CN102282174B - 抗人epo受体的抗体 - Google Patents
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Abstract
以特异性结合pY461，pY430或p465为特征的结合人EPO-R的抗体用于测定活化的EPO受体。
Description
发明背景
人红细胞生成素(EPO)是涉及祖红细胞的增殖和分化的166-aa糖蛋白。这些细胞反应由人EPO受体(EPO-R)——508-aa糖蛋白——介导。人EPO受体(EPO-R)是508个氨基酸长度的蛋白质(Swiss Prot P19235)，其含有单个跨膜结构域且已被分类为I型细胞因子受体的生长激素亚家族成员。EPO-R在例如Winkelmann，J.C.等人，Blood 76(1990)24-30和Jones，S.S.等人，Blood 76(1990)31-35)中有描述。EPO-R的活化通过二聚化发生(Matthews，D.J.，PNAS 93(1996)9471-9476)。EPO-R包含8个细胞质酪氨酸位点，其在用EPO刺激后被磷酸化(Li，K.等人，J.Biol.Chem.278(2003)40702-40709；Wu，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)1806-1810)，导致“活化的EPO-R”。
抗EPO-R抗体记载于例如Andrea，A.D.，Blood 82(1993)46-52；Elliott，S.，Blood 107(2006)1892-1895；Kirkeby，A.，J.Nerosci.164(2007)50-58；Miura，O.，Arch.Biochem.306(1993)200-208；和EP 1 146 056，EP 1 327 681，EP 0 773 962，EP 0 776 370，US 2002/0031806，US 2003/0215444，US 2004/0058393，US 2004/0071694，US 2004/0175379，US 2005/0227289，US 2005/0244409，US 2006/0018902，US 6,998,124，US 7,053,184，US 7,081,523，WO 1995/005469，WO 1996/003438，WO 2000/061637，WO 2004/035603A2，WO 2005/100403A2。然而在目前已知的技术水平中，针对EPO-R的已知抗体不能够区分非活化的和活化的EPO-R(见Jelkmann，W.等人，Crit.Rev.Onc/Hematol.67(2008)39-61；Li，K.等人，J.Biol.Chem.278(2003)40702-40709，和Wu，H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997) 1806-1810）。
发明概述
本发明包含特异性结合活化的人EPO受体和区分非活化的和活化的EPO-R的抗体，其允许对EPO-R活化的特定分析，尤其是在来自人组织的细胞和活组织（biopsy）中。
本发明包含抗体，其特征在于特异性结合在第430位（下划线）包含磷酸酪氨酰残基的TPPHLKYLYLVVSD(SEQ ID NO:25)，在第461位（下划线）包含磷酸酪氨酰残基的GLSDGPYSNPYENSLIP(SEQ ID NO:26)，或在第465位（下划线）包含磷酸酪氨酰残基的GLSDGPYSNPYENSLIP(SEQ ID NO:26)人EPO受体片段。
编号涉及不含信号肽的UniProtKB/Swiss-Prot P19235的EPO受体氨基酸序列。
根据本发明的抗体不结合在第430位没有磷酸酪氨酰残基的TPPHLKYLYLVVSD(SEQ ID NO:25)，在第461位没有磷酸酪氨酰残基的GLSDGPYSNPYENSLIP(SEQ ID NO:26)，或在第465位没有磷酸酪氨酰残基的GLSDGPYSNPYENSLIP(SEQ ID NO:26)EPO受体片段。
根据本发明的抗体在UT7细胞裂解物中特异性结合磷酸化的（活化的）EPO受体，所述细胞以100.000至500.000受体/细胞（EPO-R表达细胞）的量表达EPO-R并用500pM EPO处理以活化。根据本发明的抗体在表达EPO受体但不用EPO处理的UT7细胞裂解物中不结合EPO受体。可通过蛋白质印迹测量这些结合。
优选地本发明包含与人EPO-R结合的抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:1,9或17的CDR3区作为重链可变结构域CDR3区。
优选地所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO:1的CDR3区、SEQ ID NO:2的CDR2区和SEQ ID NO:3的CDR1区，或SEQ ID NO:9的CDR3区、SEQ ID NO:10的CDR2区和SEQ ID NO:11的CDR1区，或SEQ ID NO:17的CDR3区，SEQ ID NO:18的CDR2区和SEQ ID NO:19的CDR1区。
优选的所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3区、SEQ ID NO：2的CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区，和轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3区，SEQ ID NO：5的CDR2区和SEQ ID NO：6的CDR1区。
优选的所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：9的CDR3区、SEQ ID NO：10的CDR2区和SEQ ID NO：11的CDR1区，和轻链可变结构域包含SEQ ID NO：12的CDR3区，SEQ ID NO：13的CDR2区和SEQ ID NO：14的CDR1区。
优选的所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：17的CDR3区，SEQ ID NO：18的CDR2区和SEQ ID NO：19的CDR1区和轻链可变结构域包含SEQ ID NO：20的CDR3区，SEQ ID NO：21的CDR2区和SEQ IDNO：22的CDR1区。
优选地所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：7，15或23。
优选地所述抗体的特征在于轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8，16或24。
优选地所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：7和轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8。
优选地所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：15和轻链可变结构域包含SEQ ID NO：16。
优选地所述抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：23和轻链可变结构域包含SEQ ID NO：24。
优选地根据本发明的抗体的特征在于以至少10-8M-1至10-12M-1的结合亲和力结合EPO-R。
本发明的另一个实施方案是编码根据本发明的抗体的重链和轻链的核酸。
人和其他恒定链是目前技术水平中熟知的并由例如Kabat(见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)描 述。抗体进一步优选地为小鼠来源并包含根据Kabat的小鼠抗体的抗体可变序列框(见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。
根据本发明的抗体优选为小鼠、兔或人来源的。在人抗体中优选IgG1同种型。
本发明还提供了包含本发明的核酸、能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸的表达载体，和用于重组生产这样的抗体的包含这些载体的宿主细胞。
本发明还包含含有根据本发明的载体的原核或真核宿主细胞。
本发明还包含制备根据本发明的重组人或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明的核酸，和从所述细胞或细胞培养上清中回收所述抗体。本发明还包含可通过这样的重组方法得到的抗体。
本发明还包含根据本发明的抗体在测定/检测具有/表达活化的EPO受体的哺乳动物细胞中的用途。
优选地使用根据本发明的抗体测定人组织样品的活组织裂解物中的活化的EPO受体。优选地通过蛋白质印迹进行这样的检测。
发明详述
术语“抗体”包含抗体结构的多种形式，包括但不限于整个抗体和抗体片段。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的示例包括双抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。在例如Houston，J.S.，Methods Enzymol.203(1991)46-88中描述了scFv抗体。此外，抗体片段包含具有VH结构域(即能够与VL结构域共同组装)或结合EPO-R的VL结构域(即能够与VH结构域共同组装为功能性抗原结合位点)的特征的单链多肽，由此提供具有特异性结合人EPO-R特性的抗体。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其框架和/或“互补决定区”(CDR)被修饰以包含与亲本免疫球蛋白的CDR相比不同物种的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，将小鼠CDR移植到人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。见例如Riechmann，L.等人，Nature 332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。
术语“包含SEQ ID NO：1的重链CDR3区”表示抗体包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列作为其重链CDR3区的序列。用相同的方式表示抗体的其他5个CDR区。
如此处使用的术语“结合活化的EPO-R”指抗体与人的活化EPO-R在通过蛋白质印迹测量的生化结合测定中的结合。如果抗体在1μg/ml抗体浓度下引起400或更高的S/N(信号/噪音)比，则认为结合。如此处使用的术语“不结合EPO-R”指抗体与人EPO-R在通过蛋白质印迹测量的生化结合测定中的结合。如果抗体在1μg/ml抗体浓度下引起低于400的S/N(信号/噪音)比，则认为不结合。在蛋白质印迹中检测不到根据本发明的抗体与非活化EPO R的结合，因此S/N比甚至低于10和优选低于约1或更低。
如此处使用的术语“EPO与EPO受体的结合”指EPO与人的活化EPO-R在通过蛋白质印迹测量的生化结合测定中的结合。如果EPO在1μg/ml的EPO浓度下引起不超过10的S/N(信号/噪音)比，则认为不结合。
如此处使用的术语“pY430”指对应成熟人红细胞生成素受体的第424-437位残基的在第430位包含磷酸酪氨酰残基的17个氨基酸的合成肽(TPPHLKYLYLVVSD，SEQ ID NO：25)。如此处使用的术语“pY461”指对应成熟人红细胞生成素受体的第455-471位残基的在第461位包含磷酸酪氨酰残基的17个氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO：26)。如此处使用的术语“pY465”指对应成熟人红细胞生成素受体的第455-471位残基的在第465位包含磷酸酪氨酰残基的17个氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO：26)。
根据本发明的抗体的特征在于在0.1μg/ml的抗体浓度下在ELISA中以10或更高的S/N比特异性结合pY430，pY461或pY465。
如此处使用的术语“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)，重链的可变结构域(VH))表示轻链和重链结构域中的每对结构域，其直接参与抗体与抗原的结合。可变轻链和重链结构域具有相同的大体结构，每个结构域包含4个序列高度保守的框架(FR)区，FR区通过3个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采用β-折叠构象，CDR可能形成连接β-折叠结构的环。在每条链中的CDR通过框架区维持其三维结构并与来自其他链的CDR共同形成抗原结合位点。抗体的重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，因此提供了本发明的另一个目的。
如此处使用的术语“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除了如此处定义的高变区残基以外的那些可变结构域。因此，抗体的轻链和重链可变区从N-到C-端包含FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4结构域。特别地，重链的CD3是对抗原结合贡献最大并定义抗体性能的区域。CDR和FR区根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义确定，和/或为来自“高变环”的那些残基。
如此处使用的术语“核酸”或“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可为单链或双链，但优选双链DNA。
在本申请中使用的术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包含丙氨酸(三字母编码：ala单字母编码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
当将核酸置于与另一种核酸的功能性关系中时，核酸为“有效连接的”。 例如，如果前序列或分泌前导DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽DNA是有效连接的；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与编码序列是有效连接的；或如果核糖体结合位点处于有助于翻译的位置，则其与编码序列是有效连接的。通常，“有效连接”指连接的DNA序列是共线的，在分泌前导的情况下，连接的DNA序列是连续的且依读框的。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点的连接反应完成连接。如果这样的位点不存在，则依照传统做法是使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如此处使用的，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用并且所有这些名称包括子代。因此，措辞“转化体”和“转化细胞”包括原代对象细胞和来源于其的培养物，不考虑转移次数。也应当理解，所有后代在DNA内容中可能不完全相同，由于无意或无意突变。也包括与筛选的原始转化细胞具有相同功能或生物学活性的突变后代。
有用的人重链恒定区示例包含SEQ ID NO：23的氨基酸。有用的人轻链恒定区示例包含SEQ ID NO：24的κ-轻链恒定区的氨基酸序列。
本发明包含检测或测定人细胞组织和活组织中的活化EPO-R的方法。
本发明包含根据本发明的抗体在诊断人细胞组织和活组织中的活化EPO-R的用途。
本发明包含根据本发明的抗体在准备用于检测或测定人细胞组织和活组织中的活化EPO-R的诊断测定中的用途。
根据本发明的抗体另外包括这样的抗体，其具有“保守序列修饰”(变体抗体)，不影响或改变根据本发明的抗体的上述特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。可通过本领域已知的标准技术例如定点突变和PCR介导的突变引入修饰。保守氨基酸取代包括这样的氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有类似侧链的氨基酸残基。本领域已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，无电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非 极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在人抗EPO-R抗体中的预测的非必需氨基酸残基可优选的替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。因此此处的“变体”抗EPO-R抗体指这样的分子，其氨基酸序列与“亲本”抗EPO-R抗体的氨基酸序列在亲本抗体的一个或多个可变区具有多达10个，优选从约2至约5个添加、缺失和/或取代的差异。可通过基于Riechmann，L.等人，Nature 332(1988)323-327和Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033描述的分子建模突变进行氨基酸取代。
优选地通过重组方法制备根据本发明的抗体。这些方法在目前的技术水平中是广泛已知的，包含在原核和真核细胞中的蛋白质表达和之后的抗体多肽的分离以及通常纯化至可药用的纯度。用于蛋白质表达，将编码轻链和重链或其片段的核酸通过标准方法***表达载体。在合适的原核或真核宿主细胞例如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞中(从上清中或在细胞裂解以后)回收抗体。
抗体的重组制备在目前的技术水平中是熟知的并在例如Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中描述。
抗体可在整个细胞、细胞裂解物中或以部分纯化的或基本纯化的形式存在。通过标准技术包括碱/SDS处理、CsCl梯度离心(banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术进行纯化以去除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。见Ausubel，F.，等人，ed.Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
例如Barnes，L.M.，等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述了在NS0细胞中的表达。例如Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述了瞬时表达。Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；Norderhaug，L.，等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述了可变区的克隆。Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.，in Cytotechnology 30(1999)71-83和Schlaeger，E.-J.，inJ.Immunol.Methods 194(1996)191-199描述了优选的瞬时表达***(HEK 293)。
通过传统免疫球蛋白纯化程序例如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当地分离单克隆抗体。使用传统程序可容易的分离和测序编码单克隆抗体的DNA和RNA。杂交瘤细胞可作为这些DNA和RNA的来源。一旦被分离，DNA可被***表达载体，然后将其转染进原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞例如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞，以获得重组单克隆抗体在宿主细胞中的合成。
通过引入合适的核苷酸改变至抗体编码DNA或通过肽合成产生人EPO-R抗体的氨基酸序列变体。可进行这些修饰，然而仅在非常有限的范围内，例如如上述的那些。例如，修饰不改变上述抗体的特征例如IgG同种型和表位结合，但可改进重组生产的产量、蛋白质的稳定性或易化纯化。
也可取代与维持抗EPO-R抗体的适当构象无关的任意半胱氨酸残基，通常将其取代为丝氨酸以改进分子的氧化稳定性和避免异常交联。相反地，可在抗体中加入半胱氨酸键以改进其稳定性(特别是当抗体为抗体片段例如Fc片段时)。
通过本领域已知的多种方法制备编码抗EPO-R抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)分离或通过以前制备的人源化抗EPO-R抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)突变、PCR突变和盒式突变制备。
根据本发明的重链和轻链可变结构域与启动子、翻译起点、恒定区、3’ 非翻译区、多聚腺苷酸化和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可组合为单个载体，共转染、连续转染或分别转染至宿主细胞，然后其融合以形成表达2种链的单个宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了诊断组合物，例如用于在人细胞组织和活组织中的活化EPO-R的测定。
序列描述
SEQ ID NO：1重链CDR3，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：2重链CDR2，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：3重链CDR1，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：4轻链CDR3，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：5轻链CDR2，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：6轻链CDR1，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：7重链可变区，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：8轻链可变区，Mab C1.16.7.5
SEQ ID NO：9重链CDR3，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：10重链CDR2，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：11重链CDR1，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：12轻链CDR3，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：13轻链CDR2，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：14轻链CDR1，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：15重链可变区，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：16轻链可变区，Mab C1.8.7.16
SEQ ID NO：17重链CDR3，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：18重链CDR2，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：19重链CDR1，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：20轻链CDR3，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：21轻链CDR2，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：22轻链CDR1，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：23重链可变区，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：24轻链可变区，Mab C1.24.11.31
SEQ ID NO：25合成肽
SEQ ID NO：26合成肽
附图简述
图1：人EPOR在UT-7_EPOR细胞中的时间依赖性磷酸化。使用针对磷酸化人EPOR的不同单克隆抗体染色的UT7-EPOR细胞裂解物的蛋白质印迹分析。(a)pY430(C1.16.7.5)，(b)pY461(C1.8.7.16)，(c)pY465(C1.24.11.31)。仅在用EPO刺激细胞后，所有单克隆抗体特异性检测EPOR，未刺激的细胞(-)不被抗体标记。使用GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)作为上样对照。
实施例1
磷酸-特异性EPOR单克隆抗体的生成
pY430(C1.16.7.5)：使用对应成熟人红细胞生成素受体的第424-437位残基的在第430位包含磷酸-酪氨酰残基的17个氨基酸的合成肽(TPPHLKYLYLVVSD，SEQ ID NO：25)作为免疫原。
pY461(C1.8.7.16)：使用对应成熟人红细胞生成素受体的第455-471位残基的在第461位包含磷酸-酪氨酰残基的17个氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO：26)作为免疫原。
pY465(C1.24.11.31)：使用对应成熟人红细胞生成素受体的第455-471位残基的在第465位包含磷酸-酪氨酰残基的17个氨基酸的合成肽(GLSDGPYSNPYENSLIP，SEQ ID NO：26)作为免疫原。
用于免疫，将肽通过C端半胱氨酸与KLH偶联。用免疫原每4周免疫Balb/c小鼠1次，免疫3次，然后在融合前4天通过静脉注射加强免疫，收获脾细胞并与Ag8骨髓瘤细胞融合。使用肽包被的ELISA微滴定板根据 标准程序通过对肽的磷酸-对非-磷酸(否则与磷酸肽相同)形式的差别检验完成磷酸特异性抗体的筛选。选择抗体克隆，因为其在用EPO刺激的细胞裂解物的蛋白质印迹中检测到一条对应EPOR的特异条带(实施例2)。
SDS-PAGE和蛋白质印迹：
根据标准程序和Invitrogen的 凝胶***进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。将对应5.104-105细胞的裂解物上样至 
Novex 4-12％Bis-Tris凝胶的各道中。然后将蛋白质转移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜上并与抗体和抗GAPDH抗体(Abcam m9484，Abcam plc UK)孵育，室温2小时或4℃过夜。清洗后，将膜与抗小鼠IgG-POD缀合物孵育并用ECL试剂(Lumi-LightPLUS蛋白质印迹底物，Roche Applied Science#2015218)显色。
根据仅特异性结合活化EPO受体且不结合非活化EPO受体选择C1.24.11.31，C1.16.7.5和C1.8.7.16抗体(图1)。
实施例2
UT-7细胞的活化
UT-7细胞系是人因子-依赖性红白血病细胞系(人骨髓急性髓细胞白血病细胞系DSMZ：ACC 137)，需要EPO用于长期生长。在另外包含L-谷氨酰胺(2mM)，非必需氨基酸(1x)和丙酮酸钠(1mM)(饥饿培养基)和添加10％胎牛血清和10U/ml GM-CSF的RPMI培养基中维持UT-7细胞。在与未转导细胞(25U/ml GM-CSF而不是10U/ml)相同的培养基中维持转导细胞(UT7/EPOR)，另外加入0.4mg/ml博来霉素(zeocine)。在每次刺激前，将细胞在添加L-谷氨酰胺(2mM)，非必需氨基酸(1x)，丙酮酸钠(1mM)和0.1％胎牛血清的RPMI培养基中孵育过夜使其饥饿。
转导：
用编码hEPOR和pVSV-G的逆转录病毒表达载体(编码弹状病毒水疱性口炎病毒G糖蛋白的表达载体)瞬间转染的GP2-293(Clontech Laboratories，Inc)细胞上清转导UT-7细胞。转导后2天将培养基替换为 新鲜补充的包含0.4mg/ml博来霉素和25U/ml GM-CSF的RPMI。在选择后得到在其表面稳定表达EPOR的UT-7细胞的细胞系。
刺激：
血清饥饿的细胞用在饥饿培养基(补充0.1％胎牛血清)中的500pM红细胞生成素于指示的时候在37℃刺激1、3和5分钟。刺激后离心细胞，丢弃培养基并将沉淀孵育在冰冷的裂解缓冲液[Tris 20mM(pH7.4)，NaCl137mM，甘油10％， 
P-401％，蛋白酶抑制剂1x(Pierce，#78410)，磷酸酶抑制剂1x(Pierce#78420)]中，4℃30分钟，然后在4℃13000rpm离心10分钟。在还原剂存在下在样品缓冲液( 
Invitrogen)中煮沸裂解物上清或者直接用于SDS-PAGE。
根据如实施例1中描述的标准程序在用对应的生物素化肽包被的微滴定板上通过ELISA检测Mab的特异性结合。在1分钟以内已经可显示人EPOR的明显活化，而未刺激的细胞没有显示任何可检测的基础水平的活化。
实施例3
用于Mab与EPO活化的UT-7/EPOR细胞的结合的蛋白质印迹测定
如上述刺激UT7/EPOR细胞并通过蛋白质印迹分析。在蛋白质印迹中，Mab在用0.5nM EPO刺激1-5分钟的细胞中识别一条MW 66kD的对应EPOR的条带(图1)。在1分钟以内已经可显示人EPOR的明显活化，而未刺激的细胞没有显示任何可检测的基础水平的活化(图1)。使用GAPDH作为上样对照。因此，这些抗体特异性分析了ESA(红细胞生成素刺激剂)对EPOR的活化。
Claims (15)
1.结合人EPO受体的抗体，其特征在于特异性结合在如下划线所示的第465位包含磷酸酪氨酰残基的GLSDGPYSNPYENSLIP(SEQ ID NO:26)EPO受体片段，其中所述抗体特异性结合活化的人EPO受体，并区分非活化和活化的EPO-R。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于包含SEQ ID NO:17的CDR3区作为重链可变结构域CDR3区。
3.根据权利要求1的抗体，其特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO:17的CDR3区，SEQ ID NO:18的CDR2区和SEQ ID NO:19的CDR1区。
4.根据权利要求1或2的抗体，其特征在于重链可变结构域包含SEQID NO:23和轻链可变结构域包含SEQ ID NO:24。
5.编码根据权利要求3的抗体的重链的核酸，所述重链的特征在于包含SEQ ID NO:17的CDR3区、SEQ ID NO:18的CDR2区和SEQ ID NO:19的CDR1区。
6.编码根据权利要求4的抗体的重链的核酸，所述重链的特征在于包含SEQ ID NO:19作为可变结构域。
7.制备包含根据权利要求1至4的任一项的抗体的诊断试剂盒的方法。
8.表达载体，其特征在于包含根据权利要求5或6的核酸。
9.原核或真核宿主细胞，其特征在于包含根据权利要求8的载体。
10.制备根据权利要求3或4的重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据权利要求5或6的核酸，并从所述细胞或细胞培养上清中回收所述抗体。
11.根据权利要求1至4的任一项的抗体在制备用于测定人细胞组织和活组织检查样品中的活化EPO受体的诊断试剂盒中的用途。
12.根据权利要求11的用途，其特征在于样品为人组织裂解物。
13.根据权利要求12的用途，其特征在于通过蛋白质印迹或ELISA进行测定。
14.根据权利要求1至3的任一项的抗体，用于测定人细胞组织和活组织检查样品中的活化EPO受体。
15.根据权利要求4的抗体，用于测定人细胞组织和活组织检查样品中的活化EPO受体。
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