙特異性抗體之情況下，抗體之特異性可經設計以使得抗體之一個結合域結合至Epo，而抗體之第二結合域結合至血清白蛋白(較佳HSA)。
增加半衰期之策略尤其適用於奈米抗體、基於纖維結合蛋白之結合劑及需要增加活體內半衰期之其他抗體或蛋白質。
抗體結合物
本發明提供特異性結合至Epo蛋白質之抗體或其片段，其與異源蛋白質或多肽(或其片段，較佳至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)重組融合或以化學方式結合(包括共價及非共價結合)以產生融合蛋白。特定言之，本發明提供融合蛋白，其包含 本文所述之抗體之抗原結合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽。使蛋白質、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或結合之方法為此項技術中已知。參見例如，美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號及第5,112,946號；歐洲專利第EP 0307434號及第EP 0367166號；國際公開案第WO 96/04388號及第WO 91/06570號；Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，1995,J.Immunol.154：5590-5600；及Vil等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
其他融合蛋白可經由基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術產生。可採用DNA改組以改變本發明之抗體或其片段(例如具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)之活性。通常參見美國專利第5,605,793號、第5,811,238號、第5,830,721號、第5,834,252號及第5,837,458號；Patten等人，1997,Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999,J.Mol.Biol.287：265-76；及Lorenzo及Blasco,1998,Biotechniques 24(2)：308-313(此等專利及公開案中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。抗體或其片段，或經編碼之抗體或其片段可藉由在重組之前經受利用易錯PCR之隨機突變誘發、隨機核苷酸***或其他方法來改變。編碼特異性結合至Epo蛋白質之抗體或其片段之聚核苷酸可與一或多個異源分子之一或多個組分、基元、段、部分、域、片段等重組。
另外，抗體或其片段可與諸如肽之標記序列融合以促進純化。在較佳實施例中，標記胺基酸序列為六組胺酸肽，諸如pQE載體(QIAGEN,Inc.,9259 Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)中所提供 之標籤以及其他，其中許多為可購得的。如Gentz等人，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，例如六組胺酸提供融合蛋白質之適宜純化。適用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於來源於流行性感冒紅血球凝集素蛋白質之抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)，及「flag」標籤。
在其他實施例中，本發明之抗體或其片段與診斷或可偵測劑結合。該等抗體可適用於監測或預後疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重度作為臨床測試程序之一部分，諸如測定特定療法之功效。此類診斷及偵測可藉由使抗體與可偵測物質連接來實現，該等可偵測物質包含(但不限於)各種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光材料，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及發光蛋白質(aequorin)；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用多種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬，及非放射性順磁金屬離子。
本發明進一步涵蓋與治療部分結合之抗體或其片段之用途。抗體或其片段可與治療部分結合，該治療部分諸如為細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α發射 體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞不利之任何試劑。
此外，抗體或其片段可與改變給定生物反應之治療部分或藥物部分結合。治療部分或藥物部分不應解釋為限於經典化學治療劑。舉例而言，藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質、肽或多肽。該等蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子；細胞凋亡劑；抗血管生成劑；或生物學反應改變劑，諸如例如淋巴激素。
另外，抗體可與治療部分結合，該等治療部分諸如為放射性金屬離子(諸如α發射體，諸如213Bi)或適用於使放射金屬離子(包括(但不限於)131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)與多肽結合的巨環螯合劑。在某些實施例中，巨環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子連接至抗體。該等連接子分子通常為此項技術中已知，且描述於Denardo等人，1998,Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，1999,Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，1999,Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50中，各文獻皆以全文引用的方式併入本文中。
使治療部分與抗體結合之技術已熟知，參見例如Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」,Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」,Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)及Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.62：119-58。
抗體亦可連接至固體支撐物，其尤其適用於標靶抗原之免疫分析或純化。該等固體支撐物包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸(nylon)、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
製造本發明之抗體之方法 編碼抗體之核酸
本發明提供實質上經純化之核酸分子，其編碼包含上文所述之Epo結合抗體鏈之區段或域之多肽。本發明之一些核酸包含編碼展示於SEQ ID NO：13、33、53或73中之重鏈可變區之核苷酸序列及/或編碼展示於SEQ ID NO：14、34、54或74中之輕鏈可變區之核苷酸序列。在一特定實施例中，核酸分子為表1中鑑別之核酸分子。本發明之一些其他核酸分子包含與表1中所鑑別之核酸分子之核苷酸序列實質上一致(例如至少65%、80%、95%或99%)之核苷酸序列。當自適當表現載體表現時，多肽由能夠展現Epo抗原結合能力之聚核苷酸編碼。
本發明中亦提供聚核苷酸，其編碼來自以上闡述之Epo結合抗體之重鏈或輕鏈之至少一個CDR區且通常所有三個CDR區。一些其他聚核苷酸編碼以上闡述之Epo結合抗體之重鏈及/或輕鏈之所有或實質上所有可變區序列。由於密碼之簡併，故多種核酸序列將編碼免疫球蛋白胺基酸序列中之每一者。
本發明之核酸分子可編碼抗體之可變區及恆定區兩者。本發明之一些核酸序列包含編碼與闡述在SEQ ID NO：15、35、55或75中之 成熟重鏈序列實質上一致(例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)之成熟重鏈序列的核苷酸。一些其他核酸序列包含編碼與闡述在SEQ ID NO：16、36、56或76中之成熟輕鏈序列實質上一致(例如，至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)之成熟輕鏈序列的核苷酸。
聚核苷酸序列可藉由固相DNA重頭合成或藉由編碼Epo結合抗體或其結合片段之現有序列(例如以下實例中所述之序列)之PCR突變誘發來製造。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法實現，該等方法諸如為Narang等人，1979,Meth.Enzymol.68：90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之二乙基胺基磷酸酯法；及美國專利第4,458,066號之固體支撐物法。藉由PCR向聚核苷酸序列引入突變可如例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991中所述進行。
本發明中亦提供用於製造上文所述之Epo結合抗體之表現載體及宿主細胞。多種表現載體可用於表現編碼Epo結合抗體鏈或結合片段之聚核苷酸。基於病毒及非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中製造抗體。非病毒載體及系統包括質體、游離型載體(通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現卡匣)及人類人造染色體(參見例如，Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，適用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現Epo結合聚核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B及C (Invitrogen，San Diego，CA)、MPSV載體及用於表現其他蛋白質之此項技術中已知之許多其他載體。適用之病毒載體包括基於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP EB病毒(Epstein Barr virus)之載體；痘瘡病毒載體及勝利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)。參見，Brent等人，前述；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇視欲表現載體之所需宿主細胞而定。表現載體通常含有與編碼Epo結合抗體鏈或片段之聚核苷酸可操作地連接之啟動子及其他調節序列(例如強化子)。在一些實施例中，誘導性啟動子用於在除誘導條件外的條件下防止***序列之表現。誘導性啟動子包括例如，***糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。經轉型之生物體之培養物可在非誘導條件下擴增，而不偏重表現產物被宿主細胞較好耐受之編碼序列之群。除啟動子之外，其他調節要素亦可為Epo結合抗體鏈或片段之有效表現所要或所需的。此等要素通常包括ATG起始密碼子及鄰接核糖體結合位點或其他序列。此外，表現效率可藉由包涵對所使用細胞系統適當之強化子來增強(參見例如，Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，SV40強化子或CMV強化子可用於增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由所***之Epo結合抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白質。更常常，所***之Epo結合抗體序列在包涵於載體中之前與信號序列連接。待用於接收編碼Epo結合抗體輕鏈及重鏈可變域之序列之載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體使可變區表現為具有恆定區之融合蛋白質，進而引起產生完整抗體或其片段。該等恆定區通常為人類恆定區。
具有及表現Epo結合抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌為一種適用於選殖及表現本發明之聚核苷酸之原核宿主。適用之其他微生物宿主包括桿菌(諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis))，及其他腸內菌科(諸如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))，及多種假單胞菌種(Pseudomonas species)。在此等原核宿主中，吾人亦可製造表現載體，其通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。此外，將存在許多各種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。該等啟動子通常視情況與操縱序列一起控制表現，且具有用於啟始且完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。諸如酵母之其他微生物亦可用於表現本發明之Epo結合多肽。亦可使用與桿狀病毒載體組合之昆蟲細胞。
在一些較佳實施例中，哺乳動物宿主細胞用於表現及製造本發明之Epo結合多肽。舉例而言，其可為表現內源免疫球蛋白基因之融合瘤細胞株(例如實例中所述之1D6.C9骨髓瘤融合瘤純系)或具有外源表現載體之哺乳動物細胞株(例如以下例示之SP2/0骨髓瘤細胞)。此等細胞包括任何正常致死或正常或異常永生之動物或人類細胞。舉例而言，已開發出大量能夠分泌完整免疫球蛋白之適合宿主細胞株，其包括CHO細胞株、多種Cos細胞株、海拉(HeLa)細胞、骨髓瘤細胞株、經轉型之B細胞及融合瘤。哺乳動物組織細胞培養表現多肽之用途通常論述於例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及強化子(參見例如，Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)，及所需處理資訊位點(諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點)，及轉錄終止子序列。此等表現載體通常含有來源於哺乳動物基因或來源於哺乳動物病毒之啟 動子。適合啟動子可為組成性啟動子、細胞型特異性啟動子、階段特異性啟動子及/或可調節或可調控啟動子。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、***(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素誘導性CMV啟動子(諸如人類立即早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-強化子組合。
引入含有所關注之聚核苷酸序列之表現載體之方法視細胞宿主之類型而變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主。(通常參見Sambrook等人，前述)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉型、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒(virosome)、免疫脂質體、多價陽離子：核酸結合物、裸DNA、人工病毒粒子、融合疱疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、試劑增強之DNA吸收及離體轉導。就長期高產率製造重組蛋白質而言，將常常需要穩定的表現。舉例而言，穩定表現Epo結合抗體鏈或結合片段之細胞株可使用本發明之表現載體製備，該等表現載體含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記基因。在引入載體之後，可使細胞於增殖培養基中生長1-2天，隨後將其轉入選擇性培養基中。可選擇標記之目的為向選擇賦予抗性，且其存在使得在選擇性培養基中成功表現經引入之序列的細胞生長。抗性、穩定轉染之細胞可使用適合於該細胞類型之組織培養技術增殖。
本發明之單株抗體之產生
單株抗體(mAb)可藉由多種技術產生，該等技術包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975 Nature 256：495之標準體細胞雜交技術。製造單株抗體之許多技術可採用例如B淋巴細胞之病毒或致 癌轉型。
製備融合瘤之動物系統包括鼠類、大鼠及兔系統。在小鼠中產生融合瘤為經良好確立之程序。分離經免疫之脾細胞用於融合之免疫方案及技術為此項技術中已知。亦已知融合搭配物(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。
本發明之嵌合或人類化抗體可基於如上所述製備之鼠類單株抗體之序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可使用標準分子生物學技術由所關注之鼠類融合瘤獲得且可經工程化以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用此項技術中已知的方法使鼠類可變區與人類恆定區連接(參見例如Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用此項技術中已知之方法使鼠類CDR區***人類構架中。參見例如Winter之美國專利第5225539號及Queen等人之美國專利第5530101號、第5585089號、第5693762號及第6180370號。
在某一實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。該等針對Epo之人類單株抗體可使用帶有部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠，且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」之小鼠。
HuMAb小鼠®(Medarex，Inc.)含有編碼未重排之人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列的人類免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)以及使內源性μ及κ鏈基因座失活的靶向突變(參見例如，Lonberg等人，1994 Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現出小鼠IgM或κ表現減少，且對免疫接種作出響應，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因進行類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgGκ單株(Lonberg,N.等人，1994前述；評論於Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13：65-93；及Harding,F.及Lonberg,N.,1995 Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中)。HuMAb小鼠之製備及用途，及此類小鼠攜帶之基因組修飾進一步描述在以下中：Taylor,L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人，1993 International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人，1993 EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，1994 J.Immunol.152：2912-2920；Taylor,L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild,D.等人，1996 Nature Biotechnology 14：845-851，所有該等文獻之內容皆特定地以全文引用的方式併入本文中。此外參見，均頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號；Surani等人之美國專利第5,545,807號；均頒予Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92103918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97113852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號；及Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠，諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠來培育。此類小鼠(在本文中稱為「KM小鼠」)詳細描述於Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
再進一步地，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統在此項技術中可獲得，且可用於產生本發明之Epo結合抗體。舉例而言，可使用稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代轉殖基因系統。此類小鼠描述於Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第 6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號中。
另外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉染色體動物系統可在此項技術中獲得，且可用於產生本發明之Epo結合抗體。舉例而言，可使用稱作「TC小鼠」之攜帶人類重鏈轉染色體與人類輕鏈轉染色體之小鼠；此類小鼠描述於Tomizuka等人，2000 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之母牛在此項技術中已進行描述(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20：889-894)，且可用於產生本發明之Epo結合抗體。
本發明之人類單株抗體亦可使用篩檢人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體呈現方法來製備。該等用於分離人類抗體之噬菌體呈現方法在此項技術中已確立或描述於以下實例中。參見例如：Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已重組於其中以使得可在免疫後產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。該等小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
構架或Fc工程化
本發明之工程化抗體包括已對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾(例如，以改進抗體特性)者。通常進行此類構架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「逆突變(backmutate)」成相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有與由其衍生該抗體之生殖系序列不同的構架殘基。該等殘基可藉由將該等抗體構架序列與由其衍生該抗體之生殖系序列相比 較來鑑別。為了將構架區序列傳回至其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發向生殖系序列「逆突變」。該等經「逆突變」之抗體亦意欲由本發明涵蓋。
另一類構架修飾涉及使該構架區內，或甚至在一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，以進而降低該抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除構架區或CDR區內所作之修飾以外，或取而代之，本發明之抗體可經工程化以包括Fc區內之修飾通常以改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分連接至抗體上)，或經修飾以改變其糖基化，再改變該抗體之一個多種功能特性。以下進一步詳細描述此等實施例中之每一者。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾，以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數得以改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或增強或降低該抗體之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以減少該抗體之生物半衰期。更特定言之，將一或多種胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區以使得該抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合相對於原生Fc鉸鏈域SpA結合削弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。多種方法可行。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：如Ward之美國專 利第6,277,375號中所述之T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述，為了增加生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有自IgG之Fc區之CH2域之兩個環獲取的補救受體結合抗原決定基。
在其他實施例中，Fc區藉由用不同胺基酸殘基替換至少一個胺基酸殘基來改變，以改變抗體之效應功能。舉例而言，一或多個胺基酸可用不同胺基酸殘基替換以使得該抗體所具有的對效應配位體之親和力改變但保留親本抗體之抗原結合能力。對親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，可以不同胺基酸殘基置換選自胺基酸殘基之一或多種胺基酸以使得抗體具有改變之C1q結合及/或減弱或消除之補體依賴細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細描述於Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經改變以進而改變該抗體結合補體之能力。此方法進一步描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。
在又一實施例中，使Fc區經修飾以增加抗體介導抗體依賴細胞毒性(ADCC)之能力及/或藉由修飾一或多種胺基酸來提高抗體對Fcγ受體之親和力。此方法進一步描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點，且已描述具有經改進之結合之變異體(參見Shields,R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在再一實施例中，抗體之糖基化經修改。舉例而言，可製得無糖基化抗體(亦即，缺乏糖基化之抗體)。糖基化可經改變以例如提高抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體 序列內之一或多個糖基化位點來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，其消除一或多個可變區構架糖基化位點，以進而消除位於該位點之糖基化。該無糖基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法進一步詳細描述於Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外地或可替代地，可製得糖基化類型改變之抗體，諸如岩藻糖基殘基量減少之低岩藻糖基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。已證明該等改變之糖基化模式會增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由例如在糖基化機構改變之宿主細胞中表現抗體來實現。糖基化機構改變之細胞已在此項技術中描述，且可用作表現本發明之重組抗體進而產生糖基化改變之抗體的宿主細胞。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195描述具有經功能性破壞之FUT8基因之細胞株，其編碼岩藻糖基轉移酶，以使得在該細胞株中表現之抗體展示低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述變異CHO細胞株、Lecl3細胞，其使岩藻糖附著於Asn(297)-鍵聯碳水化合物之能力降低，亦使得在宿主細胞中得以表現之抗體低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程化以表現醣蛋白修飾之糖基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))，以使得在工程化細胞株內表現之抗體展示二分GlcNac結構增加，其使得該等抗體之ADCC活性增加的細胞株(亦參見Umana等人，1999 Nat.Biotech.17：176-180)。
工程化經改變之抗體之方法
如上文所論述，本文中展示之具有VH及VL序列或全長重鏈或輕鏈之Epo結合抗體可用於藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或附接到其上之恆定區來產生新Epo結合抗體。由此，在本發 明之另一態樣中，本發明之Epo結合抗體之結構特徵用於產生結構上相關之Epo結合抗體，其保留本發明之抗體之至少一種功能特性，諸如結合至人類Epo以及抑制Epo之一或多種功能特性(例如，抑制Epo結合至Epo受體、抑制Epo依賴性細胞增殖)。
舉例而言，本發明之抗體之一或多個CDR區或其突變可與已知構架區及/或其他CDR重組組合以產生如上文所述之本發明之其他經重組工程化之Epo結合抗體。其他類型修飾包括先前部分中所述之修飾。工程化方法之起始物質為本文中所提供之VH及/或VL序列中之一或多者，或其一或多個CDR區。為產生工程化抗體，並非必需實際上製備(亦即表現為蛋白質)具有本文中所提供之VH及/或VL序列中之一或多者，或其一或多個CDR區的抗體。相反地，序列中所含有之資訊用作起始物質以產生由原始序列衍生之「第二代」序列，且隨後「第二代」序列得以製備且表現為蛋白質。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備經修飾之Epo結合抗體之方法，其包含以下步驟：a)製造Epo結合抗體，其包含具有選自由SEQ ID NO：1、21、41及61組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：2、22、42及62組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：3、23、43及63組成之群的CDR3序列之重鏈可變區抗體序列；及具有選自由SEQ ID NO：4、24、44及64組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：5、25、45及65組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：6、26、46及66組成之群的CDR3序列之輕鏈可變區抗體序列；b)改變重鏈可變區抗體序列及/或輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個經改變之抗體序列；及c)將經改變之抗體序列表現為蛋白質。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備Epo結合抗體之方法，該Epo結合抗體由以下組成：重鏈可變區抗體序列，其具有選自 由SEQ ID NO：7、27、47及67組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：8、28、48及68組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：9、29、49及69組成之群的CDR3序列；及輕鏈可變區抗體序列，其具有選自由SEQ ID NO：10、30、50及70組成之群的CDR1序列、選自由SEQ ID NO：11、31、51及71組成之群的CDR2序列及/或選自由SEQ ID NO：12、32、52及72組成之群的CDR3序列；改變重鏈可變區抗體序列及/或輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個經改變之抗體序列；及將經改變之抗體序列表現為蛋白質。
因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備最適合在哺乳動物細胞中表現之Epo結合抗體之方法，該Epo結合抗體由以下組成：全長重鏈抗體序列，其具有選自SEQ ID NO：15、35、55及75之群的序列；及全長輕鏈抗體序列，其具有選自SEQ ID NO：16、36、56及76之群的序列；改變全長重鏈抗體序列及/或全長輕鏈抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個經改變之抗體序列；及將經改變之抗體序列表現為蛋白質。在一個實施例中，重鏈或輕鏈之改變在重鏈或輕鏈之構架區中。
經改變之抗體序列亦可藉由篩選抗體庫製備，該抗體庫具有固定之CDR3序列或如US20050255552中所述之最小必需結合決定子及CDR1及CDR2序列上之變異。篩選可根據適合自抗體庫篩選抗體之任何篩選技術(諸如噬菌體呈現技術)進行。
標準分子生物學技術可用於製備及表現經改變之抗體序列。由經改變之抗體序列編碼之抗體為保留本文所述之Epo結合抗體之一種、一些或所有功能特性之抗體，該等功能特性包括(但不限於)特異性結合至人類、獼猴、大鼠及/或小鼠Epo；及抗體在F36E及/或Ba/F3-EpoR細胞增殖分析中抑制Epo依賴性細胞增殖。
在本發明之工程化抗體之方法的某些實施例中，突變可沿著Epo 結合抗體編碼序列之所有或一部分隨機或選擇性引入，且所得經修飾之Epo結合抗體可針對如本文所述之結合活性及/或其他功能特性來篩檢。突變方法已描述於此項技術中。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和突變誘發、合成接合組裝或其組合產生及篩檢抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用計算篩檢方法以使抗體之生理化學特性最佳化的方法。
在本發明之某些實施例中，抗體已經工程化以移除脫醯胺位點。已知脫醯胺在肽或蛋白質中引起結構及功能變化。脫醯胺可引起生物活性降低，以及藥代動力學之改變及蛋白質藥物之抗原性。(Anal Chem.2005年3月1日；77(5)：1432-9)。
在本發明之某些實施例中，抗體已經工程化以提高pI且改進其藥物樣特性。蛋白質之pI為分子之總體生物物理學特性之關鍵決定因素。已知具有較低pI之抗體具較低可溶性、較低穩定性且易於凝集。此外，具有較低pI之抗體之純化具挑戰性，且在針對臨床用途之規模放大期間可能尤其難以解決。提高本發明之抗Epo抗體或Fab之pI會提高其溶解度，使得抗體能夠在較高濃度(>100mg/ml)下調配。在較高濃度(例如>100mg/ml)下之抗體之調配物提供能夠經由玻璃體內注射向患者之眼睛中投與較高劑量抗體之優勢，此又可實現給藥頻率降低，此為治療包括視網膜血管疾病之慢性病之顯著優勢。較高pI亦可提高抗體之IgG型之FcRn介導之再循環，由此能夠實現藥物在體內續存更長時間，需要更少注射。最後，抗體之總穩定性顯著改進，歸因於活體內較高pI引起較長儲存期限及生物活性。pI較佳大於或等於8.2。
經改變之抗體之功能特性可使用在此項技術中可使用及/或本文所述之標準分析(諸如闡述於實例中之標準分析(例如ELISA))進行評 估。
防治及治療用途
如本文所述之結合Epo之抗體可以治療適用之濃度用於治療與增加之Epo含量及/或活性相關之疾病或病症，此藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體或抗原結合片段來進行。本發明提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療與視網膜血管疾病相關之病狀或病症的方法。本發明提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療與糖尿病性視網膜病變(DR)相關之病狀或病症的方法。本發明提供一種向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療與黃斑水腫相關之病狀或病症的方法。本發明亦提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療糖尿病黃斑水腫(DME)的方法。本發明進一步提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之本發明抗體來治療增殖性糖尿病性視網膜病變(PDR)的方法。又進一步地，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量本發明之抗體來治療年齡相關之黃斑水腫(AMD)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、血管性水腫、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管及/或早產兒視網膜病變的方法。本發明亦提供治療β地中海型貧血及/或癌症之方法。
本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於治療與增加之Epo含量及/或活性相關之疾病或病症。本發明進一步關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於治療與視網膜血管疾病相關之病狀或病症。本發明進一步關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於治療與糖尿病性視網膜病變(DR)相關之病狀或病症。本發明進一步關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於治療與黃斑水腫、糖尿病黃斑水腫(DME)及/或增殖性糖尿病性視網膜病變(PDR)相關之病狀或病症。本 發明又進一步關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於年齡相關之黃斑水腫(AMD)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、血管性水腫、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管及/或早產兒視網膜病變。本發明進一步關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於治療β地中海型貧血及/或癌症。更特定言之，用於治療與增加之Epo含量及/或活性相關之疾病或病症的如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段除為表1中所述者以外還可為本文所述之抗體或抗原結合片段中的任一者。又進一步地，用於治療與視網膜血管疾病相關之病狀或病症的如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段除為表1中所述者以外還可為本文所述之抗體或抗原結合片段中的任一者。本發明之抗體可尤其用於預防與視網膜血管疾病(例如，DR、DME、NPDR、PDR、年齡相關之黃斑變性(AMD)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、血管性水腫、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管及/或早產兒視網膜病變)相關之病狀或病症之進展，用於治療或預防與視網膜血管疾病相關之黃斑水腫，用於降低Lucentis®(RTM)注射之頻率，且用於改進歸因於視網膜血管疾病進展之視力損失。就治療患有視網膜血管疾病之患者而言，本發明之抗體亦可與抗VEGF療法組合使用。
在一個態樣中，本發明係關於一種抑制Epo依賴性細胞增殖之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之組合物接觸(例如接觸個體中之Epo)之步驟，該組合物包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段；特定言之，該組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。在一個態樣中，該方法包含使細胞(例如包含Epo之細胞)與包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸。本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制個體之Epo依賴性細胞增殖。預期，細胞為人類細胞。細胞可 為B細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。
細胞增殖可藉由例如裂隙燈生物顯微鏡、光學相干斷層攝影術、彩色眼底攝影及螢光血管攝影術來量測(Heng等人Diabet.Med.2013年6月；30(6)：640-50)。此外，本文所述之抗體或抗原結合片段抑制Epo依賴性細胞增殖之能力可使用下文所述之諸如F36E之分析或Ba/F3-EpoR細胞增殖分析量測。
本發明亦關於一種抑制Epo依賴性細胞信號傳導之方法，其中該方法包括使Epo與包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之有效量之組合物接觸的步驟，以防止Epo與細胞表面上之受體相互作用。在一個態樣中，該方法包含使包含Epo之細胞與包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸。本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制個體中之Epo依賴性細胞信號傳導。預期，細胞為人類細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。
Epo與EpoR之結合經由JAK2激酶誘導信號傳導，其引起下游信號傳導途徑之活化，該等途徑包括磷脂醯基-肌醇3-激酶(PI-3K)/Akt、MAP激酶、STAT5及蛋白激酶C(Jelkmann,2007；Jelkmann,2004)。據報導，Epo或Epo受體(EpoR)由諸如內皮細胞、平滑肌細胞及CNS細胞之不同細胞類型內源性地產生(Ogunshola及Bogdanova,2013)。EpoR在結合Epo後之活化可觸發下游信號傳導途徑，引起不同活性，諸如鈣輸送(Korbel等人，2004)、細胞存活(Velly等人，2010)、神經保護(Grimm等人，2002)及血管生成(Ribatti,2010；Ribatti等人，2003)。因此，Epo依賴性細胞信號傳導之抑制可藉由量測此等信號傳導途徑中之一或多者之活性來測定。舉例而言，Epo依賴性細 胞信號傳導之抑制可藉由量測JAK2激酶、PI-3K/Akt、MAP激酶、STAT5或蛋白激酶C來測定。量測此等信號傳導途徑之方法為此項技術中已知，且量測此類途徑活性之套組為可購得的。此外，Epo依賴性細胞信號傳導之抑制可如上所述藉由量測細胞增殖來測定。細胞增殖可在個體中(例如血管生成)，或可使用下文所述之諸如F36E之分析或Ba/F3-EpoR細胞增殖分析量測。在一個態樣中，相對於對照，Epo依賴性細胞信號傳導在本文所述之抗體存在下在統計學上顯著(p<0.05)減少。
本發明亦關於一種抑制Epo依賴性細胞增殖或信號傳導之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸的步驟，以防止Epo與細胞表面上之受體相互作用。預期，細胞為B細胞。預期，細胞為人類細胞。
本發明亦關於一種抑制Epo結合至Epo受體之方法，其中該方法包括使Epo與有效量之包含本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸(例如接觸個體中之Epo)的步驟；特定言之，該組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。本發明亦關於一種包含如本文所述之經分離抗體或其抗原結合片段之組合物，其用於抑制Epo結合至個體之細胞上之Epo受體；特定言之，該組合物可包含抗體NVS1、NVS2、NVS3或NVS4。預期，細胞為人類細胞。進一步預期，細胞在個體中。亦預期，細胞在個體之眼睛中。又進一步預期，個體為人類。Epo與Epo受體結合之抑制可如Khankin等人PLoS ONE,2010 5：e9246所述量測。
視網膜血管疾病及與視網膜血管疾病相關之黃斑水腫之治療及/或預防可藉由眼科醫師或健康護理專業人員使用視覺功能及/或視網膜解剖學之臨床上相關量測法來測定。與視網膜血管疾病相關之病狀或病症之治療意謂引起或預期引起視覺功能及/或視網膜解剖學改進 或維持之任何行為(例如，投與本文所述之抗Epo抗體)。此外，預防在關於與視網膜血管疾病相關之病狀或病症時意謂預防或減緩處於如本文所定義視覺功能、視網膜解剖學及/或視網膜血管疾病參數惡化風險中之患者之該惡化的任何行為(例如投與本文所述之抗Epo抗體)。
舉例而言，視覺功能可包括：視力、在低照明情況下之視力、視野、中央視野、周邊視覺、對比敏感性、暗適應、光應力恢復、顏色辨別、讀速、對輔助裝置(例如，大字體、放大裝置、望遠鏡)之依賴性、面部識別、操作機動車輛之熟練度、進行一或多種日常生活之活動的能力及/或患者報導之關於視覺功能之滿意度。
視覺功能之例示性量測包括斯內倫(Snellen)視力、ETDRS視力、低光照視力、阿姆斯勒方格表(Amsler grid)、歌德曼(Goldmann)視野、漢弗萊(Humphrey)視野、微視野、佩里-羅賓森(Pelli-Robson)圖表、SKILL卡、石原色板(Ishihara color plate)、法恩斯沃思(Farnsworth)D15或D100顏色測試、標準視網膜電圖描記、多灶性視網膜電圖描記、經驗證之讀速測試、面部識別、駕駛模擬及患者報導之滿意度。由此，當ETDRS量表上之視覺增加或未能減少2行或2行以上(或10個字母)時，可稱血管疾病及/或黃斑水腫之治療達成。此外，當個體展現在讀速(每分鐘字數)方面之至少10%提高或缺乏10%降低時，可稱血管疾病及/或黃斑水腫之治療發生。此外，當個體與石原測試時經恰當識別之板或法恩斯沃思測試時經恰當排序之盤成比例展現至少20%提高或缺乏20%降低時，可稱血管疾病及/或黃斑水腫之治療發生。此外，若個體在達到預先規定之暗適應程度之時間中具有例如至少10%降低或缺少10%或10%以上提高，則可稱視網膜血管疾病及/或黃斑水腫之治療發生。此外，如合格的健康護理專業人員(亦即眼科醫師)所測定之視角所表示，當個體在視覺盲點之總面積中展現 例如至少10%減小或少缺乏10%或10%以上提高，則可稱視網膜血管疾病及/或黃斑水腫之治療發生。
可治療或預防之視網膜解剖學之非所需態樣包括例如微動脈瘤、黃斑水腫、棉絮狀斑點、視網膜內微血管異常(IRMA)、毛細管壓降、白細胞黏附、視網膜缺血、視神經盤之新血管生成、後極之新血管生成、虹膜新血管生成、視網膜內出血、玻璃體出血、黃斑瘢痕、視網膜下纖維化，及視網膜纖維化、靜脈擴張、血管迂曲、血管滲漏。由此，例如黃斑水腫之治療可如光學相干斷層攝影術所量測利用中央視網膜子場之厚度之20%或20%以上減小來測定。
評估視網膜解剖學之例示性方式包括眼底檢查法、眼底攝影、螢光血管攝影術、靛氰綠血管攝影術、光學相干斷層攝影術(OCT)、頻域光學相干斷層攝影術、掃描雷射眼底鏡、共焦顯微鏡、調適光學、眼底自發螢光檢查、生檢、屍體解剖及免疫組織化學。由此，如由螢光血管攝影術所測定，當滲漏面積減小10%時，可稱個體之血管疾病及/或黃斑水腫得以治療。
待用本發明之治療劑治療之個體亦可用治療與糖尿病相關之病狀之已知方法投與其他治療劑，諸如胰島素及抗高血壓藥品之所有形式。
諸如年齡相關之黃斑變性(AMD)、視網膜靜脈阻塞(RVO)、血管性水腫、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管及/或早產兒視網膜病變之眼睛疾病之治療及/或預防可由眼科醫師或健康護理專業人員使用視覺功能及/或視網膜解剖學之臨床上相關量測法利用上文所述之量度中的任一者來測定。儘管本文所述之量測不適用於本文中之每一種眼睛疾病，但熟習此項技術者將認識到可用於治療給定眼睛疾病之視覺功能及/或視網膜解剖學之臨床上相關量測法。
當本發明之治療劑連同另一試劑一起投與時，兩者可依次按順 序或同時投與。在一些態樣中，本發明之抗體向亦用第二藥劑(例如Lucentis®)接受療法之個體投與。在其他態樣中，結合分子與手術治療結合投與。
適用於與Epo結合抗體組合治療之藥劑包括此項技術中已知能夠調節VEGF、VEGF受體之活性的藥劑、其他受體酪胺酸激酶抑制劑或調節HIF-1介導之途徑之其他實體。已報導抑制此等途徑之其他藥劑包括：蘭比珠單抗(ranibizumab)、白唯珠單抗(bevicizumab)、派加替尼(pegaptanib)、阿柏西普(aflibercept)、帕佐泮尼(pazopanib)、索拉菲尼(sorafinib)、舒尼替尼(sunitinib)及雷帕黴素(rapamycin)。與抗發炎藥劑(諸如皮質類固醇、NSAIDS及TNF-α抑制劑)之組合治療亦可在治療視網膜血管疾病及黃斑水腫(例如糖尿病性視網膜病變及DME)方面有益。
組合療法方案可為累加的，或其可產生協同結果(例如，視網膜病變嚴重度降低超過對兩種藥劑組合使用所預期的)。在一些實施例中，本發明提供一種組合療法，其以本發明之Epo結合抗體及抗血管生成(諸如抗VEGF)劑預防及/或治療視網膜血管疾病及黃斑水腫(特定言之，糖尿病性視網膜病變，包括如上所述之DME及/或PDR)。
醫藥組合物
本發明提供醫藥組合物，其包含與醫藥學上可接受之載劑一起調配之Epo結合抗體(完整或結合片段)。組合物可額外含有適用於治療或預防例如糖尿病性視網膜病變之一或多種其他治療劑。醫藥學上可接受之載體使組合物增強或穩定，或可用於促進組合物之製備。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。
本發明之醫藥組成物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。投與之途徑及/或模式視所需結果變化。較佳投與為玻璃體內、靜脈 內、肌肉內、腹膜內或皮下，或接近標靶部位投與。醫藥學上可接受之載劑應適用於玻璃體內、靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投與(例如藉由注射或輸液)。視投與途徑而定，活性化合物(亦即抗體、雙特異性及多特異性分子)可以材料塗佈以保護化合物不受酸作用及其他可使化合物失活之天然條件影響。
組合物應為無菌及液體組合物。可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液之情況下維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在多數情況下，組合物中較佳包括等張劑(例如糖)、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。可藉由使組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)而促進長期吸收可注射組合物。
本發明之醫藥組合物可根據熟知且在此項技術中常規地實踐之方法製備。參見例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson，編，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。本發明之醫藥組合物中通常採用治療上有效劑量或靈驗劑量之Epo結合抗體。Epo結合抗體藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥學上可接受劑型。調節劑量方案以提供最佳所需反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或可按治療情況之緊急需要所指示按比例減小或增加劑量。就投與之簡便性及劑量之均一性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所使用之單位劑型係指適合作為單一劑量用於待治療之個體的實體上分離之單位；每一單位含有經計算以產生所需治療效果之預定量的與所需醫藥載劑結合之活性化合物。
可改變本發明之醫藥組合物中之活性成分的實際劑量水準，以 便得到在對患者無毒性之情況下有效達成特定患者、組合物及投藥模式所需之治療反應的一定量活性成分。所選劑量水準視多種藥物動力學因素而定，該等藥物動力學因素包括本發明所採用之特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投藥途徑、投藥時間、所採用之特定化合物之***速率、治療持續時間、與所採用之特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、待治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康情況及之前病史及其類似因素。
醫師或獸醫可以比獲得所需治療作用所需水準更低之水準的以醫藥組合物形式採用之本發明抗體的劑量起始且逐漸增加劑量直至達成所需效果。一般而言，用於治療本文所述之視網膜血管疾病之本發明組合物之有效劑量視許多不同因素變化，該等因素包括投與方式、標靶部位、患者之生理狀態、患者為人類或動物、所投與之其他藥品，及該治療為防治性或治療性。需要滴定治療劑量以使安全及功效最佳化。就用抗體全身投與而言，劑量範圍為宿主體重之約0.0001至100mg/kg，且更通常0.01至15mg/kg。就用抗體玻璃體內投與而言，劑量之範圍可能為0.1毫克/眼至10毫克/眼。更特定言之，劑量之範圍可能為1毫克/眼至9毫克/眼、2毫克/眼至8毫克/眼、3毫克/眼至7毫克/眼、4毫克/眼至6毫克/眼或4.5毫克/眼至5.5毫克/眼。在某些情況下，劑量可為0.1毫克/眼、0.2毫克/眼、0.3毫克/眼、0.4毫克/眼、0.5毫克/眼、0.6毫克/眼、0.7毫克/眼、0.8毫克/眼、0.9毫克/眼、1毫克/眼、2毫克/眼、3毫克/眼、4毫克/眼、5毫克/眼、6毫克/眼、7毫克/眼、8毫克/眼、9毫克/眼或10毫克/眼。一例示性治療方案需要每兩週全身投與一次或一月一次或每3至6個月一次。一例示性治療方案需要每兩週全身投與一次或一月一次或每3至6個月一次，或按需要投與(PRN)。
抗體通常多次投與。單次劑量之間的間隔可為數週、數月或數年。如量測患者中Epo結合抗體之血液含量所指示，間隔亦可為不規 則的。另外，替代給藥間隔可由醫師測定，且每月或視需要投與以具有效性。功效係基於病變生長、Lucentis®解救速率、如光學相干斷層攝影術(OCT)所測定之視網膜厚度以及視力。在全身投與之一些方法中，調節劑量以達成血漿抗體濃度為1至1000μg/ml，且在一些方法中為25至500μg/ml。或者，抗體可以持續釋放調配物之形式投與，在該種情況下，需要較不頻繁之投藥。劑量及頻率視抗體在患者中之半衰期而變化。一般而言，人類化抗體展示其半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投藥之劑量及頻率可視治療為防治性或治療性而變化。在防治性應用中，在長時期內，以相對不頻繁之間隔投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短之間隔投與相對較高之劑量，直至疾病之進展降低或終止，且較佳直至患者展示疾病之症狀之部分或完全改善。在其之後，可向患者投與防治性方案。
實例
提供以下實例以進一步說明本發明，但該等實例不限制本發明之範疇。本發明之其他變體將對一般熟習此項技術者易於瞭解，且由所附申請專利範圍涵蓋。
實例1：產生親和力成熟的Epo抗體
使用完整人類噬菌體呈現庫來產生本文所述之Epo結合抗體。
經生物素標記及未經生物素標記之人類及獼猴Epo用於溶液及固相淘選中。進行標準淘選以及RapMAT方法(Prassler等人，(2009)Immunotherapy 1(4)：571-583)。在二級篩檢及RapMAT淘選後，選擇純系用於序列分析，且選擇一組8個抗體用於轉化成FabCys形式、種系化、pI最佳化及脫醯胺位點移除。FabCys產生用專屬RapCLONE®方法實現。RapCLONE®以兩步方法進行，用於將大量Fab純系便利且有效地轉化成IgG及FabCys形式。在第一選殖步驟中，經由BsiWI/MfeI(對 於κ池)或HpaI/MfeI(對於λ池)消化及後續接合，將真核表現卡匣引入表現載體pMORPH®×11(對於HuCAL PLATINUM®)中。接著進行第二選殖步驟，其中含有表現卡匣之Fab池使用EcoRV/BlpI(κ及λ池)消化，且隨後選殖至pMorph®4_IgG1f或pMorph®4_h_FabCys受體載體中以用於在哺乳動物細胞中表現。關於此計劃，將RapCLONE®僅施加在獨特的經定序且經表徵之Fab上。因此，在RapCLONE®之後回收所有純系。
低pI(<8.2)通常與不良生物物理特性(包括穩定性及凝集)相關。選擇8個最終候選物(HCDR3獨特純系)用於種系化、pI最佳化及脫醯胺位點移除，產生總共12個種系化變異體。合成12個VL基因(兩個用於11317、11324、11331及11345)及一個VH(11324)。可能由於具有PTM之候選物之早期取消選擇，故僅11317(VL)、11332(VL)及11380(VH)含有脫醯胺位點，該等位點在種系化情況下移除。通常對最接近之種系進行種系化。為了提高pI，針對候選物中之6者，選擇λ種系3h代替或外加最接近之種系3r。另外，針對三個候選物構築λ 3j變異體以使風險降至最低(11317、11331及11345)。
NA，不適用
*所有PTM修飾均發生在VL中，**pI修飾發生在VH中
如上所述，蛋白質之pI為分子之總體生物物理特性之關鍵決定因素。自噬菌體呈現庫鑑別之抗Epo Fab之pI低於8.2。為了改良製造特性，將抗體特異性工程化以提高其pI且提高其藥物樣特性。提高抗Epo Fab之pI使其溶解度提高，使得Fab能夠在較高濃度(>100mg/ml)下調配。Fab在較高濃度(例如>100mg/ml)下之調配物提供能夠經由 玻璃體內注射向患者之眼睛中投與較高劑量Fab之優勢，其又可實現給藥頻率降低，此為治療包括(但不限於)濕性AMD及糖尿病性視網膜病變之慢性眼睛疾病之顯著優勢。
所得Fab展示於表1中(NVS1、NVS2、NVS3及NVS4)。
實例2：經最佳化之抗體之特徵
以下實例描述可用於量測抗體親和力之方法。此等及其他量測結合親和力之方法為此項技術中已知。
親和力測定
Epo之抗體親和力藉由使用Biacore® T200(Biacore)之表面電漿子共振(SPR)及溶液平衡滴定(SET)量測。下文描述Epo結合之各技術及相應平均結果之解釋。模型化假定考慮系統中Epo之濃度、Epo生物合成之動力學及半衰期以及所需給藥時程，且表明對Epo親和力小於50pM之Fab足以降低游離Epo之含量。
Biacore測定
相互作用之動力學，亦即複合物形成速率(ka)及分解速率(kd)可自感測器圖譜中之資訊測定。若當樣品在所製備之感測器表面上通過時發生結合，則感測器圖譜中之響應增加。若達到平衡，則將見到恆定信號。用緩衝液替換樣品引起結合分子解離，且響應減少。Biacore評估軟體藉由將資料擬合至相互作用模型而產生ka及kd值。
將三個流槽用於方法運作。流槽1(fc1)充當參考(其中未捕獲Epo Fab)以評估Epo與塗佈抗體之晶片表面之非特異性結合。捕獲及結合步驟均在流槽2至4上進行。
捕獲步驟：為了達成20之Rmax，fc2至4上之抗人類Fab之捕獲含量為約50 RL。在1μg/ul之濃度下之抗人類Fab以10μl/min之流動速率在Fc 2至4上流動。
相對Rmax之計算如下： Fab：Rmax=RL*(MW分析物/MW配位體)*化學計量20=RL*(21.4/50)*1=50 RL
分析物以20nM之濃度起始，且包括在2.5nM下有複本之8份1：2稀釋液以用於長及短解離。分析物以60μl/min之流動速率運作240秒。將解離時間設定為4000秒及600秒。針對NVS2及NVS4之10nM、2.5nM及0.3125nM之分析物濃度，將解離時間設定為4000秒。在樣品注射之後，用再生緩衝液進行洗滌步驟。
再生係在所有流槽上在各週期結束時進行。此方法之再生條件為1%磷酸與10%氫氧化鈉在60μl/min下持續100秒。
所有其他運作條件在25℃下於1×HBS-EP+緩衝液(Biacore目錄號BR-1006-69)中進行。所得信號藉由雙參考調節，由此減去來自參考流槽及無分析物之結合步驟之折射指數值。資料在10Hz下收集，且使用Biacore® T100評估軟體1.1版(GE Healthcare)分析。此程式使用整體擬合分析方法以用於測定各相互作用之速率及親和力常數。
Biacore結合動力學測定之結果展示於表2中。如所示，本文所述之抗體展示與人類Epo結合之高親和力，其KD值通常小於或等於40pM。
ND：未測定
*針對NVS1展示之資料為單一資料點
SET測定
相比於使用感測器表面之動力學分析(諸如SPR)，SET為一種測定溶液中親和力之方法。其為不給予動力學資料之平衡量測。
在SET中，用不同濃度抗原培育恆定量之抗體直至達到平衡。平衡溶液中游離抗體之濃度藉由以下方式測定：在塗佈抗原之MSDTM盤(Meso Scale DiscoveryTM)上施加溶液，接著與ECL標記之二級抗體一起培育且量測信號強度。在較低抗原濃度下，獲得較強信號(盤上與抗原結合之較高濃度游離抗體)，而對於較高抗原濃度，抗體完全被抗原捕獲，產生較低信號。若在匹配範圍內足夠數目之抗原濃度可用，則使用適當擬合模型，滴定曲線允許親和力之合理測定。就完整滴定而言，必須施加高於預期KD至少10倍之抗原濃度。施加於分析中之抗體之恆定濃度應在KD之範圍內，或在KD以下(表3)。
為了利用SET測定KD，使用抗體蛋白質之單體溶離份(至少90%單體含量，藉由分析SEC來分析；分別為用於Fab之Superdex75(Amersham Pharmacia)，或用於IgG之Tosoh G3000SWXL(TOSOH BIOSCIENCE))。
溶液中之親和力測定基本上如文獻(Friguet等人305-19)中所述進行。為了提高SET方法之靈敏度及精確度，其由基於經典ELISA轉換成基於ECL之技術(Haenel等人，2005)。
Epo抗體在培育緩衝液(具有2% BSA(Sigma目錄號A4503)及1% Tween 20及1% Triton-X(Sigma目錄號234729)之PBS)中稀釋至固定濃度，且添加至Epo於培育緩衝液中之連續稀釋液(1：5)中。
Epo之最終最高濃度：
人類、人類-達貝泊汀、獼猴、小鼠、大鼠=10nM
兔=100nM
Fab之最終濃度：
NVS2：2pM，除了兔=30pM
NVS3：2pM，除了兔=5pM
NVS4：2pM，除了兔=10pM
NVS1：2pM
使樣品藉由室溫下培育隔夜來達到平衡。
塗佈抗生蛋白鏈菌素之標準MSD盤(Meso-Scale Discovery，384孔：MSD目錄號L11SA)用25μl培育緩衝液於室溫下阻斷1小時。盤在TBST緩衝液(具有0.05% Tween 20之25mM TBS)中洗滌3次，且於25μl培育緩衝液中添加0.1μg/ml生物素標記之Epo，且於室溫下培育1小時。將盤在TBST緩衝液中洗滌3次。向盤(25μl)中添加含有Fab及Epo滴定之樣品，且於室溫下培育15分鐘。將盤在TBST緩衝液中洗滌3次。添加25μl偵測抗體(抗人類(山羊)Sulfo-TAG，在培育緩衝液中1：1000，MSD目錄號R32AJ-1)，且於室溫下培育60分鐘。將盤在洗滌緩衝液中洗滌3次，且添加50μl 1×MSD讀取緩衝液T(具有界面活性劑，MSD目錄號R92TC-1)。在MSD Spector Imager 6000上讀取盤。
在各別天進行三個實驗，各資料點一式三份。
使用GraphPad Prism軟體v4分析資料，其中從各值中減去背景(不含有Fab之孔之平均值)。將X軸值(溶液中Epo濃度)轉換成log10x。
自以下模型擬合KD值(KD)：Y=(頂點-((頂點/(2×Fab))×((((10^x)+Fab)+KD)-((((((10^x)+Fab)+KD)×(((10^x)+Fab)+KD))-((4×(10^x))×Fab))^0.5))))
頂點=在抗原濃度等於0時之信號
x=溶液中Epo之濃度
Fab=將Fab濃度之限制設定為1pM
Epo Fab之親和力使用SET分析測定，且所得KD值([pM]濃度)概述於表3中。NVS2以小於10pM之KD結合人類、人類-達貝泊汀及獼猴Epo。NVS2亦以小於50pM之KD結合小鼠Epo，且以小於20pM之KD 結合大鼠Epo。NVS3以小於5pM之KD結合人類、人類-達貝泊汀、獼猴、小鼠及大鼠Epo。NVS4以小於10pM之KD結合人類、人類-達貝泊汀、獼猴、小鼠及大鼠Epo。
ND：未測定
*針對NVS1展示之資料為單一資料點
實例3：抑制Epo誘導之細胞增殖
可使用生長及存活依賴於紅血球生成素之細胞藉助於Epo依賴性增殖抑制來量測抗Epo治療劑之效能(Chiba等人，1991)。
實例3a：Ba/F3-EpoR細胞增殖分析
此分析表明Epo抗體抑制表現Epo受體之小鼠Ba/F3細胞(Ba/F3-EpoR細胞)中Epo誘導之細胞增殖之能力。Ba/F3細胞之生長及存活為IL-3依賴性的，且已展示當在各種致癌酪胺酸激酶之情況下轉型後，其以IL-3非依賴性方式生長。當用EpoR穩定轉染後，Ba/F3-EpoR細胞變為IL-3非依賴性。使用Amaxa核轉染系統(目錄號VCA-1003，Amaxa GmbH)，根據製造商之說明書使用Nucleofector裝置(Amaxa，NucleofactorTM II)，將帶有人類EpoR之哺乳動物表現質體pcDNA3.1轉染至Ba/F3細胞中。
材料
細胞維持
生長培養基：RPMI 1640/10% FBS/1%青黴素-鏈黴素/100μg/ml濕黴素B/1U/ml Epo
分析培養基：RPMI 1640/10% FBS/1%青黴素-鏈黴素/100μg/ml濕黴素B
將Ba/F3-EpoR細胞維持在生長培養基(RPMI 1640/10% FBS/1%青黴素-鏈黴素/100μg/ml濕黴素B/1U/ml Epo)中。細胞在約1e6個細胞/毫升(每3至4天)時分開降至0.4-0.6e5個細胞/毫升。
Epo誘導之細胞增殖分析
1. 在實驗前一天，藉由以下方式製備Ba/F3-EpoR細胞：離心以移除生長培養基，接著將該等細胞再懸浮於不含有Epo之分析培養基(RPMI 1640/10% FBS/1%青黴素-鏈黴素/100μg/mL濕黴素B)中。
2. 在實驗當天，將細胞在分析培養基中洗滌2至3次(離心1000rpm，5分鐘)且以1.25×105個細胞/毫升再懸浮於分析培養基中。
3. 向384孔黑色盤(透明底部，TC處理)之各分析孔中添加2500個細胞。
4. 於384孔微盤中用分析培養基連續稀釋Epo，以使得Epo之最終濃度比所需最終濃度高兩倍。
5. 向384孔黑色盤之含有Ba/F3-EpoR細胞之樣品孔中一式三份地添加20μl連續稀釋之Epo(一式三份)。
6. 使盤以1000rpm在離心機中旋轉30至60秒，且在37℃、5% CO2下培育48小時。
7. 在終點前四小時，向所有孔中添加8μl Cell Titer Blue，且在37℃，5% CO2下再培育。
8. 四小時後，在具有Paradigm Multimode SW之Beckman Coulter Paradigm上或在可比的掃描儀上讀取盤。
9. Epo刺激Ba/F3-EpoR細胞之增殖超過基線4倍。Epo刺激Ba/F3-EpoR，其中平均EC50為11.2pM，且範圍為10pM及26pM。
10. 在分析培養基中含有4ng/ml Epo之384孔微盤中一式三份地連續稀釋抗Epo抗體，且在室溫下培育30分鐘。
11. 向預先用每孔2500個BaF3/EpoR細胞接種之384孔黑壁盤中添加20微升/孔上述Epo/抗Epo抗體混合物。
12. 如以上步驟7至9中所概述處理培育後盤。
結果
Epo抗體在1ng/ml Epo存在下在48小時之後抑制Ba/F3-EpoR細胞增殖。抗體抑制Ba/F3-EpoR細胞增殖，其IC50小於或等於350pM。
實例3b：F36E細胞增殖分析
F36E細胞之增殖高度依賴於Epo。使用上文所述之方法用Epo刺激通常引起超過基線大於6倍之信號。此曲線之EC50為7pM。
Epo誘導之F36E細胞增殖分析之中和的方案
使用F36E細胞株(一種來源於親本骨髓細胞株之Epo依賴性淋巴細胞樣永生化細胞株)之增殖分析用於篩檢抗Epo治療性抗體以及用於選擇供研發用之候選物。
材料
細胞維持
達貝泊汀(一種重組過糖基化人類Epo)用於本文所述之細胞維持及增殖分析。達貝泊汀以與重組人類Epo可比之EC50刺激F36E細胞之增殖(63.2pg/ml達貝泊汀及81.25pg/ml紅血球生成素；參見LU-15432,第44頁)。使F36E細胞以最小密度每毫升0.25e6個細胞至最大密度每毫升1.0e6個細胞在生長培養基(RPMI 1640/5% FBS/1%青黴素-鏈黴素/5.2U/ml dEpo)中維持至多10個繼代。
Epo誘導之增殖分析方案
1. 於分析培養基(RPMI 1640/5% FBS/1%青黴素-鏈黴素)中稀釋Epo至4ng/ml，為所需最終濃度之4倍。
2. 於分析培養基中稀釋抗Epo抗體至200nM(4×最終濃度)，且於分析培養基中將此濃度連續稀釋以用於六點。針對陽性參考抗體(例如：Epo26)及陰性參考抗體(例如：抗雞溶菌酶單株抗體)重複稀釋。
3. 將7.5μl經稀釋之dEpo及7.5μl抗Epo抗體系列稀釋液混合於384孔聚丙烯微盤中，一式三份，且在室溫下培育30分鐘。
4. 集結F36E細胞(每個384孔盤2e6個)，吸出生長培養基，且將細胞在分析培養基中洗滌一次(離心1200rpm，5分鐘)，隨後再懸浮於分析培養基中至3.33e5個細胞/毫升。
5. 向384孔聚苯乙烯細胞培養盤中之所有孔中添加15微升/孔細 胞(5,000個細胞/孔)。
6. 向細胞中添加15μl抗體-Epo混合物。
7. 在37℃、5% CO2下培育68小時。
8. 每孔添加8μl Cell Titer Blue，且在37℃、5% CO2下培育4小時。
9. 在Fluoroskan Ascent微盤螢光計或可比之掃描儀上在560(20)Ex/590(10)Em下量測螢光。
10. 繪製平均RFU+/-標準差相對於nM抗體，且藉由非線性回歸曲線擬合於Graph Pad Prizm軟體中測定IC50。
結果
抗Epo抗體抑制F36E細胞增殖，其IC50小於或等於200pM。
實例4：抗原決定基結合 合成肽及肽截短研究
合成或以重組方式表現對應於人類Epo(hEpo)之結構域之合成肽、hEpo之域截短或含有hEpo及人類血小板生成素(TPO)之部分的嵌合分子。對合成肽之陽性結合指示，含於Epo之域中之殘基涉及對抗Epo抗體之結合。對於截短蛋白質，結合之損失指示截短部分涉及對抗Epo抗體之結合。然而，結合之損失不排除截短顯著改變剩餘蛋白質之結構以使得影響對抗Epo抗體之結合的可能。人類Epo-人類TPO嵌合體實現結構之維持同時仍允許抗原決定基定位。對含有hTPO之一部分之變異體的結合損失指示，hEpo中之同源區域對於與抗Epo抗體結合而言至關重要。
抗紅血球生成素抗體之肽抗原決定基定位
合成以下六種肽(表6)，該等肽對應於紅血球生成素之螺旋。
分析建立
1. 於384孔MSD標準盤(Mesoscale Discovery，目錄號L21XA-4)上塗佈25μl含肽之PBS(5μg/ml)隔夜。
2. 盤用90μl PBS+5% BSA/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100阻斷4小時。
3. 向盤中添加含500nM Morphosys Epo Fab之PBS+2% BSA/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100之稀釋劑，且培育1小時。
4. 洗滌盤，且與針對Epo Fab之Sulfo-tag抗人類IgG(Meso Scale Discovery，目錄號R32AJ-1)或適用於參考蛋白質/抗體之物質一起培育(1小時)
5. 洗滌盤，且添加MSD讀取溶液(Meso Scale Discovery，目錄號R92TC-1)。
6. 讀取盤
具有紅血球生成素之截短變異體之抗紅血球生成素抗體之抗原決定基定位
Epo變異體1：螺旋A
Epo變異體2：螺旋A、環A-B
Epo變異體3：螺旋A、環A-B、螺旋B
Epo變異體4：螺旋A、環A-B、螺旋B、環B-C、螺旋C
Epo變異體5：全長紅血球生成素
分析建立
1. 在4℃下在標準抗生蛋白鏈菌素384孔盤(Mesoscale Discovery，目錄號L21SA-1)上用表現Epo變異體之生物素標記之HEK293塗佈盤隔夜。
2. 盤用90μl PBS+5% BSA/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100阻斷4小時。
3. 洗滌盤，且向盤中添加500nM Morphosys Epo Fab，且培育1小時
4. 洗滌盤，且與針對Epo Fab之Sulfo-tag抗人類IgG(Meso Scale Discovery，目錄號R32AJ-1)或適用於參考蛋白質/抗體之物質一起培育(1小時)
5. 洗滌盤，且添加MSD讀取溶液(Meso Scale Discovery，目錄號R92TC-1)。
6. 讀取盤
具有Epo/血小板生成素(Tpo)及兔/人類Epo嵌合體之抗紅血球生成素抗體之抗原決定基定位 Epo/Tpo嵌合體
Epo/Tpo變異體1：具有Tpo螺旋A之人類Epo
Epo/Tpo變異體2：具有Tpo環A-B之人類Epo
Epo/Tpo變異體3：具有Tpo螺旋B之人類Epo
Epo/Tpo變異體4：具有Tpo螺旋C之人類Epo
Epo/Tpo變異體5：具有Tpo螺旋D之人類Epo
兔/人類Epo嵌合體
兔/人類Epo變異體1：具有人類螺旋A之兔Epo
兔/人類Epo變異體2：具有人類環A-B之兔Epo
兔/人類Epo變異體3：具有人類螺旋B之兔Epo
兔/人類Epo變異體4：具有人類環B-C及螺旋C之兔Epo
兔/人類Epo變異體5：具有人類環C-D之兔Epo
兔/人類Epo變異體6：具有人類螺旋D之兔Epo
分析建立
1. 在4℃下於384孔MSD標準盤(Mesoscale Discovery，目錄號L21XA-4)上塗佈25μl含Epo嵌合體之PBS(2μg/ml)隔夜。
2. 盤用90μl PBS+5% BSA/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100阻斷4小時。
3. 向盤中添加含500nM Morphosys Epo Fab之PBS+2% BSA/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100之稀釋劑，且培育1小時。
4. 洗滌盤，且與針對Epo Fab之Sulfo-tag抗人類IgG(Meso Scale Discovery，目錄號R32AJ-1號)或適用於參考蛋白質/抗體之物質一起培育(1小時)
5. 洗滌盤，且添加MSD讀取溶液(Meso Scale Discovery，目錄號R92TC-1)。
6. 讀取盤
一般方案
標準捕獲384孔MSD盤(Meso Scale Discovery)塗佈有肽(5μg/ml於PBS中，New England Peptide LLC)或Epo嵌合體(2μg/ml於PBS中)，且在4℃下培育隔夜。在標準抗生蛋白鏈菌素捕獲384孔MSD盤上塗佈生物素標記之截短Epo變異體(2μg/ml於PBS中)隔夜。在用TBST(Thermo Scientific，目錄號28360)洗滌盤1次之後，在室溫下於稀釋劑 (PBS、5% BSA、0.1% Tween-20、0.1% TritonX-100)中阻斷盤4小時。於TBST中洗滌盤3次。向預塗佈肽/Epo變異體之MSD盤中添加五百奈莫耳濃度抗紅血球生成素fab後持續1小時。於TBST中洗滌盤3×，且添加抗人類IgG-Sulfotag(1μg/ml，Meso Scale Discovery，目錄號R32AJ-1)，且培育60分鐘。於TBST中洗滌盤3×，且添加1×讀取緩衝液T(Meso Scale Discovery，目錄號R92TC-1)。於MSD Spector Imager 6000上讀取盤，且使用GraphPad Prism軟體v4分析資料。
結果：
結果指示，抗體最低限度地結合至以下域(表7)。無抗體結合至螺旋C。
(++)顯性抗原決定基：(+)觀測到結合
具有Epo之複合物中抗體之晶體結構
糖基化重組人類紅血球生成素(Epo)得自LEK Pharmaceuticals,Inc。
使用蛋白質脫糖基化混合物(New England Biolabs，目錄號P6039S)使Epo脫糖基化。將30mg hEpo與1ml蛋白質脫糖基化混合物合併，且在37℃下培育1小時，此時，如由SDS-PAGE所測定脫糖基化不完全。隨後向Epo中再添加0.5ml蛋白質脫糖基化混合物，且在37℃下再培育1小時。凝膠分析展示接近完全脫糖基化之Epo。隨後使用在25mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl中平衡之120mL Superdex75管柱(GE Healthcare，目錄號28-9893-33)進一步純化此蛋白質。彙集含有最高脫糖基化程度之hEpo的溶離份。蛋白質複合物藉由合併5 mg脫糖基化Epo與7mg NVS3，接著在冰上培育1小時來形成。隨後濃縮蛋白質複合物混合物且將其施加至在25mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl中平衡之120ml Superdex 75上。彙集含有經SDS凝膠評估之化學計量比之Epo：NVS3的溶離份且將其濃縮至19mg/ml(利用LCUV估計之濃度)(PRONOVA #27SN)。使用此濃Epo：NVS3複合物建立結晶篩檢。晶體藉由坐式蒸汽擴散之技術生長，其中液滴含有相等體積之蛋白質及儲集溶液。晶體在4℃下在以下儲集條件下形成：0.1M Hepes pH7.0、12% PEG3350、50mM脫水乙酸鋅。晶體使用以下低溫保護溶液冷凍：0.1M Hepes pH 7.0、15% PEG3350、50mM脫水乙酸鋅、22%甘油。
Epo：NVS3複合物晶體繞射資料在光束線17-ID下在先進光子源(Advanced Photon Source；Argonne National Laboratory，USA)收集。處理資料，且在2.6Å下使用autoPROC(Global Phasing，LTD)以空間群C2按比例縮放，其中細胞尺寸a=125.57Å、b=150.15Å、c=163.84Å、α=90°、β=110.81°、γ=90°。Epo：NVS3結構藉由分子置換法使用Phaser來解析(McCoy等人，(2007)J.Appl.Cryst.40：658-674)。將PDB資料庫(Berman 2000)中來自3H0T結構之Fab分成可變域及恆定域，且將人類紅血球生成素結構Syed等人，Nature.1998年10月1日；395(6701)：511-6(PDB代碼1EER)用作搜尋模型。
每個不對稱單元含有3個Epo：NVS3複合物分子之最終模型使用PHENIX在COOT(Emsley及Cowtan(2004)Acta Cryst.60：2126-2132)中建構，且經改進以使R及Rfree值分別為23.0%及26.7%，且鍵長度及鍵角之rmsd分別為0.010Å及1.34°(Adams等人，Acta Cryst.D66,213-221(2010))。
Epo：NVS3之晶體結構經解析及改進為2.6Å。其顯示不對稱單元由三個Epo：NVS2蛋白質複合物組成，各複合物由與一個Epo蛋白質結 合之一個Fab組成。此等複合物中之兩者形成鋅介導之二聚體，且第三者展現較高b因子及較弱密度。Fab與Epo之相互作用由來自NVS3之重鏈及輕鏈兩者之互補決定區(CDR)環介導。當與1EER相比時，Epo之構形變化限於遠離Fab結合抗原決定基之環，其中所有144個對準之胺基酸之RMSD為0.5Å。Fab NVS3之重鏈及輕鏈展示域之典型免疫球蛋白樣摺疊。
Epo：NVS3之晶體結構用於鑑別NVS3之抗原結合片段之Epo抗原決定基。Epo上之相互作用表面主要由包含以下之殘基形成：殘基Ser9、Glu13、殘基Thr44至Arg53及殘基Asn147至Arg162。此等殘基對應於表示為α-螺旋A、環βA-αB及α-螺旋D之Epo之二級結構元件。此等殘基形成由NVS3識別之三維表面。相互作用包括主鏈相互作用、溶劑介導之相互作用及直接側鏈相互作用。
含有與NVS3接觸之原子之Epo殘基列於表9中。接觸定義為在NVS3之5Å內，以考慮潛在水介導之相互作用。
*相對於SEQ ID NO：81之序列位置列舉含有與NVS2接觸之原子之Epo殘基。接觸定義為在蛋白質搭配物之5Å內，以考慮潛在水介導之相互作用。
*相對於SEQ ID NO：81之序列位置
實例5：活體內模型 實例5a：眼睛水腫之小鼠模型
C57/B16小鼠(Taconic)用ssAAV2-EPO-eGFP(DR005)及ssAAV2-EGFP(TM003)(對照)視網膜下注射。注射後三週(21天)殺死小鼠。將視網膜平鋪，且量測血管口徑。
方法：ssAAV2-EPO-eGFP及ssAAV2-eGFP之視網膜下注射
將8週大的C57/B16小鼠分成兩組(各組10隻小鼠，20隻眼睛/組)，且用1μl ssAAV2以2×109個DRP/微升視網膜下注射。第一組(對照)接受視網膜下ssAAV2-EPO(TM003)，且第二組(實驗)接受ssAAV2-eGFP(DR005)。在注射後21天在視網膜鋪片中檢查小鼠Epo對視網膜血管變化之作用。
所測試之AAV(腺相關病毒)為：ssAAV2-EPO-eGFP[來自Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility,The University of North Carolina at Chapel Hill之(AAV2-CMV-mEPO-IRES-eGFP)，批號AV3782]及ssAAV2-GFP[來自Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility,The University of North Carolina at Chapel Hill之(AAV2-eGFP)：批號AV3725]。
程序：
AAV載體經由視網膜下注射傳遞於所測試小鼠之兩隻眼睛上。所描述之所有程序皆使用無菌試劑、注射器及適當PPE在無菌條件下進 行。
1. 固定小鼠，且依序用一滴環戊通(1%)及一滴2.5%苯腎上腺素使其瞳孔擴張。
2. 然後，用阿佛丁(Avertin，250mg/kg)腹膜內麻醉動物。用一滴0.5%丙美卡因(proparacaine)將角膜局部麻醉。
3. 在將動物置放於外科顯微鏡下之後，使用微型刮刀製造0.5mm鼻切口(角膜緣後)。
4. 將連接於10μl漢彌爾頓(Hamilton)注射器之鈍針經由鞏膜切口向顳側視網膜切向***。推進針直至感受到抵抗。
5. 向視網膜下空間緩慢注射1μl ssAAV2載體(ssAAV2-EPO-eGFP或ssAAV2-GFP，兩者均含有經1：50稀釋之螢光素以觀察傳遞)。
6. 在外科顯微鏡下檢查眼睛。藉由觀察到含螢光素之視網膜剝離來確認視網膜下注射成功。
7. 注射隨視網膜損害程度(根據出血規模觀測)及對晶體之損害而評分。
8. 將動物轉至另一側，且重複該程序。
9. 在注射之後，向兩隻眼睛塗覆抗生素軟膏。
視網膜鋪片上之視網膜剝離、成像及定量：
1. 在安樂死(CO2)前1至5分鐘，注射(靜脈內，尾部靜脈)0.1ml刀豆球蛋白-A(Con-A)
2. 剜出眼睛，且將其在多聚甲醛(4%於PBS中)固定兩小時。隨後使其在4℃下於PBS緩衝液中維持1至3天直至剝離
3. 移除角膜及晶體，且自後眼杯(視網膜有色上皮/脈絡膜)剝離視網膜
4. 對視網膜製造四個放射狀切口，且在光感受器層面朝下方之情況下平鋪在Vectashield封片介質中。
5. 一旦封片，即使鋪片以中央視網膜為中心(使用視神經頭作為參考)，且使用Zeiss成像系統(AxioVision)在20×下擷取Con-A標記之視網膜血管。
6. AxioVision軟體用於量測離視神經頭200μm遠之中央視網膜血管之直徑。
7. 用GraphPad Prism分析所得資料。
結果及結論：
血管直徑之定量顯示，與ssAAV2-GFP及未處理眼睛(6隻眼睛)相比，ssAAV2-EPO在中央視網膜中誘導顯著(*p<0.001)血管擴張(圖1)。比較ssAAV2-GFP相對於未處理組，未發現顯著差異。用鄧尼特事後檢驗(Dunnet post test)使用單因子ANOVA分析樣品(C)各組之代表性鋪片。藉由AAV2-Epo-eGFP之Epo長期傳遞引起靜脈口徑在統計學上顯著增加(圖1)，此為人類之糖尿病黃斑水腫之關鍵特點。因此，在一個態樣中，本發明係關於一種藉由以治療有效量向個體投與本文所述之抗EPO抗體來減小眼睛之靜脈口徑之方法。
實例5b：抗Epo抗體之活體內效力
本文所述之抗Epo抗體之活體內活性及治療功效可在上文所述之眼睛水腫之小鼠模型中評估。
小鼠模型中之活體內攻擊
8週齡之C57B6小鼠用以下中之一者視網膜下注射。
組別：
組1：AAV2-eGFP @效價2×109 DRP @效價，1微升/眼，n=10隻小鼠之20隻眼睛
組2：AAV2-Epo-eGFP @效價2×109 DRP，1微升/眼，n=10隻小鼠之20隻眼睛
組3：AAV2-Epo-eGFP @效價2×109，1微升/眼，+抗Epo Fab， 100微克/眼，每週1次，n=10隻小鼠之20隻眼睛
適當給藥之抗Epo抗體之作用在小鼠模型中藉由注射後2週量測血管直徑來檢查。
AAV-GFP(AAV2-eGFP)及AAV2-Epo-eGFP(AAV2-CMV-mEpo-IRES-eGFP)來自Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility,The University of North Carolina at Chapel Hill。
抗Epo抗體之眼內注射將抑制視網膜血管擴張抗Epo抗體以改善Epo對視網膜中較低血流量及低氧病狀之作用。由此，預期抗Epo抗體會減少亦見於患有諸如濕式AMD及糖尿病性視網膜病變之血管視網膜疾病之患者中的視網膜病變。
實例6：游離EPO之活體內中和 實例6a：使用抗Epo Fab之游離EPO之活體內中和
抗EPO抗體之活體內活性及治療功效如下在兔眼睛中評估。兔用抗EPO Fab、NVS2(1毫克/眼)經玻璃體內給藥，且四天之後用EPO(3微克/眼)之玻璃體內劑量攻擊。殺死動物，且提取包括玻璃體之眼睛組織。如下文所述測定玻璃體中游離EPO及總EPO之量。
總/游離EPO含量：
使用標準結合MSD盤(Meso-Scale Discovery，384孔：MSD目錄號L21XA)，使用塗佈緩衝液(PBS)及培育緩衝液(具有2% BSA(Sigma目錄號A4503)及0.1% Tween20及0.1% Triton-X之PBS)進行分析。
捕獲抗體以1μg/ml PBS溶液(25μl)塗佈，且在4℃下培育隔夜。盤在洗滌緩衝液(具有0.05% Tween20之PBS)中洗滌3×，且於室溫下用25μl培育緩衝液阻斷2小時。盤在洗滌緩衝液中洗滌3×。向盤中添加 玻璃體於培育緩衝液中之稀釋液(25μl)，且於室溫下培育60分鐘。將人類重組達貝泊汀用作標準(A000123，以2μg/ml起始)。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×。添加25μl初級抗體(1μg/ml於培育緩衝液中)，且於室溫下培育60分鐘。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×。添加25μl抗物種二級Sulfo-TAG抗體(1：1000於培育緩衝液中)，且於室溫下培育60分鐘。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×，且添加25μl 1×MSD讀取緩衝液T(具有界面活性劑，MSD目錄號R92TC-1)。在MSD Spector Imager 6000上讀取盤。
結果及結論：
經抗EPO或媒劑注射之動物玻璃體中所量測之總EPO含量與預期類似(圖2)。相反，在經抗EPO Fab注射之兔玻璃體中未量測出游離EPO，但在經媒劑注射之兔玻璃體中量測出游離EPO為平均約100ng/ml。正如預期，玻璃體內投與之抗EPO Fab完全中和游離EPO含量。
實例6b：使用抗Epo Fab之游離EPO之活體內中和
抗EPO抗體之活體內活性及治療功效如下在兔眼睛中評估。兔經抗EPO Fab、NVS2(1毫克/眼)及EPO(3微克/眼)之預混溶液玻璃體內給藥。殺死動物，且提取包括玻璃體之眼睛組織。如下文所述測定玻璃體中游離EPO及總EPO之量。注意：一些眼睛接受抗EPO Fab、 EPO及VEGF之預混溶液。
總/游離EPO含量：
使用標準結合MSD盤(Meso-Scale Discovery，384孔：MSD目錄號L21XA)，使用塗佈緩衝液(PBS)及培育緩衝液(具有2% BSA(Sigma目錄號A4503)及0.1% Tween20及0.1% Triton-X之PBS)進行分析。
捕獲抗體以1μg/ml PBS溶液(25μl)塗佈，且在4℃下培育隔夜。盤於洗滌緩衝液(具有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌3×，且於室溫下用25μl培育緩衝液阻斷2小時。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×。向盤中添加玻璃體於培育緩衝液中之稀釋液(25μl)，且於室溫下培育60分鐘。將人類重組達貝泊汀用作標準(A000123，以2μg/ml起始)。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×。添加25μl初級抗體(1μg/ml於培育緩衝液中)，且於室溫下培育60分鐘。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×。添加25μl抗物種二級Sulfo-TAG抗體(1：1000於培育緩衝液中)，且於室溫下培育60分鐘。盤於洗滌緩衝液中洗滌3×，且添加25μl 1×MSD讀取緩衝液T(具有界面活性劑，MSD目錄號R92TC-1)。在MSD Spector Imager 6000上讀取盤。
結果及結論：
經抗EPO或媒劑注射之動物玻璃體中所量測之總EPO含量與預期類似(圖3)。相反，在經抗EPO Fab注射之兔玻璃體中未量測出游離EPO，而在經媒劑注射之兔玻璃體中量測出游離EPO為平均約200ng/ml(圖3)。VEGF之存在對所量測之游離或總EPO含量似乎不具有任何作用。正如預期，玻璃體內投與之抗EPO Fab完全中和游離EPO含量。

Claims (37)

  1. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其以小於或等於50pM之KD結合Epo。
  2. 如請求項1之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合Epo之螺旋D域。
  3. 如請求項1或2之經分離之抗體或抗原結合片段，其另外結合Epo之環A-B域。
  4. 如請求項1或2之經分離之抗體或抗原結合片段，其另外結合Epo之螺旋A域。
  5. 如請求項1或2之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體結合人類Epo。
  6. 如請求項1之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合包含Epo螺旋D及環A-B內之胺基酸之構形抗原決定基。
  7. 如請求項7之抗體或抗原結合片段，其結合另外包含Epo螺旋A內之胺基酸之構形抗原決定基。
  8. 如請求項1之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合包含位於SEQ ID NO.81之位置44至50、52、53、147、150、151、154、155、159及162之胺基酸之構形抗原決定基。
  9. 如請求項1、2及7至9中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合包含位於SEQ ID NO.81之位置9、13、44至53、147、150、151、154、155、158、159及162之胺基酸之構形抗原決定基。
  10. 如請求項1、2及7至9中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合包含位於SEQ ID NO.81之位置23、43至50、52、53、131、143、147、150、151、154、155、159及162之胺基酸 之構形抗原決定基。
  11. 如請求項1、2及7至9中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其亦結合獼猴、小鼠或大鼠Epo。
  12. 如請求項1、2及7至9中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其以小於或等於350pM之EC50進一步抑制EPO依賴性細胞增殖。
  13. 如請求項1、2及7至9中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其抑制表現EPO受體之B細胞中的EPO依賴性細胞增殖。
  14. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其與表1中所述之抗體結合相同之抗原決定基，或與表1中所述之抗體競爭。
  15. 如請求項1、2、7至9及15中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合EPO，且其包含：a)如分別於SEQ ID NO：1、2及3中所述之重鏈可變區HCDR1、HCDR2及HCDR3，及如分別於SEQ ID NO：4、5及6中所述之輕鏈可變區LCDR1、LCDR2及LCDR3；b)如分別於SEQ ID NO：21、22及23中所述之重鏈可變區HCDR1、HCDR2及HCDR3，及如分別於SEQ ID NO：24、25及26中所述之輕鏈可變區LCDR1、LCDR2及LCDR3；c)如分別於SEQ ID NO：41、42及43中所述之重鏈可變區HCDR1、HCDR2及HCDR3，及如分別於SEQ ID NO：44、45及46中所述之輕鏈可變區LCDR1、LCDR2及LCDR3；或d)如分別於SEQ ID NO：61、62及63中所述之重鏈可變區HCDR1、HCDR2及HCDR3，及如分別於SEQ ID NO：64、65及66中所述之輕鏈可變區LCDR1、LCDR2及LCDR3。
  16. 如請求項1、2、7至9及15中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其包含胺基酸序列分別與SEQ ID NO：13及14、SEQ ID NO：33及34、SEQ ID NO：53及54、或SEQ ID NO：73及74至少90%一致之重鏈及輕鏈可變區。
  17. 如請求項1、2、7至9及15中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其結合Epo，其包含胺基酸序列與SEQ ID NO：15及16、35及36、55及56、或75及76具有至少90%序列一致性之重鏈及輕鏈。
  18. 如請求項1、2、7至9及15中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體為人類抗體、嵌合抗體、單株抗體、單鏈抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv。
  19. 如請求項1、2、7至9及15中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體為IgG同型(isotype)。
  20. 一種經分離之核酸分子，其包含編碼如請求項1至20中任一項之抗體或片段之核苷酸序列。
  21. 如請求項21之核酸分子，其中該核酸包含編碼重鏈可變域之序列，且該序列與選自SEQ ID NO：17、37、57及77之序列具有至少95%序列一致性。
  22. 如請求項21之核酸分子，其中該核酸包含編碼輕鏈可變域之序列，且該序列與選自SEQ ID NO：18、38、58及78之序列具有至少95%序列一致性。
  23. 一種載體，其包含如請求項21至23中任一項之核酸分子。
  24. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項21至23中任一項之核酸或如請求項24之載體。
  25. 一種組合物，其包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之稀釋劑或載體。
  26. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供治療個體之視網膜血管疾病之藥劑。
  27. 如請求項27之用途，其中該個體之該視網膜血管疾病與選自以下之疾病或病狀相關：糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、增殖性糖尿病性視網膜病變、非增殖性糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性、視網膜靜脈阻塞、多灶性脈絡膜炎、近視脈絡膜新生血管及早產兒視網膜病變。
  28. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供治療個體之黃斑水腫之藥劑。
  29. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供治療個體之糖尿病性視網膜病變之藥劑。
  30. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供治療個體之糖尿病性黃斑水腫之藥劑。
  31. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供治療增殖性糖尿病性視網膜病變之藥劑。
  32. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供抑制EPO依賴性細胞增殖之藥劑。
  33. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供抑制表現Epo受體之細胞中之EPO依賴性細胞增殖之藥劑。
  34. 如請求項34之用途，其中該細胞為B細胞。
  35. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供抑制糖尿病性黃斑水腫之藥劑，其中該藥劑之投與在眼中減少視網膜靜脈擴張，減少血管滲漏及/或增加血流。
  36. 一種包含如請求項1至20中任一項之抗體或抗原結合片段之組合物的用途，其用於製造供抑制EPO與細胞上EPO受體結合之藥劑。
  37. 如請求項37之用途，其中該細胞在個體中。
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