TW201400132A - 改善血腦屏障運送之安全性之方法 - Google Patents

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Jessica Couch
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Abstract

本發明係關於用於改善血腦屏障受體介導之血腦屏障運送之安全性之組合物及方法。

Description

改善血腦屏障運送之安全性之方法
本發明係關於用於改善血腦屏障受體介導之血腦屏障運送之安全性之組合物及方法。
大分子藥物之腦穿透嚴重受限於很大程度上不透性之血腦屏障(BBB)。在克服此障礙之許多策略中尤其係利用於腦毛細管內皮處所表現之內生性受體之穿胞作用運輸途徑。已設計針對該等受體之重組蛋白(單株抗體)以使得大分子至腦之受體介導之遞送成為可能。已提出使腦攝取最大化同時使返回至血液之逆向穿胞作用降至最低之策略及亦在治療投藥後使累積程度最大化之策略，其中發現相對於對BBB受體具有高親和力之典型抗體，對該等受體具有較低親和力之抗體提供實質上增加相關治療部分/分子之BBB運送及CNS滯留之潛能(Atwal等人，Sci.Transl.Med. 3,84ra43(2011)；Yu等人，Sci.Transl.Med.2011年5月25日：第3卷，第84期，第84ra44頁)。然而，尚未徹底探究該等抗體及偶聯物之投與安全性。
單株抗體具有治療神經性或中樞神經系統(CNS)疾病之巨大治療潛能，但其至腦中之通路受限於血腦屏障(BBB)。過去研究已顯示極小百分比(大約0.1%)之於血流中循環之IgG跨越BBB進入CNS中 (Felgenhauer,Klin.Wschr.52：1158-1164(1974))，其中該抗體之CNS濃度可足以容許穩健效應。先前發現，可藉由利用BBB受體(即轉鐵蛋白受體、胰島素受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白8、葡萄糖轉運體1(Glut1)及諸如此類)來提高分佈至CNS中之抗體之百分比(例如參見WO9502421)。例如，可使抗BBB受體抗體具有多特異性以靶向CNS中之一或多種期望抗原，或可使一或多種異源分子與抗BBB受體抗體偶合；在任一情形下，抗BBB受體抗體可有助於將治療分子跨越BBB遞送至CNS中。
然而，利用傳統特異性高親和力抗體靶向BBB受體通常導致BBB運送之增加有限。申請人隨後發現，在所研究之抗BBB抗體中，抗體吸收至CNS中及分佈於CNS中之量級與其對BBB受體之結合親和力呈負相關。例如，相對於較高親和力抗TfR抗體，以治療劑量投藥之對轉鐵蛋白受體(TfR)具有低親和力之抗體極大改善抗TfR抗體之BBB運送及CNS滯留，且使得可更容易達到CNS中之治療濃度(Atwal等人，Sci.Transl.Med. 3,84ra43(2011))。該BBB運送之證據係使用結合TfR及類澱粉前體蛋白(APP)裂解酶β-分泌酶(BACE1)二者之雙特異性抗體來達成。與單獨單特異性抗BACE1相比，單一全身劑量之使用本發明方法改造之雙特異性抗TfR/BACE1抗體不僅導致腦中之大量抗體吸收，且亦顯著減少腦Aβ1-40之含量，此表明BBB穿透率影響抗BACE1之效能。(Atwal等人，Sci.Transl.Med. 3,84ra43(2011)；Yu等人，Sci.Transl.Med. 3,84ra44(2011))。
彼等數據及實驗強調若干支持使用較低親和力抗體方法增加至CNS中之抗體吸收之成因機制。第一，高親和力抗BBB受體(BBB-R)抗體(例如抗TfRA)藉由使腦脈管系統中之BBB-R快速飽和來限制腦吸收，從而減少吸收至腦中之總抗體量且亦限制其至脈管系統之分佈。顯著地，降低BBB-R之親和力改善腦吸收及分佈，其中在自脈管系統 至CNS內分佈之神經元及相關神經纖維網之定位中觀測到穩健位移。第二，提出抗體對BBB-R之較低親和力損害抗體自BBB之CNS側經由BBB-R返回至該膜之血管側之能力，此乃因抗體對BBB-R之整體親和力較低，且BBB之CNS側之抗體局部濃度因抗體迅速擴散至CNS隔室中而未飽和。第三，在活體內，且如針對TfR系統所觀測到，對BBB-R具有較少親和力之抗體並非如對BBB-R具有較大親和力之彼等一樣有效地自該系統清除，且從而相比於其較高親和力對應物保持在更高循環濃度下。此係有利的，此乃因較低親和力抗體之循環抗體含量在治療含量下持續比較高親和力抗體長之時間，此從而改善抗體在腦中之吸收達更長時間。此外，血漿及腦暴露之此改善可減少在診所之投藥頻率，此將具有患者依從性及便宜性以及減小抗體及/或與其偶合之治療化合物之任何潛在副效應或脫離標靶效應的潛在益處。
上文所引用之工作中所闡述之低親和力BBB-R抗體係經選擇/改造以避免干擾轉鐵蛋白與TfR之間之天然結合，且從而避免潛在的鐵運送相關副效應。然而，在小鼠中投與某些該等抗體後，觀測到一些顯著副效應。該小鼠顯示網狀紅血球群之穩健耗竭之初級反應並伴隨迅速發作急性臨床症狀，如實例中所闡述。使用用抗人類TfR抗體處理之人類紅血球母細胞系及原代骨髓細胞之其他活體外研究證明在人類細胞系統中亦可觀測到TfR陽性類紅血球之穩健耗竭(例如參見實例7)。雖然該小鼠及時地自急性臨床症狀及降低之網狀紅血球含量恢復，但能夠安全地用作治療分子之抗TfR抗體顯然需要避免或減輕這種對網狀紅血球之影響。
因此，本發明提供組合物及方法，其極大減少或消除網狀紅血球群在抗TfR投與後之不期望減少、同時仍使由以治療濃度投與之低親和力抗TfR抗體提供之增強之BBB運送、增加之CNS分佈及CNS滯留成為可能。本文所闡述之結果顯示，對抗TfR投與之初級反應(穩健 網狀紅血球耗竭及急性臨床癥兆)在很大程度上係由抗體之抗體依賴性之細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性來驅動，而其餘網狀紅血球耗竭效應係藉由補體途徑來介導。本文中提供若干減輕抗TfR抗體對主要及殘餘網狀紅血球耗竭所觀測到效應之一般方法，且該等方法可單獨或組合使用。
在一方法中，減少或消除抗BBB-R抗體之效應子功能，以減少或消除ADCC活性。在另一方法中，進一步減小抗BBB-R抗體對BBB-R之親和力，以使得抗體與網狀紅血球群之相互作用對彼群體傷害較小。第三方法係關於減少血漿中所存在之抗BBB-R抗體之量，以減少網狀紅血球群對潛在有害濃度之抗體之暴露。第四方法力求保護、穩定及/或補充網狀紅血球群，以使得避免、減小或減輕由投與抗BBB-R抗體導致之網狀紅血球群之任何潛在耗竭。
本文中所闡述之效應子功能減少或消除可藉由以下來實現：(i)減少或消除抗體之野生型哺乳動物糖基化(例如，藉由在不會發生該糖基化之環境中產生抗體，藉由使一或多種碳水化合物附接點突變以使得抗體不會被糖基化，或藉由在抗體已經糖基化後以化學方式或以酶促方式自該抗體去除一或多種碳水化合物)；(ii)減少或消除抗BBB-R抗體之Fc受體結合能力(例如，藉由Fc區之突變，藉由Fc區內之缺失或Fc區之消除)；或(iii)利用已知具有最小效應子功能或無效應子功能之抗體同型(即，包括但不限於IgG4)。
本文中所闡述之降低抗體補體激活可藉由以下來實現：減少或消除抗BBB-R抗體之C1q結合能力(例如，藉由Fc區之突變、其內之缺失或其之消除，或藉由修飾抗BBB-R抗體之非Fc部分)，或以其他方式阻抑補體系統之激活或活性(例如，藉由共投與一或多種補體途徑激活或補體途徑活性抑制劑)。
當如本文中所例示之抗TfR抗體一樣，抗BBB-R抗體結合至網狀 紅血球或其他細胞類型上之BBB-R誘發其耗竭時，減少抗體結合至網狀紅血球或其他細胞類型上之BBB-R應進而降低在抗體投與後所觀測到之網狀紅血球或其他細胞類型耗竭之量。事實上，此已在本文中得到證明(例如參見圖6B)。可使用本文中所闡述且在實例中所顯示之任何方法改良抗BBB-R抗體對BBB-R之親和力。
減少血漿中所存在之抗BBB-R抗體之量以減少網狀紅血球群對潛在有害濃度之抗體之暴露可以若干方式實現。一種方法係簡單地降低所投藥之抗體量，潛在地同時亦提高投藥頻率，以使得降低血漿中之最大濃度，但維持對於效力充足之血清含量，同時仍低於細胞耗竭副效應之臨限值。可與劑量修改組合之另一方法係選擇或改造pH敏感性結合至TfR之抗TfR抗體，以使得其在pH 7.4下以本文中所闡述之期望較低親和力結合至血漿中之細胞表面TfR，但在內化至內體隔室中後，在彼隔室之相對較低pH(pH 5.5至6.0)下該結合至TfR迅速且顯著減少。該解離可保護抗體免於抗原介導之清除，或增加跨越BBB遞送至CNS或再循環之抗體之量，在任一情形下，相對於不包含該pH敏感性之抗TfR抗體，該抗體之有效濃度有所增加，而不增加該抗體之投與劑量。
保護、穩定及/或補充網狀紅血球群可使用醫藥或物理方法來實現。除抗BBB-R抗體以外，可共投與(同時或依序)至少一種減輕抗體對網狀紅血球群之負面副效應之其他治療劑。該等治療劑之實例包括(但不限於)紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。亦可藉由(例如)轉輸可來自具有類似血型之另一個體或可已自投與抗BBB-R抗體之個體預先萃取之類似細胞來進行紅血球(即網狀紅血球)之物理替代。
熟習此項技術者應瞭解，可採用前述方法之任一組合改造抗體(及/或其之劑量方案)，其在以下各項之間達成最佳平衡：(i)將使抗 體及任何偶聯化合物至CNS中之運送最大化之對BBB-R之期望較低親和力；(ii)偶聯化合物對其CNS抗原之親和力(作為非限制性實例包括抗TfR抗體中之第二或另一抗原結合特異性)，此乃因此與存在於CNS中具有治療效應所需之化合物量相關；(iii)抗BBB-R抗體之清除率；及(iv)對網狀紅血球群之影響。
亦應瞭解，抗TfR抗體投與之本文中所識別之網狀紅血球耗竭效應可用於治療其中網狀紅血球之過度增殖存在問題之任一疾病或病症。例如，在先天性紅血球增多症或腫瘤性紅血球增多症中，因(例如)網狀紅血球之超增殖而升高之紅血球計數導致血液變稠及伴隨生理症狀。本發明抗TfR抗體之投與(其中保存該抗體之至少部分效應子功能)將容許未成熟網狀紅血球群之選擇性去除，而不影響至CNS中之正常轉鐵蛋白運送。可調節此一抗體之投藥，以使得可使急性臨床症狀最小化(即藉由以極低劑量或以間隔較寬之間隔投藥)，如業內所熟知。
抗TfR/BACE1及抗TfR/Aβ各自均係用於治療阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)之有希望且新穎之治療候選物。此外，基於受體介導運送(RMT)之雙特異性靶向技術使寬範圍之用於CNS疾病之潛在治療法成為可能。本發明提供改造BBB穿透劑治療法之方法，其極大改善治療劑之跨越BBB之運送及CNS分佈而不耗竭網狀紅血球。
因此，在第一實施例中，本發明提供在個體中跨越血腦屏障運送化合物之方法，其包含使以低親和力與血腦屏障受體(BBB-R)結合且與化合物偶合之抗體暴露於該血腦屏障，以使得該抗體跨越血腦屏障運送與其偶合之化合物，其中在向該個體投與抗體後可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關 蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。在另一態樣中，該方法進一步包含監測個體之紅血球之耗竭之步驟。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一 該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，除該抗體及偶合化合物以外投與另一化合物。在一該態樣中，該另一化合物負責或有助於使得不存在網狀紅血球含 量之減少。在另一該態樣中，該另一化合物抑制或防止補體途徑之激活或活性(例如參見Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121)。在另一該態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於抗體相關耗竭。在另一該態樣中，該另一化合物支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。在另一態樣中，該另一化合物係來自同一個體之紅血球或網狀紅血球。在另一態樣中，該另一化合物係來自另一個體之紅血球或網狀紅血球。
在另一態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，該BBB係在哺乳動物中。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群(Angelman’s syndrome)、利德爾氏症候群(Liddle syndrome)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、匹克氏病(Pick’s disease)、佩吉特氏病(Paget’s disease)、癌症及創傷性腦損傷組成之群。在另一態樣中，該BBB係在人類中。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM 之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析(scatchard analysis)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測 到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白(huntingtin)、普里昂蛋白(prion protein，PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白(parkin)、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及 Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供增加個體之CNS暴露到化合物之方法，其中該化合物與以較低親和力與BBB-R結合之抗體偶合，從而增加CNS暴露到該化合物，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。在另一態樣中，該方法進一步包含監測個體之紅血球之耗竭之步驟。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該 效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體 來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，除該抗體及偶合化合物以外投與另一化合物。在一該態樣中，該另一化合物負責或有助於使得不存在網狀紅血球含量之減少。在另一該態樣中，該另一化合物抑制或防止補體途徑之激活或活性(例如參見Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121)。在另一該態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於抗體相關耗竭。在另一該態樣中，該另一化合物支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。在另一態樣中，該另一化合物係來自同一個體之紅血球或網狀紅血球。在另一態樣中，該另一化合物係來自另一個體之紅血球或網狀紅血球。
在另一態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，向哺乳動物投與抗體偶合化合物。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病 症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。
在另一態樣中，量測暴露到該化合物之CNS相對於與暴露到對BBB-R不具有降低之親和力之典型抗體所偶合化合物之CNS的增加度。在另一態樣中，暴露到該化合物之CNS之增加係量測為CNS中所發現之化合物量相對於投與後血清中所發現之量之比率。在另一該態樣中，CNS暴露之增加導致大於0.1%之比率。在另一態樣中，量測暴露到該化合物之CNS相對於暴露到不存在偶合抗體之化合物之CNS的增加度。在另一態樣中，至藉由成像量測該化合物之CNS暴露之增加。在另一態樣中，藉由間接讀出(例如一或多種生理症狀之改善)量測暴露到該化合物之CNS之增加度。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體 特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在 另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供降低個體所接受投與化合物之清除之方法，其中該化合物與以較低親和力與BBB-R結合之抗體偶合，以使得該化合物之清除降低，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體 時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。在另一態樣中，該方法進一步包含監測個體之紅血球之耗竭之步驟。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將 該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至 BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，除該抗體及偶合化合物以外投與另一化合物。在一該態樣中，該另一化合物負責或有助於使得不存在網狀紅血球含量之減少。在另一該態樣中，該另一化合物抑制或防止補體途徑之激活或活性(例如參見Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121)。在另一該態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於抗體相關耗竭。在另一該態樣中，該另一化合物支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。在另一態樣中，該另一化合物係來自同一個體之紅血球或網狀紅血球。在另一態樣中，該另一化合物係來自另一個體之紅血球或網狀紅血球。
在另一態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，該個體係哺乳動物。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。
在另一態樣中，量測該化合物之清除相對於與對BBB-R不具有降低之親和力之典型抗體偶合之化合物之清除的降低程度。在另一態樣中，量測該化合物之清除相對於不存在偶合抗體之化合物之清除的降低程度。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期 為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
本發明提供增加個體所接受投與化合物於CNS中之滯留之方法，其中該化合物與以較低親和力與BBB-R結合之抗體偶合，以使得增加該化合物於CNS中之滯留，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。在另一態樣中，該方法進一步包含監測個體之紅血球之耗竭之步驟。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中 該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，除該抗體及偶合化合物以外投與另一化合物。在一該態樣中，該另一化合物負責或有助於使得不存在網狀紅血球含量之減少。在另一該態樣中，該另一化合物抑制或防止補體途徑之激活或活性(例如參見Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121)。在另一該態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於抗體相關耗竭。在另一該態樣中，該另一化合物支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。在另一態樣中，該另一化合物係來自同一個體之紅血球或網狀紅血球。在另一態樣中，該另一化合物係來自另一個體之紅血球或網狀紅血球。
在另一態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣 中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，向哺乳動物投與該化合物。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。
在另一態樣中，量測該化合物之CNS滯留相對於與對BBB-R不具有降低之親和力之典型抗體偶合之化合物之CNS滯留的增加。在另一態樣中，該化合物之CNS滯留之增加係量測為CNS中所發現之化合物量相對於在投與後之一或多個時間點處於血清中所發現之量之比率。在另一該態樣中，CNS滯留之增加導致在投與後之一或多個時間點處大於0.1%之比率。在另一態樣中，量測該化合物於CNS滯留中相對於不存在偶合抗體之化合物之CNS滯留的增加。在另一態樣中，藉由成像量測該化合物於CNS滯留中之增加。在另一態樣中，藉由間接讀出(例如一或多種生理症狀之改善)量測該化合物於CNS滯留中之增加。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該 化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗 BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供使在個體之CNS中有效之化合物達最佳藥物動力學及/或藥效動力學之方法，其中該化合物與以較低親和力與BBB-R結合之抗體偶合，且該抗體係經選擇，以使得其在與該化合物偶合後對BBB-R之親和力導致與該化合物偶聯之抗體跨越BBB之運送量使該化合物於CNS中達最佳藥物動力學及/或藥效動力學，其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。在另一態樣中，該方法進一步包含監測個體之紅血球之耗竭之步驟。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該 效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體 來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，除該抗體及偶合化合物以外投與另一化合物。在一該態樣中，該另一化合物負責或有助於使得不存在網狀紅血球含量之減少。在另一該態樣中，該另一化合物抑制或防止補體途徑之激活或活性(例如參見Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121)。在另一該態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於抗體相關耗竭。在另一該態樣中，該另一化合物支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。在另一態樣中，該另一化合物係來自同一個體之紅血球或網狀紅血球。在另一態樣中，該另一化合物係來自另一個體之紅血球或網狀紅血球。
在另一態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，該BBB係在哺乳動物中。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自 由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。在另一態樣中，該BBB係在人類中。
在一態樣中，最佳化可包括產生一系列抗體-化合物複合物(其中每一抗體對BBB-R具有不同親和力)及評估每一者於CNS中之藥物動力學及/或藥效動力學。在另一態樣中，最佳化可係相對於已知標準，例如(但不限於)當直接引入至CNS中時或當在不存在偶合抗BBB-R抗體之情況下引入至個體中時該化合物之藥物動力學及/或藥效動力學。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗 TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供治療哺乳動物之神經性病症之方法，其包含用結合BBB-R且與化合物偶合之抗體治療該哺乳動物，其中該抗體已經選擇對BBB-R具有較低親和力，且從而改善該抗體及偶合化合物之CNS吸收，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因 子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。在另一態樣中，該方法進一步包含監測個體之紅血球之耗竭之步驟。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，除該抗體及偶合化合物以外投與另一化合物。在一該態樣中，該另一化合物負責或有助於使得不存在網狀紅血球含量之減少。在另一該態樣中，該另一化合物抑制或防止補體途徑之激活或活性(例如參見Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121)。在另一該態樣中，該另一化合物保護網狀紅血球免於抗體相關耗竭。在另一該態樣中，該另一化合物支持網狀紅血球之生長、發育或重建。在另一態樣中，該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。在另一態樣中，該另一化合物係來自同一個體之紅血球或網狀紅血球。在另一態樣中，該另一化合物係來自另一個體之紅血球或網狀紅血球。
在另一態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣 中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在一態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。
在一態樣中，該治療導致病症症狀之減輕或消除。在另一態樣中，該治療導致神經性病症之改善。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗 TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供改善結合BBB-R之抗體於個體中之安全性之方法，其包含改良該抗體之一或多種性質，以使得該抗體之投與降低或消除在接受未經修飾抗體之個體中所觀測到之紅血球含量之減少。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1 (Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，量測該抗體之親和力相對於對BBB-R不具有改良(即降低)之親和力之相同同型之野生型抗體的改良。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一 該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，該抗體與治療化合物偶合。在另一該態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在 另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，該BBB係在哺乳動物中。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。在另一態樣中，該BBB係在人類中。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗 TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，該抗體係基於所選抗體之親和力選自一組抗體。在另一態樣中，該抗體係經改造以具有期望親和力。在一該態樣中，使用包括(但不限於)噬菌體展示、酵母展示、隨機誘變及定點誘變之任一業內蛋白質改造方法產生該抗體。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態 樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供一種製造適用於在改善之安全性下運送化合物跨越BBB之抗體之方法，其包括選擇對血腦屏障受體 (BBB-R)具有特異性且對BBB-R具有期望較低親和力之抗體，及改良該抗體之一或多種性質，以使得該抗體之投與可降低或消除在接受未經修飾抗體之個體中所觀測到之紅血球含量之減少。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，量測該抗體之親和力相對於對BBB-R不具有改良(即降低)之親和力之相同同型之野生型抗體的改良。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使 得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體之投與劑量及/或頻率係經調節以減少紅血球所暴露之抗體濃度。在另一態樣中，該抗體係經修飾以包含至BBB-R之pH敏感性結合。
在另一態樣中，該抗體與治療化合物偶合。在另一該態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，該BBB係在哺乳動物中。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。在另一態樣中，該BBB係在人類中。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。在另一該態樣中，IC50係約5nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約50nM至約100μM。在另一該態樣中，IC50係約100nM至約100μM。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約50nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且 對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，該抗體係基於所選抗體之親和力選自一組抗體。在另一態樣中，該抗體係經改造以具有期望親和力。在一該態樣中，使用包括(但不限於)噬菌體展示、酵母展示、隨機誘變及定點誘變之任一業內蛋白質改造方法產生該抗體。
在另一態樣中，以治療劑量投與該化合物偶合抗體。在一該態樣中，該治療劑量係使該抗體所特異性結合之BBB-R飽和之劑量。在另一該態樣中，以使紅血球與該化合物偶合抗體之相互作用最小化同時仍有助於將化合物以治療含量跨越BBB遞送至CNS中之劑量及投藥頻率投與該化合物偶合抗體。
在另一態樣中，該化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋 放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供結合至血腦屏障受體(BBB-R)之抗體，其中該抗體對BBB-R之親和力係約5nM至約50μM，且其中該抗體之一或多種性質已經改良以減少至少一種對紅血球之不期望副效應。在一態樣中，該BBB-R係選自由轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)組成之群。在另一該態樣中，該BBB-R係人類BBB-R。在一該態樣中，該BBB-R係TfR。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR活性。在另一該態樣中，該BBB-R係TfR，且該抗體不抑制TfR結合至轉鐵蛋白。
在另一態樣中，該等紅血球係未成熟紅血球。在另一該態樣中，該等未成熟紅血球係網狀紅血球。在另一態樣中，網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。
在另一態樣中，該抗體之一或多種性質已經改良以減少個體中該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。在一該態樣中，該抗體對BBB-R之親和力係經改良，即降低。在另一該態樣中，量測該抗體之親和力相對於對BBB-R不具有改良(即降低)之親和力之相同同型之野生型抗體的改良。在另一該態樣中，抗體Fc區之效應子功能係經改良。在一該態樣中，相對於相同同型之野生型抗體之效應子功能，該該效應子功能已經減少或消除。在另一該態樣中，藉由減少該抗體之糖基化減少或消除該效應子功能。在另一該態樣中，藉由在不容許野生型糖基化之環境中產生抗體來減 少該抗體之糖基化。在一該態樣中，在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體。在另一該態樣中，以合成方式產生該抗體。在另一該態樣中，藉由去除該抗體上已存在之碳水化合物基團來減少該抗體之糖基化。在另一該態樣中，藉由修飾該抗體來減少該抗體之糖基化，以使得不發生野生型糖基化。在另一該態樣中，該抗體之Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。在另一態樣中，藉由將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型來減少或消除效應子功能。
在另一態樣中，Fc區係經修飾以減少或消除效應子功能。在一該態樣中，藉由Fc區之至少一種修飾減少或消除效應子功能。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除效應子功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。
在另一態樣中，該抗體之Fc區及/或非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係在Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321。在另一該態樣中，該修飾係Fc區中之一些或全部之消除。在另一該態樣中，藉由Fc區之全部或一部分之缺失或藉由改造該抗體來減少或消除補體誘發功能，以使得其不包括參與補體途徑之Fc區。在一該態樣中，該抗體係選自Fab或單鏈抗體。在另一該態樣中，該 抗體之非Fc區係經修飾以減少或消除藉由該抗體達成之補體途徑之激活。在一該態樣中，該修飾係CH1區中損害至C3之結合之點突變。在一該態樣中，該點突變係於位置132處(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223)。
在另一態樣中，該抗體與治療化合物偶合。在另一該態樣中，該化合物係神經性病症藥物。在另一態樣中，該化合物係顯像劑。在另一態樣中，該化合物係經標記。在另一態樣中，該抗體係經標記。在另一態樣中，該抗體不損害BBB-R與其一或多種天然配體之結合。在另一該態樣中，該抗體以其不抑制TfR結合至轉鐵蛋白之方式特異性結合至TfR。在另一態樣中，該BBB係在哺乳動物中。在另一該態樣中，該哺乳動物係人類。在另一該態樣中，該哺乳動物具有神經性病症。在另一該態樣中，該神經性病症係選自由阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症及創傷性腦損傷組成之群。在另一態樣中，該BBB係在人類中。
在另一態樣中，該抗體對BBB-R具有約30nM至約30μM之IC50。在另一該態樣中，該抗體當與化合物偶合時對BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等親和力之間之親和力。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特 異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體所觀測到之彼等IC50之間之IC50。在一態樣中，使用斯卡查德分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。在另一態樣中，使用競爭ELISA量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之親和力。
在另一態樣中，該抗體自其所特異性結合之BBB-R之解離半衰期為約30秒至約30分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約20分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約10分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約5分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約3分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約30秒至約2分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為約兩分鐘。在另一該態樣中，該解離半衰期為一分鐘或更短。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRA/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一該態樣中，該化合物偶合抗體特異性結合至TfR，且對TfR具有介於針對抗TfRD/BACE1抗體及抗TfRE/BACE1抗體自其至TfR之各別結合所觀測到之彼等解離半衰期之間之解離半衰期。在另一態樣中，使用BIACORE分析量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。在另一態樣中，使用競爭結合分析(例如競爭ELISA)量測抗BBB-R或抗BBB-R/化合物對BBB-R之解離半衰期。
在另一態樣中，該抗體係基於所選抗體之親和力選自一組抗體。在另一態樣中，該抗體係經改造以具有期望親和力。在一該態樣中，使用包括(但不限於)噬菌體展示、酵母展示、隨機誘變及定點誘變之任一業內蛋白質改造方法產生該抗體。
在另一態樣中，化合物與該抗體共價偶合。在一該態樣中，該化合物係藉由連接體鏈接至該抗體。在一該態樣中，該連接體係可裂解。在另一該態樣中，該連接體係不可裂解。在另一該態樣中，該化合物係直接連接至該抗體。在一該態樣中，該抗體係多特異性抗體，且該化合物形成多特異性抗體之一部分。在另一該態樣中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。在另一該態樣中，該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、Tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。在另一該態樣中，該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。在另一該態樣中，該多特異性抗係經標記。在另一態樣中，該化合物與該抗體可逆偶合，以使得該化合物與BBB運送同時或在BBB運送後自該抗體釋放。
應瞭解，前述態樣中之任一態樣可單獨或與前述實施例組合應用。
在另一實施例中，本發明提供以較低親和力與BBB-R結合且不減少紅血球含量之抗體用於製造用以治療神經性病症之醫藥的用途。前述低親和力抗BBB-R抗體中之任一者或在本文其他部分中所闡述之低親和力抗BBB-R抗體中之任一者可用於該方法中。
在另一實施例中，本發明提供以較低親和力與BBB-R結合且不減少紅血球含量之抗體，其用於治療神經性病症。前述低親和力抗BBB-R抗體中之任一者或在本文其他部分中所闡述之低親和力抗 BBB-R抗體中之任一者可用於該方法中。
在另一實施例中，本發明提供跨越血腦屏障運送治療化合物(例如神經性病症藥物)之方法，其包含將與神經性病症藥物偶合之抗BBB-R抗體暴露於該血腦屏障，以使得該抗體跨越該血腦屏障運送與其偶合之神經性病症藥物，其中該抗體不減少紅血球含量。
本發明另外提供治療哺乳動物之神經性病症之方法，其包含用結合血腦屏障受體(BBB-R)及腦抗原二者之多特異性抗體治療該哺乳動物，其中該抗BBB-R抗體已經選擇以對該BBB-R具有較低親和力，且從而改善抗腦抗原抗體之腦吸收，且其中該抗體之投與不降低紅血球含量。
本發明另外提供治療個體之與升高之紅血球含量相關或由其引起之疾病或病症之方法，其包含向該個體投與包含至少部分效應子功能之抗TfR抗體。在一態樣中，投藥步驟係以經校準以使抗體投與之急性臨床症狀最小化之劑量及/或投藥頻率進行。
應理解，前述方法及本發明組合物中之任一者可彼此組合及/或與本文說明書中所闡述之其他本發明態樣組合。
圖1A-1E繪示評估抗轉鐵蛋白受體(「TfR」)及TfR之抗TfR/β-分泌酶(「BACE1」)變體之親和力以及在小鼠中投與後該抗體及Aβ1-40之濃度之實驗結果，如實例1中所闡述。圖1A中之競爭性ELISA分析結果顯示抗TfR/BACE1變體及抗TfR變體對TfR具有不同親和力。圖1B及1D分別顯示在對照IgG、抗BACE1或抗TfR/BACE1變體之單一50mg/kg靜脈內注射後野生型小鼠中之平均血清及腦抗體濃度(n=6/群組)。圖1C及1E分別顯示在該等同樣處理之小鼠中之Aβ1-40之血漿及腦濃度，作為所注射抗體之活性之標記物。
圖2A係骨髓中之紅血球(RBC)成熟之示意性繪示，顯示自原紅血 球母細胞(Pro-EB)至嗜鹼性紅血球母細胞(Baso-EB)、至多色紅血球母細胞(Poly-EB)、至正色紅血球母細胞(Ortho-EB)且最終至網狀紅血球之進展。將網狀紅血球自骨髓釋放至其成熟至RBC之循環。在於骨髓中成熟之後期期間，紅血球前期細胞(erythroid precursor)合成含鐵蛋白質血紅素，此需要TfR表現之伴隨增加。當細胞成熟通過網狀紅血球期時，轉鐵蛋白受體隨血紅素合成及細胞增殖之停止而流出，以使得成熟RBC不表現TfR。RBC成熟之每一細胞期所存在之相對TfR數係指示於該圖頂部之圖表中，基於來自Iacpetta等人，Biochim.Biophys.Acta 687：204-210(1982)之數據。圖2B及2C繪示評估抗TfR及抗TfR/BACE1投與對小鼠中之網狀紅血球之影響之實驗結果，如實例2A中所闡述。圖2B繪示測試投藥後1小時靜脈內投與之抗TfRD、抗TfRD/BACE1或對照IgG對來自野生型小鼠全血之未成熟網狀紅血球部分之百分比之影響的實驗結果(n=6/群組)。圖2C繪示測試投藥後24小時或7天靜脈內投與之抗TfRA/BACE1、抗TfRD/BACE1或對照IgG對野生型小鼠全血中之總網狀紅血球計數之影響的實驗結果(n=6/群組)。所有數據係以平均值±SEM顯示。圖2D及2E繪示對照IgG之單一50mg/kg靜脈內注射或抗TfRD/BACE1(圖2D)或抗TfRA/BACE1(圖2E)之5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg注射後野生型小鼠中之平均腦Aβ1-40濃度(n=6/群組)。圖2F-2H繪示評估在5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg劑量下抗TfRA/BACE1及抗TfRD/BACE1與對照相比較之藥物動力學的實驗結果。圖2F提供所示時間點處腦抗體濃度之量測。圖2G提供所示時間點處血漿抗體濃度之量測。圖2H提供所示時間點處血漿Aβ含量之量測。
圖3A-3E繪示評估效應子功能之消除(圖3A-3C)或補體功能之消除(圖3D及3E)對由各種抗TfR抗體造成之網狀紅血球耗竭之影響的實驗結果，如實例2B中所闡述。顯示以所示劑量靜脈內注射抗體後24 小時來自野生型小鼠(圖3A及3C)、Fcγ-/-(B6.129P2-Fcer1gtm1Rav N12)小鼠(圖3B)或C3-/-小鼠(圖3D)之全血中之總網狀紅血球計數，如與對照IgG相比(n=6/群組)。圖3E繪示評估補體系統之損害對先前觀測到之由抗TfR造成之網狀紅血球耗竭之效應的實驗結果。向野生型或C3剔除小鼠靜脈內投與50mg/kg對照IgG或抗TfRD/對照IgG混合物(n=6/群組)。
圖4A及4B繪示評估在一系列抗體濃度下小鼠紅白血病胚細胞中抗TfRA、抗TfRA/BACE1或對照IgG對抗體依賴性之細胞介導之細胞毒性(ADCC)(圖4A)或補體依賴性細胞毒性(CDC)(圖4B)之誘導的活體外實驗結果，如實例2B中所闡述。
圖5A-5C繪示評估Fc結合或BACE1結合之消除是否影響由單特異性或雙特異性抗TfR抗體造成之網狀紅血球耗竭的實驗結果，如實例2C中所闡述。顯示靜脈內注射所示F(ab’)2或對照IgG(圖5A及5B)或雙特異性抗體(圖5C)後24小時野生型小鼠(n=6/群組)之總網狀紅血球計數。
圖6A-6C繪示評估減少對TfR之親和力對網狀紅血球耗竭及腦TfR表現之影響的實驗結果，如實例3中所闡述。圖6A及6B繪示靜脈內注射所示抗TfR/BACE1變體抗體後24小時野生型小鼠中之總網狀紅血球計數，與對照IgG相比。圖6C顯示以所示劑量靜脈內注射對照IgG、抗TfRA/BACE1或抗TfRD/BACE1後4天自整個小鼠腦溶解物含量藉由西方墨點(Western blot)達成之腦TfR表現量化(n=3/群組)。將TfR表現之量化正規化至肌動蛋白，且數據係顯示為平均值±SEM。
圖7A-7C繪示評估TfR抗體治療是否影響血腦屏障滲透性之實驗結果，如實例4中所闡述。向野生型小鼠靜脈內投與50mg/kg之對照IgG或25mg/kg之每一共注射抗體組合中。使用一般人類-Fc ELISA(圖7A)或BACE1-胞外結構域ELISA(圖7B)量測靜脈內注射後24小時 於腦中之平均抗體吸收。圖7C顯示靜脈內注射對照IgG或共注射抗體後小鼠腦中之Aβ1-40濃度之量化(n=6/群組)。
圖8A-8F繪示評估多個劑量之抗TfRD/BACE1對經治療小鼠中之網狀紅血球含量之影響的實驗結果，如實例5中所闡述。每週向野生型小鼠靜脈內投藥一次25mg/kg之對照IgG或抗TfRD/BACE1。圖8A及8B分別繪示2個或4個劑量之抗體後24小時、4天及7天所觀測到之血漿及腦抗體濃度。應注意，圖8A中之Y軸標度係以μM為單位，而圖8B中之Y軸標度係以nM為單位。亦量測血漿(圖8C)及腦(圖8D)中之相應平均Aβ1-40濃度。圖8E顯示對照IgG或抗TfRD/BACE1之第二及第三劑量後24小時及其第四劑量後7天小鼠中之總網狀紅血球計數。圖8F顯示繪示4個週劑量之對照IgG或抗TfRD/BACE1後自整個小鼠腦溶解物藉由西方墨點達成之腦TfR表現含量量化結果的圖表。將TfR表現之量化正規化至肌動蛋白，且數據係顯示為平均值±SEM。
圖9A-9B及10A-10D繪示評估無效應子抗TfR/BACE1抗體對小鼠中之血液及骨髓中之紅血球子群之影響的實驗結果。(圖9A)血液及(圖9B)骨髓二者中之不同Ter119陽性紅血球譜系群係藉由其TfR表現及細胞大小(如藉由來量測前向散射分佈)並使用流式細胞術來區分(Paniga等人，PLoS One 6,9(2011))。骨髓中之Ter119陽性細胞亞群係界定為EryA=較大TfR陽性早期嗜鹼性紅血球母細胞，EryB=較小TfR陽性多色紅血球母細胞，且EryC=TfR陰性成熟紅血球。圖9C及9D顯示投藥抗TfRD/BACE1後血液中之總Ter119陽性紅血球群(網狀紅血球及紅血球；9C)及TfR陽性網狀紅血球(9D)之時程，與對照IgG相比(n=6/群組)。圖10A至10D提供抗TfRD/BACE1或對照IgG投藥後骨髓中之不同紅血球子群(EryA、EryB、EryC)之量化圖表(n=6/群組)。
圖11A-11B及12A-12D繪示分析抗TfR/BACE1抗體之親和力及效應子功能對小鼠中之血液及骨髓中之紅血球群之影響的實驗結果。圖 11A-11B顯示無效應子抗TfRA/BACE1(Fc-)及抗TfRD/BACE1(Fc-)、全效應子功能抗TfRD/BACE1(Fc+)或對照IgG投藥後血液中之總Ter119陽性紅血球群(圖11A)及TfR陽性網狀紅血球群(圖11B)之量化(n=6/群組)。圖12A-12D提供無效應子抗TfRA/BACE1(Fc-)及抗TfRD/BACE1(Fc-)投藥、全效應子功能抗TfRD/BACE1(Fc+)或對照IgG投藥後骨髓中之不同紅血球子群(圖12A中之總Ter119陽性紅血球譜系；圖12B中之EryA；圖12C中之EryB；及圖12D中之EryC)之量化(n=6/群組)。
圖13A-B及圖14A-B繪示評估效應子功能狀態對人類紅血球母細胞系或原代人類骨髓單核細胞中之抗人類TfR(「抗hTFR」)抗體之ADCC活性之影響的實驗結果，如實例7中所闡述。
圖15A-B繪示自天然多樣性噬菌體展示文庫之純真種類及YW412.8之親和力成熟形式獲得之抗BACE1純系YW412.8之輕鏈及重鏈胺基酸序列。圖15A繪示可變輕鏈(VL)序列比對(SEQ ID NO.1-6)。圖13B繪示可變重鏈(VH)序列比對(SEQ ID No.7-8)。在兩個圖中，每一純系之HVR序列係藉由加方框區指示，其中第一個方框指示HVR-L1(圖15A)或HVR-H1(圖15B)，第二個方框指示HVR-L2(圖15A)或HVR-H2(圖15B)，且第三個方框指示HVR-L3(圖15A)或HVR-H3(圖15B)。
圖16A-B繪示自合成多樣性噬菌體展示文庫之純真種類及Fab 12之親和力成熟形式獲得抗BACE1抗體純系Fab 12之輕鏈及重鏈胺基酸序列。圖16A繪示輕鏈序列比對(SEQ ID NO.9-12)。圖16B繪示重鏈序列比對(SEQ ID NO.13)。在兩個圖中，每一純系之HVR序列係藉由加方框區指示，其中第一個方框指示HVR-L1(圖16A)或HVR-H1(圖16B)，第二個方框指示HVR-L2(圖16A)或HVR-H2(圖16B)，且第三個方框指示HVR-L3(圖16A)或HVR-H3(圖16B)。
圖17A-B繪示實例性抗Aβ抗體之重鏈(圖17A；SEQ ID NO.14)及輕鏈(圖17B；SEQ ID NO.15)。
I.定義
「血腦屏障」或「BBB」係指介於外周循環與腦脊髓(即CNS)之間之生理屏障，其係藉由腦毛細管內皮漿膜內之緊密接合來形成，從而建立限制分子(甚至諸如尿素(60道爾頓(Dalton)))等極小分子運送至腦中之緊密屏障。腦內之血腦屏障、脊髓內之血液-脊髓屏障及視網膜內之血液-視網膜屏障係CNS內之連續毛細管屏障，且在本文中共同稱為血腦屏障或BBB。BBB亦涵蓋血液-CSF屏障(脈絡叢)，其中該屏障係由室管膜細胞而非毛細管內皮細胞組成。
「中樞神經系統」或「CNS」係指控制身體功能之神經組織之複合物，且包括腦脊髓。
「血腦屏障受體」(在本文中簡稱「BBB-R」)係腦內皮細胞上表現之能夠跨越血腦屏障運送分子之跨膜受體蛋白。BBB-R之實例包括(但不限於)：轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF-R)、包括(但不限於)低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)及低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)之低密度脂蛋白受體、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。本文中之實例性BBB-R為轉鐵蛋白受體(TfR)。
「轉鐵蛋白受體」(「TfR」)係由兩個在脊椎動物中之鐵吸收中所涉及之二硫鍵結亞單位(每一表觀分子量為約90,000)構成之跨膜糖蛋白(分子量為約180,000)。在一實施例中，TfR在本文中為包含(例如)Schneider等人Nature 311：675-678(1984)中所闡釋之胺基酸序列之人類TfR。
本文所使用之「神經性病症」係指影響CNS及/或在CNS中具有 病因之疾病或病症。實例性CNS疾病或病症包括(但不限於)神經病變、類澱粉變性症、癌症、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症、局部缺血、神經變性疾病、癲癇發作、行為障礙及溶酶體貯積病。出於本身請案之目的，CNS將理解未包括眼睛，眼睛通常藉由血液-視網膜屏障與身體之其餘部分隔絕。神經性病症之具體實例包括(但不限於)神經變性疾病(包括(但不限於)路易氏體疾病(Lewy body disease)、脊髓灰質炎後症候群、夏伊-德雷格症候群(Shy-Draeger syndrome)、橄欖體橋腦小腦萎縮、帕金森氏病、多系統萎縮、紋狀黑質變性、tau蛋白病(tauopathies，包括(但不限於)阿茲海默氏病及核上性麻痹)、普里昂蛋白疾病(包括(但不限於)牛海綿狀腦病變、綿羊癢病、克-雅二氏症候群(Creutzfeldt-Jakob syndrome)、庫魯病(kuru)、格斯特曼氏病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗性病及家族致命性失眠症)、延髓性癱瘓、運動神經元病及神經系統異源變性(heterodegenerative)病症(包括(但不限於)康納丸氏病(Canavan disease)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease)、神經性類蠟脂褐質病、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette’s syndrome)、門克氏纏發症候群(Menkes kinky hair syndrome)、柯凱因氏症候群(Cockayne syndrome)、哈-斯二氏症候群(Halervorden-Spatz syndrome)、拉弗拉病(lafora disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、勒-奈二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome)及昂-綸症候群(Unverricht-Lundborg syndrome))、癡呆(包括(但不限於)匹克氏病(Pick’s disease)及脊髓小腦性失調症)、癌症(例如CNS之癌症，包括身體別處之癌症引起之腦轉移)。
「神經性病症藥物」係治療一或多種神經性病症之藥物或治療劑。本發明之神經性病症藥物包括(但不限於)抗體、肽、蛋白質、一或多種CNS標靶之天然配體、一或多種CNS標靶之天然配體之經修飾 形式、適配體、抑制性核酸(即小抑制性RNA(siRNA)及短髮夾RNA(shRNA))、核糖酶及小分子或前述中之任一者之活性片段。本發明之實例性神經性病症藥物係闡述於本文中，且包括(但不限於)：抗體、適配體、蛋白質、肽、抑制性核酸及小分子及前述中之任一者之活性片段，其本身或特異性識別及/或對諸如(但不限於)以下等CNS抗原或標靶分子起作用(即抑制、激活或檢測)：類澱粉前體蛋白或其部分、類澱粉β、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突觸核蛋白、帕金蛋白、杭丁頓氏蛋白、DR6、早老素、ApoE、神經膠瘤或其他CNS癌症標記物及神經滋養蛋白。神經性病症藥物之非限制性實例及其可用於治療之病症係提供於下表1中：
「顯像劑」係具有一或多種容許直接或間接檢測其存在及/或定位之性質之化合物。該等顯像劑之實例包括納入容許檢測之經標記部分之蛋白質及小分子化合物。
「CNS抗原」或「腦抗原」係CNS(包括腦)中所表現之抗原，其可經抗體或小分子靶向。該等抗原之實例包括(但不限於)：β-分泌酶1(BACE1)、類澱粉β(Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)、介白素6受體(IL6R)、TNF受體1(TNFR1)、介白素1β(IL1β)及半胱天冬酶6。在一實施例中，該抗原係BACE1。
除非另有指示，否則本文所使用之術語「BACE1」係指來自包括諸如靈長類(例如人類)及齧齒類(例如小鼠及大鼠)等哺乳動物之任一脊椎動物來源之任一天然β-分泌酶1(亦稱為β位點類澱粉前體蛋白裂解酶1、膜相關天冬胺酸蛋白酶2(membrane-associated aspartic protease 2)、memapsin 2、天冬胺醯基蛋白酶2或Asp2)。該術語涵蓋「全長」未經加工BACE1以及由在細胞中加工所產生之BACE1之任一形式。該術語亦涵蓋BACE1之天然存在之變體，例如剪接變體或對偶基因變體。實例性BACE1多肽之胺基酸序列係Vassar等人，Science 286：735-741(1999)中所報導之人類BACE1同種型A之序列，該文獻以引用的方式全文併入本文中。存在人類BACE1之若干其他同種型，包括同種型B、C及D。參見UniProtKB/Swiss-Prot Entry P56817，其以引用的方式全文併入本文中。
術語「抗β-分泌酶抗體」、「抗BACE1抗體」、「結合至β-分泌酶之抗體」及「結合至BACE1之抗體」係指如下之抗體：能夠以足夠親和力結合BACE1，以使得該抗體作為診斷劑及/或治療劑用於靶向BACE1。在一實施例中，抗BACE1抗體與不相關之非BACE1蛋白質之結合程度係小於抗體與BACE1之結合之約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)量測。在某些實施例中，結合至BACE1之抗體之解離常數(Kd)為1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗BACE1抗體結合至在來自不同物種及同種型之BACE1中保守之表位。在一實施例中，提供結合至BACE1上由抗BACE1抗體YW412.8.31結合之表位之抗體。在其他實施例中，提供結合至BACE1內位於BACE1之催化結構域中之外部位點之抗體。在一實施例中，提供與Kornacker等人，Biochem.44：11567-11573(2005)中所鑑別之肽(即肽1、2、3、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、2-12、3-12、4-12、5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12、4、5、6、5-10、5-9，混合型(scrambled)肽Y5A、P6A、Y7A、F8A、I9A、P10A及L11A)競爭結合至BACE1之抗體，該文獻以引用的方式全文併入本文中。實例性BACE1抗體序列係繪示於圖15A-B及圖16A-B中。一實例性抗體在本文中包含抗體YW412.8.31之可變結構域(例如如圖15A-B中)。
「天然序列」蛋白質在本文中係指包含自然界中所發現之蛋白質(包括該蛋白質之天然存在之變體)之胺基酸序列之蛋白質。本文所使用之該術語包括自其天然來源分離或重組產生之蛋白質。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛含義使用，且具體而言涵蓋單株抗體、多株抗體、自至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段(只要其呈現期望生物學活性即可)。
「抗體片段」在本文中包含完整抗體之保持結合抗原之能力之部分。抗體片段之實例為業內所熟知(例如參見Nelson,MAbs(2010)2(1)：77-83)，且包括(但不限於)Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段；雙鏈抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，其包括(但不限於)單鏈可變片段(scFv)、具有或不具有連接體之輕鏈及/或重鏈抗原結合結構域之融合(且視情況以串聯形式)；及自抗體片段形成之單特異性或多特異性抗原結合分子(包括(但不限於)自多個缺少Fc區之可變結構域構築之多特異性抗體)。
本文中所使用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群獲得之抗體，即包含該群之個別抗體係相同的及/或結合同一表位，除單株抗體產生期間可出現之可能變體以外，該等變體通常少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，每一單株抗體係針對抗原上之單一決定簇。除其特異性外，單株之優勢在於其不受其他免疫球蛋白污染。修飾詞「單株」指示抗體特徵係自實質上同源之抗體群獲得，且不應理解為需要藉由任一特定方法來生產該抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature，256：495(1975)闡述之融合瘤方法製得或可藉由重組DNA方法製得(例如參見美國專利第4,816,567號)。例如，「單株抗體」亦可使用Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中所闡述之技術自噬菌體抗體文庫分離出來。單株抗體之具體實例在本文中包括嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體，包括其抗原結合片段。
單株抗體在本文中尤其包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體的相應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體的相應序列相同或同源；以及該等抗體之 片段，只要其呈現期望生物活性即可(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中所關注之嵌合抗體包括包含源自非人類靈長類(例如舊大陸猴(Old World Monkey)，例如狒狒、恒河猴或食蟹猴)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列之「靈長類化」抗體(美國專利第5,693,780號)。
非人類(例如，鼠類)抗體之「人類化」形式係含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體係如下之人類免疫球蛋白(接受者抗體)：來自接受者超變區之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類)超變區(供體抗體)之具有期望特異性、親和力及容量之殘基所代替。在一些情形下，人類免疫球蛋白框架區(FR)殘基由相應之非人類殘基所替代。此外，人類化抗體可包含未曾在接受者抗體或供體抗體中發現之殘基。進行該等修飾以進一步改良抗體性能。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有超變區對應於非人類免疫球蛋之超變區，且所有或實質上所有FR係人類免疫球蛋白序列之FR，除上文所述之FR取代以外。人類化抗體亦將視需要包含免疫球蛋白恆定區(通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。其他細節參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
「人類抗體」在本文中係包含與可自人類B細胞獲得之抗體之胺基酸序列結構相對應之胺基酸序列結構的抗體，且包括人類抗體之抗原結合片段。該等抗體可藉由包括(但不限於)以下之各種技術來鑑別或製得：由在免疫後能夠在不存在內生性免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體之轉基因動物(例如小鼠)產生(例如參見Jakobovits等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immuno.,7：33(1993)；及美國專利第5,591,669號、第5,589,369號及第5,545,807號)；自表現人類抗體或人類抗體片段之噬菌體展示文庫選擇(例如參見McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)；Johnson等人，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)；Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Griffith等人，EMBO J.12：725-734(1993)；美國專利第5,565,332號及第5,573,905號)；經由活體外激活之B細胞生成(參見美國專利5,567,610及5,229,275)；及自產生人類抗體之融合瘤分離。
「多特異性抗體」在本文中係對至少兩種不同表位具有結合特異性之抗體。實例性多特異性抗體可結合BBB-R及腦抗原二者。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。本發明亦涵蓋經改造具有2個、3個或更多個(例如4個)功能性抗原結合位點之抗體(例如參見美國申請案第US 2002/0004587 A1號，Miller等人)。多特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
抗體在本文中包括具有改變之抗原結合或生物活性之「胺基酸序列變體」。該等胺基酸改變之實例包括對抗原具有增強之親和力之抗體(例如「親和力成熟」抗體)及具有改變之Fc區(若存在)、例如具有改變(增加或減弱)之抗體依賴性之細胞細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)(例如參見WO 00/42072，Presta,L.及WO 99/51642，Iduosogie等人)；及/或增加或減弱之血清半衰期之抗體(例如參見WO00/42072，Presta,L.)之抗體。
「親和力經改良變體」具有親代抗體(例如親代嵌合、人類化或人類抗體)之一或多個改變(增加或減少)親和力之經取代超變區或框架殘基。生成該等取代變體之便利方式使用噬菌體展示。簡言之，使若 干超變區位點(例如6個至7個位點)突變以在每一位點生成所有可能的胺基酸取代。由此生成之抗體變體以單價方式以與包裹於每一顆粒中之M13基因III產物之融合形式自絲狀噬菌體顆粒展示出來。然後針對變體之生物活性(例如結合親和力)來篩選經噬菌體展示之變體。為鑑別用於修飾之候選超變區位點，可實施丙胺酸掃描誘變以鑑別可明顯有助於抗原結合之超變區殘基。或者或另外，可有利地分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與其標靶之間之接觸點。根據本文中所闡述之技術，該等接觸殘基及鄰近殘基係取代之候選殘基。在生成該等變體後，使該組變體經歷篩選，且具有改變之親和力之抗體可經選擇用於進一步發育。
「pH敏感性抗體變體」係在第一pH下對標靶抗原之結合親和力與在不同pH下對彼標靶抗原之親和力不同的抗體變體。作為非限制性實例，本發明之抗TfR抗體可經選擇或改造以具有至TfR之pH敏感性結合，以使得其在pH 7.4下以期望較低親和力(如本文中所闡述)結合至血漿中之細胞表面TfR，但在內化至內體隔室中後，在相對較低pH(pH 5.5-6.0)下自TfR迅速解離；該解離可保護該抗體免於抗原介導之清除，並增加跨越BBB遞送至CNS或再循環之抗體量-在任一情形下，相對於不包含該pH敏感性之抗TfR抗體，該抗體之有效濃度有所增加(例如參見Chaparro-Riggers等人，J.Biol.Chem.287(14)：11090-11097；Igawa等人，Nature Biotechnol.28(11)：1203-1208)。熟習此項技術者可容易地確定特定BBB-R及偶聯化合物之親和力在血清pH及內體隔室pH下之期望組合。
該抗體在本文中可與「異源分子」偶聯，以(例如)增加半衰期或穩定性或以其他方式改善該抗體。例如，該抗體可連接至各種非蛋白質聚合物中之一者，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚環氧烷或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。連接至一或多個PEG分子之抗體片段 (例如Fab’)係本發明之實例性實施例。在另一實施例中，該異源分子係治療化合物或可視化劑(即，可檢測標記)，且該抗體係用於跨越BBB運送該異源分子。異源分子之包實例括(但不限於)化學化合物、肽、聚合物、脂質、核酸及蛋白質。
該抗體在本文中可係「糖基化變體」，以使得改變任一附接至Fc區(若存在)之碳水化合物，在存在/不存在方面改良或在類型方面改良。例如，具有缺少附接至抗體Fc區之岩藻糖之成熟碳水化合物結構的抗體係闡述於美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)中。亦參見US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。在附接至抗體Fc區之碳水化合物中具有等分N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)之抗體可參見WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)及美國專利第6,602,684號(Umana等人)。在附接至抗體Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體係報導於WO 1997/30087(Patel等人)中。關於具有附接至抗體Fc區之經改變碳水化合物之抗體亦參見WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)。亦參見闡述具有經改良糖基化之抗體之US 2005/0123546(Umana等人)。Fc區中之共有糖基化序列(在位置297-299處之Asn-X-Ser/Thr，其中X不可能係脯胺酸)之突變(例如，藉由使此序列之Asn突變成任一其他胺基酸，藉由於位置298處安置Pro，或藉由將位置299修飾成除Ser或Thr以外之任一胺基酸)應廢除彼位置處之糖基化(例如參見Fares Al-Ejeh等人，Clin.Cancer Res.(2007)13：5519s-5527s；Imperiali及Shannon,Biochemistry(1991)30(18)：4374-4380；Katsuri,Biochem J.(1997)323(Pt 2)：415-419；Shakin-Eshleman等人，J.Biol.Chem.(1996)271：6363-6366)。
術語「超變區」在本文中使用時係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變結構域中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及 重鏈可變結構域中之31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))及/或彼等來自「超變環」之殘基(例如輕鏈可變結構域中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變結構域中之26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。「框架」或「FR」殘基係除本文中所定義之超變區殘基以外之彼等可變結構域殘基。
「全長抗體」係包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定結構域(CL)及重鏈恆定結構域(CH1、CH2及CH3)之抗體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變體。
「裸抗體」係不與異源分子(例如細胞毒性部分、聚合物或放射性標記)偶聯之抗體(如本文中所定義)。
抗體「效應子功能」係指抗體之導致免疫系統激活而非補體途徑激活之彼等生物活性。該等活性主要存在於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)中。抗體效應子功能之實例包括(例如)Fc受體結合及抗體依賴性之細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一實施例中，該抗體在本文中基本上缺少效應子功能。在另一實施例中，該抗體在本文中保持最小效應子功能。修飾或消除效應子功能之方法為業內所熟知，且包括(但不限於)消除負責效應子功能之Fc區之全部或一部分(即使用呈缺少Fc區之全部或一部分之格式之抗體或抗體片段，例如(但不限於)本文中所闡述且為業內已知之Fab片段、單鏈抗體及諸如此類)；於一或多個胺基酸位置處修飾Fc區以消除效應子功能(Fc結合影響：位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、 382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439)；及改良抗體之糖基化(包括(但不限於)在不容許野生型哺乳動物糖基化之環境中產生抗體、自已糖基化之抗體去除一或多種碳水化合物基團及於一或多個胺基酸位置處(包括(但不限於)N297G及N297A)修飾抗體以消除抗體於彼等位置處糖基化之能力)。
抗體「補體激活」功能或抗體之使「補體途徑激活」成為可能或誘發「補體途徑激活」之性質可互換使用，且係指抗體之參與或刺激個體中免疫系統之補體途徑之彼等生物活性。該等活性包括(例如)C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)，且可由抗體之Fc部分及非Fc部分介導。修飾或消除補體激活功能之方法為業內所熟知，且包括(但不限於)消除負責補體激活之Fc區之全部或一部分(即使用呈缺少Fc區之全部或一部分之格式之抗體或抗體片段，例如(但不限於)本文中所闡述且未業內已知之Fab片段、單鏈抗體及諸如此類，或於一或多個胺基酸位置處修飾Fc區以消除或減小與補體組份之相互作用或激活補體組份之能力，例如已知C1q結合中所涉及之位置270、322、329及321)，及修飾或消除負責補體激活之非Fc區之一部分(即於位置132處修飾CH1區(例如參見Vidarte等人，(2001)J.Biol.Chem.276(41)：38217-38223))。
視抗體重鏈之恆定結構域之胺基酸序列而定，可將全長抗體歸類為不同「類別」。全長抗體主要有五類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將該等中之若干個類別進一步劃分成「亞類」(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。與不同抗體類別相對應之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同免疫球蛋白類別之亞單位結構及三維構型為吾人所熟知。
本文中所使用之術語「重組抗體」係指如下抗體(例如嵌合、人類化或人類抗體或其抗原結合片段)：其由包含編碼該抗體之核酸之 重組宿主細胞表現。用於產生重組抗體之「宿主細胞」之實例包括：(1)哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤細胞(包括Y0及NS0細胞)、幼倉鼠腎(BHK)Hela及Vero細胞；(2)昆蟲細胞，例如sf9、sf21及Tn5；(3)植物細胞，例如屬於菸草屬(genus Nicotiana)(例如菸草(Nicotiana tabacum))之植物；(4)酵母細胞，例如屬於酵母菌屬(genus Saccharomyces)(例如釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae))或麴菌屬(genus Aspergillus)(例如黑麴菌(Aspergillus niger))之彼等；(5)細菌細胞，例如大腸桿菌(Escherichia coli)細胞或枯草桿菌(Bacillus subtilis)細胞等。
本文中所使用之「特異性結合」(「specifically binding」或「binds specifically to」)係指選擇性或優先結合至抗原之抗體。通常使用標準分析(例如斯卡查德分析)或表面電漿子共振技術(例如使用BIACORE®)測定結合親和力。
與參照抗體一樣「結合至同一表位之抗體」係指在競爭分析中以50%或更多阻斷該參照抗體結合至其抗原之抗體，且相反地，該參照抗體在競爭分析中以50%或更多阻斷該抗體結合至其抗原。在一實施例中，抗BACE1抗體結合至由YW412.8.31結合之BACE1表位。
本文中所使用之術語「細胞毒性劑」係指可抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32及Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺蝶呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如核分解酶；抗生 素；毒素，例如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體。
「有效量」之藥劑(例如醫藥調配物)係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「Fc區」在本文中係用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分之C端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至該重鏈之羧基端。然而，該Fc區之C端離胺酸(Lys447)可或可不存在。除非本文中另有說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)進行，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所闡述。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基以外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由以下四個FR結構域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「免疫偶聯物」係與一或多種異源分子(包括(但不限於)標記或細胞毒性劑)偶聯之抗體。視情況該偶聯係經由連接體。
本文中所使用之「連接體」係將抗BBB-R抗體共價或非共價聯結至異源分子之結構。在某些實施例中，連接體係肽。在其他實施例中，連接體係化學連接體。
「標記」係與本文中之抗體偶合並用於檢測或成像之標記物。該等標記之實例包括：放射性標記、螢光團、發色團或親和力標籤。在一實施例中，該標記係用於醫學成像之放射性標記，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧- 17、釓、錳、鐵等。
「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類(例如人類及非人類靈長類，例如猴)、兔及齧齒類(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個體為人類。
「經分離」抗體係已自其天然環境之組份分離之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由(例如)電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)方法所測定。關於評估抗體純度之方法之綜述，參見(例如)Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
術語「包裝插頁」係用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明，其含有有關適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該等治療產品使用之警告的資訊。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其係呈容許含於其中之活性成份之生物活性有效之形式，且其不含對投與該調配物之個體具有不可接受之毒性之額外組份。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份以外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文中所使用之「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「治療(treat或treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然過程之臨床干預，且可出於預防目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明抗體係用於延緩疾病發育或減緩疾病進展。
II.組合物及方法 A. BBB-R抗體及其偶聯物之產生
本發明之製造方法及物件使用或納入與BBB-R結合之抗體。用於產生或篩選抗體之BBB-R抗原可係(例如)含有期望表位之BBB-R之可溶形式或其部分(例如細胞外結構域)。或者或另外，於其細胞表面表現BBB-R之細胞可用於生成或篩選抗體。熟習此項技術者將易知可用於生成抗體之BBB-R之其他形式及呈遞。BBB-R之實例在本文中包括轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF-R)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)及LRP8等、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
根據本發明，基於本文中之數據選擇「低親和力」抗BBB-R(例如抗TfR)抗體，該等數據證明該抗體展示改善CNS(例如腦)吸收。為鑑別該等低親和力抗體，可用各種分析量測抗體親和力，包括(但不限於)：斯卡查德分析及表面電漿子共振技術(例如使用BIACORE®)。根據本發明之一實施例，該抗體對BBB-R抗原(例如對TfR)具有約5nM、或約20nM、或約100nM、至約50μM、或至約30μM、或至約10μM、或至約1μM、或至約500nM之親和力。因此，該親和力可在約5nM至約50μM之範圍內、或在約20nM至約30μM之範圍內、或在約30nM至約30μM之範圍內、或在約50nM至約1μM之範圍內、或在約100nM至約500nM之範圍內，例如如藉由斯卡查德分析或BIACORE®量測。在本發明之另一實施例中，該抗體自BBB-R抗原(例如對於TfR)具有小於1分鐘、小於2分鐘、小於3分鐘、小於4分鐘、小於5分鐘、或小於10分鐘至約20分鐘或至約30分鐘之解離半衰期，如藉由競爭結合分析或BIACORE®量測。
因此，本發明提供製造用於跨越血腦屏障運送神經性病症藥物之抗體之方法，該方法包含自一組抗體選擇抗血腦屏障受體(BBB-R) 之抗體，此乃因其對BBB-R具有在約5nM、或約20nM、或約100nM、至約50μM、或至約30μM、或至約10μM、或至約1μM、或至約500mM之範圍內之親和力。因此，該親和力可係在約5nM至約50μM之範圍內、或在約20nM至約30μM之範圍內、或在約30nM至約30μM之範圍內、或在約50nM至約1μM之範圍內、或在約100nM至約500nM之範圍內，例如如藉由斯卡查德分析或BIACORE®量測。如熟習此項技術者所瞭解，若抗體為多特異性的且具有一或多個結合至與該抗體之原始標靶不同之抗原之臂，則將異源分子/化合物與抗體偶聯常將因(例如)空間位阻或甚至一結合臂之消除而降低該抗體對其標靶之親和力。在一實施例中，本發明之對與BACE1偶聯之TfR具有低親和力之抗體對TfR具有約30nM之Kd，如藉由BIACORE量測。在另一實施例中，本發明之對與BACE1偶聯之TfR具有低親和力之抗體對TfR具有約600nM之Kd，如藉由BIACORE量測。在另一實施例中，本發明之對與BACE1偶聯之TfR具有低親和力之抗體對TfR具有約20μM之Kd，如藉由BIACORE量測。在另一實施例中，本發明之對與BACE1偶聯之TfR具有低親和力之抗體對TfR具有約30μM之Kd，如藉由BIACORE量測。
評價抗體親和力之一實例性分析係藉由斯卡查德分析。例如，可使用乳過氧化酶方法使所關注之抗BBB-R抗體碘化(Bennett及Horuk,Methods in Enzymology 288第134-148頁(1997))。藉由凝膠過濾使用NAP-5管柱及其所量測之特異性活性自游離125I-Na純化放射性標記之抗BBB-R抗體。將50μL含有固定濃度之經碘化抗體及漸減濃度之連續稀釋之未經標記之抗體的競爭反應混合物置於96孔板中。在37℃及5% CO2下於生長培養基中培養瞬時表現BBB-R之細胞，該等生長培養基由補充有10% FBS、2mM L-麩醯胺酸及1×青黴素-鏈黴素之杜貝克氏改良伊氏培養基(Dulbecco’s modified eagle’s medium， DMEM)(Genentech)組成。使用Sigma細胞解離溶液將細胞自培養皿脫離，並用結合緩衝液(具有1%牛血清白蛋白、50mM HEPES、pH 7.2及0.2%疊氮化鈉之DMEM)洗滌。將經洗滌細胞以200,000個細胞存於0.2mL結合緩衝液中之近似密度添加至含有50μL競爭反應混合物之96孔板中。未經標記之抗體在與細胞之競爭反應中之最終濃度有所變化，於1000nM下開始且然後藉由1：2倍稀釋降低獲得10個濃度且包括零添加之僅緩衝液樣品。一式三份分析每一濃度之未經標記之抗體與細胞之競爭反應。在室溫下將與細胞之競爭反應培育2小時。2小時培育後，將競爭反應轉移至濾板，並用結合緩衝液洗滌四次，以自所結合之經碘化抗體分離出來。藉由γ計數器計數過濾器，且使用Munson及Rodbard(1980)之測定抗體結合親和力之擬合算法評價結合數據。
可如下實施使用本發明組合物之實例性標準分析。使用乳過氧化酶方法(Bennett及Horuk,Methods in Enzymology 288第134-148頁(1997))使抗TFRA碘化。藉由凝膠過濾使用NAP-5管柱自游離125I-Na純化放射性標記之抗TFRA；經純化抗TFRA具有19.82μCi/μg之特異性活性。將50μL含有固定濃度之經碘化抗體及漸減濃度之連續稀釋之未經標記之抗體的競爭反應混合物置於96孔板中。在37℃及5% CO2下於生長培養基中培養293個瞬時表現鼠類TfR之細胞，該等生長培養基由補充有10% FBS、2mM L-麩醯胺酸及1×青黴素-鏈黴素之杜貝克氏改良伊氏培養基(DMEM)(Genentech)組成。使用Sigma細胞解離溶液將細胞自培養皿脫離，並用結合緩衝液(具有1%牛血清白蛋白、50mM HEPES、pH 7.2及0.2%疊氮化鈉之DMEM)洗滌。將經洗滌細胞以200,000個細胞存於0.2mL結合緩衝液中之近似密度添加至含有50μL競爭反應混合物之96孔板中。經碘化抗體在每一與細胞之競爭反應中之最終濃度係100pM(134,000cpm/0.25mL)。未經標記之抗體在與細胞之競爭反應中之最終濃度有所變化，於1000nM下起始且然後對於 10個濃度以1：2倍稀釋度降低且包括零添加之僅緩衝液之樣品。一份三式分析每一濃度之未經標記之抗體與細胞之競爭反應。在室溫下將與細胞之競爭反應培育2小時。2小時培育後，將競爭反應轉移至Millipore Multiscreen濾板，並用結合緩衝液洗滌四次，以自所結合之經碘化抗體分離出來。於Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences；Waltham，MA)上計數過濾器。使用New Ligand軟體(Genentech)評價結合數據，該軟體使用Munson及Rodbard(1980)之測定抗體結合親和力之擬合算法。
可如下實施使用本發明組合物之實例性BIACORE®分析。在25℃下使用表面電漿子共振分析、使用BIACORE®-2000(BIAcore公司，Piscataway，NJ)並使用抗人類Fc套組(BiAcore公司，Piscataway，NJ)量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，利用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.0)稀釋抗人類Fc抗體，達50μg/ml，然後以5μl/分鐘之流速注射，以達成大約10000個反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗體後，注射1M乙醇胺以阻斷未經反應基團。對於動力學量測，將單特異性或多特異性抗TfR抗體變體注射於HBS-P中，以達到約220RU，然後在25℃下以大約30μl/min之流速將MuTfR-His之兩倍連續稀釋液(0.61nM至157nM)注射於HBS-P中。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評價軟體3.2版本)藉由同時擬合締合感測圖及解離感測圖來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。將平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。例如參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。
根據另一實施例，在25℃下使用表面電漿子共振分析、利用BIACORE®-2000裝置(BIAcore公司，Piscataway，NJ)並使用抗人類 Fc套組(BiAcore公司，Piscataway，NJ)量測Kd。簡言之，根據供應商說明書，利用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.0)稀釋抗人類Fc抗體，達50μg/ml，然後以5μl/分鐘之流速注射，以達成大約10000個反應單位(RU)之偶合蛋白。在注射抗體後，注射1M乙醇胺以阻斷未經反應基團。對於動力學量測，將抗BBB-R抗體變體注射於HBS-P中，以達到約220 RU，然後在25℃下以大約30μl/min之流速將BBB-R-His之兩倍連續稀釋液(0.61nM至157nM)注射於HBS-P中。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE ®評價軟體3.2版本)藉由同時擬合締合感測圖及解離感測圖來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。將平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。例如參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。
一或多種抗體對BBB-R之親和力之替代量測係其半數最大抑制性濃度(IC50)，即以50%抑制已知BBB-R配體與BBB-R結合所需要之抗體量之量度。若干測定指定化合物之IC50之方法為業內已知；常用方法係實施競爭結合分析，例如本文中於實例中所闡述者，即參照圖1A。一般而言，高IC50指示抑制已知配體之結合需要更多之抗體，且從而指示該抗體對彼配體之親和力相對較低。相反地，低IC50指示抑制已知配體之結合需要較少之抗體，且從而指示該抗體對彼配體之親和力相對較高。
量測IC50之實例性競爭性ELISA分析係其中使用漸增濃度之抗TfR或抗TfR/腦抗原(即抗TfR/BACE1、抗TfR/Aβ及諸如此類)變體抗體針對經生物素化TfRA競爭結合至TfR之分析。在4℃下，於塗覆有2.5μg/ml存於PBS中之經純化鼠類TfR細胞外結構域之Maxisorp板(Neptune,N.J.)中實施抗TfR競爭ELISA，過夜。將板用PBS/0.05%吐 溫20(Tween 20)洗滌，並使用存於PBS中之Superblock阻斷緩衝液(Thermo Scientific,Hudson,NH)阻斷。將每一個別抗TfR或抗TfR/腦抗原(即抗TfR/BACE1或抗TfR/Aβ)之滴定(1：3連續稀釋)與經生物素化抗TfRA(0.5nM最終濃度)組合，並在室溫下添加至該板1小時。用PBS/0.05%吐溫20洗滌各板，且在室溫下將HRP-鏈黴抗生物素(Southern Biotech,Birmingham)添加至該板，並培育1小時。用PBS/0.05%吐溫20洗滌各板，且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)檢測結合至該板之經生物素化抗TfRA。
在一實施例中，將本文中之低親和力抗BBB-R抗體與標記及/或神經性病症藥物或顯像劑偶合，以更有效地跨越BBB運送該標記及/或藥物或顯像劑。可藉由化學交聯劑或藉由生成融合蛋白等來達成該偶合。
共價偶聯可直接進行或經由連接體。在某些實施例中，直接偶聯係藉由構築蛋白質融合物(即藉由兩種編碼BBB-R抗體及神經性病症藥物之基因之遺傳融合及表現為單一蛋白質)進行。在某些實施例中，直接偶聯係藉由在抗BBB-R抗體之兩個部分中之一者上之反應性基團與神經性藥物上之相應基團或受體之間形成共價鍵進行。在某些實施例中，直接偶聯係藉由修飾(即遺傳修飾)欲偶聯之兩種分子中之一者以包括在適當條件下形成至欲偶聯之另一分子之共價附接的反應性基團(作為非限制性實例，巰基或羧基)進行。作為一非限制性實例，可將具有期望反應性基團(即半胱胺酸殘基)之分子(即胺基酸)引入至(例如)抗BBB-R抗體中，且與神經性藥物形成二硫鍵。核酸與蛋白質共價偶聯之方法亦為業內所已知(即光交聯，例如參見Zatsepin等人，Russ.Chem.Rev.74：77-95(2005))。非共價偶聯可藉由任何非共價附接方式進行，包括疏水鍵、離子鍵、靜電相互作用及諸如此類，如熟習此項技術者所容易瞭解。亦可使用各種連接體實施偶聯。例 如，抗BBB-R抗體及神經性藥物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑來偶聯，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。亦可使用肽連接體，其由1個至20個藉由肽鍵鏈接之胺基酸組成。在某些該等實施例中，該等胺基酸係選自20個天然存在之胺基酸。在某些其他該等實施例中，該等胺基酸中之一或多者係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及離胺酸。該連接體可係有助於在遞送至腦後釋放神經性藥物之「可裂解連接體」。例如，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含二硫鍵之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明在本文中明確地涵蓋(但不限於)使用包括(但不限於)以下之交聯體試劑製備之偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑市面有售(例如，購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.，U.S.A)。
對於神經病變病症，可選擇為止痛劑之神經性藥物，其包括(但不限於)***/類鴉片止痛劑(即嗎啡(morphine)、酚太尼枸椽酸鹽(fentanyl)、氫可酮(hydrocodone)、嘜啶(meperidine)、持殺酮(methadone)、氧化嗎啡酮(oxymorphone)、鎮痛新(pentazocine)、丙氧 酚(propoxyphene)、特拉嗎竇(tramadol)、可待因(codeine)及羥考酮(oxycodone))、非類固醇抗炎藥物(NSAID)(即布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、待克菲那(diclofenac)、二氟尼柳(diflunisal)、依託度酸(etodolac)、非諾洛芬(fenoprofen)、夫比普洛芬(flurbiprofen)、引朵美灑辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、奧沙普嗪(oxaprozin)、吡羅昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)及托美丁(tolmetin))、皮質類固醇(即可體松(cortisone)、普賴松(prednisone)、去氫皮質醇(prednisolone)、***(dexamethasone)、甲基去氫皮質醇及去炎松(triamcinolone))、抗偏頭痛劑(即舒馬曲普汀(sumatriptin)、阿莫曲普坦(almotriptan)、夫羅曲普坦(frovatriptan)、舒馬曲普坦(sumatriptan)、利紮曲普坦(rizatriptan)、依來曲普坦(eletriptan)、佐米曲普坦(zolmitriptan)、雙氫麥角胺(dihydroergotamine)、依來曲普坦及麥角胺)、乙醯胺苯酚、水楊酸鹽(即阿司匹林(aspirin)、水楊酸膽鹼、水楊酸鎂、二氟尼柳及雙水楊酯)、抗發厥藥(即卡巴馬平(carbamazepine)、氯硝西泮(clonazepam)、加巴潘汀(gabapentin)、樂命達(lamotrigine)、普瑞巴林(pregabalin)、噻加賓(tiagabine)及妥泰(topiramate))、麻醉劑(即異氟烷、三氯乙烯、鹵神、七氯烷(sevoflurane)、對胺苯甲酸乙酯(benzocaine)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、古柯鹼(***e)、環美卡因(cyclomethycaine)、二甲卡因(dimethocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)、普魯卡因(procaine)、奴佛卡因(novocaine)、丙美卡因(proparacaine)、四卡因(tetracaine)、阿替卡因(articaine)、布比卡因(bupivacaine)、卡替卡因(carticaine)、辛***(cinchocaine)、依替卡因(etidocaine)、左布比卡因(levobupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、匹派魯卡因(piperocaine)、丙胺卡因 (prilocaine)、羅哌卡因(ropivacaine)、三甲卡因(trimecaine)、蛤蚌毒素(saxitoxin)及河豚毒素(tetrodotoxin))及cox-2抑制劑(即塞來昔布(celecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)及戊地昔布(valdecoxib))。對於涉及眩暈之神經病變病症，可選擇為抗眩暈劑之神經性藥物，其包括(但不限於)氯苯甲嗪(meclizine)、苯海拉明(diphenhydramine)、普敏太定(promethazine)及煩寧(diazepam)。對於涉及噁心之神經病變病症，可選擇為抗噁心劑之神經性藥物，其包括(但不限於)普敏太定、氯丙嗪(chlorpromazine)、普魯氯嗪(prochlorperazine)、三甲氧苯紮胺(trimethobenzamide)及甲氧氯普胺(metoclopramide)。對於神經變性疾病，可選擇為生長激素或神經滋養因子之神經性藥物；實例包括(但不限於)腦衍生神經滋養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經滋養蛋白-4/5、纖維母細胞生長因子(FGF)-2及其他FGF、神經滋養蛋白(NT)-3、紅血球生成素(EPO)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉變生長因子(TGF)-α、TGF-β、血管內皮生長因子(VEGF)、介白素-1受體拮抗劑(IL-1ra)、睫狀神經滋養因子(CNTF)、神經膠細胞源神經滋養因子(GDNF)、神經秩蛋白(neurturin)、血小板源生長因子(PDGF)、神經分化因子(heregulin)、神經調節蛋白、阿特米斯(artemin)、珀賽芬(persephin)、介白素、神經膠細胞系源神經滋養因子(GFR)、粒細胞群落刺激因子(CSF)、粒細胞-巨噬細胞-CSF、神經導向因子(netrin)、心肌營養因子-1(cardiotrophin-1)、刺蝟蛋白(hedgehog)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子、多效生長因子、骨形態演發蛋白(BMP)、神經導向因子、鞘脂激活蛋白(saposin)、信號素(semaphorin)及幹細胞因子(SCF)。
對於癌症，可選擇為化學治療劑之神經性藥物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，例如噻替哌(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；烷基磺酸鹽，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒 凡(piposulfan)；氮丙啶類，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基蜜胺；番荔枝內酯(acetogenin)(尤其為布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫***酚(屈***酚，MARINOL®)；β-拉杷醌(beta-lapachone)；拉帕酚(lapachol)；秋水仙鹼；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan，HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR®)、乙醯基喜樹鹼、莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利抑制素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡澤來新(carzelesin)及比澤來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxine)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；克利特非辛(cryptophycin)(尤其為克利特非辛1及克利特非辛8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、鹽酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法蘭、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥膽甾醇酯(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀 (ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I and卡奇黴素ΩI1(例如參見Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)、包括達內黴素A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素發色團(neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉黴素(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(包括嗎啉基-多柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及去氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(例如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如甲胺蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、甲胺蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷 (floxuridine)；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺素，例如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸；乙醯葡醛酸內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百思布希(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美坦辛(maytansinoid)，例如美坦辛(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴托他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多糖複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細格孢氮雜酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；新月毒素(尤其T-2毒素、黏液菌素A(verracurin A)、桿孢菌素(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶薩托辛(gacytosine)；***糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替哌；紫杉烷(taxoid)，例如TAXOL®紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、紫杉醇之不含Cremophor之經白蛋白改造之奈米顆粒調配物ABRAXANETM(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)及TAXOTERE®多西紫杉醇(doxetaxel)(Rhône-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺蝶呤；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(VELBAN®)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼(ONCOVIN®)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；甲醯四氫葉酸(leucovovin)；長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE®)；諾安托(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基蝶呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視色素，例如視網酸；卡培他濱(capecitabine)(XELODA®)；以上中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上中之兩者或更多者之組合，例如CHOP，即環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及去氫皮質醇之組合療法之縮寫，及FOLFOX，即使用奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸之組合之治療方案之縮寫。
化學治療劑之此定義亦包括對能促進癌生長之激素的效應具有調控、降低、阻斷或抑制作用且常呈系統性或全身性治療形式之抗激素劑。其可為激素本身。實例包括抗***及選擇性***受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®他莫昔芬)、EVISTA®雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、鹽酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON®托瑞米芬(toremifene)；抗黃體酮(anti-progesterone)；***受體下調劑(ERD)；用於抑制或關閉卵巢之藥劑，例如黃體成長激素釋放激素 (LHRH)激動劑，例如LUPRON®及ELIGARD®乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲普瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；及抑制芳香酶之芳香酶抑制劑，其調控腎上腺中***之產生，例如4(5)-咪唑類、胺魯米特、MEGASE®乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN®依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR®伏氯唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®阿那曲唑(anastrozole)。另外，化學治療劑之該定義包括雙膦酸鹽類，例如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®)、DIDROCAL®依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、ZOMETA®唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽、FOSAMAX®阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA®帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID®替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其為可抑制涉及異常細胞增殖之信號傳導路徑中之基因表現之彼等，例如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，例如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；及以上中之任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
另一群組可選擇為用於癌症治療或預防之神經性藥物之化合物為抗癌免疫球蛋白(包括(但不限於)曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、貝伐珠單抗、阿侖單抗(alemtuxumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、吉妥珠單抗 奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、帕尼單抗(panitumumab)及利妥昔單抗(rituximab))。在一些情形下，抗體可連同毒性標記或偶聯物一起使用來靶向並殺死期望細胞(即癌症細胞)，包括(但不限於)具有131I放射性標記之托西莫單抗(tositumomab)或曲妥珠單抗依坦辛(trastuzumab emtansine)。
對於眼部疾病或病症，可選擇如下之神經性藥物：抗血管生成眼科藥劑(即貝伐珠單抗、蘭尼單抗(ranibizumab)及哌加他尼(pegaptanib))、眼科青光眼藥劑(即卡巴膽鹼(carbachol)、腎上腺素、地美溴銨(demecarium bromide)、阿可樂定(apraclonidine)、溴莫尼定(brimonidine)、布林唑胺(brinzolamide)、左布諾洛爾(levobunolol)、噻嗎洛爾(timolol)、倍他洛爾(betaxolol)、多佐胺(dorzolamide)、比馬前列素(bimatoprost)、卡替洛爾(carteolol)、美替洛爾(metipranolol)、地匹福林(dipivefrin)、曲伏前列素(travoprost)及拉坦前列素(latanoprost))、碳酸酐酶抑制劑(即醋甲唑胺(methazolamide)及乙醯唑胺(acetazolamide))、眼科抗組胺藥(即萘甲唑啉(naphazoline)、去氧腎上腺素(phenylephrine)及四氫唑啉)、眼部潤滑劑、眼科類固醇(即氟米龍(fluorometholone)、去氫皮質醇、氯替潑諾(loteprednol)、***、二氟潑尼酯(difluprednate)、利美索龍(rimexolone)、膚輕鬆(fluocinolone)、甲羥松(medrysone)及去炎松)、眼科麻醉劑(即利多卡因、丙美卡因及四卡因)、眼科抗感染劑(即左氧氟沙星(levofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、氯黴素(chloramphenicol)、桿菌肽(bacitracin)/多黏菌素b(polymyxin b)、磺胺醋醯(sulfacetamide)、妥布黴素(tobramycin)、疊氮紅黴素(azithromycin)、貝西沙星(besifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、正大黴素(gentamicin)、碘苷(idoxuridine)、紅黴素(erythromycin)、那他黴素 (natamycin)、短桿菌肽(gramicidin)、新黴素(neomycin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲氟尿苷(trifluridine)、更昔洛韋(ganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine))、眼科抗炎劑(即奈帕芬胺(nepafenac)、酮咯酸、夫比普洛芬、舒洛芬(suprofen)、環孢素(cyclosporine)、去炎松、待克菲那及溴芬酸(bromfenac))及眼科抗組胺藥或去充血劑(即(ketotifen)、奧洛他定(olopatadine)、依匹斯汀(epinastine)、萘甲唑啉、色甘酸(cromolyn)、四氫唑啉、吡嘧司特(pemirolast)、貝他斯汀(bepotastine)、萘甲唑啉、去氧腎上腺素、奈多羅米(nedocromil)、洛度沙胺(lodoxamide)、去氧腎上腺素、依美斯汀(emedastine)及氮卓斯汀(azelastine))。
對於癲癇發作病症，可選擇為抗痙攣劑或抗癲癇劑之神經性藥物，包括(但不限於)巴比妥鹽(barbiturate)抗痙攣劑(即撲米酮(primidone)、美沙比妥(metharbital)、甲苯比妥(mephobarbital)、阿洛巴比妥(allobarbital)、異戊巴比妥(amobarbital)、阿普比妥(aprobarbital)、苯烯比妥(alphenal)、巴比妥(barbital)、溴烯比妥(brallobarbital)及***(phenobarbital))、苯并二氮呯抗痙攣劑(即煩寧、氯硝西泮及勞拉西泮(lorazepam))、胺基甲酸酯抗痙攣劑(即非爾胺酯(felbamate))、碳酸酐酶抑制劑抗痙攣劑(即乙醯唑胺(acetazolamide)、妥泰及唑尼沙胺(zonisamide))、二苯并氮卓(dibenzazepine)抗痙攣劑(即盧非醯胺(rufinamide)、卡巴馬平及奧卡西平(oxcarbazepine))、脂肪酸衍生物抗痙攣劑(即雙丙戊酸鈉(divalproex)及丙戊酸(valproic acid))、γ-胺基丁酸類似物(即普瑞巴林、加巴潘汀及胺己烯酸(vigabatrin))、γ-胺基丁酸再吸收抑制劑(即噻加賓)、γ-胺基丁酸轉胺酶抑制劑(即胺己烯酸)、乙內醯脲抗痙攣劑(即苯妥英(phenytoin)、乙苯妥英(ethotoin)、磷苯妥英(fosphenytoin)及美芬妥英(mephenytoin))、其他抗痙攣劑(即拉科醯胺(lacosamide)及 硫酸鎂)、孕激素(即孕酮(progesterone))、噁唑啶二酮抗痙攣劑(即甲乙雙酮(paramethadione)及三甲雙酮(trimethadione))、吡咯啶抗痙攣劑(即左乙拉西坦(levetiracetam))、琥珀醯亞胺抗痙攣劑(即乙琥胺(ethosuximide)及甲琥胺(methsuximide))、三嗪抗痙攣劑(即樂命達)及尿抗痙攣劑(即苯乙醯脲(phenacemide)及苯丁醯脲(pheneturide))。
對於溶酶體貯積病，所選擇之神經性藥物可為在疾病後受損之酶本身或可模擬其活性。用於治療溶酶體貯積病症之重組酶實例包括(但不限於)於(例如)美國專利申請公開案第2005/0142141號中所闡釋之彼等(即α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡糖苷酶、N-乙醯基-半乳糖胺-6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、β-葡醣醛酸酶、酸性α-葡糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶A、己糖胺酶A、酸性神經鞘磷脂酶、β-半乳糖腦苷脂酶、β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、酸性神經醯胺酶、天冬胺酸醯基酶、棕櫚醯基-蛋白質硫酯酶1及三肽基胺基肽酶1)。
對於類澱粉變性症，可選擇包括(但不限於)以下之神經性藥物：特異性結合至選自以下標靶之抗體或其他結合分子(包括(但不限於)小分子、肽、適配體或其他蛋白質結合劑)：β分泌酶、tau、早老素、類澱粉前體蛋白或其部分、類澱粉β肽或其寡聚物或纖絲、死亡受體6(DR6)、晚期糖基化終產物受體(RAGE)、帕金蛋白及杭丁頓氏蛋白；膽鹼酯酶抑制劑(即加蘭他敏(galantamine)、多奈派齊(donepezil)、利斯的明(rivastigmine)及塔克寧(tacrine))；NMDA受體拮抗劑(即美金剛(memantine))、單胺消耗劑(即丁苯那嗪(tetrabenazine))；甲磺酸雙氫麥角毒(ergoloid mesylate)；抗膽鹼激導性抗帕金森症候群藥劑(即丙環定(procyclidine)、苯海拉明、苯海索(trihexylphenidyl)、苯紮托品(benztropine)、比哌立登(biperiden)及苯海索(trihexyphenidyl))；多巴 胺激導性抗帕金森症候群藥劑(即恩他卡朋(entacapone)、司來吉蘭(selegiline)、普拉克索(pramipexole)、溴隱亭(bromocriptine)、羅替高汀(rotigotine)、司來吉蘭、羅匹尼羅(ropinirole)、雷沙吉蘭(rasagiline)、阿撲嗎啡(apomorphine)、卡比多巴(carbidopa)、左旋多巴(levodopa)、培高利特(pergolide)、托卡朋(tolcapone)及金剛烷胺(amantadine))；丁苯那嗪；抗炎劑(包括(但不限於)非類固醇抗炎藥物(即吲哚美辛(indomethicin)及上文所列示之其他化合物)；激素(即***、孕酮及亮丙瑞林(leuprolide))；維生素(即葉酸及菸醯胺)；地美博林(dimebolin)；高牛磺酸(即3-胺基丙烷磺酸；3APS)；血清素受體活性調節劑(即紮利羅登(xaliproden))；干擾素及糖皮質激素。
對於病毒或微生物疾病，可選擇包括(但不限於)以下之神經性藥物：抗病毒化合物(包括(但不限於)金剛烷抗病毒劑(即金剛烷乙胺(rimantadine)及金剛烷胺)、抗病毒干擾素(即peg干擾素α-2b)、趨化因子受體拮抗劑(即馬拉維諾(maraviroc))、整合酶鏈轉移抑制劑(即雷特格韋(raltegravir))、神經胺酸酶抑制劑(即奧塞米韋(oseltamivir)及紮那米韋(zanamivir))、非核苷逆向轉錄酶抑制劑(即依法韋倫(efavirenz)、依曲韋林(etravirine)、地拉韋啶(delavirdine)及奈韋拉平(nevirapine))、核苷逆向轉錄酶抑制劑(泰諾福韋(tenofovir)、阿巴卡韋(abacavir)、拉米夫定(lamivudine)、齊多夫定(zidovudine)、司他夫定(stavudine)、恩替卡韋(entecavir)、恩曲他濱(emtricitabine)、阿德福韋(adefovir)、紮西他濱(zalcitabine)、喜必福(telbivudine)及去羥肌苷(didanosine))、蛋白酶抑制劑(即達蘆那韋(darunavir)、阿紮那韋(atazanavir)、呋山那韋(fosamprenavir)、替拉那韋(tipranavir)、利托那韋(ritonavir)、奈非那韋(nelfinavir)、胺普那韋(amprenavir)、茚地那韋(indinavir)及沙奎那韋(saquinavir))、嘌呤核苷(即伐昔洛韋(valacyclovir)、泛昔洛韋(famciclovir)、阿昔洛韋(acyclovir)、利巴韋 林(ribavirin)、更昔洛韋、纈更昔洛韋(valganciclovir)及西多福韋(cidofovir))及其他抗病毒劑(即恩夫韋肽(enfuvirtide)、膦甲酸(foscarnet)、帕利珠單抗(palivizumab)及福米韋生(fomivirsen)))、抗生素(包括(但不限於)胺基青黴素(即阿莫西林(amoxicillin)、胺苄西林(ampicillin)、苯唑西林(oxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯唑西林(dicloxacillin)、氟唑西林(flucoxacillin)、替莫西林(temocillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)及巴胺西林(bacampicillin))、頭孢菌素(即頭孢唑林(cefazolin)、頭孢胺苄(cephalexin)、頭孢噻吩(cephalothin)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢它啶(ceftazidime)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢華定(cephradine)、氯碳頭孢(loracarbef)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢克洛(cefaclor)及頭孢西丁(cefoxitin))、碳青黴烯(carbapenem)/培南(penem)(即亞胺培南(imipenem)、美羅培南(meropenem)、厄它培南(ertapenem)、法羅培南(faropenem)及多尼培南(doripenem))、單醯胺菌素(即胺曲南(aztreonam)、替吉莫南(tigemonam)、諾卡黴素A(norcardicin A)及α,ε-二胺基-β-羥庚二酸-β-內醯胺、β-內醯胺酶抑制劑(即克拉維酸(clavulanic acid)、他唑巴坦(tazobactam)及舒巴克坦(sulbactam))連同另一β-內醯胺抗生素、胺基糖苷(即阿米卡星(amikacin)、正大黴素、卡那黴素(kanamycin)、新黴素、奈替米星(netilmicin)、鏈黴素、妥布黴素及巴龍黴素(paromomycin))、安沙黴素(ansamycin)(即格爾德黴素(geldanamycin)及除莠黴素(herbimycin))、碳頭孢烯(carbacephem)(即氯碳頭孢)、糖肽(即替考拉寧(teicoplanin)及萬古黴素(vancomycin))、巨環內酯(即疊氮紅黴素、克拉黴素(clarithromycin)、 地紅黴素(dirithromycin)、紅黴素、羅紅黴素(roxithromycin)、醋竹桃黴素(troleandomycin)、泰利黴素(telithromycin)及觀黴素(spectinomycin))、單醯胺菌素(即胺曲南)、喹諾酮(即環丙沙星、依諾沙星(enoxacin)、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(trovafloxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)及替馬沙星(temafloxacin))、磺醯胺(即磺胺米隆(mafenide)、磺醯胺基柯衣定(sulfonamidochrysoidine)、磺胺醋醯、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、磺胺(sulfanilamide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、磺胺異噁唑、甲氧苄啶(trimethoprim)、甲氧苄啶及(sulfamethoxazole))、四環素(即四環素、地美環素(demeclocycline)、多西環素(doxycycline)、米諾環素(minocycline)及土黴素(oxytetracycline))、抗惡性腫瘤劑或細胞毒性抗生素(即多柔比星、米托蒽醌、博來黴素(bleomycin)、柔紅黴素、放線菌素D、表柔比星、伊達比星、普利黴素(plicamycin)、絲裂黴素(mitomycin)、噴司他汀(pentostatin)及戊柔比星(valrubicin))及其他抗細菌化合物(即桿菌肽、黏菌素及多黏菌素B))、抗真菌劑(即甲硝唑(metronidazole)、硝唑尼特(nitazoxanide)、替硝唑(tinidazole)、氯喹(chloroquine)、雙碘喹啉(iodoquinol)及巴龍黴素)及殺寄生蟲劑(包括(但不限於)奎寧(quinine)、氯喹、阿莫地喹(amodiaquine)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、周效磺胺(sulphadoxine)、氯胍(proguanil)、甲氟喹(mefloquine)、阿托伐醌(atovaquone)、伯胺喹啉(primaquine)、青蒿素(artemesinin)、鹵泛群(halofantrine)、多西環素(doxycycline)、克林黴素(clindamycin)、甲苯達唑(mebendazole)、雙羥萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)、噻苯噠唑(thiabendazole)、乙胺嗪(diethylcarbamazine)、伊維菌素(ivermectin)、利福平(rifampin)、兩性黴素B(amphotericin B)、美拉胂醇(melarsoprol)、依氟鳥胺酸(efornithine)及阿苯達唑(albendazole))。
對於局部缺血，可選擇包括(但不限於)以下之神經性藥物：血栓溶解劑(即尿激酶、阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)及替奈普酶(tenecteplase))、血小板聚集抑制劑(即阿司匹林、西洛他唑(cilostazol)、氯格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)及雙嘧達莫(dipyridamole))、他汀(即洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)及匹伐他汀(pitavastatin))及改善血液流動或血管撓性之化合物，包括(例如)血壓藥。
對於行為障礙，神經性藥物可選自行為改良化合物，包括(但不限於)典型抗精神病藥(即利培酮(risperidone)、奧蘭紮平(olanzapine)、阿立哌唑(apripiprazole)、喹硫平(quetiapine)、帕潘立酮(paliperidone)、阿森奈平(asenapine)、氯紮平(clozapine)、伊洛培酮(iloperidone)及齊拉西酮(ziprasidone))、吩噻嗪抗精神病藥(即普魯氯嗪、氯丙嗪、氟奮乃靜(fluphenazine)、佩吩嗪(perphenazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、硫利噠嗪(thioridazine)及美索達嗪(mesoridazine))、噻噸(即胺碸噻噸(thiothixene))、其他抗精神病藥(即匹莫齊特(pimozide)、鋰、嗎茚酮(molindone)、氟哌啶醇(haloperidol)及洛沙平(loxapine))、選擇性血清素再吸收抑制劑(即西酞普蘭(citalopram)、依地普蘭(escitalopram)、帕羅西汀(paroxetine)、氟伏沙明(fluoxetine)及舍曲林(sertraline))、血清素-去甲腎上腺素再吸收抑制劑(即杜洛西汀(duloxetine)、文拉法辛(venlafaxine)、去甲文拉法辛(desvenlafaxine)、三環類抗抑鬱藥(即多塞平(doxepin)、氯米帕明(clomipramine)、阿莫沙平(amoxapine)、去甲替林(nortriptyline)、阿 米替林(amitriptyline)、曲米帕明(trimipramine)、丙米嗪(imipramine)、普羅替林(protriptyline)及地昔帕明(desipramine))、四環類抗抑鬱藥(即米氮平(mirtazapine)及馬普替林(maprotiline))、苯基六氫吡嗪抗抑鬱藥(即曲唑酮(trazodone)及萘法唑酮(nefazodone))、單胺氧化酶抑制劑(即異卡波肼(isocarboxazid)、苯乙肼(phenelzine)、司來吉蘭及反苯環丙胺(tranylcypromine))、苯并二氮呯(即阿普唑侖(alprazolam)、艾司唑侖(estazolam)、氟胺安定(flurazeptam)、氯硝西泮、勞拉西泮及煩寧)、去甲腎上腺素-多巴胺再吸收抑制劑(即安非它酮(bupropion))、CNS刺激劑(即芬特明(phentermine)、安非拉酮(diethylpropion)、甲基***(methamphetamine)、右***(dextroamphetamine)、***(amphetamine)、甲基芬尼定(methylphenidate)、右哌甲酯(dexmethylphenidate)、賴右***(lisdexamfetamine)、莫達非尼(modafinil)、匹莫林(pemoline)、苯甲曲秦(phendimetrazine)、苄哌立隆(benzphetamine)、苯甲曲秦、阿莫達非尼(armodafinil)、安非拉酮、咖啡因(caffeine)、阿托西汀(atomoxetine)、多沙普侖(doxapram)及(馬吲哚mazindol))、抗焦慮藥/鎮靜藥/***(包括(但不限於)巴比妥鹽(即司可巴比妥(secobarbital)、***及甲苯比妥)、苯并二氮呯(如上文所述)、及其他抗焦慮藥/鎮靜藥/***(即苯海拉明、羥丁酸鈉(sodium oxybate)、紮來普隆(zaleplon)、羥嗪(hydroxyzine)、氯醛(chloral hydrate)、佐必登(aolpidem)、丁螺環酮(buspirone)、多塞平、左旋佐匹克隆(eszopiclone)、雷美爾通(ramelteon)、美普巴邁(meprobamate)及乙氯戊烯炔醇(ethclorvynol)))、胰泌素(例如參見Ratliff-Schaub等人Autism 9：256-265(2005))、類鴉片肽(例如參見Cowen等人，J.Neurochem.89：273-285(2004))及神經肽(例如參見Hethwa等人Am.J.Physiol.289：E301-305(2005))。
對於CNS炎症，可選擇解決炎症本身之神經性藥物(即非類固醇抗炎劑，例如布洛芬或萘普生)或治療炎症之根本原因者(即抗病毒或抗癌症劑)。
根據本發明之一實施例，藉由生成多特異性抗體(例如雙特異性抗體)達成「偶合」。多特異性抗體係對至少兩種不同抗原或表位具有結合特異性之單株抗體。在一實施例中，該多特異性抗體包含結合BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點，例如β-分泌酶1(BACE1)或Aβ及本文中所揭示之其他腦抗原。
該多特異性/雙特異性抗體結合之實例性腦抗原係BACE1，且結合至其之實例性抗體係本文圖9A-B中之YW412.8.31抗體。
在另一實施例中，該腦抗原係Aβ，實例性的該等抗體係闡述於WO2007068412、WO2008011348、WO20080156622及WO2008156621中，該等文獻以引用的方式明確併入本文中，其中實例性Aβ抗體包含含有分別圖11A及11B中之重鏈及輕鏈胺基酸序列之IgG4 MABT5102A抗體。
製造多特異性抗體之技術包括(但不限於)兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如參見美國專利第5,731,168)。亦可藉由以下方式來製造多特異性抗體：改造用於製造抗體Fc-異源二聚體分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩種或更多種抗體或片段交聯(例如參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如參見Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例如參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如參見Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所闡述。
本文亦包括經改造具有三個或更多個功能性抗原結合位點之抗體(包括「章魚抗體」或「雙重可變結構域免疫球蛋白」(DVD))(例如參見US 2006/0025576A1及Wu等人，Nature Biotechnology(2007))。
本文之抗體或片段亦包括包含與BBB-R(例如TfR)及腦抗原(例如BACE1)之抗原結合位點結合之「雙重作用之FAb」或「DAF」(例如參見US 2008/0069820)。
在一實施例中，該抗體係抗體片段，各種該等片段係揭示於上文中。在另一實施例中，該抗體係完整或全長抗體。視其重鏈恆定結構域之胺基酸序列而定，可將其歸類為不同類別。存在5個主要類別之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將該等類別中若干類別進一步劃分成亞類(同型物)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。與不同抗體類別相對應之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同免疫球蛋白類別之亞單位結構及三維構型為吾人所熟知。在一實施例中，該完整抗體缺少效應子功能。在另一實施例中，該完整抗體具有減少之效應子功能。
生成抗體之技術為已知，且實例係提供於上文此文件之定義部分中。在一實施例中，該抗體係嵌合、人類化或人類抗體或其抗原結合片段。
可用各種技術測定抗體至BBB-R之結合。一種該分析係用於證實結合至人類BBB-R(及腦抗原)之能力之酶聯免疫吸附分析(ELISA)。根據此分析，將塗覆有抗原(例如重組BBB-R)之板與包含抗BBB-R抗體之樣品一起培育，且測定該抗體至所關注抗原之結合。
在一態樣中，藉由(例如)已知方法(例如ELISA、西方墨點等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
可如實例中所揭示或如針對所關注之抗CNS抗原抗體所已知實施評價全身投與之抗體之吸收及該抗體之其他生物活性的分析。
現在將闡述多特異性抗體結合BACE1之實例性分析。
可使用競爭分析鑑別與本文中所闡述之抗BACE1抗體或Fab(例如用於結合至BACE1之YW412.8、YW412.8.31、YW412.8.30、YW412.8.2、YW412.8.29、YW412.8.51、Fab12、LC6、LC9、LC10)中之任一者競爭之抗體。在某些實施例中，此一競爭抗體結合至由本文中所闡述之抗BACE1抗體或Fab(例如YW412.8、YW412.8.31、YW412.8.30、YW412.8.2、YW412.8.29、YW412.8.51、Fab12、LC6、LC9、LC10)中之一者結合之同一表位(例如線性或構象表位)。用於定位抗體結合之表位之詳細實例性方法係提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」(於Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中)中。
在實例性競爭分析中，於包含結合至BACE1之第一經標記抗體(例如YW412.8、YW412.8.31、YW412.8.30、YW412.8.2、YW412.8.29、YW412.8.51、Fab12、LC6、LC9、LC10)及測試與第一抗體競爭結合至BACE1之能力之第二未經標記抗體的溶液中培育經固定化BACE1。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，於包含第一經標記抗體而不包含第二未經標記抗體之溶液中培育經固定化BACE1。在容許第一抗體結合至BACE1之條件下培育後，去除過量未經結合抗體，且量測與經固定化BACE1結合之標記量。若相對於對照樣品，與經固定化BACE1結合之標記量在測試樣品中實質上減少，則此指示第二抗體競爭與第一抗體競爭結合至BACE1。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
在一態樣中，提供用於鑒定其具有生物活性之抗BACE1抗體之分析。生物活性可包括(例如)抑制BACE1天冬胺醯基蛋白酶活性。亦提供活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體，例如如藉由均相時間解析螢光HTRF分析或微射流毛細管電泳(MCE)分析並使用合成受質肽或在活體內於表現BACE1受質(例如APP)之細胞系中評價。
本文之抗體(包括多特異性抗體)視情況係於利用編碼其重鏈及/或輕鏈之核酸序列轉變之宿主細胞(例如其中已藉由一或多種載體利用本文之核酸轉變宿主細胞)中以重組方式產生。宿主細胞視情況係哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
B.醫藥調配物
藉由將具有期望純度之抗體與可選醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))混合來製備根據本發明使用之抗體之治療調配物以用於儲存，該等調配物呈凍乾調配物或水溶液形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑需在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒性，且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苄烷銨；氯化苯銨松寧(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；鼇合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，例 如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上活性化合物，視情況具有補體活性之不會不利地影響彼此之彼等。該等醫藥之類型及有效量取決於(例如)該調配物中所存在之抗體量及個體之臨床參數。實例性之該等醫藥係論述於下文中。
該等活性成份亦可裝入分別(例如)藉由凝聚技術或藉由介面聚合製備之微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，該等系統呈膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或***液形式。該等技術係揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中。一或多種治療劑可囊封於與抗BBB-R偶合之脂質體中(例如參見美國專利申請公開案第20020025313號)。
可製備緩釋製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質係呈成形物件形式，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸-2-羥乙基酯)或聚(乙烯基醇))、聚乳酸(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與L-麩胺酸γ乙酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(例如LUPRON DEPOTTM，由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林構成之可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於活體內投與之調配物必須為無菌。此可容易地藉由過濾穿過無菌過濾膜達成。
在一實施例中，該調配物為等滲。
C.抗BBB-R抗體之治療用途
本發明之抗BBB-R抗體(包括包含其之多特異性抗體)可用於各種活體內方法中。例如，本發明提供跨越血腦屏障運送治療化合物且對 紅血球群具有減少或消除之影響之方法，該方法包含使與治療化合物偶合之抗BBB-R抗體(例如結合BBB-R及腦抗原二者之多特異性抗體)暴露於BBB，以使得該抗體跨越BBB運送與其偶合之治療化合物。在另一實施例中，本發明提供跨越血腦屏障運送神經性病症藥物之方法，該方法包含使本發明之與腦病症藥物偶合之抗BBB-R抗體(例如結合BBB-R及腦抗原二者之多特異性抗體)暴露於BBB，以使得該抗體跨越BBB運送與其偶合之神經性病症藥物，且對紅血球群具有減少或消除之影響。在一實施例中，此處之BBB係在哺乳動物(例如人類)中，例如具有包括(但不限於)以下之神經性病症者：阿茲海默氏病(AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群、利德爾氏症候群、帕金森氏病、匹克氏病、佩吉特氏病、癌症、創傷性腦損傷等。
在一實施例中，神經性病症係選自：神經病變、類澱粉變性症、癌症(例如涉及CNS或腦)、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、炎症(例如CNS或腦之炎症)、局部缺血、神經變性疾病、癲癇發作、行為障礙、溶酶體貯積病等。
神經病變病症係特徵在於不適當或不受控神經信號傳導或其缺乏之神經系統疾病或異常，且包括(但不限於)慢性疼痛(包括感受性疼痛)、由身體組織之損傷引起之疼痛(包括癌性疼痛)、神經病變疼痛(由神經、脊髓或腦之異常引起之疼痛)及精神性疼痛(完全或主要與心理病症相關)、頭痛、偏頭痛、神經病變及常伴隨該等神經病變病症之症狀及症候群(例如眩暈或疲勞)。
類澱粉變性症係一組與CNS中之細胞外蛋白質沈積相關之疾病及病症，包括(但不限於)繼發性類澱粉變性症、年齡相關類澱粉變性症、阿茲海默氏病(AD)、輕度認知障礙(MCI)、路易氏體癡呆、唐氏 症候群(Down’s syndrome)、遺傳性腦出血伴類澱粉變性症(荷蘭型(Dutch type))；關島帕金森-癡呆複合症(Guam Parkinson-Dementia complex)、腦類澱粉血管病變、亨廷頓氏病、進行性核上性麻痹、多發性硬化症；庫賈氏病(Creutzfeld Jacob disease)、帕金森氏病、傳播性海綿狀腦病、HIV相關癡呆、肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)、包涵體肌炎(IBM)及與β-類澱粉沈積相關之眼部疾病(即黃斑變性、玻璃膜疣相關視神經病變及白內障)。
CNS之癌症之特徵在於一或多種CNS細胞之(即神經細胞)異常增殖，且包括(但不限於)神經膠瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、腦膜瘤、星細胞瘤、聽神經瘤、軟骨瘤、寡樹突神經膠瘤、神經管胚細胞瘤、神經節膠質細胞瘤、神經鞘瘤、神經纖維瘤、神經胚細胞瘤及硬膜外、髓內或硬腦膜內腫瘤。
眼部疾病或病症係眼睛之疾病或病症，出於本文之目的眼睛被視為由BBB隔離之CNS器官。眼部疾病或病症包括(但不限於)鞏膜、角膜、虹膜及睫狀體之病症(即鞏膜炎、角膜炎、角膜潰瘍、角膜擦破、雪盲、電弧眼、希傑森氏表層點狀角膜炎(Thygeson’s superficial punctate keratopathy)、角膜新生血管化、富克斯氏營養不良(Fuchs’ dystrophy)、錐形角膜、乾性角膜結膜炎、虹膜及眼色素層炎)、晶狀體之病症(即白內障)、脈絡膜及視網膜之病症(即視網膜脫落、視網膜劈裂症、高血壓性視網膜病、糖尿病性視網膜病、視網膜病、早熟性視網膜病、年齡相關黃斑變性、黃斑變性(濕性或乾性)、視網膜前膜、色素性視網膜炎及黃斑水腫)、青光眼、飛蚊症、視神經及視覺路徑之病症(即雷伯氏遺傳性視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy)及視盤玻璃膜疣)、眼肌/雙眼運動調節/屈光之病症(即斜視、眼肌癱瘓、進行性外眼肌麻痹症、內斜視、外斜視、遠視、近視、散光、屈光參差症、老花眼及眼肌麻痹)、視覺障礙及失明(即弱 視、萊伯氏先天性黑蒙症(Lever’s congenital amaurosis)、盲點、色盲、失色症、夜盲症、失明、河盲症及小眼症/缺損)、紅眼、阿羅瞳孔(Argyll Robertson pupil)、角膜真菌病、乾眼症及無虹膜。
CNS之病毒或微生物感染包括(但不限於)病毒感染(即流行性感冒、HIV、骨髓灰白質炎病毒、風疹)、細菌感染(即奈瑟球菌屬(Neisseria sp.)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、變形桿菌屬(Proteus sp.)、大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎球菌屬(Pneumococcus sp.)、腦膜炎雙球菌屬(Meningococcus sp.)、嗜血桿菌屬(Haemophilus sp.)及結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)及諸如真菌等其他微生物之感染(即酵母菌、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans))、寄生蟲感染(即弓蟲(toxoplasma gondii))或導致CNS病理生理學之變形蟲感染(包括(但不限於)腦膜炎、腦炎、脊髓炎、脈管炎及膿腫)，其可為急性或慢性。
CNS之炎症包括(但不限於)由CNS之損傷引起之炎症，該損傷可係物理損傷(即歸因於意外事故、外科手術、腦創傷、脊髓損傷、震盪)及歸因於CNS之一或多種其他疾病或病症或與其相關之損傷(即膿腫、癌症、病毒或微生物感染)。
本文中所使用之CNS之局部缺血係指一組與腦中之異常血液流動或血管行為或其病因相關之病症，且包括(但不限於)：局灶性腦缺血、全腦缺血、中風(即蛛膜下出血及腦內出血)及動脈瘤。
神經變性疾病係一組與CNS中之神經細胞功能損失或死亡相關之疾病及病症，且包括(但不限於)：腎上腺腦白質失養症、亞歷山大氏病、亞爾培氏病(Alper’s disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、毛細血管擴張性失調、巴登氏病(Batten disease)、柯凱因氏症候群、皮質基底節變性、由類澱粉變性症引起或與其相關之變性、弗裏德賴西共濟失調(Friedreich’s ataxia)、額顳葉變性、肯尼迪病(Kennedy’s disease)、多系統萎縮、多發性硬化症、原發性側索硬化症、進行性核上性麻痹、脊髓肌萎縮症、橫貫性脊髓炎、雷夫蘇姆氏病(Refsum’s disease)及脊髓小腦性失調症。
CNS之癲癇發作(Seizure)疾病及病症涉及CNS中之不適當及/或異常電導，且包括(但不限於)癲癇(即意識喪失型癲癇發作、失張性癲癇發作、良性羅蘭癲癇(benign Rolandic epilepsy)、兒童意識喪失型、陣攣性癲癇發作、複雜型部分性癲癇發作、額葉癲癇、發熱癲癇發作、嬰兒點頭式痙攣、青少年肌陣攣性癲癇、青少年意識喪失型癲癇、雷葛氏症候群(Lennox-Gastaut syndrome)、蘭道-克雷夫症候群(Landau-Kleffner Syndrome)、德維特症候群(Dravet’s syndrome)、大田原症候群(Otahara syndrome)、韋氏症候群(West syndrome)、肌陣攣性癲癇發作、粒腺體病症、進行性肌陣攣性癲癇、精神性癲癇發作、反射性癲癇、拉斯穆森症候群(Rasmussen’s Syndrome)、單純型部分癲癇發作、繼發全身性癲癇發作、額葉癲癇、強直陣攣性癲癇發作、強直癲癇發作、精神運動性癲癇發作、邊緣癲癇、部分發作性癲癇發作、全身發作性癲癇發作、癲癇重積狀態、腹型癲癇、難動性癲癇發作、自律神經性癲癇發作、粗大性雙側肌陣攣、月經性癲癇、跌倒性癲癇發作、情緒性癲癇發作、局灶性癲癇發作、發笑性癲癇發作、傑克遜步伐(Jacksonian March)、拉弗拉病、運動性癲癇發作、多局灶性癲癇發作、夜間癲癇發作、光敏性癲癇發作、假性癲癇發作、感覺性癲癇發作、微小性癲癇發作、叢林性癲癇發作(sylvan seizures)、戒斷性癲癇發作及視覺反射性癲癇發作)。
行為障礙係特徵在於受折磨個體之一部分上之異常行為之CNS之病症，且包括(但不限於)：睡眠障礙(即失眠、類睡症、夜驚、晝夜節律性睡眠障礙及嗜睡症)、心境障礙(即抑鬱症、自殺性抑鬱症、焦慮、慢性情感障礙、恐怖症、恐慌發作、強迫症、注意力不足過動症 (ADHD)、注意力不足症(ADD)、慢性疲勞症候群、懼空曠症、重大創傷後遺症、雙向情感病症)、飲食病症(即厭食症或暴食症)、精神病、發育性行為障礙(即自閉症、雷特氏症候群(Rett’s syndrome)、亞斯伯格症候群(Aspberger’s syndrome))、人格障礙及精神障礙(即精神***症、妄想症、及諸如此類)。
溶酶體貯積病症係在一些情形下與CNS相關或具有CNS特異性症狀之代謝病症；該等病症包括(但不限於)：戴-薩克斯病(Tay-Sachs disease)、高歇氏病(Gaucher’s disease)、法布瑞氏病(Fabry disease)、黏多糖病(I型、II型、III型、IV型、V型、VI型及VII型)、肝糖貯積症、GM1神經節苷脂症、異染性白質失養症、法伯病(Farber’s disease)、卡納文氏白質失養症(Canavan’s leukodystrophy)及神經元蠟樣脂褐質沈積症1型及2型、尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease)、龐貝症(Pompe disease)及克拉培氏病(Krabbe’s disease)。
在另一實施例中，可藉由保持至少部分效應子功能之抗TfR抗體之在本文中所識別之網狀紅血球耗竭效應預防或治療與紅血球之不適當過量產生相關或由其引起或其中紅血球之過量產生係疾病之效應的疾病。例如，在先天性或腫瘤性紅血球增多症中，因(例如)網狀紅血球之超增殖而升高之紅血球計數導致血液變稠及相伴生理症狀(d’Onofrio等人，Clin.Lab.Haematol.(1996)Suppl.1：29-34)。本發明之抗TfR抗體(其中至少保存有該抗體之至少部分效應子功能)之投與將容許選擇性去除未成熟網狀紅血球群，而不影響至CNS中之正常轉鐵蛋白運送。可調節此一抗體之投藥，以使得可使急性臨床症狀最小化(即藉由以極低劑量或以間隔較寬之間隔投藥)，如業內所熟知。
在一態樣中，本發明抗體係用於在症狀發作之前檢測神經性病症及/或評估疾病或病症之嚴重性或持續時間。在一態樣中，該抗體容許進行神經性病症之檢測及/或成像，包括藉由放射線攝影術、斷 層攝影術或磁共振成像(MRI)成像。
在一態樣中，提供本發明之用作醫藥之低親和力抗BBB-R抗體。在其他態樣中，提供用於治療神經性疾病或病症(例如阿茲海默氏病)而不耗竭紅血球(即網狀紅血球)之低親和力抗BBB-R抗體。在某些實施例中，提供用於本文中所闡述之治療方法製造經修飾之低親和力抗BBB-R抗體。在某些實施例中，本發明提供經修飾以改善其用於治療患有神經性疾病或病症之個體之方法之安全性的低親和力抗BBB-R抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗BBB-R抗體(視情況與神經性病症藥物偶合)。在一該實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑。在其他實施例中，本發明提供經修飾以改善其安全性以用於減少或抑制具有神經性疾病或病症(例如阿茲海默氏病)之風險或罹患該疾病或病症之患者中之類澱粉蛋白斑形成之抗BBB-R抗體。以上實施例中之任一實施例之「個體」視情況係人類。在某些態樣中，本發明之用於本發明方法之抗BBB-R抗體改善其所偶合之神經性病症藥物之吸收。
在再一態樣中，本發明提供本發明低親和力抗BBB-R抗體用於製造或製備醫藥之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療神經性疾病或病症。在再一實施例中，該醫藥係用於治療神經性疾病或病症之方法中，該方法包含向患有神經性疾病或病症之個體投與有效量之該醫藥。在一該實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑。
在再一態樣中，本發明提供治療阿茲海默氏病之方法。在一實施例中，該方法包含向患有阿茲海默氏病之個體投與有效量之本發明之結合BACE1及TfR二者或Aβ及TfR二者之多特異性抗體。在一該實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑。上文實施例中任一實施例之「個體」可為人類。
本發明之抗BBB-R抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，本發明之抗BBB-R抗體可與至少一種額外治療劑共投與。在某些實施例中，額外治療劑係有效地治療與採用抗BBB-R抗體所治療者相同或不同之神經性病症之治療劑。實例性額外治療劑包括(但不限於)：上文所闡述之各種神經性藥物、膽鹼酯酶抑制劑(例如多奈派齊、加蘭他敏、利斯的明及他克林)、NMDA受體拮抗劑(例如美金剛)、類澱粉β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ-分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARγ激動劑、HMS-CoA還原酶抑制劑(他汀類，statins)、安帕金(ampakine)、鈣通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝糖合成酶激酶抑制劑、靜脈內免疫球蛋白、毒蕈鹼受體激動劑、菸鹼受體調節劑、主動或被動類澱粉β肽免疫、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑及抗類澱粉β肽抗體。在某些實施例中，針對減輕神經性藥物之一或多種副效應之能力選擇該至少一種額外治療劑。
如本文中所例示，某些抗BBB-R抗體可具有消極地影響利用抗BBB-R抗體治療之個體中之網狀紅血球群之副效應。因此，在某些實施例中，將至少一種針對減輕對網狀紅血球群之該負面副效應之能力所選擇的其他治療劑與本發明抗BBB-R抗體一起共投與。該等治療劑之實例包括(但不限於)增加紅血球(即網狀紅血球)群之藥劑、支持紅血球(即網狀紅血球)之生長及發育之藥劑及保護紅血球群免於抗BBB-R抗體之效應之藥劑；該等藥劑包括(但不限於)紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12以及藉由(例如)利用類似細胞轉輸進行之紅血球(即網狀紅血球)之物理替代，該等類似細胞可來自具有類似血型之另一個體或可已自投與抗BBB-R抗體之個體預先萃取。熟習此項技術者應瞭解，在一些情形下，較佳在抗BBB-R抗體療法之前或與其同時向個體投與意欲保護現存紅血球(即網狀紅血球)之 藥劑，而較佳與抗BBB-R抗體療法同時或在其之後投與意欲支持或起始紅血球或血液細胞群(即網狀紅血球或網狀紅血球群)之再生長/發育之藥劑，以使得可在抗BBB-R抗體治療後補充該等血液細胞。
在某些其他該等實施例中，針對抑制或防止補體途徑在投與抗BBB-R抗體後激活之能力選擇該至少一種其他治療劑。該等治療劑之實例包括(但不限於)干擾抗BBB-R抗體結合至或激活補體途徑之能力之藥劑及抑制補體途徑內之一或多種分子相互作用之藥劑，且通常係闡述於Mollnes及Kirschfink(2006)Molec.Immunol.43：107-121中，該文獻之內容以引用的方式明確併入本文中。
上文所述之該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑係包括於相同或分開調配物中)及分開投與(在此情形下，本發明抗體之投與可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或在其之後進行)。本發明抗體亦可與其他介入療法組合使用，例如(但不限於)輻射療法、行為療法或業內已知且適於欲治療或預防之神經性病症之其他療法。
本發明之抗BBB-R抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內及(若期望用於局部治療)病變內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑投藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分取決於投與時間長短。本文涵蓋各種投藥時間表，包括(但不限於)在各時間點單次投與或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
以符合良好醫療實踐之方式調配、投藥及投與本發明抗體。在此上下文中，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時間表及開業醫師已知之其他因素。該抗體不必(但視情況)與一或多種目前用於預防或治療所討論之病症或預防、減輕或改善抗體投與 之一或多種副效應之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於該調配物中之抗體量、病症或治療類型及上文所討論之其他因素。該等藥劑通常以相同劑量並利用本文中所闡述之投與途徑使用，或本文所闡述約1%至99%之劑量，或以經驗/臨床確定為合適之任一劑量及任一途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量(當單獨或與一或多種其他治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體係經投與用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。適宜一次性地或經一系列治療向患者投與該抗體。視疾病類型及嚴重性而定，不論係(例如)藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注投與，向患者投與之初始候選劑量可為約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)。視上文所提及之因素而定，一典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或更多之範圍內。對於經若干天或更長時間之重複投與，視病狀而定，治療通常將持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一實例性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與一或多個約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其組合)之劑量。可間歇性投與該等劑量，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約2個至約20個或例如約6個劑量之抗體)。可先投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。應瞭解，一種藉由投與抗TfR抗體減少對網狀紅血球群之影響之方法係改變劑量之量或定時，以使得血流中存在總體數量較低之循環抗體與網狀紅血球相互作用。在一非限制性實例中，可以高於較高劑量將具有之頻率之頻率投與較低劑量之抗TfR抗體。所使用之劑量可在需要遞送至CNS之抗體量(本身與抗體之CNS抗原特異性部分之親和力相關)、彼抗體對TfR之親和力及保護紅血球(即網狀 紅血球)、刺激生長及發育或抑制補體途徑之化合物係與抗體共投與抑或連續投與之間平衡。容易地藉由本文中所闡述且未業內已知之習用技術及分析監測此療法之進程。
應理解，可代替抗BBB-R抗體或除其以外使用本發明免疫偶聯物實施上文調配物或治療方法中之任一者。
D.製品
在本發明之另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/或診斷上文所闡述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。該容器容納組合物自身或其與另一組合物之組合以有效用於治療、預防及/或診斷病狀，且可具有無菌存取埠(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。該組合物中至少一種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示該組合物係用於治療選定病狀。此外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或否則治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之包裝插頁。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度考慮所期望之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應理解，上文製品中之任一者可代替抗BBB-R抗體或除其以外包括本發明之免疫偶聯物。
該製品視情況進一步包含具有關於治療個體之神經性病症之說 明之包裝插頁，其中該等說明指示利用本文中所揭示之抗體之治療治療神經性病症，且視情況指示該抗體因對BBB-R具有低親和力而具有改善之跨越BBB之吸收。
實例 實例1：低親和力抗TfR抗體係生成及表徵
該領域已認識到，可利用轉鐵蛋白受體(TfR)跨越血腦屏障(BBB)運送轉鐵蛋白之天然能力來容許將異源分子自血流運送至腦中(例如參見WO9502421)。申請人先前研發對此系統之重要修改(Sci.Transl.Med. 3,84ra43(2011))，即藉由降低抗TfR對轉鐵蛋白受體之親和力來在一定範圍內實質上增強至腦中之運送及與抗轉鐵蛋白受體抗體(抗TfR)偶聯之異源分子於腦中之滯留。
生成一組對鼠類TfR具有逐漸減小之親和力之抗TfR抗體，將其中三者(指定為抗TfRA、抗TfRD及抗TfRE)進一步修飾成雙特異性格式，其中另一抗體臂對BACE1具有特異性。在競爭ELISA分析中評估每一單特異性及雙特異性抗體對鼠類TfR之親和力。簡言之，在4℃下在塗覆有2.5μg/ml存於PBS中之利用六聚組胺酸標籤標記之經純化muTfR(muTfR-His)之maxisorp板(Neptune,N.J)上實施該分析過夜。將板用PBS/0.05%吐溫20洗滌，並使用存於PBS中之Superblock阻斷緩衝液(Thermo Scientific,Hudson,NH)阻斷。將1：3連續滴定之二價IgG(抗TfRA、抗TfRD、抗TfRE)或雙特異性Ab(抗TfRA/BACE1、抗TfRD/BACE1或抗TfRE/BACE1)與1nM生物素化抗TfRA組合，並在室溫下添加至該板1小時。用PBS/0.05%吐溫20洗滌各板，且將HRP-鏈黴抗生物素(SouthernBiotech,Birmingham)添加至該板並在室溫下培育1小時。用PBS/0.05%吐溫20洗滌各板，且使用TMB受質(BioFX Laboratories,Owings Mills)檢測結合至該板之經生物素化抗TfRA。(圖1A)。在該分析中所觀測到之每一單特異性或雙特異性抗體至鼠類 TfR之結合之IC50值係顯示於表2中。
如下實施小鼠中在單一投與後之抗體分佈。所有研究均使用6週至8週齡之野生型雌性C57B/6小鼠。動物之照護係依照機構指南進行。向小鼠靜脈內注射50mg/kg之對照IgG、抗BACE1或抗TfR/BACE1變體。總注射體積不超過250uL，且必要時將抗體稀釋於D-PBS中(Invitrogen)。在所示時間後，以2mL/min之速率向小鼠灌注D-PBS，持續8分鐘。提取腦，且分離皮質及海馬回，使其於存於PBS中含有不含EDTA之完全性微型蛋白酶抑制劑混合錠劑(Complete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets，Roche Diagnostics)之1% NP-40(Cal-Biochem)中勻質化。將經勻質化腦樣品在4℃下旋轉1小時，然後以14,000rpm離心20分鐘。分離上清液用於腦抗體量測。收集全血，然後灌注於EDTA microtainer管(BD Diagnostics)中，使其在室溫下靜置30分鐘，並以5000×g短暫離心(spun down)10分鐘。將血漿之頂層轉移至新管用於抗體及小鼠Aβ1-40量測。
使用抗huFc/抗huFc ELISA量測小鼠血漿及腦樣品中之總抗體濃度。在4℃下，用驢抗人類IgG之F(ab’)2片段(Fc片段特異性多株抗體，Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)塗覆NUNC 384孔Maxisorp免疫板(Neptune,NJ)，過夜。在25℃下利用PBS(0.5% BSA)將各板阻斷1小時。使用每一抗體(對照IgG、抗BACE1及抗 TfR/BACE1雙特異性變體)作為量化各別抗體濃度之標準物。用PBS、0.05%吐溫-20並使用微板洗滌器(Bio-Tek Instruments公司，Winooski，VT)洗滌各板，且在25℃下添加稀釋於含有0.5% BSA、0.35M NaCl、0.25% CHAPS、5mM EDTA、0.05%吐溫-20及15ppm Proclin®(Sigma-Aldrich)之PBS中之標準物及樣品，持續2小時。利用山葵過氧化酶偶聯之F(ab’)2山羊抗人類IgG(Fc特異性多株抗體，Jackson ImmunoResearch)檢測經結合抗體。使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)(KPL公司，Gaithersburg，MD)使樣品顯影，且在450nm下於Multiskan Ascent讀數器(Thermo Scientific,Hudson,NH)上量測吸光度。使用四參數非線性回歸程式自標準曲線測定濃度。該分析之量化(LLOQ)值下限在血清中為3.12ng/ml且在腦中為12.81ng/g。使用雙尾非成對t-測試實施實驗群組間差異之統計學分析。
結果係顯示於圖1B及1D中。對照IgG及抗BACE1抗體二者至腦中之吸收有限，該吸收持續10天量測時期，而儘管隨時間而逐漸清除，但其血漿濃度在所有時間點處在任一所測試分子中中為最高。在所評估之三種抗TfR/BACE1變體中，抗TfRA/BACE1及抗TfRD/BACE1二者均顯示在投藥後1天在腦中介於35nM與40nM濃度之間(為對照IgG之7倍至8倍；圖1D)。然而，抗TfRA/BACE1在腦中之濃度在第2天後迅速降低，並截至第6天恢復至對照含量。相抗TfRD/BACE1在腦中之存留時間比抗TfRA/BACE1長，其在腦中之濃度較平緩的下降；然而，截至第10天該濃度與對照之濃度相當。抗TfRE/BACE1更溫和地進入腦中(2倍至3倍對照)，但在隨後若干天內之下降遠小於其他兩種抗體變體之下降。所有三種抗體變體之血漿含量(圖1B)隨時間而下降。截至第4天自血漿完全清除抗TfRA/BACE1，而截至第10天完全清除抗TfRD/BACE1，且抗TfRE/BACE1仍以與對照IgG或抗BACE1之含量相當之含量殘留於血漿中。
該等發現合起來與先前之發現一致：抗體對TFR之親和力之減少實際上改善其於腦中之滯留，此乃因所使用之最高親和力抗體(抗TfRA/BACE1)自腦清除最迅速，且所使用之最低親和力抗體(抗TfRE/BACE1)存留於腦中之時間最長。然而，自數據亦明瞭，隨時間運送至腦中之總抗TfRD/BACE1量遠大於抗TfRE/BACE1之量，此表明在抗TfRD/BACE1與抗TfRE/BACE1之間存在最佳親和力，以使跨越BBB之運送及於腦中之存留最大化。
腦及血漿中所運送之分子之存在及存留僅為潛在效力之一種量度；更感興趣的係之該分子在彼等隔室中之活性。因此，在兩個隔室中藉由量測Aβ1-40(類澱粉前體蛋白(APP)上BACE1酶活性之裂解副產物)之量來評估BACE1酶活性。簡言之，在野生型小鼠中如上文所述實施抗體治療及灌注。對於Aβ1-40量測，使半腦於5M胍鹽酸鹽緩衝液中勻質化，且在室溫下使樣品轉動3小時，然後稀釋(1：10)於含有剛添加之抑肽酶(20mg/mL)及亮抑肽酶(10mg/mL)之存於PBS中之0.25%酪蛋白、5mM EDTA(pH 8.0)中。使經稀釋勻質物以14,000rpm旋轉20min。且分離上清液用於Aβ1-40量測。如上文所闡述製備血漿。根據上文所闡述之類似程序使用夾心式ELISA測定總小鼠Aβ1-40在血漿及腦中之濃度。使用於Aβ1-40量測之半腦於1% NP-40(Cal-Biochem)中勻質化，並在室溫下轉動1小時，然後以14,000rpm旋轉20分鐘。將對Aβ1-40之C端具有特異性之兔多株抗體(Millipore,Bedford,MA)塗覆至板上，且使用經生物素化抗小鼠Aβ單株抗體M3.2(Covance,Dedham,MA)用於檢測。該分析之LLOQ值在血漿中為1.96pg/ml且在腦中為39.1pg/g。使用雙尾非成對t-測試實施實驗群組間差異之統計學分析。
血漿及腦之結果係分別顯示於圖1C及1E中，且與所示時間處每一隔室中所存在之抗體量一致(參見圖1B及1D)。重要的係，隨時間在 腦中觀測到之Aβ1-40量經最長時期後在利用抗TfRD/BACE1治療之小鼠中為最低。
實例2A：抗TfR投藥對網狀紅血球之效應
出乎意料地，在利用單特異性抗TfRA或抗TfRD以1mg/kg或更高之所有劑量治療小鼠後，觀測到在利用雙特異性抗TfRA/BACE1或抗TfRD/BACE1治療之小鼠中未觀測到之不尋常及急性臨床癥兆(參見表3)。
具體而言，單特異性抗體治療之小鼠在5分鐘治療內展示投藥後嗜睡症，此時其變得穩定且無反應(在一些動物中有偶然痙攣運動)，隨後在投藥後20分鐘-25分鐘形成邋遢***外觀。所有該等所觀測到之效應在治療後之數小時內消失。某些單特異性抗體治療之小鼠看來亦在尿中呈現偶爾存在之血液，以及投藥後1小時時基於與在雙特異性抗體治療之動物中進行采血相比終端心臟采血液困難而呈現明顯低血壓。由於已知小鼠未成熟紅血球表現TfR(參見圖2A)，以存在於外周血流中，且若該等血液細胞受到損害，則可解釋小鼠中所觀測到之效應，故在小鼠中研究抗體治療對未成熟紅血球(網狀紅血球)之影響。
使用與實例1中所闡述相同之程序，向小鼠靜脈內投藥單一1mg/kg、5mg/kg或50mg/kg抗TfRD或抗TfRD/BACE1注射液，或投藥單一50mg/kg對照IgG注射液，且在投藥後1小時時獲取全血樣品，並將其置於含有鉀-EDTA之收集管中。根據製造商之說明書，在該等血液樣品上使用Sysmex XT2000iV(Sysmex,Kobe,Japan)測定紅血球及網狀紅血球計數及指數。簡言之，藉由流式細胞術並使用結合細胞RNA並量測所得細胞光散射特徵之螢光聚次甲基染料，Sysmex檢測並劃分總網狀紅血球以及未成熟網狀紅血球部分(高螢光強度及中等(middle/intermediate)螢光強度網狀紅血球之總和)。
投藥後1小時時，抗TfRD在所有所測試劑量下減少未成熟網狀紅血球含量，不管劑量多少達大約相同之程度。每一抗TfRD劑量群組中之所治療小鼠亦顯示類似嚴重性及穿透率之急性臨床癥兆(參見圖2B)。相比之下，來自1mg/kg及5mg/kg抗TfRD/BACE1治療之小鼠之血液樣品具有與來自對照IgG治療之樣品類似之分率之未成熟網狀紅血球。50mg/kg抗TfRD/BACE1治療之小鼠顯示網狀紅血球顯著減少(至對照量之約50%)(圖2B)，但此減少不伴隨任何急性臨床癥兆。因 此，含有抗TfRD之雙特異性抗體對網狀紅血球含量具有小於單特異性抗TfRD之影響，且不引發急性不利臨床癥兆。
重複該實驗，其進一步包括對TfR具有不同親和力之第二雙特異性抗體。使用與實例1中所闡述相同之程序，向小鼠靜脈內投藥單一5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg抗TfRA/BACE1或抗TfRD/BACE1注射液，或投藥單一50mg/kg對照IgG注射液，且投藥後24小時及7天時獲取血液樣品。如上文所闡述在全血中量測網狀紅血球計數。結果係顯示於圖2C中。投藥後24小時時，抗TfRA/BACE1治療之小鼠樣品中之任一者顯示總網狀紅血球計數存在類似的顯著減少。25mg/kg及50mg/kg抗TfRD/BACE1治療之樣品顯示與抗TfRA/BACE1治療之樣品類似較低之網狀紅血球計數。然而，投藥後24小時時，相對於IgG對照樣品，5mg/kg抗TfRD/BACE1治療之樣品顯示網狀紅血球數僅存在適度減少。直至投藥後7天，所有群組顯示正常含量之網狀紅血球(圖2C)，此表明自初始網狀紅血球耗竭恢復，除50mg/kg抗TfRD/BACE1樣品以外，其顯示相對於對照量網狀紅血球含量持續減少(大約50%)。因此，僅最低測試劑量之抗TfRD/BACE1對網狀紅血球具有適度影響，而所有其他所測試劑量導致在投藥後24小時時網狀紅血球幾乎完全損失，此指示減少抗體親和力(抗TfRD相對於抗TfRA)及劑量減弱與網狀紅血球損失相關之安全性問題。直至投藥後7天，然而，僅最高劑量之抗TfRD/BACE1對網狀紅血球含量具有任何可量測之影響，而所有其他所測試劑量顯示網狀紅血球計數恢復至與IgG對照小鼠之位準類似之位準。值得注意的係，在投藥後7天時抗體對TfR之絕對親和力不如抗體於血流中存留較長時間重要。儘管抗TfRA/BACE1對TfR之親和力高得多(表A)，但高劑量抗TfRA/BACE1治療之小鼠顯示網狀紅血球數7天恢復，此與此抗體相對於抗TfRD/BACE1自循環之較快速清除相對應(如實例1圖1B中所見)。
由於在網狀紅血球耗竭中觀測到劑量反應，故實施實驗來確定各種劑量是否可能與減少腦中之Aβ之相關能力相關聯。簡言之，所有研究均使用6週-8週大之野生型雌性C57B/6小鼠。向小鼠靜脈內注射50mg/kg之對照IgG或抗TfR/BACE1。總注射體積不超過250μL，且必要時將抗體稀釋於D-PBS(Invitrogen)中。在所示時間後，以2mL/min之速率向小鼠灌注D-PBS，持續8分鐘。提取腦，且分離皮質及海馬回，使其於含有不含EDTA之完全性微型蛋白酶抑制劑混合錠劑(Roche Doagnostics)之存於PBS中之1% NP-40(Cal-Biochem)中勻質化。在4℃下使經勻質化腦樣品轉動1小時，然後以14,000rpm旋轉20分鐘。分離上清液用於腦抗體量測。收集全血，然後灌注於EDTA microtainer管(BD Diagnostics)中，使其在室溫下靜置30分鐘，並以5000×g短暫離心10分鐘。將血漿之頂層轉移至新管用於抗體及小鼠Aβ1-40量測。
使用抗Fc/抗huFc ELISA量測小鼠血漿及腦樣品中之總抗體濃度。在4℃下，用驢抗人類IgG之F(ab’)2片段(Fc片段特異性多株抗體，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)塗覆NUNC 384孔Maxisorp免疫板(Neptune,NJ)，過夜。在25℃下利用PBS、0.5% BSA將各板阻斷1小時。使用每一抗體作為量化各別抗體濃度之標準物。用PBS、0.05%吐溫-20並使用微板洗滌器(Bio-Tek Instruments公司，Winooski，VT)洗滌各板，在25℃下添加稀釋於含有0.5% BSA、0.35M NaCl、0.25% CHAPS、5mM EDTA、0.05%吐溫-20及15ppm Proclin之PBS中之標準物及樣品，持續2小時。利用山葵過氧化酶偶聯之F(ab’)2山羊抗人類IgG(Fc特異性多株抗體，Jackson ImmunoResearch)檢測經結合抗體，並使用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)(KPL公司，Gaithersburg，MD)顯影，且在450nm下於Multiskan Ascent讀數器(Thermo Scientific,Hudson,NH)上量測吸光 度。使用四參數非線性回歸程式自標準曲線測定濃度。該分析之量化(LLOQ)值下限在血清中為3.12ng/ml且在腦中為12.81ng/g。使用雙尾非成對t-測試實施實驗群組間差異之統計學分析。
亦檢測腦及血漿中之Aβ1-40。簡言之，根據上文所闡述之方法用抗體治療小鼠並灌注。對於Aβ1-40量測，使半腦於5M胍鹽酸鹽緩衝液中勻質化，且在室溫下使樣品轉動3小時，然後稀釋(1：10)於含有剛添加之抑肽酶(20mg/mL)及亮抑肽酶(10mg/ml)之存於PBS中之0.25%酪蛋白、5mM EDTA(pH 8.0)中。使經稀釋勻質物以14,000rpm旋轉20min，且分離上清液用於Aβ1-40量測。如上文所闡述製備血漿。根據上文所闡述之類似程序使用夾心式ELISA測定總小鼠Aβ1-40在血漿及腦中之濃度。將對Aβ1-40之C端具有特異性之兔多株抗體(Millipore,Bedford,MA)塗覆至板上，且使用經生物素化抗小鼠Aβ單株抗體M3.2(Covance,Dedham,MA)用於檢測。該分析之LLOQ值在血漿中為1.96pg/ml且在腦中為39.1pg/g。使用雙尾非成對t-測試實施實驗群組間差異之統計學分析。
針對抗TfRD/BACE1觀測到在25mg/kg及50mg/kg劑量下腦Aβ穩健且持續減少(圖2D)，而抗TfRA/BACE1顯示在多有三種劑量下腦Aβ穩健但急性減少(圖2E)。該等數據與該等化合物在外周及腦二者中所觀測到之藥物動力學一致(圖2F-2H)。自該等數據，顯而易見，在該等研究中25mg/kg之劑量之抗TfRD/BACE1足以顯著減少腦Aβ含量。
抗TfR抗體種類導致之網狀紅血球耗竭可歸因於各種不同天然過程，包括效應子功能/抗體依賴性之細胞介導之細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、直接標靶介導之溶解/凋亡及/或由巨噬細胞進行之對經助噬網狀紅血球之吞噬作用。實施一系列實驗，以較好理解解釋在抗TfR抗體投與後所觀測到之網狀紅血球耗竭之機制。
實例2B. 調節效應子功能之影響
除對TfR之親和力及原子價不同以外，先前實驗所用之單特異性及雙特異性抗TfR抗體之不同亦在於其效應子功能之程度。單特異性抗TfR抗體係於CHO細胞中產生，且具有哺乳動物類型糖基化及野生型效應子功能。使用一或多種業內熟知之以下方法，雙特異性抗TfR/BACE1抗體具有嚴重減少或消除之與Fcγ受體相互作用之能力：因Fc區中存在突變N297G或N297A而廢除糖基化(Atwal等人，Sci.Transl.Med. 3,84ra43(2011)；Fares Al-Ejeh等人，Clin.Cancer Res.(2007)13：5519s-5527s)，修飾抗體Fc區以在位置265處含有已知完全廢除效應子功能之天冬胺酸至丙胺酸突變(D265A)(例如參見美國專利第7,332,581號)，或以防止野生型哺乳動物糖基化之方式產生抗體，例如藉由在大腸桿菌中產生其。
利用該等Fc經修飾之抗體且亦在缺少Fcγ受體或補體C3之不同小鼠品系中重複實例2A中所實施之小鼠研究，以評價網狀紅血球耗竭之潛在機制，分別包括效應子驅動之ADCC或CDC；靜脈內注射抗體後24小時評估全血樣品之總網狀紅血球計數。在第一實驗中，向野生型小鼠投與1mg/kg或25mg/kg缺少效應子功能之單特異性抗TfRD對網狀紅血球計數之耗竭效應與具有全效應子功能之抗TfRD抗體相同(將圖3A與圖2B相比較)。然而，在利用無效應子抗TfRD抗體治療之小鼠中未觀測到急性臨床癥兆，與利用效應子陽性抗TfRD抗體治療之彼等形成鮮明對比(實例2A)。類似地，當向缺少Fcγ受體之小鼠投與效應子陽性抗TfRD(以消除可由效應子功能誘發之ADCC機制)時，在投與25mg/kg之劑量後，網狀紅血球含量減少至接近零，但未觀測到急性臨床癥兆(圖3B)。
亦評估Fcγ剔除小鼠中缺少效應子功能之雙特異性抗TfRD/BACE1 D265A抗體對網狀紅血球含量之影響(圖3B)。甚至當以25mg/kg之劑量投與時，小鼠中抗體效應子功能之完全廢除及Fcγ受體之不存在並 不減輕網狀紅血球耗竭。與在野生型小鼠中使用雙特異性抗TfR/BACE1無效應子抗體之其他實驗一致，在所治療之Fcγ剔除小鼠中未觀測到不利臨床癥兆。
為確定效應子功能之存在是否足以驅動急性臨床症狀，且未經一步表徵效應子功能對網狀紅血球耗竭之貢獻，在野生型小鼠中重複該等實驗，將低劑量(5mg/kg)之無效應子抗TfRD/BACE1 D265A與相等劑量之全效應子陽性抗TfRD/BACE1相比較(圖3C)。在將效應子功能引入雙特異性抗體中後觀測到急性臨床癥兆。此外，在較低劑量下，相對於抗體之無效應子形式，利用效應子陽性抗體觀測到穩健網狀紅血球耗竭(圖3C及2C)。根據此組合數據，效應子功能對於驅動網狀紅血球耗竭係不必要的，但明顯有助於此耗竭，特別地在較低劑量下。重要的係，將小鼠中所觀測到之急性臨床症狀與抗體之效應子狀態聯繫起來，以使得無效應子抗體或Fcγ剔除小鼠均完全減輕該等症狀。
為確定臨床症狀或網狀紅血球之損失中是否涉及補體級聯，再次在缺乏補體C3之小鼠(即缺少正常補體級聯之小鼠)中實施該等實驗。如圖3D中所顯示，效應子陽性抗TfRA在該等小鼠中引起顯著網狀紅血球耗竭及穩健急性臨床症狀，此指示當所投與抗體具有全效應子功能時，補體C3及相關補體級聯在驅動任一所觀測到之效應中不起主要作用。為測試在不存在全效應子功能之情況下是否可獲得相同結果，向C3剔除小鼠投藥無效應子抗TfRD/BACE1抗體，以確定補體是否介導殘餘網狀紅血球耗竭。結果係顯示於圖3E中。的確，當藉由以高治療劑量(50mg/kg)向C3剔除小鼠投藥無效應子抗TfR雙特異性抗體來消除效應子功能及補體級聯時，殘餘網狀紅血球耗竭減少。因此，補體似乎充當在小鼠中投與無效應子抗TfR抗體後網狀紅血球耗竭之機制。
亦實施活體外補體依賴性細胞毒性(CDC)分析。簡言之，使用原代小鼠骨髓細胞或小鼠紅白血病淋巴母細胞(HPA Cultures,UK)作為標靶細胞及源自兔血清(EMD Chemicals,Gibbstown NJ)之補體實施CDC分析。計數細胞並藉由Vi-CellTM(Beckman Coulter,Fullerton,CA)測定活力。將抗TfRA/BACE1、抗TfRA或陰性或陽性對照抗體(分別IgG或抗H2Kb)1：4連續稀釋於分析培養基(補充有20mM HEPES pH 7.2及1% FBS之RPMI-1640培養基)中，並分佈至白色平底96孔組織培養板(Costar；Corning,Acton MA)中。在添加1：3稀釋於分析培養基中之血清補體及標靶細胞(2×105個細胞/孔)後，在37℃下利用5% CO2將該板培育2小時。然後將該板置於室溫下10分鐘，同時不停搖動。藉由利用SpectroMaxTM M5板讀數器量測發光強度來量化細胞溶解程度。將樣品稀釋液之發光值對抗體濃度作圖，且使用GraphPadTM(GraphPad Software公司)將劑量反應曲線擬合至四參數模型。
令人感興趣地，在存在血清補體之情況下小鼠細胞之單特異性效應子功能勝任抗TfRA或無效應子雙特異性抗TfRA/BACE1治療均不導致該等細胞之補體介導之溶解，而抗H2Kb陽性對照顯示顯著細胞溶解(圖4A)。值得注意的係，該等抗體之不同效應子活性似乎不影響其引發CDC活性之能力。一種非限制性解釋係，補體可經由脾及肝巨噬細胞對循環網狀紅血球之助噬作用活體內調介網狀紅血球耗竭(Garratty(2008),Transfusion Med.18(6)：321-334；Mantovani等人，(1972)J.Exp.Med.135：780-792；Molina等人，(2002)Blood 100(13)：4544-4549)，一種抗TfR F(ab’)2片段必須完整之機制。
亦實施類似活體外實驗，以證實先前所闡述支持效應子功能介導之抗體依賴性之細胞介導之細胞毒性(ADCC)、急性臨床症狀及網狀紅血球耗竭之間之聯繫之活體內結果。使用剛自健康供體分離之PBMC作為效應細胞以及原代小鼠骨髓細胞或小鼠紅白血病淋巴母細 胞(HPA Cultures,UK)作為標靶細胞，實施ADCC分析。為使源自FcγRIIIA之殘基158位置處之異型差異的供體變化最小化，將血液供體限制於攜帶雜合FcγRIIIA基因型(F/V158)之彼等。簡言之，藉由密度梯度離心使用Uni-Sep血液分離管(Accurate Chemical & Scientific；Westbury,NY)分離PBMC。利用鈣黃綠素AM(Molecule Probes)之1.4mM溶液預標記標靶細胞，並以4×104/孔將其接種於96孔圓底板(BD Biosciences；Mississauga,Ontario；Canada)中。將抗TfR/BACE1、抗TfR及對照抗體之連續稀釋液添加至含有該等標靶細胞之板中，隨後在37℃下利用5%二氧化碳培育30分鐘，以允許助噬。在4倍連續稀釋後，抗體之最終濃度係在1,000ng/mL至0.004ng/mL之範圍內。培育後，將存於100μL分析培養基中之1×106個PBMC效應細胞添加至每一孔中，從而得到25：1之效應細胞對標靶細胞比率，且將該等板再培育3小時。在培育結束時使該等板離心，且使用SpectraMaxTM M5微板讀數器量測上清液中之螢光信號，其中在485nm下激發並在520nm下發射。僅含有標靶細胞之孔之信號代表鈣黃綠素AM自經標記細胞之自發釋放(自發釋放)，而含有利用TritonTM X-100溶解之標靶細胞之孔提供可獲得之最大信號(最大溶解)。在含有標靶細胞及效應細胞而未添加抗體之孔中量測非抗體依賴性細胞細胞毒性(AICC)。特異性ADCC之程度係如下來計算：% ADCC=100×(樣品信號-AICC)÷(最大溶解-自發釋放)
將樣品稀釋液之ADCC值對抗體濃度作圖，且使用GraphPadTM(GraphPad Software公司)利用四參數模型擬合劑量反應曲線。
此分析中所使用之抗TfRA具有效應子功能，而該分析中所使用之抗TfRA/BACE1不具有效應子功能。如圖4B中所顯示，具有效應子功能之抗體誘導ADCC，而缺少效應子功能之抗TfRA/BACE1抗體不誘導ADCC，此與先前小鼠實驗結果相關。該等數據進一步支持如下 理念：所治療小鼠中之急性臨床癥兆歸因於由結合循環網狀紅血球之效應子陽性抗體積極引發之ADCC，且效應子驅動之ADCC亦可有助於在抗體投與後之網狀紅血球耗竭(圖3C)。
實例2C：調節Fc或BACE1結合之影響
針對在介導網狀紅血球耗竭中之潛在參與，各自分開檢查Fc臂及BACE1臂之作用。生成其中野生型IgG1 Fc區具有全效應子功能及正常糖基化之單特異性及雙特異性抗TfR。簡言之，TfR(孔洞)及IgG(隆凸)半抗體係於CHO中分開表現，並如所闡述活體外退火(Carter,P.(2001)J.Immunol.Methods 248,7-15；Ridgway,J.B.、Presta,L.G.及Carter,P.(1996)Protein Eng.9,617-621；Merchant,A.M.、Zhu,Z.、Yuan,J.Q.、Goddard,A.、Adams,C.W.、Presta,L.G.及Carter,P.(1998)Nat.Biotechnol.16,677-681；Atwell,S.、Ridgway,J.B.、Wells,J.A.及Carter,P.(1997)J.Mol.Biol.270,26-35)。藉由利用經固定化胃蛋白酶消化自抗TfR IgG、抗TfR/IgG或抗TfR/BACE1抗體生成F(ab’)2片段。該抗體在100mM乙酸鈉(pH 4.2)中重構，並在37℃下在旋轉的同時利用固定化胃蛋白酶樹脂(0.3mL固定凝膠/mg IgG)培育過夜。培育後，使該樣品離心，以使經固定化胃蛋白酶與F(ab’)2經消化之混合物分離。然後使用SP瓊脂糖凝膠(強陽離子交換樹脂，1mL HiTrapTM管柱(Supelco))純化F(ab’)2片段。將該樣品裝載於50mM NaOAc pH 5.0中，並利用0M-0.5M NaCl梯度經20管柱體積溶析，其後針對PBS pH 7.4對該樣品進行透析。利用該等抗體及F(ab’)2使用與上文相同之程序及單特異性F(ab’)2之靜脈內25mg/kg劑量或雙特異性或對照F(ab’)2或抗體之靜脈內50mg/kg劑量實施小鼠實驗；靜脈內注射抗體/F(ab’)2後24小時評估全血樣品之總網狀紅血球計數。結果係顯示於圖5A-5C中。
抗TfRD F(ab’)2之投與具有與抗TfRD抗體之投與極類似之網狀紅 血球耗竭效應(將圖5A與圖3A及3B相比較)，此指示抗體之Fc部分對於在所評價之劑量下觀測到之網狀紅血球耗竭係不必要。儘管雙特異性F(ab’)2分子顯示相對於全長雙特異性IgG抗體，網狀紅血球耗竭稍有減弱(將圖5B與圖2C相比較)，但應注意，此最可能歸因於F(ab’)2相對於IgG之通常較快速清除(Covell等人，(1986)Cancer Res.46：3969-3978)，此導致在24小時投藥後間隔內總體減少之抗體暴露。然而，在投與雙特異性F(ab’)2抗體後所觀測到之網狀紅血球耗竭進一步強調如下結論：Fc區對於網狀紅血球耗竭發生係不必要。缺少BACE1臂之雙特異性抗體(抗TfRD/對照IgG)使網狀紅血球耗竭至與抗TfRD/BACE1相同之程度(圖5C)，此證明BACE1臂亦不有助於網狀紅血球消除。
實例3：進一步改造結合親和力
某些上文結果表明觀測到之網狀紅血球耗竭程度中有親和力及劑量分量(圖2C)。為較好理解親和力及劑量乳和影響網狀紅血球耗竭，利用額外較低親和力抗TfR抗體、具體而言抗TfRE/BACE1以兩種不同劑量(25mg/kg及50mg/kg)實施重複實例2中之小鼠投藥實驗。任一所測試劑量之抗TfRE對網狀紅血球基本上無影響(圖6A)，而類似劑量之抗TfRA/BACE1或抗TfRD/BACE1使網狀紅血球耗竭。自實例1中所論述之結果，已觀測到，相比於抗TfRD/BACE1，抗TfRE/BACE1具有較好之持續血漿暴露及腦中存留，但跨越血腦屏障之運送較不穩健。考慮到抗TfRD/BACE1投與導致網狀紅血球耗竭，但抗TfRE/BACE1投與不導致網狀紅血球耗竭，生成親和力介於抗TfRD與抗TfRE對TfR之親和力之間之變體抗TfR，以檢查是否可在不犧牲BBB運送及腦中存留之情況下改善抗體之安全特性。
簡言之，採用定點誘變，以使用標準誘變技術將分別代表抗TfRD及抗TfRB變體之兩個點突變組合成指定為抗TfRDb之單一抗體。類似地，分別代表抗TfRD及抗TfRC變體之兩個點突變組合成指定為抗 TfRDc之單一抗體。使用實例2C中所闡述之隆凸及孔洞技術將兩種抗體與抗BACE1製成雙特異性格式。兩種抗體之親和力係介於抗TfRD與抗TfRE抗體對TfR之親和力之間，且抗TfRDb/BACE1抗體對TfR之親和力為抗TfRDc/BACE1抗體之大約3倍。利用該等新變體重複小鼠投與/網狀紅血球耗竭實驗，且結果係顯示於圖6B中。兩種變體證明相比於在相同劑量下利用抗TfRD/BACE1抗體所觀測到者顯著改善(即較少)之網狀紅血球耗竭，且在投藥後24小時時網狀紅血球含量近似於對照治療之小鼠。如人們所預期，當以相同劑量投與時，兩種新變體抗體隨時間之血漿抗體濃度、腦抗體濃度(最大值及隨時間之降低)及Aβ1-40之減少係介於抗TfRD/BACE1及抗TfRE/BACE1之間。
亦檢查親和力及劑量對TfR在血腦屏障處之表現之影響。利用單一劑量之抗TfRA/BACE1或抗TfRD/BACE1以5mg/kg、25mg/kg或50mg/kg治療小鼠，且在投藥後4天時經由西方墨點評價腦中之TfR表現。向來自抗體治療之小鼠之腦進行PBS灌注，然後提取，且使經分離皮質及海馬回於含有不含EDTA之完全性微型蛋白酶抑制劑錠劑(Roche Diagnostics)之存於PBS中之1% NP-40(Calbiochem)中勻質化。在4℃下使經勻質化腦轉動1小時，然後以14,000rpm旋轉20分鐘。分離上清液，且藉由4-12% Novex Bis-Tris凝膠(Invitrogen)分離相等濃度之蛋白質。在4℃下利用抗TfR(Invitrogen)及抗肌動蛋白(Abcam)抗體將膜培育過夜，隨後在室溫下利用IRDye®(Li-Cor Biosciences)二級抗體培育2小時。使免疫墨點成像，且藉由光密度測定法使用Odyssey紅外線成像系統TM軟體(Odyssey Infrared Imaging SystemTM software，Li-Cor Biosciences,Lincoln,NE)量化條帶。投藥後4天，所有三種經抗TfRD/BACE1治療之樣品中之TfR表現係類似的，但在較高劑量下相對於對照含量稍有下降(圖6C)。相比之下，漸增劑量之抗TfRA/BACE1抗體導致投藥後4天TfR在血腦屏障處之表現顯著降低。 因此，減少抗TfR抗體之親和力亦改善所觀測到之腦TfR表現之劑量依賴性減少，此潛在地進一步有助於改善抗體之總體安全特性。
實例4：BBB滲透性之評估
利用血腦屏障運送受體將異源分子運送至腦中之問題在於BBB本身可受損。因此，研究在投藥抗TfR後BBB對抗體之滲透性。向野生型小鼠靜脈內投與50mg/kg之對照IgG或25mg/kg之每一所示共注射抗體組合。使用通用人類Fc ELISA根據實例1或使用抗BACE1特異性ELISA根據與實例1中所闡述之彼等類似之程序來評估靜脈內注射後24小時腦中之平均抗體吸收。使用BACE1細胞外結構域作為外殼蛋白質，並利用山葵過氧化酶偶聯之F(ab’)2山羊抗人類IgG(Fc特異性多株抗體)實施檢測。此分析之LLOQ值對於抗BACE1而言為大約2.56ng/g且對於抗TfRD/BACE1而言為12.8ng/g。投與後使用實例1中所闡釋之相同程序量測腦Aβ1-40含量。
結果係顯示於圖7A-7C中。腦抗體暴露在對照IgG+抗TfRD/BACE1治療之小鼠中為最高，但在利用含有抗TfRD之抗體組合治療之小鼠中亦為實質性的(圖7A)。此與實例1中之結果相關，此乃因吸收抗TfRD之較低親和力雙特異性形式，並相比於抗TfRD之較高親和力單特異性形式其於腦中存留較長時間。與抗TfR抗體共投與之抗體並未大量吸收至腦中；在腦中所大量觀測到之唯一抗BACE1為與抗TfRD直接偶聯者(圖7B)。類似地，腦中所觀測到之唯一抗BACE1活性係在抗TfRD/BACE1治療之小鼠中(圖7C)。該等數據合起來指示血腦屏障對抗體之滲透性不受抗TfR治療影響。
實例5：多次投藥對網狀紅血球含量之影響
前述研究集中於單一劑量之抗TfR抗體及對網狀紅血球含量及相伴急性臨床症狀之所得影響。為確認在投與多個劑量後經較長時期後是否觀測到不同效應，實施其他研究。使用與先前實例中所闡述相同 之方案，唯有代替單一靜脈內劑量，向小鼠每週靜脈內投藥一次25mg/kg抗TfRD/BACE1或IgG對照，持續總共4週。在第二次注射後且在第四次注射後1天、4天或7天時收集組織/血液，並使用上文所闡述之方案進行加工。另外，根據製造商之說明書，使用IntegraTM 400(Roche,Indianapolis,IN)藉由比色分析針對血清樣品測定直接膽紅素、血清鐵及總的及不飽和鐵結合能力。每一時間點及治療群組使用6只小鼠。
在投與2個或4個劑量後抗TfRD/BACE1之血清抗體濃度隨時間係類似的，此表明重複投藥後小鼠血流中之清除實質上沒有區別(圖8A)。然而，相對於第二劑量後之相同時間，第四劑量後4天可看到總體抗體暴露之稍微降低，此表明針對所投與人類IgG抗體出現小鼠抗藥物抗體(ADA)。與血清抗體濃度類似，腦抗體濃度在第四劑量後4天降低，但腦中所存在之抗體隨時間之存留反映第二劑量後所觀測到者(圖8B)。投與2個或4個劑量後，Aβ1-40之血漿(圖8C)及腦(圖8D)含量與血清及腦中所存在之抗TfRD/BACE1之觀測量密切相關。
重要的係，在多個劑量背景下未觀測到網狀紅血球毒性之惡化。如圖8E中所顯示，絕對網狀紅血球數自第二劑量後1天至第四劑量後7天顯著增加(其中該等值返回至或超過對照含量)。無證據證明四週時紅血球量降低或血清鐵及總鐵結合能力(血清轉鐵蛋白之替代參數)變化。亦無證據證明組織病理學變化或任何所評價組織中之可染色鐵含量改變。不欲受限於理論，提出由初始劑量投與引發並持續整個投藥時期之增強之骨髓再生反應可負責改善第四劑量後所觀測到之總體網狀紅血球降低。另外，利用重複投藥，ADA之疑似存在進一步減少總體循環抗體含量，亦有助於第4週所觀測到之網狀紅血球耗竭之減輕。最後，第四劑量後1天、4天或7天，TfR之腦表現在抗TfRD/BACE1與對照IgG治療之小鼠之間沒有區別(圖8F)。
實例6：含有效應子及無效應子之雙特異性抗體對血液及骨髓中之紅血球祖細胞之影響
實施額外實驗，以闡明抗體投藥對骨髓中之紅血球祖細胞群之影響。首先，為檢查抗TfR/BACE1投藥後網狀紅血球損失之時程，在向野生型小鼠以200μL存於無菌PBS中之單一濃注形式靜脈內注射50mg/kg之對照IgG或缺少效應子功能之抗TfRD/BACE1(n=6/群組)後1小時、4小時、16小時及24小時，分離血液及骨髓。於投藥後所示時間點處自動物收穫血液及骨髓。異氟烷麻醉後使用眼采血用於血液提取，且自一股骨收穫骨髓，且製備單一細胞懸浮液。然後藉助70微米細胞濾器過濾細胞。洗滌細胞，並將其再懸浮於設定體積之PBS中。將固定體積之細胞懸浮液添加至固定濃度之FITC標記之螢光珠粒中，並於流式細胞儀上分析，收集5000個珠粒事件/樣品，以獲得細胞計數。藉由流式細胞術測定紅血球群之定量分析。在血液及骨髓中，藉由Ter119標記物(已經測定僅在鼠類成熟紅血球及紅血球前體細胞上表現之標記物)之表現、TfR表現及側向散射分佈篩選不同類紅血球群(如先前於Paniga等人，「Expression of Prion Protein in Mouse Erythroid Progenitors and Differentiating Murine Erythroleukemia Cells.」PLoS One 6,9(2011)中所闡述；圖9A及9B)。簡言之，於冰上利用抗小鼠Ter119-PE(eBioscience)及經生物素化抗小鼠TfR、隨後利用鏈黴抗生素-eFluor450(eBioscience)將樣品培育20分鐘。用含有0.5% BSA、2mM EDTA之PBS洗滌樣品，並在於BD LSR Fortessa多色流式細胞儀上運行，並使用FlowJo軟體(Ashland,OR)分析。
與對照IgG相比較，利用缺少效應子功能之抗TfRD/BACE1之治療不改變血液中之總紅血球數(圖9C)，但仍迅速且顯著減少血液中之表現TfR之循環網狀紅血球(圖9D)。與血液中之發現相比，無效應子抗TfRD/BACE1對骨髓中之任一紅系祖細胞群無影響(圖10A-C)，包括 高表現TfR之群(EryA及EryB群)(圖10B-C)及TfR陰性成熟紅血球(EryC群)(圖10D)。該等結果合起來證明無效應子抗TfRD/BACE1僅耗竭小鼠血液中之表現TfR之網狀紅血球，而在單一劑量後不影響骨髓中之其他類紅血球子群。
為研究全效應子功能抗體對血液及骨髓二者中之紅血球子群之影響，且為確定親和力是否在類紅血球耗竭起作用，根據如上之相同注射及樣品收集過程，向野生型小鼠提供25mg/kg之單一IV劑量之抗TfRA/BACE1(Fc-)、抗TfRD/BACE1(Fc-)、抗TfRD/BACE1(Fc+)或對照IgG(其中「Fc-」指示因存在突變D265A及N297G或因缺少糖基化而無效應子之抗體，且「Fc+」指示具有野生型效應子功能之抗體)。與對照IgG相比較，在抗體投藥後效應子功能之存在及對TfR之親和力均不影響循環血液中之總成熟紅血球數(圖11A)。為證實先前觀測結果，投藥無效應子抗TfR/BACE1抗體導致血液中之表現TfR之網狀紅血球迅速且持久降低(圖11B，與圖9D相比較)。此外，對TfR之親和力不改變雙特異性抗體驅動網狀紅血球損失之程度，此乃因投藥抗TfRA/BACE1(Fc-)或抗TfRD/BACE1(Fc-)之動物間在網狀紅血球降低之時程及量級方面均無顯著差異(圖11B)。然而，與無效應子雙特異性抗體相比較，投藥全效應子功能抗TfRD/BACE1(Fc+)導致網狀紅血球損失顯著惡化(圖11B)，此表明效應子功能在抗體投藥後網狀紅血球耗竭之嚴重性方面起重要作用。
在骨髓中，與對照IgG相比較，任一無效應子(Fc-)抗TfR雙特異性抗體均不改變總類紅血球數(圖11A)。然而，投藥後24hr時，全效應子功能抗TfRD/BACE1(Fc+)減少總類紅血球數(圖12A)。具體而言，與對照IgG相比較，在存在全效應子功能之情況下TfR陽性紅血球前體細胞(EryA及EryB群)顯著且穩健地減少，而無效應子抗TfR/BACE1抗體對TfR陽性類紅血球子群無影響(圖12B-C)。令人感興 趣地，與無效應子抗TfR/BACE1(Fc-)抗體及對照IgG相比較，在投藥全效應子功能抗TfRD/BACE1(Fc+)後在投藥後4小時及16小時時成熟紅血球數瞬時增加(圖12D)。在一種非限制性解釋中，此瞬時增加可歸因於驅動因應紅血球前體細胞耗竭而加速之紅血球成熟之繼發性代償機制。該等數據合起來表明無效應子抗TfR/BACE1抗體減輕骨髓中之TfR陽性類紅血球損失。
實例7：含有效應子及無效應子之單特異性及雙特異性抗體對人類紅白血病細胞系及原代骨髓單核細胞之影響
前述實例使用抗鼠類TfR抗體，其不特異性識別人類TfR。為確認小鼠研究中所觀測到之網狀紅血球耗竭對於鼠類系統是否為獨特的，利用結合至人類TfR之抗TfR實施其他實驗。
使用來自健康人類供體之外周血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞實施ADCC分析。使用人類紅白血病細胞系(HEL,ATCC)及原代人類骨髓單核細胞(AllCells公司)作為標靶細胞。為使可潛在地由FcγRIIIA中之殘基158位置處之異型差異引起之供體間可變性最小化，在第一組實驗中將血液供體限制於攜帶雜合RcγRIIIA基因型(F/V158)之彼等(圖13A-B)。對於第二組實驗(圖14A-B)，僅使用HEL細胞作為標靶細胞，其中PBMC來自攜帶F/V158基因型或FcγRIIIA V/V158基因型之健康人類供體。由於與增加之NK細胞介導之ADCC活性之已知關聯性以及結合IgG4抗體之能力，此分析中亦包括V/V158基因型(Bowles及Weiner,2005；Bruhns等人2008)。對細胞進行計數，並根據製造商之說明書，藉由Vi-CELL®(Beckman Coulter；Fullerton,CA)測定活力。
藉由密度梯度離心使用Uni-SepTM血液分離管(Accurate Chemical & Scientific公司；Westbury，NY)分離PBMC。將存於50μL之分析培養基(具有1% BSA及100單位/mL青黴素及鏈黴素之RPMI-1640)中之標 靶細胞以4×104/孔接種於96孔圓底板中。將測試及對照抗體之連續稀釋液(50μL/孔)添加至含有該等標靶細胞之板中，隨後在37℃下利用5% CO2培育30分鐘，以允許助噬。在5倍連續稀釋(總共10個數據點)後，抗體之最終濃度係在0.0051ng/mL至10,000ng/mL之範圍內。培育後，將存於100μL分析培養基中之1×106個PBMC效應細胞添加至每一孔中，從而得到25：1之效應細胞：標靶細胞比率，且將該等板再培育4小時。在培育結束時使該等板離心，且使用細胞毒性檢測套組TM(Roche Applied Scinece；Indianapolis,IN)測試上清液之乳酸去氫酶(LDH)活性。將LDH反應混合物添加至上清液中，且在室溫下將該等板培育15分鐘，同時不停搖動。利用1M H3PO4終止該反應，且在490nm(針對每一孔，減去在650nm下所量測之背景)下使用SpectraMax Plus微板讀數器量測吸光度。僅含有標靶細胞之孔之吸光度充當背景對照(低對照)，而含有利用Triton-X100溶解之標靶細胞之孔提供可獲得之最大信號(高對照)。在含有標靶細胞及效應細胞且未添加抗體之孔中量測非抗體依賴性細胞細胞毒性(AICC)。特異性ADCC之程度係如下來計算：
將樣品稀釋液之ADCC值對抗體濃度作圖，且使用SoftMax Pro將劑量反應曲線擬合至四參數模型。
在第一組實驗中，使用人類紅白血病細胞系(HEL細胞)或原代人類骨髓單核細胞作為標靶細胞評估各種抗人類TfR構築體之ADCC活性。在各種濃度下在ADCC分析中，使用抗gD WT IgG1作為陰性對照及鼠類抗人類HLA(I型)作為陽性對照，測試二價IgG1效應子功能勝任抗人類TfR1抗體15G11及此抗體之具有先前實例中所使用之抗 BACE1臂且呈具有廢除效應子功能之D265A及N297G突變之人類IgG1格式的雙特異性形式(參見實例6)。結果係顯示於圖13A及13B中。以HEL細胞作為標靶(圖13A)或骨髓單核細胞作為標靶(圖13B)，單特異性抗人類TfR抗體15G11引發顯著ADCC活性。此活性與陽性對照抗人類HLA抗體對HEL細胞之活性類似，且對骨髓單核細胞其位準穩健但低於陽性對照。骨髓單核細胞實驗中所觀測到之略低位準可能歸因於如下事實：該實驗中所使用之骨髓及紅血球譜系PBMC細胞之非勻質混合物中之僅一部分表現高含量之TfR，而HEL細胞遍及純系細胞群一致地具有高TfR表現。形成鮮明對比，雙特異性無效應子抗人類TfR/BACE1抗體在HEL或骨髓單核細胞中不展示任何ADCC活性，此與陰性對照類似。
在第二組實驗中，評估在此分析系統中切換抗體同型之影響。ADCC分析程序係與上文所闡述者相同，唯有所有標靶細胞均係HEL細胞，且效應細胞係來自攜帶雜合FcγRIIIa-V/F158基因型或純合FcγRIIIa-V/V158基因型之健康人類供體之PBMC。所有所測試抗人類TfR係具有抗gD之雙特異性抗體，具有三種不同Ig骨架：野生型人類IgG1、具有N297G突變之人類IgG1及人類IgG4。亦測試具有人類IgG4骨架之抗Aβ抗體，且小鼠抗人類HLA(I型)充當陽性對照。結果係顯示於圖14A及14B中。如基於已知效應細胞激活與V/V158基因型之間之聯繫所預期(Bowles及Weiner 2005)，相對於F/V158供體(影響約25%之標靶細胞)，V/V158供體PBMC更穩健地引發ADCC活性(影響約45%之標靶細胞)(將圖14A與圖14B相比較)。具有野生型IgG1之抗TfR/gD在HEL細胞中誘導穩健ADCC，而具有無效應子IgG1之抗TfR/gD在HEL細胞中不顯示任何ADCC活性，此重複來自第一組實驗之結果。值得注意的係，在100ng/mL或更高之濃度下，具有IgG4同型之抗TfR/gD顯示弱ADCC活性。在抗Aβ IgG4結果中未觀測到此活性，此 表明ADCC活性需要TfR結合。此發現與先前報導相關：IgG4具有極小但可量測之效應子功能(Adolffson等人，J.Neurosci.32(28)：9677-9689(2012)；van der Zee等人，Clin Exp.Immunol.64：415-422(1986))；Tao等人，J.Exp.Med.173：1025-1028(1991))。
因此，本文中之紅血球譜系細胞耗竭在小鼠中以TfR-及效應子功能依賴性方式發生之發現可直接轉移至人類系統。儘管已出於清晰理解之目的藉助圖解說明及實例相當詳細地闡述前述發明，但該等說明及實例不應理解為限制本發明之範圍。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容以引用的方式明確地全文併入本文中。
<110> 美商建南德克公司
<120> 改善血腦屏障運送之安全性之方法
<130> P4908R1 WO
<141> 2013-05-20
<150> US 61/763,915
<151> 2013-02-12
<150> US 61/698,495
<151> 2012-09-07
<150> US 61/649,878
<151> 2012-05-21
<160> 15
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 15

Claims (127)

  1. 一種以低親和力與血腦屏障受體(BBB-R)結合且與化合物偶合之抗體之用途，其用於製造用以在個體中運送化合物跨越該血腦屏障之醫藥，其中該用途方法包括使該抗體暴露於該血腦屏障，以使得該抗體運送該與抗體偶合之化合物跨越該血腦屏障，其中在向該個體投與抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。
  2. 一種以低親和力與血腦屏障受體(BBB-R)結合且與化合物偶合之抗體之用途，其用於製造用以增加個體之CNS暴露到化合物之醫藥，其中該化合物與該抗體偶合，從而增加CNS暴露到該化合物，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。
  3. 一種以低親和力與血腦屏障受體(BBB-R)結合且與化合物偶合之抗體之用途，其用於製造用以降低個體所接受投與化合物之清除率之醫藥，其中該化合物與該抗體偶合，以使得該化合物之清除率降低，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。
  4. 一種以低親和力與血腦屏障受體(BBB-R)結合且與化合物偶合之抗體之用途，其用於製造用以增加個體所接受投與化合物於CNS中之滯留之醫藥，其中該化合物與該抗體偶合，以使得增加該化合物於CNS中之滯留，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。
  5. 一種以低親和力與血腦屏障受體(BBB-R)結合且與化合物偶合之抗體之用途，其用於製造用以使在個體中之CNS中有效之化合物達最佳藥物動力學及/或藥效動力學之醫藥，其中該化合物與該 抗體偶合，且所選擇之該抗體應使其在與該化合物偶合後對該BBB-R之親和力得以讓該化合物所偶聯抗體跨越該BBB之運送量在CNS中達該化合物之最佳藥物動力學及/或藥效動力學，其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。
  6. 一種結合BBB-R且與化合物偶合之抗體之用途，其用於製造用以治療哺乳動物之神經性病症之醫藥，其中所選擇該抗體對該BBB-R具有低親和力，且從而改善該抗體及偶合化合物之CNS吸收，且其中在向該個體投與化合物偶合抗體時，可降低或消除該個體中之紅血球含量之減少現象。
  7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該BBB-R係選自由以下組成之群：轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
  8. 如請求項7之用途，其中該BBB-R係TfR。
  9. 如請求項8之用途，其中該等紅血球係未成熟紅血球。
  10. 如請求項9之用途，其中該等未成熟紅血球係網狀紅血球。
  11. 如請求項10之用途，其中網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。
  12. 如請求項11之用途，其中該抗體之一或多種性質已經改良，以在該個體或哺乳動物中減少該抗體對網狀紅血球含量之影響及/或減少急性臨床症狀之嚴重性或存在。
  13. 如請求項12之用途，其中該一或多種性質係選自抗體Fc區之效應子功能、該抗體之補體激活功能及該抗體對該BBB-R之親和力。
  14. 如請求項13之用途，其中該一或多種性質係選自該抗體Fc區之該效應子功能及該抗體之該補體激活功能，且其中相對於相同同型之野生型抗體，該效應子功能或補體激活功能已經減少或消除。
  15. 如請求項14之用途，其中藉由選自以下之方法減少或消除該效應子功能：減少該抗體之糖基化、將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型、及修飾該Fc區。
  16. 如請求項15之用途，其中藉由選自以下之方法減少該抗體之糖基化：在不容許野生型糖基化之環境中產生該抗體；去除該抗體上已存在之碳水化合物基團；及修飾該抗體，以使得不發生野生型糖基化。
  17. 如請求項16之用途，其中在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體，或其中以合成方式產生該抗體。
  18. 如請求項16之用途，其中該抗體之該Fc區包含位置297處之突變，以使得在彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。
  19. 如請求項15之用途，其中藉由該Fc區之至少一種修飾減少或消除該效應子功能。
  20. 如請求項19之用途，其中藉由缺失全部或一部分該Fc區或藉由改造該抗體來減少或消除該效應子功能或補體激活功能，以使得其不再包括勝任效應子功能或補體激活功能之Fc區或非Fc區。
  21. 如請求項19之用途，其中該修飾係選自：在該Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、 324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439；在該Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321；消除該Fc區之一些或全部，及CH1結構域之位置132處之點突變。
  22. 如請求項11之用途，其中投與之劑量及/或頻率係經調節以減少該等紅血球所暴露到抗體之濃度。
  23. 如請求項11之用途，其中該抗體係經修飾以包含與該BBB-R之pH敏感性結合。
  24. 如請求項11之用途，其中除該抗體以外再投與另一化合物。
  25. 如請求項24之用途，其中該另一化合物負責或有助於消除網狀紅血球含量減少現象。
  26. 如請求項25之用途，其中該另一化合物保護網狀紅血球免於與抗體相關之耗竭或支持網狀紅血球之生長、發育或重建。
  27. 如請求項26之用途，其中該另一化合物係選自紅血球生成素(EPO)、鐵補充物、維生素C、葉酸及維生素B12。
  28. 如請求項26之用途，其中該另一化合物係來自同一位或另一位個體之紅血球或網狀紅血球。
  29. 如請求項13之用途，其中進一步降低該抗體與該BBB-R之親和力。
  30. 如請求項1至6中任一項之用途，其進一步包含監測該個體之紅血球之耗竭之步驟。
  31. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該化合物係神經性病症藥物或顯像劑。
  32. 如請求項2至6中任一項之用途，其中該增加或降低係相對於對該BBB-R不具有降低之親和力之相同同型之野生型抗體量測。
  33. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該抗體不損害該BBB-R與其一或多種天然配體之結合。
  34. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該血腦屏障係在哺乳動物中。
  35. 如請求項34之用途，其中該哺乳動物患有神經性病症。
  36. 如請求項35之用途，其中該神經性病症係選自由以下組成之群：阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)、中風、癡呆、肌肉萎縮症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊性纖維變性、安格曼氏症候群(Angelman’s syndrome)、利德爾氏症候群(Liddle syndrome)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、匹克氏病(Pick’s disease)、佩吉特氏病(Paget’s disease)、癌症及創傷性腦損傷。
  37. 如請求項34之用途，其中該哺乳動物係人類。
  38. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該抗體對該BBB-R具有約1nM至約100μM之IC50。
  39. 如請求項38之用途，其中該IC50係約5nM至約100μM。
  40. 如請求項38之用途，其中該IC50係約50nM至約100μM。
  41. 如請求項38之用途，其中該IC50係約100nM至約100μM。
  42. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該抗體對該BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。
  43. 如請求項1至6中任一項之用途，其中與該化合物偶合之該抗體對該BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。
  44. 如請求項1至6中任一項之用途，其中與該化合物偶合之該抗體對該BBB-R具有約30nM至約1μM之親和力。
  45. 如請求項1至6中任一項之用途，其中與該化合物偶合之該抗體對該BBB-R具有約30秒至約5分鐘或約30秒至約2分鐘之解離半衰 期。
  46. 如請求項8之用途，其中該抗體不抑制TfR至轉鐵蛋白之結合。
  47. 如請求項1至6中任一項之用途，其中與該化合物偶合之該抗體係以治療劑量投與。
  48. 如請求項47之用途，其中該治療劑量係BBB-R飽和劑量。
  49. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該抗體係多特異性抗體，且該化合物視情況形成該多特異性抗體之一部分。
  50. 如請求項49之用途，其中該多特異性抗體包含結合該BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。
  51. 如請求項50之用途，其中該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、杭丁頓氏蛋白(huntingtin)、普里昂蛋白(prion protein，PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白(parkin)、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)及半胱天冬酶6。
  52. 如請求項51之用途，其中該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。
  53. 如請求項51之用途，其中該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。
  54. 一種改善結合BBB-R之抗體於個體中之安全性之方法，其包含改良該抗體之一或多種性質，以使得該抗體之投與降低或消除在接受未經修飾抗體之個體中所觀測到之紅血球含量減少現象。
  55. 一種製造具有改善之安全性來運送化合物跨越BBB之抗體之方法，其包括選擇特異性針對血腦屏障受體(BBB-R)且對該BBB-R具有期望地低親和力之抗體，及改良該抗體之一或多種性質，以使得該抗體之投與降低或消除在接受未經修飾抗體之個體中 所觀測到之紅血球含量減少現象。
  56. 如請求項54或55之方法，其中該BBB-R係選自由以下組成之群：轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
  57. 如請求項56之方法，其中該BBB-R係轉鐵蛋白受體(TfR)。
  58. 如請求項57之方法，其中該等紅血球係網狀紅血球。
  59. 如請求項58之方法，其中網狀紅血球含量之減少伴隨有急性臨床症狀。
  60. 如請求項59之方法，其中該一或多種性質係選自抗體Fc區之效應子功能、該抗體之補體激活功能、及該抗體對該BBB-R之親和力。
  61. 如請求項60之方法，其中該一或多種性質係選自該抗體Fc區之該效應子功能及該抗體之該補體激活功能，且其中相對於相同同型之野生型抗體，該效應子功能或該補體激活功能已經減少或消除。
  62. 如請求項61之方法，其中藉由選自以下之方法來減少或消除該效應子功能：減少該抗體之糖基化、將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型，及修飾該Fc區。
  63. 如請求項62之方法，其中藉由選自以下之方法減少該抗體之糖基化：在不容許野生型糖基化之環境中產生該抗體；去除該抗體上已存在之碳水化合物基團；及修飾該抗體，以使得不發生野生型糖基化。
  64. 如請求項63之方法，其中在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體，或其中以合成方式產生該抗體。
  65. 如請求項63之方法，其中該抗體之該Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。
  66. 如請求項62之方法，其中藉由該抗體之該Fc區或非Fc區之至少一種修飾減少或消除該效應子功能或該補體激活功能。
  67. 如請求項66之方法，其中藉由缺失全部或一部分該Fc區或藉由改造該抗體來減少或消除該效應子功能或補體激活功能，以使得其不包括勝任效應子功能或補體激活功能之Fc區。
  68. 如請求項66之方法，其中該修飾係選自：在該Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438及439；在該Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321；消除該Fc區之一些或全部，及CH1結構域之位置132處之點突變。
  69. 如請求項59之方法，其中投與之劑量及/或頻率係經調節以減少該等紅血球所暴露到抗體之濃度。
  70. 如請求項59之方法，其中該抗體係經修飾以包含與該BBB-R之pH敏感性結合。
  71. 如請求項60之方法，其中進一步降低該抗體對該BBB-R之親和力。
  72. 如請求項71之方法，其中相對於對該BBB-R不具有降低之親和力之相同同型之野生型抗體量測該降低程度。
  73. 如請求項54或55之方法，其中對該BBB-R之親和力係約1nM至 約100μM。
  74. 如請求項73之方法，其中該抗體具有約1nM至約100μM之IC50。
  75. 如請求項73之方法，其中該IC50係約5nM至約100μM。
  76. 如請求項73之方法，其中該IC50係約50nM至約100μM。
  77. 如請求項73之方法，其中該IC50係約100nM至約100μM。
  78. 如請求項54至71中任一項之方法，其中該抗體對該BBB-R具有約5nM至約50μM之親和力。
  79. 如請求項54或55之方法，其中該抗體對該BBB-R具有約30秒至約5分鐘或約30秒至約2分鐘之解離半衰期。
  80. 如請求項54或55之方法，其中該抗體係基於所選抗體之親和力選自一組抗體。
  81. 如請求項54或55之方法，其中該抗體係經改造以具有該親和力。
  82. 如請求項54或55之方法，其包含使該抗體與治療化合物偶合。
  83. 如請求項82之方法，其中該治療化合物係神經性病症藥物。
  84. 如請求項82之方法，其中與該化合物偶合之該抗體對該BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。
  85. 如請求項83之方法，其中該抗體係多特異性抗體，且該化合物視情況形成該多特異性抗體之一部分。
  86. 如請求項54或55之方法，其中該抗體係多特異性抗體，該多特異性抗體包含結合該BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。
  87. 如請求項86之方法，其中該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋白、 CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)及半胱天冬酶6。
  88. 如請求項87之方法，其中該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。
  89. 如請求項87之方法，其中該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。
  90. 如請求項54或55之方法，其中該抗體不損害該BBB-R與其一或多種天然配體之結合。
  91. 如請求項90之方法，其中該抗體不抑制TfR與轉鐵蛋白之結合。
  92. 一種與BBB-R結合之抗體，其中該抗體對該BBB-R之親和力係約5nM至約50μM，或該抗體對該BBB-R之解離半衰期係約30秒至約2分鐘，且其中該抗體之一或多種性質已經改良以減少至少一種對紅血球之不期望副效應。
  93. 如請求項92之抗體，其中該BBB-R係選自由以下組成之群：轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體(IGF受體)、低密度脂蛋白受體相關蛋白8(LRP8)、低密度脂蛋白受體相關蛋白1(LRP1)、葡萄糖轉運體1(Glut1)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。
  94. 如請求項93之抗體，其中該BBB-R係轉鐵蛋白受體(TfR)。
  95. 如請求項94之抗體，其中該等紅血球係網狀紅血球。
  96. 如請求項95之抗體，其中該至少一種對紅血球之不期望副效應係選自網狀紅血球含量之減少及急性臨床症狀。
  97. 如請求項96之抗體，其中該一或多種性質係選自該抗體Fc區之效應子功能、該抗體之補體激活功能、及該抗體對該BBB-R之親和力。
  98. 如請求項97之抗體，其中該一或多種性質係選自該抗體Fc區之該效應子功能及該抗體之該補體激活功能，且其中相對於相同同型之野生型抗體，該效應子功能或補體激活功能已經減少或消除。
  99. 如請求項98之抗體，其中藉由選自以下之方法來減少或消除該效應子功能：減少該抗體之糖基化、將該抗體同型修飾成天然減少或消除效應子功能之同型，及修飾該Fc區。
  100. 如請求項99之抗體，其中藉由選自以下之方法減少該抗體之糖基化：在不容許野生型糖基化之環境中產生該抗體；去除該抗體上已存在之碳水化合物基團；及修飾該抗體，以使得不發生野生型糖基化。
  101. 如請求項100之抗體，其中在非哺乳動物細胞產生系統中產生該抗體，或其中以合成方式產生該抗體。
  102. 如請求項100之抗體，其中該抗體之該Fc區包含位置297處之突變，以使得彼位置處之野生型天冬醯胺殘基被另一個可干擾彼位置處糖基化之胺基酸置換。
  103. 如請求項99之抗體，其中藉由該Fc區或非Fc區之至少一種修飾減少或消除該效應子功能或補體激活功能。
  104. 如請求項103之抗體，其中藉由缺失全部或一部分該Fc區或藉由改造該抗體來減少或消除該效應子功能或補體激活功能，以使得其不包括勝任效應子功能之Fc區。
  105. 如請求項103之抗體，其中該修飾係選自：在該Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與一或多種Fc受體之結合：238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、297、298、301、303、322、324、327、329、333、338、340、373、376、382、388、389、 414、416、419、434、435、437、438及439；在該Fc區中選自以下之位置進行點突變以損害其與C1q之結合：270、322、329及321；消除該Fc區之一些或全部，及CH1結構域之位置132處之點突變。
  106. 如請求項97之抗體，其中該抗體係經修飾以包含與該BBB-R之pH敏感性結合。
  107. 如請求項97之抗體，其中進一步降低該抗體對該BBB-R之親和力。
  108. 如請求項107之抗體，其中相對於對該BBB-R不具有降低之親和力之相同同型之野生型抗體量測該降低程度。
  109. 如請求項92之抗體，其中該親和力係量測為IC50。
  110. 如請求項92之抗體，其中該抗體係基於所選抗體之親和力選自一組抗體。
  111. 如請求項92之抗體，其中該抗體係經改造以具有該親和力。
  112. 如請求項92之抗體，其進一步與治療化合物偶合。
  113. 如請求項112之抗體，其中該治療化合物係神經性病症藥物。
  114. 如請求項112之抗體，其中與該化合物偶合之該抗體對該BBB-R具有約30nM至約30μM之親和力。
  115. 如請求項112之抗體，其中該抗體係多特異性抗體，且該化合物視情況形成該多特異性抗體之一部分。
  116. 如請求項92之抗體，其中該抗體係多特異性抗體，該多特異性抗體包含結合該BBB-R之第一抗原結合位點及結合腦抗原之第二抗原結合位點。
  117. 如請求項116之抗體，其中該腦抗原係選自由以下組成之群：β-分泌酶1(BACE1)、Aβ、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、tau、脂蛋白元E4(ApoE4)、α-突觸核蛋 白、CD20、杭丁頓氏蛋白、普里昂蛋白(PrP)、多白胺酸重複激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6(DR6)、類澱粉前體蛋白(APP)、p75神經滋養蛋白受體(p75NTR)及半胱天冬酶6。
  118. 如請求項117之抗體，其中該多特異性抗體結合TfR及BACE1二者。
  119. 如請求項117之抗體，其中該多特異性抗體結合TfR及Aβ二者。
  120. 如請求項92至119中任一項之抗體，其中該抗體不損害該BBB-R與其一或多種天然配體之結合。
  121. 如請求項120之抗體，其中該抗體不抑制TfR與轉鐵蛋白之結合。
  122. 一種以低親和力與BBB-R結合且不影響紅血球含量之抗體之用途，其用於製造用以治療神經性病症之醫藥。
  123. 一種如請求項92至121中任一項之抗體之用途，其用於製造用以治療神經性病症之醫藥。
  124. 一種以低親和力與BBB-R結合且不影響紅血球含量之抗體，其用於治療神經性病症。
  125. 如請求項92至119中任一項之抗體，其用於治療神經性病症。
  126. 一種包含至少部分效應子功能之抗TfR抗體之用途，其用於製造醫藥，治療個體中與升高之紅血球含量相關或由其引起之疾病或病症。
  127. 如請求項126之用途，其中投藥步驟係在經校準以使抗體投與之急性臨床症狀最小化之劑量及/或投藥頻率下進行。
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