CN101795699B - 枸杞和炎症 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及炎症领域。本发明尤其涉及天然组合物在制备治疗或预防炎症的产品中的用途。例如，枸杞提取物被证实具有抗炎特性。本发明的一种实施方式涉及包含枸杞或其一部分的初级组合物在制备治疗或预防炎症的产品中的用途。

Description

枸杞和炎症
本发明总体上涉及炎症领域。本发明尤其涉及天然化合物在制备治疗炎症的产品中的用途。例如，枸杞提取物被证实具有抗炎特性。
炎症是组织对有害刺激，例如病原体，损伤的细胞，或刺激物的复杂生物应答。其通常是生物体清除有害刺激和引发组织愈合过程的保护性尝试。但是，未充分控制的炎症可以导致几种疾病，不论受试者的年龄如何。
衰老与免疫***调节异常有关，例如细胞介导的免疫应答的显著下降，伴随增加的体液免疫功能异常(例如，对疫苗的低应答)。此外衰老经常与轻度炎症状态有关。因此，尤其很多老年人处于促进发病和死亡的感染和非感染疾病的高风险中。
枸杞因其对健康的多种益处而闻名，这是基于复合营养(例如，玉米黄素，维生素和宁夏枸杞多糖)成分。
但是，该领域仍然需要具有抗炎特性的可获得的天然化合物。
例如，营养介入，如n-3PUFA(多不饱和脂肪酸)减弱了炎性细胞功能，而且降低了细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖和NK活性)，其可以导致对于宿主防御潜在的不利影响。
因此本发明的目的是为本领域提供可选的天然化合物，其具有抗炎特性并且对于受试者的免疫防御没有任何不利影响。
本发明人惊奇地发现枸杞提取物具有抗炎特性。因此本发明的目的是通过为本领域提供枸杞提取物在制备治疗和/或预防炎症的产品中的用途而达到的。而且发现维持了免疫应答。
因此，本发明的一个实施方式是包括枸杞或其一部分和任选地包含乳或乳蛋白的载体的初级组合物，在制备治疗和/或预防炎症的产品中的用途。
该产品可以设计用于口服或局部施用。
乳或乳蛋白可以获自动物或植物来源，或来自其混合物。优选地，乳是牛奶，骆驼奶，水牛奶，山羊奶，绵羊奶，植物乳，尤其是大豆乳或其混合物。乳蛋白应当理解为可获自上面列出的一种或多种乳类型的蛋白级分。
优选地，初级组合物是易混合组合物。
特别是如果初级组合物包含乳或包含乳蛋白的载体，其有利地具有完整枸杞的基本活性组分的封闭范围，其具有在水相***中良好的稳定性，可混合性和/或可分散性。
进一步地，特别是如果包含乳或包含乳蛋白的载体，该初级组合物，以更好的生物利用率和稳定性形式，具有增强的营养价值。其具有令人愉快的味道和颜色。其能够被直接应用或被浓缩或干燥成粉末，用于日常消费的食物产品中的几种应用或其它营养用途。
如果初级组合物通过如下方法制备，那么可以获得所有这些特性，所述方法用于制备初级组合物以递送枸杞的基本亲脂和/或亲水生物活性组分，包括步骤：i)在乳或包括乳蛋白的液体介质中混合和碾磨枸杞材料，ii)任选分离不溶性纤维以获得水性悬浮液iii)任选巴氏灭菌产生的悬浮液iv)任选在加工过程中加入合成的或天然的生物活性组分v)和进一步任选干燥该悬浮液以得到粉末。
因此，在本发明的一种实施方式中，通过如下方法可得到初级组合物，该方法包括步骤：i)在乳或包括乳蛋白的液体介质中混合和碾磨枸杞材料，ii)任选分离不溶性纤维以获得水性悬浮液iii)任选巴氏灭菌获得的悬浮液iv)任选在加工过程中加入合成的或天然的生物活性组分v)和进一步任选干燥该悬浮液以得到粉末。
该方法的主要的益处是天然的和低成本，使得可以以其天然组分中稳定的水溶和脂溶化合物组合的形式改善改善多种营养物的递送，无有机溶剂残留。
在另外一方面，本发明提供了一种增加枸杞材料的生物活性化合物在水相***中的可混合性或可分散性，稳定性，和生物利用率的方法，其利用上述方法，尤其地，通过使用乳或乳蛋白，大豆乳或来自植物的乳样蛋白提取和递送枸杞的功能成分的多种营养物来实现。
上述初级组合物能够用于释放枸杞的功能成分的多种营养物，其具有改进的生物利用率，可混合性和稳定性。
术语生物活性化合物可以被理解为意思是当口服或局部应用时，显示出生物活性或健康影响的分子或组分。
枸杞可以例如，以果实和该植物的其它部分的形式使用。果实可以新鲜的，浓缩的或干燥的材料形式，例如，风干或冷冻干燥的材料使用。但优选使用干燥的成熟果实。
在本发明的一个优选实施方式中，初级组合物包含枸杞的至少一部分基本亲脂和/或亲水生物活性组分。
基本的亲脂和/或亲水生物活性组分优选选自包括脂质，生物碱，蛋白质，糖类，糖蛋白，类胡萝卜素，多酚化合物例如黄酮类化合物，维生素，矿物质或其混合物的组。
类胡萝卜素可以选自包括胡萝卜素和叶黄素例如，番茄红素，胡萝卜素，六氢番茄红素，八氢番茄红素，角黄素，β-隐黄素，辣椒红，叶黄素，玉米黄素，或那些脂肪酸酯形式或其混合物的组。
糖蛋白优选选自包括***半乳聚糖蛋白，尤其枸杞多糖和能够由β-葡糖基Yariv试剂检测的大分子的组。
黄酮类化合物优选选自包括黄酮例如5，7，4’-三羟黄酮，毛地黄黄酮，或香叶木素，黄酮醇例如栎精，杨梅黄酮，4’，5，7-三羟黄酮醇，黄烷酮，花色素例如花葵素，二甲翠雀素，或异黄酮例如染料木黄酮，大豆黄素，或其混合物的组。
本发明的初级组合物可以在乳中或包括乳蛋白的载体中含有至少包含枸杞或其中一部分的基本生物活性组分，不包括不溶性纤维。乳载体可以是来自动物或植物来源的脱脂乳或全脂乳形式(例如，大豆乳，果汁或椰子乳，等)。在一种更优选的实施方式中，根据希望得到的初级组合物使用牛奶或大豆乳。举例来说，包含乳的载体可以是包括乳蛋白，如酪蛋白或乳清蛋白的任何可食用的液体。
植物油可以任选加入到液体介质中。
枸杞材料可以在所述乳或包括乳蛋白的液体介质中以约1∶1到1∶1000，优选从1∶5到1∶50的各自比例混合和碾磨。混合和碾磨步骤可以在从1到95℃，优选从约20到80℃，和更优选从40到80℃的温度下进行。然后，不溶性纤维可以被至少部分去除以获得水性悬浮液。
其可以通过任何常规方法进行。产生的初级组合物可以通过本领域已知的技术进一步被巴氏灭菌和/或干燥成粉末。获得的初级组合物也可以是液体或凝胶形式。
这样品发明提供了初级组合物，其包括与完整果实相似谱的重要营养物，其具有良好稳定性，可混合性和生物利用率。如果选择粉末形式，这些组合物可以在水相***中是高度可分散的。在这种情况下，举例来说，粉末在冷水或热水中是可分散的。其同样能够加入乳中。
另外，组合物可以包含一种或多种乳化剂，稳定剂，抗氧化剂和其它添加剂。优选使用相容于食物的乳化剂，如磷脂，例如卵磷脂，聚氧乙烯山梨糖醇酐单或三硬脂酸酯，单月桂酸酯，单棕榈酸酯，单或三油酸酯，单或二甘油酯。
也可以使用已知在食物，化妆品，或药品中适用的任何类型的稳定剂。
可以使用已知在食物，化妆品，或药品中适用的任何类型的抗氧化剂。
可以进一步使用已知在食物，化妆品，或药品中适用的添加剂，香味剂，色素。
依照初级组合物预期的最终用途，可以加入乳化剂，稳定剂，抗氧化剂和添加剂。
该组合物可以进一步包含合成的或天然的生物活性成分如氨基酸，脂肪酸，维生素，矿物质，类胡萝卜素，多酚等。其优选在巴氏灭菌和/或干燥之前，通过干燥或者潮湿混合加入到所述组合物中。
使用本发明制备的产品可以是膳食补充剂，用作或用于药物的补充剂或用作或用于乳膏的补充剂。
在本发明的一个优选实施方式中，该产品预期用于由人或宠物使用和/或应用于人或宠物。
该产品可以施用于任何年龄的受试者，尤其是婴儿，儿童，青少年，成年人和/或老年人。但是，枸杞的益处似乎尤其适合于成年人和老年人。
根据本发明的一种优选实施方式，通过使用本发明制备的产品预期在食品中或作为食品，用于人类消费。该食品可以经肠应用-为了本发明的目的，包括口服的或-胃肠外的。
因此，该初级组合物可以是口服应用的食品中的添加剂，例如在营养组合物，食品补充剂，宠物食物产品，化妆品制剂中或在药物制剂中。初级组合物也可以是局部使用的产品，如化妆品或药物制品中的添加剂。
因此，通过使用本发明制备的产品可以是营养完全配方食品，乳制品，冷藏的或耐贮藏饮料，用于哺乳母亲的产品，液体饮料，汤，膳食补充剂，膳食替代品，营养棒，甜食，乳或发酵乳制品，酸乳酪，奶粉，肠内营养制品，婴儿配方奶粉，婴儿营养制品，浓汤，谷类制品或发酵谷类制品，冰淇淋，糖果，甜点，饼干，蛋糕，巧克力，热牛奶咖啡，咖啡，烹饪制品例如蛋黄酱，番茄酱，或沙拉酱，宠物食品或宠物饮品。在一种优选实施方式中，用于人类消费的食品组合物由上面的初级组合物补充。初级组合物，优选粉末形式的初级组合物，能够按照获得上述生物活性营养物日常摄入的量在上面提到的食品或饮料中分散，其可以根据希望的效果和目标组织选择。为获得有益效果而由个体消费的初级组合物或食品组合物的量还取决于其大小，类型和年龄。
如果该产品是口服施用的营养补充剂，其可以存在于胶囊，明胶胶囊，软胶囊，片剂，糖衣片剂，丸剂，糊剂或锭剂，树胶，或可饮用的溶液或乳剂，糖浆或凝胶中。初级组合物的剂量可以根据本领域技术人员意欲达到的目的变化，但通常在初级组合物为约0.1到100重量百分数之间。这样的补充剂也可以包括增甜剂，稳定剂，抗氧化剂，添加剂，调味剂和/或色素。此外，化妆用目的的补充剂可以包括有关皮肤的活性组合物。
在另外一种实施方式中，如果本发明的产品是药物组合物，其可以被施用用于预防和/或治疗性治疗。
在治疗应用中，组合物以足以至少部分治愈或抑制疾病症状和其并发症的量被施用。足以达到该目的的量被定义为“治疗有效剂量”。对该目的有效的量取决于本领域技术人员已知的多种因素，例如疾病的严重程度和病人的体重和一般状态。在预防应用中，根据本发明的组合物以足以至少部分降低患病风险的量应用于易感特定疾病或处于特定疾病风险的病人。这样的量定义为“预防有效剂量”。再次，准确的量取决于多种病人的特定因素，例如，病人的健康状况和体重。
本发明的组合物，如果作为药物组合物施用，优选与药学上可接受的载体一起施用，载体的基本性质根据施用方式而不同，例如，经肠的，口服的和局部(包括眼科用)途径。希望的剂型可以使用各种赋形剂制备，包括，例如，药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁。
可以理解的是，技术人员可以基于其掌握的知识，考虑施用的途径，选择靶向活性化合物到目的组织，例如，皮肤，结肠，胃，眼睛，肾脏或肝脏的适宜的组分和盖仑形式。
本发明也涉及包含上述初级组合物的化妆品组合物。例如，其可以配制在洗剂，洗发剂，乳膏，防晒霜，晒后霜剂，抗衰老霜剂和/或软膏中。能够局部使用的组合物进一步包含可以在化妆品中使用的脂肪或油，例如CTFA化妆品原料手册(Washington)中提到的那些。加入其它的化妆活性成分也是可能的。组合物进一步包含结构剂(structuring agent)和乳化剂。其它的赋形剂，着色剂，香料或遮光剂也可以加入到该组合物。可以理解的是，本化妆品制品可以包含技术人员已知的不同成分的混合物，以保证所述物质快速渗透入皮肤和预防其贮存过程中的降解。
可以理解的是，本发明的概念可以同样用作辅助性治疗，协助目前使用的药物。由于本发明的化合物可以容易地与食品材料一起施用，可以应用包含大量所述物质的专门临床食品。
上述食品，营养补充剂，化妆品或药物组合物施用给宠物或人，获得改善的健康状况，尤其是通过至少部分地减轻炎症。
能够通过应用使用本发明制备的产品而被治疗的炎症可以选自急性炎症例如脓毒症，感染，烧伤，和慢性炎症例如炎性肠病，克隆病，溃疡性结肠炎，坏死性肠结肠炎，皮肤炎症，例如紫外线或化学诱导的皮肤炎症，湿疹，反应性皮肤，银屑病，白癜风，痤疮，炎性肠病综合征，肝脏炎症，酒精性肝硬化，***反应，特异反应性，骨炎症，类风湿性关节炎，***性红斑狼疮，Gougerot-Sjogren’s综合征，赖特尔综合征，脊髓灰质炎，皮肌炎，甲状腺炎，巴泽多病，桥本病，I型糖尿病，艾迪生病，自身免疫性肝炎，乳糜泻，比尔默病，多发性硬化，肌无力，脑脊髓炎，眼炎症，肥胖相关的炎症，年龄相关的轻度炎症，Blau’s综合征，阿尔茨海默氏病，心血管疾病，动脉粥样硬化，代谢综合征，牙龈炎和paronditis。
本发明人已经研究了本发明的初级组合物抗炎效果的分子机制。不希望受理论约束，发明人现在相信，其抑制巨噬细胞的LPS-介导的促炎细胞因子的产生(图1)和人肠上皮细胞内TNF-α或LPS-诱导的NF-κB活化途径(图2)。在临床前研究中，包括本发明初级组合物的膳食补充剂在急性肠炎的小鼠模型中显示了强烈抗炎特性(图3到10)。此外，本发明的初级组合物还能够减少年老小鼠肝脏中促炎细胞因子的表达，例如，TNF-α(图11)。而且，包括本发明初级组合物的膳食补充剂增强年老小鼠体内抗原特异性的体液和细胞介导的免疫应答(分别见图12和13)。这样，本发明的初级组合物被证实有益于减轻炎症状态。同时，本发明的初级组合物还能够支持免疫***。
因此，本发明制备的产品可以用于减轻炎症状态和-同时-提升免疫***。
因此，本发明的初级组合物具有恢复受损免疫和炎症反应到稳态的潜力。通过此双重效应，本发明的初级组合物适于，例如，在老年的，临床的和宠物营养的产品中使用。
本发明的初级组合物尤其有益于维持衰老过程中的免疫功能，同时减轻年龄相关的轻度炎症状态。
本发明的初级组合物也可以应用于控制急性或慢性炎症的临床产品。
因此，在本发明的一个实施方式中，通过使用本发明制备的产品被用于改善受损的免疫应答。其也可以用于增强抗原特异性的体液免疫应答和/或增强细胞介导的免疫应答。
另外，该初级组合物和/或本发明的产品可以用于治疗或预防氧化应激相关的疾病。发明人已经证实使用该初级组合物和/或本发明的产品能够诱导抗氧化基因显著的增加，例如，GPX-1，CAT1和SOD2(图9)。因此，该初级组合物和/或本发明的产品可以提供针对氧化应激的保护，所述氧化应激由例如，自由基，如·O2-，超氧阴离子；H2O2，过氧化氢；·OH，羟基自由基；ROOH，有机氢过氧化物；RO·，烷氧自由基；ROO·，过氧自由基；HOCl，次氯酸；OONO-，过氧亚硝酸根；和/或NO·引起。
本领域技术人员明确的是，可以自由组合本文所述的任何特征而不脱离本发明原始公开的范围。
从下面的实施例和附图来看，本发明进一步的优点和特点是显而易见的。
图1显示了小鼠巨噬细胞系(RAW细胞)中通过LWB抑制LPS-介导的IL-6的产生。
图2显示了人肠上皮细胞系(稳定转染NF-κB报告基因的HT-29)中通过LWB抑制LPS-介导的NF-κB的活化。
图3显示了TNBS施用后体重的减轻。平均数+/-SEM。
图4显示了宏观的得分评定。右侧区：平均数+/-SEM；左侧区：个体值和中位数。
图5显示了组织学得分评定。右侧区：平均数+/-SEM；左侧区：个体值和中位数。
图6显示了COX-2与参考蛋白(肌动蛋白)的比例。右侧区：平均数+/-SEM；左侧区：个体值和中位数。
图7显示了pSTAT3的表达。右侧区：平均数+/-SEM；左侧区：个体值和中位数。
图8显示了急性肠炎的小鼠模型中促炎基因，例如TNFα，IL-6和IL-1β和蛋白质，例如KC的表达，补充或不补充LWB。
图9显示了急性肠炎的小鼠模型中抗氧化基因，例如，GPX-1，CAT1和SOD2的表达，补充或不补充LWB。
图10显示了抗氧化能力。右侧区：平均数+/-SEM；左侧区：个体值和中位数。
图11显示了与正常年老小鼠(H20)和成年鼠(CTRL)肝脏中观察到的水平相比，补充LWB的年老小鼠肝脏中编码TNF-α的基因的表达。
图12显示了年老小鼠体内抗原(KLH)特异性的抗体反应。
图13显示了年老小鼠体内细胞介导的免疫的迟发型超敏(DTH)反应。
实施例1
包含枸杞和乳的初级组合物的制备(LWB，乳糖-枸杞，Lacto-Wolfberry)
将干燥的枸杞果实(40g)和全脂乳(300g)加入到1升的容器。混合物保持静止不动10分钟，在氮气条件下用Polytron(Dispersing and MixingTechnology by KINEMATICA，PT3000)以26000rpm处理15分钟。在Polytron处理过程中，混合物的温度通过水浴方法维持在80-85℃，之后冷却到室温。获得的混合物接着以2000G离心10分钟。丢弃固体残余物。液相(306g橘黄色乳)被冻干。干燥产品最终被磨碎，产生54g橘黄色粉末，其与枸杞果实粉末相比，显示出极好的水分散性和改善的玉米黄素稳定性。
实施例2
试剂
来自先导批N·WB03A1506H，照上述方式在NRC(雀巢研究中心，Lausanne)生产的乳糖-枸杞(LWB)粉末和枸杞提取粉末(批次N·WB03A1506H)由J.Wang(FS，Lipids & Bioactives)提供。来自大肠杆菌血清型055：B5的脂多糖(LPS)购自Sigma(St.Louis，MO)。经伦理委员会批准，从产后20天的不同健康供者收集人母乳(HM)。钥孔血蓝蛋白(KLH)购自Sigma。
细胞培养
小鼠单核细胞/巨噬细胞系RAW 264.7(TIB-71，来自ATCC，Manassas，Virginia，USA)在添加10％热灭活FCS(Amimed)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen，Paisley，UK)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Amimed，Bioconcept，Allschwill，Switzerland)中，于37℃，5％CO2/空气的培养箱中培养。使用胰蛋白酶/EDTA(Sigma，St-Louis，MO，USA)传代细胞。人结肠腺癌细胞系HT-29克隆34细胞(即，稳定转染了NF-κB报告基因的HT-29细胞)在包含1％稳定L-谷氨酰胺和添加10％热灭活(56℃一个小时)FCS，1％青霉素/链霉素(Sigma，St Louis，MO)，500ug/ml G418(Invitrogen)和100ug/ml normocin(Invivogen)的高葡萄糖(4.5g/l)DMEM(Bioconcept，Allschwill，Switzerland)中，于37℃，5％CO2/空气的培养箱中培养。培养基每2天更换直到细胞单层达到约90％汇合。使用胰蛋白酶/EDTA(Sigma)传代细胞。
定量LPS-介导的IL-6表达
RAW264.7细胞以104个细胞/孔接种于平底96孔板(Nunc，Rosklide，Denmark)普通培养基中，置于37℃，5％CO2/空气的培养箱中。培养三天后(即，细胞达到约80％汇合)，不存在或存在LWB样品(终浓度0.1-1％)情况下，细胞在普通培养基中以0.5ug/ml大肠杆菌LPS(055：B5，Sigma)刺激或不刺激24小时。接着收获细胞培养上清液并用于定量IL-6的产量。根据制造商的说明通过ELISA(Murine IL-6Eli-pair，Diaclone，Besancon，France)测定细胞培养上清液中的白细胞介素6(IL-6)水平。
NF-κB的活性
HT-29克隆34细胞以104个细胞/孔接种于平底96孔板(Nunc)培养物维持培养基中。培养3-4天后(即，细胞达到约80％汇合)，在磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma)中清洗细胞，接着在不存在或存在LWB样品的情况下，在包含1％青霉素/链霉素的DMEM中，以LPS(10ng/ml+5％人母乳)或者重组TNF-α(10ng/ml；R&D systems，Oxon，England)刺激或不刺激24小时。接着收获细胞培养上清液并贮存于+4℃ O/N直到分析NF-κB的活性。NF-κB激活后，HT-29克隆34细胞在培养上清液中分泌碱性磷酸酶(SEAP)。根据制造商的说明(Applied Biosystems，Bedford，USA)，使用荧光检测方法(Phospha-LightTM System)检测SEAP释放。简要地，细胞培养上清液与Phospha-LightTM System的反应缓冲液在白色平底96孔聚丙烯板(Greiner)中孵育20分钟，使用Spectrafluor Plus分光光度计(Tecan 8634 Hombrechtikon，Switzerland)检测荧光。结果表达为相对发光单位(RLU)。
TNBS-诱导的结肠炎模型
TNBS结肠炎模型是由化学产品：三硝基苯磺酸(TNBS)以150mg/kg的剂量诱导的急性炎症模型。每组10只小鼠，在诱导结肠炎前七天已经用包含1％LWB(50mg)的饮食喂养，直到处死。在施用TNBS后1到4天，50mgL WB通过管饲法供给，以补偿与急性肠炎相关的低饮食摄入。评估每只动物的体重减轻，宏观的组织学评分，COX-2，pSTAT3，促炎和抗氧化基因表达和抗氧化能力。宏观的和组织学评分根据Wallace(Wallace等，1989)和Ameho(Ameho等，1997)的评分标准进行。COX-2(诱导型环加氧酶，72kDa蛋白)负责急性炎症条件下***素的可诱导的生物合成。Stat3是很多细胞因子的重要信号分子；尤其是对促炎细胞因子，如IL-6而言。
在年老小鼠中评估免疫调节的研究设计
无特定病原体的雄性C57BL/6J小鼠(4周大小)购自Charles RiverLaboratories Inc(France)。小鼠在常规环境(12小时光照/黑暗循环，温度22℃，湿度56％)下饲养和自由饮水和进食半合成的Kliba 3434。小鼠维持每笼5只直到5个月大小，接着它们被单独关在笼中。所有条件和动物处理均由雀巢和国家伦理委员会批准，其与瑞士联邦兽医顾问意见一致。21个月大小的小鼠被随机分入2组，每组10只动物。非补充的对照小鼠(H20，n＝10每年龄组)和LWB补充小鼠(LWB，n＝10每年龄组)接受半合成饮食(AIN-93)。LWB以0.5％(w/v)的溶液以饮用水形式提供，其新鲜配制并每隔一天更换。在试验过程中(44天)，允许所有小鼠自由饮水和取食。同样的研究设计被进行两次，并也用8个月大小的小鼠进行(n＝8每组)。为了研究体内T细胞依赖的体液应答(抗原特异性的抗体产生)，年老小鼠在试验的第15天通过皮下注射(100ul)1％明矾(Brenntag Biosector，Frederikssund，Denmark)中惰性抗原钥孔血蓝蛋白(KLH，Sigma)100ug进行免疫。DTH反应被用作细胞免疫的体内度量。在引发之前和之后24小时到8天进行耳厚度(耳肿胀)测量，以确定产生DTH反应的能力。简要地，用KLH免疫小鼠7天后(即试验的第22天)，通过注射回忆抗原KLH(0.5ug/ml，10ul)到每只小鼠的右耳引发DTH反应。左耳单独注射载体(盐水＝PBS)并作为每只动物的内部对照。引发后24小时，和接下来的7天过程中，非引发的耳(左耳)和引发的耳(右耳)均被测量。DTH反应(KLH-PBS)表达为耳肿胀程度，即，耳厚度的变化，应用下面的公式：Δ耳厚度-[(引发的耳(右，KLH)厚度-非诱发耳(左，PBS)耳厚度)，其中Δ耳厚度＝[引发后耳厚度-引发的前耳厚度]。在第0，15，29天从尾静脉并且第44天通过心脏穿刺收集血液样品。小鼠在试验的第44天被处死。在尸体解剖中，移除肝脏并且迅速在液氮中冻存一块。样品贮存于-80℃直至进一步分析。
定量KLH-特异性的IgG2a抗体水平
血清中KLH-特异性的IgG2a抗体的量通过ELISA测定。简要地，微量滴定板用KLH(50ul/孔，100ng/ml)包被并在37℃孵育3小时。自由结合位置用ELISA缓冲液在37℃封闭1小时。接着加入样品并在+4℃孵育过夜。摇动下，结合的抗体与来自Southern Biotechnologies(Birmingham，USA)的缀合生物素的山羊抗小鼠IgG2a(γ2a链特异性的)于37℃反应1小时。平板在加入来自KPL的TMB过氧化物酶底物后于450nm读数。抗-KLH IgG2a抗体水平被表达为OD450nm值的均值。
基因表达
肝脏样品被转移到1ml RNA裂解缓冲液中(Macherey-Nagel，Duren，Germany)并使用Ribolyzer(Hybaid，Waltham，MA，USA)以下面的设置匀浆：功率6，20分钟。使用商业上可获得的试剂盒(NucleoSpinRNA II试剂盒；Macherey-Nagel，Duren，Germany)进行RNA提取。使用Ribogreen RNA定量试剂盒(Molecular Probes；Eugene，OregonUSA)实现RNA定量，并使用Agilent RNA 6000Nano LabChip试剂盒测定RNA质量(Agilent Technologies，Palo Alto，USA)。根据制造商的说明(Applied biosystems，Biosystems；Rokreutz，Switzerland)，使用Multiscribe逆转录酶反转录总RNA(2μg)。定制的具有48个TaqMan探针的低密度阵列(LDA)(负荷能力：技术monoplicates中每张卡8个样品)购自Applied Biosystems(Foster City，USA)并根据制造商的说明使用。以SDS2.2.2计算机软件(Applied Biosystems)，使用相对定量方法ΔΔCt法计算基因表达。得到的循环阈值(Ct)值被输出到MS Excel(Microsoft，USA)进一步分析。简要地，首先计算ΔCt值(即，靶基因的Ct值-GAPDH持家基因的Ct值)，接着使用下面的公式：2-ΔCt×106，确定相对mRNA表达。
一般统计分析
通过平均数+/-SEM或标准差，和斯氏T检验(非配对)，或当适合时，两因素方差分析，来分析数据。低于5％的概率值被认为是显著的。
结果
A)体外实验证实了乳糖-枸杞的抗炎特性
乳糖-枸杞(LWB)溶液在体外抑制小鼠巨噬细胞系由LPS介导的促炎细胞因子IL-6的释放(图1)和人肠上皮细胞中LPS-介导的NF-κB的活化(图2)。
B)体内实验证实了乳糖-枸杞抗炎和免疫增强效应
a.病理的急性炎症
具有LWB的膳食补充剂在急性肠炎小鼠模型中证实了强烈的抗炎特性。口服施用1％的LWB获得了体重减轻的改善(图3)、宏观的和组织学的病变(图4和5)的改善，COX-2和pSTAT3表达水平的显著降低(图6和图7)。另外，与对照组相比，结肠内促炎基因，例如TNFα、IL-6和IL-1β和蛋白质，例如KC的表达下降(图8)。并行地，LWB诱导了结肠内抗氧化基因例如GPX-1，CAT1和SOD2的显著增加(图9)并增强了血浆中的抗氧化防御(图10)。
b.生理的年龄相关的轻度炎症
相对于成年小鼠体内观察到的水平，具有LWB膳食补充剂(饮用水中0.5％)导致了年老小鼠肝脏中炎症相关基因的表达下降(图11：编码TNF-α的基因作为示例)。
c.年老小鼠体内的免疫增强效应
具有LWB的膳食补充剂(饮用水中0.5％)改善了年老小鼠体内体液(图12)和细胞介导的免疫应答(图13)。

Claims (13)

1.包含枸杞果实或其一部分的初级组合物在制备治疗和/或预防炎症的产品中的用途，其中所述初级组合物进一步包含乳或含有乳蛋白的载体，并且其中所述初级组合物和/或产品不包含不溶性纤维， 
其中所述组合物可通过包括以下步骤的方法得到： 
i)在乳或包含乳蛋白的液体介质中混合和碾磨枸杞材料， 
ii)分离不溶性纤维以获得水性悬浮液， 
iii)任选巴氏灭菌产生的悬浮液， 
iv)任选在加工过程中加入合成的或天然的生物活性组分， 
v)和进一步任选干燥该悬浮液以得到粉末。 
2.根据权利要求1的用途，其中所述产品经设计用于经口、局部、经肠和/或胃肠外施用；和/或其中该产品是膳食补充剂，用作或用于药物的补充剂或用作或用于乳膏的补充剂；和/或其中该产品设计用于由人或宠物使用和/或应用于人或宠物。 
3.根据权利要求1或2的用途，其中该产品设计用于食品中或作为食品用于人类消费，所述食品选自营养完全配方食品、乳制品、冷藏的或耐贮藏饮料、用于哺乳母亲的产品、液体饮料、汤、膳食补充剂、膳食替代品、营养棒、甜食、乳或发酵乳产品、酸乳酪、奶粉、肠营养产品、婴儿配方奶粉、婴儿营养产品、浓汤、谷类或发酵谷类产品、冰淇淋、糖果、甜点、饼干、蛋糕、巧克力、热牛奶咖啡、咖啡、烹饪制品、宠物食品或宠物饮品。 
4.权利要求3的用途，其中所述烹饪制品为蛋黄酱、番茄酱、或沙拉酱。 
5.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述产品是片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、混悬剂、粉剂、凝胶剂、乳膏、沐浴露、牙膏、洗发剂、漱口水、唇膏、或个人卫生产品。 
6.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述产品是干燥口服补充剂、 湿润口服补充剂。 
7.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述产品是糖浆剂。 
8.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述乳来自动物或植物来源，或其混合物。 
9.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述乳是牛奶、骆驼奶、山羊奶、绵羊奶、植物乳或其混合物。 
10.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述乳是水牛奶或大豆乳。 
11.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述产品同时加强免疫***、改善受损的免疫应答、增强抗原特异性的体液免疫应答，和/或增强细胞介导的免疫应答。 
12.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述产品设计由婴儿、儿童、青少年、成年人和/或老年人使用。 
13.根据权利要求1-2之一的用途，其中所述产品设计用于维持免疫功能和/或减轻炎症状态。 
14.根据权利要求1-2之一的用途，用于治疗或预防氧化应激相关的疾病。 
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