DE19947010A1 - Das Gen PRV-1 und dessen Verwendung - Google Patents
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Abstract
Es wird eine Nucleotidsequenz beschrieben, die für das PRV-1-Protein codiert und im wesentlichen die Sequenz ID Nr. 1 umfaßt, sowie ein Verfahren zum Nachweis dieses Gens und des durch dieses Gen codierten Polypeptids.
Description
Die Erfindung betrifft eine Nucleotidsequenz, die das PRV-1-
Gen codiert, rekombinante DNA, die diese Nucleotidsequenz
enthält, Vektoren, die die rekombinante DNA enthalten und
damit transformierte Zellen, sowie ein PRV-1-Polypeptid,
Antikörper gegen dieses Polypeptid, Verfahren zum Nachweis des
PRV-1-Polypeptids und Arzneimittel enthaltend das PRV-1-
Polypeptid oder gegen das PRV-1-Polypeptid gerichtete
Antikörper.
Die Polycythaemia rubra vera, auch als Polycythaemia vera oder
P. vera bezeichnet, ist eine maligne hämatologische
Erkrankung, bei der eine vermehrte Bildung erythroider,
granulozytärer und megakaryozcytärer Zellen vorliegt. Die
Erkrankung ist klonalen Ursprungs und entsteht durch Mutation
einer einzigen hämatopoietischen Vorläuferzelle. Die Inzidenz
der P. vera beträgt 4 bis 6 pro Million Einwohner in
Deutschland. Unbehandelt führt die Krankheit innerhalb von 18
Monaten zum Tod. Eine Behandlung durch Aderlässe oder
Chemotherapie verlängert die durchschnittliche Überlebensdauer
auf über 13 Jahre.
Die Diagnose der P. vera erfolgt über klinische Kriterien. Zum
klinischen Bild gehören Kopfschmerzen, Puritus, Splenomegalie
bei zwei Drittel der Patienten, Blutungen oder Thrombosen,
Bluthochdruck bei einem Drittel der Patienten, Gicht,
ausgelöst durch gesteigerte Harnsäureproduktion und in manchen
Fällen septische Ulcera. Der wichtigste Laborbefund ist eine
Erhöhung der Werte für Hämoglobin, Hämatokrit,
Erythrozytenzahl und Erythrozytengesamtvolumen sowie eine
neutrophile Granulozytose oder Thrombozytose in vielen Fällen.
Da einerseits die meisten Kriterien eher diffus sind und
andererseits nicht alle Patienten diese Kriterien erfüllen,
ist es häufig schwierig, die P. vera von anderen
myeloproliferativen Erkrankungen, wie chronischer myeloischer
Leukämie, oder essentieller Thrombozytämie, abzugrenzen und
damit die Diagnose zu sichern. Die molekulare Ursache der P.
vera ist bisher vollkommen unbekannt. Da aber die P. vera,
wenn sie nicht behandelt wird, einen schweren Verlauf nimmt,
ist eine genaue Diagnose wichtig.
Eine Aufgabe der Erfindung war es daher, die molekulare
Ursache der Polycythaemia rubra vera aufzufinden und eine
Möglichkeit zu ihrer Diagnose zu schaffen.
Diese Aufgabe wurde gelöst, indem ein Gen isoliert wurde, das
spezifisch bei P, vera und nicht bei gesunden Kontrollen
exprimiert wird. Dieses Gen wird als PRV-1-Gen (Polycythaemia
rubra vera) bezeichnet.
Eine ähnliche Nucleotidsequenz wird in der internationalen
Anmeldung WO 98/50552 offenbart.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Polynucleotid, das
für das PRV-1-Gen codiert und im wesentlichen die Sequenz ID
Nr. 1 umfaßt. Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung
können einzel- oder doppelsträngige DNA oder RNA sein. Falls
es sich um RNA handelt, ist dem Fachmann klar, daß anstelle
von "T"-Nucleotiden "U"-Nucleotide vorliegen. Unter
"Polynucleotid" sind Nucleinsäuren mit 15 oder mehr
Nucleotiden zu verstehen.
Die erfindungsgemäße Nucleotidsequenz ist in Fig. 1
wiedergegeben. Gegenstand der Erfindung ist daher ein
Polynucleotid, das der Sequenz von Fig. 1 entspricht, sowie
ein Polynucleotid, dessen Nucleotidsequenz geringfügige
Abweichungen aufweist. Unter geringfügigen Abweichungen werden
im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Sequenzen
verstanden, bei denen einige wenige, vorzugsweise nicht mehr
als 50 und besonders bevorzugt nicht mehr als 25 Nucleotide
ausgetauscht sein können, wobei jedoch die Funktion des durch
die Nucleotidsequenz kodierten Gens nicht berührt wird. Dem
Fachmann ist bekannt, daß ein für eine Aminosäure kodierendes
Basentriplett durch ein anderes Triplett ersetzt werden kann,
das für dieselbe Aminosäure kodiert. Darüber hinaus können
weniger wichtige Bereich geringfügig deletiert und/oder
mutiert sein. In einer besonderen Ausführungsform umfaßt das
Polynucleotid die Nucleotide 36 bis 1346 der Sequenz Nr. 1,
also den kodierenden Bereich des PRV-1-Gens. Eine weitere
Ausführungsform umfaßt die Nucleotide 36 bis 1262 von Sequenz
Nr. 1. Dieser Bereich kodiert vermutlich für den aktiven
Bereich des PRV-1-Polypeptids. Das Polynucleotid der Erfindung
kann schließlich auch die Nucleotide 39 bis 1346 oder 39 bis
1262 von Sequenz Nr. 1 umfassen, so daß das Codon, das für das
Start-Methionin kodiert, nicht enthalten ist. Eine bevorzugte
Ausführungsform ist ein Polynucleotid, das die Nucleotide 99-
1346 oder 99 bis 1262 von Sequenz Nr. 1 umfaßt. Es sind damit
die Codons am 5'-Ende, die für das Signalpeptid des PRV-1-
Polypeptids kodieren, nicht enthalten.
Das erfindungsgemäße Polynucleotid kann auch ein Fragment des
PRV-1-Gens sein. Das Fragment weist in der Regel mehr als 100
Nucleotide auf, bevorzugt aber mehr als 300 Nucleotide. Die
Fragmente können auch als Primer oder als Sonden insbesondere
für die PCR eingesetzt werden, in diesem Fall können die
Fragmente dem Zweck entsprechend verkürzt sein. Üblicherweise
haben Primer eine Länge zwischen 10 und 30 Nucleotiden und
Sonden eine Länge zwischen 15 und 50 Nucleotiden.
Das PRV-1-Gen ist ein körpereigenes Gen, das jedoch bei
gesunden Personen nur auf wenige Organe beschränkt exprimiert
wird. Normalerweise wird es im wesentlichen in den
blutbildenden Organen, d. h. im Knochenmark und fötaler Leber,
und schwach in der Milz exprimiert, nicht jedoch in Herz,
Muskel, Pankreas oder Niere. Bei Patienten, die unter P. vera
leiden, wird dieses Gen, vor allem in den hämatopoietischen
Zellen, sehr stark überexprimiert.
Das PRV-1-Gen kodiert für ein Protein, das die in Fig. 2
gezeigte Proteinsequenz aufweist. Das Signalpeptid, das in der
Proteinsequenz sämtlicher Oberflächenmoleküle enthalten ist
und bei der Prozessierung des Proteins üblicherweise entfernt
wird, ist durch einen Bindestrich abgetrennt. Das Protein hat
die Sequenz ID Nr. 2. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist
also ein im wesentlichen reines Polypeptid der Sequenz Nr. 2
oder ein Polypeptid der Sequenz Nr. 2, bei dem das
Signalpeptid nicht vorhanden ist (Aminosäuren 22 bis 437 von
Sequenz Nr. 2). Weitere Ausführungsformen umfassen die
Aminosäuren 1 bis 409 oder 22 bis 409 der Sequenz Nr. 2
(vermutlich aktiver Bereich des Proteins).
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist im Hinblick auf die
biologische Aktivität vorzugsweise glycosyliert, am
bevorzugtesten ist es N-glycosyliert. Es kann dann an
wenigstens einer der Aminosäuren Asn-46, Asn-189 und Asn-382
des PRV-1-Polypeptids glycosyliert sein (Die Aminosäurenzahlen
beziehen sich auf die Sequenz Nr. 2). Die Erfindung schließt
auch Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide ein, die N
glycosyliert sind. Die Fragmente sind wenigstens 50
Aminosäuren lang, bevorzugt wenigstens 100 Aminosäuren, am
bevorzugtesten wenigstens 150 Aminosäuren. In einer anderen
Ausführungsform kann das Polypeptid O-glycosylisert sein.
Dem Fachmann ist klar, daß bestimmte Aminosäuren gegen andere
ausgetauscht sein können ohne die biologische Aktivität des
Proteins zu beeinträchtigen. Solche abgewandelten Formen der
erfindungsgemäßen Polypeptide sind auch Gegenstand der
Erfindung. Bei den Aminosäureaustauschen handelt es sich um
solche, die die biologische Aktivität des Proteins nicht
negativ beeinträchtigen. Für die Auswahl der Austausche kann
der Fachmann auf allgemein bekannte Regeln zurückgreifen.
Das PRV-1-Polypeptid kann herstellungsbedingt beispielsweise
einen Glycosylphosphatidylinositol-Anker aufweisen. Dieser ist
dann an den Aminosäuren gebunden, die den Aminosäuren 407 bis
409 der Sequenz ID Nr. 2 entsprechen. Ein GPI-Anker dient
dazu, ein Protein mittels eines Lipids auf der Außenseite der
Zellmembran zu verankern. Aus bislang nicht endgültig
geklärten Gründen beobachtet man aber häufig, daß GPI-gelinkte
Proteine auch ins Medium abgegeben werden. Man spricht von
einem sogenannten "shedding". Ob dies ein spezifischer Prozeß
ist, das heißt solche Proteine in einer kontrollierten Weise
von Enzymen aus der Membran abgespalten werden, oder ob es ein
unspezifischer Verlust des Ankers ist, ist bislang nicht
geklärt. Es ist also sehr wahrscheinlich, daß PRV-1 sowohl an
der Zellmembran als auch extrazellulär zu finden ist. Für die
Wirkung als Wachstumsfaktor ist wahrscheinlich die
sezernierte, nicht Membran-gebundene Form wichtiger, da sie
als Wachstumsfaktor diffundieren und andere Zellen erreichen
kann.
Dem Fachmann ist klar, daß er durch Manipulation dieser
Aminosäuren die Membranständigkeit des Proteins beeinflussen
kann. Dies betrifft vor allem die Herstellung bestimmter DNA-
Konstrukte, die zur Expression des PRV-1-Polypeptids oder von
Fragmenten davon bestimmt sind. Die Codons, die für diese
Aminosäuren kodieren, können mutiert oder deletiert sein.
Das Gen codiert für einen Oberflächenrezeptor der uPAR/Ly6-
Familie. Diese Rezeptorenfamilie kann mitogene Signale, d. h.
Signale, die die Zellteilung anregen, übertragen. Es wird
daher angenommen, daß die Überexpression des PRV-1-Gens, unter
anderem auf den Granulozyten von P. vera-Patienten, zu einer
Hyperproliferation dieser Zellen beiträgt.
Es wurde gefunden, daß weder bei gesunden Personen noch bei
Patienten mit anderen myeloproliferativen Erkrankungen, z. B.
mit chronischer myeloischer Leukämie, akuter myeloischer
Leukämie und essentieller Thrombozytämie, PRV-1 auf
Granulozyten exprimiert wird.
Um das von dem PRV-1-Gen codierte Polypeptid für Analysen und
Nachweisverfahren einsetzen zu können, wird es geeigneter
Weise aus rekombinanter DNA erzeugt, wobei die rekombinante
DNA bevorzugt die Nucleotidsequenz ID Nr. 1 oder wenigstens
den kodierenden Bereich des PRV-1-Gens, also die Nucleotide 36
bis 1346 von Sequenz ID Nr. 1, zumindest aber die Nucleotide
39 bis 1262, funktionell verbunden mit einem Promotor, umfaßt.
Die rekombinante DNA kann jedoch auch nur ein Fragment der
Sequenz Nr. 1 umfassen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, der die
rekombinante DNA für das PRV-1-Polypeptid oder ein Fragment
davon enthält, sowie eine mit diesem Vektor transfizierte oder
transformierte Wirtszelle. Die Wirtszellen können
prokaryontisch sein, beispielsweise Bakterien wie E. coli.
Dabei werden jedoch nicht-glycosylierte Polypeptide
exprimiert. Bevorzugt sind daher eukaryontische Wirtszellen,
die das exprimierte Protein posttranslational glycosylieren
und anderweitig modifizieren können. Beispiele für
eukaryontische Wirtszellen sind Insektenzellen wie Sf9-Zellen
zur Expression nach Infektion mit rekombinanten Baculoviren,
Säugerzellen wie COS-Zellen, CHO-Zellen, HeLa-Zellen. Diese
Beispiele sind nicht erschöpfend. Auch Hefezellen sind als
Wirtszellen möglich. Dem Fachmann ist klar, daß je nach
Wirtszelle das Glykosylierungsmuster unterschiedlich sein
kann. Damit kann auch die biologische Aktivität des
Expressionsprodukts variieren. Besonders bevorzugt sind
Wirtszellen, die das Expressionsprodukt derart glycosylieren,
daß die biologische Aktivität des Proteins erhalten ist.
Das aus Granulozyten gewonnene oder rekombinant erzeugte PRV-
1-Polypeptid kann sowohl zur Diagnose von Polycythämia vera
als auch zur Behandlung der Krankheit eingesetzt werden.
Eine Möglichkeit der Therapie besteht in der sogenannten
"Antisense-Therapie". Bei diesem Verfahren wird ein
"Antisense"-RNA-Molekül, also eine RNA, die komplementär ist
zu der PRV-RNA, eingesetzt. Da die PRV-1-RNA an ihrem Anfang
die Sequenz 5'-AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC-3' (Seq. ID-No. 3)
hat, würde die erforderliche Antisense-RNA gegen diese Sequenz
die folgende Nucleotidsequenz aufweisen: 5'-
GGCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT-3' (Seq. ID-No. 4). Diese Antisense-
RNA wird in einen Vektor eingebaut und in P. vera-Zellen
eingebracht. Das Einbringen dieser RNA erfolgt beispielsweise
über Transfektion, wobei der für die Transfektion verwendete
Vektor vorzugsweise so gestaltet ist, daß er spezifisch in die
P. vera-Zellen eingebracht wird. Die Expression der Antisense-
RNA bewirkt, daß die PRV-1-mRNA nicht mehr zu einem Polypeptid
translatiert werden kann. In derart behandelten Zellen
entsteht dann kein PRV-1-Protein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren
zum Nachweis von P. vera, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man das PRV-1-Polypeptid oder ein Epitop davon nachweist und
das Ausmaß der Expression bestimmt.
Eine Überexpression dieses Rezeptors auf reifen Zellen
außerhalb des Knochenmarks, z. B. auf Granulozyten, ist ein
starker Hinweis auf das Vorliegen der Erkrankung P. vera. Der
Nachweis erfolgt geeigneterweise mit einem Immunoassay unter
Verwendung von Antikörpern, die gegen den PRV-1-Rezeptor
gerichtet sind. Als Testverfahren eignen sich die bekannten
Varianten von Immunoassays, bei denen für das PRV-1-Polypeptid
spezifische Antikörper eingesetzt werden zusammen mit weiteren
markierten Antikörpern, die immobilisiert oder in Lösung sein
können. Die Markierung kann in an sich bekannter Weise
erfolgen, z. B. mit radioaktiven Isotopen, durch Fluoreszenz
oder Lumineszenz, mit Enzymen, durch farbbildende Reaktionen
oder sonstige zur Bestimmung geeigneten Gruppen. Diese
Varianten sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner
näheren Erläuterung. Erfindungsgemäß werden ELISA-Tests
besonders bevorzugt.
Die zum spezifischen Nachweis des PRV-1-Rezeptors
erforderlichen Antikörper können ebenfalls in an sich
bekannter Weise hergestellt werden. Geeignet sind sowohl
monoklonale als auch polyklonale Antikörper, wobei die
Verwendung monoklonaler Antikörper bevorzugt ist.
Für die Herstellung von Antikörpern können auch aus dem
Protein hergeleitete Peptide benutzt werden. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung wurden erfolgreich die Peptide mit den
Sequenzen:
- a) KVSDLPRQWTPKN (Aminosäuren 34 bis 46) [Seq. ID-No. 5] und
- b) SAREKRDVQPPASQH (Aminosäuren 391 bis 405) [Seq. ID-No. 6]
eingesetzt.
Die polyklonalen Antikörper werden üblicherweise erzeugt,
indem ein geeigneter Wirt (Kaninchen) mit dem PRV-1-
Polypeptid, gegebenenfalls gebunden an einem immunologischen
Träger (Adjuvans), immunisiert und eine Immunantwort
hervorgerufen wird. Monoklonale Antikörper können in an sich
bekannter Weise mit der Hybridoma-Technik erzeugt werden. Die
Antikörper können durch Affinitätsreinigung gereinigt werden.
Herstellung und Reinigung von Antikörpern sind beispielsweise
beschrieben in "Antibodies: A Laboratory Manual" von Harlow
und Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Weiterhin können derartige polyklonale oder monoklonale gegen
PRV-1 gerichtete Antikörper auch zur Therapie der Krankheit
verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Nachweis des PRV-1-
Rezeptors mit einem RT-PCR-Verfahren erfolgen. Dazu wird
zunächst aus den PRV-1 überexprimierenden Zellen, in der Regel
Granulozyten, RNA isoliert. Dann wird in an sich bekannter
Weise mit einem RT-Primer eine reverse Transkription
vorgenommen. Der RT-Primer ist bevorzugt ein Primer mit der
folgenden Nucleotidsequenz (SEQ ID-No. 7)
ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT.
Dadurch wird die spezifische PRV-1-RNA in DNA umgewandelt.
Diese DNA wird dann in einer PCR-Reaktion in an sich bekannter
Weise amplifiziert. Für die Amplifikationszyklen werden
bevorzugt die folgenden beiden Primer eingesetzt.
Als Primer sense (SEQ ID-No. 8)
GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG.
Primer antisense (SEQ ID-No. 9)
GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG.
Mit der offenbarten Sequenz kann der Fachmann ohne weiteres
andere ebenfalls geeignete Primer auffinden.
Da die RNA als Ausgangsmaterial für dieses Verfahren verwendet
wird, ist das PCR-Signal nur in solchen Fällen positiv, in
denen das PRV-1-Gen auch exprimiert wird. Wie oben ausgeführt,
ist dies nur dann der Fall, wenn der Patient unter P. vera
leidet. Bei gesunden Patienten erfolgt keine PRV-Expression in
den Granulozyten. Die Abwesenheit eines RT-PCR-Signals deutet
also daraufhin, daß keine P. vera vorliegt.
In einer weiteren Alternative kann auch ein Blotting-
Verfahren, bevorzugt ein Northern Blot, zur Diagnose einer P.
vera benutzt werden. Für ein derartiges Verfahren wird die RNA
aus Granulozyten isoliert und dann mit einem Blotting-
Verfahren, z. B. Northern Blot, auf die Expression von PRV-1
untersucht. Als Sonde kann die cDNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1
oder ein Abschnitt der Sequenz verwendet werden. Eine
Hybridisierung tritt nur dann auf, wenn die Granulozyten von
einem Patienten mit P. vera stammen, da nur dann eine
Expression auf den Granulozyten vorhanden ist. Die Abwesenheit
einer Hybridisierung deutet daraufhin, daß die Person, von der
die Granulozyten stammen, keine P. vera hat.
Für die Northern Blot-Hybridisierung kann auch ein Fragment
des Gens eingesetzt werden. Ein derartiges Fragment ist
üblicherweise mehr als 100 Basen lang, vorzugsweise mehr als
300 Basen lang. Alternativ hierzu können durch Verdau des Gens
mit Restriktionsendonukleasen verschiedene unterschiedliche
Fragmente des Gens hergestellt werden, die als Sonden im
Northern Blot verwendet werden können. Wenn die Fragmente von
der cDNA herstammen, liegen sie als Doppelstränge vor, die für
die Hybridisierung in die Einzelstränge aufgetrennt werden
müssen. Geeignete Beispiele sind das Bam HI-PstI-Fragment von
Basenpaar 420 bis Basenpaar 831 oder das PstI-PstI-Fragment
von Basenpaar 831 bis Basenpaar 1900.
Der Nachweis von PRV-1-mRNA und damit der PRV-1-Expression
kann auch dadurch erfolgen, daß zunächst in einer RT-PCR-
Reaktion die mRNA revers transkribiert wird und die cDNA
anschließend amplifiziert wird und dann die amplifizierte DNA
mit einer Sonde in einem Hybridisierungsverfahren nachgewiesen
wird.
Bei einer positiven Diagnose muß die Krankheit behandelt
werden, da sie ansonsten in relativ kurzer Zeit zum Tod führt.
Hierzu können spezifische gegen PRV-1 gerichtete Antikörper
verwendet werden, an die gegebenenfalls zytotoxische
Komponenten gebunden sein können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein
Arzneimittel, das neben üblichen Trägern gegen den PRV-1-
Rezeptor gerichtete Antikörper enthält.
Da bei der P. vera der PRV-1-Rezeptor überexprimiert wird,
kommt es bei Kontakt mit dem Anti-PRV-1-Antikörper zur Bindung
von vielen Antikörpern auf der Oberfläche der befallenen
Granulozyten. Die Bindung vieler Antikörper an diesen Zellen
ist ein Anreiz für die immunologischen Zellen, diese Zellen zu
zerstören. Auf diese Weise ist eine spezifische Eliminierung
der P. vera-Zellen möglich.
Überraschenderweise wurde auch gefunden, daß das PRV-1-
Polypeptid hämatopoietische Aktivität aufweist. Das PRV-1-
Polypeptid ist in der Lage, bestimmte hämatopoietische
Vorläuferzellen zur Bildung erythroider Kolonien anzuregen.
Vor allem die N-glycosylierten Polypeptide von PRV-1 weisen
diese Funktion auf. Von den erfindungsgemäßen Polypeptiden
sind daher die N-glycosylierten PRV-1-Polypeptide und
Fragmente davon, die die Wachstumsfaktoraktivität aufweisen,
bevorzugt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein Arzneimittel,
das neben einem pharmazeutisch verträglichen Träger das PRV-1-
Polypeptid oder ein biologisch aktives Fragment davon enthält.
Bevorzugt handelt es sich um glycosyliertes PRV-1-Polypeptid,
noch bevorzugter um N-glycosyliertes PRV-1-Polypeptid oder ein
biologisch aktives Fragment davon. Die Erfindung betrifft auch
Arzneimittel, die wenigstens ein erfindungsgemäßes
Polynucleotid enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung
von PRV-1-Polypeptid oder einem biologisch aktiven Fragment
davon als Wachstumsfaktor in vivo und ex vivo. Das PRV-1-
Polypeptid oder ein biologisch aktives Fragment davon kann
verwendet werden zur Behandlung sämtlicher pan-Zytopenien und
pan-Zytopathien im Knochenmark und in der Zirkulation
(Änderung der zellulären Bestandteile des peripheren Blutes
und des Knochenmarks). Die Polypeptide der vorliegenden
Erfindung können beispielsweise verwendet werden zur
Behandlung von Anämien bei Nierenversagen, Chemotherapie oder
Ganzkörperbestrahlung, zur Behandlung von Neutropenien und
Thrombozytopenien unter Chemotherapie oder
Ganzkörperbestrahlung, zur ex vivo Behandlung von peripheren
oder Knochenmarks-Stammzellen zur Expansion (Vermehrung) und
Retransfusion in den Patienten, und zur Behandlung von Sepsis,
"systemic inflammatory response syndrome" (SIRS) oder
regionaler Entzündungsreaktion. Die Polypeptide der
vorliegenden Erfindung oder diese enthaltende Arzneimittel
können auf verschiedenste Weise appliziert werden. Die
Darreichungsformen umfassen intravenöse, intramuskuläre,
subkutane, intraperitoneale, orale, transdermale und
transmukosale Verabreichung.
Auch die erfindungsgemäßen Polynucleotide können zur
Behandlung von pan-Zytopenien und pan-Zytopathien verwendet
werden. Ziel ist dabei die Expression eines PRV-1-Polypeptids
oder eines funktionellen Fragments davon in Zellen des
betroffenen Patienten. Dabei kommen vor allem Verfahren der
Gentherapie zur Anwendung. Zellen des Patienten können
isoliert werden und mit einem erfindungsgemäßen Polynucleotid
transfiziert werden (ex vivo-Manipulation), um dann dem
Patienten wieder zugeführt zu werden. Es sind auch Verfahren
denkbar, bei denen die erfindungsgemäßen Polynucleotide durch
viralen Transfer in die Zielzellen gelangen. Expression der
eingeführten Nucleinsäuren führt dann zu hämatopoietischer
Aktivität.
Die Erfindung betrifft auch Kits zum Nachweis entweder von
Polycythaemia vera oder von Störungen des hämatopoietischen
Systems. Diese enthalten ein erfindungsgemäßes Polynucleotid
und/oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid und/oder einen oder
mehrere erfindungsgemäßen Antikörper. Darüber hinaus kann das
Kit noch einen Behälter oder Zusammensetzungen, die zur
Durchführung von Nachweisreaktionen geeignet sind, enthalten.
Beispiele für solche Zusammensetzungen sind Pufferlösungen,
Reagenzien zum Blockieren von Membranen,
Hybridisierungslösungen, sekundäre Antikörper,
Substratlösungen für Nachweisreaktionen und andere. Das Kit
wird bevorzugt zur Durchführung von PCR-Reaktionen, Northern
Blots, Southern Blots, Western Blots, ELISA, RIA oder
ähnlichen Reaktionen verwendet.
Zur Erläuterung werden folgende Beispiele angegeben.
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um das Gen zu
charakterisieren:
- - Granulozyten wurden aus Blutkonserven oder Aderlässen von P. vera Patienten nach folgendem Protokoll isoliert:
- - Blut wurde mit einem gleichem Volumen an 3% Dextran- Lösung in 0.9% NaCl versetzt und 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) stehengelassen.
- - Der Ansatz trennte sich in zwei Phasen. Die obere helle Phase wurde abgenommen und 10 Minuten bei 1800 g und RT zentrifugiert.
- - Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet im gleichen Volumen 0.9% NaCl resuspendiert.
- - Jeweils 35 ml der Zellen in NaCl wurden auf 15 ml Ficoll-Hypaque geschichtet.
- - Dann wurde 60 Minuten bei 1800 g und RT ohne Bremse zentrifugiert.
- - Es bildeten sich ein Zellpellet und zwei Schichten mit einer Interphase.
- - Schichten und Interphase wurden abgesaugt und das Zellpellet 30 Sekunden lang in 10 ml eiskalter 0.2% NaCl resuspendiert und nach 30 Sekunden wurden sofort 10 ml eiskalte 1.6% NaCl zugegeben.
- - Die Zellen wurden 10 Minuten bei 1800 g und RT abzentrifugiert.
- - Dann wurde einmal in 10 ml PBS gewaschen und abzentrifugiert.
- - Das Zellpellet enthielt 95-99% reine Granulozyten.
- - Aus diesen Zellen wurde mit Standardmethoden RNA isoliert.
- - 10 mg dieser RNA wurden in einem Northern-Blot auf die Expression von PRV-1 untersucht. Als Sande wurde die gesamte cDNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 verwendet.
Dieser Versuch wurde an 19 P. vera Patienten und 21 Kontroll-
Blutkonserven durchgeführt. Es wurde eine starke
Hybridisierung der PRV-1 Sonde bei P. vera Patienten gefunden.
Bei gesunden Kontrollen wurde keine Hybridisierung beobachtet.
Aus einer schwangeren Maus wurden Embryos am Tage 13,5 nach
Befruchtung entnommen. Die fötalen Lebern wurden entnommen.
Die darin enthaltenen Zellen wurden mittels Antikörper
angefärbt und durch Säulen-Chromatographie für bestimmte
Zellen angereichert, für andere Zellsorten depletiert. Es
resultiert ein Zellgemisch, das für bestimmte hämatopoietische
Vorläuferzellen (sog. colony forming units-erythroid, CFU-E)
angereichert ist. So sind in der fötalen Leber insgesamt
ungefähr 2% CFU-E, in den angereicherten Zellen aber 30-40%
CFU-E.
Diese CFU-E wurden retroviral transfiziert. Dazu wurde 48
Stunden vorher eine sogenannte "packaging cell line", genannt
293-T, ihrerseits transfiziert. 293-T-Zellen sind eine
etablierte humane embryonale Nieren-Zellinie. 293-T-Zellen
sind stabil mit mehreren Genen eines Retrovirus transfiziert.
Werden nun diese 293-T-Zellen mit zwei Plasmiden, genannt pOS
und pKAT, transfiziert, produzieren die 293-T-Zellen ein
Retrovirus, das murine fötale Leberzellen infizieren kann.
Transfiziert man die 293-T-Zellen mit einem leeren pOS-Vektor
und pKAT, wird ein "wild typ" Retrovirus produziert, das nur
retrovirale Proteine exprimiert. Hat man hingegen in den pOS-
Vektor ein humanes Gen einkloniert, z. B. PRV-1, wird ein
Retrovirus produziert, das, wenn es Zellen infiziert hat,
dieses Protein exprimiert. Das Retrovirus wird von den 293-T-
Zellen in das Zellkultur-Medium sezerniert.
Nach zwei Tagen wird das Zellkultur-Medium der transfizierten
293-T-Zellen, welches das Retrovirus enthält, geerntet und
einmal durch einen 0,45 µm Filter filtriert. Um die fötalen
Leberzellen zu transfizieren, werden diese Zellen mit dem
filtrierten Zellkultur-Medium, welches das Retrovirus enthält,
vermischt und 2 Stunden bei 1800 rpm, 20°C unter Zugabe von
Polybren zentrifugiert. Anschließend werden die transfizierten
fötalen Leberzellen in einem Medium kultiviert (Methocult, der
Firma Cell Systems), welches zusätzlich zu den üblichen Salzen
und Aminosäuren, fötales Kälberserum, 0,0001-0,4 IU/ml
Erythropoetin (EPO) und Methylcellulose (0,8%) enthält. Das
EPO benötigen die CFU-E, um hämatopoetische Kolonien
auszubilden. Durch die Methylcellulose wird das Medium Gelee
artig fest, und es gelingt, einzelne Zellen in diesem Gelee zu
fixieren, so daß sie sich, anders als in flüssigem Medium,
nicht bewegen können. Daher kann beobachtet werden, ob sich
aus einer einzelnen Zelle eine hämatopoetische Kolonie formt
oder nicht. CFU-Es bilden erythroide Kolonien, also Kolonien,
die rote Blutzellen und deren Vorläuferzellen enthalten.
Nach drei Tagen wird gezählt, wie viele hämatopoietische
Kolonien sich entwickelt haben. Verschiedene Ansätze werden
verglichen. Nicht in jedem Experiment wurden alle Ansätze
überprüft; Ansätze 1-3 sind sehr ähnliche Kontrollen und
können jeweils einzeln mit Ansatz 4 verglichen werden.
Ansatz 1: Zellen, die nicht retroviral transfiziert wurden;
Ansatz 2: Zellen, die mit einem leeren pOS-Vektor transfiziert wurden;
Ansatz 3: Zellen, die mit einem "green fluorescent Protein" (GFP), einem nicht hämatopoietisch aktiven Protein, transfiziert wurden.
Ansatz 4: Zellen, die mit pOS-PRV-1 (Vektor + erfindungsgemäßes Gen) transfiziert wurden.
Ansatz 1: Zellen, die nicht retroviral transfiziert wurden;
Ansatz 2: Zellen, die mit einem leeren pOS-Vektor transfiziert wurden;
Ansatz 3: Zellen, die mit einem "green fluorescent Protein" (GFP), einem nicht hämatopoietisch aktiven Protein, transfiziert wurden.
Ansatz 4: Zellen, die mit pOS-PRV-1 (Vektor + erfindungsgemäßes Gen) transfiziert wurden.
Die Ergebnisse von drei wie beschrieben
durchgeführten Versuchen sind aufgeführt. Die
Zahlen geben jeweils die Anzahl der Kolonien an.
Die Versuche zeigen, daß CFU-E, die mit PRV-1 transfiziert
waren, sehr viel mehr Kolonien (bis zu 3-fach erhöht) bilden,
als die diversen Kontroll-CFU-E. Dieses Ergebnis deutet darauf
hin, daß PRV-1 einen Wachstumsfaktor für CFU-E darstellt.
Um zu untersuchen, ob PRV-1 einen löslichen Wachstumsfaktor
darstellt, oder Zell-Zell-Kontakt notwendig ist, wurde ein
weiteres Experiment durchgeführt. Die "Verpackungs-Zellinie",
293-T, produziert nicht nur nach Transfektion mit den pOS- und
pKAT-Vektoren ein Retrovirus. Zusätzlich synthetisieren die
293-T-Zellen auch das von dem in pOS klonierten Gen kodierte
Protein, also im vorliegenden Fall PRV-1. Ist das Genprodukt
ein lösliches Protein, wird es in das Medium, das die
"Verpackungs-Zellinie", 293-T, umgibt, sezerniert.
Transfiziert man die 293-T-Zellen nur mit dem pOS-Vektor, ohne
pKAT, entstehen keine Retroviren. Das Zellkultur-Medium
enthält dann nur das lösliche, von den Zellen produzierte
Protein. Es wird Medium von pOS-PRV-1-transfizierten Zellen,
ohne Retrovirus, mit CFU-Es vermischt, und im Methylcellulose-
Medium ausplattiert und die entstandenen Kolonien gezählt.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
Löslichkeit von PRV-1. Die Zahlen geben jeweils die
Anzahl der Kolonien an.
Auch in diesem Versuch haben CFU-E, die mit PRV-1-haltigem
Medium versetzt waren, sehr viel mehr hämatopoietische
Kolonien ausgebildet, als Kontroll-Zellen. Aus diesem Ergebnis
kann geschlossen werden, daß PRV-1 einen löslichen
Wachstumsfaktor darstellt.
Aus einer Patientin mit P. vera wurden Granulozyten isoliert
und aus diesen Zellen mittels Standardprotokoll
Proteinextrakte angefertigt. Diese Proteinextrakte wurden nach
dem Protokoll des "N-Glycosidase F Deglycosylation Kits" der
Firma Boehringer Mannheim behandelt. Im einzelnen bedeutet
dies, daß die Proteinextrakte mit einem "Denaturierungs
Puffer" versetzt wurden, 3 Minuten bei 95°C erhitzt wurden und
dann entweder nur mit "Reaktions Puffer" oder mit "Reaktions
Puffer" plus N-Glycosidase versetzt wurden. Der Ansatz wurde
über Nacht bei 37°C inkubiert und die Proteine auf einer PAGE-
Gel Elektrophorese mit anschließendem Western Blot analysiert.
Das PRV-1 Protein wurde mit einem Antikörper gegen ein Protein
mit der Aminosäuresequenz ID-No. 5 detektiert. Die Ergebnisse
zeigen, daß aus Granulozyten gereinigtes PRV-1 Protein 60-65
kDa groß ist, während es nach N-Glycosidase-Verdau nur noch 40
kDa groß ist. Dies beweist eindeutig, daß PRV-1 an Asparagin-
Resten (Asparagin = N) glycosyliert ist.
Claims (23)
1. N-glycosyliertes Polypeptid umfassend im wesentlichen
eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
Aminosäuren 1-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 1-409 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-409 von Sequenz Nr. 2;
oder ein Fragment davon mit wenigstens 50 Aminosäuren.
Aminosäuren 1-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 1-409 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-409 von Sequenz Nr. 2;
oder ein Fragment davon mit wenigstens 50 Aminosäuren.
2. Polypeptid umfassend im wesentlichen eine der folgenden
Aminosäuresequenzen:
Aminosäuren 1-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 1-409 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-409 von Sequenz Nr. 2.
Aminosäuren 1-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 1-409 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-437 von Sequenz Nr. 2;
Aminosäuren 22-409 von Sequenz Nr. 2.
3. Im wesentlichen reines Polypeptid der Sequenz ID Nr. 2.
4. Polynucleotid umfassend im wesentlichen eine der
folgenden Nucleotidsequenzen:
Nucleotide 1-1600 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 36-1346 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 36-1262 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 39-1346 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 39-1262 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 99-1346 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 99-1262 von Sequenz Nr. 1.
Nucleotide 1-1600 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 36-1346 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 36-1262 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 39-1346 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 39-1262 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 99-1346 von Sequenz Nr. 1;
Nucleotide 99-1262 von Sequenz Nr. 1.
5. Rekombinante DNA, die ein Polynucleotid nach Anspruch 4
umfaßt.
6. Rekombinante DNA nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nucleotidsequenz funktionell verbunden ist mit
einem Promotor.
7. Expressionsvektor enthaltend die rekombinante DNA nach
Anspruch 5 oder 6.
8. Transformierte oder transfizierte Wirtszelle, die ein
Polynucleotid nach Anspruch 4 enthält.
9. Antikörper gegen das PRV-1-Polypeptid von einem der
Ansprüche 1 bis 3 oder ein Epitop davon.
10. Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
es ein monoklonaler Antikörper ist.
11. Verfahren zum Nachweis von Polycythaemia vera, dadurch
gekennzeichnet, daß man das PRV-1-Polypeptid mit einem
oder mehreren gegen das PRV-1-Polypeptid oder ein Epitop
davon gerichteten Antikörper in einem Immunoassay
umsetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Antikörper einen polyklonalen oder monoklonalen
Antikörper nach Anspruch 9 verwendet.
13. Verfahren zum Nachweis von Polycythaemia vera, dadurch
gekennzeichnet, daß man das PRV-1-Polynucleotid mit einem
RT-PCR-Verfahren oder einem Blotting-Verfahren nachweist.
14. Arzneimittel zur Behandlung von Polycythaemia vera,
dadurch gekennzeichnet, daß es neben üblichen Trägern
gegen PRV-1 gerichtete polyklonale oder monoklonale
Antikörper enthält.
15. Arzneimittel enthaltend ein Polypeptid nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 und wenigstens einen pharmazeutisch
verträglichen Träger.
16. Arzneimittel enthaltend ein Polynucleotid nach Anspruch 4
und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
17. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1
bis 3 als Wachstumsfaktor.
18. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1
bis 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
von pan-Zytopenien und pan-Zytopathien im Knochenmark und
in der Zirkulation.
19. Verwendung eines Polynucleotids nach Anspruch 4 zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von pan-
Zytopenien und pan-Zytopathien im Knochenmark und in der
Zirkulation.
20. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1
bis 3 zur Behandlung und/oder Vermehrung körpereigener
Zellen und/oder etablierter Zellinien ex vivo oder in
vitro.
21. Kit zum Nachweis von Polycythaemia vera enthaltend
wenigstens ein Polynucleotid nach Anspruch 4 oder ein
Fragment davon
und/oder
wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 und/oder
wenigstens einen Antikörper nach Anspruch 9 oder 10.
wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 und/oder
wenigstens einen Antikörper nach Anspruch 9 oder 10.
22. Kit zum Nachweis von Störungen des hämatopoietischen
Systems enthaltend
wenigstens ein Polynucleotid nach Anspruch 4 oder ein
Fragment davon
und/oder
wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 und/oder
wenigstens einen Antikörper nach Anspruch 9 oder 10.
wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3 und/oder
wenigstens einen Antikörper nach Anspruch 9 oder 10.
23. Kit zur Detektion des PRV-1 Proteins nach einem der
Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
ELISA Test Kit ist.
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