TW201130971A - Anti-Bv8 antibodies and uses thereof - Google Patents

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201130971 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體而言係關於分子生物學領域。更特定兮之 本發明係關於抗_Bv8抗體及其用途。 本申請案為根據37 CFR 1.53(b)(1)申請之非臨時申請 案’其根據35 USC 119(e)之規定主張2009年12月23日φ咬 丫吞月 之臨時申請案第61/284,743號及2010年11月ι6曰申請之臨 時申請案第61/414,052號的優先權，該等申請案之内容以 引用的方式併入本文中。 【先前技術】 現已明確涉及自原先存在之内皮形成新血管的血管生成 與多種病症之發病機制有關。此等病症包括實體腫瘤及轉 移；動脈粥樣硬化；晶狀體後纖維組織增生；血管瘤；慢 性k症’眼内新生血管症候群’諸如增生性視網膜病變 (例如糖尿病性視網膜病變）、年齡相關之黃斑變性 (AMD)、新生血管性青光眼；移植角膜組織及其他組織之 免疫排斥反應；類風濕性關節炎；及牛皮癖。F〇lkman等 人，J. Biol. Chem.，267: 10931-10934 (1992) ; Klagsbrun等 人，Annu. Rev. Physiol.，53: 217-239 (1991);及 Garner A.， 「Vascular diseases」，Pathobiology 〇f 〇cuiar Disease. A Dynamic Approach，Garner A.，Klintworth GK編，第 2版 (Marcel Dekker，NY，1994)，第 1625-1710頁。 在腫瘤生長之情況下，jk管生成對於增生向瘤形成轉變 以及對於向腫瘤生長及轉移提供營養似乎至關重要。 152844.doc 201130971

Folkman等人，Nature 339:58 (1989)。新血管生成允許腫 瘤細胞相較於正常細胞獲得生長優勢及增殖自主性。腫瘤 通常始於單一異常細胞，該異常細胞因距可用毛細血管床 之距離而僅可增殖至數立方毫米之尺寸，且腫瘤可在一段 較長時間内保持「休眠」而不會進一步生長及擴散。接 著，一些腫瘤細胞轉換成血管生成表型而活化内皮細胞， 該等内皮細胞增殖並成熟成為新毛細血管。此等新形成之 血管不僅允許原發腫瘤繼續生長，而且允許轉移腫瘤細胞 擴散並重新定居（rec〇l〇nization)。因此，已觀測到腫瘤切 片中之微血管密度與乳癌以及若干其他腫瘤之患者存活率 之間存在關聯。Weidner等人，N. Engl. J. Med· 324:1-6 (1991) ; Horak 等人 ’ Lancet 340:1120-1124 (1992);

Macchiarini等人，Lancet 340:145-146 (1992)。雖然未充 分瞭解控制血管生成轉換之確切機制，但咸信，腫瘤塊之 新血管生成係由大量血管生成刺激劑與抑制劑之淨平衡引 起（Folkman，1995, Nat Med 1(1):27-31)。 血管發育過程受到嚴密調控。迄今，大量分子（主要為 周圍細胞產生之分泌因子）已顯示調控EC分化、增殖、遷 移及聚結成索狀結構》舉例而言，已鑑別血管内皮生長因 子（VEGF)為刺激血管生成及誘導血管滲透性方面所涉及之 關鍵因子。Ferrara等人，Endocr. Rev.，18:4-25 (1997)。甚 至單一 VEGF等位基因缺失亦導致胚胎死亡之發現指出， 此因子在血管系統發育及分化中起到不可替代之作用。此 外’已顯示VEGF為與腫瘤及眼内病症相關之新也管生成 152844.doc 201130971 的關鍵介體。Ferrara等人，Endocr. Rev.(同上）。VEGF mRNA被戶斤檢查之大部分人類腫瘤過度表現。Berkman等 人，J. Clin. Invest.，91: 153-159 (1993) ; Brown等人， Human Pathol., 26: 86-91 (1995) ; Brown 等人，Cancer Res·, 53: 4727-4735 (1993) ; Mattern等人，Brit. J. Cancer， 73: 931-934 (1996) ; Dvorak等人，Am. J. Pathol·，146: 1029-1039 (1995)。

Bv8已顯示誘導腎上腺皮質毛細血管内皮細胞之增殖、 存活及遷移（LeCouter，J.等人，/Voc iVai/ 100，2685-2690 (2003)) °Bv8 及 EG-VEGF為兩種高度相關 之分泌蛋白，亦稱為激動素原-1及激動素原-2，其在結構 上屬於較大類別的由稱為輔脂酶摺疊之五雙硫橋鍵基元界 定之肽（DeCouter, J_等人，TVaiwre 420，860_867 (2002); LeCouter, J.^· A > Proc Natl Acad Sci USA 1 00，2685-2690 (2003) ; Li，M_等人，Mo/P/mrmaco/ 59, 692-698 (2001))。最初 鑑別Bv8為來自虫圭類多彩鈐檐varz'egaie)之皮膚的 分泌蛋白（Mo 11 ay，C.等人，J 尸/zarmaco/ 374，189-196 (1999))。Bv8之選殖及表現描述於2003年3月13日公開之 WO 03/020892中。Bv8及EG-VEGF結合兩種高度相關之G 蛋白偶合受體（GPCR)，EG-VEGF/PKR-1(R1)及 EG-VEGF/PKR-2(R2)(Masuda, Y 等人，价oc/iew jBz.op/zys 及es Commun 293，496-402 (2002) ; Lin，D.C.等人，价〇/ C/zem 277, 19276-19280 (2002))。EG-VEGF 及 Bv8 經表徵為 對特定内皮細胞類型具選擇性之有絲***原（LeCouter, J. I52844.doc 201130971 等人 ’ iVaiwe 412(6850):877-84 (2001)及 LeCouter，J.等 人 ’ Proc iWz" C/M 100, 2685-2690 (2003))。已將 其他活性歸於此家族’包括傷害感受（Mollay，C·等人（同 上））、胃腸道運動（Li，M.等人（同上））、晝夜活動節律調控 (Cheng，M.Y.等人 ’ iVaiMre 417，405-410 (2002))及嗅球神 經生成（Matsumoto，S_等人，尸roc dead «Scz· f/U 103, 4140-4145 (2006))。此外，Bv8刺激活體外顆粒球性及單 核細胞性群落產生（LeCouter，J.等人，（2003)(同上）；

Dorsch，M.等人，/· lew灸oc 价〇/ 78(2), 426-34 (2005))。

Bv8已表徵為巨噬細胞之化學引誘劑（LeC〇uter等人，户〜c 伽/ ded 如·⑽ 101，16813·16919 (2〇〇4))。 鑒於血管生成在許多疾病及病症中之作用，需要一種減 少或抑制一或多種導致此等過程之生物效應的手段。本文 所引用之所有參考文獻，包括專利申請案及公開案，皆以 全文引用的方式併入。 【發明内容】 本發明之一部分係基於多種針對Βν8之抗體。ΒΜ呈現 為重要有利之治療標乾’ 本發明提供作為用於乾向與 Βν8表現及/或活性相關之病理性病狀之治療劑及診斷劑的 抗體。因此，本發明提供與Bv8有關之方法、組合物、套 組及製品。 在某一實鈿例中，提供—種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含至少一個、兩 個、三個、四個、五個或六個選自由以下組成之群的高變 152844.doc 201130971 區（HVR)序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSXjXjYXsXqXsSYMN，其中 X1為L或V;X2為D或I;X3為D、F、G、S、W或Y;X4為 A、G、H或 V ;且 X5 為 D、E 或 Y ; (ii) HVR-L2，其包含 AASXJ2EX3，其中 ΧΑΝ或 Υ ; Χ2 為L或R ;且Χ3為S或Τ ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ;

φ (iv) HVR-H1，其包含 GYX1X2X3X4YDMH，其中 X,為 S 或 T; X2為F 或 L; X3為F、M、P、T或 V; X4為D、E、H、 I或N ; (v) HVR-H2，其包含YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG，其 中X1為H、S或T; X2為 C、S或T; X3為A、L、N、S或Τ; X4為 A、E或S;X5為I、L、S或 T;及 (vi) HVR-H3，其包含DXMYGEAYAMDY，其中又1為〇 或S。 φ 在某些實施例中，抗-Bv8抗體包含以下三個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSX1X2YX3X4X5SYMN，其中 乂1為1^或¥;又2為0或1;乂3為〇、？、0、8、\^或丫；乂4為 入、0、11或乂；且又5為〇、£或丫； (ii) HVR-L2，其包含AASXjXaEXs，其中又1為>1 或Y ; X2 為L或R，且X3為S或T;及 (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ;及 人類VL κ亞群IV共同構架序列SEQ ID NO:240。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體包含以下三個HVR序列： 152844.doc 201130971 (i) HVR-H1，其包含 ογχ,χΑΑποΜΗ，其中Χι 為S 或 T; X2為 F 或 L; X3為 F、Μ、P、T或 V; X4為D、E、Η、I 或N ; (li) HVR-H2，其包含yIXiX2yX3GX4t X5yNqKFkG， 其中乂1為11、S或T; 乂2為匚、s或T; X3為A、L、N、S或 T; X4為 A、E或 S ; X5為I、l、S或T;及 (iii) HVR-H3，其包含DXiNYGEAYAMDY，其中父，為0 或S ;及 人類VH亞群I共同構架序列SEQ ID NO:241。 在某些實施例中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中該抗體包含可變域，該可變域包含以下六個HVR 序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSXiXijYXsXdXjSYMN，其中 父1為1^或 V ; X2為D或 I ; χ3為D、F、G、S、W或 Y; X4為 A、G、Η或 V ;且X5為 D、E或 Y; (ii) HVR-L2，其包含 AASX,X2EX3，其中或Y ; χ2 為L或R ;且Χ3為S或Τ ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含ΘΥΧ,ΧζΧΒΧαΥϋΜΗ，其中 或 Τ; X2為 F或 L; X3為F、M、P、T或V; X4為D、E、H、 I或N ; (v) HVR-H2，其包含YIX,X2YX3GX4T X5YNQKFKG，其 中 乂1為1^、S或 Τ; X2為 C、S或 Τ; X3為A、L、N、S或 τ; X4為 A、E或 S; X5為I、L、S或 T;及 152844.doc -8 - 201130971

(vi) HVR-H3，其包含DX1NYGEAYAMDY，其中Χι 為 G 或S。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體相較於鼠類/嵌合抗-Bv8 抗體進一步包含在VL位置28及29中之一或兩處發生之突 變。在某些實施例中，抗-Bv8抗體相較於鼠類/嵌合抗-Bv8抗體進一步包含在VH位置52a處發生之突變。在某些 實施例中，抗-Bv8抗體相較於鼠類/嵌合抗-Bv8抗體進一 步包含在VH位置54處發生之突變。在某些實施例中，抗_ Bv8抗體相較於鼠類/嵌合抗-Bv8抗體進一步包含在VH位 置95及96中之一或兩處發生之突變。在某些實施例中， 抗-Bv8抗體相較於鼠類/嵌合抗-Bv8抗體進一步包含（1)在 VL位置28及29中之一或兩處發生之突變；及/或（2)在VH位 置52a處發生之突變；及/或（3)在VH位置54處發生之突 變；及/或（4)在VH位置95及96中之一或兩處發生之突變。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體相較於鼠類/嵌合抗-Bv8抗 體進一步包含在VH位置96處發生之突變且在VH位置95處 未發生突變。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中HVR-L1包含選自由以下組成之群的胺基酸序 歹丨J : SEQ ID NO:49、55、61、67、73、79、85、91、97、 103、109、115、121、127、133、139、145及 151 ; HVR-

L2包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、1.10、 116、122、128、134、140、146及 152 ; HVR-L3 包含選自 I52844.doc -9· 201130971 由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:5 1、57、63、 69、75、81、87、93、99、105、111、ii7、123、129、 135 ' 141、147及153 ; HVR-H1包含選自由以下組成之群 的胺基酸序列.SEQ ID NO:52、58、64、70、76、82、 88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、 148及154 ; HVR-H2包含選自由以下組成之群的胺基酸序 列· SEQ ID NO:53、59、65 ' 71、77、83、89、95、 101、107、113、119、125、131、137、143、149及 155 ; 且HVR-H3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：seq ID NO:54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、 114、 120、 126、 132、 138' 144、 150及156。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類vL κ亞群 IV共同構架序列。在某些實施例中，抗_Βν8抗體進—步包 含人類VH亞群I共同構架序列。在某些實施例中，抗_Bv8 抗體進一步包含人類VL κ亞群IV共同構架序列及人類VH 亞群I共同構架序列。在某些實施例中’減去三個輕鏈 HVR序列之人類VL κ亞群Iv共同構架序列為seq id NO:240。在某些實施例中’減去三個重鏈hvR序列之VH 亞群I共同構架序列為SEQ ID NO:241。 在某些實施例中’提供一種結合至BV8之抗體或其片 段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含至少一個、兩 個、三個、四個、五個或六個選自由以下組成之群的高變 區（HVR)序列： (0 HVR-L1，其包含KASQSX^yxj^symn，其中 152844.doc •10- 201130971 又1為£或¥;又2為〇或1;义3為？、0、8、1\¥或丫；又4為八、 G、Η或V ;且X5為D、E或Y ; (ii) HVR-L2，其包含 AASX1X2EX3，其中又1為]^或 Υ ; Χ2 為L或R ;且Χ3為S或Τ ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含GYX1X2X3X4YDMH，其中又1為5 或T; X2為F或 L; X3為F、Μ、P、T或 V; X4為D、E、Η、 I或N ; (v) HVR-H2，其包含YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG，其 中 乂1為1·!、S或 T; X2為 S或 T; X3為A、L、S或 T; X4為 A、 E或S ; X5為I、L、S或T ;及 (vi) HVR-H3，其包含DSNYGEAYAMDY。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體包含以下三個HVR序列： (i) HVR-L1 ’ 其包含KASQSXiXAXsXAsSYMN，其中 Χι 為 L或 V; X2為 D或 I; X3為F、G、S、W或 Y; X4為 A、 G、Η或V ;且X5為D、E或Y ; (ii) HVR-L2，其包含 AASX1X2EX3，其中又1為>1或 Y ; X2 為L或R ;且X3為S或T ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ;及 人類VL κ亞群IV共同構架序列SEQ ID NO:240。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體包含以下三個HVR序列： (i) HVR-H1，其包含 GYX1X2X3X4YDMH，其中乂1為8 或 Τ; X2為 F 或 L; X3為 F、Μ、P、T或 V; X4為 D、E' Η、I 或N ; 152844.doc -11 - 201130971 (ii) HVR-H2，其包含YIX1X2YX3GX4T X5YNQKFKG， 其中Xi為H、S或T; X2為s或T; X3為A、L、S或T; X4為 A、E或 S ; X5為 I、L、S 或 T ;及 (iii) HVR-H3，其包含DSNYGEAYAMDY ;及 人類VH亞群I共同構架序列SEQ ID NO:241。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含以下六個HVR 序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSXiXs^YXsXAsSYMN，其中 乂1為1^或乂；又2為0或1;乂3為？、0、8、1^或丫；乂4為八、 G、Η或V ;且X5為D、E或Y ; (ii) HVR-L2，其包含 AASX,X2EX3，其中 乂1為1^或 Y ; X2 為L或R ;且X3為S或T ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含 GYXJAsXJDMH，其中 為 S 或T; X2為F 或L; X3為F、Μ、P、T或 V; X4為D、E、H、 I或N ; (v) HVR-H2，其包含YIXiX^jYXsGXJ X5YNQKFKG，其 中 Χι為 H、S或T; X2為 S 或 T; X3為A、L、S或T; X4為A、 E或S ; 乂5為1、L、S或T ;及 (vi) HVR-H3，其包含DSNYGEAYAMDY。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中HVR-L1包含選自由以下組成之群的胺基酸序 列：SEQ ID NO:55、61、67、73、79、85、91、97、 152844.doc -12- 201130971 103、109、115、121、127、133、139、145及 151 ; HVR- L2包含選自由以下組成之群的胺基酸序列；SEq id NO:56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、

122、128、134、140、146及 152 ; HVR-L3 包含選自由以 下組成之群的胺基酸序列：SEq m n〇:57、63、69、75、 81、87、93、99、1〇5、111、117、123、129、135、 141、147及153 ; HVR-H1包含選自由以下組成之群的胺基 酸序列：SEQ ID NO:58、64、70、76、82、88、94、 100 、 106 、 112 、 118 、 124 、 130 、 136 、 142 、 148及154 ; HVR-H2包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：seQ ID NO:59、65、71、77、83、89、95、101、l〇7、113、 119、125、131、137、143、149 及 155 ;且 HVR-H3 包含選 自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:60、66、 72 、 78 、 84 、 90 、 96 、 102 、 108 、 114 、 120 、 126 、 132 、 138 、 144 、 150及156 。 在某些實施例中’抗-Bv8抗體進一步包含人類vl κ亞群 IV共同構架序列。在某些實施例中，抗_Bv8抗體進一步包 含人類VH亞群I共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8 抗體進一步包含人類VL κ亞群IV共同構架序列及人類vh 亞群I共同構架序列。在某些實施例中，減去三個輕鍵 HVR序列之人類VL κ亞群IV共同構架序列為SEq ID NO:240。在某些實施例中，減去三個重鏈HVR序列之VH 亞群I共同構架序列為SEQ ID NO:241。 在另一實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 •13· 152844.doc 201130971 段，其中該抗體包含： (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:61 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:62 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··63 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:64 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:65 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··66。 在另一實施例中，提供一種結合至Βν8之抗體或其片 段，其中該抗體包含： (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:8 5 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:86 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:87 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:88 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:89 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··90。 在另一實施例中，提供一種結合至Βν8之抗體或其片 段，其中該抗體包含： (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··91 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:92 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:93 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:94 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:95 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:96。 在另一實施例中，提供一種結合至Βν8之抗體或其片 152844.doc 14 201130971 段，其中該抗體包含： (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:121 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··122 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:123 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:124 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ:125 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··126。 φ 在某些實施例中，抗-Βν8抗體進一步包含人類VL κ亞群 IV共同構架序列。在某些實施例中，抗-Βν8抗體進一步包 含人類VH亞群I共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8 抗體進一步包含人類VL κ亞群IV共同構架序列及人類VH 亞群I共同構架序列。在某些實施例中，減去三個輕鏈 HVR序列之人類VL κ亞群IV共同構架序列為SEQ ID NO:240。在某些實施例中，減去三個重鏈HVR序列之VH 亞群I共同構架序列為SEQ ID NO:241。 φ 在一個實施例中，提供一種結合至Βν8之抗體或其片 段，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:7之輕鏈可變域及 包含SEQ IDNO:8之重鏈可變域。 在另一實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:9之輕鏈可變域及 包含SEQ ID NO: 10之重鏈可變域。 在另一實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含：包含SEQ ID ΝΟ:11之輕鏈可變域及 包含SEQ ID NO: 12之重鏈可變域。 152844.doc -15- 201130971 在另一實施例中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO: 13之輕鏈可變域及 包含SEQ ID NO: 14之重鏈可變域。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域與選自由 SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13及15組成之群的胺基酸序 列具有至少9 0 %序列一致性。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含選自 由SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13及15組成之群的胺基酸 序列。 在一個實施例中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID NO:7。 在另一實施例中，提供一種結合至BV8之抗體或其片 段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID NO:9。 在另一貫施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID ΝΟ:11。 在另一實施例中，提供一種結合至Βν8之抗體或其片 段，其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID ΝΟ:13。 在某些實施例中’提供—種結合至Βν8之抗體或其片 152844.doc -16 - 201130971 段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域與選自由 SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14及16組成之群的胺基酸 序列具有至少90%序列一致性。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含選自 由SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14及16組成之群的胺基 酸序列。 在一個實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID NO:8。 在另一實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID NO:10。 在另一實施例中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID NO:12。 在另一實施例中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中該抗體包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含胺基 酸序列 SEQ ID NO:14。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中該抗體包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域與選自由 SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13及15組成之群的胺基酸序 列具有至少90%序列一致性；及重鏈可變域，該重鏈可變 域與選自由SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14及16組成之 152844.doc 17 201130971 群的胺基酸序列具有至少90°/。序列一致性。在某些實施例 中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片段，其中該抗體包 含輕鏈可變域’該輕鏈可變域包含選自由SEQ m N〇:3、 5、7、9、11、13及15組成之群的胺基酸序列；及重鏈可 變域’該重鏈可變域包含選自由SEQ ID N04、6、8、 1〇、12、14及16組成之群的胺基酸序列。 在某些實施例中’提供一種結合至BV8之抗體或其片 段’其中該抗-Bv8抗體以小於約〇·〇2 之Kd值結合至人 類 B v 8。 在某些貫施例中，提供一種結合至BV8之抗體或其片 段，其中該抗-Bv8抗體以約0.01 nM《〇 〇1 nM以下之〖(1值 結合至人類Bv8。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗-Bv8抗體結合至人類Bv8之緊密程度至少為 嵌合2G9抗-Βν8抗體的兩倍。在某些實施例中，提供一種 …合至Bv8之抗體或其片段，其中該抗_Bv8抗體結合至人 類Bv8之緊也、程度至少為嵌合2G9抗_Bv8抗體的五倍。 在某些實施例中，藉由使用表面電漿子共振檢定來量測 艮(1值。在某些實施例中，使用全長抗_Bv8抗體來量測Kd 值。在某些實施例中，使用抗_Bv8抗體之Fab型式來量測 Kd值。 在某些貫施例中’提供—種結合至Bvg之抗體或其片 丰又，其中該抗體包含至少—個、兩個、三個、四個、五個 或/、個選自由以下組成之群的高變區（HVR)序列： 152844.doc 201130971 (i) HVR-Ll，其包含SASS XiVFYMH，其中 乂！為？或 S ; (ii) HVR-L2，其包含 DTSXIAS，其中 X^K或 N ; (iii) HVR-L3 ’ 其包含 QQWS ΧιΧ2ΡΧ3Τ，其中 X,為 F、 8、\¥或丫；又2為0或£;又3為1、1^或]\4; (iv) HVR-H1’ 其包含GFXjXjTXsGMGVS，其中乂1為1^ 或Y ; X2為I或L ; X3為p或s ; (v) HVR-H2 ’ 其包含HIYWDDDTRYNPSLKS ;及 (vi) HVR-H3’其包含RDHGYYWFXJ，其中又1為0或 T。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含可變域，該可變域包含以下六個HVR 序列： (i) HVR-L1 ’ 其包含 SASS X 丨 VFYMH，其中Χι 為 P或 S ; (ii) HVR-L2 ’ 其包含 DTSX,LAS，其中 ΧΘΚ或 N ; (iii) HVR-L3 ’ 其包含 QQWS XiXJXsT，其中 X,為 F、 S、 W或 Y ; X2為 D或 E; X3為 I、L或 M; (iv) HVR-H1，其包含GFX1X2STX3GMGVS，其中乂1為[ 或Y ; X2為I或L ; X3為p或S ; (v) HVR-H2 ’ 其包含HIYWDDDTRYNPSLKS ;及 (vi) HVR-H3，其包含RDHGYYWFXJ，其中又1為口或 T。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中HVR-L1包含選自由以下組成之群的胺基酸序 列：SEQ ID NO: 157、163、169、175、181、187及 193 ; 152844.doc •19- 201130971 HVR-L2包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:158、164、170、176、182、188及 194 ; HVR-L3 包含 選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 159、 165、171、177、183、189及 195 ; HVR-H1 包含選自由以 下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:160、166、172、 178、184、190及196 ; HVR-H2包含選自由以下組成之群 的胺基酸序列：SEQ ID NO:161、167、173、179、185、 191及197 ;且HVR-H3包含選自由以下組成之群的胺基酸 序歹|J : SEQ ID NO:162、168、174、180、186、192 及 198。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類VL κ亞群 I共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包 含人類VH亞群III共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8 抗體進一步包含人類VL κ亞群I共同構架序列及人類VH亞 群III共同構架序列。 在某些實施例中’提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個 或六個選自由以下組成之群的高變區（HVR)序列： (i) HVR-L1，其包含SASS X丨VFYMH，其中乂1為卩或S ; (ii) HVR-L2，其包含DTSX丨LAS，其中X丨為K或N ; (iii) HVR-L3，其包含QQWS X】X2PX3T，其中 X1為F、 S、W或 Υ ; 乂2為0或 Ε ; Χ3為 I、L 或 Μ ; (iv) HVR-H1，其包含GFXiXjTXaGMGVS，其中 或Y ; X2為I或L ; X3為P或S ; 152844.doc -20- 201130971 (v) HVR-H2，其包含HIYWDDDTRYNPSLKS ;及 (vi) HVR-H3，其包含rdHGYYWFDY。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含以下六個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含SASS Χ,νΡΥΜΗ，其中又1為卩或S ; (ii) HVR-L2 ’ 其包含 DTSX!LAS，其中 ΧΑΚ或 Ν ; (iii) HVR-L3 ’ 其包含 QQWS XiXzPXsT，其中 X】為 F、 S、W或 Y; X2為 D或 E; X3為 I、L或 M; (iv) HVR-H1，其包含GFXiXjTXsGMGVS，其中X,&L 或Y ; X2為I或L ; X3為P或S ; (v) HVR-H2，其包含HIYWDDDTRYNPSLKS ;及 (vi) HVR-H3，其包含RDHGYYWFDY。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段’其中該抗體所包含之HVR-L1包含選自由以下組成之 群的胺基酸序列：SEQ ID NO:157、163、169、175、 181、187及193 ; HVR-L2包含選自由以下組成之群的胺基 酸序列：SEQ ID N〇:158、164、170、176、182、188及 194 ; HVR-L3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列： SEQ ID NO:159、165、171、177、183、189及 195 ; HVR-H1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:160、166、172、178、184、190及 196 ; HVR-H2 包含 選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 161、 167、173、179、185、191 及 197 ;且 HVR-H3 包含選自由 以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 174、180、 -21 - 152844.doc 201130971 186 、 192及198 。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類VL κ亞群 I共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包 含人類VH亞群III共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8 抗體進一步包含人類VL κ亞群I共同構架序列及人類VH亞 群III共同構架序列。 在另一實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO:23之輕鏈可變域及 包含SEQ ID NO:24之重鏈可變域。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個 或六個選自由以下組成之群的高變區（HVR)序列： (i) HVR-L1，其包含EASQSVDYDDDSYMN ; (ii) HVR-L2，其包含ATSNLAS ; (iii) HVR-L3，其包含QQSNEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含GYTFTNSWMN ; (v) HVR-H2，其包含RIDPSDSETHYNQKFKD ;及 (vi) HVR-H3，其包含DSSYDGFYAMDY。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含以下六個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含EASQSVDYDDDSYMN ; (ii) HVR-L2，其包含 ATSNLAS ; (iii) HVR-L3，其包含 QQSNEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含GYTFTNSWMN ; 152844.doc -22- 201130971 (v) HVR-H2，其包含RIDPSDSETHYNQKFKD ;及 (vi) HVR-H3，其包含DSSYDGFYAMDY。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體所包含之HVR-L1包含選自由SEQ ID NO :199及205組成之群的胺基酸序列；HVR-L2包含選自由 SEQ ID NO:200及206組成之群的胺基酸序列；HVR-L3包 含選自由SEQ ID NO:201及207組成之群的胺基酸序列； HVR-H1包含選自由SEQ ID NO:202及208組成之群的胺基 酸序列；HVR-H2包含選自由SEQ ID NO:203及209組成之 群的胺基酸序列；且HVR-H3包含選自由SEQ ID NO:204及 210組成之群的胺基酸序列。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類VL κ亞群 I共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包 含人類VH亞群III共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類VL κ亞群I共同構架序列及人類 VH亞群III共同構架序列。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含至少一個、兩個、三個、四個、五個 或六個選自由以下組成之群的高變區（HVR)序列： (i) HVR-L1，其包含KSSEYVSNALS ; (ii) HVR-L2，其包含GTNKLED ; (iii) HVR-L3 ’ 其包含QQGYDIPT ; (iv) HVR-H1，其包含GFTFSDYFMG ; (v) HVR-H2，其包含GIDTKSYNYATYYSGSVKG;及 152844.doc •23· 201130971 (vi) HVR-H3，其包含NYGNYGAFDS。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體包含以下六個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含 KSSEYVSNALS ; (ii) HVR-L2，其包含GTNKLED ; (iii) HVR-L3，其包含QQGYDIPT ; (iv) HVR-H1，其包含 GFTFSDYFMG ; (v) HVR-H2，其包含GIDTKSYNYATYYSGSVKG ;及 (vi) HVR-H3，其包含NYGNYGAFDS。 在某些實施例中，提供一種結合至Bv8之抗體或其片 段，其中該抗體所包含之HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO:211 ; HVR-L2 包含胺基酸序列 SEQ ID NO:212 ; HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO:213 ; HVR-H1包含胺基酸 序列SEQ ID NO:214 ; HVR-H2包含胺基酸序列SEQ ID NO:215 ;且HVR-H3 包含胺基酸序列 SEQ ID NO:216。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類VL κ亞群 I共同構架序列。在某些實施例中，抗-Βν8抗體進一步包 含人類VH亞群III共同構架序列。在某些實施例中，抗-Bv8抗體進一步包含人類VL κ亞群I共同構架序列及人類 VH亞群III共同構架序列。 在某些實施例中，抗-Bv8抗體為單株抗體。在某些實施 例中，抗-Bv8抗體為人類化抗體。在某些實施例中，抗-Bv8抗體為人類抗體。在某些實施例中，抗-Bv8抗體之至 少一部分構架序列為人類共同構架序列。在一個實施例 152844.doc -24- 201130971 中，抗體為選自Fab、Fab，-SH、Fv、scFv或（Fab')2片段之 抗體片段。 在某些實施例中，提供一種編碼本文所述之任何抗體的 聚核苷酸或核酸。在一個實施例中，提供一種包含聚核苷 酸或核酸之載體。在一個實施例中，載體為表現載體。在 一個實施例中，提供一種包含載體之宿主細胞。在一個實 施例中，宿主細胞為真核細胞。在一個實施例中，宿主細 胞為原核細胞。在一個實施例中，宿主細胞為CHO細胞。 在—個實施例中，提供一種製備抗-Bv8抗體之方法，其中 該方法包含在適於表現編碼抗體之聚核苷酸的條件下培養 宿主細胞，及分離該抗體。 在某些實施例中，本發明進一步關於一種包含上述任何 抗-Bv8抗體之組合物。在某些實施例中，本發明係關於一 種包含上述任何抗-Bv8抗體與醫藥學上可接受之載劑混合 的醫藥組合物。 在某些貫施例中，本發明係關於一種預防或治療腫瘤轉 移之醫藥組合物，其包含有效量之本文所述之任何抗_Bv8 抗體與醫藥學上可接受之載劑混合。 在某些實施例中’提供偵測生物樣品中Bvg之存在的方 法’該方法包含使生物樣品與本發明之抗_Bv8抗體在允許 該抗體結合至Bv8之條件下接觸，及偵測抗體與Bv8之間 是否形成複合物。 在某些實施例中，提供治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病 症之方法，其包含投與個體有效量之本文所述之任何抗· 152844.doc -25- 201130971

Bv8抗體。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之 群·乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、神經膠母細胞瘤、 食道癌、黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌、胰臟癌及肝細胞 癌。在某些實施例中，癌症為乳癌、結腸直腸癌、肺癌、 腎癌、卵巢癌或神經膠母細胞瘤。所涵蓋之癌症之例示性 且非限制性的名單提供於本文之r定義」項下。 在某些實施例中，提供減少或抑制患有與血管生成相關 之病理性病狀之個體體内血管生成的方法，其包含投與個 體有效量之本文所述之任何抗_Bv8抗體。在某些實施例 中，病理性病狀為贅生性病狀。在某些實施例中，病理性 病狀為非贅生性病狀。所涵蓋之非贅生性病狀之例示性且 非限制性的名單提供於本文之Γ定義」項下。在某些實施 例中，非贅生性病狀係選自由以下組成之群：糖尿病性視 網膜病變及其他增生性視網膜病變、早產兒視網膜病變、 新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑 水腫、角膜新血管生成、角膜移植物新血管生成、視網膜/ 脈絡膜新血管生成及類風濕性關節炎。 在某些實施例中，提供抑制内皮細胞增殖之方法，其包 含投與個體有效量之本文所述之任何抗_Βν8抗體。在某些 實施例中，内皮細胞為腎上腺皮質内皮細胞。 在某些實施例中，提供抑制嗜中性白血球遷移之方法， 其包含投與個體有效量之本文所述之任何抗^“抗體。 在某些實施例中，提供抑制腫瘤轉移之方法，其包含投 與個體有效量之本文所述之任何抗·Bv8抗體。在某些實施 152844.doc -26 - 201130971 例中，轉移係在淋巴系統中發生。在某些實施例中，轉移 係在遠端器官中發生。

在某些實施例中，提供治療、預防或減輕疼痛之方法， 其包含投與個體有交文量之本文所述之任何抗_Bv8抗體。在 某些實施例中，疼痛為急性疼痛或慢性疼痛。在某些實施 例中，疼痛為急性發炎性疼痛或慢性發炎性疼痛。在某些 實施例中，提供治療類風濕性關節炎之方法，其包含投與 個體有效量之本文所述之任一抗_Bv8抗體。 ” 在某些實施例中’本文所述及上文所述之方法進一步包 含投與個體有效量之第二藥物，其中抗·Bv8抗體為第一藥 物。在某些實施例中，第二藥物為另一抗體、化學治療 劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細 ι激素、細胞激素拮抗劑、細胞毒性放射線療法、皮質類 口醇止吐劑、癌症疫苗、止痛劑或生長抑制劑。在某些 貫例中第一藥物為抗血管生成劑。在某些實施例中， 第一藥物或抗血管生成劑為抗_VEGF抗體。在某些實施例 抗VEGF抗體為貝伐單抗（bevacizumab)。在某些實施 例中，第二藥物係在投與抗-Bv8抗體之前或之後投與。在 某&實施例中，帛二藥物係與抗-Bv8抗體並行投與。在某 :實^例中，該等方法進—步包含投與個體有效量之第三 藥物，其中該第三藥物為化學治療劑。 所涵蓋之化學治療劑之例示性且非限制性的名單提供於 「定墓 s 」項下。在某些實施例中，化學治療劑係選 下且成之群·太平洋紫杉醇（paclitaxel)、卡在白 152844.doc -27- 201130971 (Carb〇platin)、順翻（cispiatin)、吉西他濱（gemcitabin# 培美曲 η坐（pemetrexed)。 在某些實施例中，提供增強抗血管生成劑於患有與血管 生成相關之病理性病狀之個體中之功效的方法，該等方法 包含投與個體有效量之本文所述之任何抗_Bv8抗體與抗血 官生成劑的組合，從而增強該抗血管生成劑之抑制活性。 在某些實施例中，與血管生成相關之病理性病狀為腫瘤、 癌症或細胞增殖性病症。在某些實施例中，與血管生成相 關之病理性病狀為非贅生性病狀。在某些實施例中，非贅 生性病狀係選自由以下組成之群：糖尿病性視網膜病變及 其他增生性視網膜病變、早產兒視網膜病變、新生血管性 青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜 新灰管生成、角膜移植物新血管生成、視網膜/脈絡膜新 血管生成及類風濕性關節炎《在某些實施例中，非贅生性 病狀為類風濕性關節炎。 在某些實施例中’個體為人類患者。在某些實施例令， 個體為人類癌症患者。在某些實施例中，個體為可能經診 斷已出現轉移或可能處於出現轉移之風險下的人類癌症患 者。在某些實施例中，經VEGF拮抗劑治療之個體復發或 個體為VEGF拮抗劑所難治。在某些實施例中’ VEGF拮抗 劑為抗- VEGF抗體。在某些實施例中，抗_veGF抗體為貝 伐單抗。 在某些實施例中’抗血管生成劑係在投與抗-Bv8抗體之 前或之後投與。在某些實施例中，抗血管生成劑係與抗_ 152844.doc -28 · 201130971

Bv8抗體並行投與。在某些實施例中，抗血管生成劑為抗-VEGF藥劑。在某些實施例中，抗-VEGF藥劑為抗-VEGF抗 體。在某些實施例中，抗-VEGF抗體為貝伐單抗。 本文所述之任何實施例或其任何組合適用於本文所述之 任何及所有本發明抗-Bv8抗體及方法。 【實施方式】 本發明提供關於抗-Bv8抗體之方法、組合物、套組及製 品。此等方法、組合物、套組及製品之細節提供於本文 中。 通用技術 本文所描述或提及之技術及程序一般為熟習此項技術者 充分瞭解且通常採用習知方法來使用，諸如以下文獻中所 述之廣泛使用之方法：Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 3 版（2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等 人編（2003));系歹ij 叢書 METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson，B. D. Hames及 G. R. Taylor編（1995))， Harlow及 Lane編（1988) ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編 (1987))。 術語「Bv8」、「Bv8同源物」、「激動素原-2」（亦稱為 152844.doc •29· 201130971 「PK2」、「KAL4」及「ΜΙΊΊ」）在本文中可互換使用，且 係指全長多肽及/或全長多肽之活性片段。原生序列BV8涵 蓋天然存在之Bv8前原形式、原形式及成熟形式以及截短 形式’天然存在之變異體形式（例如替代性剪接形式），及 天然存在之對偶基因變異體。在某些實施例中，原生Bv8 胺基酸序列以SEQ ID NO:235至239展示。人類及鼠類Bv8 序列亦揭示於例如 Wechselberger 等人Le". 462:177-l81 (1999)) 及 Li 等人 （Mo/· P/mrw. 59:692-698 (2001)) 中。 「Bv8受體」為Bv8所結合之分子且其介導bv8之生物特 性。因此’術語「Bv8受體」之含義包括pkri/gpr73/EG_ VEGF 受體-1/PROKR1 及 PKR2/GPR73L1/EG-VEGF 受體 _ 2/PROKR2(LeC〇Uter 等人 ’ 2003， t/M，100:2685-2690 ; Lin 等人，2002，乂 CTzem.， 277:19276-19280 ; Masuda等人，2002，別〇咖所.

Res. Commun., 293:396-402)= 關於多肽之術語「生物活性」係指分子特異性結合並調 控例如增殖、遷移等細胞反應之能力。細胞反應亦包括經 受體介導之細胞反應，包括（但不限於）遷移及/或增殖。 對於本文而言，關於Bv8之「活性」係指保留原生 或天然存在之Βν8之生物活性及/或免疫活性的Βν8形式， 其中「生物」活性係指原生Bv8或天然存在之βν8所產生 的生物功能（抑制或刺激）’原生Bv8或天然存在之Bv8所具 有的誘導針對抗原決定基之抗體產生的能力除外；且「免 疫」活性係指原生Bv8或天然存在之Bv8所具有的誘導針 I52844.doc 201130971 對抗原決定基之抗體產生的能力。在某些實施例中，Bv8 之生物活性為調節骨髓細胞移動、促進腫瘤血管生成及/ 或促進腫瘤轉移之能力。 術語「抗-Bv8抗體」或「結合至Bv8之抗體」係指如下 抗體·其也夠以足夠親和力結合B v 8以使得該抗體適用作 乾向Bv8之診斷劑及/或治療劑。在某些實施例中’結合至

Bv8之抗體的解離常數（Kd)S 1 μΜ、$ 1〇〇 nM、S 10 nM、 φ $ 1 nM、$ 〇_l nM或£ 0.01 nM。在某些實施例中，抗·Bv8 抗體結合至在不同物種之Bv8之間保守的Bv8抗原決定 基。在某些實施例中，抗-Bv8抗體與選自由嵌合2G9、 h2G9.K4Gl.vl9、h2G9.K4Gl.v52、h2G9.K4Gl.v55、 h2G9.K4Gl.v73及嵌合2D3組成之群的抗體結合至人類Bv8 上之相同抗原決定基。在某些實施例中，抗_Bv8抗體與選 自由嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9、h2G9.K4Gl_v52、 h2G9.K4Gl.v55、h2G9.K4Gl.v73 及嵌合 2D3 組成之群的抗 $ 體競爭結合至人類B v 8。 「結合親和力」一般係指分子（例如抗體）之單一結合位 點與其結合搭配物（例如抗原）之間的非共價相互作用之強 度總和。除非另有指示，否則如本文所用之「結合親和 力」係指反映結合對之成員（例如抗體與抗原）之間1 ··丨相互 作用的ϋ有、结合親和力。分子Χ對其搭配物γ之親和力一 般可由解離常數（Kd)表示。親和力可由此項技術中已知之 常用方法（包括本文所述之方法）量測。低親和力抗體一般 緩慢地結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般 152844.doc '31 . 201130971 較快地結合抗原且傾向於保持較長時間的結合。此項技術 中已知多種量測結合親和力之方法，該等方法中之任一者 皆可用於達成本發明之目的。以下描述特定說明性實施 例〇 在某些實施例中，藉由使用抗_Βν8抗體之Fab型式及其 抗原進行放射性標記抗原結合檢定（RIA)來量測「Kd J或 Kd值」，如以下檢定所述：在一系列經滴定之未標記抗 原存在下，藉由使Fab與最小濃度的經（I25〗）標記之抗原平 衡，接著用經抗-Fab抗體塗佈之盤捕捉所結合之抗原來量 測Fab對抗原之溶液結合親和力（Chen等人，（1999) 了 Biol 293:865-881)。為建立檢定條件，用含5叫/如捕捉抗· ?315抗體（〇30?611^)之5〇111]^碳酸鈉（1^9.6)塗佈微量滴 定盤（Dynex)隔夜，隨後在室溫（約23〇〇下用含2%(〜/幻牛 血清白蛋白之PBS阻斷2至5小時。在無吸附劑盤（Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM [ΐ25ι]_抗原與相關μ之連 續稀釋液混合（例如’與presta等人，（1997) Cancer Res 57:4593-4599中對抗-VEGF抗體Fab-12之評估結果一致）。 接著培育相關Fab隔夜；然而，培育可能持續較長時段（例 如65小時）以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉 盤中以在室溫下培育（例如1小時）。接著移除溶液，且用含 0.1% TweenTM-2〇之pBS洗滌該盤8次。當盤已乾燥時添 加150微升/孔之閃爍體（Micr〇ScintTM_2〇 ; Packard)，且用 TopCount γ計數器（packard)對該盤計數1〇分鐘。選擇提供 小於或等於最大結合之20%的各Fab濃度用於競爭性結合 152844.doc •32· 201130971 檢定。根據另一實施例，藉由使用表面電漿子共振檢定， 使用 BIAcore™-2000 或 BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc” Piscataway, NJ)，在25°C下以約1〇個反應單位（RU)之固定 化抗原CM5晶片來量測Kd或Kd值。簡言之，根據供應商 之說明書，用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基）-碳化二亞胺 鹽酸鹽（EDC)及N-羥基丁二醯亞胺（NHS)活化羧甲基化聚 葡萄糖生物感測器晶片（CM5, BIAcore Inc.)。用10 mM乙 酸鈉（pH 4.8)將抗原稀釋至5 gg/ml(約0.2 μΜ)，隨後以5 μΐ/min之流動速率注射，以獲得約10個反應單位（RU)之偶 合蛋白。注射抗原之後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之 基團。為進行動力學量測，在25°C下以約25 μΐ/min之流動 速率注射於含0.05% Tween™ 20之PBS(PBST)中的Fab之兩 倍連續稀釋液（0.78 nM至5〇0 nM)。使用簡單的一對一朗 谬爾結合模型（one-to-one Langmuir binding model， BIAcore™評估軟件3.2版），藉由同時擬合締合及解離感測 器圖譜來計算締合速率（kon)及解離速率（koff)。根據比率 koff/kQn來計算平衡解離常數（Kd)。參見例如Chen，Y.等人 (1999) J. Mol. Biol· 293:865-881。若藉由上述表面電漿子共 振檢定測得締合速率（on-rate)超過1〇6 M-1 S·1，則可藉由 使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術將量測在2 5 下’在濃度漸增之抗原存在下，如光譜儀（諸如具有授拌 式比色官之止流裝備型分光光度計（Aviv Instruments)或 8000 糸列 SLM Aminco分光光度計（ThermoSpectronic))所量 測，於？38化117.2)中之2〇11]^抗抗原抗體（？31?形式）<鸯先 152844.doc -33- 201130971 發射強度（激發=295 nm ;發射=340 nm，16 nm帶通）的增 加或減少。 「分離之」核酸分子為經鑑別且與至少一種在抗體核酸 之天然來源中通常與之相關聯的污染性核酸分子分離之核 酸分子。分離之核酸分子不同於自然界中所發現之形式或 配置。因此，分離之核酸分子與存在於天然細胞中之核酸 分子相區分。然而，分離之核酸分子包括在通常表現抗體 之細胞中所含之核酸分子，在該等細胞中，例如，核酸分 子所處之染色體位置不同於天然細胞。 如本文所用之術語「載體」欲指代如下核酸分子：其能 夠轉運已與其連接之另一核酸。一種載體類型為「質 體」’其係指其他DNA區段可接合至其中之環狀雙股dna 環。另一種載體類型為噬菌體載體》另一種載體類型為病 毒載體’其中其他DNA區段可接合至病毒基因組中。某些 載體能夠在内部引入該等載體之宿主細胞中自主複製（例 如具有細菌複製起點之細菌載體、及游離型哺乳動物载 體）。其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主 細胞中之後整合至宿主細胞基因組中，從而與宿主基因組 一起複製。此外，某些載體能夠引導其操作性地連接之基 因表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」（戈朽 稱「重組載體」或「表現載體」）β 一般而言，重組^^^ 技術中可用之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中， 「質體」與「載體」可互換使用。 如本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指具 152844.doc •34- 201130971 有任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苦 酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或 鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RN A聚合酶或藉由 合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修 飾之核苷酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。若存在修 飾’則可在組裝聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修 飾。核苷酸序列中可雜有非核苷酸組分。可在合成後對聚 φ 核皆酸進行進一步修飾’諸如藉由與標記結合。其他修飾 類型包括：例如’一或多個天然存在之核苷酸經類似物 「帽式」取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電之鍵的彼 等物（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸、胺基曱酸酯 等）及具有帶電之鍵的彼等物（例如硫代磷酸酯、二硫代磷 酸S旨等）、含有懸垂部分之彼等物（諸如蛋白質（例如核酸 酶、毒素、抗體、信號肽、ply_L_離胺酸等））、具有嵌入 劑之彼等物（例如吖啶、補骨脂素（ps〇ralen)等）、含有螯合 φ 劑之彼等物（例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬 等）、含有烷化劑之彼等物、具有經修飾之鍵的彼等物（例 如α變旋異構核酸等）以及未經修飾形式之聚核苷酸。另 外’通常存在於糖中之任何羥基可例如經膦酸酯基、磷酸 酯基置換，經標準保護基保護或經活化以與其他核苷酸形 成其他鍵結；或可與固體或半固體支撐物結合。5，及3,端 ΟΗ可經磷酸化或經！至2〇個碳原子之胺或有機封端基部分 取代。其他經基亦可衍生成為標準保護基。聚核苷酸亦可 含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式， 152844.doc -35- 201130971 包括例如2’-0-甲基-核糖、2，-0-烯丙基核糖、2，-氟-核糖 或2’-疊氮基-核糖；碳環狀糖類似物；α_變旋異構糖；差 向異構糖’諸如***糖（arabinose)、木糖或來蘇糖 (lyxose)，α底β南糖；吱喃糖；景天庚酮糖（secj〇heptui〇se); 非環狀類似物；及基本核苷類似物，諸如曱基核糖苷。一 或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基置換。此等替代性鍵 聯基包括（但不限於）磷酸酯基經P(〇)S(「硫代磷酸酯」）、 P(S)S(「二硫代鱗酸酯」）、（〇)Nr2(「醯胺酸酯」）、 P(0)R、P(〇)〇R|、CO或CH2(「甲縮醛」）置換之實施例， 其中各R或R'獨立地為Η或視情況含有醚鍵（-〇-)、芳基、 浠基、ί衣燒基、環稀基或芳酿基（araldyl)之經取代或未經 取代烧基（1 -20個C)。聚核苷酸中之所有鍵無需皆相同。上 述描述適用於本文所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及 DNA » 如本文所用之「寡核苷酸」一般係指短的、一般為單 股、一般為合成之聚核苷酸，其長度一般（但不一定）小於 約200個核苷酸。術語「寡核苷酸」及「聚核苷酸」並不 互相排斥。上文有關聚核苷酸之描述同樣且完全適用於寡 核普酸。 術"α 抗體J及「免疫球蛋白J在廣義上可互換使用， 且包括單株抗體（例如全長或完整單株抗體）、多株抗體、 多價抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體，只要其展 現所要生物活性即可）且亦可包括某些抗體片段（如本文中 更詳細描述）^抗體可為人類抗體、人類化抗體及/或親和 152844.doc •36- 201130971 力成熟抗體。

「分離之」抗體為經鑑別且與其天然環境中之組分分離 及/或自其天然環境中之組分回收的抗體。其天然環境中 之污染性組分為將干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且 可包括酶、激素及其他蛋白質類或非蛋白質類溶質。在較 佳實施例中，抗體經純化（1)至大於95重量％之抗體，如由 洛瑞法（Lowry method)所測定，且最佳大於99重量％ ; (2) 至足以獲得N端或内部胺基酸序列之至少15個殘基的程 度，如藉由使用旋杯式定序儀所測定；或（3)至均質，如藉 由在還原或非還原性條件下使用庫馬斯藍（c〇〇massie biue) 或較佳銀染色進行SDS-PAGE所測定。由於抗體之天然環 境中之至少一種組分將不存在，故分離之抗體包括在重組 細胞内原位處之抗體。然而，分離之抗體通常將由至少一 個純化步驟來製備。 術語「可變」係指可變域之某些部分的序列在抗體之間 廣泛不同，且用於各特定抗體對其特定抗原的結合性及特 異性方面。然而，可變性在整個抗體可變域中並非均勻分 佈。其集中於輕鏈可變域與重鏈可變域中稱為互補決定區 或高變區（CDR或HVR，本文中可互換使用）之三個區段 中。可變域之較高度保守部分稱為構架(FR)。原生重鏈及 輕鍵之可變域各包含主要採㈣摺疊構型且由三個腿連 接的四個FR區，該等HVR形成連㈣摺疊結構且在一些情 ^下形成β摺疊結構之-部分的環。各鏈巾之魏由⑽ 緊㈣持在-起’且與來自另—鏈之峨_起促使形成抗 I52844.doc •37- 201130971 體之抗原結合位點（參見Kabat等人， 〇/ /wmw«〇/〇g/ca/ ，第 5版，National Institute of

Health，Bethesda，MD (1991))»恆定域並不直接涉及於抗 體與抗原之結合中，但展現各種效應功能，諸如使抗體參 與抗體依賴性細胞毒性。 抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個各具有單一抗原結合位 點之相同抗原結合片段，稱為「Fab」片段；及殘餘 「Fc」片段，該名稱反映其具有容易結晶之能力。胃蛋白 酶處理得到具有兩個抗原組合位點且仍能夠與抗原交聯之 F(ab’)2 片段。 「Fv」為含有完整抗原識別與抗原結合位點之最小抗體 片段。在雙鏈Fv物質中，此區域由緊密、非共價締合之一 個重鏈可變域與—個輕鏈可變域之二聚體組成。在單鏈以 物質中，一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可由可撓性肽 連接子共價連接，以使得輕鏈與重鏈可以與雙鏈Fv物質中 之結構類似之「二聚」結構締合。在此構型中，各可變域 之三個HVR相互作用以界定VH_VL二聚體表面上之抗原結 合位點。總而言之， 之，六個HVR賦予抗體以抗原結合特異

和力低於整個結合位點。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域

或多個來自抗體鉸鏈區之 (CH1) 羧基端添加有數個殘基，包括一 I52844.doc -38- 201130971 半耽胺酸。Fab’-SH在本文申指代恆定域之半胱胺酸殘基 帶有游離硫氫基（thiol group)之Fab1。F(ab')2抗體片段最初 係以Fab’片段對之形式產生，在該等片段對之間具有鉸鏈 半胱胺酸。亦已知抗體片段之其他化學偶合。 來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之「輕鏈」 可基於其恒定域之胺基酸序列而歸為兩種明顯不同之類型 (稱為κ及λ)之一。 φ 視免疫球蛋白重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，免疫球 蛋白可歸為不同類別。存在五種主要類別之免疫球蛋白： IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之數種可進一 步分成子類（同型）：例如IgG〗、IgG2、IgG3、IgG4、IgA^ IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈怪定域分別稱 為α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別之免疫球蛋白之次單元 結構及三維構型。 「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較 φ 佳保持通常與彼部分存在於完整抗體中時相關聯之功能中 的至少一種功能’較佳大部分或全部功能。抗體片段之實 例包括Fab、Fab’、F(ab，）2及Fv片段；微型雙功能抗體 (diabody);線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成 之多特異性抗體。在一個實施例中，抗體片段包含完整抗 體之抗原結合位點且因此保留結合抗原之能力。在另一實 施例中’抗體片段（例如包含Fc區之抗體片段）保留通常與 Fc區存在於完整抗體中時相關聯之生物功能中之至少一種 功能，諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補 152844.doc -39- 201130971 體結合。在一個實施例中，抗體片段為具有實質上類似於 完整抗體之活體内半衰期的單價抗體。舉例而言，此類抗 體片段可包含連接至Fc序列之抗原結合臂，Fc序列能夠賦 予該片段以活體内穩定性。 術語「高變區」、「HVR」或「HV」在本文中使用時係 指抗體可變域中序列高變及/或形成結構界定之環的區 域。一般而言，抗體包含六個HVR ;三個位於VH中（Η 1， H2、H3)，且三個位於VL中（LI、L2，L3)。在原生抗體 中，H3及L3在六個HVR中顯示最具多樣性，且咸信尤其 H3在賦予抗體以精細特異性方面起到獨特作用。參見例如 Xu 等人，Immunity 13:37-45 (2000) ; Johnson 及 Wu，

Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo 編，Human Press，Totowa，NJ，2003)。實際上，僅由重鏈組成之天然 存在之駱駝抗體在不存在輕鏈之情況下亦具功能性及穩定 性。參見例如 Hamers-Casterman等人，iVaiwre 363:446-448 (1993) ; Sheriff等人，3:733-736 (1996)。 本文中使用並涵蓋許多HVR敍述。Kabat互補決定區 (CDR)係基於序列可變性且其最常使用（Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest 5 第 5版， Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))。而Chothia指出結構環之位置 (Chothia及 Lesk，·/. Mo/. 5沁/· 196:901-917 (1987))。AbM HVR表示Kabat HVR與Chothia結構環之間的折衷，且由 Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用。「contact」 152844.doc -40- 201130971 :HVR係基於對可用複雜晶體結構之分析。此等HVR中之每 一者之殘基註解如下。 環 Kabat AbM Chothia Contact L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat編號） H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

HVR可包含如下「擴展HVR」：VL中之24-36或24-34(L1)、46-56 或 50-56(L2)及 89_97 或 89-96(L3);及 VH 中 之 26-35(Η1)、50-65 或 49-65(H2)及 93-102、94-102 或 95-102(H3)。可變域殘基係根據Kabat等人（同上）關於此等定 義中之每一者所述來編號。 「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基 以外的彼等可變域殘基。 「人類化」形式之非人類（例如鼠類）抗體為含有最少程 度之來源於非人類免疫球蛋白之序列的嵌合抗體。在一個 實施例中，人類化抗體為來自接受者之HVR之殘基經來自 152844.doc 41 201130971 非人類物種（供者抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長 類動物）之HVR且具有所要特異性、親和力及/或能力之殘 基置換的人類免疫球蛋白（接受者抗體）。在一些情況下， 人類免疫球蛋白之FR殘基經相應非人類殘基置換。此外， 人類化抗體可包含在接受者抗體中或供者抗體中未發現之 殘基。可進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而 言，人類化抗體將包含實質上全部的至少一個、且通常兩 個可變域，其中全部或實質上全部高變環對應於非人類免 疫球蛋白之高變環，且全部或實質上全部FR為人類免疫球 蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白、 通常為人類免疫球蛋白之怪定區（Fc)之至少一部分。關於 更多細節，參見例如Jones等人，iVaiwre 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人，332:323-329 (1988);及 Presta，Cwrr. (9/7. 5ζ·σ/· 2:593-596 (1992)。亦參見例如

Vaswani及Hamilton，Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998) ； Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995) ; Hurle及Gross，Cwrr. (9尸.5:428-433 (1994); 及美國專利第6,982,321號及第7,087,409號。 「人類抗體」為具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸 序列的胺基酸序列及/或已使用如本文所揭示之製備人類 抗體之任何技術而製備的抗體。人類抗體之此定義特別排 除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。可使用此項技 術中已知之各種技術（包括噬菌體呈現文庫）來產生人類抗 體。Hoogenboom及 Winter，《/· Mo/.价〇/.，227:381 (1991); 152844.doc • 42· 201130971

Marks等人，丄Mo/.出〇/.，222:581 (1991)。以下文獻中所 述之方法亦可用於製備人類單株抗體：c〇le等人’ Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss »

第 77 頁（1985) ; Boerner 等人，*/· /wmw«o/·，147(1):86-95 (1991)。亦參見 van Dijk 及 van de Winkel, Cwrr. P/iarmaco/·, 5: 368-74 (2001)。人類抗體可藉由將抗原投 與已經修飾以對抗原激發起反應而產生該等抗體，但其内 源基因座已失能之轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物 為例如經免疫之異種移植小鼠（xenomjce)(關於 XENOMOUSEtm技術，參見例如美國專利第6,〇75，181號及 第6，1 50,584號）。關於經由人類b細胞融合瘤技術產生之人 類抗體，亦參見例如Li等人，户^ &· ^以， 103:3557-3562 (2006)。 如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體 群體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可少量 存在之可能突變（例如天然發生之突變）以外皆相同。因 L飾°°單株」指示並非離散抗體之混合物形式的抗 體特徵。在某此會尬办，+ 二貫％例中，此類單株抗體通常包括 合標靶之多肽序列之甘 之抗體’其中標靶結合多肽序列係 括自複數個多肽序列中 J甲選擇早一標靶結合多肽序列 獲得。舉例而言 Μ之方法 ^ > 璉擇方法可為自複數個純系（諸如融人 瘤純系、、嗟菌體純系或 ^ 4董組DNA純系之庫）中選擇獨驻姑 系。應瞭解，可推—此 、俘獨特純 改良對標乾之親選標乾結合序列’例如，以 將k乾結合序列人類化、改良其在 152844.doc •43· 201130971 也。養物中之產量、降低其在活體内之免疫原性、形成 户特異性抗體等’且包含改變之標靶結合序列的抗體亦為 本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子（抗原決 疋基）之不同抗體的多株抗體製劑成對比，單株抗體製劑 之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。除特異性以 外’單株抗體製劑之有利之處亦在於其通常不受其他免疫 球蛋白污染。 修飾語「單株」指示自實質上均質抗體群體獲得之抗體 的特徵’且不應理解為需要由任何特定方法產生抗體。舉 例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可由多種技術製 備’包括例如融合瘤方法（例如Kohler及Milstein，TVaiwre， 256:495-97 (1975) ; Hongo等人 ’ //少於说臟，14 (3): 253-

260 (1995)，Harlow 等人，J

Mawwfl/ (Cold Spring Harbor Laboratory Press ’ 第 2版， 1988)，Hammerling等人，cmt/ Γ-

Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier，N.Y·，1981))、重組 DNA方法（參見例如美國專利第4,816,567號）、噬菌體呈現 技術（參見例如 Clackson 等人，Wa/wre，352: 624-628 (1991) ; Marks等人，J. Μο/· 5ζ·ο/. 222: 581-597 (1992); Sidhu等人，/. A/W. 338(2): 299-310 (2004); Lee等 人 ’《/ Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004) » Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)； 及 Lee 等人，乂 Immunol. Methods 284(1-2): 119- 132(2004))，及在具有編碼人類免疫球蛋白序列之部分或 152844.doc • 44 - 201130971 全部人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類或類人 類抗體之技術（參見例如WO 1998/24893 ; WO 1996/34096; WO 1996/33735 ; WO 1991/10741 ; Jakobovits等人，iVoc. dcai/· iScz·. t/iSJ 90: 2551 (1993) ; Jakobovits等人，iWziwre 362: 255-258 (1993) ; Bruggemann等人，]k /mmwwo/. 7:33 (1993);美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號及第 5,661，016 號；Marks 等人，Bio/rec/mo/ogy 10: 779-783 (1992) ； Lonberg 等人，Nature 368: 856-859 (1994)； Morrison, Nature 368: 812-813 (1994) ; Fishwild 等人， Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996) i Neuberger, Nature 5z.oiec/z«o/. 14: 826 (1996);及 Lonberg&Huszar，7wier«. Rev. Immunol. 1 3 : 65-93 ( 1 995)) o 本文中之單株抗體特別包括「嵌合」抗體，其中重鏈及/或 輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子 類之抗體中的相應序列相同或同源，而該（該等）鏈之其餘 部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體 中的相應序列相同或同源；以及該等抗體之片段，只要其 展現所要生物活性即可（參見例如美國專利第4,816,567 號；及Morrison等人，iVoc. iVai/. Jcad <Scz·· [/以 81:6851-6855 (1984))。嵌合抗體包括PRIMATIZED®抗體，其中該 抗體之抗原結合區來源於以相關抗原使獼猴免疫所產生之 抗體。 術語「多特異性抗體」以最寬泛之含義使用且特別涵蓋 152844.doc • 45· 201130971 °該等多特異性抗體包括

型雙功能抗體及微型三功能抗體（triabody)以及已共價或非 具有多抗原決定基特異性之抗體 (但不限於）：包含重鐘可變 多特異性抗體為 共價連接之抗體片段《根據一個實施例，

IgG抗體其結合至各抗原決定基之親和力為5 μΜ至0.001 ρΜ、3 μΜ至 0.001 ρΜ、1 μΜ至 0.001 ρΜ、〇 5 μΜ至 〇 〇〇1 ρΜ或 0.1 μΜ至 0.001 ρΜ。 「多抗原決定基特異性」係指特異性結合至相同或不同 抗原上之兩個或兩個以上不同抗原決定基的能力。舉例而 言，如本文所用之「雙特異性」係指結合兩個不同抗原決 定基之能力。「單特異性」係指僅結合一個抗原決定基之 能力。 表述「單域抗體」（sdAb)或「單一可變域（svd)抗體」 一般係指單一可變域（VH或VL)可賦予抗原結合性之抗體。 換言之，單一可變域不需要與另一可變域相互作用來識別 標把抗原。單域抗體之實例包括來源於駝類（羊駝及駱駝） 及軟骨魚（例如護士鯊）之抗體及藉由重組方法自人類及小 鼠抗體得到之抗體（Nature (1989) 341:544-546 ; Dev Comp Immunol (2006) 30:43-56 ； Trend Biochem Sci (2001) 152844.doc •46· 201130971

26:230-235 ; Trends Biotechnol (2003):21:484-490 ; WO 2005/035572 ； WO 03/035694 ； Febs Lett (1994) 339:285-290 ; WO00/29004 ; WO 02/05 1870)。 「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH域及VL 域，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，scFv多 肽在VH域與VL域之間進一步包含多肽連接子，其使得 scFv能夠形成抗原結合所要之結構。關於scFv之評述，參 見 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal 山’es，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，8卩1411§61> Verlag，New York，第 269-315 頁（1994)。 「抗原」為抗體可選擇性地結合之預定抗原。標靶抗原 可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原，或其他天 然存在之化合物或合成化合物。 術語「微型雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之 小型抗體片段，該等片段包含重鏈可變域（VH)連接至同一 多肽鏈中之輕鏈可變域（VL)(VH-VL)。藉由使用過短而使 同一鏈上之兩個域之間無法配對的連接子，迫使該等域與 另一鏈之互補域配對且形成兩個抗原結合位點。微型雙功 能抗體更詳細地描述於例如EP 404,097 ; WO 93/11161 ; 及 Hollinger 等人，/Voc；. TVa". Jcai/· Scz·· (75^4，90:6444-6448 (1993)中。微型三功能抗體及微型四功能抗體 (tetrabody)亦描述於 Hudson 等人，iVai. Med. 9:129-134 (2003)中。 術語「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之 152844.doc 47· 201130971 胺基酸位置編號」&其變化形式係指Kabat等人（同上）中用 於編譯抗體之重鍵可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用 此編號系統’對應於可變域之FR_VR縮短或***可變域 之FR或HVR中’實際線性胺基序列可含有較少或其他胺 基酸。舉例而言，重鏈可變域可包括在扣之殘基52之後插 入的單一胺基酸（殘基52a ’根據Kabat)及在重鏈1?11殘基82 之後***的殘基（例如殘基82a、82b及82c等根據 Kabat)。對於特定抗體，可藉由抗體序列同源區與「標 準」Kabat編號序列比對來確定殘基之Kabat編號。 當涉及可變域中之殘基（約為輕鏈之殘基^^7及重鏈之 殘基1-113)時，一般使用Kabat編號系統（例如Kabat等人， •SegwMces o//mmM„0/ogzca/ /价er咖第 5版 PubHc Health

Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。當涉及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時，一般 使用「EU編號系統」或「EU索引」（例如在Kabat等人（同 上）中所報導之EU索引）。「如Kabat中之EU索引」係指人類 IgGi EU抗體之殘基編號。除非本文另有規定，否則提及 抗體可變域中之殘基編號意謂由Kabat編號系統對殘基進 行之編號。除非本文另有規定，否則提及抗體恆定域中之 殘基編號意謂由EU編號系統對殘基進行之編號（參見例如 美國臨時申請案第60/640,323號之EU編號圖）。 「阻斷」抗體或「拮抗」抗體為抑制或降低與其結合之 抗原之生物活性的抗體。某些阻斷抗體或拮抗抗體實質上 或完全抑制抗原之生物活性。 152844.doc -48- 201130971 如本文所用之術語「實質上類似」或「實質上相同」表 示兩個數值（例如與本發明抗體相關之一個數值及與參考/ 比較抗體相關之另一數值）之間的相似程度足夠高，使得 熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值（例 如Kd值）所量度之生物特徵的情形下具有極小或不具有生 物及/或統計顯著性。該兩個值之間的差異作為參考/比較 值之函數為例如小於約50%、小於約40%、小於約30%、 小於約2 0 %及/或小於約1 〇 %。 如本文所用之片語「實質上減小」或「實質上不同」表 示兩個數值（一般為與一個分子相關之一個數值及與參考， 比較分子相關之另一數值）之間的差異程度足夠高，使得 熟習此項技術者將認為兩個值之間的差異在由該等值（例 如Kd值）所量度之生物特徵的情形下具有統計顯著性。該 兩個值之間的差異作為參考/比較分子之值的函數為例如 大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約4〇。/0及/或 大於約50%。 抗體「效應功能」係指可由抗體之F c區（原生序列f c區 或胺基酸序列變異Fe區）引起之生物活性，且其隨著抗體 同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Ciq結合及補體 依賴性細胞毒性（CDC) ; Fc受體結合；抗體依賴性細胞介 導之細胞毒性（ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如B 細胞受體）之下調；及B細胞活化。 本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之c端 區域’包括原生序列Fc區及變異卜區。雖然免疫球蛋白重 】52844.doc •49· 201130971 鏈Fc區之邊界可能不同，但人類igG重鏈Fc區通常界定為 自位置Cys226處之胺基酸殘基或自pr〇230延伸至其羧基 端。可例如在產生或純化抗體期間或藉由對編碼抗體重鏈 之核酸進行重組工程改造來移除Fc區之C端離胺酸（殘基 447 ’根據EU編號系統）。因此，完整抗體之組合物可包含 已移除所有K447殘基之抗體群體、未移除K447殘基之抗 體群體’及具有含及不含K447殘基之抗體之混合物的抗體 群體。 「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例 示性「效應功能」包括Clq結合；CDC ; Fc受體結合； ADCC ;吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體；BCR) 之下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域（例如抗 體可變域）組合，且可使用如例如本文定義中所揭示之各 種檢定來評估。 「原生序列Fc區」包含與自然界中所發現之Fc區之胺基 酸序列相同的胺基酸序列。原生序列人類Fc區包括原生序 列人類IgGl Fc區（非A異型及A異型）、原生序列人類igG2 Fc區、原生序列人類lgG3 Fc區，及原生序列人類igG4 Fc 區以及其天然存在之變異體。 「變異Fc區」包含由於至少一個胺基酸修飾、較佳一或 多個胺基酸取代而不同於原生序列F c區之胺基酸序列的胺 基酸序列。較佳地，變異Fc區與原生序列Fc區或親本多肽 Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如原生序列Fc區中 或親本多肽F c區中約1個至約10個胺基酸取代且較佳約1個 152844.doc •50- 201130971 至約5個胺基酸取代。本文中之變異Fc區較佳將與原生序 列Fc區及/或親本多肽Fc區具有至少約80%同源性，且最佳 與其具有至少約90%同源性，更佳與其具有至少約95%同 源性。 「Fc受體」或「FcR」描述結合至抗體以區之受體。在 一些實施例中，FcR為原生人類FCR。在一些實施例令， FcR為結合IgG抗體之FcRQ受體）且包括FcyRI、FcyRII及 φ FqRIII子類之受體，包括彼等受體之對偶基因變異體及替 代性剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA(「活化受體」）及 FqRIIB(「抑制受體」），其具有主要在細胞質域方面不同 之類似胺基酸序列。活化受體FqRliA在其細胞質域中含 有基於免疫受體酪胺酸之活化基元（ΙΤΑΜ)。抑制受體 FcyRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制 基元（ITIM)(參見例如 DaSron, 及ev_ /mww«o/. 15:203- 234 (I997))。FcR評述於例如 Ravetch及 Kinet，及ev. • 加㈣⑽/ 9:457-92 (1991) ; Capel等人，/所顧⑽心咖心 4:25-34 (1994);及 de Haas 等人，C7k. Med. 126:330-41 (1995)中。本文中之術語「FcR」涵蓋其他 FcR ’包括有待將來鑑別之Fcr。 術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其 負貝將母體IgG轉移至胎兒（Guyer等人，J. /所所 117:587 (1976)及Kim等人，*/. Jmmw;?。/. 24:249 (1994))且 調控免疫球蛋白之内穩定。已知量測與FcRn結合之方法 (參見例如 Ghetie及Ward·，Γοί/β；； 18(12):592-598 152844.doc •5\ · 201130971 (1997) ; Ghetie等人，TVaiwre 15(7):637-640 (1997) ; Hinton 等人，J. B/o/. C/zem. 279(8):6213-6216 (2004) ; WO 2004/92219 (Hinton等人）。 舉例而言，可在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染 人類細胞株中、或在投與具有變異Fc區之多肽的靈長類動 物中檢定活體内與人類FcRn之結合及人類FcRn高親和力 結合多肽之血清半衰期。PCT公開案WO 2000/42072(Presta)及美國申請案第 12/577,967號（Lowman) 描述與FcR之結合有所改良或減弱之抗體變異體。亦參見 例如 Shields 等人·/.出〇/_ CTzem. 9(2):6591-6604 (2001)。 「人類效應細胞」為表現一或多個FcR且執行效應功能 之白血球。在某些實施例中，該等細胞至少表現FcyRIII且 執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包 括周邊血液單核細胞（PBMC)、天然殺傷（NK)細胞、單核 細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白企球。可自原生來源（例 如血液）中分離出效應細胞。 「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指 一種細胞毒性形式，其中結合至某些細胞毒性細胞（例如 NK細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上存在之Fc受體（FcR) 的分泌Ig使此等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有 抗原之標靶細胞且隨後以細胞毒素殺死該標靶細胞。介導 ADCC之初級細胞（NK細胞）僅表現FcyRIII，而單核細胞表 現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。造血細胞上FcR之表現概述於 Ravetch及Kinet，/?ev. /zn/wwwo/ 9:457-92 (1991)之第 152844.doc ·52· 201130971 464頁的表3中。為評估相關分子之ADCC活性，可進行活 體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第 5,821，337號或美國專利第6,737,056號（？1^_)中所述之檢 定。適用於該等檢定之效應細胞包括PBMC及NK細胞。或 者或另外，可在活體内，例如在動物模型（諸如Clynes等 人，PAMS 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型） 中評估相關分子之ADCC活性。

「補體依賴性細胞毒性」或r CDC」係指標靶細胞在補 體存在下溶解。藉由補體系統之第一組分（ciq)與結合至 其同源抗原之抗體（適當子類之抗體）結合而引發傳統補體 路徑之活化。為評估補體活化，可進行CDC檢定，例如， 如 Gazzano-Santoro 寻人，乂 j所似·6仏〇心 2〇2:163 (1996)中所述。Fc區胺基酸序列改變（具有變異Fc區之多 肽）且Clq結合能力增加或減小之多肽變異體描述於例如美 國專利第6，194,551 B1號及w〇 1999/51642中。亦參見例如 Idusogie等人，乂 厂 164: 4178 4184 (2〇〇〇)。 術語「含Fc區抗體」係、指包含Fc區之抗體。可例如在純 化抗體期間或藉由對編碼抗體之核酸進行重組工程改造來 移除Fc區之〜離胺酸（殘基447 ’根據亂編號系統）。因 此’包含本發明之具有Fe區之抗體的組合物可包含具有 K447之抗體、已移降斛古 示所有K447之抗體，或含及不含K447 殘基之抗體的混合物。 對於本文而言，「接典挪f t 接又體人類構架」為包含來源於人類 免疫球蛋白構架或人類此 买負共冋構架之VL或VH構架之胺基酸 152844.doc -53· 201130971 序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同 構架之接受體人類構架可包含相同胺基酸序列，或其可含 有原有胺基酸序列變化。在存在原有胺基酸變化之情況 下’較佳存在不超過5處’且較佳4處或4處以下或3處或3 處以下原有胺基酸變化。當原有胺基酸變化存在於VH中 時’彼等變化較佳僅在位置71Η、ΜΗ及78H中之三個、兩 個或一個位置處；例如，彼等位置處之胺基酸殘基可為 ΉΑ、73T及/或78A ^在一個實施例中，VL接受體人類構 架之序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架 序列一致。 「人類共同構架」為表示在所選人類免疫球蛋白VL或 VH構架序列中最普遍存在之胺基酸殘基的構架。一般而 言’所選人類免疫球蛋白VL或VH序列係來自可變域序列 之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人所述之亞 群。在一個實施例中，VL之亞群為如Kabat等人所述之亞 群κ IV。在一個實施例中，VH之亞群為如〖讣以等人所述 之亞群I〇「VH亞群I共同構架」包含自Kabat等人所述之可 變重鏈亞群I中之胺基酸序列獲得之共同序列。 「VH亞群I共同構架」包含自Kabat等人所述之可變重鏈 亞群I中之胺基酸序列獲得之共同序列。 「VH亞群III共同構架」包含自Kabat等人所述之可變重 鏈亞群III中之胺基酸序列獲得之共同序列。 「VL亞群IV共同構架」包含自Kabat等人所述之可變輕 鏈κ亞群IV中之胺基酸序列獲得之共同序列。 I52844.doc •54- 201130971 VL亞群I共同構架」包含自Kabat等人所述之可變輕鏈 κ亞群I中之胺基酸序列獲得之共同序列。 「藥物」為用以治療所述病症或其症狀或副作用之活性 藥物》 病症」或「疾病」為將得益於本發明之物質/分子或 方法治療的任何病狀。此包括慢性及急性病症或疾病，包 括使哺乳動物易患上所述病症之彼等病理性病狀。本文中 • 欲治療之病症的非限制性實例包括惡性及良性腫瘤，·癌 瘤、母細胞瘤及肉瘤。 疾病之「病態」包括所有損害患者健康之現象。對於癌 症而言，病態包括（但不限於）異常或不可控之細胞生長、 轉移、干擾鄰近細胞之正常功能、釋放異常量之細胞激素 或其他分泌產物、抑制或加劇發炎或免疫反應等。 讨°口 、’’田胞增殖性病症」及「增生性病症」係指與一定 程度的異常細胞增殖相關之病症。在一個實施例中，細胞 • 增殖性病症為癌症。 本文所用之腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增 ·’’、_心性或良性，以及所有癌變前及癌性細胞與組 本文所提及之術語「癌症」「癌」、「細胞增殖性病 症」=增生性病症」及「腫瘤」並不互相排斥。 術居「癌症」及「癌」係指或描述哺乳動物中通常以細 胞生長/增殖失調為特徵之生理病狀。癌症之實例包括（但 不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等 癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、垂體 152844.doc •55- 201130971 癌、食道癌、星形細胞瘤、軟組織肉瘤、非小細胞肺癌、 肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、騰臟 癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱 癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌'子宮内膜癌或 子宮癌、唾液腺癌、腎癌（kidney cancer/renal cancer)、肝 癌、***癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、腦癌、子宮内 膜癌、睪丸癌、膽管癌、膽囊癌、胃癌、黑色素瘤及各種 類型之頭頸癌。 血管生成調控異常可引起許多可由本發明之組合物及方 法治療之病症。此等病症包括非贅生性病狀與贅生性病 狀。赘生性病包括（但不限於）上文所述者。 了用本發明之抗體及抗體片段治療之非贅生性病狀包括 (但不限於）例如不當或異常肥大；良性***肥大；疼痛 (急性及慢性），包括發炎性疼痛；關節炎；類風濕性關節 炎（RA);牛皮癬性關節炎；神經退化性疾病（例如阿茲海 默氏病（Alzheimer’s disease)、AIDS相關癡呆、帕金森氏病 (Parkinson’s disease)、肌萎縮性側索硬化、色素性視網膜 炎、脊髓性肌萎縮及小腦退化）；自體免疫疾病；牛皮 癬；牛皮癬性斑塊；肉狀瘤病；動脈粥樣硬化；動脈粥樣 硬化斑；橋本氏曱狀腺炎（Hashim〇t〇，s thyr〇iditis广血管 生成病症；眼病’諸如眼擬組織胞㈣病症候群、視網膜 血管生成、糖尿病性視網膜病變及其他增生性視網膜病變 (包括早產兒視網膜病變）、糖尿病性腎病變、晶狀體後纖 維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、 152844.doc -56- 201130971

糖尿病性黃斑水腫、該新血管生成、角_植物新Μ 生成、角膜移植排斥反應、視網膜/脈絡臈新血管生成、 隅角新▲管生成（虹膜紅變）、眼部新生血管性疾病；血管 疾病；涉及血管上皮細胞異常增殖之病狀；血管再狹窄； 古立安-白瑞症候群（Guillain_Barre Syndr〇me);息肉諸 如結腸息肉、家族性腺瘤息肉病、鼻息肉或胃腸息肉；胃 腸潰瘍；嬰兒肥厚性㈣狹窄；尿路阻塞症料；蒙尼柴 爾氏病（Menetrieris disease);分泌腺瘤或蛋白質流失症候 群；纖維腺瘤；呼吸道疾病；膽囊炎；神經纖維瘤；動靜 脈畸形(AVM);腦膜瘤；血管瘤；企管纖維瘤；甲狀腺增 生（包括格雷氏病（Grave，s disease));角膜及其他組織移植 疾病，發太疾病，慢性炎症；肺炎；急性肺損傷; 敗血症；慢性阻塞性肺病；原發性肺循環血壓過高；亞性 肺積液；粉瘤；灼傷、外傷、輕射、中風、缺氧或局部缺 血後水腫；心肌梗塞、缺血性損傷、腦缺企事件後損傷所 致之水腫；腦水腫（例如與急性中風/閉鎖性頭部損傷/外傷 相關之腦水腫)；血小板凝集所致之血栓；纖維變性病或 水腫病，諸如肝硬化、肺纖維化、類肉瘤病、甲狀腺炎、 全身性高黏稠度症候群、滑膜炎症、RA中之血管翳形 成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成；骨相關病態，諸如骨關 節炎、狗僂病及骨質疏鬆症；難治性腹水：骨骼或關節炎 症；骨髓發育不良症候# ;腎或肝再生不能性貧血；τ細 胞介導之過敏性疾病；佩吉特氏病（paget，s disease);多囊 I·生腎病’ II液第二間隙疾病（騰臟炎、腔室症候群、灼 152844.doc •57- 201130971 傷、腸病）’慢性炎症’諸如IBD(克羅恩氏病（Crohn's disease)及潰癌性結腸炎）；腎病；腎同種異體移植排斥反 應’移植物仏宿主疾病或移植排斥反應；發炎性腸病；急 性及慢性腎病變（包括增生性絲球體腎炎及糖尿病誘發之 月病）’腎病症候群；不當或異常組織大量生長（非癌症）； 肥胖症；脂肪組織大量生長；血友病性關f ;肥厚性瘢 痕，毛髮生長抑制；奥_韋_倫三氏症候群（〇sler Weber_ Rendu Syndrome);化膿性肉芽腫晶狀體後纖維組織增 生，硬皮病，沙眼；血管黏附；滑膜炎；皮膚過敏反應； 皮膚病’包括牛皮癬及皮炎、濕疹、光老化(例如人類皮 膚紫外輪射所致之光老化）、肥厚性廠痕形成；生殖病 狀諸如子呂内膜異位、卵巢過度刺激症候群、多囊性卵 巢疾病、子癇前症、功能不良性子宮出血或月經過多、子 宮肌瘤、早產；腹水；心、包積液（諸如與心包炎相關之心 包積液）；胸膜積液；内毒素性休克及真菌感染；某些微 生物感染，包括選自腺病毒、漢他病毒(ha—)、伯氏 疏螺旋菌（Borrelia burgdorferi)、耶氏桿菌屬（心以心 SPP·)、百日咳博德氏桿菌（Bordetella penussis)之微生物病 原體的微生物感染；及精神病症（例如精神***症、雙極 性抑鬱症、自閉症及注意力不足症）。 術語「癌變前」係指通常先於癌症發生或發展成癌症之 病狀或生長。「癌變前」生長將具有特徵為異常細胞週期 調控、增殖或分化之細&，其可由細胞週期調控、細胞增 殖或分化之標記物來確定。 152844.doc 58· 201130971 發月不良」意謂組織、器官或細胞之任何異常生長或 發育。在某些實施例中，發育不良為重度發育不良或癌變 前發育不良。 「轉移」意謂癌症自其原發部位擴散至體内其他位置。 癌細胞可脫離原發腫瘤，滲透至***及血管中經由血 &循，且在體内別處正常組織中之遠端病灶中生長（轉 移）。轉移可為局部或遠端的。轉移為連續過程，其隨腫 • 瘤細胞脫離原發腫瘤、經由血流或***行進及停駐於遠 端部位。在新部位處，細胞建立血液供應且可生長形成危 及生命之塊狀物。在某些實施例中，術語轉移性腫瘤係指 月b夠轉移，但尚未轉移至體内別處之組織或器官的腫瘤。 在某些實施例中，術語轉移性腫瘤係指已轉移至體内別處 之組織或器官的腫瘤。 腫瘤細胞内之刺激性分子路徑與抑制性分子路徑調控此 行為，且遠端部位中之腫瘤細胞與宿主細胞之間的相互作 Φ 用亦顯著。 非轉移性」意謂呈良性或保持處於原發部位且尚未滲 透至***或血管系統中或除原發部位以外之組織中的癌 症。一般而言，非轉移性癌症為處於癌症〇期、！期或π期 之任何癌症，且偶爾為出期癌症。 如本文所用之「轉移前器官」或「轉移前組織」係指内 邛尚未偵測到來自原發腫瘤或來自身體另一部分之癌細胞 的态官或組織。在某些實施例中，如本文所用之轉移前器 Β或轉移前組織係指如下器官或組織：其處於發生癌細胞 152844.doc •59· 201130971 自原發腫瘤或自身體另一部分擴散至此器官或組織之前的 階段中。轉移前器官或轉移前組織之實例包括（但不限於） 肺、肝、腦、卵巢、骨骼及骨髓。 「原發腫瘤」或「原發癌症」意謂原始癌症，而非位於 個體體内另一組織、器官或位置中之轉移性病變。 「轉移性器官」或「轉移性組織」以最寬泛之含義使 用，係指内部已擴散有來自原發腫瘤之癌細胞或來自身體 另一部分之癌細胞的器官或組織。轉移性器官及轉移性組 織之實例包括（但不限於）肺、肝、腦、卵巢、骨路及骨 髓。 本文中之「癌症復發」係指癌症在治療之後反覆，且包 括癌症在原#器官中之反覆以及癌症在原#器官以外反覆 之遠端復發。 「腫瘤負荷」意謂體内癌細胞數目、腫瘤尺寸或癌症之 量。腫瘤負荷亦稱為腫瘤負載。 「腫瘤數目」意謂腫瘤之數目。 本斤用之/〇療」係指試圖改變所治療之個體或細 胞之天然過程的臨床干預，且可出於預防之目的或在臨床 病理學過程中進行。所需治療效果包括預防疾病發生或復 發減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理學後果、 降低疾病進展速率、改善或減緩疾病病況，及緩解病情或 改良預後纟些實施例中，本發明之抗體用於延緩疾病 或病症之發展。 ' 術語「抗贅生性組合物」係指適用於治療癌症之組合 152844.doc 201130971 物，其包含至少一種活性治療劑，例如「抗癌劑」。治療 劑（例如抗癌劑）之實例包括（但不限於）例如化學治療劑； 生長抑制劑；細胞毒性劑；用於放射線療法之藥劑；抗血 管生成劑；細胞凋亡劑；抗微管蛋白劑；及用以治療癌症 之其他藥劑，諸如抗-HER_2抗體，抗_CD2〇抗體，表皮生 長因子欠體（EGFR)拮抗劑（例如酪胺酸激酶抑制劑）， HER1/EGFR抑制劑（例如埃羅替尼（eri〇tinib) φ (TARCEVA®))，血小板源性生長因子抑制劑（例如

Gleevec (甲續酸伊馬替尼（imatinib Mesylate)))，COX-2 抑制劑（例如塞内昔布（celecoxib))，干擾素，細胞激素， 結合至以下一或多個標乾之拮抗劑（例如中和抗體）：

ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、 BCMA或VEGF受體，TRAIL/Ap〇2，及其他生物活性劑及 有機化學劑等。本發明亦包括其組合。 術語「抗癌療法」或「癌症療法」係指適用於治療癌症 • 之療法。抗癌治療劑之實例包括（但不限於）例如化學治療 劑；生長抑制劑；細胞毒性劑；用於放射線療法之藥劑； 抗血管生成劑；細胞凋亡劑；抗微管蛋白劑；及用以治療 癌症之其他藥劑，諸如抗-HER-2抗體，抗-CD20抗體，表 皮生長因子受體（EGFR)拮抗劑（例如酪胺酸激酶抑制劑）， HER1/EGFR抑制劑（例如埃羅替尼（TARCEVA®))，血小板 源性生長因子抑制劑（例如GLEEVEC®(曱磺酸伊馬替 尼）），COX-2抑制劑（例如塞内昔布）’ Erbitux®(西妥昔單 抗（cetuximab)，Imclone)，干擾素’細胞激素，結合至以 152844.doc •61 · 201130971 下一或多個標靶之拮抗劑（例如中和抗體）：ErbB2、 ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或 VEGF 受體，TRAIL/Apo2，及其他生物活性劑及有機化學劑 等。本發明亦包括其組合。 「放射線療法」意謂使用定向γ射線或β射線來誘導充分 破壞細胞以限制該細胞正常發揮功能之能力或完全摧毁該 細胞。應瞭解，此項技術中已知存在許多方式來測定治療 劑量及持續時間。典型治療係以一次投藥形式提供，且典 型劑量在每天10至200個單位（戈瑞（Gray))之範圍内。

如本文所用之術語「VEGF」或「VEGF-A」係指如 Leung 等人（1989) Science 246:1306及 Houck 等人（1991) Mol. Endocrin, 5:1806所述之165胺基酸人類血管内皮細胞 生長因子及相關121、189及206胺基酸人類血管内皮細胞 生長因子，以及其天然存在之對偶基因形式及加工形式。 術語「VEGF」亦指來自非人類物種（諸如小鼠、大鼠或靈 長類動物）之VEGF。有時，來自特定物種之VEGF由如下 術語表示，諸如hVEGF表示人類VEGF，mVEGF表示鼠類 VEGF，等。術語「VEGF」亦用於指代包含165胺基酸人 類血管内皮細胞生長因子之胺基酸8至109或1至109的截短 形式之多肽。可在本申請案中由例如「VEGF(8-109)」、 「VEGF(1-109)」、「VEGF-A1()9」或「VEGF165」鑑別所提 及之任何該等形式之VEGF。「截短」原生VEGF之胺基酸 位置係如原生VEGF序列中所指示來編號。舉例而言，截 短原生VEGF中之胺基酸位置17(曱硫胺酸）亦為原生VEGF 152844.doc •62- 201130971 中之位置17(甲硫胺酸）。截短原生VEGF對KDR及Flt-l受 體之結合親和力與原生VEGF相當。 「VEGF拮抗劑」係指能夠中和、阻斷、抑制、消除、 降低或干擾VEGF活性（包括（但不限於）其與一或多個VEGF 受體之結合）之分子。VEGF拮抗劑包括（但不限於）抗-VEGF抗體及其抗原結合片段；受體分子及衍生物，其特 異性結合至VEGF，從而阻隔VEGF與一或多個受體之結 合；抗-VEGF受體抗體；VEGF受體拮抗劑，諸如VEGFR 酪胺酸激酶之小分子抑制劑；及結合至VEGF之免疫黏附 素，諸如VEGF Trap。如本文所用之術語「VEGF拮抗劑」 特別包括結合至VEGF且能夠中和、阻斷、抑制、消除、 降低或干擾VEGF活性之分子，包括抗體、抗體片段、其 他結合多肽、肽及非肽小分子。因此，術語「VEGF活 性」特別包括VEGF介導之VEGF生物活性。 關於VEGF多肽之術語「生物活性」或術語「VEGF活 性」係指與全長VEGF及/或截短VEGF相關之物理/化學特 性及生物功能。在某些實施例中，VEGF活性為誘導及/或 刺激及/或促進血管生成。在某些實施例中，VEGF活性為 誘導及/或刺激及/或促進新血管生成。在某些實施例中， VEGF活性為誘導及/或調節血管滲透性。在某些實施例 中，VEGF活性為誘導及/或刺激及/或促進内皮細胞遷移及/ 或内皮細胞增殖。 抗-VEGF中和抗體抑制裸小鼠中多種人類腫瘤細胞株之 生長（Kim 等人，TVaiwre 362:841-844 (1993) ; Warren 等 152844.doc -63- 201130971 人，J. C7k. 95:1789-1797 (1995) ; Borgstr6m 等 人，56:4032-4039 (1996) ; Melnyk 等人， Cancer Λα. 56:921-924 (1996))，且亦抑制缺企性視網膜 病症模型中之眼内血管生成。Adamis等人，心£^· Ophthalmol. 114:66-71 (1996)° 術語「抗-VEGF抗體」或「結合至VEGF之抗體」係指 如下抗體：其能夠以足夠親和力及特異性結合至VEGF以 使得該抗體適用作靶向VEGF之診斷劑及/或治療劑。舉例 而言，本發明之抗-VEGF抗體可在靶向及干擾涉及VEGF 活性之疾病或病狀中用作治療劑。參見例如美國專利 6,582,959、6,703,020 ； W098/45332 ； WO 96/30046 ； W094/10202 ; W02005/044853 ; EP 0666868B1 ;美國專 利申請案 20030206899 、 20030190317 、 20030203409 、 20050112126 、 20050186208 及 20050112126 ; Popkov 等 人，Journal of Immunological Methods 2 达 2>..)A9-164 (2004);及W020050123 59。所選抗體通常將對VEGF具有 足夠強的結合親和力。舉例而言，該抗體結合hVEGFi Kd 值可在100 nM至1 pM之間。舉例而言，可由基於表面電漿 子共振之檢定（諸如，如PCT申請公開案第W02005/012359 號中所述之BIAcore檢定）、酶聯免疫吸附檢定（ELISA)及 競爭檢定（例如RIA之競爭檢定）來測定抗體親和力。可對 抗體進行其他生物活性檢定，例如，以評估其作為治療劑 之有效性。該等檢定在此項技術中為已知的，且視標靶抗 原及抗體之預期用途而定。實例包括HUVEC抑制檢定、 152844.doc •64· 201130971

腫瘤細胞生長抑制檢定（例如，如WO 89/06692中所述）、 抗體依賴性細胞毒性（ADCC)及補體介導之細胞毒性（CDC) 檢定（美國專利5,500,362)，及促效活性或血細胞生成檢定 (參見WO 95/27062)。抗-VEGF抗體通常不會結合至其他 VEGF 同源物（諸如 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 或 VEGF-E)，亦不會結合至其他生長因子（諸如P1GF、PDGF或 bFGF)。在一個實施例中，抗-VEGF抗體包括與融合瘤 ATCC HB 10709所產生之單株抗-VEGF抗體A4.6.1結合至 相同抗原決定基的單株抗體；重組人類化抗-VEGF單株抗 體（參見 Presta 等人（1997) Ca/tcer Λα. 57:4593-4599)，包 括（但不限於）稱為「貝伐單抗（BV)」，亦稱為「rhuMAb VEGF」或「AVASTIN®」之抗體。AVASTIN®目前可購 得。貝伐單抗包含突變人類IgGi構架區及來自鼠類抗體 A.4.6.1且阻斷人類VEGF與其受體結合之抗原結合互補決 定區。貝伐單抗中約93%之胺基酸序列（包括大部分構架 區）來源於人類IgG,，且約7°/。之序列來源於A4.6.1。貝伐 單抗具有約149,000道爾頓（dalton)之分子質量且經糖基 化。貝伐單抗及其他人類化抗-VEGF抗體進一步描述於 2005年2月26日頒佈之美國專利第6,884,879號中。其他抗-VEGF抗體包括G6或B20系列抗體（例如G6-23、G6-31、 B20-4.1)，如PCT申請公開案第W02005/012359號中所 述。關於其他較佳抗體，參見美國專利第7,060,269號、第 6,582,959 號、第 6,703,020 號、第 6,054,297 號； W098/45332 ； WO 96/30046 ； W094/10202 ； EP 152844.doc -65- 201130971 0666868B1 ;美國專利申請公開案第2006009360號、第 20050186208號、第 20030206899號、第 20030190317號、 第 20030203409 號及第 20050112126 號；及 Popkov等人， ο/'/mmwwo/ogica/ 288:149-164 (2004) 〇 如本文所用之術語「B20系列多肽」係指結合至VEGF之 多肽，包括抗體。B20系列多肽包括（但不限於）來源於B20 抗體或源自B20之抗體之序列的抗體，如美國公開案第 20060280747號、美國公開案第20070141065號及/或美國 公開案第20070020267號中所述，此等專利申請案之内容 以引用的方式明確併入本文中。在一個實施例中，B20系 列多肽為B20-4.1，如美國公開案第20060280747號、美國 公開案第20070141065號及/或美國公開案第20070020267 號中所述。在另一實施例中，B20系列多肽為B20-4.1.1， 如PCT公開案第WO 2009/073 160號中所述，該公開案之全 部揭示内容以引用的方式明確併入本文中。 如本文所用之術語「G6系列多肽」係指結合至VEGF之 多肽，包括抗體。G6系列多肽包括（但不限於）來源於G6抗 體或源自G6之抗體之序列的抗體，如美國公開案第 20060280747號、美國公開案第20070141065號及/或美國 公開案第20070020267號中所述。如美國公開案第 20060280747號、美國公開案第20070141065號及/或美國 公開案第20070020267號中所述，G6系列多肽包括（但不限 於）G6-8、G6-23 及 G6-31。 「血管生成因子或血管生成劑」為刺激血管發育，例如 152844.doc • 66- 201130971 促進血管生成、内皮細胞生長、血管穩定及/或血管發生 等之生長因子。舉例而言，血管生成因子包括（但不限於） 例如 VEGF 及 VEGF 家族成員（VEGF-B、VEGF-C &VEGF-D)、P1GF、PDGF家族、纖維母細胞生長因子家族（Fgf)、 TIE配位體（血管生成素（Angiopoietin))、蝶素（ephrin)、δ 樣配位體4(DLL4)、Del-1、纖維母細胞生長因子（酸性 (aFGF)及驗性（bFGF))、卵泡抑素（f〇llistatin)、顆粒球群落 刺激因子（G-CSF)、肝細胞生長因子（HGF)/分散因子 (SF)、介白素-8(IL-8)、痩素（leptin) '中期因子、神經纖 毛蛋白（neuropilin)、胎盤生長因子、血小板源性内皮細胞 生長因子（PD-ECGF)、血小板源性生長因子（尤其PDGF-BB 或PDGFR-β)、多效生長因子（piei〇tr〇phin，PTN)、前驅顆 粒蛋白（progranulin)、增殖蛋白（pr〇liferin)、轉化生長因 子-a(TGF-a)、轉化生長因子-p(TGF-p)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)專。企管生成因子亦包括加速傷口癒合之因子， 諸如生長激素、胰島素樣生長因子_I(IGF-I)、VIGF、表皮 生長因子（EGF)、CTGF及其家族成員，及TGF-a與TGF-β。參見例如 Klagsbrun 及 D'Amore (1991) Rev. 53:217-39 ; Streit 及 Detmar (2003) 22:3172-3179 ; Ferrara 及 Alitalo· (1999) iVaiwre 5(12).1359-1364，Tonini 等人（2003) 22:6549- 655 6(例如列出已知血管生成因子之表丨）；及Sat〇 (2003)

Int. J. Clin. Oncol. S..2QQ-2Q6。 「抗血管生成劑」或「血管生成抑制劑」係指直接或間 152844.doc -67- 201130971 接抑制血管生成、血管發生或不當血管滲透性之小分子量 物質、聚核苷酸、多肽、分離之蛋白質、重組蛋白質、抗 體，或其結合物或融合蛋白。舉例而言，抗血管生成劑為 針對如上文所定義之血管生成劑的抗體或其他拮抗劑，例 如針對VEGF之抗體、針對VEGF受體之抗體、阻斷VE(}f 文體is號傳導之小分子（例如PTK787/ZK2284、SU6668、 SUTENT®/SU11248(蘋果酸舒尼替尼（sunitinifc) malate))、 AMG706)。抗血管生成劑亦包括原生血管生成抑制劑，例 如血管抑制素（angi〇statin)、内皮抑制素（end〇statin)等。 參見例如 Klagsbmn 及 D'Amore，Amui. Rev. Physiol.， 53:217-39 (1991) ; Streit 及 Detmar，Oncogene，22:3 172. 3179 (2003)(例如列出惡性黑色素瘤之抗血管生成療法的 表 3)，Ferrara及 Alitalo，Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999) ; Tonini等人，〇nc〇gene，22:6549-6556 (2003)(例如 列出抗企管生成因子之表2);及Sat0 Int. j ciin. 0ne()1” 8:200-206 (2003)(例如列出臨床試驗中所用之抗血管生成 劑的表1)»在某些實施例中，抗血管生成劑為抗_vegf藥 劑，諸如抗-VEGF抗體（例如貝伐單抗）。 如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞 功月b及/或導致細胞破壞之物質。該術語欲包括放射性同 位素（例如 At21】、I131、I125、Y9°、Reu6、Rei88、^万153、

Bi212、P32 ’及Lu之放射性同位素）；化學治療劑，例如曱 胺喋呤（methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長春花生物 驗（長春新鹼（vincristine)、長春鹼（vinblastine)、依託泊苦 152844.doc •68- 201130971 (etoposide))、小紅莓（d〇xorubicin)、美法侖（melphalan)、 絲裂黴素C、苯丁酸氮芥（chi〇rambucil)、道諾黴素 (daunorubicin)或其他嵌入劑）；酶及其片段，諸如核分解 酶；抗生素；及毒素’諸如小分子毒素’或源於細菌、真 菌、植物或動物之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異 體’及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒 性劑描述於下文。殺腫瘤劑會破壞腫瘤細胞。

「毒素」為能夠對細胞之生長或增殖產生有害作用之任 何物質。 「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療 劑之實例包括烧化劑，諸如塞替派（thiotepa)及環填醯胺 (CYTOXAN®);烧基續酸鹽，諸如白消安（busulfan)、英丙 舒凡（improsulfan)及哌泊舒凡（piposuifan);氮丙啶 (aziridine) ’ 諸如苯。坐多巴（benzodopa)、卡波酿（carboquone)、 米特多巴（meturedopa)及尤利多巴（uredopa);伸乙基亞胺 及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺（altretamine)、三伸乙基 三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥 曱基三聚氰胺；乙酿精寧（acetogenin)(尤其布拉他辛 (bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone)) ; δ-9-四氫*** 酚（delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈***酚（dronabinol)， MARJNOL®) ; β-拉帕酿（beta-lapachone);拉帕醇（lapachol); 秋水仙驗（colchicine);樺木酸（betulinic acid);喜樹驗 (camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康（topotecan， HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康（irinotecan，CAMPTOSAR®))、 152844.doc •69· 201130971 乙酿基喜樹鹼（acetylcamptothecin)、斯考普萊·;丁 (scopolectin)及9-胺基喜樹驗）；苔蘚抑素（bryostatin);卡 利斯塔汀（callystatin) ; CC-1065(包括其阿多來新 (adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin) 合成類似物）；足葉草毒素（podophyllotoxin);足葉草酸 (podophyllinic acid);替尼泊甙（teniposide);念珠藻環肽 (cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒 素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物 KW-2189 及 CB1-TM1);艾權素（eleutherobin);盤克斯塔汀 (pancratistatin);沙考地汀（sarcodictyin);海綿抑素 (spongistatin);氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芬 (chlornaphazine)、氣磷醯胺、雌莫司汀（estramustine)、異 環填醯胺（ifosfamide)、氛芥（mechlorethamine)、鹽酸氧化 氮芥、美法舍、新氮茶（novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮 芥（phenesterine) ' 潑尼莫司汀（prednimustine)、曲洛鱗胺 (trofosfamide)、尿嘧啶氮芬（uracil mustard);亞硝基腺， 諸如卡莫司汀（carmustine)、氣脲黴素（chlorozotocin)、福 莫司 >丁（fotemustine)、洛莫司 >、丁（lomustine)、尼莫司汀 (nimustine)及雷莫司汀（ranimnustine);抗生素，諸如稀二 炔抗生素（例如卡奇黴素（calicheamicin)，尤其卡奇黴素γΐι 及卡奇黴素ωΐΐ(參見例如Nicolaou等人，c/zem /«". 似.五叹/.，33: 183-186 (1994)) ; CDP323，一 種口服α_4整合素 抑制劑；達内黴素（dynemicin)，包括達内黴素a;埃斯培 拉黴素（esperamicin);以及新制癌菌素（neocarzin〇statin) 152844.doc •70· 201130971 發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團）、阿克拉黴素 (aclacinomysin)、放線菌素（actinomycin)、奥斯拉黴素 (authramycin)、重氮絲胺酸（azaserine)、博萊黴素 (bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、卡拉比星 (carabicin)、洋紅黴素（carminomycin)、嗜癌黴素 (carzinophilin)、色黴素（chromomycin)、放線菌素 D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星（det〇rubicin)、6_ 重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅每（包括 ADRIAMYCIN 、嗎琳并小紅每(morpholino- doxorubicin)、氰基嗎啉并小紅莓、2-吡咯啉并小紅莓、鹽 酸小紅莓脂質體注射液（DOXIL®)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET®) '聚乙二醇化脂質體小紅莓（CAELYx®)及去 氧小紅莓（deoxydoxorubicin))、表柔比星（epirubicin)、依 索比星（esorubicin)、黃膽素（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（諸如絲裂黴素c)、黴酚酸 (mycophenolic acid)、諾加黴素（nogalamycin)、橄欖黴素 (olivomycin)、培洛黴素（pepi〇mycin)、泊非黴素 (porfiromycin)、σ票。令黴素（puromycin)、三鐵阿黴素 (quelamycin)、羅多比星（r〇dorubicin)、鏈黑菌素 (streptonigrin)、鏈脲菌素（strept〇zocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁 (zinostatin)、佐柔比星（zorubicin);抗代謝物，諸如曱胺 喋呤、吉西他濱（GEMZAR®) '培美曲唑（ALIMTA®);喃氟 啶（tegafur，UFTORAL®)、卡培他濱（capecitabine， I52844.doc -71· 201130971 XELODA®)、埃坡黴素（ep〇thil〇ne)及 5-氟尿。密 π定（5-FU); 葉酸類似物’諸如迪諾特寧（denopterin)、曱胺嗓呤、蝶羅 吟（pteropterin)、三曱曲沙（trimetrexate) ; °票呤類似物，諸 如氟達拉濱（fludarabine)、6-酼基嘌呤、°塞咪嘌呤 (thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如環胞苷 (ancitabine)、阿紮胞苦（azacitidine)、6-氮尿誓（6-azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙 去氧尿苦 (dideoxyuridine)、去氧氟尿苦（doxifluridine)、依 諾他濱（enocitabine)、氟尿苷（floxuridine);雄激素，諸如 卡普睪酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧 (mepitiostane)、睪内酯（testolactone);抗腎上腺藥劑，諸 如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛 司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（fr〇iinic acid); 乙醯葡經醋（aceglatone); 搭填酿胺糖苦 (aldophosphamide glycoside)；胺基乙 醯丙酸 (aminolevulinic acid);恩尿 β密咬（eniluracil);安 γ π定 (amsacrine);倍思塔布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 艾達曲克（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine)；地 口丫酿（diaziquone);艾弗利散 (elfornithine);依利醋敍（elliptinium acetate);埃坡黴素； 依託格魯（etoglucid);硝酸鎵；羥基腺；香菇多糖 (lentinan)；羅尼達寧（lonidainine);類美登素 (maytansinoid)，諸如美登素（maytansine)及安絲菌素 152844.doc -72- 201130971 (ansamitocin);米托胍膝（mitoguazone);米托蒽 g昆 (mitoxantrone)；莫比達摩（mopidanmol);硝’拉維林 (nitraerine);喷司他丁（pentostatin);蛋胺氮芥 (phenamet) ; 0比柔比星（pirarubicin);洛索蒽酿

(losoxantrone); 2-乙醯肼；丙卡巴肼（procarbazine) ; PSK® 多醣複合物（JHS Natural Products，Eugene, OR);丙亞胺 (razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐糖（sizofiran);鍺螺 胺（spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid); 三亞胺醌（triaziquone) ; 2,2',2’-三氯三乙胺；單端抱黴烯 (trichothecene)(尤其 T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、 桿抱菌素A(roridin A)及胺癸叮（anguidine));烏拉坦 (urethan)；長春地辛（vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®); 達卡巴 °秦（dacarbazine);甘露莫司汀（mannomustine);二 漠甘露醇（mitobronitol);二漠衛矛醇（mitolactol);旅泊溴 烧（pipobroman);曱托辛（gacytosine); ***糖苦 (arabinoside ;「Ara-C」）；塞替派；紫杉類（taxoid)，例如 太平洋紫杉醇(paclitaxel，TAXOL®)、白蛋白工程改造之 太平洋紫杉醇奈米粒子調配物（ABRAXANETM)及歐洲紫杉 醇（docetaxel，TAXOTERE®);苯丁酸氮芥；6-硫鳥嘌呤； 巯基嘌呤；甲胺喋呤；鉑藥劑，諸如順鉑、奥沙利鉑 (oxaliplatin)(例如ELOXATIN®)及卡鉑；防止微管蛋白聚合 形成微管之長春鹼類，包括長春鹼（VELBAN®)、長春新鹼 (ONCOVIN®)、長春地辛（ELDISINE®、FILDESIN®)及長春 瑞濱（vinorelbine，NAVELBINE®);依託泊苷（VP-16);異 152844.doc -73- 201130971 環填醯胺；米托蒽S昆；甲酿四氫葉酸（leucovorin);諾凡特 龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴素 (daunomycin);胺基蝶 σ令（arninopterin);伊班膦酸鹽 (ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥 胺酸（DMFO);類視黃素（retinoid)，諸如視黃酸（retinoic acid)，包括貝瑟羅汀（bexarotene，TARGRETIN®);雙膦酸 鹽，諸如氣屈膦酸鹽（clodronate)(例如BONEFOS®或 OSTAC®)、依替膦酸鹽（etidronate，DIDROCAL®)、NE-5 8095、°坐來膦酸/°坐來膦酸鹽（zoledronic acid/zoledronate， ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽（alendronate，FOSAMAX®)、帕米 膦酸鹽（pamidronate，AREDIA®)、替魯膦酸鹽（tiludronate， SKELID®)或利塞膦酸鹽（risedronate，ACTONEL®);曲沙 他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；反 義寡核苷酸，尤其抑制異常細胞增殖所牽涉之信號傳導路 徑中基因之表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-ct、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫苗，諸如 THERATOPE®疫苗及基因治療疫苗，你J如ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑 制劑（例如 LURTOTECAN®) ; rmRH(例如 ABARELIX®); BAY439006(索拉非尼（sorafenib) ; Bayer) ; SU-1 1248(舒尼 替尼（sunitinib) ， SUTENT® ，Pfizer);略立福新 (perifosine)、COX-2抑制劑（例如塞内昔布或依託昔布 (etoricoxib))、蛋白酶體抑制劑（例如PS341);硼替佐米 (bortezomib ， VELCADE®) ; CCI-779 ;替吡法尼 I52844.doc -74- 201130971 (tipifarnib，R11577);奥拉非尼（orafenib)、ABT510 ; Bcl-2抑制劑，諸如奥利默森鈉（oblimersen sodium， GENASENSE®);匹克生瓊（pixantrone) ; EGFR抑制劑（參 見下文之定義）；酪胺酸激酶抑制劑（參見下文之定義）；絲 胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素（rapamycin)(西羅 莫司（sirolimus)，RAPAMUNE®);法呢基轉移酶抑制劑， 諸如洛那法尼（lonafarnib，SCH 6636，SARASARTM);及 上述任何化學治療劑之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生 物；以及兩種或兩種以上上述化學治療劑之組合，諸如 CHOP(環鱗醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍 (prednisolone)之組合療法的縮寫）及FOLFOX(奥沙利鉑 (ELOXATINtm)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的 縮寫）。 如本文所定義之化學治療劑包括起作用以調控、減少、 阻斷或抑制可促進癌症生長之激素作用的「抗激素劑」或 「内分泌治療劑」。其可為激素本身，包括（但不限於）：具 有混合型促效/拮抗概況之抗***，包括他莫昔芬 (tamoxifen，NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬 (toremifene，FARESTON®)、艾多昔芬（idoxifene)、屈洛昔 芬（droloxifene)、雷洛昔芬（raloxifene，EVISTA®)、曲沃 昔芬（trioxifene)、鹽酸雷洛昔芬（keoxifene)，及選擇性雌 激素受體調節劑（SERM) ’諸如SERM3 ;不具有促效特性 之純抗***，諸如氟維司群（fulvestrant，FASLODEX®) 及EM800(該等藥劑可阻斷***受體（ER)二聚化、抑制 152844.doc -75· 201130971 DNA結合、增加ER轉換及/或抑制ER含量）；芳香酶抑制 劑，包括類固醇芳香酶抑制劑，諸如福美司坦 (formestane)及依西美坦（exernestane，AROMASIN®)，及 非類固醇芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑（anastrazole， ARIMIDEX®)、來曲唑（丨etrozo丨e，FEMARA®)及胺魯米 特’以及其他^香酶抑制劑，包括伏羅嗤（vor〇z〇le， RIVISOR®)、乙酸曱地孕嗣（megestr〇i acetate ， MEGASE®)、法屈唾（fa(jroz〇ie)及4(5)-σ米η坐；黃體激素釋 放激素促效劑’包括亮丙瑞林（leUpr〇lide，LUPRON®及 ELIGARD )、戈舍瑞林(g〇sereiin)、布舍瑞林(buserelin)及 曲特瑞林（tripterelin);性類固醇，包括助孕素（諸如乙酸 曱地孕酮及乙酸甲羥孕酮）、***（諸如己烯雌酚 (diethylstilbestrol)及普雷馬林（premarin))及雄激素/類視黃 素（諸如氟經甲基睪酮（fluoxymesterone)、所有反式視黃酸 及芬維A胺（fenretinide));奥那司酮（〇naprist〇ne);抗孕 酮；***受體下調劑（ERD);抗雄激素，諸如氟他胺 (flutamide)、尼魯米特（nilutamide)及比卡魯胺 (bicalutamide);及上述任何化學治療劑之醫藥學上可接受 之鹽、酸或衍生物，以及兩種或兩種以上上述化學治療劑 之組合。 「生長抑制劑」在本文中使用時係指在活體外或活體内 抑制細胞（諸如表現Bv8之細胞）生長之化合物或組合物。 因此，生長抑制劑可為顯著降低8期中細胞（諸如表現Bv8 之細胞）之百分比的生長抑制劑。生長抑制劑之實例包括 152844.doc •76- 201130971 阻斷細胞週期進程（除s期以外之階段）的藥劑，諸如誘導 G1停滯及Μ期停滯之藥劑。傳統肘期阻斷劑包括長春鹼類 (長春新鹼及長春鹼）、紫杉烷及拓撲異構酶π抑制劑（諸如 小紅莓、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴素）。 使G1停滞之彼等藥劑亦外溢引起s期停滯，例如〇να烷化 劑’諸如他莫昔芬、潑尼松（prednis〇ne)、達卡巴嗪、氮 芬 '順链、曱胺喋呤、5_氟尿嘧啶及ara_C。更多資訊可見 於 Mendelsohn 及 Israel 編，《彳

Cancer ’ 第 1 早’題為「ceu CyCie reguiati〇n，〇nc〇genes， and antineopiastic drugs」Murakami等人（W.B. Saunders， Philadelphia, 1995)(例如第13頁）中。紫杉烷類（太平洋紫 杉醇及歐洲紫杉醇）為均來源於紫杉樹之抗癌藥。來源於 歐洲紫杉之歐洲紫杉醇（TAX〇TERE®，Rh〇ne_p〇ulenc Rorer)為太平洋紫杉醇（TAX〇L®，Brist〇i_Myers Squibb)之 半合成類似物。太平洋紫杉醇及歐洲紫杉醇促進由微管蛋 白一聚體組裝成微管且藉由防止解聚而使微管穩定，從而 抑制細胞有絲***。 「小紅菩」為一種蒽環黴素類抗生素（anthracycHne antibiotic)。小紅莓之完整化學名稱為（8S順卜1〇[(3胺基_ 之一…-二去氧-心^來蘇-己哌喃糖基^氧基卜入^丨^四氫-6,8，11-三羥基_8_(羥基乙醯基）_丨_甲氧基_5，12_并四苯二 嗣。 術含Fc區多肽」係指包含Fc區之多肽，諸如抗體或 免疫黏附素（參見下文之定義）。可例如在純化多肽期間或 152844.doc -77- 201130971 藉由對編碼多肽之核酸進行重組工程改造來移除Fc區之c 端離胺酸（殘基447，根據EU編號系統）。因此，包含本發 明之具有Fc區之多肽的組合物可包含具有K447之多肽、已 移除所有Κ447之多肽，或含及不含Κ447殘基之多肽的混 合物。 「個體」或「患者」為脊椎動物。在某些實施例中，脊 椎動物為哺乳動物❶哺乳動物包括（但不限於）農畜（諸如乳 牛）、競技型動物、寵物（諸如貓、犬及馬）、靈長類動物、 小鼠及大鼠。在某些實施例中，哺乳動物為人類。 「有效量」係指在必需劑量及時段下有效達成所要治療 結果或預防結果之量。 本發明之物質/分子、促效劑或拮抗劑之「治療有效 量」可根據以下因素而變化：諸如個體之疾病病況、年 齡、性別及體重’及物質/分子、促效劑或拮抗劑在個體 體内引發所要反應的能力。治療有效量亦為物質/分子、 促效劑或拮抗劑之治療有益作用超過其任何有毒或有害作 用的量。「預防有效量」係指在必需劑量及時段下有效達 成所要預防結果之量。通常但未必一定的是，因為預防劑 量係在個體患病之前或在患病早期使用，故預防有效量將 低於治療有效量。 「難治」係指疾病或病狀對治療具抗性或不起反應（例 如即使提供治療，贅生性漿細胞數目仍增長）。在某些實 施例中，術語「難治」係指對任何前述治療，包括（但不 限於）VEGF拮抗劑、抗血管生成劑及化學療法治療具抗性 152844.doc .78· 201130971 或不起反應。在某些實施例中，術語「難治」係指疾病或 病狀對任何前述治療’包含VEGF拮抗劑、抗血管生成劑 及/或化學療法治療固有地不起反應。在某些實施例中， VEGF括抗劑為抗-VEGF抗體。 復發」係指患者疾病退回至其原先罹病狀態，尤其在 明顯恢復或部分恢復之後症狀反覆。在某些實施例中，復 發病況係指在前述治療，包括（但不限於）VEGF拮抗劑、抗 血官生成劑及/或化學療法治療之前返回至疾病狀態之過 程·或疾病反覆。在某些實施例中，復發病況係指在對癌症 療法，包含VEGF拮抗劑、抗血管生成劑及/或化學療法治 療初始產生強烈反應之後返回至疾錄態之過程或疾病反 覆。在某些實施例中’ VEGF拮抗劑為抗_VEGF抗體。 術語「功效」在本文中以最寬泛之含義使用且係指免疫 球蛋白、抗體或Fc融合蛋白產生所要作用之能力。在某些 實，例中，功效係指免疫球蛋白、抗體或以融合蛋白以餘

和量所觀測到的最大作用。纟某些實施例中，功效係指免 疫球蛋白、抗體或Fc融合蛋白之EC5〇e在某些實施例中， 功效係指免疫球蛋白、抗體仏融合蛋白之效I在某政 實施例中，功效係指免疫球蛋白、抗體或卜融合蛋白對疾 病病程或持續時間產生有益_ (包括如本文所定義之臨 床效益）的能力。 EC5〇」係指免疫球蛋白 机趙取k融合蛋白誘導 土線與最大值之間的-半反應之濃度實施例中， 心表示觀測到最大作用之5G%的免疫球蛋白、抗體_ 152844.doc -79· 201130971 融合蛋白濃度。在某些實施例中，ec5。表示在活體内獲得 最大作用之50%所需之血漿或血清濃度。 可藉由價測本發明之抗體、融合蛋白、結合分子或組合 物抑制或減少癌性細胞生長或轉移、或者改善或減輕一或 多種與癌症相關之症狀的能力來顯示治療癌症之功效。若 在投與本發明之抗體、融合蛋白、結合分子或組合物之 後，例如，癌性細胞之生長或轉移減少、—或多種與癌症 相關之症狀改善、或死亡率及/或發病率降低，則治療視 為有治療效果。可在活體外、離體及活體内檢^中測試本 發明之抗體、融合蛋白或組合物減少腫瘤形成之能力。對 於癌症療法，亦可例如藉由評估存活持續時間、疾病進展 時間（TTP)、&應率（RR)、反應持續時間及/或生活品質來 量測活體内功效。 可藉由評估各種終點來量測臨床效益，該等終點為例如 疾病進程受到-定程度的抑制，包括減緩及完全停滞；疾 病發作次數及/或症狀數目減少；病變尺寸減小；疾病細 胞浸潤至鄰近周邊器官及/或組織中之情況受到抑制（亦即 減少、減缓或完全停止）；疾病擴散受到抑制（亦即減少、 減緩或完全停止）；自體免疫反應下降，其可能（但並非必 須）引起疾病病變消退或消解；一或多種與病症相關之症 狀得到一定程度的舒解；治療後無疾病表現之時間長度 (例如無進展存活期）延長；總體存活率增加；反應率較 高；及/或治療後特定時間點之死亡率降低。 維持療法」意謂經提供以減小疾病復發或進展之可能 152844.doc 201130971 ==法聯合提供维持療法。與其他類型之療法所用之 量。，、准持療法所用之劑量可變化且可包括遞減劑 跡肖助療法」係指在手術後偵測不到殘留疾病 情況下提供的療法’以此降低疾病復發之風險。辅 亡之機率。 且由此降低癌症相關死 盘^或多種其他治療劑「經合」投與包括同時（並行）投 ，、叹以任何次序相繼投與。 術語「同時」或「並行」在本文t用於指代兩種或兩種 以上治療劑之投藥，其中至少_部分投藥在時間上重疊。 :此’並行投藥包括在中斷投與一或多種其他藥劑之後繼 續才又與一或多種藥劑的給藥方案。 「生物樣品」（可互換地稱為「樣品」或「組織或細胞 樣品」）涵蓋自個體獲得之多種樣品類型且可用於診斷或 監測檢定中。該定義涵蓋血液及其他源於生物來源之液體 樣品；固體組織樣品’諸如活檢樣本或組織培養物或由苴 得到之細胞，及其子代。該定義亦包括在獲得之後已按任 何方式加以處置之樣品，該等方式為諸如以試劑處理、增 ’合或虽集某些組分（諸如蛋白f或聚核#酸）錢埋於半固 體或固體基質中以達成切片目的。術語「生物樣品」涵蓋 臨床樣品，且亦包括培養物中之細胞、細胞上清液、細胞 152844.doc •81 - 201130971 命解產物、血清、血漿、生物流體及組織樣品。生物樣。 之來源可為固體組織，如來自新鮮、冷;東及/或保藏二 或組織樣品或活檢或抽出物之固體組織；血液或任何血液 組分；體液，諸如腦脊髓液、羊水、腹膜液或間質液；在 個體姓娠或發育中之任何時間點的細胞。在-些實施例 中’生物樣品係自原發性或轉移性腫瘤獲 含有在自然界中不與組織天然混合之化合物二: 劑、抗凝劑、緩衝液、固定劑、營養素、抗生素或其類似 物。 對於本文而言，組織樣品之「切片」意謂組織樣品之單 -部分或碎片，例如自組織樣品切下之組織或細胞薄片。 應瞭解，可獲取組織樣品之多個切片且根據本發明進行分 析。在-些實施例中’在形態與分子層面上分析組織樣品 之同一切片’或分析其蛋白質與核酸。 術語「醫藥調配物」、「醫藥組合物」或「治療調配物」 係指如下製劑：其採用可使活性成分之生物活性保持有效 之形式，且不含有對該調配物將投與之個體具有不可接受 之毒性的其他組分。該等調配物可為無菌的。 「無菌」調配物經滅菌或不含所有活微生物及其孢子。 「標記」一詞在本文中使用時係指直接或間接結合或融 合至諸如核酸探針或抗體之試劑且有助於偵測其所結合或 融合之試劑的化合物或組合物《標記本身可為可该測的 (例如放射性同位素標記或螢光標記），或在酶標記之情況 下可催化可偵測之受質化合物或組合物發生化學變化。 152844.doc -82- 201130971 如本文所用之「載劑 4化 匕括在所用劑量及滚度下對與之 接觸之細胞或哺乳動物I毒 、 .、、'毋的醫樂學上可接受之載劑、賦 形劑或穩定劑。通常，生理與μ^ 生理學上可接受之載劑為pH緩衝水 浴液。生理學上可接夸夕鄱 — 要又之載劑的貫例包括緩衝液，諸如磷 酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血 酸；低分子量（少於約1G個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清 白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙稀吼

咯啶酮；胺基酸’諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精 胺酸或離胺酸；單酿、雙酿及其他碳水化合物，包括葡萄 糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如edta ;糖醇，諸如甘 露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉離子；及/或 非離子界面活性劑’諸如TWEENTM、聚乙二醇（pEG)及 PLURONICS™。 脂質體」為由各種類型之脂質、填脂及/或界面活性 劑構成之小泡囊，其適用於將藥物傳遞至哺乳動物。與生 φ 物膜之脂質佈置類似，脂質體之組分通常以雙層形態佈 置。 組合物 本發明之抗-Bv8抗體較佳為單株抗體。本發明之範疇内 亦涵蓋本文所提供之抗-Bv8抗體之Fab、Fab，、Fab，-SH及 F(ab )2片段。此專抗體片段可藉由諸如酶促消化之傳統手 段形成’或可藉由重組技術產生.該等抗體片段可為嵌合 或人類化抗體片段。此等片段適用於達成下文所闡述之診 斷及治療目的。 152844.doc -83 - 201130971 單株抗體係自實質上均質之抗體群體獲得，亦即構成該 群體之個別抗體除可少量存在之可能天然發生之突變以外 皆相同。因此’修飾語「單株」指示並非離散抗體之混合 物形式的抗體特徵。 本發明之抗-Bv8單株抗體可使用最先由K〇hUr等人， 256:495 (1975)描述之融合瘤方法製得，或可藉由 重組DNA方法（美國專利第4,816,567號）製得。 在融合瘤方法中，使小鼠或其他適當宿主動物（諸如倉 鼠）免疫，以引發淋巴細胞產生或能夠產生將特異性結合 至用於免疫之蛋白質的抗體。可藉由多次皮下（sc)或腹膜 内（ιρ)注射Bv8及佐劑而在動物體内產生針對Bv8之抗體。 可使用此項技術中熟知之方法製備Bv8，其中一些方法將 於本文中進一步描述《舉例而言，下文描述重組產生人類 及小鼠Bv8。在一個實施例中，用融合至免疫球蛋白重鏈 之Fc部分之Bv8使動物免疫。在一個較佳實施例中，用 Bv8-IgGl融合蛋白使動物免疫。通常將針對bv8與單填醯 脂質 A(MPL)/二黴菌酸海藻糖（trehalose dicrynomycolate， TDM)之免疫原性結合物或衍生物（Ribi Immun〇chem Research，Inc” Hamilton，MT)對動物進行免疫，且在多個 部位經皮内注射溶液。兩週後對動物加強免疫^ 7至14天 後將動物放血，且檢定血清之抗-Bv8效價。對動物加強免 疫直至效價達到平穩狀態。 或者，可在活體外使淋巴細胞免疫。接著，使用適合之 融合劑（諸如聚乙二醇）使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以 152844.doc -84- 201130971 形成融合瘤細胞（Goding， Monoclonal Antibodies: iVaciz.ce ，第 59-103 頁（Academic Press， 1986))。 對由此製備之融合瘤細胞進行接種，且使其在較佳含有 一或多種抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活之物質 的適合培養基中生長。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏 酶類次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT或HPRT)， 則用於融合瘤之培養基通常將包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及 胸苷（HAT培養基），該等物質會阻止HGPRT缺乏細胞生 長。 較佳之骨髓瘤細胞為有效融合，支持所選抗體產生細胞 穩定高量地產生抗體，且對諸如HAT培養基之培養基敏感 的骨髓瘤細胞。在此等骨髓瘤細胞中，較佳之骨髓瘤細胞 株為鼠類骨髓瘤細胞株，諸如來源於可得自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA 之 MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤，及可得自美國菌種保存中 心（American Type Culture Collection)(Rockville, Maryland 118八）之3?-2或乂63-八经8-653細胞之細胞株。亦已描述用於 產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤 細胞株（Kozbor, J. /mww/7〇/_，133:3001 (1984) ; Brodeur 等 A. ， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 5 1-63 頁（Marcel Dekker，Inc·，New York, (1987))。 檢定其中生長有融合瘤細胞之培養基中針對Bv8之單株 152844.doc -85- 201130971 抗體的產生。較佳藉由免疫沈澱或藉由活體外結合檢定 (諸如放射免疫檢定（RIA)或酶聯免疫吸附檢定（ELISA))測 定融合瘤細胞所產生之單株抗體的結合特異性。 可例如藉由 Munson 等人，i〇7:220 (1980)之斯卡查德分析（scatchard analysis)來測定單株抗體 之結合親和力。 鑑別產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體的 融合瘤細胞之後，可由限制性稀釋程序對該等純系進行次 選殖且由標準方法加以培養（G〇ding，施⑽ Antibodies: PHnciples ami Practice，第 59·1〇3Έ ㈤

Press，2986))。適於達成此目的之培養基包括例如dmem 或RPMI-1640培養基。另外，融合瘤細胞可在活體内於動 物之腹水型腫瘤中生長。 由習知免疫球蛋白純化程序自培養基、腹水或血清中適 當分離次純系所分泌之單株抗體，該等程序為諸如蛋白質 A-填脂糖、經磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。 本發明之抗-Bv8抗體可藉由使用組合文庫筛選具有所要 活性之合餘體純系而獲得u上，藉㈣選嗟菌體文 庫來選擇合成抗體純系，該等文庫含有呈現融合至嗤菌體 勒蛋白之抗體可變區(Fv)之各種片段的嗟菌體。藉由對： 要抗原進行親和層析來淘選該等噬菌體文庫。使表現〜夠 結合至所要抗原之Fv片段之㈣吸附至抗原，此^文 庫中之非結合純系分離。接著自抗原溶離結合純系，且可 藉由更多的抗原吸附/溶離循環來進一步富集。可藉由： 152844.doc • 86 · 201130971 計適合之抗原筛選程序來選擇相關噬菌體純系，隨後使用 來自相關喔菌體純系之Fv序列及Kabat等人，〇/ Proteins of Immunological Interest ，第 5 版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991)，第 1-3卷中所述 之適合恆定區（Fc)序列來構築全長抗-Bv8抗體純系，從而 獲得本發明之任何抗-Bv8抗體。 抗體之抗原結合域係由兩個具有約110個胺基酸且各自 來自輕鏈（VL)及重鏈（VH)之可變（V)區形成，兩者均存在 三個高變環或互補決定區（CDR)。可變域可以單鏈 Fv(scFv)片段形式（其中VH與VL經短的可撓性肽共價連接） 或以Fab片段形式（其中VH與VL各自融合至恒定域且以非 共價方式相互作用）功能性地呈現於噬菌體上，如Winter等 人，Ann. Rev. Immunol·, 12: 433-455 (1994)中所述。如本 文所用之scFv編碼噬菌體純系及Fab編碼噬菌體純系統稱 為「Fv噬菌體純系」或r Fv純系」。 可藉由聚合酶鏈反應（PCR)來獨立地選殖VH及VL基因之 譜系且於噬菌體文庫中隨機重組，接著可如Winter等人， J 12: 433-455 (1994)中所述在該等噬菌 體文庫中搜尋抗原結合純系。來自經免疫來源之文庫提供 針對免疫原之高親和力抗體，而無需構築融合瘤。或者， 可選殖天然譜系以提供針對多種非自體抗原以及自體抗原 之人類抗體的單一來源，而無需進行任何免疫，如

Griffiths等人，五⑽Ο 乂 12: 725-734 (1993)所述。最後， 亦可藉由自幹細胞中選殖未重排之V基因區段，且使用含 152844.doc •87- 201130971 有隨機序列之PCR引子來編碼高度可變之CDR3區且完成 活體外重排’從而以合成方式製得天然文庫，如

Hoogenboom及 Winter，《/· 5ζ·〇/.，227: 381-388 (1992)所 述。 使用絲狀噬菌體以藉由與少量鞘蛋白ρΙΙΙ融合來呈現抗 體片段。抗體片段可以單鍵Fv片段形式呈現，其中vh與 VL域經可撓性多肽間隔子於同一多狀鏈上連接，例如， 如 Marks等人，/· Μο/· 5ίο/. 222:581-597 (1991)所述；或 以Fab片段形式呈現，其中一條鏈融合至ρΙΠ，而另一條鏈 分泌至細菌宿主細胞周質中，在該周質中組裝Fab_鞘蛋白 結構’其藉由置換一些野生型鞘蛋白而呈現於噬菌體表面 上，例如，如Hoogenboom等人，施c/· 此心义，19:4133- 4137 (1991)所述。 一般而言，自人類或動物中收集之免疫細胞獲得編碼抗 體基因片段之核酸。若需要偏重於抗·Bv8純系之文庫，則 用Βν8使個體免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循 環B細胞以及其他周邊血液淋巴細胞（PBL)以供構築文庫。 在一個較佳貫施例中’藉由在帶有功能性人類免疫球蛋白 基因陣列（且缺乏功能性内源抗體產生系統）之轉殖基因小 鼠中產生抗-Bv8抗體反應’以使得Bv8免疫得到產生針對 Bv8之人類抗體的B細胞來獲得偏重於抗_Bv8純系之人類 抗體基因片段文庫。下文描述產生人類抗體之轉殖基因小 鼠的產生。 可藉由使用適合之篩選程序分離表現Bv8特異性臈結合 152844.doc • 88 - 201130971 抗體之B細胞，例如藉由使用Bv8親和層析分離細胞，或 使細胞吸附至經螢光染料標記之Bv8、隨後進行流式活化 細胞分選（FACS)來進一步富集抗·Bv8反應性細胞群體。 或者’使用來自未經免疫供者之脾細胞及/或8細胞或其 他PBL使可能產生之抗體譜系得到更好呈現，且亦允許使 用其中Βν8不具抗原性之任何動物（人類或非人類）物種來 構築抗體文庫。對於併有活體外抗體基因構築之文庫，自 φ 個體收集幹細胞以提供編碼未重排之抗體基因區段之核 酸。相關免疫細胞可自多種動物物種獲得，諸如人類、小 鼠、大鼠、兔、狼、犬、貓、豬、牛、馬及鳥類物種等。 自相關細胞中回收編碼抗體可變基因區段（包括VH及VL 區段）之核酸並使其擴增。在重排VH及VL基因文庫之情況 下’可藉由自淋巴細胞中分離基因組DNA或mRNA，隨後 如 Orlandi 等人，/V〇c_ 如· （USA), 86·3833_ 3837 (1989)中所述，使用與重排vh及VL基因之5,端及3,端 • 匹配之引子進行聚合酶鏈反應，從而製得用於表現 之多種V基因譜系來獲得所要DNA。可使用編碼成熟V域 之外顯子之5’端的後向引子以及定位於j區段内的正向引 子’自cDNA及基因組DNA擴增V基因，如Orlandi等人 (1989)及 Ward等人 ’ iVaiwre，341: 544-546 (1989)中所述。 然而’對於自cDNA擴增，後向引子亦可定位於前導外顯 子内，如 Jones等人，9: 88-89 (1991)中所述； 且正向引子可定位於恆定區内，如Sastry等人，尸 dcac/· &ζ··〔CASd 人 86: 5728-5732 (1989)中所述。為使互補 152844.doc •89· 201130971 性達到最大，可將簡併合併入引子中，如〇rlandi等人 (1989)或Sastry等人（1989)所述。較佳藉由使用靶向各v基 因家族之PCR引子以擴增存在於免疫細胞核酸樣品中之所 有可用VH及VL排列來使文庫多樣性達到最大，例如，如

Marks等人 ’ J. Mo/.出〇/·, 222: 581-597 (1991)之方法中所 述’或如 Orum·# 人 ’ jVwc/e/c dc/办及以·，21: 4491-4498 (1993)之方法中所述。對於將經擴增之dnA選殖至表現載 體中’可在一端作為標籤之PCR引子内引入稀少的限制性 位點’如Orlandi等人（1989)中所述；或使用經標記之引子 進一步進行PCR擴增’如 Clackson等人，iVaiwre，352:624-628 (1991)中所述。 以合成方式重排之V基因譜系可在活體外自V基因區段 獲得。大部分人類VH基因區段已經選殖並定序（於 Tomlinson 等人 > J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)中岸艮 導）’且繪圖（於Matsuda等人，3: 88-94 (1993)中報導）；此等經選殖區段（包括HI及Η2環之所有主 要構形）可用於使用編碼具有不同序列及長度之Η3環的 PCR引子來產生不同VH基因譜系，如Hoogenboom及 Winter，《/. Mo/.价〇/·，227: 381-388 (1992)中所述。亦可製 得具有集中於具有單一長度之長H3環中之所有序列多樣性 的 VH譜系，如 Barbas 等人，尸roc. 5W. ^/以， 89: 4457-4461 (1992)中所述。人類Vk及νλ區段已經選殖 並定序（於 Williams 及 Winter，五《广 J. 23: 1456- 1461 (1993)中報導），且可用於製得合成輕鏈譜系。基於 152844.doc • 90- 201130971

一定範圍之VH與VL·摺疊及L3與H3長度之合成V基因譜系 將編碼具有大量結構多樣性之抗體。擴增V基因編碼DNA 之後’可根據 Hoogenboom 及 Winter, ·/· Mo/· 227:381-388 (1992)之方法在活體外對生殖系v基因區段進行重排。 可藉由以數種方式將VH與VL基因譜系組合在一起來構 築抗體片段譜系》各譜系可在不同載體中形成，且該等載 體係於活體外（例如，如Hogrefe等人，128:119-126 φ (1993)中所述）或於活體内藉由組合感染（例如，如

Waterhouse等人 ’ iVwc/· Jc/A 及以· 21:2265-2266 (1993)中 所述之ΙοχΡ系統）而重組。活體内重組方法利用Fab片段之 雙鏈性質來克服大腸桿菌轉化效率強加於文庫大小之限 制。獨立地選殖天然VH及VL譜系，一者選殖至噬菌粒中 且另一者選殖至喧菌體載體中。接著藉由含嗤菌粒之細菌 的噬菌體感染來組合兩個文庫，從而使各細胞含有不同組 合且文庫大小僅受所存在之細胞數目（約1012個純系）限 I 制。兩個載體均含有活體内重組信號，從而使VH與VL基 因重組於單一複製子上並共同封裝於噬菌體病毒粒子中。 此等大型文庫提供許多具有良好親和力（K/1為約1(Γ8 M)之 多種抗體。 或者，玎將譜系依序選殖至同一載體中，例如，如 Barbas等人’〜0c. 88:7978-7982 (1991)中所述；或可藉由PCR將譜系組裝在一起，接著進 行選殖，例如’如 Clackson 等人，iVaiwre，352:624-628 (1991)中所述。亦可使用PCR組裝將¥11及VL DNA與編碼 152844.doc •91- 201130971 可挽性狀間隔子之DNA連接在一起以形成單鍵Fv(scFv)譜 系。在另一技術中’使用「細胞内PCR組裝」以藉由PCR 將VH與VL基因在淋巴細胞内組合，接著選殖經連接基因 之譜系，如Embleton等人，Λα. 20:3831-3837 (1992)中所述。 由天然文庫產生之抗體（天然或合成的）可具有中等親和 力（Κ/1為約106至ΙΟ7 Μ·1)，但亦可在活體外藉由構築第二 文庫並自其中重新選擇來模擬親和力成熟，如Winter等人 (1994)(同上）所述。舉例而言，可以Hawkins等人，乂 5ζ·ο/· 226:889-896 (1992)之方法或以 Gram 等人，_proc t/M 89:3576-3580 (1992)之方法，藉由使 用易誤聚合酶（於Leung等人，1:1 1 -1 5 (1989)中 報導）在活體外隨機引入突變。另外，可藉由例如使用帶 有跨越相關CDR之隨機序列的引子在所選個別ρν純系中進 行PCR而使一或多個CDR隨機突變，且篩選較高親和力純 系來實現親和力成熟。WO 96/07了54(1996年3月14日公開） 描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈之互補決定區中發生突變以 建立輕鏈基因之文庫的方法。另一有效方法為將藉由喔菌 體呈現所選擇之VH域或VL域與自未經免疫供者獲得之天 然存在之V域變異體譜系重組，且在數輪鏈改組中針對較 尚親和力進行篩選，如Marks等人，5z.c>iec;/m〇/,，10.779 783 (1992)中所述。此技術可產生親和力在1〇-9 M範圍内 之抗體及抗體片段。 此項技術中已知Bv8核酸及胺基酸序列，例如 152844.doc 201130971

Wechselberger 等人 462:177-181 (1999))及 Li 等 人（Mo/. 59:692-698 (2001))中。可由此項技術中已 知之多種方法來製備編碼Bv8之核酸。此等方法包括（但不 限於）藉由Engels等人，Jgwew. C/iem. /价.五叹/·, 28: 716-734 (1989)中所述之任何方法進行化學合成，諸如三 S旨、亞磷酸酯、胺基磷酸酯及H-膦酸酯方法。在一個實施 例中’表現宿主細胞較佳之密碼子用於設計Bv8編碼 φ DNA。或者，可自基因組或cDNA文庫中分離編碼bv8之 DNA。 在構築編碼Bv8之DNA分子後’使DNA分子操作性地連 接至表現載體（諸如質體）中之表現控制序列，其中該控制 序列係由經載體轉化之宿主細胞識別。一般而言，質體載 體含有來源於與宿主細胞相容之物種的複製及控制序列。 载體通常帶有複製位點以及編碼能夠在經轉化細胞中提供 表型選擇之蛋白質的序列。此項技術中已知適用於原核及 參 真核宿主細胞中之表現的載體，且一些載體將在本文中進 一步描述。可使用真核生物體（諸如酵母）或來源於多細胞 生物體（諸如哺乳動物）之細胞。 視情況’使編碼Bv8之DNA操作性地連接至分泌性前導 序列，從而將宿主細胞之表現產物分泌至培養基中。分泌 性前導序列之實例包括st„、大腸桿菌素（ec〇tin)、U、 疱疹GD、lpp、鹼性磷酸酶、轉化酶及α因子。蛋白質a之 36胺基酸前導序列（Abrahmsen等人，五从 (1985))亦適用於本文。 152844.doc -93- 201130971 用^文所狀本發明表現或選殖㈣轉染且較佳轉化宿 一 誘導啟動子、選擇轉化體或擴 i曰編碼所要序列之基因的習知營養培養基中培養。 轉染係指實際上表現抑或不表現任何編碼序列之宿主細 胞對表現載體的吸收。一般熟習此項技術者已知眾多轉毕 方法’例如CaP〇4澱及電穿孔…般而言，當宿主細2 内出現有關此載體操作之任何跡象時，則認為轉染成功。 此項技術中熟知轉染方法’且一些方法將在本文中進一步 描述。 轉化意謂將DNA引入生物體中以使1)1^八可作為染色體外 元件或由染色體之組成部分進行複製。視所用宿主細胞而 定，使用適於該等細胞之標準技術進行轉化。此項技術中 熟知轉化方法，且一些方法將在本文中進一步描述。 可如Sambrook等人（同上）一般所述來培養用於產生Bv8 之原核宿主細胞。 可在多種培養基中培養用於產生Βν8之哺乳動物宿主細 胞’此方法在此項技術中為熟知的且其中一些在本文中加 以描述。 本發明中所提及之宿主細胞涵蓋活體外培養物中之細胞 以及宿主動物體内之細胞。 可使用技術上公認之方法實現Bv8純化，其中一些在本 文中加以描述。 可使經純化之Bv8附著於用於親和層析分離噬菌體呈現 純系之適合基質，諸如壤脂糖珠粒、丙稀醯胺珠粒、玻璃 152844.doc -94- 201130971 珠粒、纖維素、各種丙稀酸系共聚物、羥基甲基丙烯酿酯 凝膠、聚丙烯酸及聚曱基丙烯酸系共聚物、耐侖（nyl〇n)、 中性及離子性載體及其類似物。可藉由从ζ·„

Enzymology，第44卷(1976)中所述之方法使Bv8蛋白質附 著於基質。使蛋白質配位體附著於多醣基質（例如瓊脂 糖、聚葡萄糖或纖維素）之常用技術涉及用函化氰活化載

體’隨後使肽配位體之初級脂族或芳族胺與經活化之基質 偶合。 或者，可將Bv8用於塗覆吸附盤之孔，於固定至吸附盤 之宿主細胞上表現或用於細胞分選，或結合至生物素以用 塗覆有抗生物素蛋白鏈菌素之珠粒捕捉，或用於淘選噬菌 體呈現文庫之任何其他技術上已知之方法中。 在適於至少一部分噬菌體粒子與吸附劑結合之條件下， 使噬菌體文庫樣品與經固定之Bv8接觸。通常對包括 值、離子強度、溫度及其類似條件之條件進行選擇以模擬 生理條件。洗務與固相結合之嗤菌體，接著㈣溶離，例 ^ > ^Barbasf A ^ Natl. Acad. Sci USA, 88:7978- ’如Marks等人，J. 述；或例如以與 7982( 1991)中所述；或用驗溶離，例如 Mo/·仏〇/·，222: 581-597 (1991)中所 CUckson等人，偏⑽，352:似销（i99i)之抗原競爭方 法類似之程序，藉由Bv8抗原競爭進行溶離。可在單輪選 擇中富集2(Μ，_倍之噬菌冑。此外，可使所富集之噬菌 體在細菌培養物中生長並進行更多輪選擇。 選擇效率視許多因素而定，包括洗務期間之解離動力 152844.doc •95· 201130971 學，及單一噬菌體上之多個抗體片段能否同時與抗原接 合。可藉由使用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及抗原於固 相中之高塗覆密度來保留具有快速解離動力學（及弱結合 親和力）之抗體。高密度不僅經由多價相互作用使噬菌體 穩定，而且有利於使已解離之噬菌體再結合。可利用長時 間洗滌及單價噬菌體呈現（如Bass等人，.如，8: 3〇9_ 314 (1990)及WO 92/09690中所述）以及抗原之低塗覆密度 (如 Marks等人，出i〇: 779_783 (1992)中所述）來 促進具有緩慢解離動力學（及良好結合親和力）之抗體的選 擇。 有可此在對Bv8具有不同親和力、甚至具有略微不同之 親和力的噬菌體抗體之間進行選擇。然而，所選抗體之隨 機：變(例如’如上文所述之一些親和力成熟技術中發生 之突變）可能產生許多突變體，其中大部分結合至抗原， 且少數具有較高親和力。使用限制性Bv8，可競爭得出極 '的円親和力噬菌體。為保留所有較高親和力突變體，可 將噬菌體與經結合生物素之過量Μ一起培育，但經結合 物素之Βν8的莫耳濃度低於Βν8之靶向莫耳親和力常 一著可由塗覆有抗生物素蛋白鏈菌素之順磁性珠粒捕 和力結合_體。此「平衡捕捉」使得可根據抗體 。親和力以一定敏感度來選擇抗體，該敏感度可使具 量高之親和力的突變體純系與具有較低親和力之大 過量噬菌體分離。亦可操控洗滌與固相結合之噬菌體中 用之條件以基於解離動力學加以區分。 152844.doc 201130971 可根據活性選擇Bv8純系。在一個實施例中，本發明提 供阻斷Bv8與其配位體（例如bV8受體PKR1及PKR2)之間結 合的Bv8抗體。對應於該等Bv8抗體之Fv純系可按以下步 驟選擇：（1)如上所述自噬菌體文庫中分離Bv8純系，及視 情況藉由在適合之細菌宿主中培養該群體來擴增噬菌體純 系之分離群體；（2)針對分別需要阻斷活性及非阻斷活性來 選擇Bv8及第二蛋白質；（3)使抗-Bv8噬菌體純系吸附至經 φ 固定之Bv8 ; (4)使用過量之第二蛋白質溶離任何識別與第 二蛋白質之結合決定子重疊或共有之BV8結合決定子的非 所要純系，及（5)>谷離步驟（4)完成後仍吸附之純系。視情 況，可藉由重複本文所述之選擇程序一或多次來進一步富 集具有所要阻斷/非阻斷特性之純系。 可容易地分離編碼本發明之源自融合瘤之單株抗體或嗟 菌體呈現Fv純系之DNA，且使用習知程序（例如藉由使用 經設計以由融合瘤或噬菌體DNA模板特異性擴增相關重鏈 鲁及輕鍵編碼區的养核苦酸引子）來定序。一旦分離，即可 將DNA置於表現載體中，接著將表現載體轉染至會 他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、 猿COS細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中， 以於重組宿主細胞中合成得到所要單株抗體。關於在細菌 中重組表現抗體編碼DNA之評論文章包括Skerra等人， Curr. Opinion in Immunol·，5: 256 (1993) JSl Pluckthun 130:151 (1992)。 可將編碼本發明Fv純系之DNA與編碼重鏈及/或輕縫怪 152844.doc •97- 201130971 定區之已知DNA序列（例如適當DNA序列可獲自Kabat等人 (同上））組合’以形成編碼全長或部分長度之重鏈及/或輕 鏈之純系。應瞭解，出於此目的可使用任何同型之怪定 區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且該等怪定 區可自任何人類或動物物種獲得。如本文所用之定義「敌 合」抗體及「雜交」抗體中包括自一種動物（諸如人類）物 種之可變域DNA得到Fv純系’接著使之融合至另一動物物 種之恆定區DNA以形成「雜交」全長重鏈及/或輕鏈之編 碼序列。在一個較佳實施例中，使來源於人類可變DNA2 F v純系融合至人類怪定區DNA以形成所有人類全長咬部分 長度之重鏈及/或輕鏈之編碼序列。 亦可例如藉由以人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列替代 源自融合瘤純系之同源鼠類序列來修飾編碼本發明之源自 融合瘤之抗-Bv8抗體的DNA(例如，如Morrison等人， Proc. TVa". dead 5W· 81:6851-6855 (1984)之方、去 中）。可藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或—部分編碼序 列與免疫球蛋白編碼序列共價連接來進一步修飾編碼源自 融合瘤或Fv純系之抗體或片段的DNA。以此方式，製備具 有本發明之源自F v純系或融合瘤純系之抗體之結合特異性 的「嵌合」抗體或「雜交」抗體。 抗體片段 本發明涵蓋抗體片段。抗體片段可藉由傳統手段（諸如 酶促消化）或藉由重組技術產生。在某些情形下，使用抗 體片段而非整個抗體存在優勢。較小尺寸之片段允許快速 152844.doc • 98- 201130971 清除’且可使得進入實體腫瘤之情況得到改良。關於某些 抗體片段之評述，參見Hudson等人（2003) Mei 9:129_ 134。 已開發出各種用於產生抗體片段之技術。傳統上，經由 完整抗體之蛋白水解消化來獲得此等片段（參見例如

Morimoto 專 k，Journal of Biochemical and Biophysical 24:107-117 (1992);及 Brennan 等人， φ 229:81 (198 5))。然而，現可由重組宿主細胞直接產生此等 片段。Fab、Fv及ScFv抗體片段皆可在大腸桿菌中表現且 自大腸桿菌分泌’由此可容易地產生大量此等片段。可自 上文所論述之抗體噬菌體文庫中分離抗體片段。或者，可 自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段且使其化學偶合以形成 F(ab )2 片 ί又（Carter 專人 ’ Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據另一方法’可自重組宿主細胞培養物直接分 離F(ab·)2片段。美國專利第5,869,046號中描述包含救助受 鲁 體結合抗原決定基殘基且活體内半衰期延長之Fab及 F(ab·)2片段。其他產生抗體片段之技術將為熟習此項技術 者顯而易知。在某些實施例中，抗體為單鏈Fv片段 (scFv)。參見WO 93/16185 ;美國專利第5,571 894號及第 5,587,458號。Fv及scFv為具有缺少恆定區之完整組合位點 的唯一物質；因此，其可適於在活體内使用期間減少非特 異性結合。可構桌scFv融合蛋白以使效應蛋白於scfv之胺 基端或幾·基端融合。參見3„仙〇办五叹⑻erz•叹， Borrebaeck編（同上）。抗體片段亦可為「線性抗體」，例 152844.doc -99- 201130971 如，如美國專利第5,641,870號中所述。該等線性抗體可為 單特異性或雙特異性抗體。 人類化抗艘 本發明涵蓋人類化抗體。此項技術中已知各種使非人類 抗體人類化之方法。舉例而言，人類化抗體可具有一或多 個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基 酸殘基常稱為「輸入」殘基，其通常係自「輸入」可變域 取得。可基本上遵循Winter及共同工作者之方法（Jones等 人（1986) iVa/wre 321:522-525 ; Riechmann 等人（1988) Nature 332:323-327 ; Verhoeyen 等人（1988) 239:1534-1536)，藉由用高變區序列取代人類抗體之相應 序列來進行人類化。因此，該等「人類化」抗體為嵌合抗 體（美國專利第4,816,567號），其中實質上不完整之人類可 變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實務上，人類 化抗體通常為一些高變區殘基及可能存在之一些FR殘基經 齧齒動物抗體中之類似位點之殘基取代的人類抗體。 欲用於製備人類化抗體之人類可變域（輕鏈與重鏈）之選 擇對於降低抗原性而言較重要。根據所謂的「最佳擬合」 方法’在已知人類可變域序列之完整文庫中篩選齧齒動物 抗體之可變域序列。接著將最接近齧齒動物序列之人類序 列視作人類化抗體之人類構架。參見例如S i m s等人（19 9 3) J. Immunol. 151:2296 ; Chothia 等人(1987) J. Mol Biol 196.901。另一方法使用來源於具有特定輕鍵或重鏈亞群 之所有人類抗體之共同序列的特定構架。相同構架可用於 152844.doc •100- 201130971 若干不同人類化抗體。參見例如Carter等人（1992)

心"· 5W· t/α，89:4285 ; Presta 等人（1993) J 151:2623 ° 另外，一般需要在保留對抗原之高親和力及其他有利生 物特性下使抗體人類化。為達成此目的，根據一種方法， 藉由使用親本序列及人類化序列之三維模型對親本序列及 各種概念性人類化產物進行分析的方法來製備人類化抗 體。三維免疫球蛋白模型通常可用且為熟習此項技術者所 熟悉。可使用說明及呈現所選候選免疫球蛋白序列之可能 三維構形結構的電腦程式。對此等呈現之檢驗允許分析殘 基在候選免疫球蛋白序列發揮功能之過程中可能起到的作 用’亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘 基。以此方式，可自接受序列及輸入序列中選擇FR殘基並 將其組合以便達成所要抗體特徵，諸如對標靶抗原之親和 力增加。一般而言，高變區殘基直接且最實質性地涉及於 影響抗原結合方面。 人類抗體 可藉由將自源自人類之噬菌體呈現文庫中選出之Fv純系 可變域序列與如上所述之已知人類恆定域序列組合來構築 本發明之人類抗體。或者，可由融合瘤方法製備本發明之 人類單株抗體。用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小 鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株已例如由K〇zb〇r j ㈣〇/， 133: 3001 (1984) ; Brodeur等人，μ咖c/績/ 心价〇办

Production Techniques and Applications > 第 51-63 頁 152844.doc • 101 - 201130971 (Marcel Dekker，Inc.，New York, 1987);及 Boerner 等人， </. /wwwwo/.，147: 86 (1991)描述。 現有可能產生轉殖基因動物（例如小鼠），其在免疫後即 能夠在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生人類抗體之整 個譜系。舉例而言，已描述在嵌合及生殖系突變小鼠中抗 體重鏈接+區（JH)基因之同種接合子缺失會完全抑制内源 抗體之產生。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至該 等生殖系突變小鼠中將在抗原激發後即產生人類抗體。參 見例如 Jakobovits等人，#如/·上μ 90: 2551 (1993) ; Jakobovits等人，362: 255 (1993);

Bruggermann等人，Year in Immunol., 7: 33 (1993) 〇 亦可使用基因改組以自非人類（例如齧齒動物）抗體得到 人類抗體’其中人類抗體具有類似於起始非人類抗體之親 和力及特異性。根據此方法，亦稱為r抗原決定基印 記」’由如本文所述之噬菌體呈現技術獲得之非人類抗體 片段之重鏈或輕鏈可變區經人類V域基因譜系置換，從而 形成非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體之群體。以抗原進 行選擇得以分離非人類鏈/人類鏈嵌合scFv*Fab，其中人 類鏈修復了移除初級嗤菌體呈現純系中之相應非人類鏈後 遭破壞之抗原結合位點，亦即抗原決定基主導（印記）人類 鍵搭配物之選擇。當重複該過程以置換其餘非人類鏈時， 獲付人類抗體（參見1993年4月1日公開之pcT WO 93/06213)。不同於藉由HVR移植對非人類抗體進行的傳統 人類化’此技術提供完全人類抗體，其不具有源於非人類 152844.doc -102- 201130971 之FR或HVR殘基。 多特異性抗趙 本發明之多特異性抗體之-個實例包括結合至副及另 一抗原之抗體。在其他實施例中，多特異性抗體可結合至 Bv8之兩個不同抗原m。多特異性抗體亦可用於將細 胞毒性劑定位於表現Bv8之細胞。此等抗體具有結合 之臂及結合細胞毒性劑之f，該細胞毒性劑為諸如沙泊寧 籲（saporin)、抗干擾素_α、長春花生物驗、萬麻毒素a鍵、 甲胺嗓吟或放射性同位素半抗原。可將多特異性抗體製備 成全長抗體或抗體片段（例如p(ab，）2雙特異性抗體）。 此項技術中已描述各種製備雙特異性抗體之方法。首批 方法之一涉及兩個免疫球蛋白重鏈_輕鏈對之共同表現， 其中兩個重鏈具有不同特異性（MUstein& CueU〇,勤 305: 537 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分 配，故此等融合瘤（四體雜交瘤（quadr〇ma))產生1〇種不同 φ 抗體分子之潛在混合物，其中僅一者具有正確的雙特異性 結構。通常藉由親和層析步驟進行的對正確分子之純化相 當繁瑣，且產物產率較低。類似程序揭示於丨993年5月i 3 日公開之W0 93/08829 中及 Traunecker等人，«/. 1〇. 3655 (1991)中。 根據一種不同方法，使抗體可變域融合至免疫球蛋白恆 定域序列。該融合為例如與免疫球蛋白重鏈恆定域（包含 鉸鏈區、CH2區及CH3區之至少一部分）之融合。在某些實 施例中’第一重鏈恆定區（CH1)存在於至少一個融合體 152844.doc -103- 201130971 中。將編碼&疫球蛋白重鏈融合體及（必要時）免疫球蛋白 輕鏈之DNA插人獨立表現載體中，且將其共同轉染至適合 之宿主生物體中。此為調整實施例中三個多肽片段之相互 比例提供較大靈活性，料構築過程中利之不等比率之 三個多肽鏈將提供最佳產率。然而’有可能將兩個或全部 二個多肽鏈之編碼序列***一個表現載體中，屆時相等比 率之至少兩個多肽鏈之表現會得到高產率或屆時比率並不 特別重要。 在此方法之一個實施例中，雙特異性抗體由一臂中之具 有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜 交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（提供第二結合特異性）構成。據 發現，此不對稱結構有助於將所要雙特異性化合物與不合 需要之免疫球蛋白鏈組合分離，此係由於免疫球蛋白輕鏈 僅存在於一半雙特異性分子中提供簡便之分離方式。此方 法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之更多 細節，參見例如Suresh等人’仏仏0心心2少則/〇狀 121:210 (1986)。 根據另一方法’「杵入白（knob-into-hole)」或「ΚηΗ」 技術係指在活體外或活體内藉由在兩個多肽相互作用之界 面處將隆凸（杵）引入一個多肽中且將凹穴（臼）引入另一多 肽中而引導該兩個多肽配對在一起的技術。舉例而言，已 在抗體之Fc:Fc結合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面中引 入 KnH(例如 US20007/0178552、W0 96/027011、W0 98/050431 及 Zhu 等人（1997) Protein Science 6:781-788)。 J52844.doc • J04- 201130971 此尤其適用於在製造多特異性抗體期間驅使兩個不同重鏈 配對在一起。舉例而言，氏區中具有KnH之多特異性抗體 可進一步包含連接至各Fc區之單一可變域，或進一步包含 與類似或不同輕鏈可變域配對之不同重鏈可變域。根據一 個實施例，將一或多個來自第一抗體分子界面之小胺基酸 側鏈用較大側鏈（例如酪胺酸或色胺酸）置換。藉由將大胺 基酸側鏈用較小胺基酸側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）置換而 φ 於第二抗體分子界面上形成尺寸與大側鏈相同或類似之補 〈員凹八」。此&供使異源二聚體之產率增加超過其他不 合需要之最終產物（諸如同源二聚體）的機制。 多特異性抗體包括交聯抗體或「異源結合」抗體。舉例 而a，異源結合物中之抗體之一者可與抗生物素蛋白偶 合，另一者與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使 免疫系統細胞靶向不合需要之細胞（美國專利第4,676,98〇

號）且用於治療 HIV感染（WO 91/00360、WO 92/00373 及 EP φ 〇3〇89)。可使用任何適宜之交聯方法製備異源結合抗體》 已知適合之交聯劑及技術（例如美國專利第4,676,98〇號）。 自抗體片段產生多特異性抗體之技術亦已描述於文獻 中。舉例而言，可使用化學鍵聯來製備雙特異性抗體。 Brennan 等人，Science，229: 81 (1985)描述如下程序：使 完整抗體經蛋白水解***以產生F(ab。2片段。在二硫醇錯 合劑亞砷酸鈉存在下還原此等片段以穩定鄰近二硫醇且防 止形成分子間雙硫鍵。接著使所產生之Fab,片段轉化為硫 代硝基苯曱酸醋（TNB)衍生物。接著藉由用酼基乙胺還原 152844.doc •105· 201130971 使Fab'-TNB衍生物之一再轉化為Fab，-硫醇，且將其與等莫 耳量之另一 Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所 產生之雙特異性抗體可用作選擇性地固定酶之試劑。 可自大腸桿菌回收Fab'-SH片段且可使其化學偶合以形 成雙特異性抗體。Shalaby等人，乂五xp· 175: 217- 225 (1992)描述完全人類化雙特異性抗體F(ab，）2*子的產 生。自大腸桿菌中獨立地分泌各Fab'片段且對其進行活體 外定向化學偶合以形成雙特異性抗體。由此形成之雙特異 性抗體能夠結合至過度表現HER2受體之細胞及正常人類τ 細胞’且觸發人類細胞毒性淋巴細胞對人類***腫瘤標靶 之溶解活性。 亦已描述各種自重組細胞培養物直接製備並分離雙特異 性抗體片段之技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙 特異性抗體。Kostelny 等人，乂 /所148(5): 1547-1553 (1992)。藉由基因融合使來自Fos及Jun蛋白質之白胺 酸拉鏈肽連接至兩種不同抗體之Fab'部分。在鉸鏈區還原 抗體同源二聚體以形成單體，接著使其再氧化形成抗體異 源二聚體。此方法亦可用於產生抗體同源二聚體。 Hollingerf Λ > Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)所述之「微型雙功能抗體」技術已提供製備雙特異 性抗體片段之替代性機制。該等片段包含經連接子連接至 輕鏈可變域（VL)之重鏈可變域（VH)，該連接子過短而使同 一鏈上之兩個域之間無法配對。因此，迫使一個片段之 VH及VL·域與另一片段之互補VL·及VH域配對，從而形成 152844.doc •106· 201130971 兩個抗原結合位點。亦已報導利用單鏈Fv(sFv)二聚體製備 雙特異性抗體片段之另一策略。參見Gruber等人，《/. Immunol, 152:5368 (1994) 〇 涵蓋具有兩價以上價數之抗體。舉例而言，可製備三特 異性抗體。Tutt等人，乂 /mmw«o/· 147: 60 (1991)。 多價抗體 與二價抗體相比，多價抗體可由表現抗體所結合之抗原 φ 的細胞較快地内化（及/或異化）。本發明之抗體可為具有三 個或三個以上抗原結合位點之多價抗體（IgM類別之抗體除 外）（例如四價抗體），該等多價抗體可藉由重組表現編碼抗 體多肽鏈之核酸而容易地產生。多價抗體可包含二聚域及 三個或三個以上抗原結合位點。在某些實施例中，二聚域 包含Fc區或鉸鏈區（或由其組成）。在此情形下，抗體將包 含Fc區及三個或三個以上處於Fc區之胺基端之抗原結合位 點。在某些實施例中，多價抗體包含三個至約八個抗原結 • 合位點（或由其組成）。在一個此類實施例中，多價抗體包 含四個抗原結合位點（或由其組成）。多價抗體包含至少一 個多肽鏈（例如兩個多肽鏈），其中該（該等）多肽鏈包含兩 個或兩個以上可變域。舉例而言，多肽鏈可包含VD1- (Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，VD2為第 二可變域，Fc為Fc區之一個多肽鏈，χ1及χ2表示胺基酸 或多肽，且η為0或1。舉例而言，多肽鏈可包含：VH_ CH1-可撓性連接子_VH_CH1_Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CHl-Fc區鏈。本文中之多價抗體可進一步包含至少兩個 152844.doc •107- 201130971 (例如四個）輕鏈可變域多肽。本文中之多價抗體可例如包 含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。此處所涵蓋之輕鏈可 變域多肽包含輕鏈可變域且視情況進一步包含(：1域。 單域抗鏜 在某些實施例中，本發明之抗_Βν8抗體為單域抗體。單 域抗體為包含抗體之全部或一部分重鏈可變域或者全部或 一部分輕鏈可變域之單一多肽鏈。在某些實施例中，單域 抗體為人類單域抗體（Domantis，Inc，Waltham，MA;參見 例如美國專利第6,248,5 1 6 B 1號）。在一個實施例中，單域 抗體由抗體之全部或一部分重鏈可變域組成。 抗體變異體 在一些實施例中’涵蓋本文所述之抗-Bv8抗體之胺基酸 序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及 /或其他生物特性。可藉由將適當變化引入編碼抗體之核 皆酸序列中或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異 體。該等修飾包括例如抗體之胺基酸序列内之殘基的缺失 及/或***及/或取代。可進行缺失、***及取代之任何組 合以獲得最終構築體’其限制條件為該最終構築體具有所 要特徵。可在產生序列的同時將胺基酸變化引入主體抗體 胺基酸序列中》 一種適用於鑑別作為較佳突變誘發位置之某些抗體殘基 或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如

Cunningham 及 Wells (1989) 244:1081-1085所述。 此處’鑑別殘基或標靶殘基群（例如帶電殘基，諸如arg、 152844.doc •⑽· 201130971 asp、his、lys及glu)，且將其用中性或帶負電胺基酸（例如 丙胺酸或聚丙胺酸）置換以影響胺基酸與抗原之相互作 用。接著，藉由在取代位點處或針對取代位點引入另外或 其他的變異體來改進彼等對取代展示出功能敏感性之胺基 酸位置。因此，雖然引入胺基酸序列變異之位點為預定 的，但突變本身之性質無須預定。舉例而言，為分析特定 位點處突變之效能，在標靶密碼子或區域處進行ala掃描或 φ 隨機突變誘發且篩選具有所要活性之經表現免疫球蛋白。 胺基酸序列***包括長度在一個殘基至含有一百個或一 百個以上殘基之多肽之範圍内的胺基端及/或羧基端融 合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列内***。末端*** 之貫例包括具有N端甲硫胺酿基殘基之抗體。抗體分子之 其他***變異體包括抗體之N端或C端與酶（例如用於 ADEPT)或延長抗體血清半衰期之多肽的融合。 在某些實施例中’改變本發明之抗體以增加或減小抗體 • 糖基化之程度。多肽之糖基化通常為N連接或〇連接β N連 接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽 序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺蘇胺酸（其中χ為除 脯胺酸以外之任何胺基酸）為使碳水化合物部分與天冬酿 胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，此等三肽序列中之任 一者存在於多肽中會形成潛在糖基化位點。〇連接糖基化 係指Ν-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖之一與經基胺基酸 (最常為絲胺酸或蘇胺酸）連接，但亦可使用5_羥基脯胺酸 或5 -經基離胺酸。 152844.doc -109- 201130971 宜藉由改變胺基酸序列以使得形成或移除一或多個上述 三肽序列（針對N連接糖基化位點）來實現抗體之糖基化位 點的添加或缺失。亦可藉由對原始抗體之序列進行一或多 個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加、缺失或取代（針對〇連接糖 基化位點）來產生變化。 在抗體包含Fc區之情況下，可改變連接於其上之碳水化 合物。哺乳動物細胞所產生之原生抗體通常包含一般經N 鍵聯與Fc區之CH2域之Asn297連接的分支雙觸寡醣。參見 例如Wright等人（1997) 77万15:26-32。寡醣可包括各 種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)、 半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中 之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體 中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異 體。

舉例而言，提供具有碳水化合物結構之抗體變異體，該 碳水化合物結構缺乏（直接或間接）連接至Fc區之岩藻糖。 該等變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利 公開案第 US 2003/0157108 號（Presta， L_) ; US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co·，Ltd)。關於「去岩 藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」之抗體變異體之公開案的實 例包括：US 2003/0157108 ; WO 2000/61739 ; WO

2001/29246 ； US 2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ; US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ； WO 152844.doc -110- 201130971 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； W02005/053742 ； W02002/031140 ； Okazaki# A » J. Mol. 5/〇厂 336:1239-1249 (2004) ; Yamane-Ohnuki 等人， 价oiec/2. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻糖基化 抗體之細胞株之實例包括蛋白質岩藻糖基化缺乏之Lee 13 CHO 細胞（Ripka 等人，」，<:/7.5/〇〇/76所.5/〇尸/2>^.249:533-545 (1986);美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號， Presta, L ;及 WO 2004/056312 Al，Adams等人，尤其實例 11)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因 易'J除CHO細胞（參見例如Yamane-Ohnuki等人， 价oiec/z_ 叹.87: 614 (2004) ; Kanda，Y.等人，5，.〇化〇/7«〇/· 94(4):680-688 (2006);及WO 2003/085107)。 進一步提供具有平分型寡醣之抗體變異體，例如，其中 連接至抗體Fc區之雙觸寡醣係由GlcNAc平分。該等抗體 變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。 該等抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011 878(Jean-Mairet等人）、美國專利第6,602,684號（Umana等人）及US 2005/0123546(Umana等人）中。亦提供在連接至Fc區之寡 醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。該等抗體變 異體可具有改良之CDC功能》該等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087(Patel 等人）、WO 1998/58964(Raju，S.)及 WO 1999/22764(Raju，S.)中。 在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個進一步 改良ADCC之胺基酸取代的Fc區，該一或多個胺基酸取代 152844.doc 201130971 為例如在Fc區之位置298、333及/或334(殘基之Eu編號）處 之取代。該等取代可與上述任何變化組合出現。 在某些實施例中’本發明涵蓋具有一些而非全部效應功 能之抗體變異體，該等效應功能使該抗體成為許多應用所 需要之候選物，在該等應用中，活體内抗體半衰期較重 要，而某些效應功能（諸如補體及ADCC)為多餘或有害 的。在某些實施例中，量測抗體之Fc活性以確保僅維持所 要特性。可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以證實 CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行Fc受 體（FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcYR結合能力（由此可能 缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。介導ADCC之初 級細胞（NK細胞）僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、 FcyRII及FcyRIII。造血細胞上FcR之表現概述於Ravetch及 Kinet，9:457-92 (1991)之第 464頁的表 3中。用以評估相關分子之ADCC活性之活體外檢定的非限 制性實例描述於美國專利第5,500,362號（參見例如 Hellstrom, I.等人，Proc. dead Scz·. USA 83:7059- 7063 (1986))及 Hellstrom，I 等人 ’ /V〇c. #加7 82:1499-1502 (1985);美國專利第 5,821，337 號（參見 Bruggemann，M.等人，*/· £χρ· Med 166:1351-1361 (1987)) 中。或者，可採用非放射性檢定法（參見例如流式細胞測 量術之ACTI™非放射性細胞毒性檢定（CeUTechn〇1〇gy，Inc

Mountain View，CA);及CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢 定（Promega，Madison，WI))。適用於該等檢定之效應細胞 152844.doc -112- 201130971 包括周邊血液單核細胞（PBMC)及天然殺傷（NK)細胞。或 者或另外，可在活體内，例如在動物模型（諸如Clynes等 人，Proc. &/· tASd 95:652-656 (1998)中所揭示

之動物模型）中評估相關分子之ADCC活性。亦可進行Cl q 結合檢定以證實抗體不能結合C 1 q且因此缺乏CDC活性。 為評估補體活化，可進行CDC檢定（參見例如Gazzano-Santoro^· A J J. Immunol. Methods 202:163 (1996) ； Cragg, M_S.等人，5/如6? 101:1045-1052 (2003);及Cragg，M.S.及 M.J. Glennie，別οοοί 103:273 8-2743 (2004))。亦可使用此項 技術中已知之方法（參見例如Petkova, S.B.等人，/«〆/. Immunol. 1 8( 12): 1 759-1769 (2006))測定 FcRn結合及活體内 清除率/半衰期。 提供具有一或多個胺基酸取代之其他抗體變異體。取代 性突變誘發之相關位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。保 守性取代展示於表1中「較佳取代」之題頭下。更多實質 性變化（稱為「例示性取代」）提供於表1中，或如下文關於 胺基酸類別進一步所述。可將胺基酸取代引入相關抗體 中，且例如篩選具有諸如改良之抗原結合性、減少之免疫 原性、改良之ADCC或CDC等所要活性的產物。 表1 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala(A) Val、Leu、lie Val Arg(R) Lys、Gin、Asn Lys Asn(N) Gin、His、Asp、Lys、Arg Gin Asp(D) Glu、Asn Glu Cys(C) Ser、Ala Ser Gln(Q) Asn、Glu Asn 152844.doc -113 - 201130971

Glu(E) Asp、Gin Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn、Gin、Lys、Arg Arg Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe、正白胺酸 Leu Leu(L) 正白胺酸、lie、Val、Met、Ala、Phe lie Lys(K) Arg、Gin、Asn Arg Met(M) Leu、Phe、lie Leu Phe(F) Tip、Leu、Val、lie、Ala、Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val ' Ser Ser Trp(W) Tyr ' Phe Tyr Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe Val(V) lie、Leu、Met、Phe、Ala、正白胺酸 Leu 抗體生物特性之改變可藉由選擇影響以下之取代來實 現：（a)在取代區域中之多肽骨架之結構，例如呈摺疊或螺 旋構形；（b)標靶位點處分子之電荷或疏水性；或（c)側鏈 大小。可根據側鏈特性之相似性對胺基酸進行分組（在A. L. Lehninger，Biochemistry，第 2版，第 73-75 頁，Worth Publishers, New York (1975)中）： (1) 非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、 Phe(F)、Trp(W)、Met(M); (2) 不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、 Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q); (3) 酸性：Asp(D)、Glu(E); (4) 鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。 或者，可基於常見側鏈特性對天然存在之殘基進行分 組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; 152844.doc -114- 201130971 (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 鹼性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈定位之殘基：Gly、pr〇 ; (6) 芳族：Trp、Tyr、phe。 非保寸性取代需要將此等類別之一的成員與另一類別交 換。亦可將該等經取代之殘基引入保守性取代位點中或引 入其餘（非保守）位點中。 一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體（例如人類化 抗體或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般而言，選 擇用於進一步開發之所得變異體相對於產生該等變異體之 親本抗體具有改變（例如改良）之生物特性。例示性取代變 異體為親和力成熟抗體，其宜使用基於嗟菌體呈現之親和 力成熟技術來產生。簡言之，使數個高變區位點（例如6_7 個位點）犬變以在各位點處產生所有可能之胺基酸取代。 由此產生之抗體係作為與封裝於各粒子内部之嗟菌體勒，蛋 白（例如Μ13之基因III產物）之至少一部分融合之融合體而 由絲狀嗤菌體粒子呈現。隨後師選具有生物活性（例如名士 合親和力）之經噬菌體呈現之變異體。為鑑別供修飾之候 選高變區位點，可進行掃描突變誘發（例如丙胺酸掃描）以 鑑別顯著促進抗原結合之高變區殘基。或者或另外，其可 有益於分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗 原之間的接觸點。該等接觸殘基及鄰近殘基為根據此項技 術中已知之技術（包括本文洋述之技術）進行取代之候選 物。一旦產生該等變異體，即使用此項技術中已知之技術 152844.doc -115- 201130971 (包括本文所述之技術）對變異體組進行篩選，且可在一或多 個相關檢定中選擇具有優良特性之變異體用於進一步開發。 編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子係由此項技術 中已知之多種方法來製備。此等方法包括（但不限於）自天 然來源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下）或 藉由對早先製備之抗體變異體或非變異體型式進行寡核苦 酸介導（或定點）突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發 來製備。 可能需要將一或多個胺基酸修飾引入本發明抗體之Fc 區，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個 胺基酸位置（包括鉸鏈半胱胺酸位置）處包含胺基酸修飾（例 如取代）之人類Fc區序列（例如人類IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4 Fc 區）。 根據本發明及此項技術之教示，預期在一些實施例中， 本發明之抗體與野生型對應抗體相比可包含一或多個變 化’例如Fc區中之一或多個變化。儘管如此，此等抗體仍 將保留與其野生型對應物相比實質上相同之治療效用所需 特徵。舉例而言’據信，可在Fc區中產生引起c 1 q結合及/ 或補體依賴性細胞毒性（CDC)改變（亦即改良或削弱）的某 些變化’例如，如WO 99/51642中所述。關於pc區變異體之 其他實例，亦參見 Duncan及Winter，iVaiwre 322:738-40 (1988); 美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。WO00/42072(PreSta)及WO 2004/056312 (Lowman) 描述與FcR之結合改良或削弱之抗體變異體。亦參見 152844.doc •116· 201130971

Shields 等人 J. 5ζ·ο/· C/iew. 9(2): 6591-6604 (2001)。 US2005/001493 4A1 (Hinton等人）中描述半衰期延長及與新 生兒Fc受體（FcRn)之結合改良的抗體，該FcRn負責將母體 IgG 轉移至胎兒（Guyer等人，·/. 117:587 (1976)及

Kim等人24:249 (1994))。此等抗體包含具有 一或多個改良Fc區與FcRn結合之取代的FcS » Fc區胺基酸 序列改變及C 1 q結合能力增大或減少之多肽變異體描述於 美國專利第6,194,551B1號、W099/51642中。亦參見 Idusogie等人，J. Immunol. 1 64: 41 78-41 84 (2000) ° 在另一態樣中，本發明提供在包含Fc區之Fc多肽之界面 中包含修飾的抗體’其中該等修飾有助於及/或促進異源 一聚化。此等修飾包含將隆凸引入第一Fc多肽中且將凹穴 引入第二Fc多肽中’其中該隆凸可定位於該凹穴中以促進 第一 Fc多肽與第二Fc多肽之複合。產生具有此等修飾之抗 體的方法在此項技術中為已知的，例如，如美國專利第 5,731，168號中所述。 在另一態樣中，可能需要形成經半胱胺酸工程改造之抗 體，例如「thioMAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺 酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基在抗體之可 達位點處出現。藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫 氫基藉此定位於抗體之可達位點處且可用於使抗體結合至 其他部分（諸如藥物部分或連接子-藥物部分），如本文進一 步所述。在某些實施例中’任意一或多個以下殘基可經半 胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號）；重鏈之A118(EU編 152844.doc 201130971 號）；及重鏈Fc區之S400(EU編號）。 抗體衍生物 可進一步修飾本發明之抗-Bv8抗體以使之含有此項技術 中已知且可容易獲得之其他非蛋白類部分。適於使抗體衍 生之部分較佳為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性 實例包括（但不限於）聚乙二醇（PEG)、乙二醇/丙二醇之共 聚物、羧曱基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯 啶酮、聚-1，3-二氧戊環、聚噁烷、乙烯/順丁烯二 酸針共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）及聚葡萄糖籲 或聚（N-乙烯吡咯啶酮）聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧 化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇（例如甘油）、 聚乙稀醇及其混合物。聚乙二醇丙酸因其於水中之穩定性 而可在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且 可為分支或未分支聚合物。連接至抗體之聚合物之數目可 變化，且若連接一個以上聚合斗勿，則該等聚合物可為相同 或不同分子。—般而言，用於衍生之聚合物之數目及/或 類型可基於包括（但不限於）以下之考慮因素來確定：待改_ 良之抗體特定特性或功能、抗體衍生物是否在規定條件下 用於療法中，等。 在另一實施例中，提供可藉由曝露於放射線而選擇性地 加熱之抗體與非蛋白類部分之結合物。在一個實施例中， 非蛋白類部分為碳奈米管（Kam等人户狀細厂 如㈣102: 1160(M1605 (2〇〇5))。放射線可具有任何波 長，且包括（但不限於）不傷害正常細胞，但將非蛋白類部 152844.doc •118· 201130971 分加熱至杀史死最接近抗體·非}白類部分之細月包之溫度下 的波長。 活性檢定 可藉由此項技術中已知之各種檢定來表徵本發明抗體之 物理/化學特性及生物功能。 在一個嘘樣中，提供鏗別具有生物活性之抗·Bv8抗體的 才双疋。生物活性可包括例如調節Bv8相關作用之一或多個 φ 態樣，包括（但不限於）Bv8結合、Bv8介導之内皮細胞增 殖、腫瘤轉移。 在本發明之某些貫施例中，分析本文中所產生之免疫球 蛋白的生物活性。在一些實施例中’測試本發明免疫球蛋 白之抗原結合活性。此項技術中已知且可用於本文中之抗 原結合檢定包括（但不限於）使用諸如西方墨點法之技術進 行之任何直接或競爭性結合檢定、放射免疫檢定、 ELISA(酶聯免疫吸附檢定）、「夾層」免疫檢定、免疫沈澱 φ 檢定、螢光免疫檢定及蛋白質A免疫檢定。下文之實例部 分中提供說明性抗原結合檢定。 可由一系列檢定進一步表徵經純化之抗體，該等檢定包 括（但不限於）N端定序、胺基酸分析、非變性尺寸排除高 壓液相層析（HPLC)、質譜法、離子交換層析及木瓜蛋白酶 消化。 在一些實施例中’本發明涵蓋具有一些而非全部效應功 能之經改變抗體’該等效應功能使該抗體成為許多應用所 需要之候遠物，在該等應用中’活體内抗體半衰期較重 152844.doc -119- 201130971 要，而某些效應功能（諸如補體及ADCC)為多餘或有害 的。在某些實施例中，量測所產生之免疫球蛋白之F c活性 以確保僅維持所要特性。可進行活體外及/或活體内細胞 毒性檢定以證實CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而 言，可進行Fc受體（FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcYR結 合能力（由此可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能 力。介導ADCC之初級細胞（NK細胞）僅表現FcyRIII，而單 核細胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。造jk細胞上FcR之表 現概述於Ravetch 及 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)之第464頁的表3中。用以評估相關分子之ADCC活 性之活體外檢定的一個實例描述於美國專利第5,500,362號 或第5,821，337號中。適用於該等檢定之效應細胞包括周邊 血液單核細胞（PBMC)及天然殺傷（NK)細胞。或者或另 外，可在活體内，例如在動物模型（諸如Clynes等人， PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型）中評 估相關分子之ADCC活性。亦可進行Clq結合檢定以證實 抗體不能結合C 1 q且因此缺乏CDC活性。為評估補體活 化，可進行CDC檢定，例如，如Gazzano-Santoro等人，《/. /mmwno厂202:1 63 (1996)中戶斤述。亦可使用此項技 術中已知之方法測定FcRn結合及活體内清除率/半衰期。 在一些實施例中，本發明提供效應功能增強及/或半衰 期延長之經改變抗體。參見例如美國申請案第12/577,967 號。 載體、宿主細胞及重組方法 152844.doc .120- 201130971 為重組產生本發明之抗體’分離編碼該抗體之核酸且將 其***可複製之載體中以供進一步選殖（DNA擴增）或供表 現。可容易地分離編碼抗體之DNA，且使用習知程序（例 如=由使用能約特異性結合至編碼抗體重鍵及輕鍵之基因 的寡核苷酸探針）來定序。可利用許多載體。載體之選擇 部分取決於待使用之宿主細胞。一般而言，較佳宿主細胞 源於原核生物或真核生物（一般為哺乳動物）。應瞭解，出 籲於此目的可使用任何同型之恆定區，包括邮 ' 咖、

IgA、IgD及IgE恆定區，且該等恆定區可自任何人類或動 物物種獲得。 a.使用原核宿主細胞產生抗體： i-構築載體 可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組分的 聚核苷fee序列。可自抗體產生細胞（諸如融合瘤細胞）中分 離所要聚核苷酸序列並進行定序。或者，可使用核苷酸合 % 成器或pcR技術合成聚核苷酸。一旦獲得編碼多肽之序 列，即將其***能夠在原核宿主中複製並表現異源聚核苷 酸之重組載體中。對於本發明而言，可使用此項技術中可 用且已知之許多載體。適當載體之選擇將主要取決於*** 載體中之核酸的大小及經載體轉化之特定宿主細胞。各載 體含有多種組分，視其功能（異源聚核苷酸之擴增或表 現，或兩者）及其與其所位於之特定宿主細胞之相容性而 定。載體組分一般包括（但不限於）：複製起點、選擇標記 基因、啟動子、核糖體結合位點（RBS)、信號序列、異源 152844.doc •121- 201130971 核酸***物及轉錄終止序列。 一般而言，含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子 及控制序列的質體載體與此等宿主一起使用。載體通常帶 有複製位點以及能夠於經轉化細胞中提供表型選擇之標纪 序列。舉例而言，通常使用PBR322(—種來源於大腸桿菌 菌種之質體）轉化大腸桿菌。PBR322含有編碼安比西林 (ampicillin，Amp)及四環素（tetracycline，Tet)抗性之美 因，且因此提供鑑別經轉化細胞之簡易手段。pBR322、 其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾以 含有可由微生物使用以供表現内源蛋白質之啟動子。用於 表現特定抗體之PBR322衍生物之實例詳細描述於等 人之美國專利第5,648,237號中。 另外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬 菌體載體可作為轉化載體與此等宿主一起使用。舉例而 言，可利用諸如λΟΕΜ.ΤΜ.-11之噬菌體來製備可用於轉化 諸如大腸桿菌LE392之易感宿主細胞的重組載體。 本發明之表現載體可包含兩種或兩種以上编石民女夕 上蜗碼各多肽組 分之啟動子-順反子對。啟動子為位於調節其 4兄〈順反 子上游（5，）之未經轉譯調控序列。原核啟動子通常分為 類，亦即誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其對=養2 件改變（例如營養素存在與否或溫度改變）起反應而^制 引發順反子以較高量轉錄之啟動子。

由多種潛在宿主細胞識別之許多啟動子已為熟知的。可 經由限制性酶消化自來源DNA中移除所選啟動子且將所L 152844.doc -122- 201130971 離之啟動子序列***本發明之載體中，從而使該啟動子可 操作地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。可使用原生 啟動子序列與許多異源啟動子引導標靶基因之擴增及/或 表現。在一些實施例中’因異源啟動子與原生標靶多肽啟 動子相比一般可使經表現之標靶基因達成較大轉錄及較高 產率，故利用異源啟動子。 適合與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、β· 半乳聚糖_及乳糖啟動子系統、色胺酸（trp)啟動子系統及 雜父啟動子（諸如tac或trc啟動子）。然而，在細菌中發揮功 能之其他啟動子（諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子）亦 適用。該等啟動子之核苷酸序列已公開，藉此使得熟習此 項技術者能夠使用連接子或接附子將啟動子可操作地接合 至編碼標靶輕鏈及重鏈之順反子（Siebenlist等人（198〇) Cell 20: 269) ’從而提供任何所需限制性位點。 在本發明之一個態樣中，重組載體内之各順反子皆包含 φ 引導經表現之多肽跨膜移位之分泌信號序列組分。一般而 吕，信號序列可為載體之組分，或其可為***載體中之標 靶多肽DNA之一部分。對於本發明而言，所選信號序列應 為可由宿主細胞識別並加工（亦即由信號肽酶裂解）之信號 序列。對於不t識別並加工異源多狀之原生信冑序列的原 核宿主細胞’信號序列經選自由以下組成之群的原核信號 序列取代：例如鹼性磷酸酶、青黴素酶（penicimnase)、 ipp或熱穩定性腸毒素ii(stii)前導序列、LamB、ph〇E、 ⑽、OmpA及MBP。在本發明之—個實施例中，表現系 152844.doc •123· 201130971 統之兩種順反子中所用之信號序列為STII信號序列或其變 異體。 在另一態樣中’本發明之免疫球蛋白可於宿主細胞之細 胞質中產生’且因此各順反子内無需皆存在分泌信號序 列。就此而言’免疫球蛋白輕鏈及重鏈於細胞質内表現、 摺疊並組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（例如 大腸桿菌trxB菌株）提供有利於雙硫鍵形成之細胞質條件， 從而允許適當摺疊及組裝經表現之蛋白質次單元。pr〇ba 及Pluckthun Gene，159:203 (1995)。 適於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括古細菌 (Archaebacteria)及真細菌（Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性 (Gram-negative)或革蘭氏陽性（Gram-positive)生物體。適 用細菌之貫例包括埃希氏桿菌（Escherichia)(例如大腸桿 菌）、芽孢桿菌（例如枯草芽孢桿菌（B· subtilis))、腸道細 菌、假早胞菌菌種（例如綠腹假单胞菌（ρ· aerUgin〇sa))、鼠 傷寒沙門氏桿菌（Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌 (Serratia marcescans)、克雷伯氏菌（Klebsiella)、變形桿菌 (Proteus)、志负桿菌（shigella)、根瘤菌（Rhizobia)、透明 顫菌（Vitreoscilla)或副球菌（Paracoccus)。在一個實施例 中’使用革蘭氏陰性細胞。在一個實施例中，本發明使用 大腸桿菌細胞作為宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株 W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第 2卷 (Washington, D.C.： American Society for Microbiology, 1987) ’第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生 152844.doc -124· 201130971 物，包括菌株33D3，其具有基因型W311〇 ptr3 lac Iq lacL8 ΔοηιρΤΔ(ηπιροί·βρΕ) degP41 kanR(美國專 利苐5,639,635號）。其他鹵株及其衍生物亦適用，諸如大 腸桿菌294(ATCC 31，446)、大腸桿菌b、大腸桿菌入 1776(ATCC 3 1,537)及大腸桿菌 RV3〇8(ATCC 31,608)。此 等貫例為說明性而非限制性的。構築具有規定基因型之上 述任何細菌之衍生物的方法在此項技術中為已知的，且描 φ 述於例如 Bass等人，Proteins，8:309-314 (1990)中。一般必 需考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當細菌。 舉例而5，當使用諸如pBR322、pBR325、pACYCl 77或 pKN410之熟知質體提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌 (Seiratia)或沙門氏菌菌種可適用作宿主。宿主細胞通常應 分泌最少量之蛋白水解酶，且理想地可將其他蛋白酶抑制 劑併入細胞培養物中。 U.產生抗體 • 用上述表現載體轉化宿主細胞，且將其於經改質以適於 誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要序列之基因的習 知營養培養基中培養。 轉化意明將DNA引入原核宿主中以使DNA可作為染色體 外το件或由染色體之組成部分進行複製。視所用宿主細胞 而疋，使用適於該等細胞之標準技術進行轉化。採用氣化 鈣進行鈣處理一般用於含有實質性細胞壁障壁之細菌細 胞。另一轉化方法採用聚乙二醇/DMSO。另一所用技術為 電穿孔。 152844.doc -125- 201130971 使用於產生本發明多肽之原核細胞於此項技術中已知且 適於培養所選宿主細胞之培養基中生長。適合培養基之實 例包括路尼亞培養液（Iuria broth，LB)加上必需之營養補 充物。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構 築而選擇之選擇劑’以選擇性地允許含有該表現載體之原 核細胞生長《舉例而言，將安比西林添加至培養基中以供 表現安比西林抗性基因之細胞生長。 除石反、氮及無機磷酸鹽來源以外亦可包括任何必需補充 物’其單獨或以與另—種補充物或培養基（諸如複合氮源） 之混合物形式以適當濃度引入。視情況，培養基可含有一 或多種選自由以下組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺 酸、胱胺、髄基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇。 在適合溫度下培養原核宿主細胞。對於大腸桿菌生長， 舉例而言’較佳溫度在約抓至⑽^更佳約抑至約 37°C之範圍内’甚至更佳為約3〇t。培養基之阳值可為約 5至約9之範圍内的任何pH值，主要視宿主生物體而定。對 於大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7 4，且更佳為約7〇。 若本發明之表現載體中使用誘導型啟動？，則在適於活 化該啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態 樣中，PhoA啟動子用於控制多肽轉錄。因此，將經轉化之 宿主細胞於填酸鹽限制性培養基中培養以進行誘導。填酸 鹽限制性培養基較佳為C.r.A.P培養基（參見例如， Simmons 等人，J· Immun〇1. Meth〇ds (2〇〇2)，263 i33- 147)。如此項技術中所知，可根據所用載體構築體使用多 152844.doc -126- 201130971 種其他誘導劑。

在-個實施例中’使經表現之本發明多肽分泌至宿主細 胞之周質令並自其回收。蛋白質回收通常包含一般藉由諸 如滲透壓衝擊、超音波處理或溶解之手段使微生物；裂。 -旦細胞碎裂，即可藉由離^過渡來移除細胞碎片或整 個細胞。可例如藉由親和樹脂層析進一步純化蛋白質。或 者，可將蛋白質轉運至培養基中且於其中進行分離。可自 培養物中移除細胞，且過滤並濃縮培養物上清液以進一步 純化所產生之蛋白質。可使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)及西方墨點檢定之通常已知方法進一步分離並鑑別 經表現之多狀。 在本發明之一個態樣中，藉由醱酵過程大量產生抗體。 多種大規模補料分批醱酵程序可用於產生重組蛋白質。大 規模酸酵具有至少1000公升之容量，較佳約1〇〇〇至 100,000公升之容量。此等醱酵罐使用葉輪攪拌器來分配 氧及營養素，尤其葡萄糖（較佳碳源/能源）^小規模醱酵一 般係4a在體積谷莖不超過約1Q0公升且可在約1公升至約 100公升範圍内之酿酵罐中進行的醋酵。 在醱酵過程中，通常在細胞已於適合條件下生長至所要 密度（例如OD5 50為約180-220，在此階段細胞處於穩定期 早期）之後開始誘導蛋白質表現。如此項技術中所知且如 上所述，可根據所用載體構築體使用多種誘導劑。可在誘 導前使細胞生長較短時段。通常誘導細胞約1 2·5〇小時， 但可使用更長或更短之誘導時間。 152844.doc -127- 201130971 為改良本發明多肽之產率及品質，可改變多種醱酵條 件。舉例而言，為改良分泌之抗體多肽之適當組裝及摺 疊，可使用過度表現伴侣蛋白（chaperone protein)之其他載 體來共同轉化宿主原核細胞，該等伴侣蛋白為諸如Dsb蛋 白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及 / 或 DsbG)或 FkpA(具有伴 侣蛋白活性之肽基脯胺醯基順，反-異構酶）。已證實伴侣蛋 白促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質的適當摺疊及 溶解性。Chen 等人（1999) J Bio Chem 274:19601-19605 ;

Georgiou等人’美國專利第6,〇83,715號；Georgi〇u等人，鲁 美國專利第 6,027,888 號；Bothmann 及 Pluckthun (2000) J.

Biol. Chem. 275:17100-17105 ; Ramm&Pluckthun(2000)J.

Biol. Chem· 275:17106-17113 ; Arie 等人（2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。 為使所表現之異源蛋白質（尤其對蛋白水解敏感之蛋白 質）之蛋白水解降至最低，某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌 株可用於本發明。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以實 現編碼已知細菌蛋白酶（諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、 Tsp蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶v、蛋白酶及其組合） 之基因中的基因突變。可利用―些大腸桿菌蛋白酶缺乏菌 株且其描述於例如_等人（1998)(同上）；Georgiou等人， 美國專利第5,264,365號；Ge〇rgi〇u等人，美國專利第 5,508,192¾¾ , Haraf Λ > Microbial Drug Resistance, 2-63-72 (1996)。 在一個實施例中 缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多 152844.doc •128· 201130971 種伴侣蛋白之質體轉化的大腸桿菌菌株用作本發明之表現 系統中之宿主細胞。 a純化抗體 可採用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程 序為適合純化程序之例示性程序：免疫親和管柱或離子交 換管柱上分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或 陽離子交換樹脂（諸如DEAE)上層析、層析聚焦、SDS_ PAGE、硫酸銨沈澱及使用例如Sephadex® ^乃之凝膠過 滤。 ° 在一個態樣中，將固定於固相上之蛋白質A用於本發明 之全長抗體產物的免疫親和純化。蛋白質A為來自金黃色 葡萄球菌之W kD細胞壁蛋白其 以高親和力結合至抗體之Fc區。Lindmarlc等人（1983) j Immunol. Meth. 62:1_13。固定蛋白質a之固相較佳為包含 玻璃或一氧化矽表面之管柱，更佳為受控微孔玻璃管柱或

矽酸官柱。在一些應用中，管柱經諸如甘油之試劑塗覆以 力求防止污染物之非特異性黏附。 作為純化之第一步驟，將如上所述自細胞培養物得到之 製劑塗佈至固定蛋白質A之固相上以使相關抗體特異性結 一蛋白質A。接著洗務固相以移除非特異性結合至固相 之污木物。最後，藉由溶離自固相回收相關抗體。 b•使用真核宿主細胞產生抗體： 載體組分一般包括（但不限於）以下一或多者：信號序 列、複製起點、—或多個標記基因、強化子元件、啟動子 152844.doc -129- 201130971 及轉錄終止序列。 ⑴信號序列組分 用於真核佰主細胞中之載體亦可含有信號序列或在相關 成熟蛋白質或多肽之N端具有特異性裂解位點的其他多 肽。所選異源信號序列較佳為由宿主細胞識別並加工（亦 即由仏號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現 中，可利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例 如單純疱疹gD信號。 。亥刖驅區之DNA在閱讀框架中接合至編碼抗體之DNA。 (U)複製起點 一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例 而言，通常可使用SV40起點，僅僅因為其含有早期啟動 子。 (iii)選擇基因組分 表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記 物典型選擇基因編碼具有以下功能之蛋白質：（a)賦予對 杬生素或其他毒素（例如安比西林、新黴素广甲 胺喋呤或四環素）之抗性；（b)補充營養缺陷（若有需要）； 或（c)提供不可自複合培養基獲得之關鍵營養素。 選擇方案之一個實例利用藥物使宿主細胞之生長停滯。 經異源基因成功轉化之彼等細胞產生賦予藥物抗性之蛋白 質且因此在選擇方案中得以保留。該顯性選擇之實例使用 藥物新黴素、黴盼酸及濕黴素（hygromycin)。 適於哺乳動物細胞之可選擇標記物的另一實例為使得能 I52844.doc 201130971 夠鑑別有能力吸收抗體核酸之細胞的可選擇標記物，諸如 DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II(較佳為 靈長類動物金屬硫蛋白基因）、腺苷去胺酶、鳥胺酸去羧 酶等。 舉例而言，首先藉由在含有曱胺喋呤（Mtx)(DHFR之競 爭性拮抗劑）之培養基中培養所有轉化體來鑑別經DHFR選 擇基因轉化之細胞。當採用野生型DHFR時，適當宿主細 ^ 胞為DHFR活性缺乏之中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株（例如 ATCC® CRL-9096)。 或者，可藉由使細胞於含有針對可選擇標記物之選擇劑 (諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素（kanamycin)、新黴素 或G41 8)之培養基中生長來選擇經編碼抗體之DNA序列、 野生型DHFR蛋白質及另一可選擇標記物（諸如胺基糖苷3’-磷酸轉移酶（ΑΡΗ))轉化或共同轉化之宿主細胞（尤其含有 内源DHFR之野生型宿主）。參見美國專利第4,965,199號。 • (iv)啟動子組分 表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且可操作地 連接至抗體多肽核酸之啟動子。已知用於真核生物之啟動 子序列。實際上，所有真核基因皆具有位於距引發轉錄處 之位點上游約25至30鹼基處的AT-富集區。據發現處於許 多基因之轉錄起始處上游70至80個鹼基處的另一序列為 CNCAAT(SEQ ID NO: 206)區，其中N可為任何核苷酸。大 部分真核基因之1端處為AATAAA(SEQ ID NO: 207)序列， 該序列可為編碼序列之3'端添加多腺嗓吟尾poly A tail)的 152844.doc -131 - 201130971 l號。所有此等序列宜***真核表現載體中。 f礼動物宿主細胞中自載體之抗體多肽轉錄係例如受自 以下獲得之啟動子控制：病毒（諸如多瘤病毒、禽痘病 :、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病 毋、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿病毒 40(SV40))之基因組、異源哺乳動物啟動子（例如肌動蛋白 啟動子或免疫球蛋白啟動子）、熱休克啟動子，其限制條 件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。 宜獲得SV40病毒之早期及晚期啟動子，其為亦含有 SV4〇病毒複製起點之8乂4〇限制性片段。宜獲得人類細胞 巨大病毒之即刻早期啟動子，其為Hindm E限制性片段。 在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體表現dna 之系統揭示於美國專利第4,419,446號中。對此系統之修飾 描述於美國專利第4,6()1，978號中。或者，可使用勞斯肉瘤 病毒（Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。 00強化子元件組分 由較高等真核生物對編碼本發明抗體多肽之D N A的轉錄 通常藉由將強化子序列***載體中而得到增強。現已知來 自哺乳動物基因（球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α_胎蛋 白及騰島素）之許多強化子序列。然而，吾人通常將使用 來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點（bp丨〇〇_ 270)後側之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化 子、複製起點後側之多瘤強化子及腺病毒強化子。關於活 化真核啟動子之強化元件’亦參見Yaniv, iVa/Mre 297.17_18 152844.doc -132- 201130971 (1982)。可將強化子在抗體多肽編碼序列之5'或3'位置處剪 接至載體中，但其較佳位於啟動子之5’位點處。 (vi) 轉錄終止組分 用於真核宿主細胞中之表現載體通常亦將含有終止轉錄 及穩定mRNA所必需之序列》該等序列通常可自真核或病 毒DNA或cDNA之5'非轉譯區且有時3'非轉譯區獲得。此等 區含有轉錄為編碼抗體之mRNA之非轉譯部分中之多聚腺 嘌呤化片段的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛 生長激素多聚腺嘌呤化區。參見W094/11026及其中所揭 示之表現載體。 (vii) 選擇及轉化宿主細胞 適於選殖或表現本文載體中之DNA的宿主細胞包括本文 所述之較高等真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。使 脊椎動物細胞在培養物（組織培養物）中繁殖已成為一種常 規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉化之 猴腎CV1細胞株（COS-7，ATCC® CRL 1651);人類胚腎細 胞株（293細胞或經次選殖以於懸浮培養物中生長之293細 胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼倉鼠腎 細胞（BHK，ATCC® CCL 10)；中國倉鼠卵細胞/-DHFR(CHO，Urlaub 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；小鼠足細胞（TM4，Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC® CCL 70);非洲 綠猴腎細胞（VERO-76、ATCC® CRL-1587);人類子宮頸癌 細胞（HELA，ATCC® CCL 2);犬腎細胞（MDCK，ATCC® 152844.doc •133· 201130971 CCL 34);布法羅大鼠肝細胞（buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC® CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC® CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠***腫瘤 (MMT 060562，ATCC® CCL51) ; TRI 細胞（Mather 等人， Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)) ; MRC 5細胞； FS4細胞；及人類肝癌細胞株（Hep G2)。 用上述表現或選殖載體轉化宿主細胞以供產生抗體，且 於經改質以適於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所要 序列之基因的習知營養培養基中培養。 (viii)培養宿主細胞 可在多種培養基中培養用於產生本發明抗體之宿主細 胞。諸如漢氏F10(Ham's F10)(Sigma)、最低必需培養基 (MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及達爾伯克改良伊格爾 培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM) (Sigma)之市售培養基適於培養宿主細胞。另外，Ham等 人，Meth. Enz. 58:44 (1979) ; Barnes 等人，Anal. Biochem.l02:255 (1980);美國專利第 4,767,704 號、第 4,657,866 號、第 4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5，122,469號；WO 90/03430 ; WO 87/00195 ;或美國專利 參考案30,985中所述之任何培養基皆可用作宿主細胞之培 養基。任何此等培養基皆可根據需要補充有激素及/或其 他生長因子（諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽 (諸如氣化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽）、緩衝液（諸如 HEPES)、核苷酸（諸如腺苷及胸苷）、抗生素（諸如 152844.doc -134- 201130971 GENTAMYCIN藥物）、痕量元素（定義為通常以微莫耳 圍内之最終濃度存在的無機化合物）及葡萄糖或等效= 源。亦可包括熟習此項技術者已知的適當濃度之任何其： 必需補充劑。培養條件（諸如溫纟、阳值及其類似條件^ 先前與經選擇以供表現之宿主細胞一起使用之條件，且將 為一般熟習此項技術者顯而易知。 (ix)純化抗體 當使用重組技術時，可於細胞内產生抗體或使其直接分 泌至培養基中。若於細胞内產生抗體，則作為第—步驟， 例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或溶解片段之顆粒碎 片。在使抗體分泌至培養基中之情況下’一般首先使用市 售蛋白質濃縮過渡器（例如Amicon或Millipore Pellicon超淚 單元）濃縮來自該等表現系統之上清液。在任何前述步驟 中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且 可包括抗生素以防止外來污染物生長。 可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析 來純化由細胞製備之抗體組合物，其中親和層析為較佳純 化技術。蛋白質A作為親和配位體之適用性視物種及存在 於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的同型而定。蛋白質A可 用於純化基於人類γ 1、γ2或γ4重鏈之抗體（Lindmark等人， «/· /mmwno/. Mei/z· 62:1-13 (1983))。蛋白質 G經推薦用於所 有小鼠同型及人類Y3(Guss等人，EMBO J. 5:1567-1575 (1986))。親和配位體所附著之基質最常為瓊脂糖’但可利 用其他基質。與用瓊脂糖可達成之流動速率及加工時間相 152844.doc •135· 201130971 比，機械穩定性基質（諸如受控微孔玻璃或聚（苯乙烯二乙 烯基）苯）可達成較快流動速率及較短加工時間。當抗體包 含 CH3 域時，Bakerbond ABX™樹脂（J· T. Baker, Phillipsburg， NJ)適用於純化。視欲回收之抗體而定，亦可利用其他用 於蛋白質純化之技術，諸如離子交換管柱上分級分離、乙 醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽上層析、肝素 SEPHAROSE™上層析、陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚 天冬胺酸管柱）上層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈 澱。 在任何初步純化步驟之後，可使用pH值介於約2.5-4.5之 間的溶離緩衝液對包含相關抗體及污染物之混合物進行低 pH疏水性相互作用層析，較佳在低鹽濃度（例如約0-0.25 Μ鹽）下進行。 兔疫结合物 本發明亦提供包含結合至一或多種細胞毒性劑之抗體的 免疫結合物（可互換地稱為「抗體-藥物結合物」或 「ADC」），該一或多種細胞毒性劑為諸如化學治療劑、 藥物、生長抑制劑、毒素（例如蛋白質毒素，源於細菌、 真菌、植物或動物之酶促活性毒素，或其片段）或放射性 同位素（亦即放射性結合物）。 免疫結合物已用於局部傳遞細胞毒性劑，亦即在癌症治 療中殺死或抑制細胞生長或增殖之藥物（Lambert, J. (2005) Cwrr. ζ’λί 5:543-549 ; Wu等人（2005)

Nature Biotechnology 23(9):1137-1146 ； Payne, G. (2003) i 152844.doc -136- 201130971 3:207-212 ； Syrigos^. Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614 ; Niculescu-Duvaz及 Spring.er (1997) di/v. Drwg Z)e/iv. 26:151-172;美國專利第 4,975,278號）。免疫結

合物可將藥物部分靶向傳遞至腫瘤並積聚於腫瘤中之細胞 内，其t全身性投與未結合之藥物可能對正常細胞以及設 法去除之腫瘤細胞產生不可接受之毒性程度（Baldwin等 人，(1986年 3 月 15 日）第 603-05 頁；Thorpe (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A j，Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical 則（A· Pinchera等人編）第 475-506頁）。已報導適 用於此等策略之多株抗體與單株抗體（Rowland等人， (1986) Cawcer 21:183-87)。此等方 法中所用之藥物包括道諾黴素、小紅莓、甲胺喋呤及長春 地辛（Rowland等人，（1986)(同上））》抗體-毒素結合物中所 用之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如 蓖麻毒素（ricin);小分子毒素，諸如格爾德黴素 (geldanamycin)(Mandler 等人（2000) «/· Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 ; Mandler等人（2000)价⑽rgamc Mec?. C/aem. Zeiier·? 10:1025-1028 ; Mandler 等人（2002) 13:786-791);類美登素（EP 1391213 ; Liu等人，（1996)尸roc. TViz". Zcad. 93:8618- 8623);及卡奇黴素（Lode 等人（1998) Λα. 58:2928 ; Hinman等人（1993) Cwcer 53:3336-3342)。 毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑 152844.doc -137- 201130971 制之機制而發揮其細胞毒性作用。一些細胞毒性藥物當與 大抗體或蛋白質受體配位體結合時易變成非活性的或活性 較小。 ZEVALIN®(替伊莫單抗替烏克坦（ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)為抗體-放射性同位素結合物，其 由針對正常及惡性B淋巴細胞之表面上所見之CD20抗原的 鼠類IgGl κ單株抗體及由硫脲連接子-螯合劑結合之11 lln 或90Y放射性同位素構成（Wiseman等人（2000)五wr. ·7ομγ. iVwc/· Mec?· 27(7):766-77 ; Wiseman 等人（2002) Β/ο〇ί/ 99(12):4336-42 ; Witzig 等人（2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63 ; Witzig 等人（2002) «/. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。儘管ZEVALIN具有抗B細胞非霍奇金氏 淋巴瘤（non-Hodgkin's Lymphoma ’ NHL)之活性，但在大 部分患者中投藥會導致嚴重且較長之血細胞減少症。 MYLOTARG (吉妥珠單抗奥0坐米星（gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一種由連接至卡奇 黴素之huCD33抗體構成的抗體-藥物結合物，於2000年獲 准用於注射治療急性骨髓性白血病（Drwgs 〇/ ί/ze Fwiwre (2000) 25(7):686 ;美國專利第 4970198號、第 5079233號、 第 5585089號、第 5606040號、第 5693762號、第 5739116 號、第5767285號、第5773001號）。康圖單抗美坦辛 (Cantuzumab mertansine，Immunogen, Inc.)，一種由、經由 雙硫鍵連接子SPP連接至類美登素藥物部分DM1之huC242 抗體構成的抗體-藥物結合物，正進展至治療表現CanAg之 152844.doc -138- 201130971

癌症（諸如結腸癌、胰臟癌、胃癌及其他癌症）的II期試 驗。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologies，Immunogen Inc.)，一種由連接至類美登素藥物部分DM1之抗***特 異性膜抗原（PSMA)單株抗體構成的抗體-藥物結合物，正 開發用於潛在治療***腫瘤。奥瑞他汀（auristatin)肽、 奥瑞他汀E(AE)及單甲基奥瑞他汀（monomethylauristatin， MMAE)，亦即海兔毒素（dolastatin)之合成類似物，結合至 嵌合單株抗體cBR96(特異性針對癌瘤之路易斯Y(Lewis Y))及cACIO(特異性針對血液惡性病之CD30)(Doronina等 人（2003) iVaiwe 价 oiec/mo/. 21(7):778-784)且正開發用於 治療。 在某些實施例中，免疫結合物包含抗體及化學治療劑或 其他毒素。本文（例如上文）描述適用於產生免疫結合物之 化學治療劑。可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A 鏈、白喉毒素之非結合性活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿 假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鍵、相思 豆毒素（abrin)A鍵、蒴蓮根毒蛋白（modeccin)A鍵、α-帚麴 菌素（alpha-sarcin)、油桐（Aleurites fordii)蛋白質、康乃馨 蛋白質、美洲商陸（Phytolaca americana)蛋白質（PAPI、 PAPII及PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制劑、麻瘋 樹毒蛋白（curcin)、巴豆毒蛋白（cr〇tin)、肥皂草 (sapaonaria officinalis)抑制劑、重組植物毒素（gelonin)、 有絲***素（mitogellin)、侷限麴菌素（restrictocin)、酴黴 素（phenomycin)、伊諾黴素（enomycin)及黴菌毒素 152844.doc -139- 201130971 (tricothecene)。參見例如1993年1〇月28日公開之w〇 93/21232。多種放射性核種可用於產生放射性結合之抗 體。實例包括212Bi、⑴卜mIn、9〇^186Re。使用多種雙 功能蛋白質偶合劑來製備抗體與細胞毒性劑之結合物，該 等偶合劑為諸如3-(2-吡啶基二硫醇）丙酸N_ 丁二醯亞胺酯 (SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生 物（諸如己二亞胺酸二曱酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二 丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮基化合物（諸如 雙（對疊氮基苯曱醯基）己二胺）、雙重氮鹽衍生物（諸如雙 (對重氮鹽苯曱醯基）·乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6_ 二異氰酸酿）及雙活性氟化合物（諸如丨，5_二氟_2,4_二硝基 苯）。舉例而言’可如Vitetta等人，Science，238: 1〇98 (1987)所述來製備蓖麻毒素免疫毒素。經碳_14標記之丨·異 硫氰基苯曱基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸（MX_DTpA)為一 種使放射性核苷酸結合至抗體之例示性螯合劑。參見W〇 94/11026 。 本文亦涵蓋抗體與以下一或多種小分子毒素之結合物： 諸如卡奇黴素、類美登素、海兔毒素、奥瑞他汀、單端孢 黴稀及C C10 6 5 ’以及此等毒素之具有毒素活性之衍生 物。 美登素與類美登素 在一些實施例中’免疫結合物包含抗體（全長抗體或片 段）結合至一或多個類美登素分子。 類美登素為藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有絲*** 152844.doc • 140· 201130971 抑制劑。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木 分離（美國專利第3,896，111號）。隨後，發現某些微 生物亦產生類美登素，諸如美登醇（maytansinol)及C-3美登 醇醋（美國專利第4,15 1,042號）。合成美登醇及其衍生物及 類似物揭示於例如美國專利第4，137,230號、第4,248,870 號、第 4,256,746號、第 4,260,608號、第 4,265,814號 '第 4,294,757 號、第 4,307,016 號、第 4,308,268 號、第 φ 4,308,269 號、第 4,309,428 號、第 4,313,946 號、第 4,315,929 號、第 4,317,821 號、第 4,322,348 號、第 4,331，598 號 '第 4,361，650 號、第 4,364,866 號、第 4,424,219 號、第 4,450,254 號、第 4,362,663 號及第 4,371，533號中。 類美登素藥物部分為抗體藥物結合物中具吸引力之藥物 部分’原因在於：（i)可相對容易地藉由醱酵或對醱酵產物 進行化學修飾、衍生而製備；（ii)易於用適合經非雙硫鍵 鲁 連接子結合至抗體之官能基衍生；（iii)在血漿中穩定；及 (iv)有效對抗多種腫瘤細胞株。 含有類美登素之免疫結合物、製備其之方法及其治療用 途揭示於例如美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐 洲專利EP 0 425 235 B1 中。Liu等人，proc. Natl. Acad.

Sci. USA 93:8618-8623 (1996)描述包含類美登素（命名為 DM1)連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242的免疫 結合物。該結合物據發現對培養之結腸癌細胞具高細胞毒 性且在活體内腫瘤生長檢定中顯示抗腫瘤活性。Chari等 152844.doc -141 - 201130971 人，Cancer Research 52:127_131 (1992)描述如下免疫結合 物：其中類美登素經由雙硫鍵連接子與結合至人類結腸癌 細胞株上之抗原的鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu 致癌基因之另一鼠類單株抗體TA1結合。在活體外測試 ΤΑ. 1 -類美登素結合物對人類乳癌細胞株sk_br_3之細胞毒 性，該細胞株之每個細胞表現3><1〇5個11£11_2表面抗原。藥 物結合物達成與游離類美登素藥物類似之細胞毒性程度， 可藉由增加針對每個抗體分子之類美登素分子之數目而增 加細胞毒性程度^ A7-類美登素結合物在小鼠體内顯示較 低全身細胞毒性。 藉由在不會顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性的 情況下使抗體與類美登素分子化學連接來製備抗體-類美 登素結合物。參見例如美國專利第5,2〇8,〇2〇號。每個抗體 分子平均結合3-4個類美登素分子已顯示增強標靶細胞之 、、’田胞毒]·生之功效，而對抗體功能或溶解性並無不利影響， 仁預期甚至1個毒素/抗體分子亦會增強細胞毒性超過使用 裸抗體。類美登素在此項技術中為熟知的，且可由已知技 術合成或自天然來源分離。適合之類美登素揭示於例如美 國專利第5,208,020號及上文所提及之其他專利及非專利公 開案中》較佳之類美登素為美登醇及在美登醇分子之芳環 中或其他位置處經改質之美登醇類似物（諸如各種美登醇 酯）。 此項技術中已知許多用於製備抗體-類美登素結合物之 鍵聯基，包括例如美國專利第5,2〇8,〇2〇號或Ep專利〇 425 152844.doc -142· 201130971 235 B1 ’ Chari等人 ’ Cancer Research 52:127-131 (1992); 及2004年10月8日申請之美國專利申請案第i〇/96〇,6〇2號中 所揭示之鍵聯基。包含連接子組分SMCC之抗體_類美登素 結合物可如2004年10月8日申請之美國專利申請案第 10/960,602號中所揭示來製備。鍵聯基包括雙疏基、硫崎 基酉夂不穩疋基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或醋 酶不穩定基團，如上述專利中所揭示，雙硫基及硫驗基較 • 佳。本文描述並例示其他鍵聯基。 可使用夕種雙功忐蛋白質偶合劑來製備抗體與類美登素 之結合物’該等偶合劑為諸如3-(2-吡啶基二硫基）丙酸N-丁二酿亞胺醋（SPDP)、4_(N•順丁烯二醯亞胺基曱基）環己 烧小甲酸丁二醯亞胺酿（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 ()醯亞胺S曰之雙功能衍生物（諸如己二亞胺酸二甲酯鹽 酸鹽）、活性醋（諸如辛二酸二丁二酿亞胺醋）、酿（諸如戊 、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯甲醯基）己二 •=)、雙重氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮鹽苯曱醯基）_乙二 =)?異氰酸醋(諸如甲苯2,6·二異氰酸醋)及雙活性氟化 合物（諸如1，5-二氟_2,4·二確基苯）。尤佳偶合劑包括提供 鍵之3 (2-处咬基二硫基）丙酸Ν· 丁二醯亞胺酯 ()(Carlss〇n等人，J. 173:723-737 (1978))及 (比定基硫基）戊酸N-丁二酿亞胺酯（Spp)。 I使連接子連接至類美登素分子之各個位置處，視連接 類型而疋。舉例而言，可藉由使用習知偶合技術與經基反 應而形成酯鍵。該反應可於具有經基之c_3位置、經經甲 152844.doc -143· 201130971 基改質之C-14位置、經羥基改質之C-15位置及具有羥基之 C-20位置處發生。在一個較佳實施例中，於美登醇或美登 醇類似物之C-3位置處形成鍵。 奥瑞他汀與海兔毒素 在一些實施例中，免疫結合物包含抗體結合至海兔毒素 或海兔毒素肽類似物及衍生物奧瑞他汀（美國專利第 5 635483號、第5780588號）。海兔毒素及奥瑞他汀已顯示 干擾微管動力學、GTP水解及細胞核與細胞***（Woyke等 人(2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)，且具有抗癌活性（US 5663149)及抗真菌活性（Pettit 等人（1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。海 兔毒素或奥瑞他汀藥物部分可經肽藥物部分之N(胺基）端 或C(羧基）端連接至抗體（WO 02/088172)。 例示性奥瑞他汀實施例包括N端連接之單甲基奥瑞他汀 藥物部分DE及DF，揭示於2004年11月5日申請之US第 10/983,340 號「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」中。 肽基藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/ 或肽片段之間形成肽鍵而製備。該等肽鍵可例如根據肽化 學領域中熟知之液相合成方法（參見E. Schr6der及K. Lubke, 「The Peptides」，第 1 卷，第 76-136 頁，1965, Academic Press)製備。奥瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據 以下文獻中之方法製備：US 5635483 ; US 5780588 ; Pettit等人（1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465 ; Pettit 152844.doc -144- 201130971 等人（1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277 ; Pettit, G.R.等人 Synthesis，1996，719-725 ;及 Pettit 等人（1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863。亦參見 Doronina (2003) Nat Biotechno 1 21(7):778-784: 2004年 11月 5 日申請 之 US 第 10/983,340 號「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」（揭示例如連接子及製 備結合至連接子之單曱基纈胺酸化合物（諸如mmae及 MMAF)之方法）。 卡奇黴素 在其他實施例中，免疫結合物包含抗體結合至一或多個 卡奇黴素分子。抗生素卡奇黴素家族能夠在低於皮莫耳之 濃度下引起雙股DNA斷裂。關於卡奇黴素家族結合物之製 備，參見美國專利 5,712,374、5,714,586、5,739，116、 5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,〇〇1 及 5,877,296 (皆頒予American Cyanamid Company)。可使用之卡奇黴素 結構類似物包括（但不限於）γΐΐ、α2Ι、α3Ι、N-乙醯基-γΐΐ、PSAG及 0Il(Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342 (1993) ; Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928 (1998);及頒予American Cyanamid之上述美國專利）。可 結合抗體之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。卡奇 黴素與QFA均具有細胞内作用位點且不易跨越質膜。因 此，細胞經抗體介導之内化作用吸收此等藥劑大大增強其 細胞毒性作用。 其他細胞毒性劑 152844.doc •145- 201130971 可結合至抗體之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素 (streptozoicin)、長春新驗及5-氟尿嘧咬（該家族之藥劑統 稱為LL-E33288複合物’如美國專利5,〇53,394、5,77〇,71〇 中所述）以及埃斯培拉黴素（美國專利5,877,296)。 可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒 素之非結合性活性片段、外毒素A鍵（來自綠腹假單胞 菌）、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素a鏈、蒴蓮根毒素a鏈、 α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白 (ΡΑΡΙ、ΡΑΡΙΙ及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴 豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、重組植物毒素、有絲***素、 侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見例如 1993 年 10 月 28 日公開之 W0 93/21232。 本發明另外涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物（例如 核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如去氧核糖核酸酶； DNase)之間形成的免疫結合物。 為選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種 放射性同位素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括 At2n、I13丨、1丨25、Y9。、Rem、Rem、Smm、則212、卩32、

Pb ，及以之放射性同位素。當結合物用於偵測時，其可 包含用於閃爍攝影研究之.放射性原子，例如tc99m或 1123，或用於核磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像， mri)之自旋標記，諸如碘_〗23及碘_131、銦-ui、氟μ、 碳-13、氮-15 '氧· 17 '釓、錳或鐵。 可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物_。 152844.doc -146 * 201130971 舉例而言，肽可經生物合成，或可藉由使用適合之胺基酸 前驅物（其涉及例如以氟_19替代氫）進行化學胺基酸合成來 合成。可經由肽中之丰胱胺酸殘基連接諸如以〜或〗!23、 Re 6、Re188及In111之標記。可經由離胺酸殘基連接釔· 90。IODOGEN 方法（Fraker 等人（1978) Biochem. Biophys. Res. Commim. 80: 49-57)可用於合併碘 _123。「M〇nocl〇nal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal，CRC Press 1989)詳細描述其他方法》 可使用多種雙功能蛋白質偶合劑來製備抗體與細胞毒性 劑之結合物，該等偶合劑為諸如3·(2_吡啶基二硫基）丙酸 Ν-丁二醯亞胺醋（SPDP)、4-(Ν-順丁烯二醯亞胺基曱基）環 己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醯亞胺酯之雙功能衍生物（諸如己二亞胺酸二甲酯鹽 酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、醛（諸如戊 二酿）、雙疊氮基化合物（諸如雙（對疊氮基苯曱醯基）己二 胺）、雙重氮鹽衍生物（諸如雙（對重氮鹽苯甲醯基）·乙二 胺）、二異氰酸酯（諸如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化 合物（清如1，5->一氣-2,4-二硝基苯）。舉例而言，可如

Vitetta等人，238:1098 (1987)中所述來製備萬麻 毒素免疫毒素。經碳-14標記之1-異硫氰基苯曱基_3_曱基 一伸乙基二胺五乙酸（MX-DTPA)為一種使放射性核苦·酸結 合至抗體之例示性螯合劑《參見W094/11026。連接子可 為促進細胞毒性藥物於細胞中釋放之「可裂解連接子」。 舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、 152844.doc -147· 201130971 光不穩定連接子、二曱基連接子或含雙硫鍵連接子（chari 等人，Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利第 5,208,020號）。 該等化合物明確涵蓋（但不限於）用以下交聯試劑製備之 ADC ： BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、ΜΡΒΗ、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、 磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及SVSB((4-乙烯基砜）苯甲酸丁二醯亞胺酯），該 等交聯試劑可購得（例如購自Pierce Biotechnology，Inc.， Rockford, IL.，U.S.A)。參見 2003-2004 Applications Handbook and Catalog之第 467-498 頁。 製備抗體藥物結合物 在抗體藥物結合物（ADC)中，抗體（Ab)經連接子（L)結合 至一或多個藥物部分（〇)，例如每個抗體約1至約20個藥物 部分。可採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件 及試劑，經若干途徑來製備式I之ADC，該等途徑包括： (1)使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵 形成Ab-L，隨後與藥物部分D反應；及（2)使藥物部分之親 核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，隨 後與抗體之親核基團反應。其他製備ADC之方法描述於本 文中。

Ab-(L-D)p ϊ 連接子可由一或多種連接子組分構成。例示性連接子組 152844.doc -148- 201130971 分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基（「mc」）、順丁烯二醯 亞胺基丙醯基（「MP」）、纈胺酸-瓜胺酸（「val-cit」）、丙 胺酸-***酸（「ala-phe」）、對胺基苯甲氧基羰基 (「PAB」）、4·(2-吡啶基硫基）戊酸N- 丁二醯亞胺酯 (「SPP」）、4-(Ν-順丁烯二醯亞胺基曱基）環己烷」-曱酸 Ν-丁二醯亞胺酯（「SMCc」）及（4-碘-乙醯基）胺基笨曱酸 N- 丁二醯亞胺酯（r SIAB」）。其他連接子組分在此項技術 籲 中為已知的且其中一些描述於本文中。亦參見2004年11月 5 曰申 s月之 US 第 10/983,340 號「Monomethylvaline

Compounds Capable of Conjugation to Ligands」。 在一些實施例中’連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺 基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二 狀包括：纈胺酸-瓜胺酸（vc或val_cit)、丙胺酸-***酸 (af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸_纈胺酸瓜胺酸 (gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸_甘胺酸（giy_giy_gly)。構成 • 胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然存在之胺基酸， 以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺 酸。可設計胺基酸連接子組分，且優化其對特定酶（例如 腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、D或纖溶蛋白酶）之 酶促裂解的選擇性。 抗體上之親核基團包括（但不限於广⑴\端胺基；⑴）側 鏈胺基’例如離胺酸；（iii)側鏈硫氫基，例如半胱胺酸； 及（iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫氫基 及搜基為親核基團且能夠與連接子部分及連接子試劑上之 152844.doc 201130971 親電子基图反應形成共價鍵，該等連接子部分及連接子試 劑包括：⑴活性酯，諸如NHS酯、H〇Bt酯、_甲酸酯及 酸鹵化物，（η)烷基及笨甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；（丨^) 醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原 之鏈間雙硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫 蘇糖醇）之還原劑處理而使抗體具有與連接子試劑結合之 反應性。由此，各半胱胺酸橋理論上將形成兩個反應性硫 醇親核體。可經由離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷（特勞特氏 試劑（Traut’s reagent))反應使胺轉化為硫醇，從而將其他 親核基團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四 個或四個以上半胱胺酸殘基（例如製備包含一或多個非原 生半胱胺酸胺基酸殘基之突變抗體）而將反應性硫氫基引 入抗體（或其片段）中。 亦可藉由對抗體進行修飾以引入可與連接子試劑或藥物 上之親核取代基反應的親電子部分，來製備抗體藥物結合 物。可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化糖基化抗體之糖，以 形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛基或酮 基。所得亞胺希夫鹼（Schiff base)基團可形成穩定鍵，或 可例如經棚氫化物試劑還原而形成穩定胺鍵。在一個實施 例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏 過碘酸鈉之反應可於蛋白質中產生可與藥物上之適當基團 反應的幾基（酿基及S同基）(Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸 殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛而非第一 152844.doc •150- 201130971 胺基酸（Geoghegan 及 Stroh，（1992) C/?e所. 3:138-146 ; US 53 62852)。該醛可與藥物部分或連接子親 核體反應。 同樣，藥物部分上之親核基團包括（但不限於）：胺、硫 醇 '經基、醢肼、肪、肼、硫代半卡巴膝（thiosemicarbazone)、 敌酸肼及芳基酿肼基團，其能夠與連接子部分及連接子試 劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等連接子部分及連 籲 接子β式劑包括：⑴活性S旨’諸如NHS S旨、HOBt S旨、齒曱 酸醋及酸齒化物；（ii)烷基及苯曱基齒化物，諸如鹵乙醯 胺；（iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醢亞胺基。 或者’可例如藉由重組技術或肽合成來製備包含抗體及 細胞毒性劑之融合蛋白。DNA之長度上可包含編碼結合物 之兩個部分的各別區域，該等區域彼此相鄰或由編碼不會 破壞結合物之所要特性之連接子肽的區域隔開。 在另—實施例中，抗體可結合至用於預靶向腫瘤之「受 • 體」（諸如抗生物素蛋白鏈菌素）’在使用中，將抗體-受體 結合物投與患者，隨後使用清除劑自循環中移除未結合之 。&物接著投與結合至細胞毒性劑（例如放射性核苷酸） 酉己位體」（例如抗生物素蛋白）。 本發明之組合物 本發明亦涵蓋組合物，包括醫藥組合物，其包含抗_Bv8 抗體及勺人 匕3編碼抗-Bv8抗體之序列的聚核苷酸。如本文所 用之組合物包含一或多個結合至Bv8之抗體及/或一或多個 包3編碼—或多個結合至Bv8之抗體之序列的聚核苷酸。 152844.doc 201130971 此等組合物可另外包含此項技術中熟知之適合載劑，諸如 醫藥學上可接受之賦形劑，包括緩衝液。 藉由將具有所要純度之抗體與視情況選用之生理學上可 接受之載劑、賦形劑或穩^劑混合來製備包含本發明之 抗-BV8抗體之治療調配物以供儲存77^ Sczewce ⑽则9 第 2〇版（2〇⑽）），該等治 療調配物呈水溶液、； 東乾調配物或其他經乾燥調配物之^ 式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下 對接受者無毒，且包括緩衝液，諸如麟酸鹽、轉樣酸鹽、 組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺 酸；防腐劑（諸如氣化十八院基二甲基苯甲基錢；氣化六 羥季銨（hexamethonium chi〇ride);氣化苯甲烴銨 (benzalkonium chloride) ^ t ^^(benzethonium chloride)； 苯盼、丁醇或苯甲醇；對經基苯甲酸烧醋，諸如對經基苯 甲酸甲醋或對經基苯甲酸丙醋；兒茶盼；間苯二紛；環己 醇；3_戊醇；及間甲酚）；低分子量(少於約ι〇個殘基)多 肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水 聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩 酿胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙 膽及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；整合 劑，諸如EDTA ;糖，諸如嚴糖、甘露糖醇、海藻糖或山 梨糖醇；成鹽相對離子，諸如納離子；金屬錯合物（例如 Zn-蛋白質錯合物）；及/或非離子界面活性劑，諸如 TWEEN™、plur〇nicstM或聚乙二醇（pEG)。 〇 152844.doc -152· 201130971 =文中之調配物亦可含有所治療之衫適應症所必需之 上活性化合物’較佳為具有彼此無不良影響之互補 :二活性化合物。該等分子宜以有效達成預期目的之量 組合存在。 里 亦可將活性成分戴留於以下者中：例如由凝聚技術或由 =面聚合製備之微膠囊’分別例如羥甲基纖維素或明膠微 膠囊及聚（甲基丙稀酸甲醋）微膠囊；膠狀藥物傳遞系統（例 #如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈来粒子及奈米膜 囊）；或***液。該等技術揭示於及_·心如㈣ 第2〇 版（2_)中。 欲用於活體内投與之調配物必須無菌。此易於藉由經無 菌過濾膜過濾來實現。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含 有本發明免疫球蛋白之固體疏水聚合物之半滲透性基質， 該等基質呈成形物品（例如薄膜或微膠囊）之形式。持續釋 φ 放基質之實例包括聚酯；水凝膠（例如聚（2-羥乙基_甲基丙 稀酸醋）或聚（乙烯醇））；聚乳酸交酯（美國專利第3,773,919 號）；L-麩胺酸與γ_乙基_L_麩胺酸酯之共聚物；不可降解 之乙烯-乙酸乙烯酯；可降解之乳酸—乙醇酸共聚物，諸如 LUPRON DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)構成之可注射微球體）；及聚-D-(-)-3- 羥基丁酸》雖然諸如乙烯·乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚 合物能夠歷經1 〇〇天以上釋放分子，但某些水凝膠歷經較 短時段釋放蛋白質。當經囊封之免疫球蛋白長時間保留於 152844.doc -153- 201130971 體内時，其可能由於在37t下與水分接觸而變性或凝集， 從而會使生物活性損失及免疫原性發生可能變化。可視所 涉及之機制來設計用於穩定之合理策略。舉例而言，若發 現凝集機制為經硫基·二硫基互換而形成分子間s_s鍵，則 可藉由修飾氫硫基殘基、自酸性溶液康乾、控制水分含 量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來 穩定。 用途 本發明之抗體可用於例如活體外、離體及活體内治療方 法中。 本發明提供適用於調節與Bv8之表現及/或活性，諸如增 加之表現及/或活性或非所需之表現及/或活性相關之疾病 病況的方法及組合物，該等方法包含投與需要該治療之個 體有效劑量之抗-Βν8抗體。 在一個態樣中，本發明提供治療或預防腫瘤、癌症及/ 或細胞增殖性病症之方法，該等方法包含投與需要該治療 之個體有效量之抗-Bv8抗體。 在一個態樣中，本發明提供抑制血管生成之方法，該等 方法包含投與需要該治療之個體有效量之抗_Bv8抗體。 在一個態樣中’本發明提供抑制腫瘤轉移之方法，該等 方法包含投與需要該治療之個體有效量之抗_Bv8抗體。 在一個態樣中’本發明提供抑制内皮細胞增殖之方法， 6亥等方法包含投與需要該治療之個體有效量之抗_8“抗 體。 152844.doc -154- 201130971 在一個態樣中，本發明提供增強另一抗血管生成劑之功 效的方法，該等方法包含投與需要該治療之個體有效量之 抗-Bv8抗體。在一些實施例中，個體患有腫瘤、癌症及/ 或細胞增殖性病症。在一些實施例中，其他抗血管生成劑 靶向VEGF，例如抗-VEGF抗體。 應瞭解，任何適合之抗-Bv8抗體皆可用於治療方法中， 包括單株抗體及/或多株抗體、人類抗體、嵌合抗體、親 φ 和力成熟抗體、人類化抗體及/或抗體片段。在一些實施 例中，使用本文所述之任何抗_Bv8抗體進行治療。 在本文中之任何方法中，吾人可投與個體或患者本文中 之抗-Bv8抗體以及有效量之第二藥物（其中本文中之抗_ Bv8抗體為第一藥物），該第二藥物為可治療需要治療之個 體之病狀的另一活性劑。舉例而言，本發明之抗體可與以 下共同投與：另一抗體、化學治療劑（包括化學治療劑之 混合液）、抗血管生成劑、免疫抑制劑、細胞激素、細胞 φ 激素拮抗劑及/或生長抑制劑。該第二藥物之類型視各種 因素而定，包括病症類型、疾病嚴重度、患者之病狀及年 齡、所用第一藥物之類型及劑量等。 在本發明之抗體抑制腫瘤生長之情況下，舉例而言，可 忐尤其需要將其與一或多種亦抑制腫瘤生長之其他治療劑

S 舉例而§ ’在治療方案中，例如在治療本文所述之 4何疾病（包括結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌及/或 姨臟癌）時’可將本發明之抗體與以下藥劑組合：抗血管 生成劑’諸如抗-VEGF抗體（例如AVASTIN®)及/或抗-ErbB I52844.doc -155· 201130971 抗體（例如HERCEPTIN®曲妥珠單抗（trastuzumab));抗-HER2抗體或EGFR抑制劑（例如埃羅替尼（TARCEVA®))或結 合至HER2之域II之抗-HER2抗體，諸如〇MNITARGtm帕妥 珠單抗（pertuzumab)抗-HER2抗體）。或者或另外，患者可 接受組合放射線療法（例如外光束照射，或使用經放射性 標記之藥劑（諸如抗體）進行治療）。上文所述之該等組合療 法包括組合投藥（其中兩種或兩種以上藥劑包括於同一調 配物或獨立調配物中）；及獨立投藥，在此情況下，投與 本發明之抗體可在投與輔助療法之前及/或之後進行。另 _ 外’預期將本發明之抗體與相對無細胞毒性之藥劑（諸如 另一生物分子，例如另一抗體）組合相對於將抗體與對細 胞具咼度毒性之化學治療劑或其他藥劑組合，會使細胞毒 性有所降低。 用本文中之抗體與一或多種第二藥物之組合進行治療 佳會改良癌症之徵象或症狀。舉例而言，該療法可使存: 率（總存活率及/或無進展存活率）相對於僅用第二藥物（

如僅用化學治療劑)治療之患者有所改良，及/或可產生 觀反應Up分或完全）。此外，用本文中之抗體與—或多$ 藥物之組合進行治療較佳會對患者產生加和且更佳i 同(或高於加和)之治療效益。在某些實施例中，第二藥4 次投藥與本文中之抗體之至少—次投藥之間的日 間間隔為約—佃B β 藥物之$丨 内。在某些實施例中，第」 二主^、—次投藥與本文中之抗體之至少一次投藥之R 的時間間隔為約兩週或兩週以内。在某些、: I52844.doc •156· 201130971 中之抗體與第二藥物並行投與。 對於癌症治療，第二藥物較佳為另一抗體、化學治療劑 (包括化學治療劑之混合液）、抗金管生成劑、免疫抑制 劑、前藥、細胞激素、細胞激素拮抗劑.、細胞毒性放射線 療法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、止痛劑、抗血管 劑及/或生長抑制劑。細胞毒性劑包括與DNA相互作用之 藥劑、抗代謝物、拓撲異構酶I或II抑制劑，或紡錘體抑制 劑或穩定劑（例如較佳為長春花生物鹼，更佳選自長春 驗、去氧長春驗（deoxyvinblastine)、長春新驗、長春地 辛、長春瑞濱、長春匹定（vinepidine)、長春填汀 (vinfosiltine)、長春利定（vinzolidine)及長春氟寧 (vinfunine))，或用於化學療法中之任何藥劑，諸如5-FU、 紫杉烧、小紅每或***（dexamethasone)。 在一些實施例中，第二藥物為用於治療癌症之另一抗 體，諸如針對HER2/neu受體之細胞外域之抗體，例如曲妥 珠單抗，或其功能性片段之一；泛HER抑制劑；Src抑制 劑；MEK抑制劑；或EGFR抑制劑（例如抗-EGFR抗體（諸如 抑制EGFR之酪胺酸激酶活性之抗體），諸如西妥昔單抗 (ERBITUX®)、二苯胺基鄰苯二甲醯亞胺、吡唑并吡啶并 嘴0定或°比°各并°比咬并癌唆、啥°全琳（quinaziline)、吉非替 尼（gefitinib)、埃羅替尼、西妥昔單抗、ABX-EFG、卡奈 替尼（canertinib)、EKB-569 及 PKI-166);或雙重 EGFR/HER-2抑制劑，諸如拉帕替尼（lapatanib)。其他第二 藥物包括阿來組單抗（alemtuzumab，CAMPATH™) ' 132844.doc •157- 201130971

FavID(IDKLH)、糖基化作用改變之CD20抗體（諸如GA· 101/GLYCART™)、奥利默森（oblimersen，GENASENSE™)、 沙立度胺（thalidomide)及其類似物（諸如來那度胺 (lenalidomide，REVLIMID™))、伊馬替尼、索拉非尼 '奥 伐組單抗（ofatumumab，HUMAX-CD20™)、抗-CD40 抗體 (例如SGN-40)及抗-CD80抗體（例如加利昔單抗 (galiximab)) 0 止吐劑較佳為鹽酸昂丹司瓊（ondansetron hydrochloride)、鹽酸格拉司瓊（granisetron hydrochloride)、曱氧氯普胺（metroclopramide)、多潘立酮 (domperidone)、氟派。定醇（haloperidol)、賽克利口秦 (cyclizine)、 勞拉西泮（lorazepam)、 丙氣拉嗓 (prochlorperazine)、 ***、左美丙唤 (levomepromazine)或托烧司壤（tropisetron)。疫苗較佳為 GM-CSF DNA及基於細胞之疫苗、樹突狀細胞疫苗、重組 病毒疫苗、熱休克蛋白（HSP)疫苗、同種異體或自體腫瘤 疫苗。止痛劑較佳為布洛芬（ibuprofen)、萘普生 (naproxen)、三水楊酸膽驗鎮或鹽酸經考_ (oxycodone hydrochloride)。抗血管劑較佳為貝伐單抗或rhuMAb-VEGF。其他第二藥物包括抗增殖劑，諸如法呢基蛋白轉 移酶抑制劑、抗- VEGF抑制劑、p53抑制劑或PDGFR抑制 劑。本文中之第二藥物亦包括生物靶向療法，諸如抗體治 療以及乾向小分子之療法，例如針對某些受體之療法。 已鑑別許多抗血管生成劑且在此項技術中為已知的，包 152844.doc -158- 201130971 括本文中列出，例如定義項下列出之抗血管生成劑，及以 下文獻中之抗血管生成劑：例如Carmeliet及Jain，Nature 407:249-257(2000)，Ferrara 等人，Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004);及 Sato Int. J. Clin. Oncol·, 8:200-206 (2003)。亦參見美國專利申請案 US20030055006。在一個實施例中，抗-Bv8抗體係與抗-VEGF中和抗體（或片段）及/或另一 VEGF拮抗劑或VEGF受 體拮抗劑組合使用，包括（但不限於）例如可溶性VEGF受體 (例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經纖毛蛋白（例 如NRP1、NRP2))片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR之適體、 中和抗-VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶（RTK)之低分子量 抑制劑、VEGF之反義策略、針對VEGF或VEGF受體之核 糖酶、VEGF之拮抗劑變異體，及其任何組合。或者或另 外，除了 VEGF拮抗劑及其他藥劑以外，兩種或兩種以上 血管生成抑制劑可視情況共同投與患者。在某些實施例 中，一或多種其他治療劑（例如抗癌劑）可與抗-Bv8抗體、 V£GF拮抗劑及抗血管生成劑組合投與。 適用於本文之化學治療劑描述於上文’例如「化學洽療 劑」之定義中。 該等第二藥物可在投與本文中之抗體之後48小時内投 與，或在投與該藥劑之後24小時内或12小時内或3-12小時 内投與，或可經預選時段（較佳約1至2天）投與。另外’該 藥劑之劑量可低於治療劑量。 本文中之抗體可與第二藥物並行、依序或交替投與，或 152844.doc • 159- 201130971 在對其他療法不起反應時投與。因此，第二藥物之組合投 藥包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物共同投與（並行 投與）；及以任一次序連續投與，其中較佳存在兩種（或所 有）藥物同時發揮其生物活性之時段。所有此等第二藥物 可彼此組合使用或單獨與第一藥物組合使用，因此如本文 所用之表述「第二藥物」並不意謂其分別指代除第一藥物 外之唯一藥物。因此，第二藥物無需為一種藥物，但可構 成或包含一種以上此類藥物。 如本文所闡述之此等第二藥物一般以與第一藥物相同之 劑量及投藥途徑使用，或以第一藥物之劑量的約1%至99〇/〇 之量使用。若完全使用該等第二藥物，則其用量較佳低於 不存在第一藥物之情況下的用量，尤其在超過第一藥物之 初始劑量之後續劑量中，以便消除或降低由此引起之副作 用》 本發明亦提供抑制或預防難治性腫瘤、復發性腫瘤生長 或復發性癌細胞生長之方法及組合物。在某些實施例中， 復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長用於描述如下病狀： 其中正接受或採用—或多種當前可用之療法（例如癌症療 法’諸如化學療法、放射線療法、手術、激素療法及/或 生物療法/免疫療法、抗-VEGF抗體療法，尤其針對特定癌 症之標準治療方案）治療之患者在臨床上未得到充分治 療’或該等患者自療法中不再收到任何有益效果，以致此 等患者需要其他有效療法。在某些實施例中，癌症為復發 性腫瘤生長或復發性癌細胞生長’其中癌細胞之數目未顯 152844.doc -160- 201130971 著減少或已增加，或腫瘤尺寸未顯著減小或已增大，或癌 細胞之尺寸或數目並無任何進―步的減，卜在某些實施例 中，具有復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長之患者對一 或多種當前可用之療法已產生抗性。在某些實施例中，術 :難治用於描述如下絲：其巾正接受或㈣—或多種當 前可用之療法（例如癌症療法，諸如化學療法、放射線療 法手術激素療法及/或生物療法/免疫療法、抗_vegf 抗體療法’尤其針對特定癌症之標準治療方案）治療之患 者在臨床上未得到充分治療。在某些實施例中，無反應性/ 難治性患者為對療法起反應、但仍遭受副作用，對療法不 起反應，或對療法之反應不能令人滿意等之患者。在某些 實施例中，癌症為無反應性/難治性腫瘤，該腫瘤對前述

治療固有地不起反應或具抗性。在某些實施例中，難治係 才曰疾病或病狀對包含VEGF拮抗劑之療法固有地不起反 應。可藉由此項技術中已知用於檢定治療癌細胞之有效性 的任何方法，在此情形下使用「復發性」或「難治性」或 無反應性」之技術上公認之含義，在活體内或活體外判 定癌細胞是否為難治的、是否存在復發性腫瘤生長或復發 性癌細胞生長。 本發明提供阻斷或減少個體之復發性腫瘤生長或復發性 癌細胞生長之方法，其係藉由投與有效量之抗_Bv8抗體以 阻斷或減少個體之復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長來 達成。本發明提供治療包含VEGF拮抗劑之療法所難治之 患者的方法’其係藉由投與該患者有效量之抗_Bv8抗體來 152844.doc • 161 - 201130971 達成。在某些實施例中，抗-Bv8抗體可在另一癌症治療劑 之後投與。在某些實施例中，抗-Bv8抗體與癌症療法同時 投與。或者或另外，抗-Bv8抗體治療與另一癌症療法交替 進行，此可以任何次序進行。本發明亦涵蓋投與一或多種 抑制性抗體以防止易患上癌症之患者之癌症發作或復發的 方法。一般而言，個體已經或同時接受癌症療法。在一個 實施例中，癌症療法為抗血管生成劑（例如VEGF拮抗劑）治 療。抗血管生成劑包括此項技術中已知及本文中之定義項 下提供之抗血管生成劑。在一個實施例中，抗血管生成劑 為抗-VEGF中和抗體或片段（例如人類化A4.6.1、 AVASTIN®(Genentech，South San Francisco, CA)、Y03 17、 M4、G6、B20、2C3等）。參見例如美國專利6,582,959、 6,884,879 ' 6,703,020 ； W098/45332 ； WO 96/30046 ； W094/10202 ; EP 0666868B1 ;美國專利申請案 20030206899 、 20030190317 、 20030203409 及 20050112126 ; Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004);及W02005012359。其他藥劑可與VEGF拮抗 劑及抗-Bv8抗體組合投與以供治療難治性腫瘤、阻斷或減 少復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長。 本發明之抗-Bv8抗體（及輔助治療劑）係藉由任何適合之 手段投與，包括非經腸、皮下、腹膜内、肺内及鼻内投 與，且必要時病灶内投與以供局部治療。非經腸輸注包括 肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下投藥。另外， 抗-Bv8抗體宜藉由脈衝輸注，尤其以抗體之遞減劑量投 152844.doc -162- 201130971 與。可經任何適合途徑（例如藉由注射，諸如靜脈内或皮 下注射）來給藥，部分取決於投藥為短期抑或長期。 在本發明抗體之製備及投藥中可將該抗體之結合標靶之 位置考慮在内。當結合標乾為細胞内分子時，本發明之某 些貫細例提供欲引入結合標乾所位於之細胞中的抗體或^ 抗原結合片段。在一個實施例中，本發明之抗_Bv8抗體可 作為胞内抗體（intrabody)於細胞内表現。如本文所用之術 φ 語「胞内抗體」係指於細胞内表現且能夠選擇性地結合至 標靶分子之抗體或其抗原結合部分，如例如Marase〇， Therapy 4. 1 1-15 (1997)； Kontermann, Methods 34： 163_ 170 (2004);美國專利第6 〇〇4 94〇號及第6 329 173號；美 國專利申凊公開案第2003/0104402號；及PCT公開案第 W02003/077945號中所述。亦參見例如Η%年3月14曰公 開之WO96/07321，其係關於使用基因療法來產生細胞内 抗體。 φ 可藉由將編碼所要抗體或其抗原結合部分之核酸（缺乏 通常與編瑪抗體或抗原結合片段之基因相關之野生型前導 序列及分泌、信號）引入標靶細胞中來實現胞内抗體之細胞 内表現。可將一或多種編碼全部或一部分本發明抗體之核 酸傳遞至標靶細胞，以使一或多種能夠結合至細胞内標靶 多肽且調節標靶多肽之活性的胞内抗體得以表現。可使用 將核酸引入細胞中之任何標準方法，包括（但不限於）微量 注射、彈道注射、電穿孔、磷酸鈣沈澱、脂質體，及用帶 有相關核酸之反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒及牛痘病 152844.doc •163· 201130971 毒載體轉染。 在某些實施例中，可藉由活體内及離體方法將核酸（視 情況含於載體中）引入患者細胞中。在活體内傳遞之一個 實例中’將核酸直接注射至患者體内，例如在需要治療干 預之部位處。在活體内傳遞之另一實例中，使用以病毒載 體（诸如腺病毒、單純;鹿療;[病毒或腺相關病毒）進行之轉染 及基於脂質之系統（適用於脂質介導之基因轉移的脂質為 例如DOTMA、DOPE及DC-Chol)，將核酸引入細胞中。關 於某些基因;t示g己及基因療法方案之評述’參見Anders〇n等 人，心256:808-813 (1992)及 WO 93/25673 以及其中 所引用之參考文獻。在離體治療之一個實例中，移除患者 之細胞，將核酸引入彼等分離之細胞中，且直接或例如以 囊封於植入患者體内之多孔膜内的方式將經修飾之細胞投 與患者（參見例如美國專利第4,892,538號及第5,283,187 號）。離體傳遞核酸之常用載體為反轉錄病毒載體。 抗體可具有增強抗體 在另一實施例中，提供内化抗體。 傳遞至細胞中之某些特徵，或可經修飾以具有該等特徵。 達成此目的之技術在此項技術中為已知的。舉例而言，已

子。該 該等肽可以化學方式合成及/或藉由 列之能力的肽分 重組DNA技術產 152844.doc •164- 201130971 生。參見例如 Marasco 等人，/Voc. iVai/. dcai/· USA, 90: 7889-7893 (1993)° 可由此項技術t已知之其他方法來增強抗體進入標靶細 胞中。舉例而言，某些序列，諸如來源於HI V Tat或觸角 足（Antennapedia)同源域蛋白之序列，能夠引導異源蛋白 跨越細胞膜有效吸收。參見例如Chen等人，Proc. ΛΓαίί. Acad. Sci. USA (1999), 96:4325-4329 « 當抗體之結合標靶位於腦中時，本發明之某些實施例提 供橫越血-腦障壁之抗體。此項技術中已知若干用於跨越 企-腦障壁轉運分子之方法，包括（但不限於）物理方法、基 於脂質之方法、基於幹細胞之方法及基於受體及通道之方 法。 跨越血-腦障壁轉運抗體之物理方法包括（但不限於）完全 規避血-腦障壁，或藉由在血-腦障壁中形成開口。規避方 法包括（但不限於）直接注射至腦中（參見例如 Papanastassiou等人，TTzera/?;/ 9: 398-406 (2002))、間 質輸注/增強對流傳遞（參見例如Bobo等人，iVoc. JVW/. Acad· Sci. 91: 2076-2080 (1994))及將傳遞裝置植入腦 中（參見例如 Gill等人，ΙαίΜπ Med. 9: 589-595 (2003);及 Gliadel Wafers™，Guildford Pharmaceutical)。在障壁中形 成開口之方法包括（但不限於）超音（參見例如美國專利公開 案第2002/0038086號）、滲透壓（例如藉由投與高滲甘露糖 醇('NeMweh, Έ. A,, Implication of the Blood-Brain Barrier 治 Mam'pw/iziz’ow，第 1卷及第 2卷，Plenum Press，N.Y. 152844.doc -165 - 201130971 (1989)))、由例如緩激肽或滲透劑a-7滲透（參見例如美國 專利第5，112,596號、第5,268，164號、第5,506,206號及第 5,686,416號），及用含有編碼抗體之基因的載體轉染跨血_ 腦障壁之神經元（參見例如美國專利公開案第2003/0083299 號）。 跨越血-腦障壁轉運抗體之基於脂質之方法包括（但不限 於）將抗體囊封於與結合至血-腦障壁之血管内皮上之受體 之抗體結合片段偶合的脂質體中（參見例如美國專利申請 公開案第200200253 13號）’及將抗體塗覆於低密度脂蛋白 粒子上（參見例如美國專利申請公開案第20040204354號）或 載脂蛋白E(apolipoprotein E)上（參見例如美國專利申請公 開案第 20040131692號）。 跨越血-腦障壁轉運抗體之基於幹細胞之方法需要對神 經祖細胞（NPC)進行遺傳工程改造以使之表現相關抗體， 接著將幹細胞植入待治療個體之腦中。參見Behrstock等人 (2005) Gene 77/er 2005年12月15日提前在線公開（據報導， 經遺傳工程改造以表現神經營養因子GDNF之NPC當植入 齧齒動物及靈長類動物模型之腦中時減少帕金森氏病之症 狀）。 跨越血-腦障壁轉運抗體之基於受體及通道之方法包括 (但不限於）使用糖皮質激素阻斷劑增加血-腦障壁之滲透性 (參見例如美國專利申請公開案第2002/0065259號、第 2003/0162695號及第2005/0124533號）；活化鉀通道（參見 例如美國專利申請公開案第2005/0089473號）；抑制ABC藥 152844.doc -166 - 201130971 物轉運體（參見例如美國專利申請公開案第2〇〇3/〇〇737i3 5虎），以轉鐵蛋白塗覆抗體並調節一或多種轉鐵蛋白受體 之活性（參見例如美國專利申請公開案第2003/0129186 號）；及使抗體陽離子化（參見例如美國專利第5,〇〇4,697 號）。 以與良好醫學實務一致之方式調配、配給及投與本發明 之抗-Bv8抗體。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定 病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病 症之起因、藥劑之傳遞部位、投藥方法、投藥時程及開業 醫師已知之其他因素。抗-Bv8抗體未必需要但視情況與一 或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。該 等其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體之量、病症 或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一 般以與本文所述相同之劑量及投藥途徑使用，或以本文所 述劑量之約丨％至99%之量使用，或以憑經驗/臨床上確定 為適當之任何劑量及任何途徑使用。 為預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量（當單獨或 與一或多種其他額外治療劑組合使用時）將視待治療疾病 之類型、抗體類型、疾病之嚴重度及病程、投與抗體以供 達成預防抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對 抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體宜一次性或經 一系列治療投與患者。視疾病類型及嚴重度而定，抗體投 與患者之初始候選劑量可為約1 pg/kg至15 mg/kg(例如(Μ mg/kg至10 mg/kg)’無論例如藉由一或多次獨立投藥，或 152844.doc -167- 201130971 藉由連續輸注。一種典型曰劑量可在約1 pg/kg至l〇〇 mg/kg或100 mg/kg以上之範圍内，視上文所提及之因素而 定。對於經數天或更長時間重複投藥，視病狀而定，一般 將持續治療直至疾病症狀得到所要抑制為止。抗體之一種 例示性劑量將在約〇 〇5 mg/kg至約50 mg/kg之範圍内。因 此，可將約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg、10 mg/kg、 15 mg/kg、20 mg/kg或25 mg/kg中之一或多種劑量（或其任 何組合）投與患者《可間歇性地投與該等劑量，例如，每 隔一週或每隔三週（例如’以使得患者接受約2至約2〇次或 例如約6 -人抗體劑量）^可投與初始較高負荷劑量，隨後投 與一或多次較低劑量。例示性給藥方案包含投與約4 mg/kg之初始負荷劑量之抗體，隨後投與約2 之每週 維持劑量之抗體。《而，其他給藥方案可能適用。此療法 之進程容易藉由習知技術及檢定來監測。 診斷方法與偵測方法 本發明之抗-Bv8抗體適用於在特定細胞或組織中偵測 Bv8表現之檢定（諸如診斷或預後檢^ )，其中該等抗體如 下所述經標記及/或固定於不溶性基質上。 在另-態樣中，本發明提供债測Bv8之方法，該等方^ 包含债測樣品中之B亦抗·Bv8抗體複合物。如本文所用< :::偵測」包括在參考或不參考對照下進行定性及" 疋量偵測（量測水準）。 在另一態樣中，本發明提供太 ，、本文所述之抗-Βν8抗體中之 ，、中該抗·Βν8抗體包含可偵測標記。 152844.doc 201130971 在另‘4樣t ’本發明提供本文所述之抗_Bv8^體中之 任者與Bv8之複合物。在—些實施例中，該複合物 體内或活體外。在-些實施例中，該複合物包含癌細胞。 在一些實施例中，抗·Βν8抗體經可偵測地作標記。 在許多熟知偵測檢定法中之任一者甲，抗_歸抗體（例 如本文所述之Βν8抗體中之任一者）可用於偵測㈣。 ，The 舉例而言，可由以下方式檢定生物樣品中之Βν8 :自所 φ 要來源獲得樣品；將樣品與抗-Βν8抗體混合以使抗體與存 在於混合物中之任何Bv8形成抗體/Bv8複合物，且偵測存 在於混合物中之任何抗體/Bv8複合物。可由此項技術中已 知適於特定樣品之方法製備用於檢定之生物樣品。根據所 用檢定之類型選擇將樣品與抗體混合之方法及偵測抗體 /Bv8複合物之方法。該等檢定包括免疫組織化學檢定、競 爭檢定及夾層檢定，以及空間抑制檢定。對於樣品製備， 可使用來自哺乳動物（通常為人類患者）之組織或細胞樣 • 品。樣品之實例包括（但不限於）癌細胞，諸如結腸、乳 房、***、印巢、肺、胃、胰臟、淋巴瘤及白血病之癌 細胞。亦可量.測血清中之Bv8。可由此項技術中已知之多 種程序獲得樣品，包括（但不限於）手術切除、抽吸或活組 織檢查。組織可為新鮮或冷凍組織。在一個實施例中，將 樣品固定並嵌埋於石蠟或其類似物中。可由習知方法固定 (亦即保藏）組織樣品（參見例如「Manuai 〇f Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology j . % 3j&(1960) Lee G. Luna, HT (ASCP)^ 152844.doc -169- 201130971

Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York ; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced

Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel編 ’ Armed Forces Institute of Pathology， American Registry of Pathology，Washington，D.C.)。一般 熟習此項技術者應瞭解，固定劑之選擇係由樣品欲以組織 學方式染色或以其他方式分析之目的確定。一般熟習此項 技術者亦應瞭解，固定之時長視組織樣品之尺寸及所用固 定劑而定。舉例而言’可使用中性緩衝福馬林（neutral buffered formalin)、鲍音液（Bouin's)或多聚甲越來固定樣 品。一般而言，首先將樣品固定，接著經遞增系列之醇脫 水’滲透並嵌埋於石蠟或其他切片介質中，以使組織樣品 可切片。或者，吾人可將組織切片且固定所獲得之切片。 舉例而言，可由習知方法將組織樣品嵌埋於石蠟中並進行 加工（參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」（同上））。可用 石蠛之貫例包括（但不限於）paraplast、Broioid及 Tissuemay » —旦嵌埋組織樣品，即可由切片機或其類似 物件將樣品切片（參見例如「Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」（同上））。對於此程序’舉例而言，切片厚度可 在約3微米至約5微米之範圍内。一旦切片，即可藉由若干 標準方法使切片附著於載玻片。載玻片黏著劑之實例包括 (但不限於）矽烷、明膠、聚-L-離胺酸及其類似物。舉例而 152844.doc -170· 201130971 言’可使嵌埋於石蠟中之切片附著於帶正電之載玻片及/ 或塗覆有聚-L-離胺酸之載玻片。若已使用石蠟作為嵌埋 材料’則一般去除組織切片之石蠟且與水再水合。可由若 干習知標準方法去除組織切片之石蠟。舉例而言，可使用 二曱苯及逐步遞減系列之醇（參見例如「Manuai 0f Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology」（同上））。或者’可使用市售石蠟去除非有 機試劑，諸如 Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。

Bv8之分析方法皆使用以下一或多種試劑：經標記之 Bv8類似物、經固定之Bv8類似物、經標記之抗_Bv8抗 體、經固定之抗-Bv8抗體及空間結合物。經標記之試劑亦 稱為「示縱劑」。

所用標記為不干擾Bv8與抗-Bv8抗體結合之任何可偵測 功能物》已知許多用於免疫檢定之標記，實例包括可直接 偵測之部分，諸如螢光染料、化學發光劑及放射性標記； 以及必須經反應或衍生處理而得以偵測之部分，諸如酶。 所用標記為不干擾Bv8與抗-Bv8抗體結合之任何可偵測 功能物。已知許多用於免疫檢定之標記，實例包括可直接 偵測之部分，諸如螢光染料、化學發光劑及放射性標記； 以及必須經反應或衍生處理而得以偵測之部分，諸如酶。 該專標a己之貫例包括放射性同位素32p、1 ^1 a、 3H及 1311 ;螢光團，諸如稀土螯合劑或螢光素及其衍生物、若 丹明（rhodamine)及其衍生物、丹醯基、 傘酮；螢光素酶 例如螢火蟲螢光素酶及細 菌螢光素酶（美國專利第 152844.doc • 171 · 201130971 4,737,456號”蟲螢光素；2 3_二 酶(膽广鹼性磷酸酶；β_半二咎嗪二酮；辣根過氧化 溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄 酶’葡萄糖澱粉酶； 葡萄糖-6-磷酸去氫酶； 酶、半乳糖氧化酶及

翁Μ甘， 氧化酶’諸如尿酸酶及W 氧㈣’其與使用過氧化氣氧化染料前驅物之酶(；： 氧化酶或微過氧化酶)偶合;生物素 ^白，自旋體標記；較自由基；及其類似 可使用習知方法使此等標記與蛋白f或多肽共價結合。 舉例而言’可使用偶合劑使抗體經上述螢光標記、化學發 光標記及酶標記作標記，該等偶合劑為諸如二搭、碳化二 亞胺、二順丁稀二醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙重氮化聯苯胺 及其類似物。參見例如美國專利第3,94G，475號（螢光測定） 及第 3,645,090 號（酶）；Hunter 等人，·_，144: 945 (1962) ’ David等人，13: 1014-1021 (1974); Pain荨人，《/· /wmwwo/. A/W/zoi/i, 40: 219-230 (1981);及

Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)。本文中之較佳標記為酶，諸如辣根過氧化酶及鹼 性磷酸酶。該標記（包括酶）與抗體之結合為一般熟習免疫 檢定技術者之標準操作程序》參見例如O’Sullivan等人， 「Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay」,Methods in 幻;，J.J. Langone 及 H. Van Vunakis 編，第 73 卷 (Academic Press, New York，New York，1981) ’ 第 147-166 152844.doc -172- 201130971 頁。 某些檢疋法需要將試劑固定。固定需要將抗_Bv8抗體與 溶液中保持游離之任何Bv8分離。此通常由以下方式實 現：在檢定程序之前使抗-Bv8抗體或Bv8類似物不溶，如 藉由吸附於水不溶性基質或表面（Bennich等人，u s 3,720,760)，藉由共價偶合（例如使用戊二醛交聯），或藉由 隨後例如經免疫沈澱使抗_βν8抗體或Bv8類似物不溶。 可使用免疫組織化學及染色方案檢查樣品中蛋白質之表 現。組織切片之免疫組織化學染色已顯示為一種評估或偵 測樣品中蛋白質之存在的可靠方法。免疫組織化學 (「IHC」）技術一般藉由發色或螢光方法來利用抗體原位 探查並觀測細胞抗原。對於樣品製備，可使用來自哺乳動 物（通*為人類患者）之組織或細胞樣品。可由此項技術中 已知之多種程序獲得樣品，包括（但不限於）手術切除、抽 吸或活組織檢查。組織可為新鮮或冷凍組織。在一個實施 例中’將樣品固定並嵌埋於石堰或其類似物卜可由習知 方法固定（亦即保藏）組織樣品。一般熟習此項技術者應瞭 解’、固疋劑之選擇係由樣品欲以組織學方式染色或以其他 方式刀析之目的確定。一般熟習此項技術者亦應瞭解，固 疋之時長視組織樣品之尺寸及所用固定劑而定。 入111<：可與諸如形態染色及/或螢光原位雜交之其他技術組 口進仃。可利用兩種mc通用方法，亦即直接檢定與間接 檢疋。根據第一檢定，直接測定抗體與標靶抗原（例如 8)之結合。此直接檢定使用可在不存在進一步抗體相互 152844.doc -173 - 201130971 作用之情況下觀測之經標記試劑，諸如螢光標 之一次抗體。在典型間接檢定中，未結合之一次抗體=合 至抗原，接著經標記之二次抗體結合至一次抗體。在_ a 抗體結合至酶標記之情況下，添加發色或螢光受質以 測抗原。由於若干二次抗體可與一次抗體上之不同抗原決 定基反應，故出現信號擴增。 用於免疫組織化學之一次及/或二次抗體通常經可偵測 部分標記。可利用許多標記。 除上文所論述之樣品製備程序以外，可能需要在汨匸之籲 前、期間或之後進一步處理組織切片。舉例而言，可進行 抗原決定基修復法，諸如加熱檸檬酸鹽緩衝液中之組織樣 品（參見例如Leong等人却〆/w则⑽心讲4(3):2〇1 (1996))。 在視情況選用之阻斷步驟之後，在適合條件下使組織切 片與一次抗體接觸一段足夠長的時間，以使得一次抗體結 合至組織樣品中之標靶蛋白抗原。用於達成此目的之適當 條件可由常規實驗確定。藉由使用上文所論述之可偵測標 記中之任一者來測定抗體與樣品之結合程度。標記較佳為 催化發色受質（諸如3,3’_二胺基聯苯胺色原體）發生化學變 化之酶標記（例如HRP〇) ^較佳使酶標記與特異性結合至 -人抗體之抗體結合（例如—次抗體為兔多株抗體且二次 抗體為山羊抗兔抗體）。 可女置由此製備之樣本並以蓋玻片覆蓋。接著例如使用 顯微鏡s平估載玻片’且可採用此項技術常規使用之染色強 152844.doc •174· 201130971 度準則。 稱為競爭檢定或夾層檢定之其他檢定法經充分確立且廣 泛用於商業診斷行業中。 競爭檢定依賴於示蹤劑Bv8類似物能夠與測試樣品Bv8 競爭有限數目之抗-Bv8抗體抗原結合位點。一般在競爭前 或競爭後使抗-Βν8抗體不溶，接著將結合至抗-Βν8抗體之 不縱劑及Bv8與未結合之示蹤劑及Bv8分離。此分離係藉 φ 由傾析（在使結合搭配物預先不溶之情況下）或藉由離心（在 競爭反應之後使結合搭配物沈澱之情況下）實現。如標記 物物質之量所量測，測試樣品Bv8之量與所結合之示蹤劑 的量成反比。制定已知量之Bv8之劑量反應曲線，且與測 °式”。果相比較以定量測定測試樣品中所存在之Bv8的量。 田使用酶作為可偵測標記物時，此等檢定稱為elisa系 統。

另種類之競爭檢定，稱為「同源」檢定，不需要相分 離。此處，製備並使用酶與Bv8之結合物，以使得當抗_ 8抗體、合至Bv8時，抗_Bv8抗體之存在改變酶活性。 人此情況下’ Bv8或其免疫活性片段係經雙功能有機橋為 合至諸如過氧化酶之酶。選擇結合物以與抗抗體一走 使用，，使得抗·Bv8抗體之結合抑制或增強標記之酶活性。 此方法本身以名稱emit廣泛實施。 空間結合物用於均相衫之位阻方法中。此等結合物精 曰=低分子量半抗原與小型Bv8片段共價連接而合成， 吏仔針對半抗原之抗體實f上不能與抗姻抗體同時結合 I52844.doc •175· 201130971 結合物。在此檢定程序下，存在於測試樣品中之Bv8將結 合抗-Βν8抗體，藉此使得抗半抗原結合結合物，從而使結 合物半抗原之特徵改變，例如當半抗原為螢光團時使螢光 發生改變。 夾層檢疋尤其適用於測定Bv8或抗-Bv8抗體。在連續夾 層檢足中’使用經固定之抗_BV8抗體來吸附測試樣品 Bv8，藉由洗滌移除測試樣品’使用所結合之bV8來吸附 經標記之第二抗-Bv8抗體，接著將所結合之物質與殘餘示 縱劑分離。所結合之示縱劑的量與測試樣品之Bv8成正 比。在「同時進行」之夾層檢定中，在添加經標記之抗_ Βν8之前不分離測試樣品。使用抗·Βν8單株抗體作為一個 抗體且使用多株抗-Βν8抗體作為另一抗體之連續夾層檢定 適用於測試樣品之Bv8。 則述内谷僅為例示性之Bv8偵測檢定。現在或今後開發 的使用抗-Bv8抗體測定Bv8之其他方法包括於其範疇内， 包括本文所述之生物檢定。 在一個態樣中，本發明提供用以偵測來自個體（諸如人 類個體）之生物樣品中之聚核苷酸（例如Bv8聚核苷酸）（例如 存在與否或其量）的方法。可採用多種偵測聚核苷酸之方 法，且包括例如RT-PCR、探針法（taqman)、擴增法、聚核 苷酸微陣列及其類似方法。 偵測聚核苷酸（諸如mRNA)之方法為熟知的，且包括例 如使用互補DNA探針之雜交檢定（諸如使用經標記Bv8核糖 探針之原位雜交）、北方墨點法及相關技術，及各種核酸 152844.doc •176· 201130971 擴增檢定（諸如使用對Bv8具特異性之互補引子的RT_ PCR，及其他擴增型偵測方法，諸如分支DNA、SPIA、 Ribo-SPIA、SISBA、TMA及其類似方法）。 宜使用北方墨點法、點潰墨點法（dot blot)或PCR分析來 例如檢定來自哺乳動物之生物樣品的Bv8 mRNA。舉例而 言，諸如定量PCR檢定之RT-PCR檢定在此項技術中為熟知 的。在本發明之一個說明性實施例中，偵測生物樣品中之

Bv8 mRNA之方法包含藉由使用至少一個引子進行反轉錄 而自樣品產生cDNA ;使用Bv8聚核苷酸作為有義及反義引 子以擴增其中之cDNA來擴增由此產生之cdnA ;且偵測經 擴增之Bv8 cDNA的存在或不存在。另外，該等方法可包 括一或多個允許吾人測定生物樣品中Bv8 mRNA之量（含 量）的步驟（例如藉由同時檢查諸如肌動蛋白類成員之管家 基因之比較性對照mRNA序列的含量）。視情況，可確定經 擴增Bv8 cDNA之序列。 探針及/或引子可經可偵測標記物標記，諸如放射性同 位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、 金屬螯合劑或酶。該等探針及引子可用於㈣樣品中— 聚核苦酸之存在，且作為谓測表現Βν8蛋白質之細胞的手 段。熟習此項技術者應瞭解，可製備許多不同引子及探針 (例如基於本文所提供之序列）且有效地用於擴增、選殖及/ 或確定Bv8mRNA之存在或不存在及/或其量。 視情況選用之本發明方法包括如下方案：其包含使用微 陣列技術偵測組織或細胞樣品中之聚核芽酸，諸如BV8聚 152844.doc •177- 201130971 核苷酸。舉例而言’使用核酸微陣列，對來自測試及對照 組織樣品之測試及對照mRNA樣品進行反轉錄且經標記以 產生cDNA探針。接著使探針與固定於固體支撐物上之核 酸陣列雜交。陣列經組態以使得各陣列成員之序列及位置 已知。舉例而言，可使可能於某些疾病病況中表現之所選 基因於固體支撐物上排成陣列。經標記探針與特定陣列成 員之雜交表明探針所源於之樣品表現彼基因。疾病組織之 差別基因表現分析可提供有價值之資訊。微陣列技術利用 核酸雜交技術及計算技術以在單一實驗中評估數千基因之 mRNA表現圖譜（參見例如2〇〇丨年丨〇月i j曰公開之w〇 01/75166;參見例如 U.S. 5,700,637、美國專利 5 445 934 及 美國專利 5,807,522 ; Lockart，Nature Bioteehnol〇gy， 14:1675-1680 (1996); Cheung，V.G,等人， 21(增刊）.15-19 (1999)，關於陣列製造之論述）。]〇1^八微陣 列為含有直接於玻璃或其他基板上合成或點潰於其上之基 因片段的微型陣列。數千基因通常以單一陣列表示。典型 微陣列實驗包含以下步驟：丨.由自樣品分離之RNA製備經 螢光標記之標靶；2.使經標記之標靶與微陣列雜交；3•對 陣列進行洗滌、染色及掃描；4·分析掃描影像；及5產生 基因表現圖譜。當前使用兩種主要類型之DNA微陣列：寡 核苦酸（通常為25至70基體）陣列及含有自cDNA製備之pCR 產物的基因表現陣列。形成陣列時，可預先製造寡核苷酸 且將其點潰於表面上，或直接於表面上合成（原位卜

Affymetrix GeneChip®系統為市售微陣列系統其包含 152844.doc •178· 201130971 藉由在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而製造之陣列。探針/ 基因陣列：募核苷酸（通常為25基體），係藉由基於半導體 之光微影與固相化學合成技術之組合而直接在玻璃晶圓上 合成。各陣列含有至多400,000個不同寡核苷酸且各寡核 苷酸以數百萬個副本存在.因為寡核苷酸探針係於陣列上 之已知位置處合成，故雜交圖案及信號強度可由

Affymetnx Microarray Suite軟體依據基因一致性及相對表 φ 現量來解譯。各基因於陣列上由一系列不同寡核苷酸探針 表不。各探針對由完全匹配寡核苷酸及失配寡核苷酸組 成。完全匹配探針具有與特定基因精確互補之序列且因此 量測基因之表現。失配探針與完全匹配探針之不同之處在 於中心鹼基位置處之單一鹼基取代，其干擾標靶基因轉錄 物之結合。此幫助測定背景及有助於針對完全匹配寡核苷 酸所量測之信號的非特異性雜交。Micr〇array Suite軟體自 完全匹配探針之雜交強纟中扣除失配探針之雜交強度來測 • 定各探針組之絕對強度值或比強度值。基於當前資訊自 GenBank®及其他核苷酸儲存庫中選擇探針。咸信該等序列 識別基因3’端之獨特區域。使用GeneChip®雜交烘箱（「電 轉烤肉架式（rotissede)」烘箱）來一次性地進行至多64個陣 歹J之雜交。流體化工作台（fluidics stati〇n)執行探針陣列之 洗滌及染色。其為全自動的且含有四個模組，各模組固持 一個探針陣列。使用預定程式之流體化方案經Micr〇array Smte軟體獨立地控制各模組。掃描器為共焦雷射螢光掃描 器，其由結合至探針陣列之經標記cRNA量測所發出之螢 152844.doc -179- 201130971 光強度。具有Microarray Suite軟體之電腦工作台控制流趙 化工作台及掃描器。Microarray Suite軟體可使用預定程式 之探針陣列雜交、洗滌及染色方案控制至多8個流體化工 作台。該軟體亦擷取雜交強度數據且使用適當算法將該數 據轉換成各基因之存在/不存在命令。最後，該軟體藉由 比較分析來偵測各實驗之間基因表現的變化且將輸出結果 格式化為.txt檔案，其可用於進一步數據分析之其他軟體 程式t。 在一些實施例中，治療係針對選自由以下組成之群的癌 φ 症：結腸直腸癌、肺癌、卵巢癌、垂體癌、胰臟癌、*** 纖維腺瘤、***癌、頭頸鱗狀細胞癌、軟組織肉瘤、乳 癌、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌、胃癌、結腸直腸癌 (CRC)、上皮癌、腦癌、子宮内膜癌、畢丸癌、膽管癌、 膽囊癌及肝細胞癌。 生物樣品描述於本文中，例如在生物樣品之定義中。 製品

在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、 :及二或診斷上文所述病症之物質的製品。該製品包含 窃及谷态上或與容器相關聯之標籤或藥品說明書。適合 容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由諸如玻: 塑膠之多種材料形成。容器容納單獨之組合物或與有效 療、預防及/或診斷病狀之另-組合物的組合，且可呈 無菌接取口 (例如容器可為靜脈内溶液袋或具有可由； 注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中至少-種活性劑 152844.doc •180· 201130971 本發明之抗體。標籤或藥品說明書指示組合物用 選病狀，諸如癌症。此外，製品可包含㈣中容㈣合物 之第-容器’纟中該組合物包含本發明之抗體；及㈨其中 容納組合物之第二容器。本發明之此實施例中之製品^進 一步包含指示第一抗體組合物及第二抗體組合物可用於治 療特定病狀（例如癌症）之藥品說明書。或者或另外，製品 可進一步包含第二（或第三）容器，其包含醫藥學上可接$ 之緩衝液，諸如抑菌注射用水（BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食 Jm'水林格氏溶液（RinSer’s solution)及右旋糖溶液。其可 進一步包括就商業及使用者之角度而言合乎需要之其他物 質’包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，可在上 文所提供之一般描述下實施各種其他實施例。 實例 除非另有指示’否則實例中所提及之市售試劑係根據製 造商之說明書使用。 實例1 :產生抗_Bv8抗體 此實例展示針對Bv8之鼠類抗-Bv8抗體的人類化。殘基 編號係根據Kabat(Kabat等人，Sequences of proteins of immunol〇gical interest，第 5 版，Public Health Service， National Institutes of Health, Bethesda，MD (1991))。使用 單字母胺基酸縮寫。 產生源自融合瘤之抗^抗體 藉由用重組人類Βν8細胞外域多肽（PeproTech，Rock 152844.doc 201130971

Hill，NJ)使小鼠或倉鼠免疫來產生抗-Bv8抗體。選擇來源 於小鼠融合瘤之純系2G9、2B9、3F1，其包含圖2A、2B、 3A、3B、4A及4B中所闡述之可變輕鏈（VL)及可變重鏈 (VH)序列。亦選擇來源於倉鼠融合瘤之純系2D3，其包含 圖5A及5B中所闡述之VH及VL序列。 選殖源自融合瘤之抗-Bv8抗體可變域且產生嵌合抗體 使用 RNeasy Mini 套組（目錄號 74104 ; QIAGEN ； Valencia，CA)分別自產生小鼠抗-Bv8單株抗體2B9、3F1及 2G9以及倉鼠抗-Bv8單株抗體2D3融合瘤細胞中提取總 RNA。使用具有以下合併引子之RT-PCR來擴增可變輕鏈 (VL)及可變重鏈（VH)域： 2B9輕鏈（LC)正向引子： 5 ’GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCAGCAATMA3’（SEQ ID NO:225) 2B9重鏈（HC)正向引子： ’GATCGACGTACGCTCAGGTGACKCTGAARGAGTCWGG3’（SEQ IDNO:226) 3F1輕鏈（LC)正向引子： 5OTACGATATCGTKCTSACCCARTCTCC35 (SEQ ID NO:227) 3F1重鏈（HC)正向引子： 5,GATCGACGTACGCTCAGGTGACKCTGAARGAGTCWGG3, (SEQ ID NO:228) 2G9輕鏈（LC)正向引子： 5 ’ GTACGATATCGTKCTSACCCARTCTCC 3 ’（SEQ Κ) NO:229) 2G9重鏈（HC)正向引子： OATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG3,（SEQ ID NO:230) 2D3輕鏈（LC)正向引子： 152844.doc -182- 201130971 5’ GATCGATATCCARATGACNCARACNCC 3’（SEQ ED NO:231) 2D3重鏈（HC)正向引子： 55 GATCGA CGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG35 (SEQ ID NO:232) 輕鏈反向引子：5’GCTGTAGGTGCTGTCTTTGCT3’（SEQIDNO:233) 重鏈反向引子：5’CTGGW(：AGGGMT(XAGAGTT(XA3MSEQIDMa234) 所示引子序列根據以下IUB代碼： IUB代碼 G鳥嘌呤 A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 C胞嘧啶 R(A 或 G) Y(C 或 T) M(A 或 C) K(G 或 T) S(C或 G) W(A 或 T) H(A或C或T) B(C或G或T) V(A或C或G) D(A或G或T) N(A或C或G或T) 正向引子特異性針對VL區及VH區之N端胺基酸序列。 輕鏈（LC)及重鏈（HC)反向引子分別經設計以黏接至在物種 152844.doc -183- 201130971 之間高度保守之恆定輕鏈域（CL)及恆定重鏈域1 (CH1)中之 區域。 隨後使經擴增之PCR產物接合至TA選殖載體（Invitrogen， Carlsbad，CA)並進行定序。接著將所鑑別之VL DNA序列 次選殖至含有人類κ恆定域之pRK哺乳動物細胞表現載體 (Carter 等人，ZVoc. Natl. Acad. Sci. USA, 89，4285-4289 (1992))中。將VH DNA序列***編碼全長人類γΐ恆定域之 pRK載體中。 使用 Fugene轉染試劑（Roche, Mannheim, Germany)將 LC 及HC表現載體共同轉染至經腺病毒轉化之人類胚腎細胞 株293中。在無血清培養基中產生抗體且藉由蛋白質A層析 來純化。 將高變區移植物引導至接受體人類共同構架上 此項工作所用之噬菌粒為單價Fab-g3呈現載體且由2個 處於單一 phoA啟動子控制下之開放閱讀框架組成。第一開 放閱讀框架由stll信號序列融合至接受體輕鏈之VL及CL域 組成，且第二開放閱讀框架由stll信號序列融合至接受體 重鏈之VH及CH1域、繼之以次要噬菌體鞘蛋白P3組成。 在產生抗-Bv8抗體之CDR-移植變異體之前，將小鼠抗 體之可變輕鏈（VL)及可變重鏈（VH)域之序列與人類共同序 列比對。 對於純系2B9及3F1，人類共同輕鏈κ l(huKI)與人類共 同重鏈亞群III(huGIII)為最接近之人類構架，且將小鼠 2B9(m2B9)及小鼠3Fl(m3Fl)輕鏈及重鏈序歹ij之高變區分 152844.doc -184- 201130971 別移植至huKI及huGIII共同接受體構架中，以產生直接 CDR-移植變異體，稱為h2B9.vl(圖6A及6B)及h3Fl.vl(圖 4A及 4B)。 值得關注的是，對於純系2G9，與小鼠2G9最接近之人 類構架為人類共同輕鏈κ IV(huKIV)及人類共同重鏈亞群 I(huGI)。因此，最初將小鼠2G9(m2G9)輕鏈及重鏈之高變 區不僅分別移植至huKI及huGIII中，而且分別移植至 huKIV及huGI共同接受體構架中，以產生4種不同CDR-移 植變異體，標識為h2G9.KlGl、h2G9.KlG3、h2G9.K4Gl 及h2G9.K4G3(圖14及15)。減去Kabat輕鏈HVR序列之人類 VL κ亞群IV共同構架序列以SEQ ID NO:240展示。減去重 鏈HVR序列之人類VH亞群I共同構架序列以SEQ ID NO:241展示。參見圖1G。在VL域中，將以下區域移植至 人類共同接受體中：L1中之位置24-34、L2中之位置50-56 及L3中之位置89-97。在VH域中，移植H1中之位置26-35 ; H2中之位置49-65、71及73 ;及H3中之位置95-102。 藉由使用針對各高變區之獨立寡核苷酸，以呈現於噬菌 體上之Fab形式及IgG形式進行Kunkel突變誘發來產生直接 CDR-移植變異體（h2B9.vl ' h3Fl.vl、h2G9.KlGl、 h2G9.KlG3、h2G9.K4Gl、h2G9.K4G3)。藉由 DNA定序來 鑑別正確純系。 選擇及潤飾人類化2G9.K4G1 如本文所述，藉由Biacore，使用BIAcore™-3000儀器來 量測4種CDR-移植抗-Bv8抗體變異體h2G9.KlGl、 152844.doc -185- 201130971 h2G9.KlG3、h2G9.K4Gl及 h2G9.K4G3之結合親和力。另 外，如本文所述進行腎上腺皮質内皮細胞（ACE)增殖檢 定，以研究4種變異體之Bv8中和活性。 BIAcore分析結果顯示，在高濃度分析下，變異體 h2G9.KlGl 及 h2G9.KlG3 與 h2G9.K4Gl 及 h2G9.K4G3 相比 具有顯著較快之解離速率（off-rate)。此外，ACE增殖檢定 顯示，在4種變異體中，變異體h2G9.K4Gl具有最佳活 性，因為其幾乎完全阻斷Bv8與ACE細胞之結合。然而， BIAcore分析及ACE增殖檢定表明h2G9.K4G 1抗-Bv8抗體之 結合親和力及中和活性仍低於嵌合2G9抗-Bv8抗體。因 此，選擇抗-Bv8抗體h2G9.K4Gl用於親和力成熟以進一步 改良其結合親和力。 在開始抗-Bv8抗體h2G9.K4Gl之親和力成熟之前，分析 HVR序列之潛在穩定性問題，涉及製造過程中之異構化、 未配對半胱胺酸及去醯胺化。在以下位點處鑑別出潛在問 題：⑴輕鏈可變序列之位置28及29處之相鄰殘基；（ii)重 鏈可變序列之位置52a ; (iii)重鏈可變序列之位置54 ;及 (iv)重鏈可變序列之位置95及96處之相鄰殘基。 產生在上文所提及之殘基位置處具有單一胺基酸取代之 抗-Bv8抗體h2G9.K4Gl變異體，且各變異體以Fab形式呈 現於噬菌體上。產生具有以下單一胺基酸修飾之總共12種 變異體，且藉由噬菌體競爭ELISA評估其結合親和力： CDR-L1-D28E、D28S、G29A、G29S ; CDR-H2-C52aA、 C52aS、N54A、N54S ; CDR-H3:D95E、D95S、G96A、 152844.doc _ 186 · 201130971 G96S。12種變異體與h2G9.K4Gl相比較之結合親和力展示 於圖14A及14B中。圖式展示大部分變異體保持類似或稍 有改良之結合親和力。令人驚訝的是，在CDR-H3中具有 D95S取代之變異體對1 μΜ人類Bv8完全喪失結合性。此 外，在CDR-H3中具有D95E取代之變異體與h2G9.K4Gl相 比顯示結合親和力顯著下降100倍。 藉由組合以下全部4種胺基酸取代而產生標識為 h2G9,K4Gl.Polish 之純系· CDR-L1-D28S;CDR-H2-C52aS、N54S ; CDR-H3:G96S。BIAcore 分析顯示嵌合 2G9 Fab及h2G9.K4Gl.Polish Fab具有類似結合親和力，且嵌合 2G9 IgG與h2G9.K4Gl.Polish IgG均顯示完全阻斷Bv8誘導 之 ACE 細胞增殖（圖 21)。此外，在0011-1^1-0288;€011-H2-C52aS、N54S ; CDR-H3:G96S處之胺基酸取代（抗 _Bv8 抗體h2G9.K4Gl .Polish)出乎意料地使結合親和力恢復至接 近於嵌合2G9抗-Bv8抗體之結合親和力。 對高變區進行軟性隨機化 使用維持偏重於鼠類高變區序列之軟性隨機化策略將序 列多樣性引入各高變區中以進一步改良針對純系 h2G9.K4Gl.Polish之親和力。此係使用由Gallop等人，X MeA CTiem. 37:1233-1251 (1994)首次描述之中毒寡核苷酸 合成策略來實現。對於高變區内有待突變之特定位置，用 核苷酸之70-1 0-1 0-1 0混合物使編碼野生型胺基酸之密碼子 中毒，從而在各位置處產生平均50%之突變率。軟性隨機 化寡核苷酸在鼠類高變區序列之後圖案化，且涵蓋由直接 152844.doc -187- 201130971 高變區移植物界定之相同區域。 產生禮菌體文庫 在37°C下，在6個含有660 ng寡核苷酸、50 mM Tris(pH 7.5)、10 mM MgCl2、1 mM ATP、20 mM DTT及 5 U 聚核苷 酸激酶之20 μΐ反應物中獨立地使針對各高變區進行設計之 隨機化寡核苷酸庫磷酸化，持續1小時。接著在50 mM Tris(pH 7.5)、10 mM MgCl2中將6個經峨酸化之寡核苷酸 庫與20 pg Kunkel模板組合，最終體積為500 μΐ，從而使 得寡核苷酸與模板之比率為3。在90°C下使混合物黏接4分 鐘，在50°C下黏接5分鐘，接著於冰上冷卻。使用修改方 案，用QIAquick PCR純化套組（目錄號28106 ; QIAGEN Inc.，Valencia, CA)移除未黏接之過量寡核苷酸以防止黏接 之DNA過度變性。向500 μΐ黏接混合物中添加150 μΐ PB， 且將混合物分配給2個二氧化矽管柱。用750 μΐ PE洗滌各 管柱且超自旋（extra spin)乾燥管柱之後，用110 μΐ之10 mM Tris、1 mM EDTA(pH 8)溶離各管柱。接著在室溫下 藉由添加 1 μΐ 100 mM ATP、10 μΐ 25 mM dNTP(dATP、 dCTP、dGTP及 dTTP各 25 mM)、15 μΐ 100 mM DTT、25 μΐ l〇x TM 緩衝液（0.5 M Tris(pH 7.5)、0.1 M MgCl2)、2400 U T4接合酶及30 U T7聚合酶來填充經黏接並清潔之模板 (220 μΐ)，持續3小時。 在Tris-乙鹽酸-EDTA/瓊脂糖凝膠上分析填充產物（Sidhu 等人，ί/ϊ 少328:333-363 (2000))。通常 可見三個區帶：底部區帶為正確填充並接合之產物、中間 152844.doc • 188- 201130971 區帶為經填充但未接合之產物，且頂部區帶為置換股之產 物。頂部區帶係由T7聚合酶之固有副活性產生且難以避免 (Lechner等人’ 乂 仏〇/· CTie/n. 258:11174-11184 (1983)); 然而’此區帶轉化之有效性為頂部區帶之3〇分之一且通常 對文庫之貢獻極小。中間區帶係由於最終接合反應缺乏51 磷酸所致；此區帶有效轉化，但遺憾的是主要得到野生型 序列。 $ 接著清潔填充產物並電穿孔至SS320細胞中，且在 M13/K07輔助噬菌體存在下繁殖，如sidhu等人，办 ζ·«五《zywo/ogj; 328:333-363 (2000)中所述。文庫大小在 1至 2 X 109個獨立純系之範圍内。對來自初始文庫之隨機純系 進行定序以評估文庫品質。 選擇噬菌體 將人類Bv8(PeproTech)用作噬菌體選擇之標靶。在第一 輪淘選中，將含10 pg/ml人類Bv8之PBS塗覆於MaxiSorp微 φ 量滴定盤（Nunc)上。對於第一輪選擇，使用8個標靶孔； 單一標乾孔用於連續數輪選擇。使用超級阻斷劑（SUper Blocker，Pierce)阻斷各孔1小時。自培養物上清液收集噬 菌體且使其懸浮於含有1% BSA及0.05% TWEEN 20之 PBS(PBST)中。結合至各孔2小時之後，藉由用含有〇 〇50/〇 Tween 20之PBS(PBT)充分洗滌來移除未結合之噬菌體。藉 由用50 mM HC1、0·5 M KC1培育該等孔30分鐘來溶離經結 合之嗤菌體。使用XL1藍細胞（Strategene)及Μ13/Κ07輔助 '噬菌體（New England BioLabs)使噬菌體繁殖並擴增，且在 152844.doc •189· 201130971 37C下於2YT、50 pg/ml羧苄青黴素（carbenaciUin)中生長 隔夜以供下一輪淘選。將自經標靶塗覆之孔溶離之噬菌體 的效價與自未經標靶塗佈之孔回收之噬菌體的效價相比較 以評估富集。 在第二輪分選開始時，使用溶液分選方法來分選噬菌體 文庫（Lee，C.V.等人（2〇〇4) «/· Af〇/·价0/ 3扣(5): 1〇73_93)， 此允許吾人增加選擇嚴格度以分離親和力改良之純系。使 用磺酸基-NHS-LC-生物素（b-Bv8，· Pierce，Rockford，IL)使 人類Bv8l合生物素。在4c下用含1〇 gg/mi中性鏈親和素 (neutravidin)之PBS塗覆微量滴定孔隔夜，接著使用超級阻 斷劑（Pierce)阻斷1小時。對於第二輪選擇，在室溫（RT)下 將懸浮於PBST緩衝液中之200 菌體與5 nM bBv8混合 2小時。在室溫下將結合至b_Bv8之噬菌體捕捉經中性鏈親 和素塗覆之孔上，維持15分鐘，且用PBT緩衝液洗去未結 合之噬菌體。如上所述，使用1〇〇 mM HC1溶離噬菌體3〇 分鐘，中和並繁殖。類似於第2輪選擇進行以下數輪選 擇，但具有以下不同：在第3輪及第4輪中，最終b_Bv8濃 度為0·1 nM;在第5輪中，最終b-Bv8濃度為〇·〇5 nM。在 噬菌體與b-Bv8結合之後，開始第4輪及第5輪，在室溫下 將500倍及1 〇〇〇倍過量之未結合生物素之人類Bv8分別添加 至混合物中1至2小時，以在捕捉於中性鏈親和素上之前競 爭淘汰解離速率較快之結合劑。 進行嗟菌體競爭EL1SA以測定嗤菌體1C50 用含2 重組人類Bv8(PeproTech)之PBS塗覆 152844.doc •190- 201130971 ]^八乂18011?1^微量滴定盤隔夜，接著在室溫下用PBST緩衝 液（含0.5% BSA及0.05% Tween 20之PBS)阻斷1小時。在室 溫下將來自培養物上清液之噬菌體與含連續稀釋之人類 Bv8之PBST緩衝液一起在組織培養微量滴定盤中培育1小 時，其後，將80 μΐ混合物轉移至經標靶塗覆之孔中，維持 15分鐘，以捕捉未結合之噬菌體。用ΡΒΤ緩衝液（含0.05% Tween 20之PBS)洗蘇該盤，且添加與HRP結合之抗· M13(Amersham Pharmacia Biotech)(l:5000，於 PBST緩衝 液中），持續40分鐘。用ΡΒΤ緩衝液洗滌該盤，且藉由添加 四曱基聯苯胺受質（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg，MD)顯色。繪製450 nm下之吸光度隨溶液中 之標靶濃度而變之曲線，以測定噬菌體IC50。此用作呈現 於噬菌體表面上之Fab純系之親和力估算結果。圖14A及 14B描繪噬菌體競爭檢定之結果，其展示經潤飾之 h2G9.K4Gl 變異體（LI : D28E、D28S、G29A、G29S ; H2 : C52aA、C52aS、N54A、N54S ; H3 : D95E、D95S、 G96A及G96S)對人類Bv8之結合。圖16及17描繪噬菌體競 爭檢定之結果，其展示親和力改良之h2G9.K4Gl .Polish變 異體（來自L1/L2軟性隨機化文庫之h2G9.K4Gl.v27、v52、 v55、v63、v64、v67、v77、v80 ;來自 H1/H2軟性隨機化 文庫之h2G9.K4Gl.vl9、v25、v37、v65、v73、v75、 v77、v92)對人類Bv8之結合。 由BIAcore測定抗體親和力 對於抗-Bv8抗體（Fab或IgG)之結合親和力測定，使用 152844.doc -191 - 201130971 BIAcoreTM-3000儀器進行表面電漿子共振（SRP)量測。簡言 之，根據供應商之說明書使用EDC及NHS試劑活化CM5生 物感測器晶片，且偶合人類Bv8(PeproTech)或食蟹猴 (Cynomologus Monkey)Bv8(Genentech ; PUR21 590)以達到 約1 50個反應單位（RU)，隨後以1 Μ乙醇胺阻斷未反應之基 團。為進行動力學量測，在25°C下以30 μΐ/rnin之流動速率 注射含抗-Bv8 Fab之兩倍連續稀釋（0.19 nM至25 nM)或IgG 之兩倍連續稀釋（0.019 nM至10 nM)的HBS-P緩衝液（0.01 Μ HEPES(pH 7.4)、0.15 M NaC卜 0.005%界面活性劑 P20)。 使用簡單的一對一朗繆爾結合模型（BIAcore評估軟體3.2 版）計算締合速率（kQn)及解離速率（kw)。根據比率kaff/kon 來計算平衡解離常數（Kd)。參見圖18至21。結果顯示人類 化抗-Bv8 抗體 h2G9.K4Gl.vl9 及 h2G9.K4Gl.v55 結合至人 類Bv8及食蟹猴Bv8之緊密程度至少為嵌合2G9抗-Bv8抗體 的兩倍。 ACE增殖檢定 將ACE細胞以每孔5000個細胞之密度接種於6孔盤中之 生長培養基中。.對於抑制檢定，首先添加指定濃度 (pg/mL)之抗-Bv8抗體。0.5至1小時後，接著添加人類 Bv8(Peprotech)達到10 nM之最終濃度。6天後，藉由添加1 ml 2χ胰蛋白酶（GIBCO)至各孔中而使細胞解離，且使用Z2 柯爾特粒子計數與尺寸分析器（Z2 coulter particle count and size analyzer，Beckman Coulter)對一式兩份之孔進行 計數。參見圊12、13、15、23及24。圖23展示人類化抗- 152844.doc -192- 201130971

Bv8抗體 h2G9K4Gl.vl9、h2G9K4Gl.v52、h2G9K4Gl.v55 及h2G9K4Gl.v73在阻斷人類Bv8誘導之ACE增殖方面顯示 顯著改良。 進行競爭ELISA以對Bv8抗體抗原決定基繪圖 用含1 pg/mL嵌合2B9 IgG之PBS塗覆NUNC™ 96孔 Maxisorp免疫盤（NUNC ; Roskilde，Denmark)隔夜，接著在 室溫下用PBST緩衝液（含0.5% BSA及0.05% Tween 20之 PBS)阻斷1小時。使用EZ-連接磺酸基-NHS-LC-生物素（目 錄號 21335 ; Pierce ; Rockford，IL)試劑以 1:4 之莫耳比 (HuBv8:生物素）來製備經結合生物素之人類Bv8。 為在競爭檢定中測定經結合生物素之人類Bv8的量，將 自100 nM三倍連續稀釋至0.04 nM之經結合生物素之人類 Bv8添加至經抗體塗覆之盤中，持續15分鐘。接著，用 PBT緩衝液（PBS及0.05% Tween 20)洗滌該等盤。使用抗生 物素蛋白鏈菌素偵測經結合生物素之物質，使其與辣根過 氧化酶（目錄號21126 ; Pierce ; Rockford，IL)結合且用 PBST緩衝液以1:2500稀釋。培育45分鐘後，洗滌該盤且將 100 μί四甲基聯苯胺(R&D Systems)添加至各孔中，持續 約5分鐘以誘導信號顯示。當出現藍色時，向各孔中添加 100 μί之1 Μ磷酸以終止顯示過程。以分光光度計在450 nm下讀取光學密度。 為對Bv8抗體抗原決定基與嵌合2B9繪圖，在室溫下將 IgG(嵌合2B9、嵌合3F1、嵌合2D3 '嵌合2G9及對照IgG) 之三倍連續稀釋液首先與含2 nM經結合生物素之人類 152844.doc •193- 201130971

Bv8(藉由上述結合檢定測定）之PBST緩衝液一起培育1至2 小時，接著將其轉移至經抗體（嵌合2B9 IgG ; 1 pg/mL)塗 覆之盤上，維持15分鐘。接著用PBT緩衝液洗滌該盤，且 由如上所述之方案偵測盤上結合至嵌合2B9 IgG的經結合 生物素之人類Bv8之量。 在競爭檢定中’嵌合3F1及嵌合2G9抗體與嵌合2B9競爭 結合至人類Bv8，表明兩種抗體均具有與嵌合2B9重疊之 抗原決定基。然而，嵌·合2D3僅顯示部分地與欲合2B9抗 體競爭結合至人類Bv8，表明嵌合2D3抗體可能具有與嵌 合2B9以及嵌合3F1及嵌合2G9抗體不同之抗原決定基（圖 11)。 實例2:活體内功效研究 自美國菌種保存中心（Manassas, VA)獲得人類HT-55、 C〇1〇-205(結腸直腸癌）、A673(橫紋肌肉瘤）、HPAC(胰臟 癌）及Calu-6(肺癌）細胞。人類結腸直腸癌HM7細胞株為LS 174T之衍生物。使Calu-6、A673、HPAC及HM7於漢氏 F12、低葡萄糖DMEM 1:1中生長。使c〇l〇-205及HT-55於 RPMI 1640培養基中生長。兩種培養基均補充有1〇% v/v FBS、1% v/v 青徽素 / 鍵徽素（penicillin/streptomycin) (Invitrogen，Carlsbad, CA)、2 mM L-麵醯胺酸（invitr〇gen， Carlsbad, CA)及 1 pg/ml FUNGIZONETM(invitr〇gen，Carlsbad, CA)。在37Ϊ下使細胞於5% C02中生長至匯合，將其收集 且以每毫升15 X106個細胞再懸浮於無菌Matrigel中。藉由 向每隻小鼠之背側皮下（S.C.)注射1 ·5X 1 〇6個細胞而將異種 152844.doc *194· 201130971 移植物接種於6至8週齡之BALB/c裸小鼠（Charles River ; Hollister，CA)體内且使之生長。在接種腫瘤細胞之後24小 時，開始每週兩次以1 0 mg/kg之劑量，經腹膜内（i.p.)，用 以下抗-Bv8抗體處理：嵌合2D3、嵌合3F1、嵌合2B9及嵌 合2G9 ;人類化2G9變異體19、人類化2G9變異體55及人類 化2G9.K4Gl.Polish。吾人採用每週兩次10 mg/kg之抗-GP-120 Mab及每週兩次5 mg/kg之抗-VEGF Mab G6.31或B20作 為對照（Liang，W.C.等人，C/zem 2W, 951-961 (2006))。在所有實驗中，藉由使用測徑規，每週兩次沿著 最長軸及垂直軸量測移植之腫瘤。使用橢圓體體積公式 (0.5 xLxWxW)計算腫瘤體積，且在所有處理組中來自每組 1 〇隻小鼠之平均腫瘤體積及標準誤差示於圖上。抗-Bv8抗 體與抗-VEGF抗體組合使用時，亦對LXFL529人類非小細 胞肺癌具有加和效應。將LXFL529人類非小細胞肺癌細胞 植入米色裸小鼠（n=7至9)中。接著，在腫瘤接種之後24小 時内用對照抗-豬草（Ragweed) 1428及抗-Bv8小鼠抗體（3F1 及2B9)處理小鼠。在腫瘤達到約400 mm3之後，用抗-VEGF抗體處理小鼠。結果顯示使用嵌合及人類化抗-Bv8 抗體單劑及與抗-VEGF抗體之組合處理會減緩各種腫瘤之 腫瘤生長。參見圖25至37。 自美國菌種保存中心（Manassas，VA)獲得小鼠LLC(路易 斯肺癌（Lewis lung carcinoma))、人類H460(非小細胞肺癌） 及HT29(結腸直腸癌）細胞。在含10%胎牛血清（Hyclone ; Logan, UT)之RPMI 1640培養基力口上1% L_麩醯胺酸中培養 152844.doc -195- 201130971 LLC及HM7細胞。在37°C下使細胞於5% C02中生長，將其 收集’離心’用漢克氏平衡鹽溶液（Hanks’ balanced salt solution，HBSS)洗滌一次且進行計數。將^!^細胞再懸浮 於 50% HBSS及 50% MatrigelTM(BD Biosciences ; San Jose, CA)中’且將HM7細胞再懸浮於HBSS(Invitrogen ; Carlsbad，CA)中’兩者之濃度均為3.5x 1〇7個細胞/毫升， 以供注射至小鼠體内。在含1 〇%胎牛血清、1 〇〇單位/毫升 青黴素G、100 pg/mL硫酸鍵徽素、1 mM丙_酸鈉、2 mM 麩醯胺酸、10 mM HEPES、0.075%碳酸氫鈉及25 pg/mL健 他黴素（gentamicin)之RPMI-1640培養基中培養H460細胞。 在37°C下於5% C〇2及95%空氣之氛圍中，在含濕氣培育箱 中於組織培養瓶中培養細胞’接著收集，且以5 X1 〇7個細 胞/毫升之濃度再懸浮於碟酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS)中， 以供注射至小鼠體内。最初自ATCC獲得HT29細胞，隨後 藉由連續皮下移植入無胸腺裸小鼠體内將所得異種移植腫 瘤維持為活體内細胞株，接著移植以進行實驗。藉由向每 隻小鼠之之背側皮下（S.C.)注射3.5X 106個細胞而將LLC細 胞接種於8至9週齡之雌性BALB/c裸小鼠（Charles River, Hollister, CA)體内，且使之生長成同種異體移植物。藉由 向每隻小鼠之後腿皮下注射3.5 X 106個細胞而將HM7細胞接 種於12週齡之雌性無胸腺裸小鼠（Harlan spragUe Dawley，Inc ; Frederick，MD)體内；藉由向每隻小鼠之背 側皮下注射1 χ 1 07個細胞而將H460細胞接種於10至11週齡 之雌性無胸腺裸（ww/«u)小鼠（Harlan Sprague Dawley，Inc ; 152844.doc •196- 201130971

Frederick, MD)體内；且將1 mm3之HT29腫瘤片段皮下植 入11至12週齡之雌性無胸腺裸（《«/««)小鼠（Harlan Sprague Dawley, Inc ; Frederick, MD)之體側。每週兩次以 10 mg/kg 腹膜内給與抗-Bv8抗體嵌合2D3、鼠類3F1及鼠類2B9，且 每週一次以30 mg/kg腹膜内給與人類化抗-Bv8抗體2G9。 吾人每週兩次以30或100 mg/kg腹膜内投與抗-豬草MAb且 每週兩次以5 mg/kg腹膜内投與抗-VEGF MAb B20-4.1.1， 作為對照。在細胞接種或腫瘤移植（HT29)之後的以下時長 處開始處理：對於LLC為7小時，對於HM7為8天，對於 H460為11天，及對於HT29為36天。量測腫瘤及體重，且 在研究持續時間内每週至少進行兩次一般臨床觀測。使用 橢圓體體積公式（〇.5xLxWxW)計算腫瘤體積。為分析相同 動物之腫瘤體積隨時間變化之重複量測結果，使用混合模 型化方法，且產生擬合之腫瘤體積數據（Pinheiro等人nlme: linear and nonlinear mixed effects models; 2009; R版套裝 3.1-96版）。建構卡普蘭-邁爾曲線（Kaplan-Meier plot)以顯 示研究中存活之動物隨時間變化之百分比。使用鼠類及人 類化抗-Bv8抗體單劑及與抗-VEGF抗體之組合處理會減緩 各種腫瘤之腫瘤生長（參見圖38至40及圖42)且延長存活（參 見圖41及43)。 實例3 :進行競爭性ELISA以量測人類化抗-Bv8抗體阻 斷人類Bv8結合至小鼠2G9抗體之能力 在4°C下，用含1 pg/ml親本小鼠2G9 IgGl抗體之50 mM 碳酸鈉緩衝液（？119.6)以25微升/孔塗覆1^3\丨8〇” 384孔盤 152844.doc -197- 201130971 隔夜。用含有0.05%聚山梨醇酯（pH 7.4)之磷酸鹽緩衝生理 食鹽水（PBS)洗滌盤’且用含有0.5% BSA、10 ppm 卩1*〇(^11&117.4)之？88以80微升/孔阻斷。在室溫下培育1小 時後，洗滌盤。以25微升/孔添加於含有0.5% BSA、0.05% 聚山梨酸酯20(pH 7.4)之PBS中之連續稀釋人類化2G9抗體 (0.11 pM至180 nM)與經結合生物素之人類Bv8(最終濃度為 0.5 ng/ml或57 pM)的混合物。培育兩小時後，洗滌盤且添 加與辣根過氧化酶結合之抗生物素蛋白鏈菌素（GE Healthcare)。培育最後30分鐘之後，洗滌盤且添加受質 3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺（Kirkegaard & Perry Laboratories) 〇 藉由添加1 Μ填酸來終止反應，且使用Multiskan Ascent讀 取器（Thermo Scientific，Hudson, NH)在 450 nm下讀取吸光 度。為進行數據分析，使用四參數非線性回歸曲線擬合程 式來擬合滴定曲線，且測定IC50濃度（KaleidaGraph， Synergy Software，Reading, PA) ° 結果顯示，人類化抗-Bv8抗體h2G9.K4Gl_vl9、 h2G9.K4Gl.v52 、h2G9.K4Gl.v55 、h2G9.K4Gl.v73 及 h2G9.K4Gl.vl9H/v55L與嵌合 2G9及 h2G9.K4Gl.Polish抗-Bv8抗體相比，阻斷人類Bv8與小鼠2G9抗體之結合的能力 較大。參見圖22。 本發明通篇引用之所有參考文獻皆以全文引用的方式明 確併入本文中。 雖然已參考特定實施例描述本發明，但應瞭解，本發明 並不限於該等實施例。相反，本發明欲涵蓋隨附申請專利 152844.doc -198. 201130971 範圍之精神及範疇内所包括的各種修改及相等物。 在本申請案通篇，包括申請專利範圍中，術語「包含」 用作包括性、開放式的過渡片語，其並不排除其他未列舉 之元件或方法步驟。 【圖式簡單說明】 圖1A-F展示抗-Bv8抗體之輕鏈及重鏈HVR環序列。圖式 展示輕鏈HVR序列LI、L2及L3，及重鏈HVR序列HI、H2 及H3。各抗體之序列編號如下：嵌合2G9(HVR-H1為SEQ ID NO:49 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:50 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:51 ; HVR-L1 為 SEQ ID NO:52 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:53 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:54) ; h2G9.K4Gl.Polish (HVR-L1 為 SEQ ID NO:55 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:56 ;

HVR-L3 為 SEQ ID NO:57 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:58 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:59 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:60); h2G9.K4Gl.vl9(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:61 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:62 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:63 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:64 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:65 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:66) ; h2G9.K4Gl.v25(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:67 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:68 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:69 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:70 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:71 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:72) ; h2G9_K4Gl.v27(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:73 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:74 ; HVR-L3 為 SEQ ID N0.75 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:76 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:77 ; HVR-H3為 SEQ ID NO:78) ; h2G9.K4Gl.v37(HVR- 152844.doc -199- 201130971 L1 為 SEQ ID NO:79 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:80 ； HVR-L3 為 SEQ ID NO:81 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:82 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:83 ； HVR-H3 為 SEQ ID NO:84);

h2G9.K4Gl.v52(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:85 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:86 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:87 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:88 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:89 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:90) ; h2G9.K4Gl.v55(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:91 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:92 ; HVR-L3為 SEQ ID NO:93 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:94 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:95 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:96) ； h2G9.K4Gl.v63(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:97 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:98 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:99 ; HVR-H1 為 SEQ ID N0:100 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:101 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:102) ; h2G9.K4Gl.v64 (HVR-L1 為 SEQ ID NO:103 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:104 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:105 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:106 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:107 ; HVR-H3為 SEQ ID NO:108); h2G9.K4Gl.v65(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:109 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:110 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:lll ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:112 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:113 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:114) ; h2G9.K4Gl.v67(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:115; HVR-L2 為 SEQ ID NO:116; HVR-L3 為 SEQ ID NO:117 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:118 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:119 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:120) ; h2G9.K4Gl_v73 (HVR-L1 為 SEQ ID NO:121 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:122 ; 152844.doc -200- 201130971 HVR-L3 為 SEQ ID NO:123 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:124 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:125 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:126); h2G9,K4Gl.v75(HVR-Ll 為 SEQ ID NO: 127 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:128 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:129 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:130 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:131 ; HVR-H3 為

SEQ ID NO:132) ; h2G9.K4Gl.v77(HVR-Ll 為 SEQ ID

NO:133 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:134 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:135 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:136 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:137 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:138) ; h2G9.K4Gl.v80 (HVR-L1 為 SEQ ID NO:139 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:140 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:141 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:142 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:143 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:144); h2G9.K4Gl.v92(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:145 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:146 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:147 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:148 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:149 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:150) ; h2G9.K4Gl.vl9H/v55L(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:151 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:152 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:153 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:154 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:155 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:156);喪合 2B9(HVR-L1 為 SEQ ID NO:157 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:158 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:159 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:160 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:161 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:162) ; h2B9.vl (HVR-Ll 為 SEQ ID NO:163 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:164 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:165 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:166 ; 152844.doc -201 - 201130971

HVR-H2 為 SEQ ID N〇:167 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:168); h2B9.vlO(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:169 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:170 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:171 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:172 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:173 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:174) ; h2B9.v23(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:175 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:176 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:177 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:178 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:179 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:180) ; h2B9.v37(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:181 ; HVR-L2 為 SEQ ID N〇:182 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:183 ; HVR-H1 為 SEQ ID n〇:184 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:185 ; HVR-H3 為 SEQ ID n〇:186); h2B9.v56(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:187 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:188 ; HVR-L3 為 SEQ ID

NO:189 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:190 ; HVR-H2為 SEQ ID

NO:191 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:192) ; h2B9.v76(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:193 ; HVR-L2 為 SEQ ID NO:194 ; HVR_L3 為 SEQ ID NO:195 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:196 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:197 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:198);嵌合 3F1(HVR-L1 為 SEQ ID NO:199 ; HVR-L2 為 SEQ ID N0:200 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:201 ; HVR-H1 為 SEQ ID

NO:202 ; HVR-H2 為 SEQ ID NO:203 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:204) ; h3Fl.vl(HVR-Ll 為 SEQ ID NO:205 ; HVR-L2為 SEQ ID NO:206 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:207 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:208 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:209 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:210);及嵌合 2D3(HVR-L1 為 SEQ ID NO:211 ; 152844.doc •202- 201130971 HVR-L2 為 SEQ ID NO:212 ; HVR-L3 為 SEQ ID NO:213 ; HVR-H1 為 SEQ ID NO:214 ; HVR-H2為 SEQ ID NO:215 ; HVR-H3 為 SEQ ID NO:216)。 胺基酸位置係根據如上所述之Kabat編號系統來編號。 圖1G展示減去Kabat輕鏈HVR序列之人類VL κ亞群IV共 同構架序列以SEQ ID NO:240展示。減去Kabat重鏈HVR序 列之人類VH亞群I共同構架序列以SEQ ID NO:241展示； 圖2A-1至2B-2展示抗-Bv8抗體2G9變異體之（A)輕鏈可變 域及（B)重鏈可變域之胺基酸序列。位置係根據Kabat來編 號且高變區加框； 圖3A-B展示抗-Bv8抗體2B9變異體之（A)輕鏈可變域及 (B)重鏈可變域之胺基酸序列。位置係根據Kabat來編號且 高變區加框； 圖4A-B展示抗-Bv8抗體3F1變異體之（A)輕鏈可變域及 (B)重鏈可變域之胺基酸序列。位置係根據Kabat來編號且 高變區加框； 圖5A-B展示抗-Bv8抗體2D3變異體之（A)輕鏈可變域及 (B)重鏈可變域之胺基酸序列。位置係根據Kabat來編號且 南變區加框； 圖6A-1至6B-2展示人類化抗-Bv8抗體2B9變異體之（A)輕 鏈可變域及（B)重鏈可變域之胺基酸序列。位置係根據 Kabat來編號且高變區加框； 圖7A-B展示輕鏈可變域胺基酸序列，其展示（1)小鼠 2G9(m2G9)構架序列及人類共同κ I構架序列與（2)m2G9構 152844.doc -203 - 201130971 架序列及人類共同κ IV構架序列之間的差異。位置係根據 Kabat來編號且高變區加框； 圖8A-B展示重鏈可變域胺基酸序列，其展示（1)小鼠 2G9(m2G9)構架序列及人類共同亞群I(G1)構架序列與 (2)m2G9構架序列及人類共同亞群III(G3)構架序列之間的 差異。位置係根據Kabat來編號且高變區加框； 圖 9展示抗-Bv8抗體 h2G9.K4Gl.Polish、h2G9.K4Gl.v27、 h2G9.K4Gl.v52 、 h2G9.K4Gl.v55 、 h2G9.K4Gl.v63 、 h2G9.K4Gl.v64 、 h2G9.K4Gl.v67 、 h2G9.K4Gl.v77 及 h2G9.K4Gl.v80之L1、L2及L3胺基酸序列； 圖 10 展示抗-Bv8 抗體 h2G9.K4Gl.Polish 、 h2G9.K4Gl.vl9 、h2G9.K4Gl.v25 、h2G9.K4Gl.v37 、 h2G9.K4Gl.v65 、h2G9.K4Gl.v73 、h2G9.K4Gl.v75 、 h2G9.K4Gl.v77、h2G9.K4Gl.v92 之 HI、H2 及 H3 胺基酸序 列； 圖11展示嵌合2D3抗體可具有不同於嵌合2B9以及嵌合 3F1及嵌合2G9抗體之抗原決定基。ELISA競爭檢定展示嵌 合3F1及嵌合2G9抗體與結合至人類Bv8之嵌合2B9競爭。 嵌合2D3僅部分地與結合至人類Bv8之嵌合2B9抗體競爭； 圖12屐示小鼠2G9、嵌合2G9、小鼠2B9、嵌合2B9及嵌 合3F1對人類Bv8誘導之ACE細胞增殖的阻斷。檢定結果展 示嵌合2G9能夠完全抑制人類Bv8誘導之ACE細胞增殖； 圖 13展示嵌合 2G9、h2G9.K4Gl、h2G9.K4G3、h2G9.KlGl 及h2G9.KlG3抗-Bv8抗體對人類Bv8誘導之ACE細胞增殖 152844.doc -204- 201130971 的阻斷。檢定結果展示嵌合2G9抗-Bv8抗體在20 pg/mL抗 體濃度下具有最高阻斷活性； 圖14A-B描繪噬菌體競爭檢定之結果，其展示 h2G9.K4Gl 變異體（LI : D28E、D28S、G29A、G29S ; H2 : C52aA、C52aS、N54A、N54S ; H3 : D95E、D95S、G96A及 G96S)對人類Bv8之結合； 圖15展示嵌合2G9及h2G9.K4Gl.Polish抗-Bv8抗體對人 類Bv8誘導之ACE細胞增殖的阻斷； 圖16描繪噬菌體競爭檢定之結果，其展示親和力改良之 h2G9.K4Gl .Polish變異體（來自L1/L2軟性隨機化文庫之 h2G9.K4Gl.v27、v52、v55、v63、v64、v67、v77、v80) 對人類Bv8之結合； 圖17描繪噬菌體競爭檢定之結果，其展示親和力改良之 h2G9.K4Gl.Polish變異體（來自H1/H2軟性隨機化文庫之 h2G9.K4Gl.vl9、v25、v37、v65、v73、v75、v77、v92) 對人類Bv8之結合； 圖18展示以下針對人類Bv8之抗-Bv8抗體（Fab)的解離常 數：h2G9.K4Gl.Polish、h2G9.K4Gl.vl9、h2G9.K4Gl.v52、 h2G9.K4Gl.v55 及 h2G9_K4Gl.v73 ; 圖19展示針對人類Bv8及食蟹猴Bv8之人類化抗-Bv8抗 體（Fab 及 IgG)h2G9.K4Gl.vl9 及 h2G9.K4Gl.v55 的解離常 數； 圖20展示在25°C下於人類Bv8固定化81八〇〇^晶片上注射 50 nM抗-Bv8 Fab抗體之感測器圖譜，其展示解離速率改 152844.doc -205- 201130971 良； 圖21展示以下針對人類Bv8及食蟹猴Bv8之抗-Bv8抗體 (IgG)的解離常數：嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9及h2G9.K4Gl.v55。 結果展示人類化抗-Bv8抗體h2G9.K4Gl.vl9及 h2G9.K4Gl.v55之親和力似乎至少為嵌合2G9抗-Bv8抗體 的兩倍； 圖22展示人類化抗-Bv8抗體阻斷人類Bv8與小鼠2G9抗 體之結合。五種親和力成熟人類化抗-Bv8抗體 (h2G9.K4Gl.vl9、h2G9.K4Gl.v52、h2G9.K4Gl.v55、 h2G9.K4Gl.v73 及 h2G9.K4Gl.vl9H/v5 5L)之阻斷能力約為 經潤飾之親本K4G1分子的5至8倍； 圖 23 展示嵌合 2G9、h2G9K4Gl.Polish、h2G9K4Gl.vl9、 h2G9K4Gl.v52、h2G9K4Gl.v55及 h2G9K4Gl.v73抗-Bv8抗 體在指定濃度bg/mL)下對人類Bv8誘導之ACE細胞增殖的 阻斷。人類化抗-Bv8抗體 h2G9K4Gl.vl9、h2G9K4Gl.v52、 h2G9K4Gl.v5 5及h2G9K4Gl.v73展示在阻斷人類Bv8誘導 之ACE增殖方面有顯著改良； 圖 24 展示 h2G9K4Gl.Polished 、 h2G9K4Gl.vl9 、 h2G9K4Gl.v55及嵌合2D3抗-Bv8抗體在指定濃度（pg/mL) 下對小鼠Bv8誘導之ACE細胞增殖的阻斷； 圖25展示嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3及嵌合2G9 抗-Bv8抗體對治療HM7人類結腸癌之功效研究； 圖26展示嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3及嵌合2G9 抗-Bv8抗體對治療A673人類橫紋肌肉瘤之功效研究； 152844.doc •206- 201130971 圖27展示嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3及嵌合2G9 抗-Bv8抗體對治療HT55人類結腸癌之功效研究； 圖28展示嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3及嵌合2G9 抗-Bv8抗體對治療Calu-6人類肺癌之功效研究； 圖29展示嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3及嵌合2G9 抗-Bv8抗體對治療Colo-205人類結腸癌之功效研究； 圖30屐示嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3及嵌合2G9 抗-Bv8抗體對治療HPAC人類胰臟癌之功效研究； 圖 31展示嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9 及 h2G9.K4Gl.v55 抗-Bv8抗體對治療Calu-6人類肺癌之功效研究； 圖 32 展示嵌合 2D3、h2G9.K4Gl.Polish、h2G9.K4Gl.vl9 及h2G9.K4Gl.v55抗-Bv8抗體對治療HM7人類結腸癌之功 效研究； 圖 33 展示嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9 及 h2G9.K4Gl.v55 抗-Bv8抗體對治療A673人類橫紋肌肉瘤之功效研究； 圖 34展示嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9 及 h2G9.K4Gl.v55 抗-Bv8抗體對治療HT5 5人類結腸癌之功效研究； 圖 35 展示嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9 及 h2G9.K4Gl.v55 抗-Bv8抗體對治療Colo-205人類結腸癌之功效研究； 圖 36展示嵌合 2G9、h2G9.K4Gl.vl9及 h2G9.K4Gl.v55 抗-Bv8抗體對治療HPAC人類胰臟癌之功效研究； 圖37展示在存在及不存在抗-VEGF抗體之情況下抗-Bv8 小鼠抗體（3F1及2B9)對治療LXFL529人類非小細胞肺癌細 胞之功效研究； 152844.doc -207· 201130971 圖38展示路易斯肺癌（LLC)同種異體移植物對抗-Bv8抗 體單劑或與抗-VEGF抗體之組合起反應而使生長受抑制； 圖39展示HM7人類結腸直腸癌異種移植物對抗-Bv8抗體 單劑或與抗-VEGF抗體之組合起反應而使生長受抑制； 圖40展示H460人類非小細胞肺癌異種移植物對抗-Bv8抗 體與抗-VEGF抗體之組合起反應而使生長受抑制； 圖41展示帶有H460人類非小細胞肺癌異種移植物之小鼠 對抗-Bv8抗體與抗-VEGF抗體之組合起反應而使存活延 長； 圖42展示HT29人類結腸直腸癌異種移植物對單獨 抗-Bv8抗體或與抗-VEGF抗體之組合起反應而使生長受抑 制；及 圖43展示帶有HT29人類結腸直腸癌異種移植物之小鼠 對單獨抗-Bv8抗體或與抗-VEGF抗體之組合起反應而使存 活延長。 152844.doc -208 - 201130971 序 列表 <110>美商建南德克公司 <120>抗-BVS抗體及用途 <130> P4373R1 <140> 099145312 <141> 2010-12-22 <150> 61/284,743; 61/414,052 <151> 2009-12-23; 2010-11-16 <160> 24】

<210> 1 <211> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 1

Asp lie Vai Met llu Gin Ser Fro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly G)u Arg Ala Tbr lie Asn Cys Lys Scr Scr Gin Ser Val Leu 20 25 30

Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 丁yr Gin Gin Lys 35 40 45

Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tvr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60

Glu Ser Gly Va] Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala 80 S5 90

Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly

95 100 105

Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Atg 110 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 2

Glu Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 3 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Tlu Phe Thr 20 25 30

Ser Tyr Tyr ile His 丁rp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp He Gly Trp He Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr 50 55 60

Aia Gin Lys Phe Gin Gly Arg Val Thr He Thr Arg Asp Thr Ser 65 70 75 152844-序列表.doc 201130971

Thr Ser Thr Ala Tyr Leu GIu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 95 100 105

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 3

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro GJy 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60

Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Asn He His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys Arg 110 <210> 4 <211> 121 <2]2> PRT <213>人工序列 <220>

<223>序列經合成 <400> 4

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Thr Giy 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Asp Met His 丁rp Val Lys Gin Ser Gin Gly Lys Ser Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr ΊΙιγ Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Ser γΠιγ Thr Ala Tyr Met Gin Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Giy Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser 110 115 120 152844·序列表.doc 201130971

Scr <210> 5 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 5

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ssr Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Scr Gly Scr Gly Thr Asp Phc

65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 80 S5 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe ΊΊιγ Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys Arg 110 <210> 6 <211> 121 <2]2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 6

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly ] 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp He Gly Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr lie rHir Val Asp Lys Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Scr Glu Asp 80 S5 90

Thr Aia Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Tyr G]y Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Va] Ser 110 115 120

Ser <210> 7

<211> 112 <212> PRT 152844-序列表.doc 201130971 <2Π>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 7

Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Scr Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu 】le Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 110 <210> 8 <211> 121

<212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 8

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 J5

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu ΊΉγ 20 25 30

Asn Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Tyr lie His Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser <2I0> 9 <2tl> 112 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 9 4-

152844-序列表.doc 201130971

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Leu lie 20 25 30

Tyr Gly Ala Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu ilc Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Thr 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Tlir Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys Arg 110

<210> 10 <211〉 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 10

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe ΊΙίγ 20 25 30

Asp Tyr Asp Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Gin Trp lie Gly 丁yr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Aia Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Ixu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr I-eu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser <210> 11 <21!> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 11

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu ] 5 10 15

Gly G]u Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Leu Asp 20 25 30 152844·序列表.doc 201130971

Tyr Tyr His Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Cly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 80 85 90 丁yr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 110 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <2〗3>人工序列 <220>

<223>序列經合成 <4〇〇> 12

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Scr Giy Tyr Ser Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu 丁rp lie Gly Tyr lie Ser Sei* Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr He rrhr Val Asp Lys Ser 65 ' 70 75

Thr Ser Thi. Ala Tyr Leu (ilu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> )3

Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 1 5 10 15

Gly Gla Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60 152844·序列表.doc 201130971

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 llir Leu Thr lie Ser Scr Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Tin Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 110 <210> 14 <2U> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 14

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys AJa Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

His Tyr Asp Met His 了rp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Tyr He Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Thr He Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly ITir Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser

<210> 15 <211> 112 赢 <212> PRT 〇 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4〇0> 15

Asp lie Val Mel Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ala Ser Gin Ser Leu Asp 20 25 30

Tyr Tyr His Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Scr Gly Ser Gly Thr Asp Phe '65 70 75

Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 80 85 90 152844·序列表.doc 201130971

Tyr Cys Gin Gin He Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Tnr Lys Val Glu He Lys Arg 110 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 16

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu rFhr 20 25 30

Asn Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Jle Gly Tyr He His Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val ΊΙιγ lie Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Tin Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Scr Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 丨05

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val ΊΤίγ Val Ser 110 115 120

Ser <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 17

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Set* Gin Ser He Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin l.,ys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Fro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg -8 -

152844-序列表.doc 201130971 <230> 18 <2Π> 109 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 18

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu 丁rp Val Ser Val lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr 50 55 60

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 65 70 75

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 80 85 90

Glu Asp Tlir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr Trp 95 100 105

Gly Gin Gly Thr <210> 19 <211> 107 <212> FRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 19

Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro 1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thx Ser Pro Lys Tlu 35 40 45

Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser 65 70 75

Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr 丁yr Tyr Cys G]n Gin Trp 80 85 90

Ser vSer Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly ITir Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg 成 列合 序經 4T工 列 2011PR人 序 0>1>2>3>0>3> τ» Τ* 11 11* O'J 2222 22 < < < < < < <400> 20 152844-序列表.doc 9- 201130971

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser 15 10 15

Gin Thr Leu Ser Leu rFhr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Tlir lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Ser Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala 80 85 90

Asp Thr Ala ΊΉγ Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <210> 21 <2Π> 107 <2I2> PRT <2Γ3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 21

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro 1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Thr 35 40 45

Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly llir Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser 65 70 75

Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Ser Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210> 22 <23l> 114 <212> PR丁 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <_> 22

Gin Val Thr Leu Lys Giu Ser Gly Pro Gly He Leu Gin Pro Scr 15 10 15

Gin Tlir Leu Ser Lea Thr Cys Scr Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 35 40 45 -10- 152844·序列表.doc 201130971

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Ττρ Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp ΙΉγ 65 70 75

Ser Ser Asn G】n Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala 80 85 90

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe rFhr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 23

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Scr Ala Ser Val

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Scr Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser 丁yr Asp Pro Met Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg

<210> 24 <211> 114 ▲ <212> PRT ^ <2丨3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 24

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly

15 10 IS

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 80 85 90 -11 - 152844·序列表.doc 201130971

Asp rfhr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Asp Tyr Trp City Gin Gly Thr 110 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 25

Asp He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Glu Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Asp Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Leu Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Asn Leu Leu lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 50 55 60

Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Asn He His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr 80 85 90

Ser Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 95 W0 105

Tin Lys Val Glu Jle Lys Arg 110 <210> 26 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <·220> <223>序列經合成 <400> 26

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Pro Val Glu Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Ser 丁rp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45

Glu 丁rp lie Gly Arg ile Asp Pro Scr Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Ser Ser rrhr Ala Tyr lie His Leu Ser Ser Leu Tlir Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Tyr Asp Gly Phe 95 丨00 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 115

<210> 27 <211> 112 <212> PRT •】2-

152844·序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 27

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Va] Ser Leu 15 10 15

Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Glu Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Asp Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Leu Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Asn Leu Leu lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser 50 55 60

Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala ΊΤιγ Tyr 80 85 90

Ser Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys Arg no <210> 28 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 28

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Fro Val Glu Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Tlir 20 25 30

Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Arg Gly Leu 35 40 45

Glu Trp He Gly Arg He Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Ser Ser Thr A]a Tyr He His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr 丁yr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Tyr Asp Gly Phe 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 115 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 29

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15 -13- 152844-序列表.doc 201130971

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Glu Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Asp Asp Ser Tyr Met Asn Trp 丁yr Gin Leu Lys Pro Gly 35 40 45

Lvs Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser ' 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe vSer Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Tin* Tyr 80 85 90

Ser Cys Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Va】Glu lie Lys Arg 110 <2I0> 30 <21L> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 30

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Giy 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30

Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Arg lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Asp Arg Ala Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Tyr Asp Gly Phe 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Giy Gin Gly Thr 110 115 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 31

Asp He Gin Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu 15 10 15

Gly Asp Arg Val Ser lie I'hr Cys Lys Ser Ser Glu Tyr Val Ser 20 25 30

Asn Ala Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Val Ser Gly Thr Asn Lys Leu Glu Asp Giy Val Pro Ser 50 55 60 -14-

152844·序列表.doc 201130971

Arg Fhe Ser Gly Ser G)y Ser Gly ΊΤιτ Gin Phe Ser Leu GIu He 65 70 75

Ser Ser Leu Glu AJa Asp Asp Ser Gly lie Tyr Fhe Cys Gin Gin 80 85 90

Gly Tyr Asp lie Pro Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210〉 32 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 32

Glu V7al Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly He Val Lys Pro Ala 15 10 15

Gly Ser Leu Gin Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Asp Tyr Phe Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Gly He Asp Thr Lys Ser Tyr Asn Tyr Ala Thr 50 55 60

Tyr Tyr Ser Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 65 70 75

Asp Ser Gin Ser Met Val Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Thr 80 85 90

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asn Tyr Gly Asn Tyr 95 100 105

Gly Ala Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr 110 115 <210> 33 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 33

Asp lie Gin Met Thr G]n Thr Pro Scr Ser Leu Ser Val Ser Leu 15 10 15

Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ser Ser Glu Tyr Val Ser 20 25 30

Asn Ala Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Val Ser Gly Thr Asn Lys Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly llir Gin Phe Ser Leu Glu He 65 70 75

Ser Scr Leu Glu Ala Asp Asp Ser Gly lie Tyr Phe Cys Gin Gin 80 85 90

Gly Tyr Asp lie Pro Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105 -15- 152844-序列表.doc 201130971

Lys Arg <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 34

Glu Va] Gin Leu Val Clu Ser Gly Gly Gly tie Val Lys Pro Ala 15 10 15

Gly Ser Leu Gin Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Asp Tyr Phe Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Ala Gly lie Asp Ήιγ Lys Ser Tyr Asn Tyr Ala Thr 50 55 60

Tyr Tyr Ser Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp 65 70 75

Asp Ser Gin Ser Met Val Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Thr 80 85 90

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys ΙΉγ Arg Asn Tyr Gly Asn Tyr 95 100 105

Gly Ala Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr 110 115 <210> 35 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 35

Asp lie Val Leu Ήίγ Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro 15 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pile 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Tlu 35 40 45

Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 11)r Ser Tyr Ser Leu Thr l]e Ser 65 70 75

Asn Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Ser Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210> 36 <211> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220> •16-

152844-序列表.doc 201130971 <223>序列經合成 <400> 36

Gin Val Thr Leu Lys GIu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Scr 15 10 15

Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Giy Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Ήιγ Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Tht He Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Ser Asn Gin Val Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Tlir Ala 80 85 90

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Giy Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr

no <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 37

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr 35 40 45

Trp lie 丁yr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thx Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Ser Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210> 3S <2ll> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 38

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Leu Lea Ser 20 25 30 -17· 152844-序列表,doc 201130971

Thr Ser Gly Wet Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp rrhr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu BO 85 90

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Tip Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <210> 39 <211> 107 <2i2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 39

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Glti Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr 35 40 45

Trp He Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly tSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Tht He Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe A1a Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Phe Asp Pro lie Thr Phe Gly Gin Gly Ήίγ Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210> 40 <211> 114 <212〉 PR丁 <2丨3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 40

Glu Va! Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly GJy Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Mel Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr 11c Ser Lys Asp Thr 65 70 75 •】8 -

152844-序列表.doc 201130971

Set Lys Asn llir Val Tyr Leu Gin Met Asn Scr Leu Arg Ala Glu 80 85 90

Asp rIlir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 41

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr 35 40 45

Trp lie 丁yr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Trp Glu Pro Leu Hir Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210> 42 <211> 114 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 42

Glu Va) Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His He Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60 丁yr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 80 85 90

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Asp 丁yr 丁rp Gly Gin Gly Thr 110 •19· 152844-序列表.doc 201130971 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 43

Asp lie Gin Met Tlir Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Ser Ala Ser Ser Pro Val Phe 20 25 30

Tyr Mel His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys ΊΙιγ 35 40 45

Trp lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Scr Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phc Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Tyr Glu Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <210〉 44 <211> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 44

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His He 丁yr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Tlir 65 70 75

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Mel Asn Ser Leu Arg Ala Glu 80 85 90

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <2i0> 45 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 45 20-

152844-序列表.doc 201130971

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie llir Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr 35 40 45

Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phe Ser Gly Scr Gly Ser Gly Ήιγ Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro GIu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Ser Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg

<210> 46 <211> Π4 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4〇〇> 46

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Tyr He Ser 20 25 30

Thr Pro Gly Met Gly Val Ser Trp Va] Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Lea Ala His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Scr Arg Uu Thr lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 80 85 90

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105 丁rp Phe Asp 丁yr Trp Giy Gin G]y Thr 110 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 47

Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr 35 40 45 -21 · 152844-序列表.doc 201130971

Trp lie Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60

Phc Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thi Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala ΊΙιγ Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp 80 85 90

Ser Tyr Asp Pro Met Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 95 100 105

Lys Arg <2]0> 48 <211> 114 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 48

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gty Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Leu Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys

35 40 AS

Gly Leu Glu Trp Leu Ala His He Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg 50 55 60

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Lys Asn ΊΉγ Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 80 85 90

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp His Gly Tyr Tyr 95 100 105

Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 110 <2!0> 49 <211> 15 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 49

Lys Ala Scr Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 50

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210> 51 <211> 9 <212> PRT -22-

152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 51

Gin Gin He Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 52 <211> 10 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 52 G]y Tyr Scr Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 10 <210> 53 <211> 17 <212> PRT <2]3>人工序列 coon-s. 胃序列經合成 <400> 53

Tyr lie Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 54 <m> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 54

Asp Gly Asn Tyr Gly Giu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 !0

<210> 55 <231> 15 <212> PRT ^ <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 55

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met ^sn 15 10 15 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 56

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<2i0> 57 <2!1> 9 <212> PRT 23- 152844·序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 57

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 58 <211> 10 <2i2> PR丁 <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 58

Gly Tyi· Ser Plie Thi· Asp Ty】· Asp Met His 5 10 <210> 59 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 59

Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <>60

Asp Ser Asn Tyr Gly Giu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 63 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 61

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 62 <211> 7 <212> PRT c213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 62

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210> 63 <21l> 9 <212> PRT 24- 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 63

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 64

Gly Tyr Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Met His 5 10 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 65

Tyr lie His Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 66 <211> 12 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 66

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <2i3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 67

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4O0> 68

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210> 69 <211> 9 <212> PRT 25- 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 69

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 70 ,.

Gly Tyr Ser Leu Phe His Tyr Asp Mel His <2)0> 71 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> 序列經合成 <400> 71

Tyr lie Ser Thr Tyr Tlir Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe I 5 10 15

Lys Gly <210> 72 <2Π> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 72

Asp Ser Asn Tyr Gly Giu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <2i0> 73 <211〉15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 73

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 74 <2\\> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 74

Ala Ala Scr Asn Leu Glu Ser

<210> 75 <211> 9 <212> PRT 26-

152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 75

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 76

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 10

<210> 77 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <223>序列經合成 <400> 77

Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 78 <21i> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4〇〇> 78

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 79 <21]> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 79

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 80 <21 ]> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 80

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210> 81 <21.1> 9 <2I2> PRT 27- 152844·序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 81

Gin Gin lie Asn Glu Asp Fro Phe Thr <210> 82 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 82

Gly Tyr Ser Phe Thr His Tyr Asp Met His 5 10 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> S3 丁yr Jle Ser Thr Tyr Ala Gly Glu Thi. Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <2)0> 84 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <>84

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 85

Lys Ala Ser Gin Ser Leu lie Tyr Gly Ala Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 86

Aia Aia Ser Asn Arg Glu Thr

<210> 87 <211> 9 <2I2> PRT 28-

152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 87

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 88 <2U> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 88

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 10 <210> 89 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 89

Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 90 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 90

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 91

Lys Ala Ser Gin Ser Leu Asp Tyr Tyr His Tyr Scr Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 92

Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser

<210> 93 <211> 9 <212> PRT 29. 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 93

Gin Gin tie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210〉 94 <2ll> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 94

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His <210> 95 <211> 17 <2I2> PRT <213>人工序列

<220> 序列經合成 <>95

Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr ]yr Asn Gin Lys Phe l 5 10 15

Lys Gly <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 96

Asp Scr Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10

<210> 97 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <>97 Lys Ala

SerG.n Ser Va. Asp Tyr Tyr G,y Asp Ser Tyr Met A, <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 98

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Thr

<210> 99 <21l> 9 <212> PRT 30- 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 99

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phc Thr 5 <210> 100 <211> 10 <212> PR丁 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 100

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 10 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 101

Tyr l]e Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 1 5 10 15

Lys Gly <210> 102 <2U> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 102

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 103

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 】04

Ala Ala Ser Asn Arg Glu Scr

<210> 105 <21 ]> 9 <212> PRT 31· 152844·序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 105

Gin Gin He Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 106

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 1.0 <210> 107 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 107

Tyr lie Sei· Ser Tyr Ser Gly Ala Thr 丁hr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 108 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 108

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Mel Asp Tyr 5 10 <210> 109 <211> 15 <212> PKT <2i3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 109

Lys Aia Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> U0 <2U> 1 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 110

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210> 111 <211> 9 <212> PRT 32·

152844-序列表.doc 201130971 <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 111

Gin Gin He Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 112 <211〉 10 <212> ?KT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 112

Gly Tvr Thr Phe Met His Tyr Asp Met His 5 10 <210> 113 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 113

Tyr lie Ser Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 114

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala ‘Met Asp 丁yr 5 10 <210> 115 <21l> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 115

Lys Ala Ser Gin Ser Leu Asp 丁yr Trp Val Asp Ser 丁yr Met Asn 15 10 15 <2i0> 116 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 116

Ala Ala Ser Asn Arg Glu Thr

<210> 117 <21l> 9 <212> PRT 33· 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 117

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 118 <2ll> 10 <212> ΡίΤΓ <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 118

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 10 <210> 119 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 119

Tyr lie Ser Scr Tyr Ser Gly Ala Ήιγ Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 120 <2U> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 120

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 121 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 121

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Scr Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 122 <231> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 122

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<2i0> 123 <211> 9 <212> PRT 34-

152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 123

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> 序列經合成 <400> 124

Gly Tyr Ser Phe Thr His Tyr Asp Met His 5 10 <2i0> 125 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 125

Tyr lie Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Thr lie Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 126 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 126

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 127 <211> 15 <21：2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 127

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 128

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210> 129 <211> 9 <212> PRT 35- 152844_ 序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 129

Gin Gin He Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 130

Gly Tyr Tlir Phe Pro lie Tyr Asp Met His 5 10 <210> 131 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 131

Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 1 5 10 15

Lys Gly <210〉 132 <2U> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 132

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 133 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 133

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <21〇> 134 <21l> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> 序列經合成 <400> 134

Ala Ala Ser Asn Arg Glu Thr

<210> 】35 <211> 9 <212> PRT 36-

152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 135

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 136 <211> 10 <212> PR丁 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 136

Gly Tyr Thr Phe Thr Giu Tyr Asp Mel His 5 10 <210> 137 <2U> 17 <2]2> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 137

Tyr He Thr Thr Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 138 <21l> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 138

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 )0 <210> 139 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 139

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 140

Ma Ala Ser Tyr krg Glu Ser

<210> 141 <2U> 9 <212> PRT 37- 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 141

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210> 142 <211> !0 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> \A2

Gly Tyi· Ser Phe Thr Asp Tyr Asp Met His 5 10 <210> 143 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 143

Tyr lie Set Ser Tyr Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <2I0> 144 <211> 12 <212〉 PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4()0> 144

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 145 <2ll> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4C0> 145

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 146 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <>146

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210〉 147 <211> 9 <212> PRT 38·

152844·序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 147

Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr <2i0> 148 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 148

Gly Tyr Ser Phe Val His Tyr Asp Met His 5 10 <210> 149 <21l> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 149

Tyr lie Ser Ser Tyr Ser Gly Ala ΊΉγ Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Gly <210> 150 <211> 1.2 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 150

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu Ala Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 151 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 151

Lys Ala Ser Gin Ser Leu Asp Tyr Tyr His Tyv Ser Tyr Met Asn 15 10 15 <210> 152 <2H> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 152

Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser

<210> 153 <211> 9 <212> PRT 39- 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 153

Gin Gin He Asn Glu Asp Pro Phe 7*hr <210> 154 <21)> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 154

Gly Tyr Ser Leu Thr Asn Tyr Asp Met His <210〉 155 <211> ]7 <212> PRT <213>人工序列

<220〉 <223>序列經合成 <400> 155 Tyr 】le His Ser Tyr Ser Gly 1 5

Ser Thr Leu Tyr Asn Gin Lys Phe 10 15

Lys Gly <2i0> 156 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 156

Asp Ser Asn Tyr Gly Glu AJa Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 157 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 157

Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met His 5 10 <210> 158 <211> 7 <212> PRT <2丨3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 158

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

<210> 159 <211> 9 <212> PRT 40-

152844-序列表.doc 201130971 <2Π>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 159

Gin Gin Trp Ser Ser Asp Pro Leu Thr <210> !60 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 160

Gly Phe Leu Leu Ser Thr Ser Giy Met Gly Val Ser 户 1 Λ <2l0> I6l <2Il> 16 <2l2> PRT <2l3>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> I6l His He Tyr Trp Asp i 5

Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 10 15

Ser <2l0> 162 <2ll> 10 <2l2> PRT <2l3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> l62

Arg Asp His Gly 丁yg Tyr Trp Phe Thr <2l0> 163 <2U> 10 <2l2> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <^00> 163

Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met His 5 10 <2l0> ^ <2ll> 7 <2l2> PRT <2l3>人工序列 <220> <223>序列經合成.

Lys Leu Ala Ser

<2l0> 165 <2li> 9 <2l2> PRT -4l · 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 165

Gin Gin Trp Ser Scr Asp Pro Leu Thr <210> 166 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 166

Gly Phe Leu Leu Ser 7Ήγ Ser Gly Met Gly Val Ser ^ 10 <210> 167 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <?·23>序列經合成 <400> 167

His Jle Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15

Ser <210> 168 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 168

Arg Asp His Gly Tyr Tyr Trp Phe Thr Tyr <210〉 169 <21l> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 169

Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met His 5 l〇 <210> 170 <211> 7 <2i2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 170

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

<210> 171 <211> 9 <212> PRT 152844·序列表.doc 42-

201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 171

Gin Gin Trp Set Phe Asp Pro He Thr <210> 172 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 172

Gly Phe Leu Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser 5 10 <2i0> 173 <2)1> 16 <212> PRT <213>人工序列 鲁 <220> <223>序列經合成 <400> 173

His He Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Ser <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 174

Arg Asp His Gly 丁yr Tyr Trp Phe Asp Tyr 5 10

<210> 175 <211> 10 <21_2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 375

Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met His 5 10 <210> 176 <21]> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 176

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

<210> 17? <213> 9 <212> PRT 43- 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 177

Gin Gin Trp Ser Trp Glu Pro Leu Tar <210> 178 <211> 12 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 178

Gly Phe Leu Leu Ser Tiir Ser Gly Met Gly Vai Ser 5 10 <210> 179 <2U> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 179

His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 1.0 15

Ser <210> 180 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220>

<223>序列經合成 <400> ISO

Arg Asp His Gly Tyr Tyr Trp Phe Asp Tyr 5 10 <210> 181 <21l> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 181

Ser Ala Ser Ser Pro Val Phe Tyr Met His 5 10 <2I0> 182 <211> 7 <212> PRT <2丨人工序列 <220> <223>序列經合成 <>182

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser

<210> 1S3 <2U> 9 <212> PRT 】52844·序列表.doc 44 -

201130971 <2】3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 183 άΐη Gin Trp Ser Tyr Glu Pro Leu Thr <210> 184 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 184 G]y Phe Leu Leu Ser Ser Gly Met Gly Vai Ser 5 10 <210> 185 <21l> 16 <212> FKT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <400> 185

His lie Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Ser <210> 186 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4〇〇> 186

Arg Asp His Gly Tyr Tyr Trp Phe Asp Tyr 5 10 <210> 187 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <400> 187

Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met His 5 10 <210> 188 <21l> 7 <212> Pl^ <233>人工序列 <·220> <223>序列經合成 <40()> 188

Asp llir Ser Lys Leu Ala Ser

<210> 189 <21l> 9 <212> PRT 45· 152844·序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 189

Gin Gin 丁rp Ser Ser Asp Pro Leu Thr <2i0> 190 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 190

Gly Fhe Tyr lie Ser Thr Pro Gly Met Gly Val Ser 5 10 <210> 191 <211> 16 <212> PR丁 <213>人工序列 <220> c223>序列經合成 <4〇〇> 191

His lie Tyr Trp Asp Asp Asp T\\r Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 1 5 10 15

Ser <210> 192 <211> 10 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 192

Aig Asp His Gly Tyr Tyr 丁rp Phe Asp Tyr 5 10 <210> 193 <211> 10 <2t2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 193

Ser Ala Ser Ser Ser Val Phe Tyr Met His 5 10 <210> 194 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 194

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

<210> 195 <211> 9 <212> FRT 152844-序列表.doc •46-

201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 195

Gin Gin Trp Ser Tyr Asp Pro Met Thr <210> 196 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <2M>序列經合成 <4〇〇> 196

Gly Phe Leu Leu Ser llir Ser Gly Met Giy Val Ser 5 10 <210> 197 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 φ <220> <223>序列經合成 <400> 197

His I3e Tyr Trp Asp Asp Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 15 10 15

Ser <210> 19δ <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 198

Arg Asp His Gly Tyr Tyr 丁rp Phe Asp Tyr

<210> 199 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <>199

Glu Ala Ser Gin Scr Val Asp Tyr Asp Asp Asp Ser Tyr Met Asn l 5 10 15 <21Q> 200 <2U> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223;>序列經合成 <400> 200

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

<210> 201 <211> 9 <212> PRT 47· 152844-序列表.doc 201130971 <2i3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 201

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr <210〉 202 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 202

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Tip Mel Asn 5 10 <2I0> 203 <211> 17 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 203

Arg lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Tlir His Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Asp <210> 204 <2Ii> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 204

Asp Ser Ser Tyr Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 5 10 <210> 205 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 205

Glu Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Asp Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213>人工序列 <220> 序列經合成 <400> 206

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

<210> 207 <211> 9 <212> PRT 48·

152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 207

Gin Gl.n Ser Asn Glu Asp Pro Phc Thr <210> 208 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 208

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser Trp Met Asn 5 10 <210> 209 <21l> 17 <212> PRT <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <A00> 209

Arg lie Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gin Lys Phe 15 10 15

Lys Asp <210> 210 <211> 12 <2I2> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 210

Asp Ser Ser Tyr Asp Glv Phe Tyr Ala Met Asp 丁yr 5 ' 10 <210> 211 <211> 11 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 211

Lvs Ser Ser Glu Tyr Val Ser Asn Ala Leu Ser S 10 <2i0> 212 <211> 7 <212> PRT <2]3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 212

Gly fFhr Asn Lys Leu Glu Asp <210> 213 <211> 8 <212> PRT 49· 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 213

Gin Gin Gly Tyr Asp lie Pro Thr <210> 214 <21I> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 214

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Met Gly 5 10 <210> 215 <211> 19 <_2]2> PR丁 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 215

Gly ile Asp Thr Lys Ser Tyr Asn Tyr Ala Tlir Tyr Tyr Ser Gly 15 10 15

Ser Val Lys Gly <210> 216 <2ll> 10 <212> PR丁 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 216

Asn Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Phe Asp Ser 5 10 <2I0> 217 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 217

Asp lie G)n Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Scr Gin Ser Ile Ser 20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 90 -50 152844-序列表.doc 201130971

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 lie Lys Arg <210> 218 <211> 112 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 218

Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60

Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu Asn He His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Tlir Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg no <210> 219 <211> 112 <212> PRT <2】3>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 219

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp 20 25 30

Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GJy Thr Asp Phe 65 70 75

Thr Leu llir lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gin lie Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gb 95 100 105

Thr Lys Va) Glu lie Lys Arg 110

<210> 220 <211> Π2 <212> PRT -51 - 152844-序列表.doc 201130971 <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 220

Asp lie Val Met Thr G)n Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly GIu Arg AJa Thr lie Asn Cys Lys AJa Ser GJn Ser Val Asp 20 25 30

Tyr A*>p Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 45

Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tiir Asp Phe 65 70 75

Tin* Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ala GIu Asp Val Ala Val Tyr 80 85 90

Tyr Cys Gin Gtn He Asn Glu Asp Pro Phe Thr Phe Giy Gin Gly 95 100 105

Thr Lys Val Glu He Lys Arg 110 <210> 221 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <4〇〇> 221

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Tie Gly Tyr lie Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Cilu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 90

Tlir Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser <210> 222 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 222 52-

152844·序列表.doc 201130971 G3u Val Gin Leu Val Glu Ser G!y Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Val Ser Val lie Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr 50 55 60

Tyr Tyr Ala Asp Scr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp 65 70 75

Asn Scr Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 80 85 90 CJlu Asp Thr Ala Val 丁yr Tyr Cys Ala Arg Gly Phe Asp Tyr 丁rp 95 100 105

Gly Gin Giy Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 Π5

<210> 223 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 223

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Thr Gly 15 10 15

Ala Scr Val Lys Tie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30

Asp Tyr Asp Met His Trp Val Lys Gin Ser Gin Gly Lys Ser Leu 35 40 45

Glu Trp lie Gly Tyr lie Ser Cys Ί\γ Asn Gly Ala Thr Thr Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Lys Ser 65 70 75

Scr Thr Tlir Ala Tyr Met Gin Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Tht Ser Leu Thr Val Ser 110 115 120

Ser <210> 224 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 224

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 •53- 152844-序列表.doc 201130971

Asp Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val Gly Tyr lie Ser Cys Tyr Asn Gly Ala Thr Thr Tyr 50 55 60

Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asn Tyr Gly Glu Ala 95 100 105

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120

Ser <210> 225 <211> 35 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 13 <223> N為烏嘌呤或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 16 <223> N為鳥嘌呤或胞嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 19 <223> N為腺嘌呤或胞嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 22 <223> N為腺嘌呤或烏嘌呤 <220> <221〉 Unsure <222> 34 <223> N為腺嘌呤或胞嘧啶 <400> 225 gtcagatatc gtnctnacnc antctccagc aatna 35 <210> 226 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 23 <223> N為鳥嘌呤或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 29 <223> N為腺嘌吟或烏嘌呤 54- 152844-序列表.doc 201130971 <220> <221> Unsure <222> 35 <223> N為腺嘌呤或胸腺嘧啶 <400> 226 gatcgacgta cgctcaggtg acnctgaang <210> 227 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 agtcngg 37

<220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 13 <223> N為鳥嘌呤或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 16 <223> N為鳥嘌呤或胞嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 22 <223> N為腺嘌呤或鳥嘌呤 <400> 227 gtacgatatc gtnctnaccc antctcc 27 <210> 228 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列

<220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 23 <223>N為鳥嘌呤或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 29 <223> N為腺嘌呤或烏嘌呤 <220> <221> Unsure <222> 35 <223> N為腺嘌呤或胸腺嘧啶 <400> 228 gatcgacgta cgctcaggtg acnctgaang <210> 229 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 13 <223> N為鳥嘌呤或胸腺嘧啶 <220〉 <221> Unsure agtcngg 37 152844-序列表.doc •55- 201130971 <222> 16 <223> N為烏嘌呤或胞嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 22 <223> N為腺嘌呤或鳥嘌呤 <400> 229 gtacgatatc gtnctnaccc antctcc 27 <210> 230 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 20 <223> N為胞嘧啶或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 26 <223>N為烏嘌呤或胞嘧啶 <400> 230 gatcgacgta cgctgaggtn cagctncagc agtctgg 37 <210> 231 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <220> <221〉 Unsure <222> 13 <223> N為腺嘌呤或烏嘌呤 <220> <221> Unsure <222> 19 <223> ]<1為腺嘌呤、胞嘧啶、烏嘌呤或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 22 <223> N為腺嘌呤或鳥嘌呤 <220> <221> Unsure <222> 25 <223> 1^為腺嘌呤、胞嘧啶、烏嘌呤或胸腺嘧啶 <400> 231 gatcgatatc canatgacnc anacncc 27 <210> 232 <211> 37 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 17 <223> N為腺嘌呤或烏嘌呤 -56-

152844-序列表.doc 201130971 <220> <221> Unsure <222> 23 <223> N為腺嘌呤或鳥嘌呤 <220> <221> Unsure <222〉 24 <223> N為胞嘧啶或胸腺嘧啶 <220〉 <221> Unsure <222> 32 <223> N為腺嘌呤或鳥嘌吟 <400> 232 gatcgacgta cgctgangtg canntggtgg antctgg 37 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列

<220〉 <223>序列經合成 <400> 233 gctgtaggtg ctgtctttgc t 21 <210> 234 <211> 23 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <220> <221> Unsure <222> 5 <223> N為腺嘌呤或胸腺嘧啶 <220> <221> Unsure <222> 11 <223> N為腺嘌呤或胞嘧啶 <400> 234 ctggncaggg ntccagagtt cca 23 <210> 235 <211〉 108 <212> PRT <213〉智人 <400〉 235

Met Arg Ser Leu Cys Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Pro Pro Leu Leu Leu Thr Pro Arg Ala Gly Asp Ala Ala Val lie 20 25 30

Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly Gly Met Cys 35 40 45

Cys Ala Val Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg He Cys Thr Pro 50 55 60

Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val 65 70 75

Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro 80 85 90 •57- 152844-序列表.doc 201130971

Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe lie Cys Leu 95 100 105

Ala Gin Lys <210> 236 <211> 107 <212〉 PRT <213>小鼠 <400〉 236

Met Gly Asp Pro Arg Cys Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 35

Pro Leu Leu Phe Thr Pro Pro Ala Gly Asp Ala Ala Val lie Thr 20 25 30

Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly Gly Met Cys Cys 35 40 45

Ala Val Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie Cys Thr Pro Met 50 55 60

Gly Gin Val Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr Arg Lys Val Pro 65 70 75

Phe Trp Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro Cys Leu Pro Gly 80 85 90

Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe lie Cys Leu Ala 95 100 105

Arg Lys <210> 237 <211> 81 <212> PRT <213>恆河猴 <400> 237

Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly 15 10 15

Gly Met Cys Cys Ala Val Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie 20 25 30

Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr 35 40 45

Arg Lys Val Pro Phe Val Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro 50 55 60

Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe 65 70 75 lie Cys Leu Ala Arg Lys 80 <210> 238 <211> 81 <212> PRT <213>智人 <400> 238

Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly 15 10 15

Gly Met Cys Cys Ala Val Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie 20 25 30

Cys Thr Pro Met Gly Lys Leu Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr 35 40 45 • 58 ·

152844·序列表.doc 201130971

Arg Lys Val Pro Phe Phe Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro 50 55 60

Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe 65 70 75 lie Cys Leu Ala Gin Lys 80 <210> 239 <211> 81 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 239

Ala Val lie Thr Gly Ala Cys Asp Lys Asp Ser Gin Cys Gly Gly 15 10 15

Gly Met Cys Cys Ala Val Ser lie Trp Val Lys Ser lie Arg lie 20 25 30

Cys Thr Pro Met Gly Gin Val Gly Asp Ser Cys His Pro Leu Thr 35 40 45

Arg Lys Val Pro Phe Trp Gly Arg Arg Met His His Thr Cys Pro 50 55 60

Cys Leu Pro Gly Leu Ala Cys Leu Arg Thr Ser Phe Asn Arg Phe 65 70 75 lie Cys Leu Ala Arg Lys 80 <210> 240 <211> 81 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 240

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu 15 10 15

Gly Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 20 25 30

Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 50 55 60

Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gly Gin Gly Thr 65 70 75

Lys Val Glu lie Lys Arg 80 <210> 241 <211> 82 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>序列經合成 <400> 241

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Trp Val Arg Gin Ala 20 25 30 •59- 152844-序列表.doc 201130971

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg Val Thr He Thr Val 35 40 45

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg 50 55 60

Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gin Gly 65 70 75

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 80

60- 152844-序列表.doc

Claims (1)

1. 201130971 七、申請專利範圍： 1. 一種抗-Bv8抗體，其包含可變域，該可變域包含至少一 個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由以下組成之 群的高變區（HVR)序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSX1X2YX3x4x5symn，其 中 Χι 為 L或V ; X2為D或I; X3為D、F、G、S、W或 Y; X4為 A、G、Η 或 V ;且 X5為 D、E 或 Y ; (ii) HVR-L2，其包含 AASXiXfX;，其中χ^Ν或 γ ; Χ2為L或R ;且Χ3為S或Τ ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-Hl，其包含GYX1X2X3X4YDMH，其中 或 Τ; X2為F或 L ; X3為F、Μ、P、T或 V; X4為D、E、 Η、I或 N ; (ν) HVR-H2，其包含 YIXAYXsGXJ X5YNQKFKG， 其中又1為11、S或Τ; X2為C、S或Τ; X3為A、L、N、S或 Τ ; X4為 A、E或S;X5為I、L、S或 T;及 (vi) HVR-H3，其包含DXiNYGEAYAMDY，其中又！為 G或S。 2. 如請求項1之抗-Bv8抗體，其包含可變域，該可變域包 含以下六個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSX1X2YX3X4X5SYMN，其 中 Χι 為L或 V; X2為D或 I; X3為D、F、G、S、W或 Y ; X4 為 A、G、Η或 V ;且 X5 為 D、E或 Y ; (ii) HVR-L2，其包含 AASXiXAXs，其中 Χι 為 N或 Y ; 152844.doc 201130971 X2為L或R ;且X3為S或Τ ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含GYX1X2X3X4YDMH，其中 或T; X2為 F 或 L; X3為F、Μ、P、T或 V; X4為D、E、 Η、I或 N ; (v) HVR-H2，其包含YIXAYXsGXJ X5YNQKFKG， 其中X〗gH、S或T; X2為C、S或T; X3為A、L、N、S或 1';乂4為八、£或3;又5為1、1^、8或丁；及 (vi) HVR-H3，其包含DXiNYGEAYAMDY，其中又，為 G或S。 3.如請求項2之抗-Bv8抗體，其中HVR-L1包含選自由以下 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:49、55、61、67、 73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、 133、139、145及151 ; HVR-L2包含選自由以下組成之 群的胺基酸序列：SEQ ID NO:50、56、62、68、74、 80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、 140、146及152 ; HVR-L3包含選自由以下組成之群的胺 基酸序列：SEQ ID NO:51、57、63、69、75、81、87、 93、99、105、111、117、123、129、135、141、147及 153 ; HVR-H1包含選自由以下組成之群的胺基酸序列： SEQ ID NO:52、58、64、70、76、82、88、94、100、 106、112、118、124、130、136、142、148 及 154 ; HVR-H2包含選自由以下組成之群的胺基酸序歹1J : SEQ ID NO:53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、 152844.doc 201130971 113、119、125、131、137、143、149及 155 ;且 HVR-H3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、 Π4、120、126、132、138、144、150及 156。 4. 如請求項1之抗_Bv8抗體，其包含可變域，該可變域包 含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自由以 下組成之群的高變區（HVR)序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSXiXzYXsXiXsSYMN，其 中Χι為L或V; X2為D或I; X3為F、G、S、W或Y; X4為 A、G、Η或 V;且 X5為 D、E或 Y; (ii) HVR-L2，其包含 AASXiX2EX3，其中 乂丨為>^或 Y ; X2為L或R ;且X3為S或T ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-H1，其包含 GYX1X2X3X4YDMH，其中 X!為 s 或 T ; X2 為 F 或 L ; X3 為 F、Μ、P、T 或 V ; X4 為 D、E、 Η、I或 N ; (ν) HVR-H2，其包含ΥΙΧΛΥΧΑΧβ X5YNQKFKG， 其中乂1為11、S或T; X2為S或T; 乂3為八、L、S或Τ; χ4 為A、Ε或S; Χ5為I、L、S或Τ;及 (vi) HVR-H3，其包含DSNYGEAYAMDY。 5. 如請求項4之抗-Bv8抗體，其包含可變域，該可變域包 含以下六個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含KASQSXiXzYXjXdXsSYMN，其 中或V; X2為D或I; X3為F、G、S、W或Y;又4為 152844.doc 201130971 A、G、Η或 V;且 X5為 D、E或 Υ; (ii) HVR-L2，其包含AASXiXzEXs，其中又丨為]^或Υ ; Χ2為L或R ;且Χ3為S或Τ ; (iii) HVR-L3，其包含QQINEDPFT ; (iv) HVR-Hl，其包含GYXiXaXBXjYDMH，其中乂1為8 或1';乂2為？或1^;乂3為？、]\4、？、丁或¥;乂4為0、丑、 Η、I或 N ; (ν) HVR-H2，其包含YIXAYXsGXJ X5YNQKFKG， 其中乂1為11、S或Τ; X2為S或Τ; X3為A、L、S或Τ; X4 為A、E或S; X5為I、L、S或T;及 (vi) HVR-H3，其包含DSNYGEAYAMDY。 6.如請求項5之抗-Bv8抗體，其中HVR-L1包含選自由以下 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:55、61、67、73、 79、85、91、97、103、109、115、121、127、133 ' 139、145及151 ; HVR-L2包含選自由以下組成之群的胺 基酸序歹|J : SEQ ID NO:56、62、68、74、80、86、92、 98、104、110、116、122、128、134、140、146 及 1 52 ; HVR-L3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列： SEQ ID NO:57、63、69、75、81、87、93、99、105、 111、117、123、129、135、141、147及 153 ; HVR-H1 包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、 118、124、130、136、142、148及 154 ; HVR-H2 包含選 自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:59、65、 152844.doc -4- 201130971 71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、 131、137、143、149及155 ;且HVR-H3包含選自由以下 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:60、66、72、78、 84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、 144 、 150及156 。 7·如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其中該抗體包 含： ^ (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:61 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:62 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:63 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:64 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:65 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:66。 8. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其中該抗體包 含： • (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:85 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:86 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:87 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:88 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:89 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:90。 9. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其中該抗體包 含： (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:91 ; 152844.doc 201130971 (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:92 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:93 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:94 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:95 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID ΝΟ··96。 1 0.如請求項1至6中任一項之抗-Βν8抗體，其中該抗體包 含： (1) HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:121 ; (2) HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:122 ; (3) HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:123 ; (4) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:124 ; (5) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:125 ;及 (6) HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO:126。 11. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其進一步包含人 類VL κ亞群IV共同構架序列SEQ ID NO:240及人類VH亞 群I共同構架序列SEQ ID NO:241。 12. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其包含：包含 SEQIDNO:7之輕鏈可變域及包含SEQIDNO:8之重鏈可 變域。 13. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其包含：包含 SEQ ID NO:9之輕鏈可變域及包含SEQ ID NO:10之重鏈 可變域。 14. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其包含：包含 8£卩10 1^0:11之輕鏈可變域及包含8£(^10 1^0:12之重鏈 152844.doc 201130971 可變域。 1 5_如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其包含：包含 SEQ ID NO: 13之輕鏈可變域及包含SEQ ID NO: 14之重鏈 可變域。 16. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其中該抗-Bv8抗 體以小於約0.02 nM之Kd值結合至人類Bv8 » 17. 如請求項1至6中任一項之抗-Bv8抗體，其中該抗-Bv8抗 體結合至人類Bv8之緊密程度至少為嵌合2G9抗-Bv8抗體 的兩倍。 18. —種結合至Bv8之抗體或其片段，其中該抗體包含可變 域，該可變域包含以下六個HVR序列： (i) HVR-L1，其包含SASS X,VFYMH，其中乂丨為P或 S ； (ii) HVR-L2，其包含DTSXAAS，其中X丨為K或N ; (iii) HVR-L3，其包含 QQWS Χ,ΧβΧα，其中 X,為 F、 S、W或 Y ; χ2為 D或 E ; X3為 I、L或 M; (iv) HVR-H1，其包含GFX!X2STX3GMGVS，其中 乂】為 L或Y ; X2為I或l ;且X3為P或S ; (v) HVR-H2，其包含HIYWDDDTRYNPSLKS ;及 (vi) HVR-H3，其包含RDHGYYWFDY。 19. 如請求項18之抗-Bv8抗體，其中HVR-L1包含選自由以 下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 169、175、 181、187及193 ; HVR-L2包含選自由以下組成之群的胺 基酸序列：SEQ ID NO: 170、176、182、188 及 194 ; 152844.doc 201130971 HVR-L3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:171、177、183、189及 195 ; HVR-H1 包含選自由 以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 172、178、 184、190及196 ; HVR-H2包含選自由以下組成之群的胺 基酸序列：SEQ ID NO: 173、179、185、191 及 197 ;且 HVR-H3包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ IDNO:174' 180、186、192 及 198。 20. —種核酸，其編碼如請求項1至19中任一項之抗體》 2 1. —種載體，其包含如請求項20之核酸。 22. 如請求項21之載體，其中該載體為表現載體。 23. —種宿主細胞，其包含如請求項21或22之載體。 24. —種組合物，其包含如請求項丄至^中任一項之抗體。 25. 如請求項24之組合物，其中該組合物包含載劑。 26. 如請求項24或25之組合物，其為醫藥學組合物。 27· —種製備抗·Βν8抗體之方法，該方法包含（a)在適合之宿 主細胞中表現如請求項21或22之載體，及（b)回收該抗 體。 28. 如請求項27之方法，其中該宿主細胞為原核細胞。 29. 如請求項27之方法，其中該宿主細胞為真核細胞》 30· —種如請求項1至19中任一項之抗-Bv8抗體之用途，其 係用於製造用以治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病症之藥 物。 3 1.如請求項30之用途，其中該癌症係選自由以下組成之 群：乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎癌、神經膠母細胞 152844.doc 201130971 瘤、食道癌、黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌、胰臟癌及肝 細胞癌。 3 2.如請求項3 1之用途，其中該癌症為乳癌、結腸直腸癌、 肺癌、腎癌、卵巢癌或神經膠母細胞瘤。 33. —種如請求項1至19中任一項之抗_Bv8抗體之用途，其 係用於製造用以減少或抑制患有與血管生成相關之病理 性病狀之個體體内血管生成的藥物。 34. 如請求項33之用途，其中該病理性病狀為贅生性病狀。 35· —種如請求項！至19中任一項之抗_Bv8抗體之用途，其 係用於製造用以抑制内皮細胞增殖之藥物。 36.如請求項30至35中任一項之用途，其中該抗-Bv8抗體為 第一藥物，且其中該第一藥物係與有效量之第二藥物一 起投與。 37·如請求項36之用途’其中該第二藥物為另一抗體、化學 :療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前 樂、細胞激素、細胞激素拮抗劑、細胞毒性放射線療 法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、止痛劑或生長抑 制劑。 38. 如請求項37之用途， 39. 如請求項38之用途， 體。 其中該第一樂物為抗血管生成劑。 其中該抗血管生成劑為抗_VEGF抗 40.如祜求項39之用 J ^ 丹r该柷-VEGF抗體為貝伐單抗。 41.如請求項36之田、全 朴丄 早沉 項6之用途’其中該第二藥物係在投與該抗·β 抗體之前或之後投與 152844.doc -9- 201130971 42. 如請求項36之用途，其中該第二藥物係與該抗-Bv8抗體 並行投與。 43. 如請求項30至35中任一項之用途，其中該藥物係與有效 量之化學治療劑一起投與。

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