KR102386154B1 - Epo를 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EPO의 억제를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 EPO에 결합하고 EPO-의존성 세포 증식 및/또는 EPO-의존성 세포 신호전달을 억제할 수 있는 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

Description

EPO를 표적화하는 항체에 대한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING EPO}

당뇨병성 망막병증 (DR)은 당뇨병 환자에서 가장 흔한 합병증이다. 당뇨병성 황반 부종 (DME)은 DR의 임의의 단계에서 발생할 수 있고, DR 환자에서 시각 상실의 주요 원인이다. 10년간의 추적 후 DME의 발생은 제1형 당뇨병에서 20.1%, 제2형 인슐린-의존성 당뇨병에서 25.4%, 및 제2형 인슐린-비의존성 당뇨병에서 13.9%인 것으로 보고되어 있다 (Klein et al. (1995) Ophthalmology 102, 7-16). DR의 선구적 연구인 ETDRS 시험 ((1985) Photocoagulation for Diabetic Macular Edema - Early Treatment Diabetic- Retinopathy Study Report .1. Archives of Ophthalmology 103, 1796-1806)은 레이저 광응고 요법이 DME 눈에서 중등도의 시각 손실의 위험을 3년째에 ~50%만큼 감소시키기는 하지만, 단지 소수의 눈이 시각을 회복하고, 일부 눈은 집중 치료 후에도 계속해서 시각 손실을 겪는 것으로 입증하였다. 최근 몇 년간, 약물요법 및 안구 약물 전달에서의 진전은 DME의 치료가 유망함을 제시하였다. DME에서 2가지의 III상 본 시험 중 하나인 리스토어(RESTORE) 연구 (Mitchell et al. (2011) Ophthalmology 118, 615-625)는 루센티스(Lucentis)®가 레이저 단독요법보다 우수함을 입증하였다. 일차 임상 종점인 최대 교정 시력 (BCVA)에서의 평균 변화는 루센티스® 군에서 유의하게 개선되었다 (루센티스® 군의 경우에 +6.1 글자 vs. 레이저 군의 경우에 +0.8 글자; p < 0.0001). 유사한 유익한 효과가 VEGF 트랩-아이(Trap-Eye) (레게네론 인크.(Regeneron Inc.), 미국 뉴욕주) 및 오주르덱스(Ozurdex)® (덱사메타손 유리체내 임플란트; 알레간 인크.(Allergan Inc.), 미국 캘리포니아주)에 의해 입증되었다 (Do et al. (2011) Ophthalmology 118, 1819-1826; Haller et al. (2010) Archives of Ophthalmology 128, 289-296). 그러나, 오주르덱스로 치료한 눈의 16%에서 녹내장 위험이 있는 증가된 안내압이 발생하였다.

DME에 대한 이들 신규 치료 옵션에도 불구하고, 실질적인 미충족 의료 수요가 여전히 존재한다. 루센티스® 본 시험에서 눈의 ~25%는 치료 12개월 후 시력을 전혀 회복하지 못했고, 눈의 ~50%는 20/40 또는 더 나쁜 시력으로 남아있다. 게놈-전반 연관성 연구는 에리트로포이에틴 (Epo) 프로모터 다형성 (T)에 대해 동형접합인 당뇨병 환자는 증식성 DR이 발생할 위험이 2.17-배 더 높음을 나타내었다 (Tong et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 6998-7003). 흥미롭게도, Epo에 대해 T 프로모터 대립유전자를 갖는 사람은 G 대립유전자를 갖는 사람과 비교하여 Epo의 유리체 농도가 대략 7.5-배 더 높았다 (Tong et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 6998-7003).

현행 치료를 대체하거나 보충하기 위해 당뇨병성 망막병증, 특히 DME에 대한 유효 치료를 개발할 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명은 Epo 및/또는 다르베포이에틴에 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo 및/또는 다르베포이에틴에 100 pM 이하의 K_D로 결합한다. 예를 들어, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo 및/또는 다르베포이에틴에 50 pM 이하, 40 pM 이하, 35 pM 이하, 30 pM 이하, 25 pM 이하, 20 pM 이하, 15 pM 이하, 14 pM 이하, 13 pM 이하, 12 pM 이하, 11 pM 이하, 10 pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 인간 Epo에 비아코어(Biacore)에 의한 측정 시 35pM 이하, 또는 용액 평형 적정 (SET)에 의한 측정 시 6pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 다르베포이에틴에 비아코어에 의한 측정 시 24pM 이하, 또는 SET에 의한 측정 시 4pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다.

본 발명은 인간, 시노몰구스, 마우스 및/또는 래트 Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 Epo 헬릭스 D 및 루프 A-B로부터 선택된 아미노산을 포함하는 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간 Epo 헬릭스 D, 루프 A-B 및 헬릭스 A로부터 선택된 아미노산을 포함하는 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88)에 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89)에 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89) 및 헬릭스 A (인간 Epo의 아미노산 4-26; 서열 86)에 결합할 수 있다. 본 발명의 추가 측면에서, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88), 및 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89)에 결합할 수 있다. 본 발명의 추가 측면에서, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88), 및 헬릭스 A (인간 Epo의 아미노산 4-26; 서열 86)에 결합할 수 있다. 본 발명의 추가 측면에서, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88), 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89) 및 헬릭스 A (인간 Epo의 아미노산 4-26; 서열 86)에 결합할 수 있다.

본 발명은 또한 인간 Epo의 아미노산 잔기 Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, 및 Arg162를 포함하는 Epo (서열 81) 상의 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간 Epo의 아미노산 잔기 Ser9, Gln13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159, 및 Arg162를 포함하는 Epo (서열 81) 상의 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간 Epo의 아미노산 잔기 Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, 및 Arg162를 포함하는 Epo (서열 81) 상의 입체형태적 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 Epo에 결합하고 추가로 표 1에 기재된 바와 같은 항체와 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가로 표 1에 기재된 바와 같은 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 Epo에 결합하고 8.2 초과, 8.3 초과, 8.4 초과, 8.5 초과 또는 9.0 초과의 등전점 (pI)을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 시노몰구스 Epo, 마우스 Epo 및/또는 래트 Epo에 100 pM 이하, 80 pM 이하, 70 pM 이하, 60 pM 이하, 50 pM 이하, 40 pM 이하, 35 pM 이하, 30 pM 이하, 25 pM 이하, 20 pM 이하, 15 pM 이하, 10 pM 이하, 5 pM 이하, 4 pM 이하, 3 pM 이하, 2 pM 이하, 1 pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 시노몰구스 Epo, 마우스 Epo 및/또는 래트 Epo에 비아코어에 의한 측정 시 80pM 이하, 또는 SET에 의한 측정 시 40pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 시노몰구스 Epo에 비아코어에 의한 측정 시 80pM 이하, 또는 SET에 의한 측정 시 8pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 마우스 Epo에 비아코어에 의한 측정 시 45pM 이하, 또는 SET에 의한 측정 시 37pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 래트 Epo에 비아코어에 의한 측정 시 57pM 이하, 또는 SET에 의한 측정 시 13pM 이하의 K_D로 결합할 수 있다.

본원에 기재된 단리된 항체 및 항원 결합 단편의 결합 친화도는 SET에 의해 결정될 수 있다. SET 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 단편의 결합 친화도는 비아코어 검정에 의해 결정될 수 있다. 비아코어 동역학적 검정 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본원에 기재된 단리된 항체 및 항원 결합 단편은 Epo-의존성 세포 증식을 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하, 190 pM 이하, 180 pM 이하, 175 pM 이하, 170 pM 이하, 160 pM 이하, 150 pM 이하, 125 pM 이하, 115 pM 이하, 110 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하 또는 80 pM 이하의 IC₅₀으로 억제하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo-의존성 세포 증식을 시험관내 Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정에 의한 측정 시 338 pM 이하, 183 pM 이하, 175 pM 이하, 174 pM 이하, 145 pM 이하, 112 pM 이하, 89 pM 이하 또는 74 pM 이하의 IC₅₀으로 억제할 수 있다.

본원에 기재된 단리된 항체 및 항원 결합 단편은 B-세포에서 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 및 항원 결합 단편은 마우스 B-세포에서 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo-의존성 세포 증식을 시험관내 Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정에 의한 측정 시 350 pM 이하, 300 pM 이하, 250 pM 이하, 200 pM 이하, 175 pM 이하, 150 pM 이하, 125 pM 이하, 115 pM 이하, 110 pM 이하, 100 pM 이하, 90 pM 이하 또는 80 pM 이하의 IC₅₀으로 억제할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo-의존성 세포 증식을 시험관내 Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정에 의한 측정 시 338 pM 이하, 174 pM 이하, 112 pM 이하 또는 74 pM 이하의 IC₅₀으로 억제할 수 있다.

본원에 기재된 단리된 항체 및 항원 결합 단편은 인간 B-세포의 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo-의존성 세포 증식을 시험관내 F36E 세포 증식 검정에 의한 측정 시 200 pM 이하, 190 pM 이하, 180 pM 이하, 170 pM 이하, 160 pM 이하, 150 pM 이하, 125 pM 이하, 100 pM 이하 또는 90 pM 이하의 IC₅₀으로 억제할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo-의존성 세포 증식을 시험관내 F36E 세포 증식 검정에 의한 측정 시 183 pM 이하, 175 pM 이하, 145 pM 이하 또는 89 pM 이하의 IC₅₀으로 억제할 수 있다.

단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 차단할 수 있고/거나 세포 표면에 대한 Epo 결합을 방지할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 인간, 시노몰구스, 마우스 및/또는 래트 Epo에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편과 결합에 대해 경쟁한다.

본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 인간 또는 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편 또는 ScFv 단편 및/또는 IgG 이소형일 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 표 1에 기재된 Fab의 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 보다 구체적으로, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 표 1에 기재된 Fab의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 보다 구체적으로, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab NVS1 (각각 서열 13 및 14), NVS2 (각각 서열 33 및 34), NVS3 (각각 서열 53 및 54), 또는 NVS4 (각각 서열 73 및 74)의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 서열 1, 21, 41, 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; 서열 2, 22, 42, 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 서열 3, 23, 43, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하며, 인간 Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 이러한 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 추가로 서열 4, 24, 44, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 25, 45, 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 26, 46, 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함한다.

본 발명은 또한 서열 4, 24, 44, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 5, 25, 45, 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 6, 26, 46, 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하며, 인간 Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 갖는 Epo에 결합하며, 여기서 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 서열 1, 2, 3을 포함하고, LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 4, 5, 6을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 서열 21, 22, 23을 포함하고, LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 24, 25, 26을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 서열 41, 42, 43을 포함하고, LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 44, 45, 46을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2, HCDR3은 서열 61, 62, 63을 포함하고, LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 64, 65, 66을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 코티아(Chothia)에 의해 정의된 바와 같은 서열 13, 33, 53 또는 73의 가변 중쇄의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 14, 34, 54 또는 74의 가변 경쇄의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 서열 13, 33, 53 또는 73의 중쇄 가변 도메인 서열의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, 및 서열 14, 34, 54 또는 74의 경쇄 가변 도메인 서열의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 가질 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 13, 33, 53 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 조합되어 Epo에 대한 항원 결합 부위를 형성한다. 특히, 경쇄 가변 도메인 서열은 서열 14, 34, 54 및 74로부터 선택될 수 있으며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Epo에 결합한다.

본 발명은 또한 서열 14, 34, 54 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하며, 인간 Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인은 조합되어 Epo에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.

특히, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 서열 13 및 14; 33 및 34; 53 및 54; 또는 73 및 74의 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 가질 수 있다.

본 발명은 추가로 서열 13, 33, 53, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열 14, 34, 54, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 본 발명의 추가 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트에 의해 정의된 바와 같은, 표 1에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 갖는다. 또한, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 코티아에 의해 표 1에 기재된 바와 같이 정의될 수 있는 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 서열 14, 34, 54, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 가지며, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 15, 35, 55, 또는 75의 서열을 포함하는 중쇄를 가질 수 있다. 단리된 항체는 또한 중쇄와 조합되어 인간 Epo에 대한 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 경쇄를 포함할 수 있다. 특히, 경쇄는 서열 16, 36, 56, 또는 76을 포함하는 서열을 가질 수 있다. 특히, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 서열 15 및 16; 35 및 36; 55 및 56; 또는 75 및 76의 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 가질 수 있다.

본 발명은 추가로 서열 15, 35, 55, 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하며, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열 16, 36, 56, 및 76으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.

본 발명은 추가로 서열 16, 36, 56, 및 76으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, Epo에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 항체 조성물은 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 구체적으로, 본 발명은 추가로 표 1의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 예를 들어 항체 NVS1, NVS2, NVS3 또는 NVS4를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 2종 이상의 조합을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 서열 13, 33, 53 및 73으로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 특히, 핵산은 서열 17, 37, 57, 및 77로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 본 발명의 추가 측면에서, 서열은 서열 17, 37, 57, 또는 77이다.

본 발명은 또한 서열 14, 34, 54 및 74로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 특히, 핵산은 서열 18, 38, 58, 및 78로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 본 발명의 추가 측면에서, 서열은 서열 18, 38, 58, 또는 78이다.

본 발명은 또한 서열 18, 38, 58, 및 78로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터 중 하나 이상을 포함하는 단리된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 서열 및 상기 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 서열을 포함하며, 여기서 상기 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것인 단리된 숙주 세포에 관한 것이다. 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 숙주 세포는 비-인간 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계 (예를 들어, Epo를 대상체 내에서 접촉시킴)를 포함하는, Epo-의존성 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 방법은 세포 (예를 들어, Epo를 포함하는 세포)를 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 Epo가 세포 표면 상의 수용체와 상호작용하는 것을 방지하는 단계를 포함하는, Epo-의존성 세포 신호전달을 억제하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 방법은 Epo를 포함하는 세포를 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 Epo-의존성 세포 신호전달을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 Epo가 세포 표면 상의 수용체와 상호작용하는 것을 방지하는 단계를 포함하는, Epo-의존성 세포 증식 또는 신호전달을 억제하는 방법에 관한 것이다. 세포는 B 세포인 것으로 고려된다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계 (예를 들어, Epo를 대상체 내에서 접촉시킴)를 포함하는, Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체의 세포 상의 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제하는데 사용하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 추가로 Epo를 (예를 들어, 대상체 내에서) 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에 대한 Epo 결합을 억제하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 방법은 세포 (예를 들어, Epo를 포함하는 세포)를 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 대상체 내의 세포에 대한 Epo 결합을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 황반 부종을 치료하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체에서 황반 부종을 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 황반 부종은 망막 혈관 질환과 연관된다. 황반 부종과 연관된 망막 혈관 질환은 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 증식성 당뇨병성 망막병증, 비-증식성 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 또는 미숙아 망막병증을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체에서 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애를 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애는 당뇨병성 망막병증인 것으로 고려된다. 또 다른 측면에서, 상태 또는 장애는 연령-관련 황반 변성인 것으로 고려된다. 추가로, 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애는 망막 정맥 폐쇄, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 또는 미숙아 망막병증일 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 당뇨병성 망막병증과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체에서 당뇨병성 망막병증과 연관된 상태 또는 장애를 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 황반 부종과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체에서 황반 부종과 연관된 상태 또는 장애를 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로, 황반 부종과 연관된 상태 또는 장애는 당뇨병성 황반 부종인 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 대상체에게 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 증식성 당뇨병성 망막병증을 치료하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체에서 증식성 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 추가로, 조성물은 대상체의 눈에 투여되며, 여기서 조성물은 망막 정맥 확장을 감소시키고/거나, 혈관 누출을 감소시키고/거나, 안내 혈류를 증가시키는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

임의의 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에 사용된 용어, 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"은 주어진 항원 (예를 들어, 에리트로포이에틴: Epo)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)₂ 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인 또는 VL 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

추가로, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 재조합 방법을 사용하여 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있고, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성하여 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체는 하나 이상의 항원 결합 부분 또는 항체의 단편을 포함한다. 이들 항체 단편은 통상의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드에 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재한 미국 특허 번호 6,703,199 참조).

항원 결합 단편은 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있다 (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; 및 미국 특허 번호 5,641,870).

본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 다수의 부위에서 항원과 약한 비-공유 결합력을 통해 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강해진다. 본원에 사용된 용어 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어: Fab 단편)에 대한 "높은 친화도"는 일반적으로 10^-9M 이하의 KD를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.

용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것, 뿐만 아니라 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되어 있는 알파 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기를 갖거나 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "결합 특이성"은 오직 1종의 항원 결정기와 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다.

어구 항체 (예를 들어, Epo-결합 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합한다"는 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 Epo 또는 시노몰구스 Epo)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.

용어 "망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애"는 망막이 변성되거나 기능장애가 생기게 되는 상태, 장애 또는 질환을 지칭한다. 이는 당뇨병성 망막병증 (DR), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 증식성 당뇨병성 망막병증 (PDR), 비-증식성 당뇨병성 망막병증 (NPDR), 연령-관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 또는 미숙아 망막병증을 포함한다. Epo 억제에 의해 치료될 수 있는 망막 혈관 질환의 해부학적 특징은 황반 부종, 정맥 확장, 혈관 비틀림, 플루오레세인 혈관조영에 의한 측정 시 혈관 누출, 망막 출혈, 및 미세혈관 이상 (예를 들어 미세동맥류, 면화 반점, IRMA), 모세관 폐쇄, 백혈구 부착, 망막 허혈, 시신경 원판의 신생혈관화, 후극의 신생혈관화, 홍채 신생혈관화, 망막내 출혈, 유리체 출혈, 황반 반흔, 망막하 섬유증, 및 망막 섬유증을 포함한다.

용어 "당뇨병성 망막병증과 연관된 상태 또는 장애"는 망막 혈관계, 망막 대사, 망막 색소 상피, 혈액-망막 장벽, 또는 최종 당화 산물 (AGE)의 안구 수준, 알도스 리덕타제 활성, 글리코실화 헤모글로빈, 및 단백질 키나제 C에 대한 당뇨병 (제1형 또는 제2형)의 영향의 결과로서 망막이 변성되거나 기능장애가 생기게 되는 상태를 지칭한다. 당뇨병성 망막병증 환자에서 시각 상실은 망막 허혈, 황반 부종, 혈관 누출, 유리체 출혈의 결과, 또는 망막 뉴런에 대한 상승된 글루코스 수준의 직접적 효과일 수 있다. Epo 억제에 의해 치료될 수 있는 당뇨병성 망막병증의 해부학적 특징은 미세동맥류, 면화 반점, 정맥 확장, 황반 부종, 망막내 미세혈관 이상 (IRMA), 망막내 출혈, 혈관 증식, 원판의 신생혈관화, 피부홍조, 및 망막 허혈을 포함한다. "당뇨병성 황반 부종"은 당뇨병성 망막병증 대상체에서 발생하고, 질환의 임의의 단계에서 발생할 수 있다.

용어 "황반 부종과 연관된 상태 또는 장애"는 황반 종창 또는 비후가 망막 혈관 누출 유체, "황반 부종"의 결과로서 일어나는 상태 또는 장애를 지칭한다. 황반 부종은 망막 혈관 질환에서 일어나고, 종종 망막 혈관 질환의 합병증이다. 황반 부종과 연관된 구체적 상태 또는 장애는 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 황반 부종, 증식성 당뇨병성 망막병증, 비-증식성 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 또는 미숙아 망막병증을 포함한다. Epo의 억제에 의한 황반 부종의 치료는 안저 검사, 광 간섭 단층촬영, 및 개선된 시력에 의해 결정될 수 있다.

용어 "키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가, 상이하거나 또는 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가, 상이하거나 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체로 인해, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체와 비교하여 인간에서 감소된 항원성을 가지면서 항원을 인식하는 그의 특이성은 보유할 수 있다.

용어 "Epo 단백질" 또는 "Epo 항원" 또는 "EPO" 또는 "Epo"는 상호교환적으로 사용되고, 다양한 종에서의 에리트로포이에틴 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 인간 Epo는 표 1에 기재된 바와 같은 서열: 서열 81을 갖는다. 다른 종으로부터의 Epo 단백질의 예가 표 1에 서열 82, 83, 84 또는 85로 제공된다. 인간, 시노몰구스, 마우스, 래트, 및 토끼 Epo에 대한 단백질 서열은 공개적으로 입수가능하고, 표 1에 기재되어 있다. 인간 Epo는 또한 과글리코실화될 수 있다. 과글리코실화된 Epo는 관련 기술분야에서 또한 "다르베포이에틴"으로 공지되어 있고, 레크 파마슈티칼스(LEK Pharmacueticals)를 비롯한 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있다.

용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서, 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 통상의 기술자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.

폴리펩티드 서열의 경우에, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 배제하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기들로 이루어지고, 통상적으로 특정한 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 상실되지만 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역도 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 형태로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.

용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 (i) 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득되는 (ii) 불멸화 세포에 융합된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.

"인간화" 항체는 인간에서 덜 면역원성이면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응부 (즉, 불변 영역, 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체하여 달성될 수 있다. 예를 들어, [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]을 참조한다. 인간 조작 기술의 다른 예는 US 5,766,886에 개시된 조마(Xoma) 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 100% 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의한 측정 시 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교 및 정렬했을 때, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율 (즉, 명시된 영역에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에는 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성)을 갖는 경우에 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100개 내지 500개 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20개, 50개, 200개 또는 그 초과의 아미노산) 길이에 걸쳐 존재한다.

서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에는 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대안적 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.

본원에 사용된 "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후 서열을 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로는 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로는 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 개수 중 어느 하나의 절편에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘, [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘, [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575), 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.

퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 두가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘으로, 이는 각각 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977]; 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일한 길이의 워드와 정렬했을 때 어떠한 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치를 지칭한다 (상기 문헌 [Altschul et al.]). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이것을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수, 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우에는 점수화 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우에, 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 ([Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.

BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.

PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 패널티 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된 이. 메이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)을 사용하여 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 또한 결정할 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (월드 와이드 웹 상의 gcg.com에서 이용가능함)에 혼입된 니들만(Needleman) 및 분취(Wunsch) (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

상기 나타낸 서열 동일성의 백분율 이외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기 기재된 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 2개의 분자 또는 그의 상보체가 하기 기재된 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.

용어 "Epo-의존성 세포 증식을 억제한다"는 항-Epo 항체가 Epo에 의해 자극되고/거나 유도된 세포 활성화 (예를 들어, 세포 신호전달), 복제 및/또는 증식을 간섭하는 능력을 지칭한다. 구체적으로, "억제한다"는 대조군과 비교하여 본원에 기재된 바와 같이 항-Epo 항체 또는 그의 단편과의 접촉 후 대상체에서 Epo-의존성 세포 증식 또는 다른 파라미터 (예를 들어, Epo 의존성 세포 신호전달, 혈관신생)에서의 통계적으로 유의한 감소 (즉, p<0.05)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "Epo-의존성 세포 증식을 억제한다"는 또한 하기 기재된 바와 같은 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애를 갖는 것으로 진단된 환자에서 본원에 기재된 항-Epo 항체에 의한 치료 후 시각 기능 또는 망막 해부학에서의 임상적으로 관련된 개선을 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "Epo 의존성 세포 신호전달을 억제한다"는 Epo에 의해 자극되거나 유도된 세포내 신호전달 경로의 활성화에 있어서 통계적으로 유의한 (즉, p<0.05) 감소를 야기하는 본원에 기재된 항-Epo 항체의 능력을 지칭한다.

용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, Epo와 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 Epo 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). Epo에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 그러나 다른 항원에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 Fc 기능을 변경시키는 변형, 예를 들어 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 증진 또는 감소시키는 변형이 이루어진, 이들 부류 중 하나의 변형된 버전을 포함한다. 이소형은 경쇄 불변 영역에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, 카파, 람다)를 또한 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "K_D"는 Ka에 대한 Kd의 비 (즉, Kd/Ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되고, 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 K_D 값은 관련 기술분야에 널리 확립되어 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 방법은 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명을 측정하는 것, 또는 용액 평형 적정 (SET)에 의해 용액 중에서의 친화도를 측정하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용되고, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결부를 함유하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다.

달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 하기 상술되는 바와 같이, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3의 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 상기 용어는 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템 내에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우에, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하며, 즉 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 근접하여 위치할 필요가 없다.

본원에 사용된 용어 "최적화된"은, 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은, 또한 "모" 서열로도 공지되는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 본래 코딩되는 아미노산 서열을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다. 본원의 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현도 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열도 또한 최적화된 것으로 지칭된다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스), 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 특정 실시양태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지도 지칭하는 것으로 의도됨을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.

용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물 (예를 들어: 포유동물 및 비-포유동물), 예컨대 비-인간 영장류 (예를 들어: 시노몰구스 원숭이), 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 언급되는 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 사용된 용어 "시노" 또는 "시노몰구스"는 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 지칭한다.

본원에 사용된 용어, 임의의 질환 또는 장애 (예를 들어, 망막 혈관 질환, 당뇨병성 망막병증, 황반 부종)를 "치료하는" 또는 "치료"는, 한 실시양태에서, 질환 또는 장애를 개선하는 것 (즉, 질환 또는 그의 임상적 증상 중 적어도 하나의 발생을 늦추거나, 저지하거나, 또는 감소시키는 것)을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 환자에 의해 식별가능하지 않을 수 있는 것을 비롯한 적어도 하나의 물리적 파라미터를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 (예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 다로 조절하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 예방하거나 지연시키는 것을 지칭한다. 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애, 당뇨병성 망막병증과 연관된 상태 또는 장애, 및/또는 황반 부종과 연관된 상태 또는 장애를 비롯한, 본원에 기재된 적응증과 관련하여 "예방"은 시각 기능, 망막 해부학, 망막 혈관 질환 파라미터, 당뇨병성 망막병증 질환 파라미터, 및/또는 황반 부종 질환 파라미터의 악화 위험이 있는 환자에서 하기 기재된 바와 같이 상기 악화를 예방하거나 늦추는 임의의 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애, 당뇨병성 망막병증과 연관된 상태 또는 장애, 및/또는 황반 부종과 연관된 상태 또는 장애의 "치료"는 시각 기능 및/또는 망막 해부학의 개선 또는 보존을 야기하거나, 개선 또는 보존하는 것으로 생각되는 임의의 행위를 의미한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기 본원에 기재되어 있다.

용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV 또는 AAV2)이다. 특정 벡터는 그가 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있는데, 이는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같이, 동등한 기능을 하는 발현 벡터의 이러한 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.

도 1은 EPO가 중심 망막에서 혈관 확장을 유발함을 제시한다.
도 2는 항-EPO Fab가 토끼 눈에서 EPO를 중화시킴을 제시한다.
도 3은 항-EPO Fab가 토끼 눈에서 EPO를 중화시킴을 제시한다.

본 발명은 부분적으로, Epo에 특이적으로 결합하는 항체 분자의 발견에 기초한다. 본 발명은 전체 IgG 포맷 항체 뿐만 아니라 그의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab 단편 둘 다에 관한 것이다 (예를 들어, 항체 NVS1, NVS2, NVS3 및 NVS4 참조).

따라서, 본 발명은 Epo (예를 들어, 인간 Epo, 시노몰구스 Epo, 래트 Epo, 및 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 항체, 제약 조성물, 제조 방법, 및 이러한 항체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.

Epo 항체 & 항원 결합 단편

본 발명은 Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo, 뿐만 아니라 인간-과글리코실화 Epo (다르베포이에틴)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 단리된 인간 모노클로날 항체 및 Fab를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 서열 13, 33, 53 또는 73의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는, Epo 단백질 (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 하기 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함하는, Epo 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 표 1에 열거된 VH CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VH CDR을 포함하는 (또는 대안적으로, 이로 이루어진), Epo 단백질 (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명은 서열 14, 34, 54 또는 74의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는, Epo 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 하기 표 1에 열거된 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함하는, Epo 단백질 (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 하기 표 1에 열거된 VL CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VL CDR을 포함하는 (또는 대안적으로, 이로 이루어진), Epo 단백질 (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

본 발명의 다른 항체는, 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 CDR 영역에서 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이는 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교했을 때 CDR 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 Epo 단백질 (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄, 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다 (예를 들어, 표 1은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 최적화된 핵산 서열을 제시함).

<표 1> Epo 항체, Fab 및 Epo 단백질의 예

본 발명의 다른 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열과 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 퍼센트 동일성을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교했을 때 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었지만 실질적으로 동일한 항원 결합 활성을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.

각각의 이들 항체는 Epo에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 Epo-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 Epo-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)을 사용하여 시험할 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄 / 전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄 / 전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 13, 33, 53 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 14, 34, 54 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 갖는, Epo (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 보다 구체적으로, 특정 측면에서 본 발명은 각각 서열 13 및 14로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 다른 구체적 측면에서, 본 발명은 각각 서열 33 및 34로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 각각 서열 53 및 54로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 각각 서열 73 및 74로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 15, 35, 55 및 75로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포에서의 발현이 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄, 및 서열 16, 36, 56, 및 76으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포에서의 발현이 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 항체; 또는 (ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공한다. 보다 구체적으로, 특정 측면에서, 본 발명은 각각 서열 15 및 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 다른 구체적 측면에서, 본 발명은 각각 서열 35 및 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 각각 서열 55 및 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 각각 서열 75 및 76으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.

본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다.

주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme)]에 기재된 것을 비롯하여 널리 공지된 다수의 스킴 중 임의의 것을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.

예를 들어, 카바트 하에, 중쇄 가변 도메인 (VH)에서의 CDR 아미노산 잔기는 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL)에서의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. 코티아 하에, VH에서의 CDR 아미노산은 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3)로 넘버링되고; VL에서의 아미노산 잔기는 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2), 및 91-96 (LCDR3)으로 넘버링된다. 카바트 및 코티아 둘 다의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH에서의 아미노산 잔기 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2), 및 95-102 (HCDR3) 및 인간 VL에서의 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2), 및 89-97 (LCDR3)로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 그의 조합을 포함하는 Epo 결합 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 1, 21, 41 또는 61로 제시된다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 2, 22, 42 또는 62로 제시된다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 3, 23, 43, 또는 63으로 제시된다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 4, 24, 44, 또는 64로 제시된다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 5, 25, 45, 또는 65로 제시된다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 6, 26, 46, 또는 66으로 제시된다. 이들 CDR 영역은 카바트 시스템을 사용하여 설명된다.

대안적으로, 코티아 시스템 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)을 사용하여 정의되는 바와 같이, 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 7, 27, 47, 또는 67로 제시된다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 8, 28, 48, 또는 68로 제시된다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 9, 29, 49, 또는 69로 제시된다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 10, 30, 50, 또는 70으로 제시된다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 11, 31, 51, 또는 71로 제시된다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 12, 32, 52, 또는 72로 제시된다.

각각의 이들 항체가 Epo에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공됨을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있지만 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있지만), 각각의 항체는 바람직하게는 본 발명의 다른 Epo 결합 분자를 생성하기 위해 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유한다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 Epo 결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 및 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA, SET, 비아코어)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있음이 통상의 기술자에게 매우 명확할 것이다. 상기에 더하여, 한 실시양태에서, 단일 가변 도메인으로서 Epo에 결합하는 본원에 기재된 항체의 항원 결합 단편은 VH CDR1, 2 및 3 또는 VL CDR 1, 2 및 3을 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 1에 기재된 Fab의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab NVS1, NVS2, NVS3 또는 NVS4의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, Epo에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트에 의해 정의된 바와 같은 표 1에 기재된 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, Epo에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 코티아에 의해 정의된 바와 같은 표 1에 기재된 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 2의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 3의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 4의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 5의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 6의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 21의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 22의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 23의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 24의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 25의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 26의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 41의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 42의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 43의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 44의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 45의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 46의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 61의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 62의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 63의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 64의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 65의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 66의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 7의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 8의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 10의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 11의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 12의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 27의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 28의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 29의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 30의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 31의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 32의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 47의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 48의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 49의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 50의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 51의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 52의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 67의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 68의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 69의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 70의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 71의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 72의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, Epo에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 Epo에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, Epo에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4이다.

본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나, 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 서열상 가장 근접한 (즉, 최대 % 동일성) 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다. 특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 생성물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열과 비교시, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열이 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교시에 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 아미노산 서열이 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자의 예는 DP47 및 DPK9 뿐만 아니라 하기 기재된 가변 도메인 배선 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

상동 항체

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 항체는 Epo 단백질 (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 결합하고, 표 1에 기재된 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.

예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 도메인은 서열 13, 33, 53, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 도메인은 서열 14, 34, 54, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는; Epo (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 그의 기능적 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 특정 측면에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 추가로 카바트에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열, 예를 들어 각각 서열 1, 2, 3, 4, 5, 및 6; 각각 서열 21, 22, 23, 24, 25, 및 26; 각각 서열 41, 42, 43, 44, 45, 및 46; 또는 각각 서열 61, 62, 63, 64, 65, 및 66을 포함한다. 본 발명의 특정의 다른 측면에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 추가로 코티아에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 서열, 예를 들어 각각 서열 7, 8, 9, 10, 11, 및 12; 각각 서열 27, 28, 29, 30, 31, 및 32; 각각 서열 47, 48, 49, 50, 51, 및 52; 또는 각각 서열 67, 68, 69, 70, 71, 및 72를 포함한다.

다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 기재된 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 것의 VH 및 VL 영역과 높은 (즉, 80% 또는 그 초과의) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 서열 13, 33, 53 또는 73 및 서열 14, 34, 54, 또는 74를 각각 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 코딩된 변경된 항체를 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.

다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 기재된 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 서열 15, 35, 55, 또는 75 중 임의의 것의 전장 중쇄, 및 서열 16, 36, 56, 또는 76 중 임의의 것의 전장 경쇄와 높은 (즉, 80% 또는 그 초과의) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유 기능에 대해 코딩된 변경된 항체를 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.

다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 표 1에 기재된 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.

다른 실시양태에서, 중쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 표 1에 기재된 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.

본원에 사용된, 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수와 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성은 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100과 같음). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 [Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다.

보존적 변형을 갖는 항체

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖고, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기초한 명시된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 Epo-결합 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 1, 21, 41, 및 61, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 2, 22, 42 및 62, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 3, 23, 43, 및 63, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 4, 24, 44 및 64, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 5, 25, 45 및 65, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 6, 26, 46, 및 66, 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인; Epo에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 포함하며, 여기서 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형에 기초한 명시된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 Epo 결합 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어지며, 여기서 전장 중쇄는 서열 15, 35, 55 및 75, 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 16, 36, 56, 및 76, 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인; Epo (예를 들어, 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 Epo)에 특이적으로 결합하는, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 단리된 항체를 제공한다.

동일한 에피토프에 결합하는 항체

본 발명은 표 1에 기재된 Epo 결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 항체는 따라서 Epo 결합 검정 (예컨대 실시예에 기재된 것)에서 본 발명의 다른 항체와 경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. Epo 단백질에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 Epo에 대한 결합에 대해 항체와 경쟁할 수 있음을 입증하고; 이러한 항체는 비-제한적 이론에 따라 그것이 경쟁하는 항체와 Epo 단백질 상의 동일하거나 관련된 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 Epo 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체는 등몰 농도의 경쟁 항체의 존재 하에 경쟁 항체가 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 Epo 결합을 50% 초과만큼 억제하는 경우에 결합에 대해 "경쟁한다".

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 헬릭스 D 도메인 (Epo 단백질의 아미노산 138-162; 서열 88)에 결합한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 헬릭스 A (Epo 단백질의 아미노산 4-26; 서열 86) 및 Epo의 루프 A-B (Epo 단백질의 아미노산 27-55; 서열 89)에 결합한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88)에 결합한다. 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89)에 결합한다. 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89) 및 헬릭스 A (인간 Epo의 아미노산 4-26; 서열 86)에 결합한다. 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88), 및 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89)에 결합한다. 다른 실시양태에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 Epo의 D 헬릭스 도메인 (인간 Epo의 아미노산 138-162; 서열 88), 루프 A-B 도메인 (인간 Epo의 아미노산 27-55; 서열 89) 및 헬릭스 A (인간 Epo의 아미노산 4-26; 서열 86)에 결합한다.

본 발명의 다른 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo (서열 81)의 위치 44-50, 52, 53, 147, 150, 151, 154, 155, 159, 및 162의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 다른 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo (서열 81)의 위치 9, 13, 44-53, 147, 150, 151, 154, 155, 158, 159, 및 162의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 다른 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo (서열 81)의 위치 23, 43-50, 52, 53, 131, 143, 147, 150, 151, 154, 155, 159, 및 162의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 특정한 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo (서열 81)의 아미노산 Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (위치 44-50), Lys-Arg (위치 52-53), Asn (위치 147), Arg-Gly (위치 150-151), Lys-Leu (위치 154-155), Glu (위치 159), 및 Arg (위치 162)를 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 다른 특정한 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo (서열 81)의 아미노산 Ser (위치 9), Glu (위치 13), Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (위치 44-50), Lys-Arg (위치 52-53), Asn (위치 147), Arg-Gly (위치 150-151), Lys-Leu (위치 154-155), Gly (위치 158), Glu (위치 159), 및 Arg (위치 162)을 포함하는 에피토프에 결합한다. 본 발명의 추가 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 Epo (서열 81)의 아미노산 Glu (위치 23), Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (위치 43-50), Lys-Arg (위치 52-53), Arg (위치 131), Arg (위치 143), Asn (위치 147), Arg-Gly (위치 150-151), Lys-Leu (위치 154-155), Glu (위치 159), 및 Arg (위치 162)을 포함하는 에피토프에 결합한다.

본 발명은 또한 아미노산 잔기 Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, 및 Arg162를 포함하는 에피토프인 인간 Epo 상의 입체형태적 에피토프를 포함하며, 여기서 에피토프에 결합하는 항체는 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제할 것이다. 본 발명의 에피토프에 결합하는 항체는 추가로 Epo-의존성 세포 증식을 억제할 것으로 또한 고려된다.

본 발명은 추가로 아미노산 잔기 Ser9, Glu13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159, 및 Arg162를 포함하는 에피토프인 인간 Epo 상의 입체형태적 에피토프를 포함하며, 여기서 에피토프에 결합하는 항체는 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제할 것이다. 본 발명의 에피토프에 결합하는 항체는 추가로 Epo-의존성 세포 증식을 억제할 것으로 또한 고려된다.

본 발명은 추가로 아미노산 잔기 Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159, 및 Arg162를 포함하는 에피토프인 인간 Epo 상의 입체형태적 에피토프를 포함하며, 여기서 에피토프에 결합하는 항체는 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제할 것이다. 본 발명의 에피토프에 결합하는 항체는 추가로 Epo-의존성 세포 증식을 억제할 것으로 또한 고려된다.

조작 및 변형된 항체

변형된 항체를 조작하기 위해, 본 발명의 항체는 추가로 출발 물질로서 본원에 제시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 변형된 항체는 출발 항체와 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL), 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.

수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정 자연 발생 항체의 특성을 모방한 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 윈터(Winter)의 미국 특허 번호 5,225,539, 및 퀸(Queen) 등의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).

따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 1, 21, 41, 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 2, 22, 42, 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 3, 23, 43 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 4, 24, 44 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 5, 25, 45, 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 6, 26, 46, 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 다양한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 7, 27, 47, 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 8, 28, 48, 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 9, 29, 49, 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 10, 30, 50, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 11, 31, 51, 및 71로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 12, 32, 52, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 다양한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.

이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (월드 와이드 웹 상의 mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase에서 입수가능함), 뿐만 아니라 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836]에서 찾아볼 수 있고, 이들 문헌의 각각의 내용은 본원에 명백하게 참고로 포함된다.

본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 퀸 등의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조). 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단편을 구축하기 위한 스캐폴드로 사용될 수 있는 프레임워크는 VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2, 및 Vk2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 프레임워크는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 월드 와이드 웹 상의 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1에서의 vBase 데이터 베이스에서 찾아볼 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태는 서열 13, 33, 53, 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이러한 서열의 프레임워크 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 추가로 서열 14, 34, 54, 및 74로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이러한 서열의 프레임워크 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 Epo 결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하는 것으로, "친화도 성숙"으로 공지되어 있다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에서 제공되는 것과 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 21, 41, 및 61을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 1, 21, 41, 또는 61과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 2, 22, 42, 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 2, 22, 42, 또는 62와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 3, 23, 43, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 3, 23, 43, 또는 63과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 4, 24, 44, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 4, 24, 44, 또는 64와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 5, 25, 45, 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 5, 25, 45, 또는 65와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 6, 26, 46, 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 6, 26, 46, 또는 66과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진 단리된 Epo-결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 7, 27, 47, 및 67을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 7, 27, 47, 또는 67과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 8, 28, 48, 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 8, 28, 48, 또는 68과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 9, 29, 49, 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 9, 29, 49, 또는 69와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 10, 30, 50, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 10, 30, 50, 또는 70과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 11, 31, 51, 및 71로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 11, 31, 51, 또는 71과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 12, 32, 52, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 12, 32, 52, 또는 72와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진 단리된 Epo-결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

대안적 프레임워크 또는 스캐폴드에의 항원-결합 도메인 그라프팅

생성되는 폴리펩티드가 Epo에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 5가지 주요 이디오타입 또는 그의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 낙타류에서 확인되는 것과 같은 단일 중쇄 항체가 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 통상의 기술자에 의해 계속해서 발견되고 개발되고 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그라프팅될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 표적 Epo 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한, 공지된 또는 향후의 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브리지, 및 아블링스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이싱), 소형 모듈 면역제약 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-결정질 또는 유비퀴틴) (실 프로테인스 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에는 적어도 3개의 이러한 루프가 존재하며, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 그것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 성질 및 친화도가 항체의 그것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 표준 클로닝 기술을 사용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.

안키린 기술은 다양한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하도록 안키린 유래의 반복 모듈을 갖는 단백질을 스캐폴드로서 사용하는 것에 기초한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 α-헬릭스 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.

아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이들 도메인은 본래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기반으로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 생성할 수 있다.

아피바디 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기반으로 하는 3개의 헬릭스 다발로 구성된 소형의 단순 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이 중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 이는 6 kDa의 분자량을 갖는다. 아피바디 분자는 작은 크기에도 불구하고 그의 결합 부위가 항체의 결합 부위와 유사하다.

안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게에 의해 개발된 제품이다. 이는 화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 관여하는 소형의 강건한 단백질의 광범위한 집단인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다. 단백질 아키텍처는 초가변 루프가 경질 프레임워크의 상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과는 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되어, 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간 더 크다. 결합 포켓을 구성하는 4개의 루프 세트는 현저한 구조적 유연성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 하기 위해 결합 부위를 독점적 방법으로 재성형할 수 있다. 리포칼린 패밀리의 한 단백질인 피에리스 브라시카에(Pieris brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트를 돌연변이유발하는 것에 의해 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT 공개 번호 WO 1999/16873이다.

아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 소형의 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 아필린 분자는 각각 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 기반으로 하는 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2종의 아필린 스캐폴드가 사용되며, 이 중 하나는 감마 결정질의 인간 구조적 눈 수정체 단백질이고, 다른 것은 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드는 둘 다 매우 소형이고, 고온 안정성을 나타내고, pH 변화 및 변성제에 거의 내성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO 2001/04144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO 2004/106368에 기재되어 있다.

단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2kDa)이다.

본 발명은 Epo 단백질에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체를 제공한다. 키메라 또는 인간화 항체와 비교하여, 본 발명의 인간 Epo-결합 항체는 인간 대상체에게 투여될 때 더욱 감소된 항원성을 갖는다.

낙타류 항체

신세계 구성원, 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama pacos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로마데리우스(Camelus dromaderius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질은 크기, 구조적 복잡성 및 인간 대상체에 대한 항원성에 관하여 특성화되었다. 자연계에서 발견되는 바와 같은 이러한 패밀리의 포유동물로부터의 특정 IgG 항체에는 경쇄가 결여되어 있고, 따라서 다른 동물로부터의 항체의 경우에서의 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 전형적인 4쇄 4차 구조와 구조적으로 상이하다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일에 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.

VHH로 확인된 소형 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성하는, 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 소형 단백질을 생성하기 위해 유전자 조작함으로써 수득될 수 있다. 1998년 6월 2일에 등록된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고; 또한 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는 예를 들어 아블린크스 (벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체와 마찬가지로, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득하기 위해 재조합적으로 변경될 수 있고, 즉 나노바디는 "인간화"될 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 천연적으로 낮은 항원성을 추가로 감소시킬 수 있다.

낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기로 인한 한가지 중요성은 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력으로, 즉 낙타류 나노바디는 전형적인 면역학적 기술을 사용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 그리고 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기로 인한 또 다른 중요성은, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로서 억제할 수 있기 때문에 전형적인 항체의 기능보다 전형적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력으로 작용할 수 있다는 것이다.

저분자량 및 조밀한 크기는 추가로, 낙타류 나노바디가 극도로 열안정성이고, 극한 pH 및 단백질분해적 소화에 대해서도 안정적이고, 낮은 항원성이도록 한다. 또 다른 중요성은 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 약물 수송을 추가로 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특징은 높은 치료 잠재력을 나타낸다. 또한, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.

따라서, 본 발명의 특징은 Epo에 대해 높은 친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 자연적으로 생성되며, 즉 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 Epo 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후 낙타류에 의해 생산된다. 대안적으로, Epo-결합 낙타류 나노바디는 조작되며, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 Epo를 사용하는 패닝 절차를 사용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 조작된 나노바디는 수용 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 WO 1994/004678에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 그라프팅하는 것에 의해 수득된다.

이중특이적 분자 및 다가 항체

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 EPO-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자가 생성되도록 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 등에 의해).

따라서, 본 발명은 Epo에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 Epo의 또 다른 에피토프이다.

추가로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 경우에, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 비롯한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 4,946,778에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.

디아바디는 VH 및 VL 도메인이 동일한 쇄 상에서 이들 2개 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 연결된, 단일 폴리펩티드 쇄로 발현된 2가의 이중특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에서 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 배위), 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA (VL-VH 배위)의 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현하는 것에 의해 생산될 수 있다. 이들 대부분은 박테리아 내에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 대략 15개의 아미노산 잔기의 링커로 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 연결하여 생산된다 ([Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 ([Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc와 융합되어 "디-디아바디"를 생성할 수 있다 ([Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65] 참조).

본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.

이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 개별적으로 생성한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83, 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)에서 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.

결합 특이체가 항체인 경우에, 이는 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.

대안적으로, 결합 특이체가 둘 다 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 어셈블리될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.

이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 Epo에 결합하는 본 발명의 항체의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합 부분은 단백질 융합 또는 공유 또는 비공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법이 이중특이적 분자에 대해 기재되어 있다. 4가 화합물은 예를 들어 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜 수득할 수 있다.

삼량체화 도메인은, 예를 들어 보레안(Borean)의 특허 EP 1 012 280B1에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은 예를 들어 WO 1998/018943에 기재되어 있다.

연장된 반감기를 갖는 항체

본 발명은 연장된 생체내 반감기를 갖는, Epo 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

많은 인자, 예를 들어 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 흡수)는 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 다양한 전략을 사용하여 본 발명의 항체의 반감기를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드, 및 탄수화물 쉴드에 대한 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질에의 유전적 융합에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 모이어티에 대한 (유전적 또는 화학적) 커플링에 의해; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc에의 유전적 융합에 의해; 또는 나노담체, 서방성 제제 또는 의료 장치에의 혼입에 의한다.

항체의 생체내 혈청 순환을 지속시키기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 다관능성 링커의 존재 또는 부재 하에 항체 또는 그의 단편에 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해 부착시킬 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 전형적으로 항체 또는 그의 단편을 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 하나 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되게 하는 조건 하에 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜" 및 "PEG"는 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화된 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 손실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 보장하기 위해 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 면밀히 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정에 의해 결합 활성 뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 니시무라(Nishimura) 등의 EP 0 154 316 및 이시까와(Ishikawa) 등의 EP 0 401 384를 참조한다.

다른 변형된 PEG화 기술은, tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구축 시스템을 통해 화학적으로 명시된 측쇄를 생합성 단백질에 혼입하는, 화학적으로 직교 지시된 조작 기술의 재구축 (ReCODE PEG)을 포함한다. 이러한 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포에서 30개를 초과하는 새로운 아미노산이 생합성 단백질 내로 혼입되게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 부위에 비천연 아미노산을 혼입시켜, 정지 코돈으로부터의 앰버가 화학적으로 명시된 아미노산의 혼입을 신호하는 것으로 전환되게 한다.

또한, 재조합 PEG화 기술 (rPEG)도 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300-600개 아미노산의 비구조화 단백질 꼬리를 기존의 제약 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15배 더 크기 때문에, 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 통상적인 PEG화와 대조적으로, 제조 방법은 크게 간소화되고 생성물은 균질하다.

폴리시알화는 활동 수명을 지속시키고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선하기 위해 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산의 중합체 (당)이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용되는 경우에, 폴리시알산은 접합체에 보호 미세환경을 제공한다. 이는 순환 중인 치료 단백질의 활동 수명을 증가시키고, 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 자연적으로 발견된다. 특정 박테리아는 수백만년에 걸쳐 그의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화하여왔다. 이어서, 이들 천연 폴리시알릴화 박테리아는 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연계의 궁극적인 은폐 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로, 미리 결정된 물리적 특성을 갖는 것으로서 용이하게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링될 때에도 완전하게 비-면역원성이다.

또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분에서 유래된 변형된 천연 중합체이고, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상적으로 부족한 혈액량을 대체하고 혈액의 레올로지 특성을 개선하기 위해 투여된다. 항체의 HES화는 분자의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 순환 반감기의 지속을 가능하게 하여 생물학적 활성을 증가시킨다. 다양한 파리미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 HES 항체 접합체를 적합화할 수 있다.

증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/23289; 국제 공개 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.

또한, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정적이게 하거나 또는 보다 긴 생체내 반감기를 갖게 하기 위해 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민; HSA)에 접합될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200, 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP0 413622를 참조한다. 또한, 상기 기재된 바와 같은 이중특이적 항체와 관련하여, 항체의 특이성은 항체의 하나의 결합 도메인은 Epo에 결합하고 항체의 제2 결합 도메인은 혈청 알부민, 바람직하게는 HSA에 결합하도록 설계될 수 있다.

반감기를 증가시키는 전략은 나노바디, 피브로넥틴-기반 결합제, 및 생체내 반감기를 증가시키고자 하는 다른 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.

항체 접합체

본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 단편, 바람직하게는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합되어 (공유 및 비공유 접합 둘 다를 포함) 융합 단백질을 생성하는, Epo 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 항체 또는 항체 단편에 융합 또는 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 0307434 및 EP 0367166; 국제 공개 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341]을 참조한다.

추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 ("DNA 셔플링"으로 총칭됨)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 활성을 변경하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리율을 갖는 항체 또는 그의 단편). 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, 및 5,837,458; [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313을 참조한다 (이들 특허 및 간행물은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 항체 또는 그의 단편, 또는 코딩된 항체 또는 그의 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다. Epo 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.

또한, 항체 또는 그의 단편은 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 특히 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 91311 캘리포니아주 채츠워스 에톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그이며, 다수가 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 ("HA") 태그 (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) 및 "플래그" 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 특정한 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 예측하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제와 같은, 이에 제한되지는 않는 다양한 효소; 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴과 같은, 이에 제한되지는 않는 보결분자단; 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린과 같은, 이에 제한되지는 않는 형광 물질; 루미놀과 같은, 이에 제한되지는 않는 발광 물질; 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린과 같은, 이에 제한되지는 않는 생물발광 물질; 아이오딘 (131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin과 같은, 이에 제한되지는 않는 방사성 물질; 및 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 방출 금속 및 비-방사성 상자성 금속 이온을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 물질에 항체를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명은 추가로, 치료 모이어티에 접합된 항체 또는 그의 단편의 사용을 포괄한다. 항체 또는 그의 단편은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출체에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다.

또한, 항체 또는 그의 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제, 항혈관신생제; 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 예를 들어 림포카인을 포함할 수 있다.

또한, 항체는 치료 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출체, 예컨대 213Bi, 또는 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 포함하나 이에 제한되지는 않는 방사선금속 이온을 폴리펩티드에 접합시키는데 유용한 마크로시클릭 킬레이트화제에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있고, [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; 및 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함된다.

항체에 치료 모이어티를 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.

항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 항체를 생산하는 방법

항체를 코딩하는 핵산

본 발명은 상기 기재된 Epo-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 중 일부는 서열 13, 33, 53, 또는 73에 제시된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열 14, 34, 54, 또는 74에 제시된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인되는 것이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인되는 것의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65, 80%, 95% 또는 99%) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현되는 경우에, 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 Epo 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 기재된 Epo-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 1개의 CDR 영역 및 통상적으로 모든 3개의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 Epo-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열을 모두 또는 실질적으로 모두 코딩한다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.

본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역을 둘 다 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 일부는 서열 15, 35, 55, 또는 75에 기재된 성숙한 중쇄 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 성숙한 중쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 서열 16, 36, 56, 또는 76에 기재된 성숙한 경쇄 서열과 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 성숙한 경쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.

폴리뉴클레오티드 서열은 Epo-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 신생 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열로 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 기재된 Epo-결합 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. Epo-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하기 위해 바이러스-기반 및 비-바이러스 발현 벡터를 둘 다 사용할 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 전형적으로 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 갖는 에피솜 벡터, 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, [Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 Epo-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현시키는데 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C, (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 기타 단백질의 발현을 위한 관련 기술분야에 공지되어 있는 다수의 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 포함한다. [Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.

발현 벡터의 선택은 벡터를 발현시키고자 의도되는 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 Epo-결합 항체 쇄 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 산물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비-유도 조건 하에서 증량될 수 있다. 프로모터에 더하여, Epo-결합 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 바람직할 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시키는 것에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

발현 벡터는 또한 삽입된 Epo-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하는 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 흔히, 삽입된 Epo-결합 항체 서열은 신호 서열에 연결된 후 벡터에 포함된다. Epo-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편이 생산되게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.

Epo-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로는 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 Epo-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 함께 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 Epo-결합 폴리펩티드를 발현시키고 생산하기 위해 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 예를 들어, 이는 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이는 임의의 정상적인 사멸, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 비롯하여 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 조직 세포 배양의 사용은 예를 들어 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서 (예를 들어, [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어 염화칼슘 형질감염은 통상적으로 원핵 세포에 대해 사용되는 반면에, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 대해 사용될 수 있다. (일반적으로, 상기 문헌 [Sambrook, et al.] 참조). 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 탄도적 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), 작용제-증진된 DNA 흡수, 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해, 종종 안정적인 발현이 바람직할 것이다. 예를 들어, Epo-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정적으로 발현하는 세포주는, 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조할 수 있다. 벡터의 도입 후 세포를 1-2일 동안 영양강화 배지에서 성장되도록 한 다음 선택 배지로 전환할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하기 위한 것이고, 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포가 선택 배지에서 성장하게 한다. 안정적으로 형질감염된 내성 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체의 생성

모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린, 래트 및 토끼 시스템을 포함한다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA를 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득하고 이것을 조작하여 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하게 할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다 (예를 들어, 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 CDR 영역을 인간 프레임워크 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 윈터의 미국 특허 번호 5225539, 및 퀸 등의 미국 특허 번호 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370을 참조한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. Epo에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하고, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 총칭된다.

HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 부류 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 높은 친화도의 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851]에 추가로 기재되어 있고, 이들 모두의 내용은 그 전문이 구체적으로 본원에 참고로 포함된다. 또한, 모두 론베르크(Lonberg) 및 카이(Kay)의 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429; 및 수라니(Surani) 등의 미국 특허 번호 5,545,807; 모두 론베르크 및 카이의 PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962; 및 코르만(Korman) 등의 PCT 공개 번호 WO 01/14424를 참조한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, 이시다(Ishida) 등의 PCT 공개 WO 02/43478에 상세하게 기재되어 있다.

또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하고, 본 발명의 Epo-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스, 인크.)로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 쿠체르라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 및 6,162,963에 기재되어 있다.

또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 입수가능하고, 본 발명의 Epo-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 둘 다 보유하는 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되어 있고 (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 이는 본 발명의 Epo-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 또한 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있거나 또는 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어, 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698; 도베르(Dower) 등의 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717; 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197; 그리피스(Griffiths) 등의 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081을 참조한다.

본 발명의 인간 모노클로날 항체는 면역화시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포를 재구성한 SCID 마우스를 사용하여 또한 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 윌슨(Wilson) 등의 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767에 기재되어 있다.

프레임워크 또는 Fc 조작

본 발명의 조작된 항체는 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이" 항체도 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 칼(Carr) 등의 미국 특허 공개 번호 20030153043에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경하기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.

한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 보드머(Bodmer) 등의 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 변경된다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입되어, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖게 된다. 이러한 접근법은 워드(Ward) 등의 미국 특허 번호 6,165,745에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 워드의 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이가 도입될 수 있다: T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 프레스타(Presta) 등의 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체의 이펙터 기능을 변경시키기 위해 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것에 의해 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 둘 다 윈터 등에 의한 것인, 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 이러한 접근법은 이두소기(Idusogie) 등의 미국 특허 번호 6,194,551에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경함으로써 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이러한 접근법은 보드머 등의 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다.

또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 Fc 영역이 변형된다. 이러한 접근법은 프레스타의 PCT 공개 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 인간 IgG1 상의 FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 ([Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).

또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거하여 그 부위에서 글리코실화가 제거되도록, 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 코(Co) 등의 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

추가로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 행(Hang) 등의 EP 1,176,195는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. 프레스타의 PCT 공개 WO 03/035835는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고, 그러한 숙주 세포 내에서 발현된 항체의 저푸코실화가 또한 일어난다 (또한, [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). 우마나(Umana) 등의 PCT 공개 WO 99/54342는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이와 같이 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 ADCC 활성을 증가시킨다 (또한 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).

변경된 항체를 조작하는 방법

상기 논의된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 Epo-결합 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 Epo-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 Epo-결합 항체의 구조적 특징을 사용하여 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성, 예컨대 인간 Epo에 대한 결합 및 또한 Epo의 하나 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, Epo 수용체에 대한 Epo 결합 억제, Epo-의존성 세포 증식 억제) 특성을 보유하는, 구조적으로 관련된 Epo-결합 항체를 생성한다.

예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역, 또는 그의 돌연변이는 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합적으로-조작된 Epo-결합 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 본래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 다음, "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 a) 서열 1, 21, 41, 및 61로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 2, 22, 42, 및 62로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 3, 23, 43, 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 4, 24, 44, 및 64로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 5, 25, 45, 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 6, 26, 46, 및 66으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 포함하는 Epo-결합 항체를 생산하는 단계; b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하는 단계; 및 c) 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계를 포함하는, 변형된 Epo-결합 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 7, 27, 47, 및 67로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 8, 28, 48, 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 9, 29, 49, 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 10, 30, 50, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 11, 31, 51, 및 71로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 12, 32, 52, 및 72로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 Epo-결합 항체를 제조하고; 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.

따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 15, 35, 55 및 75의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열; 및 서열 16, 36, 56, 및 76의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어진, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 Epo-결합 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 중쇄 또는 경쇄의 변경은 중쇄 또는 경쇄의 프레임워크 영역 내에 있다.

변경된 항체 서열은 또한 US20050255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기 및 CDR1 및 CDR2 서열에 대한 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.

표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 기재된 Epo-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 기능적 특성은 인간, 시노몰구스, 래트, 및/또는 마우스 Epo에 대한 특이적 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 항체는 F36E 및/또는 Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정에서 Epo-의존성 세포 증식을 억제한다.

본 발명의 항체를 조작하는 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 Epo-결합 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 Epo-결합 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 쇼트(Short)의 PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 어셈블리, 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, 라자르(Lazar) 등의 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용한 방법을 기재한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 탈아미드화 부위를 제거하기 위해 조작된다. 탈아미드화는 펩티드 또는 단백질에서 구조적 및 기능적 변화를 유발하는 것으로 공지되어 있다. 탈아미드화는 감소된 생물활성, 뿐만 아니라 단백질 제약의 약동학 및 항원성의 변경을 일으킬 수 있다 (Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5):1432-9).

본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 pI를 증가시키고 그의 약물-유사 특성을 개선하기 위해 조작된다. 단백질의 pI는 분자의 전반적인 생물물리학적 특성의 주요 결정인자이다. 낮은 pI를 갖는 항체는 덜 가용성이고, 덜 안정적이고, 응집되기 쉬운 것으로 공지되어 있다. 또한, 낮은 pI를 갖는 항체의 정제는 도전과제이고, 특히 임상 용도를 위한 규모-확대 동안 문제가 될 수 있다. 본 발명의 항-Epo 항체 또는 Fab의 pI를 증가시키는 것은 그의 용해도를 개선하여 항체가 보다 높은 농도 (>100 mg/ml)로 제제화될 수 있게 하였다. 높은 농도 (예를 들어 >100mg/ml)의 항체 제제는 환자의 눈에 유리체내 주사를 통한 항체의 보다 많은 용량의 투여를 가능하게 하는 이점을 제공하고, 이는 투여 빈도를 감소시킬 수 있어서, 망막 혈관 질환을 비롯한 만성 질환의 치료를 위한 유의한 이점을 제공한다. 보다 높은 pI는 또한 항체의 IgG 버전의 FcRn-매개된 재순환을 증가시켜 약물이 체내에서 보다 오랜 기간 동안 지속되게 함으로써 보다 적은 횟수의 주사를 필요로 한다. 마지막으로, 항체의 전반적인 안정성은 보다 높은 pI로 인해 유의하게 개선되어, 보다 긴 반감기 및 생체내 생물활성을 야기한다. 바람직하게는, pI는 8.2 이상이다.

변경된 항체의 기능적 특성은 관련 기술분야에서 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 평가할 수 있다.

예방 및 치료 용도

본원에 기재된 바와 같은 Epo에 결합하는 항체는 증가된 Epo 수준 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량을 투여함으로써 상기 치료를 위해 치료상 유용한 농도에서 사용될 수 있다. 본 발명은 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여함으로써 상기 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 당뇨병성 망막병증 (DR)과 연관된 상태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여함으로써 상기 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 황반 부종과 연관된 상태 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여함으로써 상기 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 당뇨병성 황반 부종 (DME)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여함으로써 상기를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 증식성 당뇨병성 망막병증 (PDR)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여함으로써 상기를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 연령-관련 황반 부종 (AMD), 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 혈관부종, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 및/또는 미숙아 망막병증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체의 유효량을 투여함으로써 상기를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 베타 지중해빈혈 및/또는 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 증가된 Epo 수준 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 ?t리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 당뇨병성 망막병증 (DR)과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종 (DME), 및/또는 증식성 당뇨병성 망막병증 (PDR)과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 연령-관련 황반 부종 (AMD), 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 혈관부종, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 및/또는 미숙아 망막병증에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 베타 지중해빈혈 및/또는 암을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 증가된 Epo 수준 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 1에 기재된 것에 더하여 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있다. 추가로, 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 1에 기재된 것에 더하여 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 항체는 특히, 망막 혈관 질환 (예를 들어, DR, DME, NPDR, PDR, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 혈관부종, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화, 및/또는 미숙아 망막병증)과 연관된 상태 또는 장애의 진행을 예방하고, 망막 혈관 질환과 연관된 황반 부종을 치료 또는 예방하고, 루센티스® (RTM) 주사 빈도를 감소시키고, 망막 혈관 질환 진행으로 인한 시각 상실을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 망막 혈관 질환 환자의 치료를 위한 항-VEGF 요법과 함께 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계 (예를 들어, Epo를 대상체 내에서 접촉시킴)를 포함하는 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 방법은 세포 (예를 들어, Epo를 포함하는 세포)를 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 세포는 B 세포일 수 있다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

세포 증식은 예를 들어 슬릿-램프 생체-현미경, 광 간섭 단층촬영, 컬러 안저 촬영, 및 플루오레세인 혈관조영 (Heng et al. Diabet. Med. 2013 Jun;30(6):640-50)에 의해 측정될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편이 Epo-의존성 세포 증식을 억제하는 능력은 하기 기재된 F36E, 또는 Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정과 같은 검정을 사용하여 측정될 수 있다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 Epo가 세포 표면 상의 수용체와 상호작용하는 것을 방지하는 단계를 포함하는, Epo-의존성 세포 신호전달을 억제하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 방법은 Epo를 포함하는 세포를 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 대상체에서 Epo-의존성 세포 신호전달을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.

EpoR에 대한 Epo의 결합은 JAK2 키나제를 통한 신호전달을 유도하며, 이는 포스파티딜-이노시톨 3-키나제 (PI-3K)/Akt, MAP 키나제, STAT5 및 단백질 키나제 C를 포함하는 하류 신호전달 경로의 활성화로 이어진다 (Jelkmann, 2007; Jelkmann, 2004). Epo 또는 Epo 수용체 (EpoR)는 내피 세포, 평활근 세포, 및 CNS 세포와 같은 다양한 세포 유형에 의해 내인성으로 생산되는 것으로 보고되어 있다 (Ogunshola and Bogdanova, 2013). Epo의 결합시 EpoR의 활성화는 하류 신호전달 경로를 촉발하여 칼슘 수송 (Korbel et al., 2004), 세포 생존 (Velly et al., 2010), 신경보호 (Grimm et al., 2002), 및 혈관신생 (Ribatti, 2010; Ribatti et al., 2003)과 같은 다양한 활성으로 이어질 수 있다. 따라서, Epo-의존성 세포 신호전달의 억제는 이들 신호전달 경로 중 하나 이상의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, Epo-의존성 세포 신호전달의 억제는 JAK2 키나제, PI-3K/Akt, MAP 키나제, STAT5 또는 단백질 키나제 C를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이들 신호전달 경로를 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이러한 경로 활성을 측정하기 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 또한, Epo-의존성 세포 신호전달의 억제는 상기 기재된 바와 같이 세포 증식을 측정함으로써 결정될 수 있다. 세포 증식은 대상체 내에 존재할 수 있거나 (예를 들어, 혈관신생), 또는 하기 기재되는 F36E, 또는 Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정과 같은 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 한 측면에서, Epo-의존성 세포 신호전달은 대조군과 비교하여 본원에 기재된 항체의 존재 하에 통계적으로 유의하게 (p<0.05) 감소된다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시켜 Epo가 세포 표면 상의 수용체와 상호작용하는 것을 방지하는 단계를 포함하는, Epo-의존성 세포 증식 또는 신호전달을 억제하는 방법에 관한 것이다. 세포는 B 세포인 것으로 고려된다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다.

본 발명은 또한 Epo를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계 (예를 들어, Epo를 대상체 내에서 접촉시킴)를 포함하는 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제하는 방법에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 대상체의 세포 상의 Epo 수용체에 대한 Epo 결합을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이며; 특히, 조성물은 항체 NVS1, NVS2, NVS3, 또는 NVS4를 포함할 수 있다. 세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 또한, 세포는 대상체의 눈 내에 있는 것으로 고려된다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다. Epo 수용체에 대한 Epo 결합의 억제는 [Khankin et al. PLoS ONE, 2010 5:e9246]에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

망막 혈관 질환 및 망막 혈관 질환과 연관된 황반 부종의 치료 및/또는 예방은 시각 기능 및/또는 망막 해부학의 임상적 관련 측정법을 사용하여 안과의사 또는 건강 관리 전문가에 의해 결정될 수 있다. 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애의 치료는 시각 기능 및/또는 망막 해부학의 개선 또는 보존을 야기하거나, 야기할 것으로 생각되는 임의의 행위 (예를 들어, 본원에 기재된 항-Epo 항체의 투여)를 의미한다. 또한, 망막 혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애와 관련하여 예방은 시각 기능, 망막 해부학, 및/또는 망막 혈관 질환 파라미터의 악화 위험이 있는 대상체에서 상기 악화를 본원에 정의된 바와 같이 예방하거나 늦추는 임의의 행위 (예를 들어, 본원에 기재된 항-Epo 항체의 투여)를 의미한다.

시각 기능은, 예를 들어 시력, 낮은 조명 하의 시력, 시야, 중심 시야, 말초 시각, 대조 감수성, 암순응, 광스트레스 회복, 색 구별, 읽기 속도, 보조 장치에 대한 의존성 (예를 들어, 대형 서체, 확대 장치, 망원경), 안면 인식, 자동차를 조작하는데 있어서의 숙련도, 일상 생활 중 하나 이상의 활동을 수행하는 능력, 및/또는 시각 기능에 관한 환자-보고된 만족도를 포함할 수 있다.

시각 기능의 예시적인 척도는 스넬렌(Snellen) 시력, ETDRS 시력, 저휘도 시력, 암슬러(Amsler) 그리드, 골드만(Goldmann) 시야, 험프리(Humphrey) 시야, 마이크로시야측정, 펠리-롭슨(Pelli-Robson) 차트, 스킬(SKILL) 카드, 이시하라(Ishihara) 색 플레이트, 판스워스(Farnsworth) D15 또는 D100 컬러 테스트, 표준 망막전위도검사, 다초점 망막전위도검사, 읽기 속도, 안면 인식, 운전 시뮬레이션, 및 환자 보고된 만족도에 대한 검증된 검사를 포함한다. 따라서, 혈관 질환 및/또는 황반 부종의 치료는 ETDRS 스케일 상에서 시각의 2개 이상의 줄 (또는 10개의 글자)의 획득 또는 상실 실패 시에 달성된다고 할 수 있다. 또한, 혈관 질환 및/또는 황반 부종의 치료는 대상체가 읽기 속도 (분당 단어)에서 적어도 10% 증가, 또는 10% 감소의 부재를 나타내는 경우에 이루어졌다고 할 수 있다. 또한, 혈관 질환 및/또는 황반 부종의 치료는 대상체가 이시하라 시험에서 올바른 것으로 확인된 플레이트 또는 판스워스 시험에서 올바르게 배열된 디스크의 비율에서 적어도 20% 증가, 또는 20% 감소의 부재를 나타내는 경우에 이루어졌다고 할 수 있다. 또한, 망막 혈관 질환 및/또는 황반 부종의 치료는 대상체가 미리 지정된 정도의 암순응까지의 시간에서 예를 들어 적어도 10% 감소, 또는 10% 이상의 증가의 부재를 갖는 경우에 이루어졌다고 할 수 있다. 또한, 망막 혈관 질환 및/또는 황반 부종의 치료는 대상체가 검증된 건강 관리 전문가 (즉, 안과의사)에 의해 결정된 시각도로 표현되는 시각 암점의 총 면적에서 예를 들어 적어도 10% 감소, 또는 10% 이상의 증가의 부재를 나타내는 경우에 이루어졌다고 할 수 있다.

치료 또는 예방될 수 있는 망막 해부학의 바람직하지 않은 측면은 예를 들어 미세동맥류, 황반 부종, 면화 반점, 망막내 미세혈관 이상 (IRMA), 모세혈관 소실, 백혈구 부착, 망막 허혈, 시신경 원판의 신생혈관화, 후극의 신생혈관화, 홍채 신생혈관화, 망막내 출혈, 유리체 출혈, 황반 반흔, 망막하 섬유증, 및 망막 섬유증, 정맥 확장, 혈관 비틀림, 혈관 누출을 포함한다. 따라서, 예를 들어 황반 부종의 치료는 광 간섭 단층촬영에 의한 측정 시 중심 망막 서브필드 두께의 20% 이상의 감소에 의해 결정될 수 있다.

망막 해부학을 평가하는 예시적인 수단은 안저검사, 안저 촬영, 플루오레세인 혈관조영, 인도시아닌 그린 혈관조영, 광 간섭 단층촬영 (OCT), 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층촬영, 주사 레이저 검안경검사, 공초점 현미경검사, 순응 광학, 안저 자가형광, 생검, 부검 및 면역조직화학을 포함한다. 따라서, 혈관 질환 및/또는 황반 부종은 플루오레세인 혈관조영에 의한 결정시에 누출 영역의 10% 감소시 대상체에서 치료되었다고 할 수 있다.

본 발명의 치료제로 치료할 대상체에는 또한 당뇨병과 연관된 상태를 치료하는 방법으로 공지된 다른 치료제, 예컨대 모든 형태의 인슐린 및 항고혈압 의약이 투여될 수 있다.

안구 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 혈관부종, 다초점성 맥락막염, 근시성 맥락막 신생혈관화 및/또는 미숙아 망막병증의 치료 및/또는 예방은 안과의사 또는 건강 관리 전문가에 의해 시각 기능 및/또는 망막 해부학의 임상적 관련 측정법을 사용하여 상기 기재된 척도 중 임의의 것에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 척도가 본원의 각각의 그리고 모든 안구 질환에 적용되지 않을 지라도, 통상의 기술자는 주어진 안구 질환을 치료하는데 사용될 수 있는 시각 기능 및/또는 망막 해부학의 임상적 관련 측정법을 인식할 것이다.

본 발명의 치료제가 또 다른 작용제와 함께 투여되는 경우에, 2가지는 임의의 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 항체는 제2 작용제 (예를 들어, 루센티스®)에 의한 요법을 또한 받고 있는 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, 결합 분자는 외과적 치료와 함께 투여된다.

Epo 결합 항체와의 조합 치료에 적합한 작용제는 VEGF, VEGF 수용체, 다른 수용체 티로신 키나제 억제제, 또는 HIF-1 매개된 경로를 조절하는 다른 엔티티의 활성을 조절할 수 있는 관련 기술분야에 공지된 작용제를 포함한다. 이들 경로를 억제하는 것으로 보고되어 있는 다른 작용제는 라니비주맙, 베비시주맙, 페갑타닙, 아플리베르셉트, 파조파닙, 소라페닙, 수니티닙 및 라파마이신을 포함한다. 코르티코스테로이드, NSAID, 및 TNF-α 억제제와 같은 항염증제와의 조합 치료는 망막 혈관 질환 및 황반 부종, 예를 들어 당뇨병성 망막병증 및 DME의 치료에 있어서 또한 유익할 수 있다.

조합 요법은 부가적일 수 있거나, 또는 이는 상승작용적 결과 (예를 들어, 2개의 작용제의 조합 사용에 대해 기대되는 것보다 더 큰 망막병증 중증도의 감소)를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 Epo 결합 항체 및 항혈관신생제, 예컨대 항-VEGF 작용제에 의한, 망막 혈관 질환 및 황반 부종, 특히 상기 기재된 바와 같은 DME 및/또는 PDR을 비롯한 당뇨병성 망막병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 조합 요법을 제공한다.

제약 조성물

본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 Epo-결합 항체 (무손상 또는 결합 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 예를 들어 당뇨병성 망막병증을 치료 또는 예방하는데 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 조성물을 증진 또는 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 유리체내, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 제약상 허용되는 담체는 유리체내, 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

조성물은 멸균이고 유체여야 한다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 내에 포함시키는 것에 의해 유도될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, Epo-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효과적인 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. Epo-결합 항체는 통상의 기술자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.

본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전 병력을 비롯한 다양한 약동학적 인자 및 기타 인자에 의존한다.

의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체의 용량을 목적하는 치료 효과 달성에 필요한 것보다 더 낮은 수준에서 시작하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 망막 혈관 질환의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 다양한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정될 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 15 mg/kg의 범위이다. 항체를 유리체내 투여하는 경우에, 투여량은 0.1 mg/눈 내지 10mg/눈의 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 용량은 1 mg/눈 내지 9 mg/눈, 2 mg/눈 내지 8 mg/눈, 3 mg/눈 내지 7 mg/눈, 4 mg/눈 내지 6 mg/눈 또는 4.5 mg/눈 내지 5.5 mg/눈의 범위일 수 있다. 특정 경우에, 용량은 0.1 mg/눈, 0.2 mg/눈, 0.3 mg/눈, 0.4 mg/눈, 0.5 mg/눈, 0.6 mg/눈, 0.7 mg/눈, 0.8 mg/눈, 0.9 mg/눈, 1 mg/눈, 2 mg/눈, 3 mg/눈, 4 mg/눈, 5 mg/눈, 6 mg/눈, 7 mg/눈, 8 mg/눈, 9 mg/눈, 또는 10 mg/눈일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회, 또는 필요한 만큼 (PRN) 전신 투여를 수반한다.

항체는 통상적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 Epo-결합 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 나타나는 바에 따라 불규칙적일 수 있다. 또한, 대안적 투여 간격은 의사에 의해 결정될 수 있고, 매월 또는 효과상 필요에 따라 투여될 수 있다. 효능은 광 간섭 단층촬영 (OCT)에 의해 결정된 바와 같은 병변 성장, 루센티스® 구제 비율, 망막 두께, 및 시력에 기초한다. 전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1-1000 μg/ml, 및 일부 방법에서는 25-500 μg/ml의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체의 그것보다 더 긴 반감기를 나타낸다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 비교적 덜 빈번한 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법을 투여할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 변형은 통상의 기술자에게 매우 명백할 것이고, 첨부된 특허청구범위에 포괄된다.

실시예 1: 친화도 성숙 Epo 항체의 생성

완전 인간 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 본원에 기재된 Epo 결합 항체를 생성하였다.

비오티닐화 및 비-비오티닐화 인간 및 시노몰구스 Epo를 용액 및 고체상 패닝에 사용하였다. 표준 패닝 뿐만 아니라 RapMAT 접근법 (Prassler et al., (2009) Immunotherapy 1(4):571-583)도 수행하였다. 이차 스크리닝 및 RapMAT 패닝 후, 서열 분석을 위한 클론을 선택하고, FabCys 포맷으로의 전환, 배선화, pI 최적화 및 탈아미드화 부위의 제거를 위해 8종의 항체 세트를 선택하였다. FabCys 생성은 독점적 랩클론(RapCLONE)®방법으로 달성하였다. 다량의 Fab 클론의 IgG 및 FabCys 포맷으로의 편리하고 효율적인 전환을 위해 랩클론®을 2-단계 방법으로서 수행하였다. 제1 클로닝 단계에서, 진핵 발현 카세트를 BsiWI/MfeI (κ 풀의 경우) 또는 HpaI/MfeI (λ 풀의 경우) 소화 및 후속 라이게이션을 통해 발현 벡터 pMORPH®x11 (HuCAL PLATINUM®의 경우)에 도입하였다. 이에 이어 제2 클로닝 단계에서, 발현 카세트를 함유하는 Fab 풀을 EcoRV/BlpI (κ 및 λ 풀)를 사용하여 소화하고, 후속해서 포유동물 세포에서의 발현을 위해 pMorph®4_IgG1f 또는 pMorph®4_h_FabCys 수용자 벡터에 클로닝하였다. 본 프로젝트를 위해, 랩클론®은 고유하고 서열분석되고 특성화된 Fab에 대해서만 적용하였다. 따라서, 모든 클론은 랩클론® 후 회수하였다.

낮은 pI (<8.2)는 일반적으로 안정성 및 응집을 비롯하여 불량한 생물물리학적 특성과 연관된다. 배선화, pI 최적화 및 탈아미드화 부위의 제거를 위해 8종의 최종 후보 (HCDR3 고유 클론)를 선택하여 총 12종의 배선화 변이체를 생성하였다. 12종의 VL-유전자 (11317, 11324, 11331 및 11345의 경우에 2종) 및 1종의 VH (11324)를 합성하였다. PTM을 갖는 후보의 조기 탈선택 가능성으로 인해, 오직 11317 (VL), 11332 (VL) 및 11380 (VH)에만 배선화에 의해 제거되는 탈아미드화 부위를 함유시켰다. 배선화는 일반적으로 가장 가까운 배선에 대해 행하였다. pI를 증가시키기 위해, 가장 가까운 배선 3r 대신 또는 그에 더하여 후보 중 6종에 대해 람다 배선 3h를 선택하였다. 추가로 위험을 최소화하기 위해 3종의 후보에 대해 람다 3j 변이체를 구축하였다 (11317, 11331 및 11345).

상기 언급된 바와 같이, 단백질의 pI는 분자의 전반적인 생물물리학적 특성의 주요 결정인자이다. 파지 디스플레이 라이브러리로부터 확인된 항-Epo Fab는 8.2 미만의 pI를 가졌다. 제조 특성을 개선하기 위해, 항체의 pI를 증가시키고 약물-유사 특성을 개선하기 위해 항체를 특이적으로 조작하였다. 항-Epo Fab의 pI를 증가시키는 것은 그의 용해도를 개선하여 Fab가 보다 높은 농도 (>100 mg/ml)로 제제화될 수 있게 하였다. 높은 농도 (예를 들어 >100mg/ml)의 Fab 제제는 환자의 눈에 유리체내 주사를 통한 Fab의 보다 많은 용량의 투여를 가능하게 하는 이점을 제공하고, 이는 투여 빈도를 감소시킬 수 있어서, 습성 AMD 및 당뇨병성 망막병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는 만성 안구 질환의 치료를 위한 유의한 이점을 제공한다.

생성된 Fab를 표 1에 제시한다 (NVS1, NVS2, NVS3, 및 NVS4).

실시예 2: 최적화된 항체의 특성화

하기 실시예는 항체 친화도를 측정하는데 사용될 수 있는 방법을 기재한다. 결합 친화도를 측정하는 이들 및 다른 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

친화도 결정

Epo에 대한 항체 친화도는 비아코어® T200 (비아코어)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 용액 평형 적정 (SET)에 의해 측정하였다. 각각의 기술의 설명 및 Epo 결합에 대한 상응하는 평균 결과를 하기 기재한다. 모델링 가정은 시스템 내 Epo의 농도, Epo 생합성의 동역학 및 반감기, 뿐만 아니라 목적하는 투여 스케줄을 고려하며, 이는 Epo에 대해 50pM 미만의 친화도를 갖는 Fab가 보다 낮은 수준의 유리 Epo에 대해 충분함을 시사한다.

비아코어 결정

상호작용의 동역학, 즉 복합체 형성률 (k_a) 및 해리율 (k_d)은 센소그램에서의 정보로부터 결정될 수 있다. 샘플이 제조된 센서 표면 위를 통과할 때 결합이 발생하면, 센소그램에서의 반응은 증가한다. 평형에 도달하면 일정한 신호가 보일 것이다. 완충제로 샘플을 대체하는 것은 결합된 분자의 해리를 유발하며, 반응은 감소한다. 비아코어 평가 소프트웨어는 데이터를 상호작용 모델에 적합시킴으로써 k_a 및 k_d의 값을 생성한다.

방법 구동을 위해 3종의 유동 세포를 사용하였다. 유동 세포 1 (fc1)은 항체 코팅된 칩 표면에 대한 Epo의 비-특이적 결합을 평가하기 위한, 어떠한 Epo Fab도 포획하지 않는 참조로서 제공되었다. 포획 및 결합 단계는 둘 다 유동 세포 2-4에 대해 수행되었다.

포획 단계: Rmax 20을 달성하기 위해, fc2-4에 대한 항-hu Fab의 포획 수준은 대략 50RL이었다. 1ug/ul 농도의 항-hu Fab를 Fc2-4 상에 10 μl/분의 유량으로 유동시켰다.

상대 Rmax를 위한 계산을 다음과 같다:

Fab: R_max = R_L*(MW_분석물 / MW_리간드)*화학량론 20=RL*(21.4/50)*1 = 50 RL

분석물은 20nM의 농도에서 시작하였고, 길고 짧은 해리를 위해 8종의 1:2 희석액을 2.5nM에서 이중으로 포함시켰다. 분석물을 240초 동안 60μl/분의 유량으로 구동시켰다. 해리 시간은 4000초 및 600초로 설정하였다. NVS2 및 NVS4의 경우에 해리 시간은 10nM, 2.5nM 및 0.3125nM 분석물 농도에 대해 4000초로 설정하였다. 샘플 주사 후, 재생 완충제에 의한 세척 단계가 존재하였다.

재생은 모든 유동 세포에 대해 각각의 사이클의 말미에 수행하였다. 본 방법의 경우에 재생 조건은 10% 수산화나트륨을 함유하는 1% 인산, 100초 동안 60ul/분이었다.

모든 다른 구동 조건은 1x HBS-EP+ 완충제 (비아코어 cat# BR-1006-69) 중에서 25℃에서 수행하였다. 생성된 신호는 더블 레퍼런싱에 의해, 참조 유동 세포 및 어떠한 분석물도 함유하지 않는 결합 단계로부터 굴절률 값을 차감하여 조정하였다. 10 Hz에서 데이터를 수집하고, 비아코어® T100 평가 소프트웨어 버전 1.1 (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하여 분석하였다. 이 프로그램은 각각의 상호작용에 대한 속도 및 친화도 상수를 결정하기 위한 전체적 적합 분석 방법을 사용한다.

비아코어 결합 동역학 결정의 결과를 표 2에 제시한다. 제시된 바와 같이 본원에 기재된 항체는 인간 Epo에 대해 높은 친화도 결합을 나타내었고, K_D 값은 전형적으로 40 pM 이하였다.

<표 2> Epo 항체의 친화도 결합 (비아코어)

SET 결정

센서 표면을 사용하는 동역학적 검정, 예컨대 SPR과 대조적으로, SET는 용액 중에서 친화도를 결정하는 방법이다. 이것은 동역학적 데이터를 전달하지 않는 평형 측정법이다.

SET에서는, 일정한 양의 항체를 평형에 도달될 때까지 다양한 농도의 항원과 함께 인큐베이션하였다. 용액을 항원 코팅된 MSD™ 플레이트 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)™) 상에 적용한 다음 ECL-표지된 이차 항체와 함께 인큐베이션하고, 신호 강도를 측정함으로써 평형화된 용액 중 유리 항체의 농도를 결정하였다. 낮은 항원 농도에서는 강한 신호가 달성되었고 (플레이트 상의 항원에 결합하는 유리 항체의 높은 농도), 반면에 높은 항원 농도의 경우에는 항체가 완전히 항원-포획되어 낮은 신호가 생성되었다. 매칭 범위에서 충분한 수의 항원 농도가 이용가능한 경우에, 적정 곡선은 적절한 적합 모델을 사용하여 친화도의 합리적인 결정을 가능하게 한다. 완전한 적정을 위해서는, 예상되는 K_D보다 적어도 10배 더 높은 항원 농도가 적용되어야 한다. 검정에 적용되는 항체의 일정한 농도는 K_D의 범위 내에 있거나 또는 그 미만이어야 한다 (표 3).

SET에 의한 K_D 결정을 위해, 항체 단백질의 단량체 분획을 사용하였다 (분석용 SEC; 각각 Fab의 경우에 슈퍼덱스75(Superdex75) (아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)), 또는 IgG의 경우에 도소(Tosoh) G3000SWXL (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)에 의한 분석시, 적어도 90% 단량체 함량).

용액 중에서의 친화도 결정은 기본적으로 문헌 (Friguet et al. 305-19)에 기재된 바와 같이 수행하였다. SET 방법의 감수성 및 정확도를 개선하기 위해, 전형적 ELISA에서 ECL 기반 기술 (Haenel et al., 2005)로 바꾸었다.

Epo 항체를 인큐베이션 완충제 (2% BSA (시그마(Sigma) cat#A4503) 및 1% 트윈20(Tween20) 및 1% 트리톤 -X (시그마 cat#234729)를 함유하는 PBS) 중에서 고정 농도로 희석하고, 인큐베이션 완충제 중의 Epo의 연속 희석액 (1:5)에 첨가하였다.

Epo의 최종 최고 농도:

인간, Hu-다르베포이에틴, 시노몰구스, 마우스, 래트 = 10nM

토끼= 100nM

Fab의 최종 농도:

NVS2: 2pM, 토끼 = 30pM 제외

NVS3: 2pM, 토끼 = 5pM 제외

NVS4: 2pM, 토끼 = 10nM 제외

NVS1: 2pM

샘플을 실온에서 밤새 인큐베이션하여 평형에 도달하도록 하였다.

스트렙타비딘-코팅된 표준 MSD 플레이트 (메조-스케일 디스커버리, 384-웰: MSD cat#L11SA)를 25μl 인큐베이션 완충제로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 TBST 완충제 (0.05% 트윈20을 함유하는 25mM TBS) 중에서 3x 세척하고, 0.1μg/ml의 비오티닐화-Epo를 25μl 인큐베이션 완충제 중에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST 완충제 중에서 3x 세척하였다. Fab 및 Epo 적정을 함유하는 샘플을 플레이트에 첨가하고 (25μl), 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST 완충제 중에서 3x 세척하였다. 25μl 검출 항체를 첨가하고 (항-인간 (염소) 술포-TAG, 인큐베이션 완충제 중 1:1000, MSD cat#R32AJ-1), 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하고, 50μl의 1x MSD 판독 완충제 T를 첨가하였다 (계면활성제 함유, MSD cat#R92TC-1). 플레이트를 MSD 스펙터 이미저(Spector Imager) 6000 상에서 판독하였다.

3회 실험을 별개의 날에 수행하여, 각각의 데이터 포인트는 3중으로 존재하였다.

데이터는 각각의 값으로부터 백그라운드 (Fab를 함유하지 않는 웰의 평균)를 차감하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 v4를 사용하여 분석하였다. X-축 값 (용액 중 Epo의 농도)은 log10x로 변환하였다.

KD 값 (KD)을 하기 모델에 적합시켰다:

Top= 항원 농도 = 0에서의 신호

x= 용액 중 Epo의 농도

Fab= Fab 농도에 대한 제약은 1pM로 설정함

Epo Fab의 친화도를 SET 검정을 사용하여 결정하였고, 생성된 K_D 값 ([pM] 농도)을 표 3에 요약한다. NVS2는 인간, 인간-다르베포이에틴 및 시노몰구스 Epo에 10pM 미만의 K_D로 결합하였다. NVS2는 또한 마우스 Epo에 50pM 미만의 K_D 및 래트 Epo에 20pM 미만의 K_D로 결합하였다. NVS3은 인간, 인간-다르베포이에틴, 시노몰구스, 마우스 및 래트 Epo에 5pM 미만의 K_D로 결합하였다. NVS4는 인간, 인간-다르베포이에틴, 시노몰구스, 마우스 및 래트 Epo에 10pM 미만의 K_D로 결합하였다.

<표 3> Epo 항체의 친화도 결합 (SET)

실시예 3: Epo 유도된 세포 증식의 억제

성장 및 생존에 대해 에리트로포이에틴 의존성인 세포를 사용하여 Epo-의존성 증식 억제에 의해 항-Epo 치료제의 효력을 측정할 수 있다 (Chiba et al., 1991).

실시예 3a: Ba/F3-EpoR 세포 증식 검정

본 검정은 Epo 수용체를 발현하는 마우스 Ba/F3 세포 (Ba/F3-EpoR 세포)에서 Epo 항체가 Epo 유도된 세포 증식을 억제하는 능력을 입증한다. Ba/F3 세포는 성장 및 생존에 대해 IL-3 의존성이고, 다양한 종양원성 티로신 키나제에 의한 형질전환시 IL-3 독립적 방식으로 성장하는 것으로 밝혀졌다. EpoR에 의한 안정한 형질감염으로, Ba/F3-EpoR 세포는 IL-3 독립적이게 된다. 뉴클레오펙터(Nucleofector) 장치 (아막사(Amaxa), 뉴클레오펙터™ II)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 아막사 뉴클레오펙션 시스템 (카탈로그 번호 VCA-1003, 아막사 게엠베하(Amaxa GmbH))을 사용하여 인간 EpoR을 보유하는 포유동물 발현 플라스미드 pcDNA3.1을 Ba/F3 세포에 형질감염시켰다.

물질

세포 유지

성장 배지: RPMI1640/10% FBS/1% Pen-Strep/100μg/ml 히그로마이신 B/1U/ml Epo

검정 배지: RPMI1640/10% FBS/1% Pen-Strep/100μg/ml 히그로마이신 B

Ba/F3-EpoR 세포를 성장 배지 (RPMI1640/10%FBS/1%Pen-Strep/100μg/ml 히그로마이신 B/1U/ml Epo) 중에 유지시켰다. 세포를 ~1e6 세포/ml에서 (3-4일마다) 0.4-0.6e5 세포/ml로 분할하였다.

Epo 유도된 세포 증식 검정

1. 실험 하루 전, 성장 배지를 제거하기 위해 원심분리에 의해 Ba/F3-EpoR 세포를 준비한 후, 세포를 Epo를 함유하지 않는 검정 배지 (RPMI1640/10% FBS/1% Pen-Strep/100μg/mL 히그로마이신 B)에 재현탁시켰다.

2. 실험 당일, 세포를 검정 배지 중에서 2-3회 세척하고 (1000rpm, 5분 원심분리), 검정 배지에 1.25x 10⁵ 세포/ml로 재현탁시켰다.

3. 2500 세포를 384-웰 흑색 플레이트 (투명 바닥, TC 처리됨) 내의 각각의 검정 웰에 첨가하였다.

4. 384-웰 마이크로플레이트에서 Epo를 검정 배지로 연속 희석하여 Epo의 최종 농도가 목적하는 최종 농도보다 2배 더 높게 하였다.

5. 20μl의 연속 희석된 Epo (3중)를 384-웰 흑색 플레이트의 Ba/F3-EpoR 세포를 함유하는 샘플 웰에 3중으로 첨가하였다.

6. 플레이트를 원심분리기 내에서 1000rpm에서 30-60초 동안 회전시키고, 48시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

7. 종점 4시간 전, 8μl 셀 타이터 블루(Cell Titer Blue)를 모든 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 재인큐베이션하였다.

8. 4시간 후, 플레이트를 베크만 쿨터 패러다임(Beckman Coulter Paradigm) 상에서 패러다임 다중모드 SW로, 또는 유사한 스캐너 상에서 판독하였다.

9. Epo는 Ba/F3-EpoR 세포의 증식을 기준선보다 4-배 초과하여 자극하였다. Epo는 11.2 pM의 평균 EC₅₀ 및 10pM 및 26pM의 범위로 Ba/F3-EpoR을 자극하였다.

10. 항-Epo 항체를 검정 배지 중 4ng/ml Epo를 함유하는 384-웰 마이크로플레이트에서 3중으로 연속 희석하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

11. 상기 Epo/항-Epo 항체 혼합물의 20μl/웰을 웰당 2500 BaF3/EpoR 세포로 사전 시딩된 384-웰 흑색 벽 플레이트에 첨가하였다.

12. 플레이트 인큐베이션 후 상기 단계 7-9에 요약된 바와 같이 처리하였다.

결과

Epo 항체는 1ng/ml Epo의 존재 하에 48시간 후 Ba/F3-EpoR 세포 증식을 억제하였다. 항체는 350pM 이하의 IC₅₀으로 Ba/F3-EpoR 세포 증식을 억제하였다.

<표 4>

실시예 3b: F36E 세포 증식 검정

F36E 세포는 증식을 위해 Epo에 매우 의존적이다. 상기 기재된 방법을 사용한 Epo에 의한 자극은 전형적으로 기준선보다 6-배 더 큰 신호를 생성하였다. 이 곡선의 EC50은 7 pM이다.

Epo 유도된 F36E 세포 증식 검정의 중화를 위한 프로토콜

항-Epo 치료 항체를 스크리닝하고 개발을 위한 후보를 선택하기 위해, 모 골수 세포주로부터 유래된 Epo-의존성 림프구-유사 불멸화 세포주인 F36E 세포주를 사용한 증식 검정을 사용하였다.

물질

세포 유지

재조합 과글리코실화 인간 Epo인 다르베포이에틴을 본원에 기재된 세포 유지 및 증식 검정을 위해 사용하였다. 다르베포이에틴은 F36E 세포에서 재조합 인간 Epo에 대한 것과 유사한 EC50으로 증식을 자극하였다 (63.2 pg/ml 다르베포이에틴 및 81.25 pg/ml 에리트로포이에틴; LU-15432, pg. 44 참조). F36E 세포를 성장 배지 (RPMI1640/5% FBS/1% Pen-Strep/5.2U/ml dEpo) 중에 ml당 최소 밀도 0.25e6 세포 내지 ml당 최대 밀도 1.0e6 세포로 최대 10 계대 유지시켰다.

Epo 유도된 증식 검정 프로토콜

1. Epo를 검정 배지 (RPMI1640/5% FBS/1% Pen-Strep) 중에 4x-배 목적 최종 농도인 4ng/ml로 희석시켰다.

2. 항-Epo 항체를 검정 배지 중에 200nM, 4x 최종 농도로 희석시키고, 이 농도를 검정 배지 중에서 6개의 포인트에 대해 연속 희석시켰다. 희석은 양성 참조 항체 (예를 들어: Epo26) 및 음성 참조 항체 (예를 들어: 항-닭 리소자임 모노클로날 항체)에 대해 반복하였다.

3. 7.5ul 희석된 dEpo 및 7.5ul 항-Epo 항체 연속 희석액을 384-웰 폴리프로필렌 마이크로플레이트에서 3중으로 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.

4. F36E 세포 (384-웰 플레이트당 2e6)가 펠릿화되었고, 성장 배지를 흡출하고, 세포를 검정 배지에서 1회 세척한 다음 (1200rpm, 5분 원심분리), 검정 배지 중에 3.33e5 세포/ml로 재현탁시켰다.

5. 15μl/웰 세포 (5,000 세포/웰)를 384-웰 폴리스티렌 세포 배양 플레이트 내의 모든 웰에 첨가하였다.

6. 15ul 항체-Epo 혼합물을 세포에 첨가하였다.

7. 68시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.

8. 8μl 셀 타이터 블루를 웰당 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.

9. 플루오로스캔 아센트(Fluoroskan Ascent) 마이크로플레이트 형광계 또는 유사한 스캐너 상에서 560(20)Ex/590(10)Em에서 형광을 측정하였다.

10. 평균 RFU +/- 표준 편차 vs. nM 항체를 플롯팅하고, 그래프 패드 프리즘 소프트웨어에서 비-선형 곡선 적합에 의해 IC50을 결정하였다.

결과

항-Epo 항체는 F36E 세포 증식을 200pM 이하의 IC₅₀으로 억제하였다.

<표 5>

실시예 4: 에피토프 결합

합성 펩티드 & 펩티드 절단 연구

인간 Epo (hEpo)의 구조적 도메인, hEpo의 도메인 말단절단, 또는 hEpo 및 인간 트롬보포이에틴 (TPO)의 일부를 함유하는 키메라 분자에 상응하는 합성 펩티드를 합성하거나 재조합적으로 발현시켰다. 합성 펩티드에 대한 양성 결합은 그러한 Epo 도메인 내에 함유된 잔기가 항-Epo 항체에 대한 결합에 관여됨을 나타낸다. 말단절단된 단백질의 경우에, 결합 상실은 항-Epo 항체에 대한 결합에 있어서 말단절단된 부분의 관여를 나타낸다. 그러나, 결합 상실은 말단절단이 항-Epo 항체에 대한 결합에 영향을 미치도록 나머지 단백질의 구조를 유의하게 변경시킬 가능성을 배제하는 것은 아니다. 인간 Epo-인간 TPO 키메라는 에피토피 맵핑을 여전히 허용하면서 구조의 유지를 가능하게 하였다. hTPO의 일부를 함유하는 변이체에 대한 결합 상실은 hEpo 내의 상동 영역이 항-Epo 항체에의 결합을 위해 중요함을 나타낸다.

항-에리트로포이에틴 항체의 펩티드 에피토프 맵핑

에리트로포이에틴의 헬릭스에 상응하는 하기 6종의 펩티드 (표 6)를 합성하였다.

<표 6>

검정 설정

1. PBS (5ug/ml) 중 25ul의 펩티드를 384 웰 MSD 표준 플레이트 (메조스케일 디스커버리, Cat. No.L21XA-4) 상에 밤새 코팅하였다.

2. 플레이트를 90ul의 PBS+5%BSA/0.1%트윈-20/0.1% 트리톤X-100로 4시간 동안 차단시켰다.

3. PBS+2%BSA/0.1%T트윈-20/0.1% 트리톤X-100의 희석액 중 500nM 모르포시스 Epo Fab를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다.

4. 플레이트를 세척하고, Epo Fab의 경우에 술포-태그 항-인간 IgG (메조 스케일 디스커버리, Cat. 번호 R32AJ-1)와 함께 또는 참조 단백질/항체에 적절한 종과 함께 인큐베이션하였다 (1시간).

5. 플레이트를 세척하고, MSD 판독 용액 (메조 스케일 디스커버리, Cat. R92TC-1)을 첨가하였다.

6. 플레이트를 판독하였다.

에리트로포이에틴의 말단절단된 변이체를 갖는 항-에리트로포이에틴 항체의 에피토프 맵핑

Epo 변이체 1: 헬릭스 A

Epo 변이체 2: 헬릭스 A, 루프 A-B

Epo 변이체 3: 헬릭스 A, 루프 A-B, 헬릭스 B

Epo 변이체 4: 헬릭스 A, 루프 A-B, 헬릭스 B, 루프 B-C, 헬릭스 C

Epo 변이체 5: 전장 에리트로포이에틴

검정 설정

1. 플레이트를 Epo 변이체를 발현하는 비오티닐화 HEK293으로 표준 스트렙타비딘 384 웰 플레이트 (메조스케일 디스커버리, Cat. No.L21SA-1) 상에 밤새 4℃에서 코팅하였다.

2. 플레이트를 90ul의 PBS+5%BSA/0.1%트윈-20/0.1% 트리톤X-100으로 4시간 동안 차단시켰다.

3. 플레이트를 세척하고, 500nM 모르포시스 Epo Fab를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다.

4. 플레이트를 세척하고, Epo Fab의 경우에 술포-태그 항-인간 IgG (메조 스케일 디스커버리, Cat. No. R32AJ-1)와 함께 또는 참조 단백질/항체에 적절한 종과 함께 인큐베이션하였다 (1시간).

5. 플레이트를 세척하고, MSD 판독 용액 (메조 스케일 디스커버리, Cat. R92TC-1)을 첨가하였다.

6. 플레이트를 판독하였다.

Epo/트롬보포이에틴 (Tpo) 및 토끼/인간 Epo 키메라를 갖는 항-에리트로포이에틴 항체의 에피토프 맵핑

Epo/Tpo 키메라

Epo/Tpo 변이체 1: Tpo 헬릭스 A를 갖는 인간 Epo

Epo/Tpo 변이체 2: Tpo 루프 A-B를 갖는 인간 Epo

Epo/Tpo 변이체 3: Tpo 헬릭스 B를 갖는 인간 Epo

Epo/Tpo 변이체 4: Tpo 헬릭스 C를 갖는 인간 Epo

Epo/Tpo 변이체 5: Tpo 헬릭스 D를 갖는 인간 Epo

토끼/인간 Epo 키메라

Rb/Hu Epo 변이체 1: 인간 헬릭스 A를 갖는 토끼 Epo

Rb/Hu Epo 변이체 2: 인간 루프 A-B를 갖는 토끼 Epo

Rb/Hu Epo 변이체 3: 인간 헬릭스 B를 갖는 토끼 Epo

Rb/Hu Epo 변이체 4: 인간 루프 B-C 및 헬릭스 C를 갖는 토끼 Epo

Rb/Hu Epo 변이체 5: 인간 루프 C-D를 갖는 토끼 Epo

Rb/Hu Epo 변이체 6: 인간 헬릭스 D를 갖는 토끼 Epo

검정 설정

1. PBS (2ug/ml) 중의 25ul의 Epo 키메라를 384 웰 MSD 표준 플레이트 (메조스케일 디스커버리, Cat. No.L21XA-4) 상에 밤새 4℃에서 코팅하였다.

2. 플레이트를 90ul의 PBS+5%BSA/0.1%트윈-20/0.1% 트리톤X-100으로 4시간 동안 차단시켰다.

3. PBS+2%BSA/0.1%트윈-20/0.1% 트리톤X-100의 희석액 중의 500nM 모르포시스 Epo Fab를 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다.

4. 플레이트를 세척하고, Epo Fab의 경우에 술포-태그 항-인간 IgG (메조 스케일 디스커버리, Cat. No. R32AJ-1)와 함께 또는 참조 단백질/항체에 적절한 종과 함께 인큐베이션하였다 (1시간).

5. 플레이트를 세척하고, MSD 판독 용액 (메조 스케일 디스커버리, Cat. R92TC-1)을 첨가하였다.

6. 플레이트를 판독하였다.

일반적 프로토콜

표준 포획 384-웰 MSD 플레이트 (메조 스케일 디스커버리)를 펩티드 (PBS 중 5ug/ml, 뉴잉글랜드 펩티드 엘엘씨(New England Peptide LLC)) 또는 Epo 키메라 (PBS 중 2ug/ml)로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 비오티닐화 말단절단된 Epo 변이체 (PBS 중 2ug/ml)를 표준 스트렙타비딘 포획 384-웰 MSD 플레이트 상에 밤새 코팅하였다. 플레이트를 TBST (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), Cat. No. 28360)로 1X 세척 후, 플레이트를 희석제 (PBS, 5% BSA, 0.1% 트윈-20, 0.1% 트리톤X-100) 중에서 4시간 동안 실온에서 차단시켰다. 플레이트를 TBST 중에서 3X 세척하였다. 500 나노몰의 항-에리트로포이에틴 fab를 MSD 플레이트에 사전코팅된 펩티드/Epo 변이체에 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 TBST 중에서 3X 세척하고, 항-인간 IgG-술포태그 (1ug/ml, 메조 스케일 디스커버리, Cat. No.R32AJ-1)를 첨가하고, 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 TBST 중에서 3X 세척하고, 1X 판독 완충제 T (메조 스케일 디스커버리, Cat. No.R92TC-1)를 첨가하였다. 플레이트를 MSD 스펙터 이미저 6000 상에서 판독하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어 v4를 사용하여 데이터를 분석하였다.

결과:

결과는 항체가 하기 도메인에 최소한으로 결합함을 나타낸다 (표 7). 어떠한 항체도 헬릭스 C에 결합하지 않았다.

<표 7>

Epo와의 복합체 내의 항체의 결정 구조

글리코실화된, 재조합 인간 에리트로포이에틴 (Epo)을 레크 파마슈티칼스, 인크.로부터 입수하였다.

Epo를 단백질 탈글리코실화 믹스 (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), cat #P6039S)를 사용하여 탈글리코실화시켰다. 30 mg의 hEpo를 1 ml의 단백질 탈글리코실화 믹스와 조합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 이때 탈글리코실화는 SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 불완전하였다. 이어서 추가의 0.5 ml의 단백질 탈글리코실화 믹스를 Epo에 첨가하고, 추가로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 겔 분석은 Epo의 거의 완전한 탈글리코실화를 나타내었다. 이어서 이 단백질을 25 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl 중에 평형화된 120 ml 슈퍼덱스75 칼럼 (지이 헬스케어, cat #28-9893-33)을 사용하여 추가로 정제하였다. 가장 높은 수준의 hEpo의 탈글리코실화를 함유하는 용리 분획을 풀링하였다. 5mg의 탈글리코실화된 Epo를 7 mg의 NVS3과 조합한 후, 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션하여 단백질 복합체를 형성하였다. 이어서 단백질 복합체 믹스를 농축시키고, 25mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl 중에 평형화된 120 ml 슈퍼덱스75에 적용하였다. Epo:NVS3의 SDS-겔 평가된 화학량론적 비를 함유하는 분획을 풀링하고, 19 mg/ml로 농축시켰다 (농도는 LCUV에 의해 추정됨) (프로노바(PRONOVA) #27SN). 이러한 농축된 Epo:NVS3 복합체를 사용하여 결정화 스크린을 설정하였다. 시팅-드롭 증기 확산 기술에 의해, 드롭이 동등 부피의 단백질 및 저장 용액을 함유하게 하면서 결정을 성장시켰다. 결정은 4℃에서 하기 저장 상태로 형성되었다: 0.1M Hepes pH7.0, 12%PEG3350, 50mM 아세트산아연 탈수화물. 하기 동결보호 용액을 사용하여 결정을 동결시켰다: 0.1M Hepes pH7.0, 15%PEG3350, 50mM 아세트산 아연 탈수화물, 22% 글리세롤.

Epo:NVS3 복합체 결정 회절 데이터는 어드밴스드 포톤 소스(Advanced Photon Source) (아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory), 미국)에서 빔라인 17-ID에서 수집하였다. 공간군 C2에서 오토프록(autoPROC) (글로벌 페이징, 리미티드(Global Phasing, LTD))을 사용하여 데이터를 처리하고 2.6Å에서 평가하여, 셀 치수는 a=125.57Å, b=150.15 Å, c=163.84Å, 알파=90^o, 베타=110.81^o, 감마=90^o였다. Epo:NVS3 구조는 페이저(Phaser)를 사용하여 분자 대체에 의해 해석하였다 (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674). PDB 데이터베이스 (Berman 2000)에서 3H0T 구조로부터 Fab를 가변 및 불변 도메인으로 분할하고, 인간 에리트로포이에틴 구조 (Syed et al., Nature. 1998 Oct 1;395(6701):511-6), PDB 코드 1EER을 검색 모델로서 사용하였다.

COOT (Emsley & Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132)에서 비대칭 단위당 3분자의 Epo:NVS3 복합체를 함유하는 최종 모델을 구축하고, R 및 R_유리 값을 각각 23.0% 및 26.7%로 정밀화하였고, 결합 길이 및 결합각의 경우에 페닉스(PHENIX)에 의한 rmsd는 각각 0.010 Å 및 1.34°였다 (Adams et al., Acta Cryst. D66, 213-221 (2010)).

Epo:NVS3의 결정 구조를 해석하고, 2.6Å으로 정밀화하였다. 비대칭 단위는 3개의 Epo:NVS2 단백질 복합체로 구성되고, 각각은 1개의 Epo 단백질에 결합된 1개의 Fab로 구성된 것으로 밝혀졌다. 이들 복합체 중 2종은 아연 매개된 이량체를 형성하고, 3번째 것은 더 높은 b-인자 및 더 약한 밀도를 나타내었다. Fab에서 Epo까지의 상호작용은 NVS3의 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 상보성 결정 영역 (CDR) 루프에 의해 매개되었다. Epo의 입체형태 변화는 1EER과 비교하여 Fab 결합 에피토프에서 원위인 루프로 제한되었고, 모든 144개의 정렬된 아미노산에 대한 RMSD는 0.5Å이었다. Fab NVS3의 중쇄 및 경쇄는 도메인에 대해 전형적인 이뮤노글로불린-유사 폴드를 나타내었다.

Epo:NVS3의 결정 구조를 사용하여 NVS3의 항원 결합 단편의 Epo 에피토프를 확인하였다. Epo 상의 상호작용 표면을 잔기 Ser⁹, Glu¹³, 잔기 Thr⁴⁴ 내지 Arg⁵³ 및 잔기 Asn¹⁴⁷ 내지 Arg¹⁶²를 포함하는 잔기로 주로 형성하였다. 이는 α-헬릭스 A, 루프 βA-αB 및 α-헬릭스 D로 표시되는 Epo의 이차 구조 요소에 상응한다. 이들 잔기는 NVS3에 의해 인식되는 3차원적 표면을 형성하였다. 상호작용은 백본 상호작용, 용매 매개된 상호작용, 및 직접 측쇄 상호작용을 포함하였다.

<표 8> NVS3에 대한 Epo 상호작용 잔기

NVS3과 접촉하는 원자를 함유하는 Epo 잔기를 표 9에 열거한다. 접촉은 잠재적인 물 매개된 상호작용을 고려하여 NVS3의 5 Å 내인 것으로 규정된다.

<표 9>

NVS2와 접촉하는 원자를 함유하는 Epo 잔기를 열거한다. 접촉은 잠재적인 물 매개된 상호작용을 고려하여 단백질 파트너의 5 Å 내인 것으로 규정된다.

<표 10>

실시예 5: 생체내 모델

실시예 5a: 안구 부종의 마우스 모델

C57/Bl6 마우스 (타코닉(Taconic))에 ssAAV2-EPO-eGFP (DR005) 및 ssAAV2-EGFP (TM003) (대조군)를 망막하 주사하였다. 마우스를 주사 후 3주째 (21일)에 희생시켰다. 망막을 편평-실장하고, 혈관 구경을 측정하였다.

방법:

ssAAV2-EPO-eGFP 및 ssAAV2-eGFP의 망막하 주사

8-주령 C57/Bl6 마우스를 2개의 군 (각각 10마리의 마우스, 20 눈/군)으로 나누고, 1 μl ssAAV2를 2x10⁹ DRP/μl로 망막하 주사하였다. 제1 군 (대조군)에는 ssAAV2-EPO (TM003)를, 제2 (실험군)에는 ssAAV2- eGFP (DR005)를 망막하 제공하였다. 망막 혈관 변화에 대한 마우스 Epo의 효과를 주사 후 21일째에 망막 편평-실장물에서 검사하였다.

AAV (아데노-연관 바이러스) 시험된 것은 다음과 같다: ssAAV2-EPO-eGFP [노스캐롤라이나 대학교 채플힐(The University of North Carolina at Chapel Hill)의 진 테라피 센터 바이러스 벡터 코어 퍼실리티(Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility)로부터의 (AAV2-CMV-mEPO-IRES-eGFP), Lot# AV3782] 및 ssAAV2-GFP [노스캐롤라이나 대학교 채플힐의 진 테라피 센터 바이러스 벡터 코어 퍼실리티로부터의 (AAV2-eGFP): Lot# AV3725].

절차:

AAV 벡터를 망막하 주사를 통해 시험된 마우스의 양쪽 눈에 전달하였다. 기재된 모든 절차는 멸균 시약, 시린지 및 적절한 PPE를 사용하여 무균 조건 하에 수행하였다.

1. 마우스를 고정시키고, 한 방울의 시클로펜톨레이트 (1%)에 이어 한 방울의 2.5% 페닐에프린으로 그의 동공을 확장시켰다.

2. 다음으로, 동물을 아베르틴(Avertin) (250 mg/kg)으로 i.p로 마취시켰다. 각막은 한 방울의 0.5% 프로파라카인으로 국소 마취시켰다.

3. 동물을 외과용 현미경 하에 둔 후, 마이크로-스칼펠을 사용하여 윤부 후방에 0.5 mm 비강 절개부를 만들었다.

4. 10 μl 해밀턴 시린지에 부착된 무딘 바늘을 공막 절개부를 통해 측두 망막쪽으로 접선방향으로 삽입하였다. 바늘을 저항이 느껴질 때까지 전진시켰다.

5. 1 μl의 ssAAV2 벡터 (ssAAV2-EPO-eGFP 또는 ssAAV2-GFP, 둘 다 전달을 가시화하기 위해 1:50으로 희석된 플루오레세인을 함유함)를 망막하 공간에 천천히 주사하였다.

6. 외과용 현미경 하에 눈을 검사하였다. 성공적인 망막하 주사는 플루오레세인 함유 망막 박리를 가시화하여 확인하였다.

7. 망막 손상 (출혈 크기에 의해 가시화됨) 및 수정체 손상의 정도에 따라 주사를 점수화하였다.

8. 동물을 반대 쪽으로 돌리고 절차를 반복하였다.

9. 주사 후 양쪽 눈에 항생제 연고를 도포하였다.

망막 박리, 망막 편평실장물에 대한 영상화 및 정량화:

1. 0.1 ml 콘카발린-A (Con-A)를 안락사 (CO₂) 1 내지 5분 전에 주사하였다 (i.v., 꼬리 정맥).

2. 안구를 적출하고, 2시간 동안 파라포름알데히드 (PBS 중 4%) 중에서 고정시켰다. 이어서 박리 전까지 이를 4℃에서 PBS 완충제 중에 1-3일 동안 유지시켰다.

3. 각막 및 수정체를 떼어내고, 후부 안배 (망막 색소 상피/맥락막)로부터 망막을 박리해내었다.

4. 망막에 4개의 방사상 절개부를 만들고, 광수용체 층이 아래를 향하게 하여 벡타쉴드(Vectashield) 실장 배지 내에 편평-실장하였다.

5. 실장되면 편평-실장물을 중심 망막이 중심이 되게 하고 (참조로서 시신경 유두를 사용함), 자이스 영상화 시스템(Zeiss Imaging System) (악시오비전(AxioVision))을 사용하여 20X에서 Con-A 표지된 망막 혈관을 포획하였다.

6. 악시오비전 소프트웨어를 사용하여 시신경 유두로부터 200 μm 떨어진 중심 망막 혈관의 직경을 측정하였다.

7. 수득된 데이터를 그래프패드 프리즘으로 분석하였다.

결과 및 결론:

혈관 직경의 정량화는 ssAAV2-EPO가 ssAAV2-GFP 및 나이브 눈 (6개의 눈)과 비교하여 중심 망막에서 유의한 (* p<0.001) 혈관 확장을 유발함을 밝혀내었다 (도 1). ssAAV2-GFP vs. 나이브 군 비교시 어떠한 유의차도 발견되지 않았다. 일원 ANOVA 및 던넷 사후 검정을 사용하여 샘플을 분석하였다 (C) 각 군에 대해 대표적인 편평-실장물. AAV2-Epo-eGFP에 의한 Epo의 장기간의 전달은 인간에서 당뇨병성 황반 부종의 주요 특징인 정맥 구경에서의 통계적으로 유의한 증가를 야기하였다 (도 1). 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-EPO 항체를 대상체에게 치료 유효량으로 투여함으로써 눈에서 정맥 구경을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

실시예 5b: 항-Epo 항체의 생체내 효능

본원에 기재된 항-Epo 항체의 생체내 활성 및 치료 효능을 상기 기재된 안구 부종의 마우스 모델에서 평가할 수 있다.

마우스 모델에서 생체내 시험접종

8주령의 C57B6 마우스에 하기 중 하나를 망막하 주사하였다.

군:

군 1: AAV2-eGFP @ 역가 2 x 10⁹ DRP @ 역가, 1ul/눈, n = 10마리의 마우스의 20개의 눈

군 2: AAV2-Epo-eGFP @ 역가 2 x 10⁹ DRP , 1ul/눈, n = 10마리의 마우스의 20개의 눈

군 3: AAV2-Epo-eGFP @ 역가 2 x 10⁹ , 1ul/눈, + 항-Epo Fab, 100ug/눈, 1 매주, n = 10마리의 마우스의 20개의 눈

주사 후 2주째에 혈관 직경을 측정하여 마우스 모델에서 적절하게 투여된 항-Epo 항체의 효과를 검사하였다.

노스캐롤라이나 대학교 채플힐의 진 테라피 센터 바이러스 벡터 코어 퍼실리티로부터의 AAV-GFP (AAV2-eGFP) 및 AAV2-Epo-eGFP (AAV2-CMV-mEpo-IRES-eGFP).

항-Epo 항체의 안내 주사는 망막 혈관 확장을 억제하고, 항-Epo 항체는 망막 내 혈류 및 저산소 상태 감소에 대한 Epo의 효과를 개선할 것이다. 따라서, 항-Epo 항체는 습성 AMD 및 당뇨병성 망막병증과 같은 혈관 망막 질환이 있는 환자에서 또한 관찰되는 망막 병리상태를 감소시킬 것으로 예상된다.

실시예 6: 유리 EPO의 생체내 중화

실시예 6a: 항-Epo Fab를 사용한 유리 EPO의 생체내 중화

항-EPO 항체의 생체내 활성 및 치료 효능을 토끼 눈에서 하기와 같이 평가하였다. 토끼에 항-EPO Fab, NVS2 (1mg/눈)를 유리체내 투여하고, 4일 후 유리체내 용량의 EPO (3 ug/눈)를 시험접종하였다. 동물을 희생시켜 유리체를 포함하는 안구 조직을 추출하였다. 유리체 내 유리 EPO 및 총 EPO의 양은 하기 기재된 바와 같이 결정되었다.

총/유리 EPO 수준:

표준 결합 MSD 플레이트 (메조-스케일 디스커버리, 384-웰: MSD cat#L21XA)를 사용하여 코팅 완충제 (PBS) 및 인큐베이션 완충제 (2% BSA (시그마 cat#A4503) 및 0.1% 트윈20 및 0.1% 트리톤-X를 함유하는 PBS)를 사용하여 검정을 수행하였다.

포획 항체를 PBS (25μl) 중에 1μg/ml로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 (0.05% 트윈20을 함유하는 PBS) 중에서 3x 세척하고, 25μl 인큐베이션 완충제로 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하였다. 인큐베이션 완충제 중의 유리체 희석액을 플레이트에 첨가하고 (25μl), 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인간 재조합 다르베포이에틴을 표준물 (A000123, 2μg/ml에서 시작됨)로서 사용하였다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하였다. 25μl 일차 항체를 첨가하고 (인큐베이션 완충제 중 1μg/ml), 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하였다. 25μl의 항-종 이차 술포-태그 항체를 첨가하고 (인큐베이션 완충제 중 1:1000), 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하고, 25μl의 1x MSD 판독 완충제 T를 첨가하였다 (계면활성제 함유, MSD cat#R92TC-1). 플레이트를 MSD 스펙터 이미저 6000 상에서 판독하였다.

결과 및 결론:

항-EPO 또는 비히클이 주사된 동물의 유리체 내에서 측정된 총 EPO 수준은 예상한 바와 유사하였다 (도 2). 대조적으로, 어떠한 유리 EPO도 항-EPO Fab가 주사된 토끼의 유리체 내에서 측정되지 않았지만, 비히클이 주사된 토끼의 유리체 내에서는 평균 ~ 100ng/ml 유리 EPO가 측정되었다. 유리체내 투여된 항-EPO Fab는 유리 EPO 수준을 예상한 바와 같이 완전히 중화시켰다.

실시예 6b: 항-Epo Fab를 사용한 유리 EPO의 생체내 중화

항-EPO 항체의 생체내 활성 및 치료 효능을 토끼 눈에서 하기와 같이 평가하였다. 토끼에 항-EPO Fab, NVS2 (1mg/눈) 및 EPO (3ug/눈)의 사전-혼합 용액을 유리체내 투여하였다. 동물을 희생시켜 유리체를 포함하는 안구 조직을 추출하였다. 유리체 내 유리 EPO 및 총 EPO의 양은 하기 기재된 바와 같이 결정되었다. 주: 일부 눈에는 항-EPO Fab, EPO, 및 VEGF의 사전-혼합 용액이 제공됨.

총/유리 EPO 수준:

표준 결합 MSD 플레이트 (메조-스케일 디스커버리, 384-웰: MSD cat#L21XA)를 사용하여 코팅 완충제 (PBS) 및 인큐베이션 완충제 (2% BSA (시그마 cat#A4503)및 0.1% 트윈20 및 0.1% 트리톤-X를 함유하는 PBS)를 사용하여 검정을 수행하였다.

포획 항체를 PBS (25μl) 중에 1μg/ml로 코팅하고, 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 (0.05% 트윈20을 함유하는 PBS) 중에서 3x 세척하고, 25μl 인큐베이션 완충제로 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하였다. 인큐베이션 완충제 중의 유리체 희석액을 플레이트에 첨가하고 (25μl), 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인간 재조합 다르베포이에틴을 표준물로서 사용하였다 (A000123, 2μg/ml에서 시작됨). 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하였다. 25μl 일차 항체를 첨가하고 (인큐베이션 완충제 중 1μg/ml), 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하였다. 25μl의 항-종 이차 술포-태그 항체를 첨가하고 (인큐베이션 완충제 중 1:1000), 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제 중에서 3x 세척하고, 25μl의 1x MSD 판독 완충제 T를 첨가하였다 (계면활성제 함유, MSD cat#R92TC-1). 플레이트를 MSD 스펙터 이미저 6000 상에서 판독하였다.

결과 및 결론:

항-EPO 또는 비히클이 주사된 동물의 유리체 내에서 측정된 총 EPO 수준은 예상한 바와 유사하였다 (도 3). 대조적으로, 어떠한 유리 EPO도 항-EPO Fab가 주사된 토끼의 유리체 내에서 측정되지 않았고, 한편 비히클이 주사된 토끼의 유리체 내에서는 평균 ~ 200ng/ml 유리 EPO가 측정되었다 (도 3). VEGF의 존재는 측정된 유리 또는 총 EPO 수준에 어떠한 영향을 갖는 것으로 보이지 않았다. 유리체내 투여된 항-EPO Fab는 유리 EPO 수준을 예상한 바와 같이 완전히 중화시켰다.

SEQUENCE LISTING <110> GHOSH, JOY RUTZ, MARK ANTHONY TISSOT-DAGUETTE, KATRIN URLIKE SLPAWSKI, IGOR ROGUSKA, MICHAEL <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTIBODIES TARGETING EPO <130> PAT054963-US-NP <140> 14/095,910 <141> 2013-12-03 <150> 61/733,566 <151> 2012-12-05 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Gly Ile Asp Pro Ile Ser Gly Phe Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Glu Leu Tyr Tyr Pro Gly Thr Trp Met Ala Val Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ser Gly Asp Asn Ile Pro Glu Tyr Tyr Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Arg Asp Asn Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gln Val Phe Asp Glu Ser Ser Trp His Trp Val 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Asp Pro Ile Ser Gly Phe 1 5 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Glu Leu Tyr Tyr Pro Gly Thr Trp Met Ala Val Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Asp Asn Ile Pro Glu Tyr Tyr 1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Arg Asp Asn 1 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Phe Asp Glu Ser Ser Trp His Trp 1 5 <210> 13 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asp Pro Ile Ser Gly Phe Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Tyr Tyr Pro Gly Thr Trp Met Ala Val Met Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Pro Glu Tyr Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Phe Asp Glu Ser Ser Trp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 15 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asp Pro Ile Ser Gly Phe Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Tyr Tyr Pro Gly Thr Trp Met Ala Val Met Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys 225 <210> 16 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Pro Glu Tyr Tyr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Phe Asp Glu Ser Ser Trp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 17 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 caggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaggtg 60 tcctgtaaag ctagtggcgg cacctttaga tcctacgcta ttagctgggt gcgacaggct 120 ccaggccagg gcctcgaatg gatgggcggc atcgacccta ttagcggctt cgccgactac 180 gctcagaaat ttcagggcag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctac 240 atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtgt actactgcgc tagagagctg 300 tactaccccg gcacctggat ggccgtgatg gcctattggg gcagaggcac cctggtgaca 360 gtgtcttct 369 <210> 18 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 agctacgtgc tgacccagcc ccctagcgtg tcagtggccc ctggcaagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgataacat ccccgagtac tacgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctatagagat aacgagcggc ctagcggcat ccccgagcgg 180 ttttccggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta tttcaagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg tcaggtgttc gacgagtctt catggcactg ggtgttcggc 300 ggaggcacca agctgaccgt gctg 324 <210> 19 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 caggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaggtg 60 tcctgtaaag ctagtggcgg cacctttaga tcctacgcta ttagctgggt gcgacaggct 120 ccaggccagg gcctcgaatg gatgggcggc atcgacccta ttagcggctt cgccgactac 180 gctcagaaat ttcagggcag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctac 240 atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtgt actactgcgc tagagagctg 300 tactaccccg gcacctggat ggccgtgatg gcctattggg gcagaggcac cctggtgaca 360 gtgtcttctg ctagcactaa gggcccctcc gtgttccctc tggccccttc cagcaagtct 420 acctctggcg gcaccgctgc tctgggctgc ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg 480 acagtgtcct ggaactctgg cgccctgacc tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg 540 cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc gtggtgacag tgccttcctc cagcctgggc 600 acccagacct atatctgcaa cgtgaaccac aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg 660 gtggagccta agtcatgc 678 <210> 20 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 agctacgtgc tgacccagcc ccctagcgtg tcagtggccc ctggcaagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgataacat ccccgagtac tacgtgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctatagagat aacgagcggc ctagcggcat ccccgagcgg 180 ttttccggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta tttcaagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg tcaggtgttc gacgagtctt catggcactg ggtgttcggc 300 ggaggcacca agctgaccgt gctgggccag cctaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 360 ccccccagca gcgaggagct gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatcagcgac 420 ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480 gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540 agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 600 ggcagcaccg tggaaaagac cgtggcccca accgagtgca gc 642 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Trp Ile Asp Pro Tyr Arg Ser Glu Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Val Ser Ser Glu Pro Phe Asp Ser 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp His Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Ala Thr Trp Thr Phe Glu Gly Asp Tyr Val 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Asp Pro Tyr Arg Ser Glu 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Val Ser Ser Glu Pro Phe Asp Ser 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Asp Lys Leu Gly Asp His Tyr 1 5 <210> 31 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Asp Asp Ser 1 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Trp Thr Phe Glu Gly Asp Tyr 1 5 <210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Tyr Arg Ser Glu Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ser Ser Glu Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Thr Phe Glu Gly Asp Tyr 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 35 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Tyr Arg Ser Glu Ile Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ser Ser Glu Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 <210> 36 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp His Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Thr Phe Glu Gly Asp Tyr 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 135 140 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205 Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 37 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgaagatt 60 agctgtaaag gctcaggcta tagcttcact agctactgga tcggctgggt gcgacagatg 120 cccggcaagg gcctggaatg gatgggctgg atcgacccct atagatcaga gattaggtat 180 agccctagct ttcagggcca ggtgacaatt agcgccgata agtctattag caccgcctac 240 ctgcagtggt ctagcctgaa ggctagtgac accgctatgt actactgcgc tagagtgtct 300 agcgagccct tcgatagctg gggccagggc accctggtga cagtgtcttc a 351 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 agctacgtgc tgacccagcc ccctagcgtg tcagtggccc ctggcaagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgataagct gggcgatcac tacgcctact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac tctaagcggc ctagcggcat ccccgagcgg 180 tttagcggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta tttcaagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg cgctacctgg accttcgagg gcgactacgt gttcggcgga 300 ggcactaagc tgaccgtgct g 321 <210> 39 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgaagatt 60 agctgtaaag gctcaggcta tagcttcact agctactgga tcggctgggt gcgacagatg 120 cccggcaagg gcctggaatg gatgggctgg atcgacccct atagatcaga gattaggtat 180 agccctagct ttcagggcca ggtgacaatt agcgccgata agtctattag caccgcctac 240 ctgcagtggt ctagcctgaa ggctagtgac accgctatgt actactgcgc tagagtgtct 300 agcgagccct tcgatagctg gggccagggc accctggtga cagtgtcttc agctagcact 360 aagggcccct ccgtgttccc tctggcccct tccagcaagt ctacctctgg cggcaccgct 420 gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cctgagcctg tgacagtgtc ctggaactct 480 ggcgccctga cctccggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540 tccctgtcct ccgtggtgac agtgccttcc tccagcctgg gcacccagac ctatatctgc 600 aacgtgaacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gggtggagcc taagtcatgc 660 <210> 40 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 agctacgtgc tgacccagcc ccctagcgtg tcagtggccc ctggcaagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgataagct gggcgatcac tacgcctact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgac tctaagcggc ctagcggcat ccccgagcgg 180 tttagcggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta tttcaagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg cgctacctgg accttcgagg gcgactacgt gttcggcgga 300 ggcactaagc tgaccgtgct gggccagcct aaggctgccc ccagcgtgac cctgttcccc 360 cccagcagcg aggagctgca ggccaacaag gccaccctgg tgtgcctgat cagcgacttc 420 tacccaggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgacagca gccccgtgaa ggccggcgtg 480 gagaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaagtacg ccgccagcag ctacctgagc 540 ctgacccccg agcagtggaa gagccacagg tcctacagct gccaggtgac ccacgagggc 600 agcaccgtgg aaaagaccgt ggccccaacc gagtgcagc 639 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ser Asn Thr Ala Ala Trp Asn 1 5 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Val Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ser Val Pro Gly Gly Asp Pro Gly Leu Glu His Ala Phe Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ser Gly Asp Asn Leu Gly Thr Tyr Tyr Val Glu 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Ala Ser Phe Ala Ser Trp Ser Asp Ser Val 1 5 10 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Thr Ala 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr 1 5 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Ser Val Pro Gly Gly Asp Pro Gly Leu Glu His Ala Phe Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Asp Asn Leu Gly Thr Tyr Tyr 1 5 <210> 51 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Asp Asp Ser 1 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Phe Ala Ser Trp Ser Asp Ser 1 5 <210> 53 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Thr Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Val Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Pro Gly Gly Asp Pro Gly Leu Glu His 100 105 110 Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Thr Tyr Tyr Val 20 25 30 Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Ala Ser Trp Ser Asp Ser 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 55 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Thr Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Val Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Pro Gly Gly Asp Pro Gly Leu Glu His 100 105 110 Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 56 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Thr Tyr Tyr Val 20 25 30 Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Phe Ala Ser Trp Ser Asp Ser 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 135 140 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 180 185 190 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205 Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 57 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 caggtgcagc tgcagcagtc aggccctggc ctggtgaaac ctagtcagac cctgagcctg 60 acctgcgcta ttagcggcga tagcgtgtca tctaacaccg ccgcctggaa ctggattaga 120 cagtcaccta gtagaggcct ggaatggctg ggcgtgatct actataggtc taagtggtac 180 aacgactacg ccgtgtcagt gaagtctagg atcactatta accccgacac ctctaagaat 240 cagttcagcc tgcagctgaa tagcgtgacc cccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgct 300 agatcagtgc ctggcggcga ccccggcctg gaacacgcct ttgcctactg gggcagaggc 360 accctggtga cagtgtcttc t 381 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 agctacgtgc tgacccagcc ccctagcgtg tcagtggccc ctggcaagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgataacct gggcacctac tacgtggaat ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgat agcgatagac ctagcggcat ccccgagcgg 180 tttagcggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta ttagtagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg cgctagtttc gctagttgga gcgattcagt gttcggcgga 300 ggcactaagc tgaccgtgct g 321 <210> 59 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 caggtgcagc tgcagcagtc aggccctggc ctggtgaaac ctagtcagac cctgagcctg 60 acctgcgcta ttagcggcga tagcgtgtca tctaacaccg ccgcctggaa ctggattaga 120 cagtcaccta gtagaggcct ggaatggctg ggcgtgatct actataggtc taagtggtac 180 aacgactacg ccgtgtcagt gaagtctagg atcactatta accccgacac ctctaagaat 240 cagttcagcc tgcagctgaa tagcgtgacc cccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgct 300 agatcagtgc ctggcggcga ccccggcctg gaacacgcct ttgcctactg gggcagaggc 360 accctggtga cagtgtcttc tgctagcact aagggcccct ccgtgttccc tctggcccct 420 tccagcaagt ctacctctgg cggcaccgct gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc 480 cctgagcctg tgacagtgtc ctggaactct ggcgccctga cctccggcgt gcacaccttc 540 cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac tccctgtcct ccgtggtgac agtgccttcc 600 tccagcctgg gcacccagac ctatatctgc aacgtgaacc acaagccttc caacaccaag 660 gtggacaagc gggtggagcc taagtcatgc 690 <210> 60 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 agctacgtgc tgacccagcc ccctagcgtg tcagtggccc ctggcaagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgataacct gggcacctac tacgtggaat ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacgat agcgatagac ctagcggcat ccccgagcgg 180 tttagcggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta ttagtagagt ggaagccggc 240 gacgaggccg actactactg cgctagtttc gctagttgga gcgattcagt gttcggcgga 300 ggcactaagc tgaccgtgct gggccagcct aaggctgccc ccagcgtgac cctgttcccc 360 cccagcagcg aggagctgca ggccaacaag gccaccctgg tgtgcctgat cagcgacttc 420 tacccaggcg ccgtgaccgt ggcctggaag gccgacagca gccccgtgaa ggccggcgtg 480 gagaccacca cccccagcaa gcagagcaac aacaagtacg ccgccagcag ctacctgagc 540 ctgacccccg agcagtggaa gagccacagg tcctacagct gccaggtgac ccacgagggc 600 agcaccgtgg aaaagaccgt ggccccaacc gagtgcagc 639 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Ser Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Trp Ile Asn Pro Leu Lys Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Glu Gly Met Tyr Phe Asp Ile 1 5 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asp Lys Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Asp Thr Asn Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Gln Ser Trp Asp Leu Asp Phe Asn Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Asn Pro Leu Lys Gly Asn 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Glu Gly Met Tyr Phe Asp Ile 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Asp Ser Ile Gly Asp Lys Tyr 1 5 <210> 71 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Asp Thr Asn 1 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Trp Asp Leu Asp Phe Asn Thr Tyr 1 5 <210> 73 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Leu Lys Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Met Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asp Lys Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Leu Asp Phe Asn Thr 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 75 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Leu Lys Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Met Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 <210> 76 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Ile Gly Asp Lys Tyr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Leu Asp Phe Asn Thr 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 77 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 caggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggcgctag tgtgaaggtg 60 tcctgtaaag ctagtggcta caccttcact agctactaca tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg attaaccccc tgaagggcaa cactaactac 180 gcccagaaat tccagggccg agtgactatg actagggaca ctagcattag caccgcctac 240 atggaactgt ctaggctgag atcagaggac accgccgtgt actactgcgc tagagaaggc 300 atgtacttcg acatctgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtcttct 348 <210> 78 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 agctacgagc tgactcagcc cctgagcgtg tcagtggccc tgggacagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgactctat cggcgacaaa tacgtgtact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacact aacaagcggc ctagcggcat ccccgagcgg 180 tttagcggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta ttagtagggc tcaggccggc 240 gacgaggccg actactactg tcagtcatgg gacctggact tcaacaccta cgtgttcggc 300 ggaggcacta agctgaccgt gctg 324 <210> 79 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 79 caggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggcgctag tgtgaaggtg 60 tcctgtaaag ctagtggcta caccttcact agctactaca tgagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg attaaccccc tgaagggcaa cactaactac 180 gcccagaaat tccagggccg agtgactatg actagggaca ctagcattag caccgcctac 240 atggaactgt ctaggctgag atcagaggac accgccgtgt actactgcgc tagagaaggc 300 atgtacttcg acatctgggg ccagggcacc ctggtgacag tgtcttctgc tagcactaag 360 ggcccctccg tgttccctct ggccccttcc agcaagtcta cctctggcgg caccgctgct 420 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttccct gagcctgtga cagtgtcctg gaactctggc 480 gccctgacct ccggcgtgca caccttccct gccgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 540 ctgtcctccg tggtgacagt gccttcctcc agcctgggca cccagaccta tatctgcaac 600 gtgaaccaca agccttccaa caccaaggtg gacaagcggg tggagcctaa gtcatgc 657 <210> 80 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 80 agctacgagc tgactcagcc cctgagcgtg tcagtggccc tgggacagac cgctagaatc 60 acctgtagcg gcgactctat cggcgacaaa tacgtgtact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcccccg tgctggtgat ctacgacact aacaagcggc ctagcggcat ccccgagcgg 180 tttagcggct ctaatagcgg caacaccgct accctgacta ttagtagggc tcaggccggc 240 gacgaggccg actactactg tcagtcatgg gacctggact tcaacaccta cgtgttcggc 300 ggaggcacta agctgaccgt gctgggccag cctaaggctg cccccagcgt gaccctgttc 360 ccccccagca gcgaggagct gcaggccaac aaggccaccc tggtgtgcct gatcagcgac 420 ttctacccag gcgccgtgac cgtggcctgg aaggccgaca gcagccccgt gaaggccggc 480 gtggagacca ccacccccag caagcagagc aacaacaagt acgccgccag cagctacctg 540 agcctgaccc ccgagcagtg gaagagccac aggtcctaca gctgccaggt gacccacgag 600 ggcagcaccg tggaaaagac cgtggcccca accgagtgca gc 642 <210> 81 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 82 <211> 165 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 82 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ser Glu Ser 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Val 65 70 75 80 Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Phe Glu Pro Leu Gln Leu His Met Asp 85 90 95 Lys Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Ile Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Glu Ala Ile Ser Leu Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 115 120 125 Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr 130 135 140 Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys 145 150 155 160 Arg Arg Gly Asp Arg 165 <210> 83 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Pro Arg Leu Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ser Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Pro Glu Thr Leu Gln Leu His Ile Asp 85 90 95 Lys Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Val Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Leu Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Leu Thr Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ala Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val 145 150 155 160 Cys Arg Arg Gly Asp Arg 165 <210> 84 <211> 166 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 84 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly 20 25 30 Pro Arg Leu Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Lys Val Glu Glu Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ser Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu 65 70 75 80 Gln Ala Asn Ser Ser Gln Pro Pro Glu Ser Leu Gln Leu His Ile Asp 85 90 95 Lys Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Val Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Leu Met Ser Pro Pro Asp Ala Thr Gln Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Leu Thr Ala Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Arg Gly Asp Arg 165 <210> 85 <211> 199 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 85 Lys Leu Ala Thr Met Gly Val Arg Gly Arg Leu Ala Leu Leu Pro Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Leu Leu Val Leu Ala Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly 20 25 30 Ala Pro Ala Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile 35 40 45 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly 50 55 60 Cys Ser Leu Gly Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 65 70 75 80 His His Trp Lys Lys Ser Glu Ala Gly Arg His Ala Val Glu Val Trp 85 90 95 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Met Leu Arg Ser Gln Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Ser Ser Gln Leu Pro Glu Thr Leu Gln Val His Val Asp 115 120 125 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu 130 135 140 Gly Val Gln Lys Glu Ala Val Ser Pro Pro Glu Ala Ala Ser Ser Ala 145 150 155 160 Ala Pro Leu Arg Thr Val Ala Ala Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg 165 170 175 Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu 180 185 190 Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg 195 <210> 86 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr 20 <210> 87 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn 20 25 <210> 88 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu 1 5 10 15 Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg 20 25 <210> 89 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro 1 5 10 15 Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu 20 25 <210> 90 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 1 5 10 15 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser 20 25 30 Pro Pro Asp 35 <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala 1 5 10 15 Leu <210> 92 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 92 His His His His His His 1 5 <210> 93 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly 20 25 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met 1 5 10 15 <210> 95 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser 20 25 30 <210> 96 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys 1 5 10 15 Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg 20 25 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 1 5 10

Claims (20)

1. 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제와 조합하여 투여되는,
   a) 각각 서열 1, 2, 및 3에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 4, 5, 및 6에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
   b) 각각 서열 21, 22, 및 23에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 24, 25, 및 26에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
   c) 각각 서열 41, 42, 및 43에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 44, 45, 및 46에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; 또는
   d) 각각 서열 61, 62, 및 63에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 64, 65, 및 66에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3
   을 포함하는 에리트로포이에틴(EPO)에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, 망막 혈관 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 1, 2, 및 3에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 4, 5, 및 6에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 각각 서열 13 및 14와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
3. 제2항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 15 및 16에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인 제약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 21, 22, 및 23에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 24, 25, 및 26에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 각각 서열 33 및 34와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
5. 제4항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 35 및 36에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인 제약 조성물.
6. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 41, 42, 및 43에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 44, 45, 및 46에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 각각 서열 53 및 54와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
7. 제6항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 55 및 56에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인 제약 조성물.
8. 제1항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 61, 62, 및 63에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 64, 65, 및 66에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, 각각 서열 73 및 74와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 제약 조성물.
9. 제8항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 각각 서열 75 및 76에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인 제약 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 Fab인 제약 조성물.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 바이러스 벡터에서 발현되는 것인 제약 조성물.
12. 제11항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인 제약 조성물.
13. 제12항에 있어서, AAV 벡터가 AAV2인 제약 조성물.
14. 제12항에 있어서, AAV 벡터가 대상체에 망막하 투여되는 것인 제약 조성물.
15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 혈관 질환이 당뇨병성 황반 부종인 제약 조성물.
16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 망막 혈관 질환이 증식성 당뇨병성 망막병증, 황반 부종, 연령-관련 황반 변성 또는 망막 정맥 폐쇄인 제약 조성물.
17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체, 항-VEGF 수용체 항체 또는 VEGF 억제제인 제약 조성물.
18. 제17항에 있어서, 항-VEGF 항체가 라니비주맙인 제약 조성물.
19. 제17항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 제약 조성물.
20. 제17항에 있어서, VEGF 억제제가 아플리베르셉트인 제약 조성물.
    

Images