TWI786087B - Fgf21模擬抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種結合至人類β-klotho之單株抗體及其抗原結合片段，及含其之醫藥組合物及治療方法。

Description

FGF21模擬抗體及其用途
本發明係關於一種纖維母細胞生長因子21 (FGF21)模擬抗體。亦揭示治療FGF21相關病症諸如肥胖症、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症侯群及其他代謝病症，以及降低危重患者之死亡率及發病率的方法。
纖維母細胞生長因子(FGF)家族之特徵在於22種基因上不同的同源配位體，其分組為七個亞家族。根據已公開之文獻，FGF家族現在由至少二十三個成員(FGF-1至FGF-23)組成(Reuss等人(2003) Cell Tissue Res. 313:139-157)。 纖維母細胞生長因子21 (FGF21)係自小鼠胚胎單離且係最接近FGF19及FGF23。此FGF亞家族調節經典FGF罕見之多種生理過程，即能量及膽汁酸穩態、葡萄糖及脂質代謝、及磷酸鹽以及維生素D穩態。此外，與經典FGF不同地，此亞家族係以內分泌方式起作用(Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8)。已報導FGF21優先在肝臟中表現(Nishimura等人(2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206；專利公開案WO01/36640；及專利公開案WO01/18172)並描述其作為針對缺血性血管疾病、傷口癒合、及與肺、支氣管或肺泡細胞功能喪失相關聯之疾病及許多其他病症之治療。 已確定FGF21為強效代謝調節劑。全身性投與FGF21至患有飲食誘導型或遺傳性肥胖及糖尿病之齧齒動物及恆河猴發揮強烈的抗高血糖及三酸甘油酯降低作用，並降低體重(Coskun,T,等人(2008) Endocrinology 149:6018-6027；Kharitonenkov, A.等人(2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635；Kharitonenkov, A.等人(2007) Endocrinology 148:774-781；Xu, J等人(2009) Diabetes 58:250-259)。FGF21係含有28個胺基酸前導序列之209個胺基酸多肽。人類FGF21具有與小鼠FGF21約79%之胺基酸一致性及與大鼠FGF21約80%之胺基酸一致性。 在哺乳動物中，FGF經由一組四種FGF受體FGFR1至4介導其作用，及繼而於多種接合變異體中表現。每種FGF受體含有細胞內酪胺酸激酶結構域，其在配位體結合時被激活，從而導致涉及MAPK (Erk1/2)、RAF1、AKT1及STAT之下游信號傳導路徑。(Kharitonenkov, A.等人(2008) BioDrugs 22:37-44)。若干報導表明，FGFR1至3之「c」報告子接合變異體呈現對β-klotho之特異性親和力且可充作FGF21之內源性受體(Kurosu等人，2007 J. Biol. Chem. 282:26687-26695；Ogawa等人，2007 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7437；Kharitonenkov等人，2008 J. Cell Physiol. 215, 1-7)。在3T3-L1細胞及白色脂肪組織中，FGFR1係迄今為止最豐富之受體，且因此最可能地FGF21在此組織中之主要功能受體為β-klotho-FGFR1c複合物。 雖然FGF21激活FGF受體及下游信號傳導分子，包括FRS2a及細胞外信號調節激酶(ERK)，但尚未偵測FGFR與FGF21之直接相互作用。此外，各種非脂肪細胞對FGF21無應答，即使其等表現多種FGFR同功異型物。所有此等資料表明，輔因子必須通過FGFR來介導FGF21信號傳導。研究已確定在肝臟、脂肪細胞及胰腺中高度表現之beta-klotho (β-klotho)為對FGF21之細胞應答的決定因素(Kurosu, H.等人(2007) J Biol Chem 282, 26687-95)。β-klotho-FGFR複合物，而非單獨之FGFR，在體外與FGF21結合(Kharitonenkov, A.等人(2008) J Cell Physiol 215, 1-7)。FGF21結合至與FGFR1c、2c或3c複合之β-klotho；但不結合至與FGFR4複合之β-klotho (Owen等人，2015 Trends in Endocrinology 26: 22-29)。已在FGF23-klotho-FGFR系統中識別類似機制(Urakawa, I.等人(2006) Nature 444, 770-4)。 最先在小鼠3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取測定中確定FGF21之生物活性(Kharitonenkov, A.等人(2005) J Clin Invest 115, 1627-35)。隨後，顯示FGF21誘導與胰島素無關之葡萄糖攝取及GLUT1表現。在一系列糖尿病齧齒動物模型中亦顯示FGF21改善高血糖症。此外，發現過量表現FGF21之轉殖基因小鼠對飲食誘導型代謝異常具有抵抗性，包括體重及脂肪量下降以及胰島素敏感性增強(Badman, M.K.等人(2007) Cell Metab 5, 426-37)。將FGF21投與至糖尿病非人靈長類動物(NHP)引起空腹血漿葡萄糖、三酸甘油酯、胰島素及胰高血糖素水平之下降，並導致脂蛋白分佈之顯著改善，包括HDL膽固醇增加近80% (Kharitonenkov, A.等人(2007) Endocrinology 148, 774-81)。重要地，在此NHP研究期間，任何時候均未觀察到低血糖症。其他研究確定FGF21為一種有助於控制對空腹狀態之適應的重要內分泌激素。此提供先前之脫節，PPARa之下游，藉此肝臟與身體之其餘部分就調節能量穩態之生物學進行通信。FGF21調節脂肪(脂肪分解)、肝臟(脂肪酸氧化及酮體生成)及腦(蟄伏)之組合觀察結果確定其為對空腹反應之主要內分泌調節劑(Kharitonenkov, A.及Shanafelt, A.B. (2008) BioDrugs 22, 37-44)。 將FGF21直接用作生物治療劑之問題為其半衰期極短。在小鼠中，人類FGF21之半衰期為0.5至1小時，而在食蟹獼猴中，其半衰期為2至3小時。此外，當野生型FGF21用於藥物調配物或製劑時，其穩定性受到例如間甲苯酚之防腐劑的不利影響。
本發明係關於一種FGF21模擬抗體(即與beta-klotho (β-klotho)結合並激活人類纖維母細胞生長因子21 (以下有時稱為「FGF21」)受體複合物及FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)之單株抗體)、其抗原結合片段、以及包含其之藥物組合物及治療方法。 在特定態樣中，本發明(FGF21模擬物，β-klotho結合抗體之)抗原結合片段可為具有FGF21樣活性及選擇性但增加治療上所需之特徵(諸如蛋白質穩定性、低免疫原性、便於生產及所需體內半衰期)的分子。 本發明單株FGF21模擬抗體、其抗原結合片段及包含其之醫藥組合物係適用於治療與FGF21相關聯之病症，諸如肥胖、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症侯群、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱及其他代謝病症，以及降低危重患者之死亡率及發病率。 在特定態樣中，本文所述之單離FGF21模擬抗體或抗原結合片段以小於或等於500 pM或400 pM之平衡解離常數(KD )(例如如藉由BIACORE™結合分析法所測定)結合β-klotho，且亦可以小於或等於50 nM之EC50 (例如如藉由細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化(pERK或磷酸-ERK)細胞分析法所量測)激活食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物。在特定態樣中，本文所述之單離FGF21模擬抗體或抗原結合片段以小於或等於300 pM或400 pM之平衡解離常數(KD ) (例如如藉由BIACORE™結合分析法所測定)結合β-klotho，且亦可以小於或等於50 nM之EC50 (例如如藉由pERK細胞分析法所量測)激活食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物。 在特定態樣中，本文所述之FGF21模擬抗體或抗原結合片段以小於或等於100 pM或50 pM之平衡解離常數(KD )結合β-klotho。例如，本文所述之單離抗體或抗原結合片段可以小於或等於100 pM、小於或等於50 pM、小於或等於45 pM、小於或等於40 pM、小於或等於35 pM、小於或等於25 pM、或小於或等於15 pM之KD 結合至人類β-klotho。更具體言之，本文所述之單離抗體或抗原結合片段亦可以小於或等於10 pM之KD (例如如藉由BIACORE™結合分析法或溶液平衝滴定分析法(SET)所量測)結合人類β-klotho；且亦可以小於或等於50 nM之EC50 (例如如藉由pERK細胞分析法所量測)激活食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物。 本發明係關於結合至人類及食蟹獼猴β-klotho之單離抗體或其抗原結合片段。本發明亦係關於結合β-klotho並激活FGF21受體複合物及FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)之單離抗體及其抗原結合片段。在特定態樣中，本文所述之單離抗體或其抗原結合片段不激活人類FGFR2c_β-klotho、FGFR3c_β-klotho或FGFR4_β-klotho受體複合物。 本發明亦係關於結合β-klotho且另外與表1中所述之抗體(例如，抗體NOV005或NOV006)競爭結合的單離抗體或其抗原結合片段。本發明亦進一步係關於結合與表1所述之抗體(例如，抗體NOV005或NOV006)相同之抗原決定基的單離抗體或其抗原結合片段。如本文所述，抗體及/或其抗原結合片段之間的「競爭」表示兩種抗體(或其結合片段)結合至相同之β-klotho抗原決定基(例如，如藉由競爭性結合分析法、藉由熟習此項技術者所熟知之方法中的任一者所測定)。若競爭性抗體或其抗原結合片段結合與本發明抗體或抗原結合片段相同之β-klotho抗原決定基或重疊β-klotho抗原決定基，則該抗體或其抗原結合片段亦與本發明β-klotho抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)「競爭」。如本文所用，競爭性抗體或其抗原結合片段亦可包括(i)在空間上阻斷本發明抗體或抗原結合片段結合其標靶(例如，若該競爭性抗體結合至附近之非重疊β-klotho及/或β-klotho抗原決定基並在物理上防止本發明抗體或抗原結合片段結合其標靶)；及/或(ii)結合至不同之非重疊β-klotho抗原決定基並誘導β-klotho蛋白質發生構象變化，使得該蛋白質不再能夠由本發明β-klotho抗體或抗原結合片段以不存在該構象變化時發生之方式進行結合。 可藉由溶液平衡滴定(SET)來測定本文所述之單離抗體及抗原結合片段的結合親和力。用於SET之方法係此項技術中已知且係在下文進一步詳細論述。或者，可藉由Biacore分析法來測定本文所述之單離抗體或片段的結合親和力。用於Biacore動態分析法之方法係此項技術中已知且係在下文進一步詳細論述。 單離FGF21模擬抗體或其抗原結合片段可用於增加FGF21受體複合物之活化並藉此增加FGF21信號傳導路徑之活化。在一特定態樣中，單離FGF21模擬抗體或其抗原結合片段可用於增加FGF21受體複合物之活化並藉此增加FGF21信號傳導路徑之活化至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。 如本文所述之單離FGF21模擬抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、人類或人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、Fv片段、F(ab')2片段、或scFv片段、及/或IgG同型物(例如，IgG1、IgG2或IgG4)。 如本文所述之單離FGF21模擬抗體或其抗原結合片段亦可包括其中已將胺基酸自相應人類VH或VL生殖系序列置換至該抗體架構中之架構。 本發明之另一態樣包括具有表1中所述之Fab之完整重鏈及輕鏈序列的單離抗體或其抗原結合片段(例如，抗體NOV005或NOV006)。更具體言之，該單離抗體或其抗原結合片段可具有Fab NOV005或NOV006之重鏈及輕鏈序列。 本發明之另一態樣包括單離抗體或其抗原結合片段，其包含表1中所述之Fab之重鏈及輕鏈可變域序列(例如，抗體NOV005或NOV006)。更具體言之，該單離抗體或其抗原結合片段包含Fab NOV005或NOV006之重鏈及輕鏈可變域序列。 本發明亦係關於包含本文所述之單離抗體或其抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)之組合物(例如，醫藥組合物)，以及與醫藥上可接受之載劑組合的抗體組合物。具體言之，本發明進一步包括包含表1之抗體或其抗原結合片段(諸如，例如抗體NOV005或NOV006)的醫藥組合物。本發明亦係關於包含表1之單離抗體或其抗原結合片段(例如抗體NOV005或NOV006)中的兩者或更多者之組合的醫藥組合物。 本發明亦係關於包含編碼重鏈可變區之核酸序列的單離核酸分子，該重鏈可變區包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。在特定態樣中，該核酸分子包含相比選自由SEQ ID NO:16、36或38組成之群的序列具有至少90%之序列一致性的序列。在本發明之又一態樣中，本文所提供之核酸分子包含SEQ ID NO:16、36或38之核酸序列。 本發明亦係關於包含編碼輕鏈可變區之核酸序列的單離核酸分子，該輕鏈可變區具有SEQ ID NO:26或32之胺基酸序列。在特定態樣中，該核酸分子包含相比SEQ ID NO:27、54、33或40之核酸序列具有至少90%之序列一致性的序列。在本發明之又一態樣中，本文所提供之核酸分子包含SEQ ID NO:27、54、33或40之核酸序列。 本發明亦係關於包含本文所述之核酸分子中之一或多者的載體。在特定態樣中，第一載體編碼本文所提供之抗體(諸如NOV005或NOV006)的重鏈可變區或重鏈，第二載體編碼本文所提供之抗體(諸如NOV005或NOV006)的輕鏈鏈可變區或輕鏈。將該第一載體及該第二載體轉導至宿主細胞中用於共同表現以形成包含此等重鏈及此等輕鏈之抗體。 本發明亦係關於單離宿主細胞，其包括編碼上述抗體之重鏈的重組DNA序列及編碼上述抗體之輕鏈的第二重組DNA序列，其中該等DNA序列係以可操作方式與啟動子連結且能夠在該宿主細胞中表現。預期抗體可為人類單株抗體。亦預期該宿主細胞為非人哺乳動物細胞，例如CHO細胞或HEK293細胞。 本發明亦係關於激活纖維母細胞生長因子21 (FGF21)受體並藉此激活FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)，其中該方法包括使細胞與有效量之包含本文所述的單離抗體或其抗原結合片段之組合物接觸的步驟。 在一特定態樣中，設想該細胞為人類細胞。進一步設想該細胞係在個體中。在一實施例中，設想該細胞為脂肪細胞。在其他實施例中，該細胞可為肝細胞、胰腺細胞、內皮細胞、肌肉或腎細胞中之一或多者。在特定態樣中，仍進一步設想該個體為人類。 本發明亦係關於治療、管理、改善或預防個體中之與FGF21相關聯之病症的方法，其中該方法包括將有效量之包含本文所述之抗體或其抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)的組合物投與至該個體的步驟。在一態樣中，該與FGF21相關聯之病症為肥胖。在一態樣中，該與FGF21相關聯之病症為2型糖尿病。設想該個體為人類。 前述單離抗體或其抗原結合片段中之任一者可為單株抗體或其抗原結合片段。 以下態樣中描述本發明之非限制性實施例： 1.一種結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： 包含SEQ ID NO:6、9、10或12之胺基酸序列的重鏈CDR1 (HCDR1)； 包含SEQ ID NO:7、11或13之胺基酸序列的重鏈CDR2 (HCDR2)； 包含SEQ ID NO:8或14之胺基酸序列的重鏈CDR3 (HCDR3)； 包含SEQ ID NO:19、31、22或25之胺基酸序列的輕鏈CDR1 (LCDR1)； 包含SEQ ID NO:20或23之胺基酸序列的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及 包含SEQ ID NO:21或24之胺基酸序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)。 2.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： 包含SEQ ID NO:6、9、10或12之胺基酸序列的重鏈CDR1 (HCDR1)； 包含SEQ ID NO:7、11或13之胺基酸序列的重鏈CDR2 (HCDR2)； 包含SEQ ID NO:8或14之胺基酸序列的重鏈CDR3 (HCDR3)； 包含SEQ ID NO:31、22或25之胺基酸序列的輕鏈CDR1 (LCDR1)； 包含SEQ ID NO:20或23之胺基酸序列的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及 包含SEQ ID NO:21或24之胺基酸序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)。 3.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： 包含SEQ ID NO:6、9、10或12之胺基酸序列的重鏈CDR1 (HCDR1)； 包含SEQ ID NO:7、11或13之胺基酸序列的重鏈CDR2 (HCDR2)； 包含SEQ ID NO:8或14之胺基酸序列的重鏈CDR3 (HCDR3)； 包含SEQ ID NO:19、31、22或25之胺基酸序列的輕鏈CDR1 (LCDR1)； 包含SEQ ID NO:20或23之胺基酸序列的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及 包含SEQ ID NO:21或24之胺基酸序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)。 4.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (i)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3； (ii)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3； (iii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的LCDR3；或 (iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3。 5.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (i)包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3； (ii)包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3； (iii)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的LCDR3；或 (iv)包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3。 6.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:19或31之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3。 7.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:19或31之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3。 8.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的LCDR3。 9.如態樣1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的LCDR2，及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的LCDR3。 10.如態樣1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段增加β-klotho及FGFR1c之活性。 11.如態樣1至9中任一項之抗體或其抗原結合片段，其以小於或等於450 pM之KD 結合至人類β-klotho蛋白，如藉由BIACORE™結合分析法所量測。 12.如態樣1至9中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包括(i) β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的一或多個胺基酸；或(ii)來自該β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之以下各段殘基246至265、536至550、834至857及959至986的一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸殘基，或基本上由其等組成。 13.如態樣1至9中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包括(i) β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689的一或多個胺基酸；或(ii)來自該β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之以下各段殘基646至670、696至700及646至689的一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸殘基，或基本上由其等組成。 14.如態樣1至13中任一項之單離抗體或其抗原結合片段，其能夠以小於或等於50 nM之EC50激活食蟹獼猴FGFR1c-β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。 15.如態樣1至14中任一項之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段不接觸人類β-klotho (SEQ ID NO:52)之殘基701 (Tyr)或703 (Arg)。 16.如態樣1至15中任一項之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含：包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列或具有與之相比至少90%或95%一致性之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO:26或32之胺基酸序列或具有與之相比至少90%或95%一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 17.如態樣1至16中任一項之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含含有SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH。 18.如態樣1至17中任一項之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含含有SEQ ID NO:26或32之胺基酸序列的VL。 19.如態樣17之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列的VL或(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的VL。 20.如態樣1至19中任一項之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的輕鏈，或(ii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的輕鏈。 21.一種單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段結合至與如態樣1至20中任一項之單離抗體或片段相同之抗原決定基，其中該抗體或抗原結合片段不包含(i)如表2中所述之抗體NOV004的Combined或Kabat CDR；及/或(ii)包含SEQ ID NO:43或55之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO:47或57之胺基酸序列的輕鏈可變區。 22.一種單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段與如態樣1至20中任一項之單離抗體或片段競爭結合至β-klotho，其中該抗體或抗原結合片段不包含(i)如表2中所述之抗體NOV004的Combined或Kabat CDR；及/或(ii)包含SEQ ID NO:43或55之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO:47或57之胺基酸序列的輕鏈可變區。 23.如態樣1至20中任一項之單離抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段不包含(i)如表2中所述之抗體NOV004的Combined或Kabat CDR；及/或(ii)包含SEQ ID NO:43或55之胺基酸序列的重鏈可變域及包含SEQ ID NO:47或57之胺基酸序列的輕鏈可變區。 24.一種醫藥組合物，其包含如上述態樣中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。 25.一種治療代謝病症之方法，其包括將有效量之包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物投與至罹患代謝病症之個體。 26.如態樣25之方法，其中該個體罹患肥胖、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高三酸甘油酯血症及代謝症侯群中之一或多者。 27.如態樣25之方法，其中該個體罹患肥胖、糖尿病及血脂異常中之一或多者。 28.一種治療心血管病症之方法，其包括將有效量之包含如前述態樣中任一項之抗體或片段的醫藥組合物投與至罹患心血管病症之個體。 29.如態樣28之方法，其中該個體罹患動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭及冠心病中之一或多者。 30.如態樣1至23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用作藥劑。 31.一種減輕體重之方法，其包括將有效量之包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物投與至有需要之個體。 32.一種減少食慾或食物攝取量之方法，其包括將有效量之包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物投與至有需要之個體。 33.一種降低個體中之血漿三酸甘油酯(TG)濃度或血漿總膽固醇(TC)濃度的方法，其包括將有效量之包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物投與至有需要之個體。 34.如態樣31、32或33之方法，其中該個體罹患代謝病症。 35.如態樣34之方法，其中該個體罹患以下病症之一或多者：肥胖、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症及代謝症侯群。 36.一種核酸，其編碼如前述態樣中任一項之抗體中的一或多者，或該等抗體中任一者之VL及/或VH。 37.一種核酸，其包含與表1中所述之序列相比具有至少90%一致性之序列。 38.一種核酸，其包含與表1中所述之序列相比具有至少95%一致性之序列。 39.一種核酸，其包含表1中所述之序列。 40.一種載體，其包含如態樣36、37、38或39之核酸。 41.一種宿主細胞，其包含如態樣40之載體。 42.一種包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物，其用於治療代謝病症。 43. 一種製備結合β-klotho之抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在適於表現該抗體或其片段之條件下培養如態樣41之宿主細胞的步驟。 44.如態樣42之醫藥組合物，其中該代謝病症為肥胖、糖尿病、高三酸甘油酯血症或血脂異常。 45.一種包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物，其用於治療心血管病症。 46.一種包含如態樣1至23中任一項之抗體或抗原結合片段的醫藥組合物，其用於減輕個體之體重之方法、減少個體之食慾或食物攝取量之方法、降低個體之血漿三酸甘油酯(TG)濃度或血漿總膽固醇(TC)濃度之方法。 47.一種如態樣1至23中任一項之抗體或其抗原結合片段的用途，其用於製備用於治療個體之代謝病症、用於治療個體之心血管病症、用於減輕個體之體重、用於減少個體之食慾或食物攝取量、用於降低個體之血漿三酸甘油酯(TG)濃度或血漿總膽固醇(TC)濃度之藥劑。
本申請案主張2017年2月8日申請之美國臨時申請案第62/456,609號之權益，其係以全文引用的方式併入本文中。序列表 本申請案包含已經以ASCII格式電子提交之序列表，且其係以全文引用的方式併入本文中。該ASCII副本創建於2018年1月19日，命名為PAT057578-WO-PCT_SL.txt且大小為80,531字組。 本發明係部分基於以下發現：特異性結合至β-klotho並導致FGF受體(例如，FGFR1c)之活化及FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)的活化之抗體分子。本發明係關於全IgG型抗體以及其抗原結合片段(諸如Fab片段)兩者(例如，抗體NOV005或NOV006)。 因此，本發明提供特異性結合至β-klotho (例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)之抗體、醫藥組合物、製造方法及使用此等抗體及組合物之方法。術語 除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬之技術領域的技術者通常所瞭解相同之含義。 如文中所用，術語「FGF21」係指纖維母細胞生長因子(FGF)蛋白家族之成員。FGF21之例示性胺基酸序列(GenBank寄存編號NP_061986.1)係如SEQ ID NO:1所述，其對應多核苷酸序列(NCBI參考序列號NM_019113.2)係如SEQ ID NO:2所述。 如本文所用，術語「FGF21受體」係指FGF21之受體(Kharitonenkov,A等人，(2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7；Kurosu, H等人，(2007) JBC 282:26687-26695；Ogawa, Y等人，(2007) PNAS 104:7432-7437)。 術語「FGF21多肽」係指在人類中表現之天然多肽。出於本發明之目的，可互換地使用術語「FGF21多肽」指示任何全長FGF21多肽，例如，SEQ ID NO:1，其由209個胺基酸殘基組成且其係由SEQ ID NO:2之核酸序列進行編碼；多肽之任何成熟形式，其由181個胺基酸殘基組成且其中移除全長FGF21多肽之胺基末端上的28個胺基酸殘基(即，構成信號肽)，及其變異體。 本文所用之術語「抗體」意指整個抗體及任何抗原結合片段(即，「抗原結合部分」)或其單一鏈。整個抗體為一種包括由二硫鍵交互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。各重鏈均包含一重鏈可變區(文中簡稱為VH)及一重鏈恆定區。該重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2及CH3。各輕鏈均包含一輕鏈可變區(文中簡稱為VL)及一輕鏈恆定區。該輕鏈恆定區包含一個結構域，CL。VH及VL區可進一步再分為命名為互補決定區(CDR)之高變區，其內部分散有更保守之命名為架構區(FR)的區域。各VH及VL均包含以下列順序由胺基端至羧基端排列之三個CDR及四個FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區包含一個與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)之宿主組織或因子的結合。 如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指保留特異性結合至給定抗原(例如，β-klotho)之能力之完整抗體的一或多個片段。抗體之抗原結合功能可由完整抗體之片段進行。涵蓋於術語抗體之抗原結合部分或抗原結合片段之內之結合片段的實例包括Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；F(ab)2 片段，一種包含藉由雙硫橋在鉸鏈區連接之兩個Fab片段的二價片段；由VH及CH1域組成之Fd片段；由抗體之單臂之VL及VH域組成的Fv片段；由VH域或VL域組成之單域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989 Nature 341:544-546)；及單離互補決定區(CDR)。 此外，雖然Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由單獨之基因編碼，但其等可使用重組法藉由使其等能夠成為其中VL及VH區組對形成單價分子之單一蛋白質鏈的合成連接子而連接(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如，Bird等人，1988 Science 242:423-426；及Huston等人，1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)。此等單鏈抗體包括抗體之一或多個抗原結合部分或片段。此等抗體片段係使用熟習此項技術者知曉之習知技術來獲得，並以與完整抗體相同之方式篩選有用之片段。 抗原結合片段亦可併入至單域抗體、巨型抗體、微型抗體、內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及bis-scFv (參見，例如，Hollinger及Hudson，2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136)。可將抗體之抗原結合部分接枝至基於諸如纖維連接蛋白III型(Fn3)之支架中(參見美國專利號6,703,199，其描述纖維連接蛋白多肽抗體)。 抗原結合片段可併入至包含一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)之單鏈分子，該片段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人(1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062；及美國專利號5,641,870)。 如本文所用，術語「親和力」係指在單一抗原位點上抗體與抗原之間相互作用的強度。在每個抗原位點內，抗體「臂」之可變區在許多位點上通過弱非共價力與抗原相互作用；相互作用越多，親和力越強。如本文所用，針對抗體或其抗原結合片段(例如，Fab片段)而言之術語「高親和力」通常係指抗體或抗原結合片段具有10-9 M或更低之KD。術語「胺基酸」係指天然及合成胺基酸，以及以類似於天然胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然胺基酸為彼等由遺傳密碼所編碼之胺基酸，以及彼等隨後進行修飾之胺基酸，例如，羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物係指具有與天然胺基酸相同之鹼性化學結構(即，結合至氫、羧基、胺基及R基團之α碳)的化合物，例如，高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基锍。此等類似物具有經修飾之R基團(例如，正亮胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然胺基酸相同之鹼性化學結構。胺基酸模擬物係指具有與胺基酸之一般化學結構不同之結構但以類似於天然胺基酸之方式其作用的化合物。 如本文所用，術語「結合特異性」係指個別抗體組合位點僅與一個抗原決定位反應之能力。 片語「特異性(或選擇性)結合」至抗體(例如，β-klotho結合抗體)係指確定蛋白質及其他生物製劑之異源族群中存在同源抗原(例如，人類β-klotho或食蟹獼猴β-klotho)的結合反應。片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在此與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。 術語「FGF21介導」或類似術語係指FGF21受體及/或本發明抗體在結合至β-klotho時介導細胞應答及FGF21信號傳導路徑之事實，藉此觸發多種生理效應，包括但不限於以下之一或多者的降低：血漿三酸甘油酯、血漿胰島素、血糖、食物攝取量及體重。 如本文所用，「與FGF21相關聯之病症」、「與FGF21相關聯之病狀」、「與FGF21相關聯之疾病或病狀」或類似術語係指任何數量之病狀或疾病，尋求藉由激活FGF21信號傳導路徑(例如，藉由激活FGF21受體信號傳導)來預防、診斷及/或治療該等病狀或疾病。此等可包括特徵為異常FGF21信號傳導(例如，FGF21介導之信號傳導及/或FGF21受體信號傳導的異常激活)之病狀、疾病或病症。此等病狀包括但不限於代謝、內分泌及心血管病症，諸如肥胖、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代謝症候群、急性心肌梗塞、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱、與胰島素受體中之嚴重失活突變相關聯的病症、及其他代謝病症，及降低危重患者之死亡率及發病率。 術語「2型糖尿病」係特徵為不管胰島素之可利用性而過量產生葡萄糖，且循環葡萄糖含量因葡萄糖清除不充分而導致保持過高之病狀。 「1型糖尿病」係特徵為由完全缺乏胰島素所引起之高血糖含量的病狀。當身體之免疫系統攻擊胰腺中產生胰島素之β細胞並破壞其等時，就會出現此病狀。隨後胰腺產生極少或不產生胰島素。 「胰腺炎」為胰腺之炎症。 「血脂異常」為脂蛋白代謝之失調，包括脂蛋白過度產生或缺乏。血脂異常可表現為總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇及三酸甘油酯濃度之增加、及血液中高密度脂蛋白(HDL)膽固醇濃度之降低。 「非酒精性脂肪肝炎(NASH)」為與酒精消耗無關之肝病，其特徵在於肝細胞之脂肪變化，伴有小葉內炎症及纖維化。 「葡萄糖耐受不良」或葡萄糖耐受性不良(IGT)為血糖異常之糖尿病前期狀態，其與心血管病理之風險增加相關聯。糖尿病前期病狀防止個體有效地將葡萄糖轉移之細胞中並將其用作有效的燃料源，導致血液中之葡萄糖含量升高及一定程度之胰島素抵抗。 「高血糖症」定義為血液中之糖(葡萄糖)過量。 當個體之血糖水平太低以至於無法為該個體之身體活動提供足夠的能量時發生「低血糖症」，亦稱為低血糖。 「高胰島素血症」定義為血液中之胰島素水平高於正常水平。 「胰島素抵抗」定義為其中正常量之胰島素產生低於正常之生物反應的狀態。 就人類個體而言，「肥胖」可定義為體重比給定人群之理想體重高20%以上(R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, 第904-916頁)。其亦可定義為身體質量指數(BMI，定義為個人之體重(千克)除以其身高(米)之平方(kg/m2 ))大於或等於30。 「代謝症候群」可定義為以下徵兆中至少三者之集群：腹部脂肪--於大多數人中，腰圍40英寸或更大；高血糖--空腹後為至少110毫克/分升(mg/dl)；高三酸甘油酯--血液中至少150 mg/dL；低HDL--小於40 mg/dl；及，血壓為130/85 mmHg或更高。 「高血壓(Hypertension/high blood pressure)」係全身性動脈血壓短暫或持續升高至可能導致心血管損傷或其他不良後果之水平。可將高血壓任意地定義為收縮壓高於140 mmHg或舒張壓高於90 mmHg。 「心血管疾病」為與心臟或血管相關之疾病。 「外周動脈疾病」是當斑塊在將血液輸送至頭部、器官及四肢之動脈中積聚時發生。隨時間之流逝，斑塊可硬化並使動脈變窄，此限制富氧血液流向器官及身體之其他部分。 「動脈粥樣硬化」係血管疾病，其特徵在於大型及中型動脈內膜中不規則分佈之脂質沉積物，其導致動脈管腔狹窄並最終發展為纖維化及鈣化。病灶通常係局灶性，且進展緩慢且間歇。血流受限為大多數臨床表現之原因，其隨病灶之分佈及嚴重程度而變化。 「中風」係與持續超過24小時之腦循環受損有關的任何急性臨床事件。中風涉及不可逆腦損傷，症狀之類型及嚴重程度，此取決於循環已受損之腦組織的位置及程度。 「心臟衰竭」(亦稱為充血性心臟衰竭)係其中心臟不再能夠將足夠之血液泵送至身體之其餘部位的病狀。 「冠心病」(亦稱為冠狀動脈疾病)係將血液及氧氣供應至心臟之小血管變窄。 「腎病」(Kidney disease/nephropathy)為腎臟之任何疾病。糖尿病性腎病係1型或2型糖尿病患者之發病率及死亡率的主要原因。 「糖尿病併發症」係由高血糖水平與其他身體功能(諸如腎臟、神經(神經病變)、足(足潰瘍及循環不良)及眼睛(例如視網膜病))所引起之問題。糖尿病亦增加心臟病及骨及關節病症之風險。糖尿病之其他長期併發症包括皮膚問題、消化問題、性功能障礙以及牙齒及牙齦問題。 「神經病變」係涉及腦神經或外周或自主神經系統之任何疾病。 「胃輕癱」係胃蠕動虛弱，其導致腸排空延遲。 本發明所涵蓋之危重患者通常經歷不穩定之高代謝狀態。此不穩定代謝狀態係歸因於底物代謝之變化，其可導致一些營養素之相對缺乏。一般而言，脂肪及肌肉兩者之氧化均會增加。 此外，危重患者較佳為經歷全身性炎症反應症侯群或呼吸窘迫之患者。發病率降低意指降低危重患者發展其他疾病、病狀或症狀之可能性或降低其他疾病、病狀或症狀之嚴重程度。例如，降低發病率可對應於菌血症或敗血症或與多個器官衰竭相關聯之併發症之發生率的降低。 術語「經保守性修飾之變異體」應用於胺基酸及核酸序列兩者。就特定核酸序列而言，經保守性修飾之變異體係指彼等編碼一致或基本上一致之胺基酸序列之核酸，或在核酸不編碼胺基酸序列之情況下，序列基本上一致之核酸。由於遺傳密碼之簡併性，大量功能上一致之核酸編碼任何給定蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在每個其中由密碼子指定丙胺酸之位置上，該密碼子可變為所述之對應密碼子中的任一者而不改變所編碼之多肽。此等核酸變異為「沉默變異(silent variation)」，其為保守性修飾變異中之一種。本文中編碼多肽之每個核酸序列亦描述該核酸之每種可能的沉默變異。熟習此項技術人員將認識到，核酸中之每個密碼子(除通常為甲硫胺酸之唯一密碼子的AUG，及通常為色胺酸之唯一密碼子的TGG外)均可經修飾以產生功能上一致之分子。因此，編碼多肽之核酸的每種沉默變異隱含於每個描述之序列中。 對於多肽序列而言，「經保守性修飾之變異體」包括多肽序列之個別取代、缺失或添加，其導致胺基酸經化學上相似之胺基酸取代。提供功能上相似之胺基酸的保守性取代表係此項技術中所熟知。此等經保守性修飾之變異體為本發明多型性變異體、種間同系物及等位基因之補充且不排除其等。以下八組含有彼此為保守性取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)，甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)，麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)，麩胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)，離胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)，亮胺酸(L)，甲硫胺酸(M)，纈胺酸(V)；6)***酸(F)，酪胺酸(Y)，色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)，蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)，甲硫胺酸(M)(參見，例如，Creighton, Proteins (1984))。在一些實施例中，術語「保守性序列修飾」係用於指示不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體之結合特徵的胺基酸修飾。 術語「抗原決定基」意指能夠特異性結合至抗體之蛋白質決定子。抗原決定基通常由諸如胺基酸或糖側鏈之分子的化學活性表面基團組成，且通常具有特異三維結構特徵以及特異電荷特徵。構象及非構象抗原決定基之區別在於，在變性溶劑存在下，與前者之結合丟失而與後者之結合不丟失。 如本文所用，術語「人類抗體」旨在包括具有其中架構及CDR區均衍生自人類來源之序列之可變區的抗體。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦來源於該等人類序列，例如，人類生殖系序列或人類生殖系序列之突變形式。本發明人類抗體可包含未由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由體外隨機或位點專一誘變或藉由體內體細胞突變產生之突變)。 術語「人類單株抗體」係指具有其中架構及CDR區均衍生自人類序列之可變區之展示單一結合特異性的抗體。在一實施例中，人類單株抗體係由融合瘤所產生，該融合瘤包括從具有包含融合至永生化細胞之人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因之基因組的轉殖基因非人動物(例如，轉殖基因小鼠)獲得之B細胞。 「人源化」抗體係保留非人抗體之反應性同時在人體中免疫性較低之抗體。此可(例如)藉由保留非人CDR區並用其等之人類對應物(即，恆定區以及可變區之架構部分)替換抗體之剩餘部分來實現。參見，例如，Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984；Morrison及Oi，Adv. Immunol., 44:65-92, 1988；Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536, 1988；Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991；及Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994。人類工程改造技術之其他實例包括但不限於US 5,766,886中所揭示之Xoma技術。 在兩個或更多個核酸或多肽序列的情況下，術語「一致」或百分比「一致性」係指兩個或更多個相同之序列或子序列。當如使用以下序列比較演算法中之一者或藉由人工對齊及目視檢查所量測般在比較窗口或指定區域上進行比較及對齊以獲得最大對應性時，若兩個序列具有一致(即，在指定區域上60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致性，或者當沒有指定時，在整個序列上)胺基酸殘基或核苷酸之特定百分比，則該等兩個序列係「實質上一致」。視情況地，一致性存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區域上，或更佳地存在於長度為100至500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個胺基酸)之區域上。 爲進行序列比較，通常將一個序列作為測試序列與之比較的參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列鍵入電腦，指定後續坐標(若需要)並指定序列演算程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算隨後基於該等程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。 如本文所用，「比較窗口」包括參考選自由20至600，通常約50至約200，更通常約100至約150組成之群的連續位置之數量中任一者之片段，其中，可使序列與具有相同數量之連續位置的參考序列在最佳對齊該等兩個序列後進行比較。使序列對齊用於比較之方法係在此項技術中所熟知。可(例如)藉由Smith及Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c之局部同源性演算法、藉由Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970之同源性對齊演算法、藉由Pearson及Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988之相似性搜尋方法、藉由此等演算法之電腦實現(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)、或藉由人工對齊及目視檢查(參見，例如，Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003))來進行用於比較之序列的最佳對齊。 適於測定序列一致性百分比之演算法的兩個實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其等各自描述於Altschul等人，Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977；及Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990中。用於運行BLAST分析之軟體係通過美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)可公開獲得。此演算法涉及藉由識別查詢序列中之長度為W的短詞來首先識別高評分序列對(HSP)，當與資料庫序列中之相同長度的單詞對齊時，其匹配或滿足一些正值閾值分數T。T被稱為鄰近單詞評分閾值(Altschul等人，前述)。此等初始鄰近單詞命中作為啟動搜索之種子，以尋找包含其等之更長HSP。只要可增加累積對齊分數，便使單詞命中在每個序列的兩個方向上延伸。對於核苷酸序列而言，使用參數M (匹配殘基對之獎勵得分；始終＞ 0)及N (錯配殘基之罰分；始終＜ 0)計算累積得分。對於胺基酸序列而言，使用計分矩陣來計算累積得分。在以下情況下，單詞命中向每個方向之延伸將停止：累計對齊分數比其所達到之最大值下降量X；由於一或多個負分殘基對齊之累積，累積分數變為零或低於零；或達到任一序列之端點。BLAST演算法參數W、T及X確定對齊之靈敏度及速率。BLASTN程式(用於核苷酸序列)默認使用11之字長(W)，10之期望值(E)，M=5，N=-4以及兩條鏈之比較。對於胺基酸序列而言，BLASTP程式默認使用3之字長及10之期望值(E)，而BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989)默認使用50之對齊(B)，10之預期(E)，M=5，N=‑4，以及兩條鏈之比較。 BLAST演算法亦對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見，例如，Karlin及Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993)。由BLAST演算法所提供之一種相似性量測為最小總計概率(P(N))，其提供偶然發生兩個核苷酸或胺基酸序列之間的匹配之概率的指示。例如，若測試核酸與參考核酸之比較中的最小總計概率係小於約0.2，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。 兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可以使用E. Meyers及W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)之演算法來確定，該演算法已併入至ALIGN程式(版本2.0)中，使用PAM120加權殘基表，12之空位長度罰分及4之空位罰分。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性百分比可使用Needleman及Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)演算法來確定，該演算法已併入至GCG套裝軟體(在全球資訊網之gcg.com上可獲得)之GAP程式中，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之空位加權以及1、2、3、4、5或6之長度加權。 除上述序列一致性之百分比外，兩個核酸序列或多肽係實質上一致之另一指示為由第一核酸編碼之多肽係與針對由第二核酸編碼之多肽所產生的抗體發生免疫交叉反應，如下所述。因此，多肽通常係實質上與第二多肽一致，例如，在該等兩個肽僅藉由保守性取代相異時。兩個核酸序列係實質上一致之另一指示指示為該等兩個分子或其等之補體在嚴格條件下彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列係實質上一致之又另一指示為可使用相同之引子來擴增該等序列。 術語「單離抗體」係指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如，特異性結合β-klotho之單離抗體係實質上不含特異性結合β-klotho以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合β-klotho之單離抗體具有與其他抗原的交叉反應性。而且，單離抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。 術語「同型物」係指由重鏈恆定區基因所提供之抗體類別(例如，IgM、IgE、諸如IgG1或IgG4之IgG)。同型物亦包括此等類別中之一者的修飾變型，其中已進行修飾以改變Fc功能，例如，增強或減少效應子功能或與Fc受體結合。 如本文所用，術語「kassoc 」或「ka 」旨在係指特定抗體-抗原相互作用之締合速率，而本文所用之術語「kdis 」或「kd 」旨在係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率。如本文所用，術語「KD 」旨在係指自kd 與ka 之比率(即kd /ka )所獲得之解離常數，且表示為莫耳濃度(M)。可使用本技術領域中已良好確立之方法來測定抗體之KD 值。測定抗體之KD 的方法包括使用諸如Biacore® 系統之生物感測器系統量測表面電漿子共振，或藉由溶液平衡滴定(SET)量測溶液中之親和力。 如本文所用，術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指單一分子組合物之抗體分子的製劑。單株抗體組合物展示針對特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。 術語「核酸」在本文中與術語「多核苷酸」可互換使用，且係指單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵聯的核酸，其係合成、天然及非天然的，其具有與參考核酸相似之結合特性，且其以類似於參考核苷酸之方式進行代謝。此等類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、磷酸甲酯、對掌性-磷酸甲酯、2-O-核糖核苷酸甲酯、肽-核酸(PNA)。 除非另外指出，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守性修飾之變異體(例如，簡併密碼子取代)及互補序列，以及明確指示之序列。如下詳述，具體而言，可藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列來實現簡併密碼子取代(Batzer等人Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994)。 術語「以操作方式連接」係指兩個或更多個多核苷酸(例如，DNA)片段之間的功能關係。通常，該術語係指轉錄調節序列與轉錄序列的功能關係。例如，若啟動子或增強子序列在合適之宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則其係與該編碼序列以操作方式連接。一般而言，與轉錄序列以操作方式連接之啟動子轉錄調控序列係在物理上與轉錄序列連續，即，其等係順式作用。然而，一些轉錄調控序列(諸如增強子)不必係在物理上與其等增強轉錄之編碼序列連續或位於附近。 如本文所用，術語「最佳化」意指核苷酸序列經改變以使用較佳係在生產細胞或生物體(通常真核細胞，例如，畢赤酵母細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中之密碼子編碼胺基酸序列。最佳化之核苷酸序列係經工程改造以完全或儘可能多地保留最初由亦被稱為「親本」序列之起始核苷酸序列所編碼之胺基酸序列。本文之最佳化之序列係經工程改造以具有較佳在在哺乳動物細胞中之密碼子。然而，本文亦設想此等序列在其他真核細胞或原核細胞中之最佳化表現。由最佳化之核苷酸序列所編碼之胺基酸序列亦稱為最佳化的。 術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以係指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於其中一或多個胺基酸殘基係對應天然胺基酸，以及天然胺基酸聚合物及非天然胺基酸聚合物之人造化學模擬物的胺基酸聚合物。除非另有說明，否則特定多肽序列亦隱含地涵蓋其經保守性修飾之變異體。 如本文所用，術語「重組人類抗體」包括所有藉由重組方式製備、表現、產生或單離的人類抗體，諸如由針對人類免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉殖染色體的動物或由其製備之融合瘤單離的抗體、由經轉形以表現人類抗體之宿主細胞，例如由轉染瘤單離的抗體、由重組、組合人類抗體庫單離的抗體，及藉由涉及將全部或一部分人類免疫球蛋白基因、序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式所製備、表現、產生或單離的抗體。該等重組人類抗體具有架構及CDR區均源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可進行體外誘變(或當使用針對人類Ig序列轉殖基因之動物時，活體內體細胞誘變)及因此重組抗體之VH及VL區的胺基酸序列為該序列：雖然源於人類生殖系VH及VL序列及與之相關，其不天然存在於活體內人類抗體生殖系基因譜中。 術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指其中引入重組表現載體之細胞。應瞭解，此等術語旨在不僅係指特定個體細胞，亦係指此細胞之後代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而在繼代中發生，所以此等後代可實際上不與親本細胞一致，但仍包含於本文所用術語「宿主細胞」之範圍內。 術語「個體」包括人類及非人動物。非人動物包括所有脊椎動物(例如，哺乳動物及非哺乳動物)，諸如非人靈長類動物(例如：食蟹獼猴)、綿羊、狗、乳牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除註明外，術語「患者」或「個體」在本文中可互換使用。如本文所用，術語「食蟹獼猴(cyno/cynomolgus)」係指食蟹獼猴(cynomolgus monkey)(馬來猴(Macaca fascicularis ))。 如本文所用，在一實施例中，術語「治療」任何疾病或病症(例如，與FGF21相關聯之病症)係指改善該疾病或病症(即，減緩或阻止或減少該疾病或其臨床症狀中之至少一者的發展)。在另一實施例中，「治療」係指緩解或改善至少一種物理參數(包括彼等無法被患者識別的參數)。在又另一實施例中，「治療」係指在物理(例如，可識別症狀之穩定化)、生理(例如，物理參數之穩定化)或兩者上調控該疾病或病症在又另一實施例中，「治療」係指預防該疾病或病症或延緩該疾病或病症的出現或發展或進展。 當涉及本文所述之適應症(包括，例如，與FGF21相關聯之病症)時，「預防」意指如下所述在具有與FGF21相關聯之疾病參數之惡化風險的患者中防止或減緩(例如)該惡化之任何作用。 術語「載體」旨在係指能夠運輸與其連接之另一多核苷酸的多核苷酸分子。載體之一種類型為「質體」，其係指其中可連接額外DNA片段之環狀雙鏈DNA環。載體之另一種類型為病毒載體，諸如腺相關病毒載體(AAV或AAV2)，其中額外DNA區段可連接至該病毒基因組中。某些載體能夠在其等所引入之宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點及附加型哺乳動物載體之細菌載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可在引入至宿主細胞時整合至該宿主細胞之基因組中，並藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導其等以操作方式連接之基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。 一般而言，用於重組DNA技術之表現載體通常係以質體之形式存在。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用，因為質體為最常用之載體形式。然而，本發明旨在包括此等其他形式之表現載體，諸如具有等同功能之病毒載體(例如，複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。 如本文所用，「FGF21活性之調節」係指FGF21活性之增加或減少，其可為(例如)藥劑與FGF21多核苷酸或多肽之相互作用、FGF21信號傳導路徑之活化及/或FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)的活化等之結果。例如，生物活性之調節係指生物活性之增加或減少。FGF21活性可藉由包括(但不限於)分析法個體中之血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇水平；藉由評估β-klotho及/或FGF受體(例如，FGFR-1c)之多肽水平；或藉由評估FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)之活化的方式來評估。 FGF21活性之比較亦可藉由(例如)量測FGF21下游生物標記之水平及量測FGF21信號傳導之增加來實現。活性亦可藉由量測以下來評估：細胞信號傳導；激酶活性；脂肪細胞之葡萄糖攝入量；血液胰島素、三酸甘油酯或膽固醇水平波動；肝臟脂質或肝臟三酸甘油酯水平變化；FGF21及/或β-klotho與FGF21受體之間之相互作用；或FGF21受體之磷酸化。在一些實施例中，FGF21受體之磷酸化可為酪胺酸磷酸化。在一些實施例中，FGF21活性之調節可引起FGF21相關表型之調節。 如本文所用，「FGF21下游生物標記」為基因或基因產物，或基因或基因產物之可量測標記。在一些實施例中，作為FGF21之下游標記的基因或活性呈現經改變之表現水平，或在血管組織中之水平。在一些實施例中，下游標記之活性在FGF21調節劑的存在下改變。在一些實施例中，當FGF21經本發明FGF21調節劑干擾時，下游標記呈現經改變之表現水平。FGF21下游標記包括(但不限於)葡萄糖或2-脫氧葡萄糖攝取量、pERK及其他磷酸化或乙醯化蛋白或NAD水平。 如本文所用，術語「上調」係指活性或數量之增加、激活或刺激。例如，在本發明背景下，FGF21調節劑可增加β-klotho及/或FGF21受體之活性。在一實施例中，FGFR-1c可響應FGF21調節劑而上調。上調亦可係指FGF21相關活性，諸如例如，降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇水平；降低肝臟脂質或三酸甘油酯水平；減輕體重；改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性；或引起FGF21受體之磷酸化；或增加FGF21下游標記之能力。FGF21受體可為β-klotho及FGFR-1c。上調可為與對照相比至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少400%或至少500%。 如本文所用，術語「調節劑」係指調節與FGF21相關病症(諸如1型或2型糖尿病或如肥胖之代謝病狀)相關聯之一或多種生理或生化事件的組合物。該等事件包括但不限於降低血糖、胰島素、三酸甘油酯或膽固醇水平；降低肝臟脂質或肝臟三酸甘油酯水平；減輕體重；改良葡萄糖耐受性、能量消耗或胰島素敏感性之能力。FGF21 蛋白 本發明提供如本文所定義可誘導FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體介導之信號傳導)的FGF21模擬抗體(例如，與β-klotho結合之單株抗體)。在活體內，FGF21之成熟形式為該分子之活性形式。例示性人類FGF21野生型序列具有NCBI參考序列號NP_061986.1，且可在諸如(例如) US 6,716,626B1之發證專利中找到，如下 (SEQ ID NO:1)所述。
Figure 02_image001
Figure 02_image003
編碼全長FGF21多肽(NCBI參考序列號NM_019113.2)之對應mRNA序列係如下 (SEQ ID NO:2)所示
Figure 02_image005
Figure 02_image007
成熟FGF21序列缺少前導序列，且亦可包括多肽之其他修飾，諸如胺基末端(具有或無前導序列)及/或羧基末端之蛋白水解加工、較小多肽自較大前體之裂解、N-連接及/或O-連接之醣基化、及熟習此項技術者理解之其他轉譯後修飾。成熟FGF21序列之代表性實例具有以下序列(SEQ ID NO:53，其表示全長FGF21蛋白序列(NCBI參考序列號NP_061986.1)之胺基酸位置29至209)：
Figure 02_image009
Figure 02_image011
編碼成熟FGF21多肽(SEQ ID NO:53)之對應cDNA序列係如下所示(SEQ ID NO:63)：
Figure 02_image013
Figure 02_image015
FGF21 模擬抗體及抗原結合片段 本發明提供特異性結合至β-klotho (例如，人類β-klotho)之抗體。在一些實施例中，本發明提供特異性結合至人類及食蟹獼猴β-klotho之抗體。本發明抗體包括(但不限於)如實例中所述般進行單離之人類單株抗體及Fab。 β-klotho野生型序列具有NCBI參考序列號NP_783864.1，且可在諸如Xu等人，(2007) J Biol Chem. 282(40):29069-72及Lin等人，(2007) J Biol Chem. 282(37):27277-84之文獻中找到。編碼人類β-klotho之全長cDNA具有GenBank寄存編號NM_175737。蛋白質序列係如下(SEQ ID NO:52)。
Figure 02_image017
本發明提供特異性結合β-klotho蛋白(例如，人類及/或食蟹獼猴β-klotho)且能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體及其抗原結合片段，其中該抗體係描述於表1中，例如，NOV005或NOV006。在特定態樣中，本文所提供之特異性結合β-klotho蛋白(例如，人類及/或食蟹獼猴β-klotho)且能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體及其抗原結合片段不為表2中所述之抗體，例如，NOV001、NOV002、NOV003或NOV004。表2中所述之抗體業經描述於2016年8月2日申請之PCT國際專利申請案號PCT/IB2016/054660中，其係以全文引用之方式併入本文中。 本發明提供特異性結合β-klotho蛋白(例如，人類及/或食蟹獼猴β-klotho)之抗體，其中該等抗體包含具有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的VH域。本發明亦提供特異性結合至β-klotho蛋白之抗體，其中該等抗體包含具有下文表1中所列之VH CDR中任一者之胺基酸序列的VH CDR。特定言之，本發明提供特異性結合至β-klotho蛋白(例如，人類及/或食蟹獼猴β-klotho)之抗體，其中該等抗體包含(或可選地，由以下組成)一個、兩個、三個或更多個具有下文表1中所列之VH CDR中任一者之胺基酸序列的VH CDR。 本發明提供特異性結合至β-klotho蛋白之抗體，該等抗體包含具有SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列的VL域。本發明亦提供特異性結合至β-klotho蛋白(例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)之抗體，該等抗體包含具有下文表1中所列之VL CDR中任一者之胺基酸序列的VL CDR。特定言之，本發明提供特異性結合至β-klotho蛋白(例如，人類及/或食蟹獼猴β-klotho)之抗體，該等抗體包含(或可選地，由以下組成)一個、兩個、三個或更多個具有下文表1中所列之VL CDR中任一者之胺基酸序列的VL CDR。 本發明之其他抗體包括已突變但仍在CDR區中具有與表1中所述之序列中所描繪的CDR區至少60、70、80、85、90或95%之一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括突變型胺基酸序列，其中當與表1中所述之序列中所描繪的CDR區相比時，CDR區中突變之胺基酸不超過1、2、3、4或5個。 本發明亦提供核酸分子或多核苷酸，其等包含編碼特異性結合至β-klotho蛋白(例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)之抗體之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈的核酸序列。此等核酸序列可最佳化以在哺乳動物細胞中表現(例如，表1顯示本發明抗體之重鏈及輕鏈的最佳化核酸序列)。表 1.FGF21 模擬抗體及 Fab 之實例
Figure AA1
Figure AA1-1
Figure AA1-2
Figure AA1-3
Figure AA1-4
Figure AA1-5
Figure AA1-6
Figure AA1-7
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Figure AA1-10
 表 2 ： FGF21 模擬抗體
Figure AA2
Figure AA2-1
Figure AA2-2
Figure AA2-3
Figure AA2-4
Figure AA2-5
 本發明之其他抗體包括彼等其中之胺基酸或編碼胺基酸之核酸已突變但仍具有與表1中所述之序列至少60、65、70、75、80、85、90或95%之一致性的抗體。一些實施例包括突變型胺基酸序列，其中當與表1中所述之序列中所描繪的可變區相比時，可變區中突變之胺基酸不超過1、2、3、4或5個，同時保留大體上相同之結合活性。 本發明之其他抗體包括彼等其中之胺基酸或編碼胺基酸之核酸已突變但仍具有與表1中所述之序列至少60、65、70、75、80、85、90或95%之一致性的抗體。一些實施例包括突變型胺基酸序列，其中當與表1中所述之序列中所描繪的可變區相比時，可變區中突變之胺基酸不超過1、2、3、4或5個，同時保留大體上相同之結合活性。 因為此等抗體中每一種均可與β-klotho結合，所以可「混合並匹配」VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)以產生本發明之其他結合β-klotho之抗體。可使用本技術領域中已知之結合分析法(例如，ELISA，及實例部分中所述之其他分析法)來測試此等經「混合並匹配」之β-klotho結合抗體。當混合並匹配此等鏈時，來自特定VH/VL配對之VH序列應使用結構上相似之VH序列來替換。同樣地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應使用結構上相似之全長重鏈序列來替換。同樣地，來自特定VH/VL配對之VL序列應使用結構上相似之VL序列來替換。同樣地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應使用結構上相似之全長輕鏈序列來替換。 因此，在一態樣中，本發明提供單離抗體(例如單株抗體)或其抗原結合區，其具有：包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變域，及包含SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列的輕鏈可變域，其中該抗體特異性結合至β-klotho (例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)。 在另一態樣中，本發明提供(i)單離抗體，其具有：包含針對在哺乳動物細胞中表現最佳化之SEQ ID NO: 17之胺基酸序列的全長重鏈，及包含針對在哺乳動物細胞中表現最佳化之SEQ ID NO: 28或34之胺基酸序列的全長輕鏈；或(ii)包含其抗原結合部分之功能性蛋白質。更具體言之，在某些態樣中，本發明提供單離抗體或其抗原結合區域，其包含各自包含選自SEQ ID NO: 17及28；或17及34之胺基酸序列的重鏈及輕鏈。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或片段包含含有SEQ ID NO:15之胺基酸序列或具有與之相比至少90%或95%一致性之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)；及包含SEQ ID NO:26或32之胺基酸序列或具有與之相比至少90%或95%一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或片段包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的VH。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或片段包含含有SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列的VL。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或片段包含(i)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列的VL，或(ii)包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的VL。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的輕鏈，或(ii)包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列的輕鏈。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或抗原結合片段不包含如表2中所述之抗體NOV004的Combined或Kabat CDR。 如本文所用，術語「互補決定區」及「CDR」係指賦予抗原特異性及結合親和力之在抗體可變區內的胺基酸序列。一般而言，每個重鏈可變區中有三個CDR (HCDR1、HCDR2、HCDR3)，且每個輕鏈可變區中有三個CDR (LCDR1、LCDR2、LCDR3)。 給定CDR之精確胺基酸序列邊界可使用許多熟知方案之任一者輕易地確定，該等方案包括彼等由Kabat等人(1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人，(1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)；及ImMunoGenTics (IMGT) numbering (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P.等人，Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (「IMGT」編號方案)。例如，對於經典格式而言，在Kabat下，重鏈可變域(VH)中之CDR胺基酸殘基經編號為31至35 (HCDR1)、50至65 (HCDR2)及95至102 (HCDR3)；及輕鏈可變域(VL)中之CDR胺基酸殘基經編號為24至34 (LCDR1)、50至56 (LCDR2)及89至97 (LCDR3)。在Chothia下，VH中之CDR胺基酸經編號為26至32 (HCDR1)、52至56 (HCDR2)及95至102 (HCDR3)；且VL中之胺基酸殘基經編號為26至32 (LCDR1)、50至52 (LCDR2)及91至96 (LCDR3)。藉由組合Kabat及Chothia之CDR定義，該等CDR係由人類VL中之胺基酸殘基26至35 (HCDR1)、50至65 (HCDR2)及95至102 (HCDR3)及胺基酸殘基24至34 (LCDR1)、50至56 (LCDR2)及89至97 (LCDR3)組成。在IMGT下，VH中之CDR胺基酸殘基經編號約為26至35 (CDR1)、51至57 (CDR2)及93至102 (CDR3)，且VL中之CDR胺基酸殘基經編號約為27至32 (CDR1)、50至52 (CDR2)及89至97 (CDR3)(根據「Kabat」進行編號)。在IMGT下，可使用程式IMGT/DomainGap Align來確定抗體之CDR區。藉由組合Kabat及Chothia之CDR定義，該等「Combined」CDR可係由人類VL中之胺基酸殘基26至35 (HCDR1)、50至65 (HCDR2)及99至108 (HCDR3)及胺基酸殘基24至39 (LCDR1)、55至61 (LCDR2)及94至102 (LCDR3)組成。在另一態樣中，本發明提供β-klotho結合抗體，其包含表1中所述之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合。在特定態樣中，使用Kabat系統描繪此等CDR。在另一特定態樣中，使用Combined系統描繪此等CDR。 考慮到此等抗體中之每一種均可與β-klotho結合及抗原結合特異性係主要由CDR1、2及3區提供，因此可「混合並匹配」VH CDR1、2及3序列以及VL CDR1、2及3序列(即，可混合並匹配來自不同抗體之CDR，雖然每個抗體較佳含有VH CDR1、2及3以及VL CDR1、2及3以產生本發明之其他β-klotho結合分子。可使用本技術領域中已知之結合分析法及實例中所述之彼等(例如，ELISA、SET、Biacore®結合分析法)來測試此等經「混合並匹配」之β-klotho結合抗體。當混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應使用結構上相似之CDR序列來替換。同樣地，當混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應使用結構上相似之CDR序列來替換。一般技術者將輕易明瞭，可藉由使用與本文針對本發明單株抗體所示之CDR序列結構上相似之序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列來產生新穎之VH及VL序列。除上述以外，在一實施例中，本文所述抗體之抗原結合片段可包含VH CDR1、2及3或VL CDR1、2及3，其中該片段結合至β-klotho作為單一可變域。 在本發明之某些實施例中，該等抗體或其抗原結合片段可具有表1中所述之Fab的重鏈及輕鏈序列。更具體言之，該抗體或其抗原結合片段可具有Fab NOV005或NOV006之重鏈及輕鏈序列。 在本發明之某些實施例中，特異性結合β-klotho之抗體或抗原結合片段包含Fab NOV005或NOV006之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3，以及Fab NOV005或NOV006之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3，例如，如表1所示。 在本發明之其他實施例中，特異性結合β-klotho之抗體或抗原結合片段包含如由Kabat所定義及表1中所述之重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2、及輕鏈可變區CDR3。在本發明之其他實施例中，特異性結合β-klotho之抗體或抗原結合片段包含如由Chothia所定義及表1中所述之重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2、及輕鏈可變區CDR3。在本發明之其他實施例中，特異性結合β-klotho之抗體或抗原結合片段包含如由Combined Kabat及Chothia所定義及表1中所述之重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2、及輕鏈可變區CDR3。在本發明之其他實施例中，特異性結合β-klotho之抗體或抗原結合片段包含如由IMGT所定義及表1中所述之重鏈可變區CDR1、重鏈可變區CDR2、重鏈可變區CDR3、輕鏈可變區CDR1、輕鏈可變區CDR2、及輕鏈可變區CDR3。 在某些實施例中，本發明包括如表1所述之特異性結合至β-klotho的抗體或抗原結合片段，例如，抗體NOV005或NOV006。在一較佳實施例中，結合β-klotho並激活FGF21受體複合物之抗體或抗原結合片段為Fab NOV005或NOV006。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (i)包含SEQ ID NO:6、9、10或12之胺基酸序列的重鏈CDR1 (HCDR1)； (ii)包含SEQ ID NO:7、11或13之胺基酸序列的重鏈CDR2 (HCDR2)； (iii)包含SEQ ID NO:8或14之胺基酸序列的重鏈CDR3 (HCDR3)； (iv)包含SEQ ID NO:19、31、22或25之胺基酸序列的輕鏈CDR1 (LCDR1)； (v)包含SEQ ID NO:20或23之胺基酸序列的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及 (vi)包含SEQ ID NO:21或24之胺基酸序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (i)包含SEQ ID NO:6、9、10或12之胺基酸序列的重鏈CDR1 (HCDR1)； (ii)包含SEQ ID NO:7、11或13之胺基酸序列的重鏈CDR2 (HCDR2)； (iii)包含SEQ ID NO:8或14之胺基酸序列的重鏈CDR3 (HCDR3)； (iv)包含SEQ ID NO:31、22或25之胺基酸序列的輕鏈CDR1 (LCDR1)； (v)包含SEQ ID NO:20或23之胺基酸序列的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及 (vi)包含SEQ ID NO:21或24之胺基酸序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含： (i)包含SEQ ID NO:6、9、10或12之胺基酸序列的重鏈CDR1 (HCDR1)； (ii)包含SEQ ID NO:7、11或13之胺基酸序列的重鏈CDR2 (HCDR2)； (iii)包含SEQ ID NO:8或14之胺基酸序列的重鏈CDR3 (HCDR3)； (iv)包含SEQ ID NO:19、31、22或25之胺基酸序列的輕鏈CDR1 (LCDR1)； (v)包含SEQ ID NO:20或23之胺基酸序列的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及 (vi)包含SEQ ID NO:21或24之胺基酸序列的輕鏈CDR3 (LCDR3)。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： (i)該HCDR1包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列；或 (ii)該HCDR1包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中： 該HCDR1包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，及該LCDR3包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含CDR LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO: 19或31之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的LCDR2，包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的LCDR3。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段包含含有CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3之VH及包含CDR LCDR1、LCDR2及LCDR3之VL，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO: 19或31之胺基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的LCDR2，包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的LCDR3。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或片段增加β-klotho及/或FGFR1c之活性。在特定態樣中，該抗體或其片段增加β-klotho及/或FGFR1c之活性至少約10%或20%，例如如藉由磷酸-ERK活性所測定。在特定態樣中，該抗體或其片段增加β-klotho及/或FGFR1c之活性至少約30%或40%，例如如藉由磷酸-ERK活性所測定。在特定態樣中，該抗體或其片段增加β-klotho及/或FGFR1c之活性至少約50%或60%，例如如藉由磷酸-ERK活性所測定。在特定態樣中，該抗體或其片段增加β-klotho及/或FGFR1c之活性至少約70%或80%，例如如藉由磷酸-ERK活性所測定。在特定態樣中，該抗體或其片段增加β-klotho及/或FGFR1c之活性至少約90%或95%，例如如藉由磷酸-ERK活性所測定。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或抗原結合片段以小於或等於500 pM或450 pM之KD 結合至人類β-klotho蛋白，例如如藉由BIACORE™結合分析法所測定。在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或抗原結合片段以小於或等於450 pM或400 pM之KD 結合至人類β-klotho蛋白，例如如藉由BIACORE™結合分析法所測定。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或抗原結合片段以小於或等於10 pM或20 pM之KD 結合至人類β-klotho蛋白，例如如藉由BIACORE™結合分析法所測定。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該β-klotho之抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986的一或多個胺基酸。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689的一或多個胺基酸。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或抗原結合片段保護人類β-klotho (SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986的一或多個胺基酸，如藉由氫-氘交換(HDx)所測定。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或抗原結合片段保護β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689的一或多個胺基酸。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或片段不接觸人類β-klotho (SEQ ID NO: 52)之殘基701 (Tyr)或703 (Arg)。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以(例如)小於或等於50 nM之EC50激活人類FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以(例如)小於或等於100 nM之EC50激活人類FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以(例如)小於或等於40 nM或30 nM之EC50激活人類FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以(例如)小於或等於50 nM之EC50激活人類FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測，且其中該抗體或其抗原結合片段不能夠激活FGFR2c-β-klotho受體複合物、FGFR3c-β-klotho受體複合物及/或FGFR4-β-klotho受體複合物。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以小於或等於50 nM之EC50激活食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以小於或等於40 nM或30 nM之EC50激活食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，單株抗體)或其抗原結合片段，其結合至β-klotho之抗原決定基並誘導FGF21受體複合物(例如，FGFR1c-β-klotho受體複合物)之活性，其中該抗體或其抗原結合片段能夠以小於或等於20 nM之EC50激活食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物，如藉由pERK細胞分析法所量測。如本文所用，若抗體之可變區或全長鏈係自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統獲得，則該人類抗體包含「衍生自」特定生殖系序列或為「其產物」之重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。此等系統包括使用所關注之抗原使攜帶人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫或使用所關注之抗原篩選顯示於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因庫。「衍生自」人類生殖系免疫球蛋白序列或為「其產物」之人類抗體可藉由比較人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列並選擇在序列上與人類抗體之序列最接近(即，最大%一致性)之人類生殖系免疫球蛋白序列來確認。 「衍生自」特定人類生殖系免疫球蛋白序列或為「其產物」之人類抗體可含有與生殖系序列相比之胺基酸差異，歸因於(例如)天然體細胞突變或有意引入之定點突變。然而，在VH或VL架構區中，所選人類抗體通常在胺基酸序列上與由人類生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如，鼠類生殖系序列)相比時確認人類抗體為人類之胺基酸殘基。在某些情況中，人類抗體可在胺基酸序列上與由該生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%、或至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。 通常，重組人類抗體將在VH或VL架構區中顯示與由人類生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列不超過10個之胺基酸差異。在某些情況中，人類抗體可顯示與由該生殖系免疫球蛋白基因所編碼之胺基酸序列不超過5個、或甚至不超過4個、3個、2個或1個之胺基酸差異。人類生殖系免疫球蛋白基因之實例包括但不限於下文所述之可變域生殖系片段，以及DP47及DPK9。同源抗體 在又另一實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含與表1中所述之序列同源的胺基酸序列，且該抗體結合至β-klotho蛋白(例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)，並保留表1中所述之彼等抗體的所需功能特性(例如，激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性及/或FGF21之一或多種活性)。 例如，本發明提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其功能性抗原結合片段，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，其中該重鏈可變域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少80%、至少90%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致的胺基酸序列；該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列至少80%、至少90%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致的胺基酸序列；其中該抗體特異性結合至β-klotho (例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)並誘導β-klotho之活性，且其中該重鏈可變域不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 43或55之胺基酸序列)且該輕鏈可變區不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 47或57之胺基酸序列)。在本發明之某些態樣中，該等重鏈及輕鏈序列進一步包含如由Kabat所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。在本發明之某些其他態樣中，該等重鏈及輕鏈序列各自進一步包含如由Chothia所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。在本發明之某些其他態樣中，該等重鏈及輕鏈序列各自進一步包含如由Combined所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。在本發明之某些其他態樣中，該等重鏈及輕鏈序列各自進一步包含如由IMGT所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。 例如，本發明提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其功能性抗原結合片段，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，其中該重鏈可變域包含與SEQ ID NO: 15之胺基酸序列至少80%、至少90%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致的胺基酸序列；該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列至少80%、至少90%、95%、96%、97%、98%或至少99%一致的胺基酸序列；其中該抗體特異性結合至β-klotho (例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)，且其中該重鏈可變域不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 43或55之胺基酸序列)且該輕鏈可變區不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 47或57之胺基酸序列)。在本發明之某些態樣中，該等重鏈及輕鏈序列進一步包含如由Kabat所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。在本發明之某些其他態樣中，該等重鏈及輕鏈序列進一步包含如由Chothia所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。在本發明之某些其他態樣中，該等重鏈及輕鏈序列進一步包含如由Combined所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。在本發明之某些其他態樣中，該等重鏈及輕鏈序列進一步包含如由IMGT所定義之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，例如如表1中所述。 在其他實施例中，該VH及/或VL胺基酸序列可係與表1中所述之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，其中該重鏈可變域不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 43或55之胺基酸序列)且該輕鏈可變區不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 47或57之胺基酸序列)。在其他實施例中，除在不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置上之胺基酸取代外，該VH及/或VL胺基酸序列可係一致。具有與表1所述之彼等抗體的VH及VL區具有高(即，80%或更大)一致性之VH及VL區的抗體可各自藉由誘變(例如，定點誘變或PCR介導誘變)編碼SEQ ID NO: 10、30、50或70及SEQ ID NO: 20、40、60或80之核酸分子來獲得，其後接著使用本文所述之功能分析法法測試所編碼之變異抗體的保留功能，其中該重鏈可變域不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 43或55之胺基酸序列)且該輕鏈可變區不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 47或57之胺基酸序列)。在其他實施例中，該全長重鏈及/或全長輕鏈胺基酸序列可係與表1中所述之序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，其中該重鏈不包含表2中所述之重鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 45、56、59或61之胺基酸序列)且該輕鏈不包含表2中所述之輕鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 49、58、60或62之胺基酸序列)。具有與SEQ ID NO: 17之全長重鏈及SEQ ID NO: 28或34之全長輕鏈具有高(即，80%或更大)一致性之全長重鏈及全長輕鏈的抗體可藉由誘變(例如，定點誘變或PCR介導誘變)編碼此等多肽之核酸分子來獲得，其後接著使用本文所述之功能分析法法測試所編碼之變異抗體的保留功能，其中該重鏈不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 45、56、59或61之胺基酸序列)且該輕鏈不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 49、58、60或62之胺基酸序列)。具有與SEQ ID NO: 17之全長重鏈及SEQ ID NO: 28或34之全長輕鏈具有高(即，80%或更大)一致性之全長重鏈及全長輕鏈的抗體可藉由誘變(例如，定點誘變或PCR介導誘變)編碼此等多肽之核酸分子來獲得，其後接著使用本文所述之功能分析法法測試所編碼之變異抗體的保留功能，其中該重鏈不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 45、56、59或61之胺基酸序列)且該輕鏈不包含表2中所述之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 49、58、60或62之胺基酸序列)。 在其他實施例中，該全長重鏈及/或全長輕鏈核酸序列可係與表1中所述之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，其中該重鏈不包含表2中所述之重鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 45、56、59或61之胺基酸序列)且該輕鏈不包含表2中所述之輕鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 49、58、60或62之胺基酸序列)。 在其他實施例中，該重鏈之可變區及/或該輕鏈之可變區核酸序列可係與表1中所述之序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，其中該重鏈不包含表2中所述之重鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 45、56、59或61之胺基酸序列)且該輕鏈不包含表2中所述之輕鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 49、58、60或62之胺基酸序列)。 如本文所用，考慮到爲了兩個序列之最佳對齊需要引入之空位的數量及各空位的長度，該等兩個序列之間的百分比一致性為該等序列共有之一致位置之數目的函數(即，一致性%=一致位置之數量/位置之總數×100)。序列之比較及兩個序列之間之百分比一致性的測定可使用數學演算法來完成，如下文之非限制性實例中所述。 此外或替代地，本發明蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」來進行針對公共資料庫之搜索以(例如)識別相關序列。例如，可使用Altschul等人，1990 J.Mol. Biol. 215:403-10之BLAST程式(版本2.0)進行此等搜索。具有保守性修飾之抗體 在某些實施例中，本發明抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中此等CDR序列之一或多者具有基於本文所述之抗體或其保守性修飾的指定胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明β-klotho結合抗體之所需功能特性。 因此，本發明提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其係由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：該重鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 6及其保守性修飾組成之群；該重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 7及其保守性修飾組成之群；該重鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 8及其保守性修飾組成之群；該輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 19及31及其保守性修飾組成之群；該輕鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 20及其保守性修飾組成之群；該輕鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 21及其保守性修飾組成之群；且該抗體或其抗原結合片段特異性結合至β-klotho。 因此，本發明提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其係由包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區組成，其中：該重鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 6、9、10及12及其保守性修飾組成之群；該重鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 7、11及13及其保守性修飾組成之群；該重鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 8及14及其保守性修飾組成之群；該輕鏈可變區CDR1胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 19、31、22及25及其保守性修飾組成之群；該輕鏈可變區CDR2胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 20及23及其保守性修飾組成之群；該輕鏈可變區CDR3胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 21及24及其保守性修飾組成之群；且該抗體或其抗原結合片段特異性結合至β-klotho。 在一態樣中，本發明提供針對在哺乳動物細胞中表現最佳化之單離抗體，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有選自由SEQ ID NO: 15及其保守性修飾組成之群的胺基酸序列；且該全長輕鏈具有選自由SEQ ID NO: 26及32及其保守性修飾組成之群的胺基酸序列；且該抗體特異性結合至β-klotho (例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)，且其中該重鏈可變區不包含表2中所述之重鏈可變區胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 43或55之胺基酸序列)且該輕鏈可變區不包含表2中所述之輕鏈可變區胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 47或57之胺基酸序列)。 在其他實施例中，本發明抗體係針對在哺乳動物細胞中表現最佳化，其具有全長重鏈序列及全長輕鏈序列，其中此等序列之一或多者具有基於本文所述之抗體或其保守性修飾的指定胺基酸序列，且其中該等抗體保留本發明β-klotho結合抗體之所需功能特性。因此，本發明提供針對在哺乳動物細胞中表現最佳化之單離抗體，其係由全長重鏈及全長輕鏈組成，其中該全長重鏈具有選自由SEQ ID NO: 17及其保守性修飾組成之群的胺基酸序列；且該全長輕鏈具有選自由SEQ ID NO: 28及34及其保守性修飾組成之群的胺基酸序列；且該抗體特異性結合至β-klotho (例如，人類及食蟹獼猴β-klotho)，且其中該重鏈不包含表2中所述之重鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 45、56、59或61之胺基酸序列)且該輕鏈不包含表2中所述之輕鏈胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 49、58、60或62之胺基酸序列)。結合至相同抗原決定基或競爭結合至相同抗原決定基之抗體 本發明提供結合至與表1中所述之β-klotho結合抗體(例如，NOV005或NOV006)相同之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)。在特定態樣中，此等抗體及抗原結合片段係能夠增加β-klotho及FGFR1c之活性。因此，可基於其在β-klotho結合分析法中(諸如彼等在實例中所述者)與本發明之其他抗體競爭(例如，以統計學顯著之方式競爭性抑制其結合)的能力來識別額外抗體。測試抗體抑制本發明抗體與β-klotho蛋白結合之能力證實該測試抗體可與彼抗體競爭結合β-klotho；根據非限制性理論，此等抗體可結合至與與其競爭之抗體相同或相關(例如，結構上相似或空間上接近)之β-klotho蛋白上的抗原決定基。在某些實施例中，結合至與本發明抗體相同之β-klotho上之抗原決定基的抗體為人類單株抗體。此等人類單株抗體可如本文所述般進行製備並單離。如本文所用，當在等莫耳濃度之競爭抗體的存在下，競爭抗體抑制本發明抗體或抗原結合片段之β-klotho結合超過50% (例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%)時，抗體「競爭」結合。在某些實施例中，結合至與本發明抗體相同之β-klotho上之抗原決定基的抗體為人源化單株抗體。此等人源化單株抗體可如本文所述般進行製備並單離。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體NOV005或NOV006相同之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體相同之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體相同之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體相同之抗原決定基的抗體，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體NOV005或NOV006重疊之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體重疊之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體重疊之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供結合至與β-klotho結合抗體重疊之抗原決定基的抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO: 52)之殘基246至265中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基536至550中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基834至857中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基959至986中的一或多個胺基酸。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的兩個或更多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的三個或更多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986的胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗原決定基包含來自以下各段胺基酸殘基之至少一個胺基酸殘基：β-klotho序列(SEQ ID NO: 52)之246至265、536至550、834至857及959至986。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之一或多個抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之一或多個抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基696至700中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之一或多個抗原決定基的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至689中的一或多個胺基酸。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之一或多個抗原決定基(例如，不連續抗原決定基)的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689中的一個、或兩個、或三個、或四個、或五個或更多個胺基酸。在某些態樣中，本文提供結合至β-klotho之兩個或更多個抗原決定基(例如，不連續抗原決定基)的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之三個或更多個抗原決定基(例如，不連續抗原決定基)的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689中的一或多個胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之三個或更多個抗原決定基(例如，不連續抗原決定基)的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689中的胺基酸。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之三個或更多個抗原決定基(例如，不連續抗原決定基)的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該等抗原決定基包含來自以下胺基酸殘基範圍中各者之胺基酸殘基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之646至670、696至700及646至689。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其保護以下β-klotho (SEQ ID NO: 52)肽中之一者、兩者、三者、四者、五者或更多者：胺基酸殘基245至266、246至265、343至349、344至349、421至429、488至498、509至524、536至550、568至576、646至669、646至670、696至700、773至804、834至857及959至986，如藉由氫-氘交換(HDx)所測定。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其保護以下β-klotho (SEQ ID NO: 52)肽：胺基酸殘基246至265、536至550、834至857及959至986，如藉由氫-氘交換(HDx)所測定。 在特定態樣中，本文提供單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其保護以下β-klotho (SEQ ID NO: 52)肽：胺基酸殘基245至266、246至265、343至349、344至349、421至429、488至498、509至524、536至550、568至576、646至669、646至670、696至700、773至804、834至857及959至986，如藉由氫-氘交換(HDx)所測定。 在某些態樣中，本文提供增加β-klotho及FGFR1c之活性的單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段不接觸人類β-klotho (SEQ ID NO: 52)之殘基701 (Tyr)或703 (Arg)。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO: 52)之殘基246至265中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基536至550中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基834至857中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基959至986中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的兩個或更多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的三個或更多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基246至265、536至550、834至857及959至986中的胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸來自以下各段胺基酸殘基之至少一個胺基酸殘基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之246至265、536至550、834至857及959至986，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基696至700中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至689中的一或多個胺基酸，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。 在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之殘基646至670、696至700及646至689之胺基酸中的一者、兩者、三者、四者、五者或更多者，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在某些態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸來自以下各段胺基酸殘基之一或多個胺基酸殘基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之646至670、696至700及646至689，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸來自以下各段胺基酸殘基之一或多個胺基酸殘基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之646至670、696至700及646至689，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。在特定態樣中，本文提供結合至β-klotho之單離抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段接觸β-klotho序列(SEQ ID NO:52)之胺基酸殘基646至670、696至700及646至689，例如如由X射線結晶學、氫-氘交換分析法或掃描誘變所測定。 在特定態樣中，本發明提供與抗體NOV005或NOV006競爭結合至β-klotho之抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)。 在特定態樣中，本發明提供與β-klotho結合抗體競爭結合至β-klotho之抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 26或32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供與β-klotho結合抗體競爭結合至β-klotho之抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。 在特定態樣中，本發明提供與β-klotho結合抗體競爭結合至β-klotho之抗體(例如，能夠激活或增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的抗體)，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。經工程改造及修飾之抗體 本發明抗體(例如，NOV005或NOV006)可進一步使用具有本文所示之VH及/或VL序列中之一或多者的抗體作為起始物質以工程改造經修飾之抗體來製備，該經修飾之抗體可具有自起始抗體改變之性質。可藉由修飾一個或兩個可變區(即，VH及/或VL)內(例如在一或多個CDR區內及/或在一或多個架構區內)之一或多個殘基來工程改造抗體。此外或替代地，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基來進行工程改造，例如以改變抗體之效應子功能。 一種可進行之可變區工程改造為CDR移植。抗體主要通過位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基與靶抗原相互作用。由於此原因，CDR內之胺基酸序列係在各個抗體之間比在CDR之外之序列更加多樣化。因為CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，所以藉由構建包含來自特定天然抗體之CDR序列的表現載體來表現模擬該特定天然抗體之性質的重組抗體係可能的，該等CDR序列移植至來自具有不同特性之不同抗體的架構序列上(參見，例如，Riechmann, L.等人，1998 Nature 332:323-327；Jones, P.等人，1986 Nature 321:522-525；Queen, C.等人，1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033；頒發給Winter之美國專利號5,225,539，及頒發給Queen等人之美國專利號5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。 因此，本發明之另一實施例係關於包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單離抗體或其抗原結合片段，該重鏈可變區包含具有選自表1中所述之HCDR1序列之胺基酸序列的CDR1序列；具有選自表1中所述之HCDR2序列之胺基酸序列的CDR2序列；具有選自表1中所述之HCDR3序列之胺基酸序列的CDR3序列；且該輕鏈可變區具有具有選自表1中所述之LCDR1序列之胺基酸序列的CDR1序列；具有選自表1中所述之LCDR2序列之胺基酸序列的CDR2序列；及具有選自表1中所述之LCDR3序列之胺基酸序列的CDR3序列。因此，該等抗體包含單株抗體之VH及VL CDR序列，亦可包含來自此等抗體之不同架構序列。 因此，本發明之另一實施例係關於包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單離抗體或其抗原結合片段，該重鏈可變區包含含有選自由SEQ ID NO: 6及9組成之群之胺基酸序列的CDR1序列；包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的CDR2序列；包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的CDR3序列；且該輕鏈可變區具有包含選自由SEQ ID NO: 19及31組成之群之胺基酸序列的CDR1序列；包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列的CDR2序列；及包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列的CDR3序列。因此，該等抗體包含單株抗體之VH及VL CDR序列，亦可包含來自此等抗體之不同架構序列。 該等架構序列可係自包含生殖系抗體基因序列之公共DNA資料庫或公開參考文獻獲得。例如，人類重鏈及輕鏈可變區基因之生殖系DNA序列可在「VBase」人類生殖系序列資料庫(在全球資訊網之mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上可獲得)，以及Kabat, E. A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242；Tomlinson, I. M.等人，1992 J. Mol. Biol. 227:776-798；及Cox, J. P. L.等人，1994 Eur. J Immunol. 24:827-836中找到，其等各者之內容係以引用之方式明確地併入本文中。 用於本發明抗體之架構序列的實例為在結構上與本發明所選抗體所用之架構序列(例如，本發明單株抗體所用之一致序列及/或架構序列)相似之彼等。可將VH CDR1、2及3序列以及VL CDR1、2及3序列移植至具有與在架構序列來源之生殖系免疫球蛋白基因中所發現的序列一致之序列的架構區上，或可將該等CDR序列移植至與該等生殖系序列相比含有一或多個突變之架構區上。例如，已發現在某些情況下，使架構區內之殘基突變對維持或增強抗體之抗原結合能力係有益的(參見例如，頒發給Queen等人之美國專利號5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。可用作在其上構建本文所述之抗體及抗原結合片段之支架的架構包括但不限於VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2及Vk2。其他架構係在此項技術中已知且可在(例如)全球資訊網之vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上的vBase資料庫中找到。 因此，本發明之實施例係關於單離抗體或其抗原結合片段，其包含含有SEQ ID NO: 15之胺基酸序列或在此等序列之架構區中具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的重鏈可變區，且進一步包含具有選自由SEQ ID NO: 26或32組成之群之胺基酸序列或在此等序列之架構區中具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的輕鏈可變區，其中該重鏈可變區不包含表2中所述之重鏈可變區胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 43或55之胺基酸序列)且該輕鏈可變區不包含表2中所述之輕鏈可變區胺基酸序列(例如，SEQ ID NO: 47或57之胺基酸序列)。 另一種類型之可變區修飾為使VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基突變以藉此改良所關注抗體之一或多種結合特性(例如，親和力)，稱為「親和力成熟」。可進行定點誘變或PCR介導誘變以引入突變，並可在如本文所述及實例中所提供之活體外或活體內分析法法中評估其對抗體結合或所關注之其他功能特性的影響。可引入保守性修飾(如上所討論)。該等突變可為胺基酸取代、添加或缺失。此外，所改變之CDR區內的殘基通常不超過1、2、3、4或5個。 已知某些胺基酸序列基元經歷轉譯後修飾(PTM)，諸如醣基化(即NxS/T，x為除P外之任一者)、游離半胱胺酸之氧化、脫醯胺(例如NG)或異構化(例如DG)。若存在於CDR區中，則藉由定點誘變理想地移除彼等基元以增加產物之均一性。 親和力成熟之過程係在此項技術中經充分描述。在許多顯示系統中，噬菌體顯示(Smith GP (1985) Science 228:1315-1317)及在諸如酵母之真核細胞上的顯示(Boder ET及Wittrup KD (1997) Nature Biotechnology 15: 553-557)似乎係最普遍應用之系統來選擇抗體-抗原相互作用。彼等顯示系統之優點為其等適用於寬範圍之抗原，及可輕易地調節選擇嚴格性。在噬菌體顯示中，可顯示scFv或Fab片段，並額外在酵母中顯示全長IgG。彼等普遍應用之方法允許從具有超過10E7之多樣性的較大庫中選擇所需抗體變異體。具有較小多樣性之庫(例如10E3)可藉由微表現及ELISA進行篩選。 可藉由例如易錯PCR (Cadwell RC及Joyce GF (1994) Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140)產生非靶向或隨機抗體變異體庫，並提供非常簡單但有時受限制之方法。另一種策略為CDR定向抗體候選者之多樣化。可使用例如簡併寡核苷酸(Thompson J等人(1996) J.Mol.Biol. 256: 77-88)、三核苷酸誘變(TRIM) (Kayushin AL等人(1996) Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755)或此項技術中已知之任何任何其他方法具體地靶向一或多個CDR之一或多個位置。 因此，在另一實施例中，本發明提供由重鏈可變區組成之單離β-klotho結合抗體或其抗原結合片段，該重鏈可變區具有由選自SEQ ID NO: 6及9之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 6及9相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列組成的VH CDR1區；具有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 7相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VH CDR2區；具有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VH CDR3區；具有選自由SEQ ID NO: 19及31組成之群之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 19及31相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR1區；具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 20相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR2區；及具有SEQ ID NO: 21之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 21相比具有一、二、三、四或五個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列的VL CDR3區。將抗原結合域移植至替代架構或支架中 可使用多種抗體/免疫球蛋白架構或支架，只要所得多肽包含至少一個特異性結合之β-klotho之結合區。此類架構或支架包括人類免疫球蛋白或其片段之5種主要個體基因型，且包括較佳具有人源化特徵之其他動物物種的免疫球蛋白。就此而言，特別關注諸如彼等於駱駝中所識別之單一重鏈抗體。熟習此項技術者不斷發現及開發新穎之架構、支架及片段。 在一態樣中，本發明係關於使用本發明CDR可移植至其上之非免疫球蛋白支架產生基於非免疫球蛋白之抗體。可使用已知或未來之非免疫球蛋白架構及支架，只要其等包含對靶標β-klotho蛋白具有特異性之結合區。已知之非免疫球蛋白架構或支架包括(但不限於)纖維連接蛋白(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、結構域抗體(Domantis, Ltd., Cambridge, MA及Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgium)、脂質運載蛋白(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、小型模組化免疫醫藥(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、巨型抗體(Avidia, Inc., Mountain View, CA)、蛋白A (Affibody AG, Sweden)及人泛素(γ-晶體蛋白或泛素) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)。 纖維連接蛋白支架係基於III型纖維連接蛋白結構域(例如，III型纖維連接蛋白之第十模組(10 Fn3域))。III型纖維連接蛋白結構域具有分佈在兩個β片狀之間的7或8個β鏈，其等本身緊靠彼此包裹以形成蛋白質之核心，並進一步包含將該等β鏈彼此連接且係暴露於溶劑之環(類似於CDR)。在β片狀夾層之每個邊緣處存在至少三個此等環，其中邊緣為垂直於β鏈方向之蛋白質的邊界(參見US 6,818,418)。此等基於纖維連接蛋白之支架不為免疫球蛋白，雖然整體折疊與包含駱駝及駱馬IgG中之整個抗原識別單元的最小功能性抗體片段(重鏈之可變區)的折叠緊密相關。由於此結構，非免疫球蛋白抗體模擬在性質及親和力上與抗體之性質及親和力相似的抗原結合特性。此等支架可用於環隨機化及與活體內抗體之親和力成熟過程相似的活體外重排策略中。此等基於纖維連接蛋白之分子可用作支架，其中該分子之環區可使用標準選殖技術經本發明CDR替換。 錨蛋白技術係基於使用具有錨蛋白衍生重複模組之蛋白質作為用於支承可用於結合至不同靶標之可變區的支架。錨蛋白重複模組為由兩個反平行α-螺旋及β-轉角組成之33個胺基酸多肽。可變區之結合係主要藉由使用核糖體顯示來進行最佳化。 高親和力多聚體(Avimer)係衍生自含有天然A-結構域之蛋白質，諸如LRP-1。此等結構域係天然用於蛋白質-蛋白質相互作用，且在人類中，超過250種蛋白質係在結構上基於A-結構域。高親和力多聚體係由許多經由胺基酸連接子連接之不同「A結構域」單體(2-10)組成。可使用(例如)美國專利申請公開案號20040175756；20050053973；20050048512及20060008844中所描述之方法來產生可結合至標靶抗原之高親和力多聚體。 親和體親和配位體為由基於蛋白A之IgG結合域中的一者之支架的三螺旋束組成之小型單純蛋白質。蛋白A為來自細菌金黃色葡萄球菌之表面蛋白。此支架結構域係由58個胺基酸組成，其中13個係經隨機化以產生具有大量配位體變異體之親和體庫(參見例如US 5,831,012)。親和體分子模擬抗體，其等具有6 kDa之分子量，作為對比，抗體之分子量為150 kDa。雖然其體積小，但親和體分子之結合位點係與抗體之結合位點相似。 抗運載蛋白為由Pieris ProteoLab AG公司所開發之產品。其等係衍生自脂質運載蛋白，其為通常涉及化學敏感或不溶性化合物之生理轉運或儲存的一組廣泛之小型且穩固的蛋白質。一些天然脂質運載蛋白存在於人類組織或體液中。該蛋白質架構使人想起免疫球蛋白，其在剛性架構頂部具有高變環。然而，與抗體或其重組片段相比，脂質運載蛋白係由具有160至180個胺基酸殘基之單一多肽鏈組成，其僅略大於單一免疫球蛋白結構域。構成結合袋之四環組顯示明顯之結構可塑性且容許多種側鏈。因此，結合位點可在專屬過程中進行重新塑造，以便以高親和力及特異性識別具有不同形狀之規定標靶分子。一種脂質運載蛋白家族中之蛋白質，大菜粉蝶(Pieris brassicae)之後膽色素結合蛋白(BBP)已用於藉由誘變該四環組來開發抗運載蛋白。描述抗運載蛋白之專利申請案的一個實例係在PCT專利案號WO 199916873中。 人泛素分子為小型非免疫球蛋白蛋白質，其經工程改造對蛋白質及小分子具有特異性親和力。新穎人泛素分子可很快從兩個庫中選擇，每個庫均基於不同之人源支架蛋白。人泛素分子不顯示與免疫球蛋白蛋白質之任何結構同源性。目前，採用兩種人泛素支架，其中一種為γ晶體，人類結構晶狀體蛋白，另一種為「泛素」超家族蛋白。兩種人類支架均非常小，顯示高溫穩定性且幾乎抵抗pH變化及變性劑。此高穩定性主要歸因於蛋白質之擴大的β片狀結構。γ晶體衍生蛋白質之實例係描述於WO200104144中，及「泛素樣」蛋白質之實例係描述於WO2004106368中。 蛋白質抗原決定基模擬物(PEM)為模擬蛋白質之β-髮夾二級結構的中等大小，環狀，肽樣分子(MW 1至2kDa)，該二級結構為涉及蛋白質-蛋白質相互作用之主要二級結構。 本發明提供特異性結合至β-klotho蛋白之全人抗體。在某些態樣中，與嵌合或人源化抗體相比，本發明之人類β-klotho結合抗體在投與至人類個體時具有進一步降低之抗原性。駱駝科抗體 獲自駱駝及單峰駱駝家族(雙峰駝(Camelus bactrianus)及單峰駝(Calelus dromaderius))之成員，包括諸如美洲駝種(llama species)(小羊駝(Lama paccos)、原駝(Lama glama)及瘦駝(Lama vicugna))之新世界成員的抗體蛋白已就尺寸、結構複雜性及對人類個體之抗原性進行表徵。天然發現之來自此哺乳動物家族之某些IgG抗體缺乏輕鏈，且因此在結構上不同於來自其他動物之抗體之具有兩條重鏈及兩條輕鏈的典型四鏈四級結構。參見PCT/EP93/02214 (WO 94/04678公開於1994年3月3日)。 駱駝科抗體中為鑑別為VHH之小型單一可變域之區域可藉由基因工程改造獲得，產生對標靶具有高親和力之小型蛋白質，產生來源於低分子量抗體的蛋白質，稱為「駱駝科奈米抗體(camelid nanobody)」。參見頒發於1998年6月2日之美國專利號5,759,808；亦參見Stijlemans, B.等人，2004 J Biol Chem 279: 1256-1261；Dumoulin, M.等人，2003 Nature 424: 783-788；Pleschberger, M.等人，2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448；Cortez-Retamozo, V.等人，2002 Int J Cancer 89: 456-62；及Lauwereys, M.等人，1998 EMBO J 17: 3512-3520。駱駝科抗體及抗體片段之工程改造庫可購自例如Ablynx、Ghent、Belgium。如同非人類來源之其他抗體，駱駝科抗體之胺基酸序列可經重組改變以獲得更密切類似人類序列之序列，即奈米抗體可經「人源化」。因此，駱駝科抗體對人類之天然低抗原性可進一步降低。 駱駝科奈米抗體之分子量約為人類IgG分子之十分之一，且該蛋白質之實體直徑僅為幾奈米。該小尺寸所引起之一個結果為駱駝科奈米抗體能夠結合於對較大抗體蛋白功能上隱形之抗原位點，即駱駝科奈米抗體適用作偵測使用經典免疫技術時隱藏之抗原的試劑且適用作可能之治療劑。因此，小尺寸之另一結果為駱駝科奈米抗體可由於結合於標靶蛋白之凹槽或窄間隙中之特定位點而具有抑制作用，且因此相較於經典抗體，所發揮作用可更密切類似經典低分子量藥物之功能。 低分子量及緊密尺寸進一步使駱駝科奈米抗體具有極高熱穩定性，對極端pH值及蛋白水解消化具穩定性，且具有極弱抗原性。另一結果為駱駝科奈米抗體易於自循環系統移入組織中，且甚至橫穿血腦障壁並可治療影響神經組織之病症。奈米抗體可進一步促進藥物橫穿血腦障壁輸送。參見公開於2004年8月19日之美國專利申請案號20040161738。此等特徵與對人類之低抗原性組合表明極大治療潛力。此外，此等分子可在原核細胞(諸如大腸桿菌(E. coli))中充分表現，且表現為與噬菌體之融合蛋白並具有功能性。 因此，本發明之特徵為對β-klotho (例如，人類β-klotho)具有特異性親和力之駱駝科抗體或奈米抗體。在本文之某些實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體係在駱駝科動物中天然產生，即，其係由駱駝科動物在用β-klotho或其肽片段、使用本文關於其他抗體所述之技術進行免疫之後產生。或者，將β-klotho結合駱駝科奈米抗體工程改造，即藉由例如如本文實例中所述，使用淘選程序以β-klotho作為標靶自呈現經適當突變誘發之駱駝科奈米抗體蛋白之噬菌體庫選擇產生。經工程改造之奈米抗體可進一步藉由基因工程改造定製以使在接受個體中具有自45分鐘至2週之半衰期。在特定實施例中，駱駝科抗體或奈米抗體係藉由將本發明人類抗體之重鏈或輕鏈CDR序列移植至奈米抗體或單結構域抗體架構序列中來獲得，如例如PCT/EP93/02214中所描述。雙特異性分子及多價抗體 在另一態樣中，本發明係關於包含本發明β-klotho結合抗體或其片段(例如，抗體NOV005或NOV006)的雙特異性或多特異性分子。本發明之抗體或其抗原結合區可衍生化或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如另一抗體或受體之配位體)，以產生結合至少兩個不同結合位點或標靶分子之雙特異性分子。實際上，本發明抗體可衍生化或連接至一個以上之其他功能分子以產生結合兩個以上之不同結合位點及/或標靶分子的多特異性分子；亦希望該等多特異性分子涵蓋於本文中所使用之術語「雙特異性分子」中。為了產生本發明之雙特異性分子，可將本發明之抗體與一或多個其他結合分子(諸如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物)功能性連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價結合或其他方法連接)以產生雙特異性分子。 因此，本發明包括雙特異性分子，其包含至少一種針對β-klotho之第一結合特異性及針對第二標靶抗原決定基之第二結合特異性。例如，該第二標靶抗原決定基為β-klotho中不同於第一標靶抗原決定基之另一抗原決定基。 此外，在雙特異性分子具有多特異性之發明中，除第一及第二標靶抗原決定基外，該分子可進一步包括第三結合特異性。 在一態樣中，本發明之雙特異性分子包含至少一個抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。該抗體亦可為輕鏈或重鏈二聚物，或其任何最小片段，諸如Fv或如Ladner等人之美國專利案案號4,946,778中所述之單鏈構築體。 雙功能抗體為二價、雙特異性分子，其中VH及VL域表現在單一多肽鏈上，藉由過短以致不允許同一鏈上之兩個域之間配對的連接子連接。VH及VL域與另一鏈之互補域配對，藉此形成兩個抗原結合位點(參見例如Holliger等人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人，1994 Structure 2:1121-1123)。雙功能抗體可藉由在同一細胞內表現具有結構VHA-VLB及VHB-VLA (VH-VL構型)或VLA-VHB及VLB-VHA (VL-VH構型)之兩條多肽鏈來產生。其中大多數可在細菌中以可溶形式表現。單鏈雙功能抗體(scDb)係藉由用具有約15個胺基酸殘基之連接子連接兩條形成雙功能抗體之多肽鏈來產生(參見Holliger及Winter，1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology, 2(1):21-36)。scDb可在細菌中以可溶性活性單體形式表現(參見Holliger及Winter，1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30；Wu等人，1996 Immunotechnology, 2(1):21-36；Pluckthun及Pack，1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105；Ridgway等人，1996 Protein Eng., 9(7):617-21)。可將雙功能抗體與Fc融合以產生「雙-雙功能抗體」(參見Lu等人，22004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65)。 可用於本發明雙特異性分子之其他抗體為鼠類單株抗體、嵌合單株抗體及人源化單株抗體。 雙特異性分子可藉由使用此項技術中已知之方法使成分特異性結合來製備。例如，雙特異性分子之各結合特異性可獨立地產生並隨後彼此結合。當結合特異性為蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價結合。交聯劑之實例包括蛋白A、碳化二亞胺、N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基-硫乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯二順丁烯二醯亞胺(oPDM)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)及4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺酸基丁二醯亞胺酯(sulfo-SMCC) (參見例如，Karpovsky等人，1984 J. Exp. Med. 160:1686；Liu, MA等人，1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。其他方法包括彼等描述於Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132；Brennan等人，1985 Science 229:81-83)，及Glennie等人，1987 J. Immunol. 139: 2367-2375)中之方法。結合劑為SATA及sulfo-SMCC，兩者皆可購自Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)。 當結合特異性為抗體時，其等可藉由兩條重鏈之C末端鉸鏈區的氫硫基鍵結來結合。在特定實施例中，該鉸鏈區係在結合之前經修飾以含有奇數個(例如一個)氫硫基殘基。 或者，兩種結合特異性皆可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表現及裝配。此方法在雙特異性分子為mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2或配位體×Fab融合蛋白之情況下尤其適用。本發明之雙特異性分子可為包含一個單鏈抗體及一個結合決定子之單鏈分子，或包含兩個結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。製備雙特異性分子之方法描述於例如美國專利號5,260,203；美國專利號5,455,030；美國專利號4,881,175；美國專利號5,132,405；美國專利號5,091,513；美國專利號5,476,786；美國專利號5,013,653；美國專利號5,258,498；及美國專利號5,482,858中。 雙特異性分子與其特異性標靶之結合可藉由(例如)酶聯免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(REA)、FACS分析、生物分析法(例如生長抑制)或西方墨點分析法(Western Blot assay)來確認。此等分析法各自通常藉由使用對所關注複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)來偵測所關注之蛋白質-抗體複合物的存在。 在另一態樣中，本發明提供多價化合物，其包含結合至β-klotho之本發明抗體的至少兩個一致或不同抗原結合部分。該等抗原結合部分可經由蛋白質融合或共價或非共價鍵聯連接在一起。或者，鍵聯方法已針對雙特異性分子進行描述。四價化合物可例如藉由使本發明抗體與結合至本發明抗體之恆定區(例如Fc或鉸鏈區)的抗體交聯來獲得。 三聚合域係描述於例如Borean專利EP 1 012 280B1中。五聚合模組描述於例如PCT/EP97/05897中。具有延長之半衰期的抗體 本發明提供特異性結合至β-klotho蛋白質、具有延長之活體內半衰期的抗體(例如，NOV005或NOV006)。 許多因素可影響蛋白質之活體內半衰期。例如，腎過濾、肝內代謝、蛋白水解酶(蛋白酶)降解及免疫原性反應(例如，抗體中和蛋白質及巨噬細胞及樹突狀細胞吸收蛋白質)。可使用各種策略延長本發明抗體之半衰期。例如，化學鍵聯至聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗體骨架、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合配位體及碳水化合物外殼；與結合至血清蛋白並發生轉移之蛋白質(諸如白蛋白、IgG、FcRn)遺傳融合；與結合至血清蛋白之其他結合部分(諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體、親和體及抗運載蛋白)偶合(遺傳或化學偶合)；與rPEG、白蛋白、白蛋白域、白蛋白結合蛋白及Fc遺傳融合；或併入奈米載體、緩釋調配物或醫療裝置中。 為延長抗體之活體內血清循環，可經由PEG與抗體N末端或C末端的位點特異性結合或經由存在於離胺酸殘基上之ε胺基，使用或不使用多功能性連接子將諸如高分子量PEG之惰性聚合物分子與抗體或其片段連接。為使抗體聚乙二醇化，通常使該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使一或多個PEG基團連接至該抗體或抗體片段之條件下反應。聚乙二醇化可藉由反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於使其他蛋白質衍生化之任何形式的PEG，諸如單(C1至C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，欲聚乙二醇化之抗體為去醣基化抗體。將使用使生物活性損失最小之直鏈或分支鏈聚合物衍生化。結合程度可藉由SDS-PAGE及質譜法密切監測以確保PEG分子與抗體之正確結合。可藉由尺寸排阻或藉由離子交換層析法使未反應之PEG與抗體PEG共軛物分離。可使用熟習此項技術者熟知之方法(例如本文所述之免疫分析法)測試PEG衍生化抗體之結合活性以及活體內功效。此項技術中已知使蛋白質聚乙二醇化之方法且其可應用於本發明之抗體。參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384。 其他經修改之聚乙二醇化技術包括重構化學正交定向之工程改造技術(reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology) (ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之重構系統將化學指定側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術能夠將超過30個新胺基酸併入大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞內之生物合成蛋白質中。tRNA在琥珀密碼子所在之任何位置處併入非天然胺基酸，從而使該琥珀密碼子由終止密碼子轉化為傳導化學指定胺基酸之信號合併的密碼子。 重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於延長血清半衰期。此技術包括以遺傳方式使300至600個胺基酸之未結構化蛋白質尾與現有藥物蛋白質融合。因為此未結構化蛋白質鏈之表觀分子量為其實際分子量之約15倍，所以蛋白質之血清半衰期大大延長。與需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化相比，製造過程大大簡化且產物為均質的。 聚唾液酸化為另一種技術，其使用天然聚合物聚唾液酸(PSA)來延長有效壽命且改良治療性肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸(一種糖)之聚合物。當用於蛋白質及治療性肽藥物遞送時，聚唾液酸提供結合時之保護性微環境。此增加治療性蛋白在循環中之有效壽命且防止其被免疫系統識別。PSA聚合物天然存在於人體內。某些細菌經數百萬年演化仍採用PSA聚合物包覆其璧。接著此等天然聚唾液酸化細菌能夠藉助於分子擬態阻撓身體防禦系統。自然界之最終隱形技術PSA可輕易地由大量具有預定物理特徵之該等細菌產生。細菌PSA即使與蛋白質偶合時亦完全無免疫原性，因為其在化學上與人體內之PSA一致。 另一種技術包括使用與抗體連接之羥乙基澱粉(「HES」)衍生物。HES為來源於糯玉米澱粉之改質天然聚合物且可藉由體內酶代謝。通常投與HES溶液以替代不足的血容量且改良血液之流變性質。抗體經羥基化(hesylation)能夠藉由增加分子之穩定性以及藉由降低腎清除率來延長循環半衰期，從而增強生物活性。藉由改變不同參數(諸如HES之分子量)，可定製各種HES抗體共軛物。 具有延長之活體內半衰期的抗體亦可藉由將一或多個胺基酸修飾(即取代、***或缺失)引入IgG恆定域或其FcRn結合片段(較佳為Fc或鉸鏈Fc域片段)中來產生。參見例如國際公開案號WO 98/23289；國際公開案號WO 97/34631；及美國專利號6,277,375。 此外，可將抗體與白蛋白(例如，人類血清白蛋白)結合以使抗體或抗體片段在活體內更穩定或具有較長活體內半衰期。該等技術係在此項技術中熟知，參見例如國際公開案號WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及歐洲專利號EP 413,622。此外，在如上所述之雙特異性抗體的背景下，抗體之特異性可經設計使得抗體之一個結合域結合至FGF21，同時抗體之第二結合結合至血清白蛋白，較佳HSA。 延長半衰期之策略尤其適用於奈米抗體、基於纖維連接蛋白之結合劑及需要延長活體內半衰期之其他抗體或蛋白質。抗體共軛物 本發明提供特異性結合至β-klotho蛋白質之抗體或其片段，該等抗體或其片段與異源蛋白質或多肽(或其片段，較佳為至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個胺基酸之多肽)重組融合或化學結合以產生融合蛋白。特定言之，本發明提供融合蛋白，其包含本文所述之抗體(例如，NOV005或NOV006)的抗原結合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH域、VH CDR、VL域或VL CDR)及異源蛋白質、多肽或肽。使蛋白質、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或結合之方法係此項技術中已知。參見，例如，美國專利號5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851及5,112,946；歐洲專利號EP 307,434及EP 367,166；國際公開案號WO 96/04388及WO 91/06570；Ashkenazi等人，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng等人，1995, J. Immunol. 154:5590-5600；及Vil等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341。 其他融合蛋白可通過基因改組、基元改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術來產生。DNA改組可用於改變本發明抗體或其片段(例如，具有較高親和力及較低解離速率之抗體或其片段)之活性。通常參見美國專利號5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252及5,837,458；Patten等人，1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson等人，1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；及Lorenzo及Blasco，1998, Biotechniques 24(2):308- 313 (此等專利及公開案各係以全文引用之方式併入本文中)。抗體或其片段或所編碼之抗體或其片段可在重組之前藉由進行易錯PCR之隨機誘變、隨機核苷酸***或其他方法來改變。編碼特異性結合至β-klotho蛋白質之抗體或其片段的多核苷酸可與一或多個異源分子之一或多個組分、基元、區段、部分、域、片段等一起重組。 此外，抗體或其片段可與標記序列(諸如肽)融合以便於純化。在較佳實施例中，該標記胺基酸序列為六聚組胺酸肽(SEQ ID NO: 64)，諸如pQE載體(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)中所提供之標記，其中多者可在市面上購得。例如，如Gentz等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824中所述，六聚組胺酸(SEQ ID NO: 64)使融合蛋白之純化方便進行。適用於純化之其他肽標記包括(但不限於)對應於衍生自流感病毒血球凝集素蛋白之抗原決定基的血球凝集素(「HA」)標記(Wilson等人，1984, Cell 37:767)及「flag」標記。 在其他實施例中，本發明抗體或其片段與診斷劑或可偵測劑結合。作為臨床測試程序之一部分，該等抗體可適用於監測或預測疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重程度，諸如測定特定療法之功效。該診斷及偵測可藉由使抗體與可偵測物質偶合來完成，該等可偵測物質包括(但不限於)：各種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素及抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)繖酮(umbelliferone)、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、二甲胺基磺萘醯氯(dansyl chloride)或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白(aequorin)；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142 Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬，及非放射性順磁性金屬離子。 本發明進一步涵蓋使用與治療性部分結合之抗體或其片段的用途。抗體或其片段可與諸如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α發射體)之治療性部分結合。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害之任何藥劑。 此外，抗體或其片段可與調節給定生物反應之治療性部分或藥物部分結合。治療性部分或藥物部分不應理解為限於典型化學治療劑。例如，該藥物部分可為具有所需生物活性之蛋白質、肽或多肽。該等蛋白質可包括(例如)毒素，諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A (ricin A)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，諸如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織血纖維蛋白溶酶原活化劑、細胞凋亡劑、抗血管生成劑；或生物反應調節劑，諸如(例如)淋巴激素。 此外，抗體可與治療性部分(諸如放射性金屬離子，諸如α-發射體，諸如213Bi)或適用於使射電金屬離子(包括(但不限於) 131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)與多肽結合之巨環螯合劑結合。在某些實施例中，該巨環螯合劑為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接分子與抗體連接。該等連接分子通常係在此項技術中已知且描述於Denardo等人，1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90；Peterson等人，1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；及Zimmerman等人，1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50中，其等各係以全文引用之方式併入本文中。 已熟知使治療性部分與抗體共軛之技術，參見(例如)Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld等人(編)，第243-56頁(Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delibery」, Controlled Drug Delivery (第2版)，Robinson等人(編)，第623-53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe,「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera等人(編)，第475-506頁(1985)；「Analysis, Results, And Future Prospectibe Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」， Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(編)，第303-16頁(Academic Press 1985)，及Thorpe等人，1982, Immunol. Rev. 62:119-58。 抗體亦可附著於固體支撐物，此尤其適用於標靶抗原之免疫分析法或純化。該等固體支撐物包括(但不限於)玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。生產抗體之方法 編碼該等抗體之核酸 本發明提供實質上經純化之核酸分子，其編碼包含上述β-klotho結合抗體鏈之區段或域的多肽。本發明之一些核酸包含編碼SEQ ID NO: 15中所示之重鏈可變區的核苷酸序列，及/或編碼SEQ ID NO: 26或32中所示之輕鏈可變區的核苷酸序列。在特定態樣中，本文所提供之核酸分子為表1中所鑑別之分子，例如，包含編碼VH之SEQ ID NO: 16、36或38之序列的核酸分子，或包含編碼VL之SEQ ID NO: 27、54、33或40之序列的核酸分子。本發明之一些其他核酸分子包含與表1中所鑑別之分子的核苷酸序列實質上一致(例如至少65%、80%、95%或99%)之核苷酸序列，例如，包含編碼VH之SEQ ID NO: 16、36或38之序列的核酸分子，或包含編碼VL之SEQ ID NO: 27、54、33或40之序列的核酸分子。當自適當表現載體表現時，由此等多核苷酸所編碼之多肽能夠展現FGF21抗原結合能力。 本發明亦提供編碼本文所述β-klotho結合抗體(例如，表1中所述之彼等)之重鏈及/或輕鏈之所有或實質上所有可變區序列的多核苷酸。在特定態樣中，本發明提供編碼β-klotho結合抗體NOV005之VH及/或VL的所有或實質上所有可變區序列的多核苷酸。在特定態樣中，本發明提供編碼β-klotho結合抗體NOV005之重鏈及/或輕鏈的所有或實質上所有可變區序列的多核苷酸。在特定態樣中，本發明提供編碼β-klotho結合抗體NOV006之VH及/或VL的所有或實質上所有可變區序列的多核苷酸。在特定態樣中，本發明提供編碼β-klotho結合抗體NOV006之重鏈及/或輕鏈的所有或實質上所有可變區序列的多核苷酸。 由於密碼簡併性，故多種核酸序列將編碼各免疫球蛋白胺基酸序列。例如，SEQ ID NO: 16及36為編碼NOV005之VH的兩個核酸序列，及SEQ ID NO: 27及54為編碼NOV005之VL的兩個核酸序列。 本發明之核酸分子可編碼抗體之可變區與恆定區。本發明之一些核酸序列包含編碼與SEQ ID NO:17中所示之重鏈序列實質上一致(例如，至少80%、90%或99%)之重鏈序列的核苷酸。一些其他核酸序列包含編碼與SEQ ID NO:28或34中所示之輕鏈序列實質上一致(例如，至少80%、90%或99%)之輕鏈序列的核苷酸。在特定態樣中，本文所提供之核酸分子為表1中所鑑別之分子，例如，包含編碼重鏈之SEQ ID NO:18、37、30或39之序列的核酸分子，或包含編碼輕鏈之SEQ ID NO:29、51、35或41之序列的核酸分子。 在特定態樣中，本文提供包含編碼VH之SEQ ID NO:16之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼VH之SEQ ID NO:36之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼VH之SEQ ID NO:38之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼VL之SEQ ID NO:27之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼VL之SEQ ID NO:54之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼VL之SEQ ID NO:29之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼VL之SEQ ID NO:51之核酸序列的多核苷酸。 在特定態樣中，本文提供包含編碼重鏈之SEQ ID NO:18之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼重鏈之SEQ ID NO:37之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼重鏈之SEQ ID NO:30之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼重鏈之SEQ ID NO:39之核酸序列的多核苷酸。 在特定態樣中，本文提供包含編碼輕鏈之SEQ ID NO:29之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼輕鏈之SEQ ID NO:51之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼輕鏈之SEQ ID NO:35之核酸序列的多核苷酸。在特定態樣中，本文提供包含編碼輕鏈之SEQ ID NO:41之核酸序列的多核苷酸。 多核苷酸序列可藉由重新(de novo)固相DNA合成或藉由編碼β-klotho結合抗體或其結合片段之現有序列(例如，如下文實例中所述之序列)之PCR誘變來產生。核酸之直接化學合成可藉由此項技術中已知之方法完成，諸如Narang等人，1979, Meth. Enzymol. 68:90之磷酸三酯法；Brown等人，Meth. Enzymol. 68:109, 1979之磷酸二酯法；Beaucage等人，Tetra. Lett., 22:1859, 1981之二乙基胺基磷酸酯法；及美國專利號4,458,066之固相支撐物法。可如以下文獻中所述，藉由PCR將突變引入多核苷酸序列中：例如，PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich(編), Freeman Press, NY, NY, 1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis等人(編), Academic Press, San Diego, CA, 1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1:17, 1991。 本發明亦提供用於產生本文所述之β-klotho結合抗體(例如，NOV005或NOV006)的表現載體及宿主細胞。可採用多種表現載體來表現編碼β-klotho結合抗體鏈或結合片段之多核苷酸。基於病毒之表現載體及非病毒表現載體均可用於在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。非病毒載體及系統包括質體、通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現匣的附加型載體及人類人造染色體(參見例如Harrington等人，Nat Genet 15:345, 1997)。例如，適用於在哺乳動物(例如，人類)細胞中表現FGF21結合多核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、pThioHis B及pThioHis C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、pEBVHis B及pEBVHis C (Invitrogen, San Diego, CA)、MPSV載體及此項技術中已知用於表現其他蛋白質之眾多其他載體。適用病毒載體包括基於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體；基於SV40、乳頭狀瘤病毒、HBP艾普斯坦-巴爾二氏病毒(Epstein Barr Virus)之載體；牛痘病毒載體及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)載體。參見Brent等人，同上；Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995；及Rosenfeld等人，Cell 68:143, 1992。 表現載體之選擇係視載體欲表現於其中之預定宿主細胞而定。該等表現載體通常含有與編碼β-klotho結合抗體鏈或片段之多核苷酸以操作方式連接的啟動子及其他調控序列(例如增強子)。在一些實施例中，使用誘導性啟動子以防止在誘導條件下外表現所***之序列。誘導性啟動子包括(例如)***糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子。轉型有機體之培養物可在不偏向編碼序列(其表現產物由宿主細胞更好地耐受)之群體的非誘導條件下擴增。除啟動子外，亦可要求或需要其他調控元件以有效表現β-klotho結合抗體鏈或片段。此等元件通常包括ATG起始密碼子及鄰近核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由包含適合於所用細胞系統之增強子來增強(參見例如Scharf等人，Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994；及Bittner等人，Meth. Enzymol., 153:516, 1987)。例如，SV40增強子或CMV增強子可用於增強哺乳動物宿主細胞中之表現。 表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由所***之FGF21結合抗體序列所編碼之多肽形成融合蛋白。更通常而言，在包含於載體中之前使所***之β-klotho結合抗體序列與信號序列連接。用於接受編碼β-klotho結合抗體輕鏈及重鏈可變域之序列的載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體允許可變區以與恆定區之融合蛋白形式表現，藉此引起完整抗體或其片段產生。該等恆定區通常為人類恆定區。 具有及表現β-klotho結合抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核細胞。大腸桿菌為一種適用於選殖及表現本發明之多核苷酸的原核宿主。其他適用之微生物宿主包括桿菌，諸如枯草桿菌(Bacillus subtilis )；及其他腸內菌科(enterobacteriaceae )，諸如沙門氏菌(Salmonella )、沙雷氏菌(Serratia )；及各假單胞菌(Pseudomonas )種。在此等原核宿主中，亦可製造表現載體，其通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製起點)。另外，可存在任何數量之各種熟知啟動子，諸如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或噬菌體λ之啟動子系統。該等啟動子通常視情況與操縱基因一起控制表現，且具有用於啟動及完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及其類似序列。亦可使用其他微生物(諸如酵母)來表現本發明之FGF21結合多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。 在一些較佳實施例中，使用哺乳動物宿主細胞表現並產生本發明之β-klotho結合多肽。例如，其可為表現內源性免疫球蛋白基因之融合瘤細胞系(例如，下文實例中所述之1D6.C9骨髓瘤融合瘤純系)或具有外源性表現載體之哺乳動物細胞系(例如，下文例示之SP2/0骨髓瘤細胞)。此等細胞包括任何正常死亡或正常或異常永生之動物或人類細胞。例如，已開發出能夠分泌完整免疫球蛋白之多種合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、多種Cos細胞系、海拉(HeLa)細胞、骨髓瘤細胞系、經轉型之B細胞及融合瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物表現多肽係在(例如) Winnacker, FROM GENES TO CLONES，VCH出版社，N.Y., N.Y., 1987中一般性討論。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現控制序列，諸如複製起點、啟動子及增強子(參見例如Queen等人，Immunol. Rev. 89:49-68, 1986)；及必需加工資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點及轉錄終止子序列。此等表現載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。合適啟動子可為組成性啟動子、細胞類型特異性啟動子、階段特異性啟動子及/或可調節或可調控啟動子。適用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成性腺病毒主要晚期啟動子、***(dexamethasone)誘導性MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成性MPSV啟動子、四環素誘導性CMV啟動子(諸如人類立即早期CMV啟動子)、組成性CMV啟動子及此項技術中已知之啟動子-增強子組合。 引入含有所關注之多核苷酸序列之表現載體的方法視細胞宿主之類型而變化。例如，原核細胞通常使用氯化鈣轉染，而其他細胞宿主可使用磷酸鈣處理或電穿孔。(一般參見Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉型、注射及顯微注射、衝擊法、病毒顆粒、免疫脂質體、多價陽離子：核酸共軛物、裸DNA、人造病毒粒子、融合疱疹病毒結構蛋白VP22 (Elliot及O'Hare, Cell 88:223, 1997)、藥劑增強之DNA吸收及離體轉導。對於長期高產量產生重組蛋白而言，通常需要穩定表現。例如，穩定表現β-klotho結合抗體鏈或結合片段之細胞系可使用含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選擇標記基因之本發明表現載體來製備。在引入載體後，可使細胞於富集培養基中生長1至2天，隨後將其轉入選擇培養基中。可選擇標記之目的為賦予抗選擇性且其存在允許選擇性培養基中成功表現所引入之序列的細胞生長。經穩定轉染之抗性細胞可使用適於細胞類型之組織培養技術來增殖。單株抗體之產生 單株抗體(mAb)可藉由多種技術來製備，該等技術包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,1975 Nature 256:495之標準體細胞雜交技術。可使用多種製備單株抗體之技術，例如B淋巴細胞之病毒性轉形或致癌性轉形。 用於製備融合瘤之動物系統包括鼠類、大鼠及兔系統。在小鼠體內產生融合瘤為良好建立之程序。用於單離經免疫之脾細胞以供融合之免疫方案及技術在此項技術中已知。亦已知融合配偶體(例如，鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。 本發明之嵌合抗體或人源化抗體可基於如上述所製備之鼠類單株抗體的序列來製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自所關注之鼠類融合瘤獲得且可使用標準分子生物學技術進行工程改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為形成嵌合抗體，可使用此項技術中已知之方法使鼠類可變區與人類恆定區連接(參見例如Cabilly等人之美國專利號4,816,567)。為形成人源化抗體，可使用此項技術中已知之方法將鼠類CDR區***人類架構中。參見例如Winter之美國專利號5225539及Queen等人之美國專利號5530101、5585089、5693762及6180370。 在某些實施例中，本發明之抗體為人類單株抗體。該等針對β-klotho之人類單株抗體可使用帶有部分人類免疫系統而非小鼠系統之轉殖基因或轉殖染色體小鼠來產生。此等轉殖基因及轉殖染色體小鼠包括本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」。 HuMAb mouse® (Medarex, Inc.)含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微小基因座以及使內源性μ及κ鏈基因座失活之靶向突變(參見例如Lonberg等人，1994 Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展現減少之小鼠IgM或κ表現，且作為對免疫作用之反應，所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgGκ單株(Lonberg, N. 等人，1994，同上；評述於Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N.及Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immuno1. 13:65-93，及Harding, F.及Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546中)。以下文獻中進一步描述HuMAb小鼠之製備及使用以及該等小鼠所帶有之基因組修飾：Taylor, L.等人，1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人，1993 International Immunology 5:647-656；Tuaillon 等人，1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi等人，1993 Nature Genetics 4:117-123；Chen, J.等人，1993 EMBO J. 12:821-830；Tuaillon等人，1994 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L.等人，1994 International Immunology 579-591；及Fishwild, D.等人，1996 Nature Biotechnology 14:845-851，所有該等文獻之內容均明確以全文引用的方式併入本文中。進一步參見美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；及5,770,429 (均頒予Lonberg及Kay)；Surani等人之美國專利號5,545,807；PCT公開案號WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884及WO 99/45962 (均頒予Lonberg及Kay)；及Korman等人之PCT公開案號WO 01/14424。 在另一實施例中，本發明之人類抗體可使用在轉殖基因及轉殖染色體上帶有人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如帶有人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖染色體之小鼠)產生。該等小鼠(本文中稱為「KM小鼠」)係在Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中詳細描述。 此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖基因動物系統在此項技術中可獲得且可用於產生本發明之β-klotho結合抗體。例如，可使用稱為Xenomouse (Abgenix, Inc.)之替代轉殖基因系統。該等小鼠描述於例如Kucherlapati等人之美國專利號5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。 此外，表現人類免疫球蛋白基因之替代轉殖染色體動物系統在此項技術中可獲得且可用於產生本發明之β-klotho結合抗體。例如，可使用稱為「TC小鼠」之帶有人類重鏈轉殖染色體及人類輕鏈轉殖染色體的小鼠；該等小鼠描述於Tomizuka等人，2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727中。此外，帶有人類重鏈及輕鏈轉殖染色體之牛已描述於此項技術中(Kuroiwa等人，2002 Nature Biotechnology 20:889-894)且可用於產生本發明之FGF21結合抗體。 亦可使用篩檢人類免疫球蛋白基因庫之噬菌體顯示方法來製備本發明之人類單株抗體。該等用於分離人類抗體之噬菌體顯示方法已確立於此項技術中或描述於下文實例中。參見例如：Ladner等人之美國專利號5,223,409；5,403,484；及5,571,698；Dower等人之美國專利號5,427,908及5,580,717；McCafferty等人之美國專利號5,969,108及6,172,197；及Griffiths等人之美國專利號5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915及6,593,081。 本發明之人類單株抗體亦可使用人類免疫細胞已重構於其中以便免疫後可產生人類抗體反應之SCID小鼠來製備。該等小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利號5,476,996及5,698,767中。架構或 Fc 工程改造 本發明經工程改造之抗體包括已對VH及/或VL中之架構殘基進行修飾以(例如)改良抗體特性之抗體。通常進行該等架構修飾以降低抗體之免疫原性。例如，一種方法為使一或多個架構殘基「回復突變」成對應生殖系序列。更具體言之，已經歷體細胞突變之抗體可含有與抗體所來源之生殖系序列不同的架構殘基。該等殘基可藉由將抗體架構序列與該抗體所來源之生殖系序列比較來鑑別。為了使架構區序列恢復為其生殖系構型，可藉由例如定點誘變或PCR介導之誘變來使體細胞突變「回復突變」成生殖系序列。亦希望該等「回復突變」抗體涵蓋於本發明中。 另一類架構修飾涉及使架構區或甚至一或多個CDR區中之一或多個殘基突變以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫作用」且更詳細地描述於Carr等人之美國專利公開案號20030153043中。 或者或除在架構區或CDR區內進行修飾外，本發明之抗體亦可經工程改造以包括Fc區中之修飾，通常改變抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體固著、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本發明之抗體可經化學修飾(例如，可將一或多個化學部分連接至抗體)或經修飾以改變其醣基化，以再次改變該抗體之一或多種功能特性。以下更詳細地描述此等各實施例。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引的編號。 在一實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得該鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目發生改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利號5,677,425中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目經改變以(例如)有助於輕鏈及重鏈之裝配或增加或降低抗體之穩定性。 在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短該抗體之生物半衰期。更具體言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中以便減弱該抗體與葡萄球菌蛋白質A (SpA)之結合(相對於天然Fc鉸鏈域SpA結合)。此方法更詳細地描述於Ward等人之美國專利號6,165,745中。 在另一實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。可存在多種方法。例如，如Ward之美國專利號6,277,375中所述，可引入一或多個以下突變：T252L、T254S、T256F。或者，為延長生物半衰期，可使抗體在CH1或CL區中發生變異以含有獲自IgG Fc區之CH2域之兩個環的補救受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利號5,869,046及6,121,022中所述。 在其他實施例中，藉由用不同胺基酸殘基取代至少一個胺基酸殘基來使Fc區變異以改變抗體之效應功能。例如，一或多個胺基酸可用不同胺基酸殘基取代以使得抗體對效應配位體之親和力發生改變，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和力發生改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法更詳細地描述於Winter等人之美國專利號5,624,821及5,648,260中。 在另一實施例中，一或多個選自胺基酸殘基之胺基酸可用不同胺基酸殘基取代以使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法更詳細地描述於Idusogie等人之美國專利號6,194,551中。 在另一實施例中，一或多個胺基酸殘基經變異以藉此改變抗體固著補體之能力。此方法更詳細地描述於Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。 在另一實施例中，藉由修飾一或多個胺基酸來修飾Fc區以增加抗體介導抗體依賴細胞毒性(ADCC)之能力及/或增加抗體對Fcγ受體之親和力。此方法更詳細地描述於Presta之PCT公開案WO 00/42072中。此外，人類IgG1上針對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點已定位且已所描述結合改良之變異體(參見Shields,R.L.等人，2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604)。 在另一實施例中，修改抗體之醣基化。例如，可製備去醣基化抗體(即，抗體缺乏醣基化)。可改變醣基化以例如增加抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來完成。例如，可進行一或多個胺基酸取代，從而消除一或多個可變區架構醣基化位點，藉此消除該位點處之醣基化。該去醣基化可增加抗體對抗原之親和力。該方法更詳細地描述於Co等人之美國專利號5,714,350及6,350,861中。 或者或另外，可製備醣基化類型改變之抗體，諸如具有少量岩藻糖基殘基之低岩藻醣基化抗體或二分GlcNac結構增加之抗體。已證明該等經改變之醣基化模式可增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由例如在醣基化方式改變之宿主細胞中表現抗體來完成。醣基化方式改變之細胞已描述於此項技術中且可用作表現本發明之重組抗體，藉此產生醣基化改變之抗體的宿主細胞。例如，Hang等人之EP 1,176,195描述一種細胞系，其中編碼岩藻糖基轉移酶之FUT8基因在功能上已破壞，以致該細胞系中所表現之抗體展現低岩藻醣基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835描述變異CHO細胞系、Lecl3細胞，其使岩藻糖連接至Asn (297)鍵聯之碳水化合物之能力降低，亦導致彼宿主細胞中所表現之抗體之低岩藻醣基化(亦參見Shields,R.L.等人，2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342描述經工程改造以表現醣蛋白修飾糖基轉移酶(例如β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnTIII))的細胞系，以使得經工程改造之細胞系中所表現之抗體展現增加之二分GlcNac結構，從而增強抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，1999 Nat. Biotech. 17:176-180)。工程改造經改變抗體之方法 如上文所論述，藉由修飾全長重鏈及/或輕鏈序列、VH及/或VL序列或其所連接之恆定區，可使用具有本文所示之VH及VL序列或全長重鏈及輕鏈序列之β-klotho結合抗體形成新的β-klotho結合抗體。因此，在本發明之另一態樣中，使用本發明之β-klotho結合抗體之結構特徵來形成結構相關之β-klotho結合抗體，其保留本發明之抗體之至少一種功能特性，諸如結合人類β-klotho以及激活FGF21-受體複合物之一或多種功能特性(例如，激活FGF21-受體信號傳導)。 例如，本發明之抗體之一或多個CDR區或其突變可與已知架構區及/或其他CDR重組性組合以形成如上論述之本發明之其他經重組工程改造的β-klotho結合抗體。其他類型之修飾包括前一部分中所述之修飾。工程改造方法之起始物為本文所提供之一或多個VH及/或VL序列，或其一或多個CDR區。為形成經工程改造之抗體，實際上不一定製備具有本文所提供之一或多個VH序列及/或VL序列或其一或多個CDR區的抗體(即，以蛋白質形式表現)。更確切而言，使用序列中所含之資訊作為形成衍生自原始序列之「第二代」序列的起始物且隨後製備「第二代」序列並以蛋白質形式表現。 因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備β-klotho結合抗體(例如，NOV005或NOV006)的方法，該β-klotho結合抗體包含具有SEQ ID NO:6或9之CDR1序列、SEQ ID NO:7之CDR2序列及/或SEQ ID NO:8之CDR3序列的重鏈可變區抗體序列；及具有SEQ ID NO:19或31之CDR1序列、SEQ ID NO:20之CDR2序列及/或SEQ ID NO:21之CDR3序列的輕鏈可變區抗體序列；視情況地，該方法包括改變該重鏈可變區抗體序列及/或該輕鏈可變區抗體序列中之至少一個胺基酸殘基以形成至少一個變異抗體序列；及以蛋白質形式表現該變異抗體序列。 因此，在另一實施例中，本發明提供一種製備針對在哺乳動物細胞中表現最佳化之β-klotho結合抗體的方法，該β-klotho結合抗體由以下組成：具有SEQ ID NO:17之序列的全長重鏈抗體序列；及具有SEQ ID NO:28或34之序列的全長輕鏈抗體序列；視情況地，該方法包括改變該全長重鏈抗體序列及/或該全長輕鏈抗體序列中之至少一個胺基酸殘基以形成至少一個變異抗體序列；及以蛋白質形式表現該變異抗體序列。在一實施例中，重鏈或輕鏈之改變係在該重鏈或輕鏈之架構區中。 變異抗體序列亦可藉由篩檢具有固定CDR3序列或如US2005/0255552中所述之最小必需結合決定子及多種CDR1與CDR2序列的抗體庫來製備。該篩檢可根據適於自抗體庫篩檢抗體之任何篩檢技術(諸如噬菌體顯示技術)執行。 標準分子生物學技術可用於製備及表現變異抗體序列。由變異抗體序列所編碼之抗體為保留本文所述之β-klotho結合抗體之一種、一些或所有功能特性的一種抗體，該等功能特性包括(但不限於)特異性結合至人類、食蟹獼猴、大鼠及/或小鼠β-klotho；且該抗體在FGFR1c_ β-klotho_HEK293 pERK細胞分析法中激活FGF21介導之信號傳導(例如，FGF21-受體依賴性信號傳導)。在工程改造本發明抗體之方法的某些實施例中，可沿β-klotho結合抗體編碼序列之全部或一部分隨機或選擇性引入突變，且可針對如本文所述之結合活性及/或其他功能特性篩檢所得經修飾之β-klotho結合抗體。突變方法已描述於此項技術中。例如，Short之PCT公開案WO 02/092780描述使用飽和誘變、合成接合組裝或其組合來形成及篩檢抗體突變之方法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679描述使用電腦篩檢方法來最佳化抗體之生理化學特性的方法。 在本發明之某些實施例中，已工程改造抗體來移除脫醯胺位點。已知脫醯胺作用引起肽或蛋白質中之結構及功能改變。脫醯胺可導致生物活性降低以及蛋白質醫藥之藥物動力學及抗原性的改變。(Anal Chem . 2005年3月1日; 77(5):1432-9)。 在本發明之某些實施例中，已工程改造抗體來增加pI並改良其藥物樣特性。蛋白質之pI為分子整體生物物理性質之關鍵決定因素。已知具有低pI之抗體不易溶解、不穩定且易於聚集。此外，具有低pI之抗體的純化具有挑戰性且可係存在問題，尤其在臨床使用之擴大規模期間。增加本發明之抗β-klotho抗體或Fab的pI改良其等之溶解度，使得該等抗體能夠以更高之濃度(＞100 mg/ml)進行調配。高濃度(例如＞100 mg/ml)之抗體的調配物提供能夠經由玻璃體內注射將更高劑量之抗體投與至患者眼中的優點，此進而可能夠減少給藥頻率，其為治療包括心血管疾病之慢性疾病的顯著優點。更高pI亦可增加IgG型抗體之FcRn介導再循環，從而使藥物能夠在體內持續更長的時間，需要更少的注射次數。最後，顯著改良抗體之整體穩定性，歸因於更高之pI導致活體內更長之保質期及生物活性。較佳的，pI係大於或等於8.2。 可使用此項技術中可用及/或本文所描述之標準分析法法(諸如實例中所示之彼等(例如，ELISA))來評估變異抗體之功能特性。預防性及治療性用途 藉由將有效量之本發明抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)投與至有需要之個體，可將如本文所述之結合β-klotho的抗體(例如，NOV005或NOV006)及其抗原結合片段以治療有用之濃度用於治療與異常FGF21信號傳導(例如，FGF21介導信號傳導及/或FGF21受體信號傳導之異常活化)相關聯之疾病或病症。本發明提供藉由將有效量之本發明抗體(例如，NOV005或NOV006)投與至有需要之個體來治療FGF21相關之代謝病症的方法。本發明提供藉由將有效量之本發明抗體(例如，NOV005或NOV006)投與至有需要之個體來治療FGF21相關之心血管病症的方法。 本發明抗體(例如，NOV005或NOV006)尤其可用於預防治療、預防及改良FGF21相關病狀或病症，該等病狀或病症包括但不限於代謝、內分泌及心血管病症，諸如肥胖、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高三酸甘油酯血症、代謝症候群、急性心肌梗塞、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱、與胰島素受體中之嚴重失活突變相關聯的病症、及其他代謝病症，及降低危重患者之死亡率及發病率。 本發明抗體(例如，NOV005或NOV006)尤其可用於治療、診斷、改善、改良或預防許多疾病、病症或病狀，該等疾病、病症或病狀包括(但不限於)與胰島素抵抗相關聯之代謝疾病，諸如2型糖尿病、1型糖尿病、胰島素受體突變病症(INSR病症，例如，B型胰島素抵抗)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)及各種形式之部分脂質營養不良(包括家族性部分脂質營養不良及HIV-高效抗逆轉錄病毒療法(HIV-HAART)誘導之部分脂質營養不良)以及與胰島素產生相關聯之疾病(例如，1型糖尿病)，及降低危重患者之死亡率及發病率。 已使用不同之表現型描述INSR之多個失活突變。患者通常對胰島素作用具有嚴重抵抗力，此在***時進展為高血糖症。目前的護理標準為當個體變得高血糖時使用極高劑量之胰島素進行治療，此通常不足以控制高血糖症。 在特定態樣中，本發明抗體(例如，NOV005或NOV006)尤其可用於治療或控制1型糖尿病、血脂異常、高血糖症、低血糖症、葡萄糖耐受不良、高三酸甘油酯血症或HIV-HAART誘導之部分脂質營養不良。 本發明抗體亦可與其他藥劑組合使用來預防、治療或改良FGF21相關病症。例如，斯他汀(statin)療法可與本發明FGF21模擬抗體及抗原結合片段組合使用來治療患有心血管或代謝病症之患者。 在特定態樣中，本文提供減輕個體之體重(例如，減輕至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少12%、至少15%或至少20%)之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在特定態樣中，本文提供減少個體之食慾或食物攝取量(例如，減少至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少12%、至少15%或至少20%)之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在特定態樣中，本文提供降低(例如，降低至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少12%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%)個體之血漿三酸甘油酯(TG)濃度或血漿總膽固醇(TC)濃度之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在本文所提供之方法的特定態樣中，該個體罹患代謝病症，諸如肥胖、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高三酸甘油酯血症及代謝症侯群。在本文所提供之方法的特定態樣中，該個體罹患心血管病症。在特定態樣中，該個體為人類。 在某些態樣中，本文提供治療或管理個體之肥胖之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在某些態樣中，本文提供治療或管理個體之2型糖尿病之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在某些態樣中，本文提供治療或管理個體之1型糖尿病之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在某些態樣中，本文提供治療或管理個體之脂質營養不良(諸如HIV-HAART誘導之部分脂質營養不良)之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在某些態樣中，本文提供治療或管理個體之NASH之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。 在某些態樣中，本文提供治療或管理個體之胰島素受體突變病症之方法，其包括將有效量之醫藥組合物投與至有需要之個體，該醫藥組合物包含結合β-klotho且能夠增加β-klotho/FGFR1c受體複合物之活性的本文所述之抗體或抗原結合片段(例如，NOV005或NOV006)。醫藥組合物 本發明提供包含與醫藥上可接受之載劑一起調配之β-klotho結合抗體(完整或結合片段)的醫藥組合物。該等組合物可另外含有一或多種適於治療或預防(例如)心血管病症之其他治療劑。醫藥上可接受之載劑使組合物增強或穩定或可用於使組合物便於製備。醫藥上可接受之載劑包括生理上相容之溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及其類似物。 本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中已知之各種方法投與。投藥途徑及/或方式視所需效果而變化。較佳玻璃體內、靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下投藥或在標靶部位附近投藥。醫藥上可接受之載劑應適於玻璃體內、靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊椎或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，活性化合物(即，抗體、雙特異性分子及多特異性分子)可用物質塗佈以保護化合物不受酸及可使化合物失活之其他天然條件的作用。在特定態樣中，用於本文所提供之方法中的包含本文所述β-klotho結合抗體(諸如抗體NOV005或NOV006)之醫藥組合物係經皮下投與。在特定態樣中，用於本文所提供之方法中的包含本文所述β-klotho結合抗體(諸如抗體NOV005或NOV006)之醫藥組合物係經靜脈內投與。 該組合物應為無菌液體組合物。適當流動性可(例如)藉由使用包衣劑(諸如卵磷脂)、在分散液情況下藉由維持所需粒徑及藉由使用界面活性劑來維持。在許多情況下，組合物中較佳包含等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。可注射組合物之長期吸收可藉由在組合物中包含延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來達成。 本發明之醫藥組合物可根據此項技術中熟知且常規實施之方法來製備。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co.，第20版，2000；及Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編，Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。醫藥組合物較佳在GMP條件下製造。本發明之醫藥組合物中通常使用治療有效劑量之β-klotho結合抗體。β-klotho結合抗體係藉由熟習此項技術者已知之習知方法調配成醫藥上可接受之劑型。給藥方案經調整以提供最佳所需反應(例如治療反應)。例如，可投與單次大劑量(single bolus)，可隨時間分次投與多次劑量，或可依治療情形之緊急狀態所指示，按比例減少或增加劑量。將非經腸組合物調配為單位劑型對於方便投藥及達成劑量均一性係特別有利的。如本文所用，單位劑型係指作為單一劑量適用於欲治療之個體的實體上不連續單元；各單元含有經計算可產生所需治療作用之預定量的活性化合物與所需醫藥載劑。 可改變本發明醫藥組合物中之活性成分的實際劑量以便獲得有效達成特定患者、組合物及投藥方式所需之治療反應而不使患者中毒的活性成分用量。所選劑量水平係取決於多種因素，包括所採用之本發明特定化合物或其酯、鹽或醯胺的活性，投與途徑，投與時間，所採用之特定化合物的***速率，治療持續時間，與所採用之特定化合物組合使用的其他藥物、化合物及或物質，接受治療之患者的年齡、性別、體重、狀態、健康情況及先前醫療病史，及類似因素。 內科醫師或獸醫可從低於為達成所需治療效果所需之劑量水平開始在醫藥組合物中使用的本發明抗體之劑量，並逐步增加劑量直到達成所需效果。一般而言，用於治療本文所述之心血管病症之本發明組合物的有效劑量視許多不同因素而改變，該等因素包括投藥方式、標靶部位、患者生理狀態、患者為人類或動物、所投與之其他藥物及處理為預防性或治療性。需要滴定治療劑量以最佳化安全及功效。在特定實施例中，對於全身性投與抗體而言，劑量範圍為每公斤宿主體重約0.0001 mg至100 mg或為0.01 mg至15 mg。例示性治療方案需要全身性投藥每兩週一次或一個月一次或每3至6個月一次。例示性治療方案需要全身性投藥每兩週一次或一個月一次或每3至6個月一次，或按需投藥(PRN)。抗體通常在多個時間投與。單次給藥之時間間隔可為一週、一月或一年。時間間隔亦可無規律，而藉由量測患者體內β-klotho結合抗體之血液含量指示。另外，替代之給藥間隔可以由醫師確定並每月或如有效治療所需進行投與。在全身性投藥之一些方法中，劑量經調整可達成1至1000 μg/ml之血漿抗體濃度且在一些方法中達成25至500 μg/ml之血漿抗體濃度。或者，抗體可以持續釋放調配物形式投與，在此情況下，不需要頻繁投藥。劑量及頻率視抗體在患者體內之半衰期而變化。一般而言，人源化抗體顯示的半衰期比嵌合抗體及非人類抗體之半衰期長。投藥劑量及頻率可視處理為預防性或治療性而變化。在預防性應用中，可長期以相對不頻繁之時間間隔投與相對低的劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短的時間間隔投與相對高的劑量直至疾病進展減緩或終止，且較佳直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善。此後，可向患者投與預防性方案。實例 提供以下實例來進一步說明本發明，而非限制其範疇。本發明之其他變化形式對於一般技術者明顯易懂且涵蓋於隨附申請專利範圍中。實例 1 ：抗體篩選及產生 製備用作抗原之人類 FGFR1c_ β -klotho_300.19 細胞 產生穩定表現人類FGFR1c (1-386 aa)及β-klotho之300.19細胞用作全細胞抗原。將編碼人類β-klotho (GenBank登錄號NM_175737)之全長cDNA選殖至pEF1/Myc-His B (Invitrogen目錄號V92120)之Eco RI及Eco RV位點。將編碼人類FGFR1c (GenBank登錄號NM_023106)之胺基酸1至386的cDNA選殖至pEF6/Myc-His B (Invitrogen，目錄號V96220)之Bam HI及Not I位點中。在兩種構築體中，緊挨起始密碼子之前包含Kozak序列(CACC)，並在載體中之Myc-His標籤之前添加終止密碼子。使用Amaxa Nucleofector裝置及Nucleofector套組(Lonza，目錄號VCA-1003)藉由電穿孔用β-klotho及FGFR1c質體共轉染鼠類pre-B 300-19細胞。持續3週使用1 mg/ml遺傳黴素(Geneticin) (Invitrogen，目錄號10131)及8 μg/ml殺稻瘟菌素(Blasticidin) (Invitrogen，目錄號46-1120)選擇穩定純系。製備用於細胞分析法之表現 FGFR/ β -klotho 的 HEK293 細胞 為了測試β-klotho抗體之結合特異性、功能活性或直系同源基因交叉反應性，使用標準Lipofectamine 2000轉染及細胞純系選擇方法產生穩定表現人類FGFR1c_β-klotho、人類FGFR2c_β-klotho、人類FGFR3c_β-klotho、人類FGFR4_β-klotho或食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho之HEK293細胞。 使用以下編碼全長人類β-klotho (NM_175737)、人類FGFR1c (NM_023106)、人類FGFR2c (NP_001138387)、人類FGFR3c (NP_000133)或人類FGFR4 (NP_998812) cDNAs之哺乳動物表現質體：對於食蟹獼猴β-klotho而言，使用基於人類及恆河猴β-klotho序列之引子從食蟹獼猴脂肪組織cDNA (BioChain，目錄號C1534003-Cy)中PCR擴增全長序列，並進行選殖。使用基於人類FGFR1c序列(編號NM_023106)之引子從食蟹獼猴脂肪組織cDNA (BioChain，目錄號C1534003-Cy)中選殖食蟹獼猴FGFR1c cDNA，且顯示其在胺基酸水平上與人類FGFR1c一致。因此，由於人類及食蟹獼猴FGFR1c胺基酸序列係一致的，所以使用上述人類FGFR1c cDNA構築體來製備穩定表現食蟹獼猴β-klotho及人類FGFR1c (編號NM_023106)之HEK293細胞。測定抗體與 β -klotho 之結合親和力 使用Biacore動力分析測定抗體之結合親和力。將S系列感測器晶片CM5 (GE Healthcare，目錄號BR-1005-30)平衡至環境溫度持續約30分鐘。用1x HBS-EP+緩衝液(10x溶液，GE Healthcare，目錄號 BR-1006-69)接觸系統並將晶片載入至Biacore儀器中。使用BIA標準化(GE Healthcare，目錄號BR-1006-51)溶液對晶片進行標準化，並用50 mM NaOH以60 μL/分鐘之流速對所有流動路徑調節晶片。重複30秒注射三次，等待時間為60秒。以60 μL/分鐘注射10 mM乙酸鈉pH 5.0持續120秒並重複兩次。在使用人類抗體捕獲套組(Human Antibody Capture Kit) (GE Healthcare，目錄號BR-1008-39)固定抗人類IgG Fc開始新循環之後。在固定緩衝液(10 mM乙酸鈉pH 5.0)中將抗人類Fc Ab稀釋至50 μg/mL。將胺偶聯劑以1:1 (EDC及NHS)混合並以10 μL/分鐘注射7分鐘。隨後以10 μL/分鐘注射抗人類Fc Ab 6分鐘。最後，以10μL/分鐘注射乙醇胺7分鐘，等待時間為60秒。這應導致約8000至10000 RU之固定。隨後吾人對NOV004、NOV005及NOV006進行10 RU之Rmax (捕獲水平=〜28 RU)的測試注射。使用10 uL/mL之流速及3 M MgCl2 再生緩衝液完成此步驟。每次均對各流槽進行評估，歸因於晶片表面、IgG親和力、IgG蛋白質質量及稀釋度差異之變化。吾人從0.5 ug/mL之IgG濃度開始，並根據試樣注射之結果增加(或減少)濃度。例如，若在15秒內觀察到100 RU，則吾人將Ab溶液稀釋至0.25 ug/mL並重複注射。在測定各流槽中各抗體之捕獲參數之後，將各種濃度之人類β-klotho通過晶片並藉由Biacore動力學計算ka (1/Ms)、kd (1/s)、KD (M)及Rmax (RU)。確定不同抗體是否競爭性結合至 β -klotho 使用Forte Bio確定抗體是否競爭性結合至人類β-klotho。使用PBS緩衝液以1/10 (v/v)比率在10x動力學緩衝液(Forte Bio目錄號18-1092)中稀釋所有試樣及試劑。用動力學緩衝液將人類β-klotho (R and D Systems 5889-KB-050)稀釋至所需濃度(5 ug/ml)。將人類β-klotho載入至抗his感測器(Forte Bio，目錄號18-5114)上持續20秒，隨後將抗體1載入至該感測器上持續400秒直至達到飽和條件(200 nM)。最後在200 nM抗體1的存在下將競爭抗體以200 nM載入至該感測器上持續100秒。第二結合信號之缺失指示抗體競爭結合至人類β-klotho。使用 pERK 細胞分析法測量 FGFR_ β -klotho 受體活化 使用標準技術進行細胞培養及量測磷酸-ERK 1/2 (pERK)水平。簡而言之，在37℃ 5% CO2 下將穩定表現人類FGFR1c_β-klotho、人類FGFR2c_β-klotho、人類FGFR3c_β-klotho、人類FGFR4_β-klotho或食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho之HEK293細胞維持在含有10% FBS (Hyclone，SH30071)、殺稻瘟菌素(Invitrogen，A1113902)及遺傳黴素(Invitrogen，10131035)之DMEM培養基(Invitrogen，11995)中。將細胞接種至384孔聚-D-離胺酸塗層板(BD Biosciences，354663)中，並在37℃ 5% CO2 下培養過夜，其後接著血清飢餓。 將融合瘤上清液或β-klotho抗體在Freestyle 293培養基中稀釋，並將各種濃度之抗體添加至板中。培育後，洗滌細胞，隨後用胞溶緩衝液溶解。將細胞胞溶產物轉移至384孔分析法板(PerkinElmer，目錄號6008280)，並使用AlphaScreen SureFireTM pERK 1/2套組(Perkin Elmer，TGRES10K)量測磷酸-ERK 1/2水平。使用標準AlphaScreen設置在EnVision 2104多標籤閱讀器(Perkin Elmer)上讀取板。使用方程Y = 底部 + (頂部-底部)/(1+10^((LogEC50 -X) x 斜率))及GraphPad Prism 5軟體將劑量-反應數據繪製為pERK活性基礎倍數與蛋白濃度比以確定EC50 值。單株抗體之製備 基本上藉由如Dreyer等人(2010)中所述(Dreyer AM等人(2010) BMC Biotechnology 10:87)的全細胞免疫在Balb/c (Jackson Laboratory菌株：BALB/cJ)或Bcl2 22 wehi (Jackson Laboratory菌株：C.Cg-Tg(BCL2)22Wehi/J)小鼠中產生抗人類β-klotho抗體。 簡而言之，以10至30天之間隔將1 x 107 個人類FGFR1c_β-klotho_300.19細胞注射至Balb/c小鼠中六次。用弗氏完全佐劑(Freund's Complete Adjuvant) (Sigma-Aldrich F5881)完成第一次全細胞注射。細胞及佐劑不混合，且分別注射至兩個相近但不同之皮下部位中。其後接著用Sigma佐劑系統(Sigma-Aldrich S6322)或不用佐劑腹膜內注射相同之細胞。 使用Bcl2 22 wehi小鼠，將1 x 107 個人類FGFR1c_β-klotho_300.19細胞以7天之間隔注射至此等動物中四次。用弗氏完全佐劑(Sigma-Aldrich F5881)完成首次注射。將細胞及佐劑分別注入兩組兩個相近但不同之皮下部位。隨後在無佐劑的情況下完成皮下細胞注射。 藉由熒光激活細胞分選(FACS)分析法量測免疫小鼠中之免疫反應。使用經1,000倍或10,000倍稀釋之免疫小鼠血清染色人類FGFR1c_β-klotho_HEK及人類FGFR1c_β-klotho_300.19細胞，其後接著使用別藻藍蛋白(APC)第二抗鼠類IgG檢測抗體(Jackson ImmunoResearch目錄號115-136-071)進行染色。在Becton Dickinson LSRII或Foressa流式細胞儀上讀取熒光。選擇4隻效價最高之小鼠用於電融合。融合瘤篩選、次選殖及選擇 在Cytofusion培養基(LCM-C，Cyto Pulse Sciences)中洗滌2 x 108 個脾臟細胞及5 x 107 個融合配偶體F0細胞(ATCC，CRL-1646)，並根據製造商之說明書以600伏之峰值脈衝使用Hybrimune波形發生器(Cyto Pulse Sciences，型號CEEF-50B)進行融合。將細胞以每孔3000個F0細胞之計算密度接種至384孔板中，並在HAT選擇培養基(Sigma-Aldrich目錄H0262)中培養。 主篩選使用高通量FACS平台(Anderson, Paul. Automated Hybridoma Screening, Expansion, Archiving and Antibody Purification. In: 3rd Annual 2014 SLAS Conference. 2014年1月18日至22日，San Diego, CA)進行。簡而言之，將融合瘤上清液與人類FGFR1c_β-klotho穩定表現及非表現細胞系一起培育，並用抗鼠類IgG-APC二抗(Jackson ImmunoReseach目錄號115-136-071)測定抗體結合。 測試來自每種融合瘤上清液之抗體同時針對四種條形碼化之細胞系的結合：300.19親本細胞、human_FGFR1c_β-klotho_300.19細胞、親本HEK293細胞及人類FGFR1c-β-klotho_HEK 293細胞。主篩選中選擇了348次命中。初次命中在96孔板中擴大，並藉由FACS再次確認在人類FGFR1c_β-klotho_HEK 293細胞上之結合，獲得122個經確認之命中。使用本文所述之磷酸-ERK 1/2分析法法針對人類FGFR1c_β-klotho受體複合物之細胞活化對115個FACS重新確認結合之命中之含HAT (次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷)培養基的上清液進行分析。 將其中上清液中具有最高磷酸-ERK 1/2細胞活性的融合瘤擴大，並從其等之上清液中純化IgG。使用實例2中所述之磷酸-ERK 1/2分析法法針對人類FGFR1c_β-klotho受體複合物之細胞活化分析來自74個融合瘤之經純化IgG。使用實例2中所述之磷酸-ERK 1/2分析法法針對對食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物之直系同源基因交叉反應性及對人類FGFR2c_β-klotho及人類FGFR3c_β-klotho受體複合物之選擇性分析對人類FGFR1c_β-klotho受體複合物之磷酸-ERK 1/2活化具有最佳潛力的融合瘤IgG。以此等分析結果為基礎，選擇一些融合瘤純系(例如，127F19)進行進一步分析。特定言之，針對交叉反應性分析最有效之純化IgG(諸如純系127F19)並顯示激活食蟹獼猴FGFR1c_β-Klotho；但不激活人類FGFR2c_β-Klotho、FGFR3c_β-Klotho、FGFR4_β-Klotho或Klotho_FGFR。所選IgG (例如純系127F19)結合至表現β-Klotho或FGFR1c_β-Klotho之細胞，而非單獨表現FGFR1c之細胞。 為了評估表現α-klotho之細胞中的127F19信號傳導，使用α-klotho、Egr1-螢光素酶及Renilla螢光素酶轉染HEK293細胞。簡而言之，將HEK293細胞在DMEM、10% FBS中培養並以30000個細胞/孔接種，並使用Lipofectamine 2000用Klotho、Egr-1-luc及TK-Rennila轉染。第二天，將FGF23、FGF21及127F19在補充有0.1% FBS之DMEM中稀釋至指定濃度並添加至轉染細胞過夜。根據製造商之說明，藉由Dual-Glo熒光素酶分析法套組(Promega，E2920)檢測螢光素酶活性。不出所料，需要α-klotho表現用於其信號傳導之FGF23顯示強烈的螢光素酶表現。然而，FGF21或127F19均不顯示任何顯著的螢光素酶表現，此表明α-klotho不作為FGF21或此等FGF21模擬抗體之共同受體。單株抗體之人源化及親和力成熟 人源化 人源化之過程係在此項技術中經充分描述(Jones PT等人(1986) Nature 321: 522-525；Queen C等人(1989) PNAS USA 86: 10029-10033；Riechmann L等人(1988) Nature 33:323-327；Verhoeyen M等人(1988) Science 239: 1534-1536)。術語人源化描述非人抗體(例如，鼠源抗體)之抗原結合位點至人類受體架構(例如，人類生殖系序列)之轉移(Retter I等人(2005). Nucleic Acids Res. 33:D671-D674.)。 使抗體人源化之主要原理為使在人體中產生對抗體之免疫原性反應的風險最小化(Rebello PR等人(1999) Transplantation 68: 1417-1420)。抗原結合位點包含互補決定區(CDR) (Chothia C及Lesk AM (1987) Journal of Molecular Biology 196: 901-917；Kabat E等人(1991) Anon.第5版；NIH出版號91: 3242)及位於CDR外部(即，在直接或間接影響結合之可變域(VL及VH)的架構區中)之位置。例如，可在位於CDR2與CDR3之間之所謂的「外」環區中發現可直接影響結合之架構殘基。間接影響結合之殘基係在例如所謂的維尼爾區(Vernier Zone)中發現(Foote J, Winter G. (1992) Journal of Molecular Biology 224:4 87-499)。其等被認為支持CDR構象。當選擇合適受體架構來最小化架構區中最終人源化抗體與人類生殖系受體序列之偏差數目時，將考慮在CDR外部之此等位置。 針對輕鏈及重鏈兩者之人源化測試多種人類生殖系受體架構。例如，針對重鏈之人源化測試人類架構VBase_VH4_4-30.1及VBase_VH3_3-21，並針對輕鏈之人源化測試人類架構VBase_VK1_O18及VBase_VK3_L25。序列最佳化親和力成熟 已知某些胺基酸序列基元經歷轉譯後修飾(PTM)，諸如醣基化(即NxS/T，x為除P外之任一者)、游離半胱胺酸之氧化、脫醯胺(例如NG)或異構化(例如DG)。若存在於CDR區中，則藉由定點誘變理想地移除彼等基元以增加產物之均一性。 親和力成熟之過程係在此項技術中經充分描述。在許多顯示系統中，噬菌體顯示(Smith GP, 1985, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317)及在諸如酵母之真核細胞上的顯示(Boder ET及Wittrup KD, 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology 15: 553-557)似乎係最普遍應用之系統來選擇抗體-抗原相互作用。彼等顯示系統之優點為其等適用於寬範圍之抗原，及可輕易地調節選擇嚴格性。在噬菌體顯示中，可顯示scFv或Fab片段，並額外在酵母中顯示全長IgG。彼等普遍應用之方法允許從具有超過10E7之多樣性的較大庫中選擇所需抗體變異體。具有較小多樣性之庫(例如10E3)可藉由微表現及ELISA進行篩選。可藉由例如易錯PCR (Cadwell RC及Joyce GF, 1994, Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140)產生非靶向或隨機抗體變異體庫，並提供非常簡單但有時受限制之方法。另一種策略為CDR定向抗體候選者之多樣化。可使用例如簡併寡核苷酸(Thompson J等人，1996, Affinity maturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop of human immunodeficiency virus: use of phage display to improve affinity and broaden strain reactivity. J. Mol. Biol. 256: 77-88)、三核苷酸誘變(TRIM) (Kayushin AL等人，1996, A convenient approach to the synthesis of trinucleotide phosphoramidites--synthons for the generation of oligonucleotide/peptide libraries. Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755) 或此項技術中已知之任何任何其他方法特異性靶向一或多個CDR之一或多個位置。對人源化候選者進行胺基酸修飾以移除PTM。表現質體之產生 編碼人源化VL及VH域之DNA序列係在GeneArt™ (Life Technologies Inc. Regensburg, Germany)訂購，其包括針對智人之密碼子最佳化。藉由剪切及黏貼將編碼VL及VH域之序列自GeneArt源載體次選殖至適於在哺乳動物細胞中分泌之表現載體中。將重鏈及輕鏈選殖至個別表現載體中以允許共轉染。表現載體之元件包括啟動子(細胞巨大病毒(CMV)增強子-啟動子)、促進分泌之信號序列、聚腺苷酸化信號及轉錄終止子(胎牛生長激素(BGH)基因)、允許在原核生物中附加型複制及複製之元件(例如SV40起點及ColE1或本領域已知的其他)及允許選擇之元件(胺苄西林(ampicillin)抗性基因及爭光黴素(zeocin)標記)。人源化抗體候選者之表現及純化 組成性地表現SV40大T抗原(HEK293-T ATCC11268)之人類胚腎細胞為用於短暫表現人源化及/或最佳化IgG蛋白之常用宿主細胞系中的一種。使用PEI (聚伸乙基亞胺，MW 25.000直鏈，Polysciences, USA目錄號23966)作為轉染試劑進行轉染。 藉由親和力在HiTrap ProtA MabSelect®SuRe柱上進行第一次純化。測試溶離液之聚集(SEC-MALS)及純度(SDS-PAGE、LAL及MS)。若需要，第一次純化之池裝有SPX (Hi Load 16/60 Superdex 200等級120 mL (GE-Helthcare))。NOV004、NOV005及NOV006為衍生自小鼠融合瘤127F19之人源化mAb。選擇IgG1 L234A/L235A (LALA)或IgG1κ D265A/P329A (DAPA)同型物作為預防方法以降低抗體促進抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力(參見例如，Hezareh M等人(2001) Journal of Virology 75: 12161-12168)。如所述般表現並純化為IgG1 (DAPA)同型物之人源化候選者NOV004、NOV005及NOV006。實例 2 ：單株抗體之活體外表徵 進行活體外工作以顯示NOV004、NOV005及NOV006之結合及細胞活性特性。如實例1中所述之Biacore係用於估計mAb對人類β-klotho之KD s。NOV004、NOV005及NOV006各自具有經計算為約3xE-10M、3xE-10M及4xE-10M之KD s。 使用如實例1中所述之pERK分析法來分析mAb之FGFR_β-klotho受體活性。NOV004激活人類及食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物，其中各自EC50 s經計算約為3 nM及20 nM (圖1)。NOV005激活人類及食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物，其中各自EC50 s經計算約為3 nM及16 nM (圖1)。NOV006激活人類及食蟹獼猴FGFR1c_β-klotho受體複合物，其中各自EC50 s經計算約為4 nM及18 nM (圖1)。NOV005、NOV006及NOV006不激活人類FGFR2c_β-klotho、FGFR3c_β-klotho或FGFR4_β-klotho受體複合物(圖2)。如實例1中所述般分析mAb之FGF23活性。NOV005、NOV006及NOV004不顯示FGF23活性(圖3)。Forte Bio資料顯示，NOV005及NOV006與NOV004競爭結合至人類β-klotho (圖4)。 藉由具有人類IgG1-LALA同型物NOV004之形式的人類β-klotho細胞外結構域之氫氘交換進行的抗原決定基標測研究顯示，以下肽在mAb-β-klotho ECD複合物中受顯著保護：246至265、343至349、421至429、488至498、509至524、536至550、568至576、646至669、773至804、834至857及959至986 aa；及以下區域受最強保護：246至265、536至550、834至857及959至986 aa (資料未顯示；參見PCT國際申請公開案號WO 2017/021893，其以全文引用之方式併入本文中)。這些組合結合、活性及競爭資料之研究指示，NOV005及NOV006亦將顯著保護該等β-klotho ECD區域。實例 3 ：單株抗體在大鼠中之藥物動力學曲線 動物及維持條件 根據實驗動物護理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council)提供動物護理及飼養。所有程序均由美國衛生及公共服務部(US Department of Health and Human Services)所制定之標准進行控管，並根由據諾華生物醫學研究院(NIBR)動物護理及使用委員會所批准之方案進行。將雄性史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat) (n = 3/組)安置於在架子上之實底籠中，其經裝備以自動供水任意採食，保持12小時光照/黑暗週期(上午6點至下午6點)，並免費獲得標準囓齒動物食物(Harlan-Teklad；Frederick, MD；目錄號8604)。飼養場保持在68與76℉之間，濕度為30至70%。NOV004 、 NOV005 或 NOV006 製備及給藥 NOV004、NOV005及NOV006含於10 mM His/His-HCl、220 mM蔗糖中之儲備溶液在使用前在冷藏下解凍。在給藥早晨，將所有三種抗體在PBS中稀釋至約3 mg/mL，並將適量體積吸入給藥注射器(3 mL/kg)中並保持在室溫直至給藥。將動物置於管型限位器中並經由靜脈內(IV)注射將NOV004、NOV005或NOV006投與至尾部靜脈中(10 mg/kg)。血樣收集 在第-3天(基線)、第0天 (給藥後1小時及6小時)、及給藥後第1、2、3、4、8、16及28天收集血樣。所有時間點均為從第0天給定之劑量投與結束時開始計時。在每個時間點，用EDTA (Becton, Dickinson, and Company；Franklin Lakes, NJ；目錄號365973)將約70 μl(70 μL)之血液收集至BD Microtainer收集/分離管中。用紗布施加壓力以止血。使試樣在20,817 x g下離心10分鐘，並隨後將〜30 μL血漿轉移至0.2 mL Thermo-strip管(Thermo-Scientific；Pittsburg, PA；目錄號AB-0451)並在80℃下冷凍。每次收集後，將大鼠送回家籠中。血漿總 NOV004 、 NOV005 或 NOV006 濃度之量測 使用定制夾心免疫分析法定量大鼠血漿中之人類IgG (即NOV004、NOV005或NOV006)，其中山羊抗人類Fc-γ抗體(KPL號109-005-098)作為捕獲抗體且具有HRP標記之山羊抗人類-IgG作為檢測抗體。將捕獲抗體(2 μg/mL含於PBS中，30 μL/孔)塗覆於384孔白色微量滴定板(Greiner Bio-One；Monroe, NC；目錄號781074)上。在室溫(RT)不振盪下培育板過夜。在不洗滌的情況下抽吸塗覆溶液後，將90 μL之1x乳液稀釋劑/阻斷溶液(KPL；Gaithersburg, MD；目錄號50-82-01)添加至每個孔中，並將板在RT下培育2小時。在培育結束時，吸出溶液，並將板在-80℃下與乾燥劑一起儲存於箔袋中。 在分析法當天，藉由在酪蛋白緩衝液中連續稀釋來製備十六個NOV004、NOV005及NOV006標準濃度，範圍為0.244至4000 pM，包括緩衝液陰性對照。所有研究試樣均在酪蛋白緩衝液中手動1:50稀釋，並隨後使用Biomek Fx連續稀釋5倍，總共為三次稀釋。將板在室溫培育2小時，並隨後用磷酸鹽洗滌緩衝液(90 μL/孔)洗滌3次。將經HRP標記之山羊抗人類IgG (400 ng/mL含於酪蛋白緩衝液，30 μL/孔)添加至每個板中，並將板在RT下培育1小時。用磷酸鹽緩衝液(90 μL/孔)洗滌板3次，並隨後添加KPL LumiGLO化學發光底物(30 μL/孔；目錄號54-61-00)。立即在SpectraMax M5板讀器(Molecular Devices)上以50 ms積分時間在所有波長下讀取化學發光。從NOV004、NOV005或NOV006標準曲線***血漿試樣中之人類Fc濃度(pM)，乘以稀釋因子，並轉換成nM濃度。 在IV投與NOV004、NOV005或NOV006後1小時，動物呈現約200 μg/mL之平均Cmax 。NOV004、NOV005及NOV006在史－道二氏大鼠中呈現相同之PK曲線(圖5)。實例 4 ：可開發性及調配物評估 對抗體NOV004、NOV005及NOV006進行生產過程及調配物研究。在之前評估NOV004期間所觀察到之高分子量物質(HMW)的形成表明溶液中高度聚集且促進其他FGF21模擬抗體之發展及評估，其具有可比較功能活性但更佳之生產及調配物特性，例如，沒有或極少觀察到HMW形成(例如，少於20%、少於15%、少於10%、或少於5%)。 在GeneArt™ (Life Technologies Inc. Regensburg, Germany)及ATUM (Menlo Park, CA)處訂購編碼抗體NOV005及NOV006之DNA序列，其包括針對智人之密碼子最佳化。將表現NOV004、NOV005及NOV006之載體線性化並轉染至CHO細胞系中。使用10nM甲胺蝶呤(MTX)選擇池直至恢復至＞95%存活率。選擇每個分子之一個池用於波產生並適當擴大規模。13天後收穫波產生之培養物上清液並過濾。 使用針對標準抗體之兩種管柱層析純化方法處理NOV005及NOV006之波收穫物質——使用親和層析(樹脂-GE Healthcare MabSelect SuRe)進行捕獲及使用陽離子交換層析(CEC)(樹脂-Fractogel EMD SO3-)進行精細純化。使所捕獲之物質接受病毒滅活(將pH調節至3.5，在室溫下在此pH下培育70分鐘，其後接著將pH調節至5.0)並在通過CEC處理之前進行無菌過濾。在CEC之後，使用切向流過濾將物質透濾以使緩衝液交換成10mM組胺酸/組胺酸-HCl，pH 5.0。隨後，將物質濃縮至約200 mg/mL以提供用於調配物研究之物質。例如，在調配物緩衝液中評估抗體，並確定某些參數，特定言之，在40℃下4週後之HMW的形成。下表3總結來自例示性實驗之資料，該實驗評估在40℃下4週後在NOV004、NOV005及NOV006之試樣中所觀察到之HMW的形成。表 3 ： 高分子量物質(HMW)形成
Figure 107104076-A0304-0001
 LOQ = 量化極限 NOV005及NOV006相對於NOV004在序列方面的差異賦予儲存時HMW形成之顯著改良。NOV005及NOV006兩者在40℃下4週顯示小於1%之HMW形成，而NOV004顯示高得多的HMW形成，在40℃下4週約64%之HMW形成。 下文提供NOV005及NOV004之VH及VL的序列比對：VH 一致性：79.2 相似性：88.3%
Figure 02_image019
VL 一致性：99.1% 相似性：100.0%
Figure 02_image021
Figure 02_image023
此資料顯示，與NOV004相比，NOV005及NOV006出乎意料地顯示最小的聚集趨勢，如HMW之形成所示，且表明，NOV005及NOV006顯示對醫藥調配物而言合適且更佳之特徵。實例 5 ：在肥胖食蟹獼猴中之研究 研究FGF21模擬mAb (諸如NOV004、NOV005或NOV006)在肥胖食蟹獼猴中對食物消耗、體重及血漿生物標記之影響。 例示性方案： 使用間隔一周(研究第0天及第7天)投與之兩次皮下(s.c.)，1 mg/kg劑量的FGF21模擬mAb 諸如NOV004、NOV005或NOV006)處理五隻雄性食蟹獼猴，並在給藥後超過100天評估食物消耗、體重及血漿生物標記。對每個劑量而言，將動物限制在其家籠中，收集血樣，並隨後給予每隻動物1 mg/kg皮下劑量之FGF21模擬mAb (諸如NOV004、NOV005或NOV006)。食物消耗量測在第一次劑量前1週開始，並在整個研究中繼續。在餵食前稱重研究飲食，並每天分成兩等份。第二天早上，收集剩餘的飲食並稱重。計數落在捕集盤中之顆粒(每個1 g)的數量並添加至剩餘食物之重量中。每日食物消耗係根據所提供之食物的重量減去所收集之食物的重量來計算。未量測水果及蔬菜之消耗。用稱重上之動態特徵在每週之三個早上(在採血或給藥之前)一式兩份地量測未餵養體重。量測血漿 FGF21 模擬 mAb 濃度 使用基於ELISA之夾心免疫分析法對食蟹獼猴血漿中之人類Fc IgG進行定量。抗人類IgG小鼠IgG1 (一種針對人類IgG之小鼠單株抗體)係用作捕獲抗體。用2 μg/mL抗人類IgG-IgG小鼠IgG1(30 μL/孔)塗覆白色Greiner 384孔板，並在室溫(RT)下培育過夜。吸出塗層抗體，並在室溫下以90 μL/孔加入1x乳液阻斷劑(KPL號50-82-01)持續2小時。吸出阻斷溶液並將板在-80℃下儲存於具有乾燥劑之板袋中直至進行分析法。在分析法當天，使板及試劑達到室溫。藉由將純化IgG在定制酪蛋白試樣稀釋劑中從4000稀釋至16 pM及包括緩衝液對照來製備標準物。將試樣在與標準物相同之稀釋劑中以1:50、1:250、1:1250及1:6250之比例一式兩份地稀釋，並隨後在室溫下將標準物、稀釋試樣及對照物添加至板中2小時(所有步驟之工作體積為30 μL/孔)。隨後用基於磷酸鹽之洗滌緩衝液洗滌板3次。在室溫下將經辣根過氧化物酶(HRP)標記之抗人類Fc-γ抗體添加至板1小時，并隨後用基於磷酸鹽之洗滌緩衝液洗滌板3次。將化學發光底物添加至板，並立即在發光板讀器上讀取板。 每個板一式三份地分析法FGF21模擬單株抗體(例如NOV004、NOV005或NOV006)標準物。一式兩份地分析法稀釋血漿試樣。將未知試樣從IgG標準曲線***。使用SoftMax Pro軟體v5.4.1進行曲線擬合、反算、回收率%及試樣濃度插值。使用4參數邏輯曲線擬合選項繪製並擬合由IgG標準物所產生之信號。經血漿試樣中之Fc濃度(pM)從FGF21模擬mAb標準曲線***並乘以稀釋因子。確定分析法之量化下限(LLOQ)及量化上限(ULOQ)。將LLOQ及ULOQ定義為100%回收率± 20%及CV ＜ 20%之最低及最高標準濃度，並隨後乘以稀釋因子。檢測抗藥物抗體 將血漿試樣在LowCross緩衝液(Boca Scientific；Boca Raton，FL；目錄號100 500)中以1:5稀釋。在LowCross緩衝液中製備含有0.6 μg/mL經生物素標記之FGF21模擬mAb及0.6 μg/mL經毛地黃毒苷標記之FGF21模擬mAb的反應混合物。將稀釋血漿(80 μL)與160 μL反應混合物在96孔U底板(BD Falcon；Billerica，MA；目錄號351177)中組合。用Parafilm密封板之邊緣，並將板在振盪平台上在37℃下培育2小時(150 rpm，避光)。隨後將每種混合物之等分試樣(100 μL)轉移至經鏈黴抗生物素塗覆之96孔板(Roche;目錄號11734776001)的複制孔中，該板係首先經由含有0.05% (v/v)吐溫-20之1X PBS組成的洗滌緩衝液洗滌三次(每孔300 μL)。將板密封，並隨後在室溫下在振盪平台上培育1小時(300 rpm，避光)。用洗滌緩衝液(每孔300 μL)洗滌板3次，並隨後將在LowCross緩衝液中1:2500稀釋之100 μL抗毛地黃毒苷過氧化物酶_POD Fab片段(Roche；目錄號11633716001)添加至每個孔中。將板密封，在室溫下在振盪平台上培育45分鐘(300 rpm，避光)，並隨後用洗滌緩衝液(每孔300 μL)洗滌3次。將TMB單組分HRP微孔底物(Bethyl Laboratories；Montgomery TX；目錄號E102；100 μL/孔)添加至每個孔中，並使藍色顯色9至10分鐘，避光。藉由將100 μL之0.18N H2SO4添加至每個孔中來終止顯色反應，將板短暫振盪，並在OD450 處量測黃色。血漿葡萄糖濃度之量測 使用Autokit葡萄糖分析法(Wako Chemicals；Richmond，VA；目錄號439-90901)量測血漿葡萄糖濃度。藉由將校準物稀釋至500、200、100、50、20及0 mg/dL標準物來製備標準曲線。在透明平底96孔板(Thermo Scientific；目錄號269620)中將預先加熱至37℃之分析法試劑(300 μL)添加至2 μL血漿、標準物及對照試樣中。將板在板振盪器上混合30秒，並隨後在37℃下培育5分鐘。在混合20秒後，使用Molecular Devices SPECTRAmax PLUS 384 (Sunnyvale，CA)在505/600 nm處讀取板。藉由與標準曲線比較來計算試樣葡萄糖濃度。血漿胰島素濃度之量測 根據製造商之說明使用Millipore人類胰島素特異性RIA套組(Billerica，MA；目錄號HI-14K)測定血漿胰島素濃度。將適量之分析法緩衝液、標準物或稀釋血漿試樣在5 mL 75 x 12 mm PP SARSTEDT管(目錄號55.526)中與125 I-胰島素及抗胰島素抗體混合。在室溫下將管渦旋、覆蓋並培育20小時。培育後，添加1 mL 4℃之沉澱試劑並將管渦旋並在4°C下培育30分鐘。使所有管離心30分鐘(4℃，3000 rpm)，傾析上清液，並在PerkinElmer WIZARD2自動γ計數器(型號2470；PerkinElmer；Waltham，MA)上計數顆粒。藉由與使用已知量之胰島素所產生的標準曲線比較來計算胰島素濃度。血漿三酸甘油酯濃度之量測 使用三酸甘油酯(GPO)液體試劑組(Pointe Scientific；Canton，MI；目錄號T7532-500)量測血漿三酸甘油酯(TG)濃度。在透明平底96孔板(Thermo Fisher Scientific；Tewksbury, MA；目錄號269620)中將經預熱之分析法試劑(300 μL，37℃)添加至5 μL血漿中。將板在板振盪器上混合30秒，並隨後置於37℃之培養箱中5分鐘。在混合20秒後，用SPECTRAmax PLUS板讀器在500 nm處量測吸光度。藉由與使用已知量之TG標準物(Pointe Scientific；目錄號T7531-STD)所產生的標準曲線比較來計算TG濃度。血漿膽固醇濃度之量測： 使用膽固醇(液體)試劑組(Pointe Scientific；目錄號C7510-500)定量血漿總膽固醇(TC)。在透明平底96孔分析法板(Thermo Fisher Scientific；目錄號269620)中將經預熱之分析法試劑(200 μL，37°C)添加至10 μL血漿中。將板在板振盪器上混合30秒，並隨後在37℃下培育5分鐘。在混合20秒後，在SPECTRAmax PLUS板讀器中在500 nm處量測吸光度。藉由與使用已知量之膽固醇標準物(Stanbio Laboratory；Boerne, TX；目錄號1012-030)所產生的校準曲線比較來計算膽固醇濃度。血漿高密度脂蛋白膽固醇濃度之量測 爲了測定高密度脂蛋白(HDL)膽固醇濃度，在0.5 mL微量離心管中將50 μL血漿試樣與50 μL膽固醇沉澱試劑(Wako Chemicals；Richmond, VA；目錄號431-52501)組合，並進行短暫渦旋。將管置於室溫下10分鐘，並隨後在4℃下以2000 xg 離心10分鐘。離心後，移除約一半之上清液(含有原始血漿試樣之HDL膽固醇部分)，並將10 μL用於上述之膽固醇分析法。血漿 β - 羥基丁酸濃度之量測 使用β-羥基丁酸LiquiColor測試套組(Stanbio Laboratory；目錄號2440-058)量測血漿β-羥基丁酸(β-HB)濃度。在透明平底96孔板(Thermo Fisher Scientific；目錄號269620)中將分析法試劑R1 (215 μL，預先加熱至37℃)添加至20 μL質量控制或血漿試樣中。將板在板振盪器上混合30秒，並隨後置於37℃之培養箱中5分鐘。在SPECTRAmax PLUS板讀器中在505 nm處量測預讀吸光度。將分析法試劑R2 (35 μL，預熱至37℃)添加至每個孔中，並將板再次在板振盪器上混合30秒並在37℃下培育5分鐘。在混合20秒後，在505 nm處量測最終吸光度，從中減去預讀值。β藉由與使用已知量之β-HB校準物(Wako Diagnostics；Richmond, VA；目錄號412-73791)所產生的校準曲線進行比較來計算β-HB濃度。統計分析 使用GraphPad Prism (第6.05版；GraphPad Software；La Jolla, CA)進行統計分析。將每隻動物之食物攝入量數據標準化為基線(以第-6天至第0天之平均值計算)之百分比，並隨後計算組平均值±平均值之標準誤差(SEM)；藉由非參數弗里德曼(Friedman)試驗及鄧恩(Dunn)多重比較後試驗，將每一天與第0天進行比較。將體重表示為組平均值±平均值之標準誤差(SEM)，以基線(以第-7、-5、-3及0天之平均值計算)之百分比計算。亦藉由非參數弗里德曼試驗及鄧恩多重比較後試驗分析原始體重及血漿生物標記數據。將P ＜ 0.05視為顯著。實例 6 ：在肥胖食蟹獼猴中研究 為了評估NOV005在雄性血糖正常肥胖食蟹獼猴中之作用，間隔一週投與兩次皮下1 mg/kg劑量之NOV005 (n = 5隻動物)或載體(n = 3隻動物)。中期研究結果總結如下： ● NOV005減少了標準食物之食物消耗，其中與基線相比峰值平均減少約60%(圖6A)，及與經NOV005處理之動物的基線相比平均峰值體重減少約10%(圖6B) ● 針對脂質及碳水化合物代謝之生物標記中的變化分析非空腹動物之血漿： ○ 在第35天，觀察到經NOV005處理之動物中血漿TG水平與基線相比平均降低約65% ○ 在第35天，相比基線NOV005亦使總膽固醇及胰島素降低，但此等變化在統計學上不顯著 ○ 在研究結束時將量測之其他生物標記包括脂聯素、β-羥基丁酸、ApoCIII、HDL-C及脂蛋白形態表 0 NOV005 改良肥胖食蟹獼猴之血漿生物標記水平
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 以引用方式併入 本文所引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書等，以及其中所引用之參考文獻，在其等尚未被引用的情況下，以全文引用之方式併入本文中。
圖 1 ： NOV004、NOV005及NOV006對人類(圖1A)及食蟹獼猴(圖1B)之FGFR1c_β-klotho_HEK293細胞的pERK活化。pERK活化資料指示，(i) NOV004分別以約3 nM及20 nM之EC50 激活人類及食蟹獼猴之FGFR1c_β-klotho受體複合物；(ii) NOV005分別以約3 nM及16 nM之EC50 活化人類及食蟹獼猴之FGFR1c_β-klotho受體複合物；及(iii) NOV006分別以約4 nM及18 nM之EC50 激活人類及食蟹獼猴之FGFR1c_β-klotho受體複合物。圖 2 ： NOV004、NOV005及NOV006對人類FGFR2c_β-klotho (圖2A)、FGFR3c_β-klotho (圖2B)及FGFR4_β-klotho (圖2C) HEK293細胞之pERK活化的分析。使用FGF21作為FGFR2c_β-klotho或FGFR3c_β-klotho之活化的陽性對照。使用FGF19作為FGFR4_β-klotho之活化的陽性對照。圖 3 ： 使用經α-klotho、Egr1-螢光素酶及Renilla螢光素酶轉染之HEK293細胞，針對FGF23活性之NOV004、NOV005及NOV006之圖譜分析。FGF23係用作陽性對照。圖 4 ： NOV005及NOV006針對NOV004之對人類β-klotho的競爭性結合活性。使用Forte Bio®生物感測器系統來測定對人類β-klotho之競爭性結合活性。在步驟1中，將重組人類β-klotho載入至該感測器上，其後接著在步驟2中載入NOV004直至飽和。隨後載入NOV005或NOV006並偵測針對NOV004之競爭性結合活性。第二結合信號之缺失指示抗體競爭結合至人類β-klotho。使用無關抗體作為陰性對照，且使用NOV004作為自我競爭之陽性對照。圖 5 ： 在大鼠中IV注射後之NOV004、NOV005及NOV006的濃度-時間曲線。在IV投與NOV004 (圖5A)、NOV005 (圖5B)或NOV006 (圖5C) 1小時後，動物呈現約200 μg/mL之平均Cmax ，其中三種抗體全部顯示可比較之PK曲線。圖 6A ： 將NOV005 (n = 5隻動物)或載體(n = 3隻動物)之兩個皮下1 mg/kg劑量間隔一週(給藥天數由箭頭指示)地投與至雄性血糖正常之肥胖食蟹獼猴。將標準飼料之食物消耗數據以組平均± SEM標準化為基線之百分比。在整個研究過程中，猴子以水果、蔬菜及花生為食。圖 6B ： 將NOV005 (n = 5隻動物)或載體(n = 3隻動物)之兩個皮下1 mg/kg劑量間隔一週(給藥天數由箭頭指示)地投與至雄性血糖正常之肥胖食蟹獼猴。經NOV005及載體處理之動物的基線體重分別為11.3 + 1.2及11.4 + 1.3 kg。將體重數據標準化為基線之百分比，其中 (A)組平均± SEM及(B)所示之個別動物數據。
<110> 瑞士商諾華公司(NOVARTIS AG)
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Figure 107104076-A0305-02-0189-68
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Figure 107104076-A0305-02-0192-74
Figure 107104076-A0305-02-0193-75
Figure 107104076-A0305-02-0194-76
Figure 107104076-A0305-02-0195-77
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Figure 107104076-A0305-02-0195-78
Figure 107104076-A0305-02-0196-79
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Figure 107104076-A0305-02-0197-80
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Figure 107104076-A0305-02-0197-81
Figure 107104076-A0305-02-0198-82
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Figure 107104076-A0305-02-0198-83
Figure 107104076-A0305-02-0199-84
Figure 107104076-A0305-02-0200-85
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Figure 107104076-A0305-02-0200-86
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Figure 107104076-A0305-02-0201-88
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Figure 107104076-A0305-02-0204-91
Figure 107104076-A0305-02-0205-92
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Figure 107104076-A0305-02-0205-104
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Figure 107104076-A0305-02-0206-95
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Figure 107104076-A0305-02-0208-97
Figure 107104076-A0305-02-0209-98
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Figure 107104076-A0305-02-0209-99
Figure 107104076-A0305-02-0210-100
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<212> DNA
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Figure 107104076-A0305-02-0210-101
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<220>
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Figure 107104076-A0305-02-0211-102

Claims (28)

  1. 一種結合至β-klotho之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)，及含有SEQ ID NO：26或32之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
  2. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含下列：包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的VL。
  3. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含下列：包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的輕鏈。
  4. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含下列：包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的VH及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的VL。
  5. 如請求項1之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含下列：包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的輕鏈。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  7. 一種如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項6之醫藥組合物的用途，其用於製備用於減輕體重之藥劑。
  8. 一種如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項6之醫藥組合物的用途，其用於製備用於減少食慾或食物攝取之藥劑。
  9. 一種如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項6之醫藥組合物的用途，其用於製備用於降低血漿三酸甘油酯(TG)濃度或血漿總膽固醇(TC)濃度之藥劑。
  10. 一種如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項6之醫藥組合物的用途，其用於製備用於治療罹患代謝病症之個體之代謝病症之藥劑。
  11. 如請求項10之用途，其中該個體罹患以下病症中之一或多者：代謝症侯群、心血管疾病及腎病。
  12. 如請求項11之用途，其中該個體罹患以下病症中之一或多者：肥胖、1型及2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡 萄糖耐受不良、高血糖症、急性心肌梗塞、高血壓、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭、冠心病、糖尿病併發症、神經病變、胃輕癱及與胰島素受體中之嚴重失活突變相關聯的病症。
  13. 如請求項11或12之用途，其中該個體罹患以下病症中之一或多者：急性心肌梗塞、高血壓、心血管疾病、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭及冠心病。
  14. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該個體罹患肥胖。
  15. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該個體罹患血脂異常。
  16. 如請求項15之用途，其中該血脂異常為高三酸甘油酯血症。
  17. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該個體罹患糖尿病。
  18. 如請求項17之用途，其中該糖尿病為2型糖尿病。
  19. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該個體具有胰島素抵抗性。
  20. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該個體罹患非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
  21. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該個體罹患非酒精性脂肪肝炎(NASH)。
  22. 一種如請求項1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段或如請求項6之醫藥組合物的用途，其用於製備用於治療罹患心血管病症之個體之心血管病症之藥劑。
  23. 如請求項22之用途，其中該個體罹患動脈粥樣硬化、外周動脈疾病、中風、心臟衰竭及冠心病中之一或多者。
  24. 一種核酸，其編碼結合β-klotho之抗體或其抗原結合片段，該核酸包含編碼如SEQ ID NO：15中所述之重鏈可變區及如SEQ ID NO：26或32中所述之輕鏈可變區之核苷酸序列。
  25. 一種載體，其包含如請求項24之核酸。
  26. 一種宿主細胞，其包含如請求項25之載體。
  27. 一種製備結合β-klotho之抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在適於表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養如請求項26之宿主細胞的步驟。
  28. 一種製備結合β-klotho之抗體或其抗原結合片段的方法，其包含培養宿主細胞的步驟，該宿主細胞包含載體，該載體包含如請求項24之核酸。
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