TW200930389A - Wolfberries and inflammation - Google Patents

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200930389 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明一般而言係有關發炎領域。特定言之，本發明係 有關一種以天然化合物於製備治療發炎之產物上之用途。 例如，西方雪果萃取物顯示有抗炎性質。 【先前技術】 發k疋組織對傷害性刺激（如病原體、損害性細胞或刺 激物）之複雜生物效應。生物體會除去有害刺激並啟動組 織癒合過程，試圖加以保護。然而，不論個體年齡，調節 不足之發炎可導致若干疾病。 年齡增長與免疫系統調節失調有關，如：細胞介導之免 疫反應顯著下降，伴隨體液免疫機能障礙加劇（例如，對 疫苗之反應較低）。此外，年齡增長常常與極輕微發炎狀 態有關H，尤其許多年長者，罹患可導致發病和死 亡之傳染性和非傳染性疾病之風險增加。 φ 基於西方雪果之多重營養物成分（例如玉米黃質、維生 素和寧夏枸杞（々d⑽如咖抑㈣多糖），其多種健康益處已為吾 人所知。 ' 然而’相關技藝上仍需要利用具有抗炎性質之天然化合 . 物。 例如：營養介入法（如：使用n_3 roFA(多不餘和脂肪酸） 不僅減少炎性細胞功能’而且減少細胞介導免疫反應（例 如淋巴細胞增殖和NK活性），其可導致可能不利於寄主防 衛性之影響。 134143.doc 200930389 【發明内容】 因此，本發明目的在於提供一種替代性天然化合物，其 具有抗炎性質而且不會對個體免疫防衛性產生任何不利影 響。 ’、" • 本發明者驚訝地發現西方雪果萃取物具有抗炎性質。因 此，本發明目的可藉由使用西方雪果萃取物製備治療及/ 或預防發炎之產物而得以實現。而且發現：免疫反應不受 影響。 【實施方式】 因此，本發明之一個實施例為利用包括西方雪果或其一 部分及視需要選用之乳或含乳蛋白質載體之主要組合物， 於製備治療及/或預防發炎之產物上之用途。 此產物計畫經口或局部投與。 此乳或乳蛋白質可為動物或者植物來源或源自其混合 物。較佳地，此乳是牛乳、美洲，轮乳、水牛乳、山羊乳: ❹，綿羊乳、植物乳’尤指豆漿’或其混合物。乳蛋白質應理 解為從-種或多種如上所列乳類型獲得之蛋白質。 • 較佳地，此主要組合物為可混溶之組合物。 有利地’尤其當主要組合物包括乳或含乳蛋白質載體 =具有接近完整西方雪果必需活性組分之組成，並在 7十系統中有良好穩定性、可混溶性及/或分散性。 此外’尤其當主要組合物包括乳或含乳蛋白質載體 其以較好的生物利用率和 ’ 值。其㈣“午'穩疋陡之形式具有提高之營養價 其味道和顏色俱佳。其能直接使用、濃縮或乾燥成粉 134143.doc 200930389 末，形成日用食物之若干應用或其他營養用途。 如果該主要組合物之製法可以製成可釋放西方雪果必需 親脂性及/或親水性生物活性物質成分之主要組合物，艮 可實現所有此類特色，此製備方法包括以下步驟：i)於乳P 或含乳蛋白質之液體介質中混合和碾磨西方雪果，⑴視需 要選擇性分離不能溶解的纖維，獲得水性懸浮液，叫由 所產生之懸浮液可視需要選擇性進行巴氏殺菌

(P«ng) ’ iv)處理期間，視需要選擇性添加合成或天 然生物活性物質成分’v)進—步視需要選擇性乾燥懸 液’獲得粉末。 因此’在本發明之-個實施财，此主要組合物藉由包 括如下步驟之方法獲得：i)於乳或含乳蛋自質之液體介質 中混合和礙磨西方雪果，Η)視需要選擇性分離不能溶解的 纖維、’獲得水性懸浮液，叫由所產生之懸浮液視需要選 擇ί·生進仃巴氏殺菌(pasteurising)，iv)處理期間，視需要選 擇性添加合成或天然生物活性物質成分，V)進一步視需要 選擇性乾燥懸浮液，獲得粉末。 此方法之主要優點為天然和經濟效益，能夠改進其天然 :合物中(不含有機溶劑殘餘)呈穩定之水溶性和脂溶性： &物形式之多重營養素之釋放。 樣中，本發明提供-種增加西方雪果生物活性化 ^在水性體系中之混溶性或分散性、穩定性及之生物利 蛋白暂S 4《係使用如上述方法，特定言之使用乳或乳 、豆漿或來自植物之類乳蛋白質，供萃取和釋放西 134143.doc 200930389 方雪果多重營養素功能成分。 如上所述之主要組合物能用於傳送具有改進之生物利用 率、混溶性和穩定性西方雪果功能成分之多重營養素。 術語生物活性化合物應理解為當經口投與:局部施用 時，具有生物活性或影響健康之分子或成分。

西方雪果可以呈例如：植物果實及其他植物部分之形式 使用。果實可呈新鮮、濃縮或乾燥形<，例如：風乾或束 乾物質。以使用乾燥熟果實較佳。 、本發明-項較佳實施例中，此主要組合物包括至少一部 为西方雪果必需親脂性及/或親水性生物活性物質成分。 此必需親脂性及/或親水性生物活性物質成分較佳地選 自由如下組成之群組：脂質、生物驗、蛋白質、碳水化合 物、醣蛋白、類胡蘿》素、多酚類化合物，如：類黃酮、 維生素、礦物質，或其混合物。 類胡蘿蔔素可由如下組成之群組：胡㈣素類和葉黃 質，如：蘇紅素、胡蘿蔔素、六氫祐紅素、八氫蘇紅素、 斑整黃、β-隱黃質、辣椒紅、葉黃素、玉米黃質或彼等呈 脂肪酸酯形式之物質，或其混合物。 糖蛋白質組成之群 試劑（beta-Glucosyl 分子。 醣蛋白較佳係選自由***半乳聚 組，特定言之可藉由β-葡糖基Yariv Yariv reagent)檢測之寧夏枸杞多醣和高 類黃酮較佳係選自由如下組成之群組：黃嗣（如：^ 素、木犀草素或香葉木素）、黃酮醇(如：槲黃素、楊掏 素、山奈齡）、黃烧嗣、花青素（如：天葵素、錦莫色素）或 I34I43.doc 200930389 異黃酮（如：金雀異黃酮、木質異黃酮），或其混合物。 本發明主要組合物可以於乳或含乳蛋白質載體中至少包 含西方雪果必需生物活性物質成分或其一部分，但不包括 不能溶解的纖維。此乳載體可呈動物或植物來源之脫脂乳 或全乳形式（例如豆漿、果汁或椰子汁等等）^在更佳實施 例中，使用牛乳或豆漿，其取決於所需之主要組合物。此

❹ 含乳載體可為含有乳蛋白質（如：酪蛋白或乳清蛋白）之任 何食用液體。 可以視需要選擇性添加植物油至液體介質。 西方雪果可在此乳或含乳蛋白質液體介質中，依大約 1:1至1:1000，較佳為1:5至1:50之間之各比率混合和礦 磨。。此混合和碾磨步驟可於丨至％^之間進行，介於20至 8〇°C之間較佳，介於4G至崎之間更佳。然後至少部分 除去不能溶解的纖維，獲得水性懸浮液。 此可藉由任何常規方法實現。I生之主要組合物可進一 步也藉由相關技藝上熟知之技術進行巴氏殺菌及/或乾燥 成私末€得之主要組合物也可呈液體或凝膠形式。 本發明因此提供一種具有類似完整果實之重要營養素組 成之主要組σ物’其具有良好穩定性、混溶性和生物利用 2如果選擇粉末形式，此類組合物可在水性體系中高度 散S該匱況下’例如’此粉末可分散於冷水或熱水 中。同樣可添加至乳中。 此組合物可另外包含— A 種或多種乳化劑、穩定劑、抗氧 化劑及其他添加劑。齡4及+ &佳係使用與食物相容之乳化劑， 134143.doc 200930389 如：磷脂，例如卵磷脂、聚氧乙烯山梨醇酐單硬脂酸酯 或-三硬酯酸酯、單月桂酸酯、單棕櫚酸酯、單油酸酯或 三油酸酯、單酸或二酸甘油酯。 也可使用已知用於食物、化妝品或藥品之任何類型穩定 劑。 可使用已知用於食物、化妝品或者藥品之任何類型抗氧 化劑。 Φ 可進一步使用已知用於食物、化妝品或者藥品之添加 劑、香料和著色劑。 根據主要組合物預定最終用途’可添加乳化劑、穩定 劑、抗氧化劑和添加劑。 此組合物可進一步地包含合成或天然生物活性物質成 分，如胺基酸、脂肪酸、維生素、礦物質、類胡蘿蔔素、 多酚等等’其可在巴氏殺菌及/或乾燥之前，較佳係藉由 乾式或濕式混合法添加此組合物中。 ® 利用本發明製備之產物可以是食物補充劑、作為藥劑或 用於藥劑中之補充劑、或作為乳油或用於乳油中之補充 劑。 在本發明之較佳實施例中，此產物預定應用與/或施用 • 至人或寵物。 此產物可投與至任何年齡之個體，特定言之嬰兒、幼 月〉、年成人及/或老年人。然而，西方雪果似乎特 別適合成年人和老年人。 如本發明之較佳實施例，利用本發明製備之產物可供人 134143.doc 200930389 食用或作為食品。該食品經腸内服用（即本發明之目的， 包括口服）或非經腸式使用。 因此’此主要組合物可能是用於口服之食物添加劑， 如.用在營養組合物、食品補充劑、寵畜食物、化妝品製 . 劑或藥物製劑中。此主要組合物也可是用於局部施用產物 之添加劑’如：化妝品或藥品中。 因此，利用本發明製備之產物可以是營養完全配方、乳 φ 製时、冷藏或耐貯飲料、用於哺乳母親之產品、液體飲 料、湯、食物補充劑、膳食代替物、營養棒、糕餅、乳或 發酵乳產物、優酪乳、以乳為主之粉末、腸内營養品、嬰 兒配方、嬰兒營養品、菜泥、縠物產品或以發酵毅物為主 之產品、霜淇淋、糖果、甜點、餅乾、蛋糕、巧克力、卡 布奇諾、咖却、餐厨用品，如：蛋黃醬、番蘇糊或沙㈣ 汁寵畜食物或寵畜飲料。在較佳實施例中，供人食用之 食品組合物中可補充上述主要組合物。此主要組合物，較 ❿ <圭係呈粉末形式’以-定數量分散在以上食物或飲料中， 以便每日攝取如上所述生物活性物質營養素，其取決於預 _效果和標㈣織。個體為獲得有益效果而食用之主要組 合物或食品的數量還將依賴其體型大小、類型以及年齡決 定。 如果此產品是用於口服之營養補充劑，其可呈膠囊、明 夕囊軟膠囊鍵劑、糖衣機、藥丸、糊劑或軟鍵劑、膠 質或可飲用溶液或乳液、糖聚或凝膠。主要組合物劑量可 由習此相關技藝之人士依計晝目的而改變，但是通常介於 134143‘doc •12- 200930389 0.1至100 wt/〇之主要組合物之間。此補充劑也可包括増甜 劑、穩定劑、抗氧化劑、添加劑、調味劑及/或著色劑。 化妝品目的之補充劑可另外包含針對皮膚之活性化合物。 在另-個實施例中，如果本發明之產品是藥品組合物， 其可用於預防性處理及/或治療性處理。 在/口療用途中’其投藥量應足以至少部分治療或預防疾 病和其併發症之症狀。實現此目的之適當數量即定義為" ❹ ❹ 治療有效劑量，，。用於,μ· B Μ 1 + 於此目的之有效量將取決於習此相關 技藝之人士所熟知之許多因素，如：疾病嚴重程度和患者 體重和-般狀態。在預防用途中，投與容易羅患或有惟患 某疾病風險之患者之本發明組合物投藥量應足以至少部分 降低發展成該疾病之風險。此數量即定義為"預防有效劑 量"。此外，精確數量取決於患者之許多特殊因素，如： 患者健康狀態和體重。 如果本發明化合物作為藥品組合物投與，其較佳係使用 醫樂可接受載體投與，載體性質依投與方式而不同，例 生腸α 口和局部（包括眼科）途徑。所需調配物可使 用許多賦形劑製備，包括例如：藥物級甘露糖醇、乳糖、 殿粉、硬脂酸鎂、糖精納、纖維素、碳酸鎮。 ，理解，習此相關技藝之人士將依據其本身知識，考量 選擇適當成分和蓋倫劑型，使活性化合物得以 本發:織例如.皮膚、結腸、胃、眼睛、腎或肝。 盆=有關包括如上述主要組合物之化妝品組合物。 J 成例如：洗劑、洗髮精、乳霜、防曬品、曰曬後 134143.doc 200930389 用乳霜、抗老化乳霜及/或軟膏。能局部使用之此組合物 亦包括可被用於化妝品之脂肪或油，例如"ctfa工作，化妝 品成分手冊，華盛頓（CTFA work，cosmetic比抑…恤

Handbook，Washington)"中所提及者。還可能添加其他化 • 妝品活性成分。此組合物另外包括結構劑和乳化劑。還可 添加其他賦形劑、著色劑、香料或不透明劑至組合物中。 應理解.此化妝品將含習此相關技藝之人士熟知之不同成 e 分的混合物，以確保此物質快速滲透至皮膚並預防在儲存 期間降解》 應理解：本發明原理同樣適用為可促進目前使用之藥物 之佐劑療法。因為本發明化合物容易與食物一起投與，因 此可採用包含高數量此物質之特別臨床食物。 投與寵物或人時，如上所述食物、營養補充劑、化妝品 或藥品。特定言之，可藉由至少部分減輕發炎而改進健 康。 ❿ 可使用本發明製備之產品治療之發炎選自由如下組成之 群組.急性發炎，如：膿毒病、傳染、燒傷和慢性發炎， 如.义性腸病、克羅恩氏病（Crohn’s disease)、潰瘍性结腸 炎、壞死性小腸結腸炎、皮膚發炎’如：紫外線或化學引 起之皮膚發炎、濕疹、反應性皮膚、乾癬、白斑病、粉 刺、腸炎綜合症、肝炎、酒精性肝硬化、過敏反應、特異 性反應、骨炎、類風濕關節炎、全身性狼瘡、葛氏_索氏 (G〇Ugerot_Sj0gren)綜合症、萊特氏综合症（Reiter，s syndrome)、脊髓灰質炎、皮肌炎、曱狀腺炎、巴澤多 134143.doc 200930389 (Basedow)病、橋本病、i刑她 々納1型糖尿病、愛迪生氏病（Addison's disease)、自體免疫肝炎、乳糜填、比爾默病（Bi_，s —)、多發性硬化、肌無力、腦脊聽炎、眼睛發炎、肥 胖有關之發A年齡有關之極輕微發炎、布勞（Blau)綜合 征、阿兹海默氏病、心臟金管疾病、動脈粥樣硬化、新陳 代謝綜合症、齒齦炎和牙周病。

❷ 本發明者已經研究本發明主要組合物抗炎效果之分子機 轉。在不希望受限於理論下，本發明者目前相信：在人腸 上皮細胞中’其藉由巨嗟細胞（圖呀挪…·或LPS引起之 NF-kB活化（圖2)途徑，而抑制Lps介導產生促炎細胞素。 在預臨床研究中，使用本發明主要組合物之腾食補充法已 在老鼠急性腸炎模式中證明其強力抗炎性質(圖3至1〇)。另 外’本發明主要組合物在老年小鼠肝臟中能進—步減少促 炎性細胞素（如·· TNF_a)之表現（圖11)β此外，使用本發明 主要組合物之勝食補充法可在衰老小鼠中加強抗原特異性 體液免疫反應和細胞介導之免疫反應（分別為圖12和13)。 因此，本發明主要組合物在減少之發炎狀態時顯示有益效 果。同時，本發明主要組合物進一步能夠支援免疫系統。 因此，利用本發明製備之產品可用於減少發炎狀態，同 時加強免疫系統。 因此，本發明主要組合物有潛力使受損之免疫和發炎反 應恢復回穩衡狀態。憑此雙重效果，本發明主要組合物例 如：適用在針對老年人、臨床和寵物營養之產品中。 特定言之，本發明主要組合物有利於在老化期間保持免 134143,doc -15- 200930389 疫功能’同時減少與年齡有關之極輕微發炎狀態。 本發明主要組合物還可用於臨床產品，以控制急性症炎 或慢性發炎。 因此’在本發明一個實施例中，利用本發明製備之產品 係用來改進受損之免疫反應。也可用來加強抗原特異性體 液免疫反應及/或加強細胞介導之免疫反應。 另外，此主要組合物及/或本發明之產品可用於治療或 Φ 預防與氧化壓力相關之病變。本發明者已顯示，本發明主 要組合物及/或產品之應用可極大幅增加抗氧化劑基因， 如：GPX-l、CAT1和SOD2(圖9)。因此’本發明主要組合 物及/或產品可提供對抗氧化壓力的保護，例如：由自由 基、（如：·〇2·，過氧化物陰離子）；H2〇2、過氧化 氫；·ΟΗ、羥基；ROOH、有機過氧化物；RO·、烷氧基； ROO·、過氧自由基；HOC1、次氣酸；ΟΟΝΟ·，過氧亞确 酸根；及/或NO·所引起之壓力。 φ 習此相關技藝之人士咸了解，可在不脫離原始揭露之本 發明範圍内，自由組合本文所敍述之任何特色。 自以下實例和圖示’可進一步了解本發明之優點和特 ' 徵。 實例1: 包含西方雪果和乳之主要組合物（LWB，乳-西方雪果）製法 取西方雪果（40 g)和全乳（3 00 g)加至1公升容器中。混合 物保持靜置10分鐘並在氮蒙氣下，以Polytron均質器 (KINEMATICA公司分散和混合技術，PT3000)，於26000 134143.doc •16· 200930389 rpm下處理15分鐘。在Polytron均質器處理期間，藉由水浴 維持混合物溫度在80-85°C，然後冷卻至室溫。所得混合 物在2000 g下離心10分鐘。丟棄固體殘渣。凍乾液相（306 g橙黃色乳）。最後磨碎乾燥產物，產生54 g橙黃色粉末， 其與西方雪果粉末相比，顯示具有很好之水分散性和改良 之玉米黃質穩定性。 實例2 試劑 由 J. Wang (FS，Lipids & Bioactives)提供由 NRC (雀巢研 究中心（Nestl0 Research Center; Lausanne))製造之批號 N°WB03A1506H之如上所述乳-西方雪果（LWB)粉末和西方 雪果萃取物粉末（批號N°WB03A1506H)。來自大腸桿菌血 清型 055:B5(LPS)係購自 Sigma 藥廠（St, Louis，MO)。遵循 倫理委員會批准後，自不同健康供體產後20日内收集人母 乳（HM)。鑰孔戚血藍蛋白（KLH)購自Sigma藥廠。 細胞培養 小鼠單核細胞/巨噬細胞細胞系RAW 264.7(來自美國 ATCC，Manassas，Virginia，USA 之 TIB-71)維持於 37〇C 下， 5% C02/空氣培養箱中已補充10%加熱失活之FCS (Amimed)和1%青徽素/鏈黴素（英國Paisley市Invitrogen公 司）之 DME 培養基（DMEM，瑞士 Amimed，Bioconcept, Allschwill)中。使用姨蛋白酶/EDTA(美國Sigma藥腐；（81-Louis, MO, USA))傳代培養細胞。人結腸腺癌細胞系HT-29 純系34細胞（亦即使用NF-κΒ報導子基因穩定轉染之HT-29 134143.doc •17- 200930389 細胞）維持於37°C之5% C02/空氣培養箱中之包含1%穩定L-穀胺醯胺之高葡萄糖（4.5 g/)並補充10%加熱失活（56°C下1 小時）之FCS、1%青黴素/鏈黴素（Sigma藥廠（St Louis， MO))、5 00pg/ ml G418(Invitrogen)和 100pg/ml 諾黴素 (Normocin)(Invivogen)之 DMEM(瑞士 Bioconcept 藥廠 (Allschwill，Switzerland))中。每2日更換培養基，直至細 • 胞單層到達90%匯合度。使用胰蛋白酶/EDTA(Sigma)傳代 培養細胞。 LPS介導IL-6表現之定量法 於37°C之5% C02/空氣培養箱中，在含標準培養基之96 平底孔板中，依1〇4個細胞/孔接種RAW 264.7細胞。培養3 日後（即細胞到達80%匯合度），在有或無LWB樣本（0.1-1 % 最後濃度）下，在標準培養基中，使用或不使用0.5 pg/ ml 大腸桿菌（E. coli) LPS (05 5:B5，Sigma藥廠），刺激細胞24 小時。然後收集細胞培養物上清液並用於定量IL-6產量。 . 如製造商指示，藉由ELISA(法國Murine IL-6 Eli-pair，

Diaclone, Besanfon)計算細胞培養上清液中介白素-6(IL-6) 濃度。 NF-κΒ活性 在含維持培養基之96平底孔板中，以104個細胞/孔接種 HT-29純系34細胞。培養3-4日後（即細胞到達80%匯合 度），在磷酸鹽缓衝生理食鹽水溶液（PBS)(Sigma藥廠）中洗 滌細胞，然後，在有或無LWB樣本下，在包含1%青黴素/ 鏈黴素之DMEM中，使用或不使用LPS(10 ng/ml + 5%人乳） 134143.doc -18- 200930389 或重組體TNF-ot(10 ng/ml;英國 R&D systems, Oxon)，刺激 細胞24小時。然後收集細胞培養上清液並存儲在+4。〇 0/N，直至分析NF-κΒ活性。活化NF-kB後，HT-29純系34 細胞在培養物上清液中分泌鹼性磷酸酶（SEAP)。依製造商 指示（美國Applied Biosystems，Bedford)，使用螢光檢測方 法（Phospha-Light™ System)測定SEAP釋放量。簡言之，在 白色96孔平底聚丙烯孔板（Greiner)中，由細胞培養物上清 液與來自Phospha-LightTM System之反應緩衝液培養20分 鐘，並使用Spectrafluor Plus分光光度計（Tecan 8634 Hombrechtikon, Switzerland)測定榮光。結果以用相對螢光 單位來表示（RLU)。 TNBS引起之結腸炎模式 TNBS結腸炎模式為藉由化學產物（150毫克/公斤劑量之 三硝基苯磺酸（TNBS))引起之急性發炎模式。在引發結腸 炎之前七天直至殺死期間之動物，每組十隻小鼠，接受包 含1% LWB(50 mg)之食物飼養。在投與TNBS後1至4天之 間，藉由胃管灌食法給與50 mg LWB，以彌補與急性腸炎 有關之較低食物攝取。每隻動物均分析體重減少量、宏觀 得分、組織學得分、COX-2、pSTAT3、促炎性和抗氧化劑 基因表現及抗氧化劑效力。遵循Wallace(Wallace等人， 1989)和Ameho(Ameho等人，1997)之得分標準，完成宏觀 和組織學評分。在急性發炎條件下，由COX-2(環加氧酶之 可誘導形式，72kDa蛋白質）負責誘導生物合成***素。 Stat3為許多細胞活素之鍵控信號分子；尤其為作為IL-6之 134143.doc •19- 200930389 促炎性細胞活素之鍵控信號分子。 用於5平價哀老小鼠免疫調節之試驗設計 沒有特異性病原體之雄性C57BL/6J小鼠（4周幻係構自 法國Charles River Labo論deS Inc.公司。小鼠生活於常規 . 環境下（12小時光照/黑暗週期，22。(；，56%濕度）並自由飲 . 水和攝取半合成性Knba 3434飼料。每個籠關5隻小鼠，直 至5個月大，然後每個籠關丨隻老鼠^動物之所有條件和處 ❹ 理均經過雀巢公司⑽㈣和州倫理委員會批准並獲瑞士 聯邦獸醫顧問同意。在21個月大時，老鼠隨機分成2組， 每組ίο隻。無補充劑之對照組小鼠（H2〇，每個年齡群 n=10)和補充LWB之小鼠（LWB，每個年齡群n=1〇)接受^合 成性飼料（Am-93)。LWB以〇.5%(w/v)溶液供應於飲用: 中，其新鮮製備並每隔一天更換。實驗期間（44曰），所有 小鼠谷許隨意飲水及攝食。進行相同試驗設計兩次，並亦 使用8個月大小鼠（每個年齡群n=8)進行試驗。試驗活體内 ❿ T細胞依賴性體液反應（產生抗原-特異性抗體）時，在實驗 第15天，藉由皮下注射（100 μ1)含於1% Aium(丹麥 Frederikssund市 Brenntag Biosector公司）中之 1〇〇 惰性抗 原鑰孔戚血藍蛋白（KLH，Sigma藥廠）免疫接種衰老之小 - 鼠。採用DTH反應用作活體内細胞免疫測量值β在誘發前 及誘發後24小時至8天，測定耳朵厚度（耳朵腫脹），以決定 其產生DTH反應之能力。簡言之，在使用KLH(即實驗第 22天）免疫接種後7天’藉由注射回憶性抗原KLH(l〇 μΐ之 0.5 gg/ml)至每一隻小鼠右耳，誘發〇ΤΗ反應。僅用媒劑 134143.doc •20· 200930389 (生理食鹽水=PBS)注射左耳，並充當每一隻動物之組内對 照組。誘發後24小時，並在接下來7天期間，測量未誘發 之耳朵（左耳）和已誘發之耳朵（右耳）。使用以下公式：耳 朵厚度之△·[已誘發之耳朵（右耳，KLH)厚度-未誘發之耳 . 朵（左耳，PBS)厚度]，以耳朵膨脹程度，亦即耳朵厚度變 化表示DTH反應（KLH-PBS)，其中耳朵厚度之[誘發後耳 朵厚度-誘發前耳朵厚度]。在實驗第〇、15、29天時收集血 ❻ 樣，及於第44天經由心臟穿刺收集血樣。在實驗第44天殺 死老鼠。在屍體解剖中，取出肝臟，取一小份立即於液態 氮中凍結。樣本存儲於-80°C直至進一步分析。 KLH特異性IgG2a抗體濃度定量法 由ELISA測定血清中之KLH特異性igG2a抗體之數量。簡 5之’用ΚΧΗ(50μ1/孔’ 1〇〇 ng /mi)塗覆微量滴定板，並 在37 C下培養3小時。在37°C下使用ELISA緩衝液阻斷游離 結合位置1小時。然後添加樣本，並在+4。〇下培養一夜。 ❿ 由已結合之抗體在37 C下與來自Southern Biotechnologies (美國Birmingham)之生物素共輛羊抗小鼠igG2a(y2a鍵特異 性）振盪反應1小時。在添加來自KPL之TMB過氧化物酶受 質後’分析板在450 nm下讀數。抗弘11 IgG2a抗體濃度係 ' 以〇D450nm平均值表示。 基因表現 取肝樣本移入1 ml RNA溶胞緩衝液（德國Diiren市 Macherey-Nagel公司）並使用設定在動力6之RibolyZer均質 器（美國Hybaid，Waltham，MA)均質化20秒。使用自商品購 134143.doc -21 - 200930389 買之套組（德國 Dtiren市 Macherey-Nagel 公司 NucleoSpin RNA II 套組）提取 RNA。使用 Ribogreen RNA Quantitation 套組（美國 Molecular Probes; Eugene, Oregon)定量 RNA，並 使用 Agilent RNA 6000 Nano LabChip套組（美國 Agilent Technologies, Palo Alto)分析RNA品質。遵循製造商指示 (瑞士Applied biosystems，Biosystems; Rokreutz)，使用 Multiscribe反轉錄酶反轉錄總RNA (2 pg)。定製之具有48 個TaqMan探針（負載量：在反應槽（technical monoplicates) 中，每一卡片承載8個樣本）之低密度基因陣列（LDA)係購 自Applied Biosystems(美國Foster市）並依製造商指示使 用。使用相對定量法AACt方法與SDS2.2.2軟體（Applied Biosystems)計算基因表現。產生之循環閾值（Ct)輸入至MS Excel(美國微軟（Microsoft))進一步分析。簡言之，首先計 算ACt值（即標靶基因Ct值-GAPDH管家基因Ct值），然後使 用下式：2·Λί：ιχ106計算相對mRNA表現。 ❹ 一般統計分析 由平均值+/-SEM或SD及史都登氏（Student)-t試驗（不配 對）或適當時藉由雙向方差分析，分析數據。小於5%概率 ‘值即視為顯著。 - 結果： A)證明乳-西方雪果抗炎性質之活體外實驗 乳-西方雪果（LWB)溶液於活體外抑制鼠科巨嗟細胞細胞 系受LPS介導之促炎性細胞素IL-6釋放（圖1)及抑制人腸上 皮細胞受LPS介導之NF-κΒ活化作用（圖2)。 134143.doc -22- 200930389 B)也明乳-西方雪果抗炎和加強免疫效果之活體内實驗 a.病理性急性炎 使用LWB之膳食補充法，在鼠科急性腸炎模式中證明其 強力抗炎性質《口服1% LWB可改善體重損失（圖3)、宏觀 和組織學損害（圖4和5)、明顯減少COX-2和pSTAT3表現程 度（圊6和7)。另外，與對照組相比，促炎性基因（如： TNFoc、IL-6和IL-Ιβ)和蛋白質（如；結腸中2KC)之表現 〇 減少（圖8)。同時，LWB在結腸中誘發強力增加抗氧化劑 基因（如：GPX-1、CATwS〇D2(圖9)，並在血漿中提高抗 氧化劑防禦性（圖1 〇)。 b. 與生理年齡有關之極輕微發炎 使用LWB (0.5%於飲用水中）之膳食補充法誘發衰老小鼠 肝臟中與發炎有關之基因表現下降至成年小鼠所觀察到之 程度（圖11 :例如用於編碼TNF-ot之基因）。 c. 衰老小鼠之免疫提高效果 〇 使用LWB (0.5%於飲用水中）之膳食補充法改進衰老小鼠 體液反應（圖12)和細胞介導之免疫反應（圖13)。 【圖式簡單說明】 圖1顯示：在鼠科巨噬細胞細胞系中，藉由LWb抑制lps 介導之IL-6產生（RAW細胞）。 圖2顯示：在人腸内上皮細胞系中，藉由LWB抑制Lps介 導之NF-κΒ活化（使用NF-icB報導子基因穩定轉染之HT_ 29)。

圖3顯示：投與TNBS之後減少之體重。平均值+ /_ SEM 134143.doc -23- 200930389 圖4A顯示：由個體數值和中位數值指示之宏觀得分評 價。 圖4B顯示：由平均值+/-SEM指示之宏觀得分評價。 圖5A顯示：由個體數值和中位數值指示之組織學得分評 價。 圖5B顯示：由平均值+ /-SEM指示之組織學得分評償。 圖6A顯示：由個體數值和中位數值指示有關對照蛋白 (肌動蛋白）之COX-2比率。 圖6B顯示：由平均值+ /-SEM指示之有關對照蛋白（肌動 蛋白）之COX-2比率。 圖7A顯示：由個體數值和中位數值指示之pSTAT3表 現。 圖7B顯示：由平均值+/- SEM指示之pSTAT3表現。 圖8A顯示：TNFoc促炎性基因之表現。 圖8B顯示：IL-6促炎性基因之表現。 g 圖8C顯示：在未補充和有補充LWB之鼠科急性腸炎模式 中之KC蛋白質。 圖8D顯示：IL-Ιβ促炎性基因之表現。 圖9A顯示：在未補充和有補充LWB之鼠科急性腸炎模式 中之GPX-1抗氧化劑基因之表現。 圖9B顯示：在未補充和有補充LWB之鼠科急性腸炎模式 中之CAT1抗氧化劑基因之表現。 圖9C顯示：在未補充和有補充LWB之鼠科急性腸炎模式 中之SOD2抗氧化劑基因之表現。 134143.doc -24- 200930389 圖10A顯不·由個體數值和中位叙社一 私示之抗氧化劑能 力。 圖10B顯示：由平均值+/-SEM指示之抗氧化劑能力。 圖11顯示：與在正常衰老小鼠（H20)和成年小氣（ctrl) 之肝臟中所觀察到之濃度相比，已補充LWB之衰老老鼠肝 臟中編碼TNF-α之基因表現。 圖12顯示：在衰老老鼠中之抗原（KLH)特異性抗體反 應。 圖13顯示：在衰老老鼠中之細胞介導免疫延滯型過度敏 感（DTH)反應。 ❹ 134143.doc 25-

Claims (1)

1. 200930389 十、申請專利範圍： 1· 一種包括西方雪果及/或其一部分之主要組合物用於製備 治療及/或預防發炎之產物之用途。 2. 如請求項丨之用途，其中此主要組合物進一步包括乳或 含乳蛋白質載體。 3. 如4求項1至2中任一項之用途，其中此主要組合物及/或 產品不包含不能溶解的纖維。 ❿4.如請求項1至2中任一項之用途，其中此產品預定供經 口、局部、腸及/或非經腸式投藥；及/或其中此產物可 為食物補充劑、作為藥劑或用於藥劑中之補充劑、作為 乳油或用於乳油中之補充劑；及/或其中此產品預定應用 至人或寵物。 5·如明求項1至2中一項之用途，其中此產品預定用於或用 作食品供人食用’例如作為營養完全配方、乳製品冷 藏或耐貯飲料、用於哺乳母親之產品、液體飲料、湯、 Φ 食物補充劑、膳食代替物、營養棒、糕餅、乳或發酵乳 產品、優酪乳、以乳為主之粉末、腸内營養產物、嬰兒 配方、嬰兒營養品、菜泥、穀物產品或以發酵穀物為主 ' 之產品、霜淇淋、糖果、甜點、餅乾、蛋糕、巧克力、 . 卡布奇諾、咖啡、餐廚用品（如：蛋黃醫、番茄糊或沙拉 醬料）、寵畜食物或寵畜飲料。 6·如請求項1至2中一項之用途，其中此產品是錠劑、膠 囊、藥丸、溶液、懸浮液、糖漿、粉末、凝膠、乳劑、 乾式口服補充物、濕式口服補充物、沐浴精、牙膏、洗 134143.doc 200930389 髮精、漱口劑、口紅或者個人衛生用品β 7·如請求項1至2中任一項之用途，其中此主要組合物包括 至少—部分西方雪果之親脂性及/或親水性生物活性物質 成分’其中此必需親脂性及/或親水性生物活性物質成分 較佳係選自由如下組成之群組：脂質、生物鹼、蛋白 質、碳水化合物、醣蛋白、類胡蘿蔔素、多酚類化合 物，如：類黃酮、維生素、礦物質，或其混合物。 8.

   9. 10. 如凊求項7之用途，其中此醣蛋白係選自由***半乳 聚糖蛋白質組成之群組，特定言之可藉由卜葡糖基 試劑（beta-Glue〇Syi YaHv reagent)檢測之寧夏枸杞（如聰 多釀和高分子，或其混合物；及/或其中類黃酮 選自由如下組成之群組：黃酮（如：芹菜素、木犀草素或 香葉木素）、黃酮醇（如：獬黃素、揚梅素、山奈紛）、黃 燒嗣化青素（如.天葵素、錦葵色素）或異黃_(如：金 雀異汽酮、木質異黃綱)’《其混合物；及/或其中類胡 蘿蔔素選自由如下組成之群組：#蘿蔔素和葉黃質， 如：莊紅素、胡蘿葡素、六氫莊紅素、八氫莊紅素、斑 蟹黃、卜隱黃質、辣椒紅、葉黃素、玉米黃質或彼等呈 脂肪酸S旨形式之物質，或其混合物。 11求項1至2中任一項之用途，其中此乳來自於動物或 、物’或其混合物，可為牛乳、美洲駝乳、水牛乳、山 :::綿平乳、植物合成乳，尤指豆漿，或其混合物。 如請求項1至2中任一 m、 之用途，其中藉由包括如下步驟 之方法製得此主要組人 背、，且合物：！）於乳或者含牛乳蛋白質之 134143.doc 200930389 液體介質中混合和礦磨西方雪果，ϋ)視需要選擇性分離 不能溶解的纖維，獲得水性懸浮液，iii)由所產生之懸浮 液視需要選擇性進行巴氏殺菌（pasteurising)，iv)處理期 間，視需要選擇性添加合成或天然生物活性物質成分， v)進一步視需要選擇性乾燥懸浮液，獲得粉末。 11. 如請求項1至2中一項之用途，其中此發炎選自由如下組 成之群組：急性發炎，如：膿毒病、傳染、燒傷和慢性 ❿ 發炎，如：發炎性腸病、克羅恩氏病（Crohn's disease，）、潰瘍 性結腸炎、壞死性小腸結腸炎、皮膚發炎，如：紫外線 或化學引起之皮膚發炎、濕疹、反應性皮膚、乾癖、白 斑病、粉刺、腸炎综合症、肝炎、酒精性肝硬變、過敏 反應、特異性反應 '骨炎、類風濕關節炎、全身性狼 瘡、葛氏-索氏（Gougerot-SjSgren's)综合症、萊特氏綜合 症（Reiter’s syndrome)、脊髓灰質炎、皮肌炎、甲狀腺炎、巴 澤多（Basedow)病、橋本病、！型糖尿病、愛迪生氏病 參 （Addison,s disease)、自體免疫肝炎、乳糜瀉、比爾默病 (Biermefs disease)、多發性硬化、肌無力、腦脊髓炎、眼睛 發炎、肥胖有關之發炎、年齡有關之極輕微發炎、布勞 (Blau)綜合征、阿茲海默氏病、心臟血管疾病、動脈粥 ， 樣硬化、新陳代謝综合症、齒齦炎和牙周病。 12. 如請求項1至2中任一項之用途，其中此產品同時加強免 疫系統’以改進受損之免疫反應、加強抗原特異性體液 免疫反應及/或加強細胞介導之免疫反應。 13. 如請求項1至2中任一項之用途，其中此產品預定用於嬰 134143.doc 200930389 兒、幼童、青少年、成年人及/或老年人。 14_如請求項1至2中任一項之用途，其中此產品預定用於維 持免疫功能及/或減輕發炎狀態。 1 5.如响求項丨至2中任—項之用途，其係治療或預防與氧化 壓力有關之病變。

   ❹ 134143.doc