SK6842002A3

SK6842002A3 - Modified peptides and peptidomimetics for use in immunotherapy

Info

Publication number: SK6842002A3
Application number: SK684-2002A
Authority: SK
Inventors: Staveren Catherina Joanna Van; Cornelis Marius Timmers; Van Phillippus Johannes Galen; Rnaldus Marcellus Alph Knegtel; Anna Maria Helena Boots; Andreas Martinus Ma Miltenburg
Original assignee: Akzo Nobel Nv
Priority date: 1999-10-18
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2002-09-10
Also published as: MXPA02003520A; CN1379786A; HK1046693A1; HUP0203504A2; WO2001029081A1; EP1226167A1; NO20021763D0; CO5271650A1; IL148778A0; CA2386398A1; RU2002113107A; AU780238B2; JP2003512388A; TR200201036T2; ZA200202577B; PL354590A1; BR0014803A; KR20020047245A; AR026068A1; NZ518256A

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka modifikovaných peptidov, ktoré sú založené na HC gp-39 (263-275), farmaceutických prostriedkov obsahujúcich takéto peptidy, ako aj použitia týchto peptidov na indukciu tolerancie u pacientov trpiacich na autoimunitné ochorenia.

Doterajší stav techniky

Imunitný systém je založený na princípe diskriminácie medzi cudzími antigénmi (nevlastné antigény) a autoantigénmi (vlastné antigény odvodené z vlastného tela jednotlivcov), ktorý sa dosahuje prostredníctvom zabudovanej tolerancie voči autoantigénom.

Imunitný systém chráni jedincov pred cudzími antigénmi a odpovedá na vystavenie cudziemu antigénu aktiváciou špecifických buniek, ako napríklad T- a B lymfocytov, a produkovaním rozpustných faktorov, ako interleukínov, protilátok a komplementových faktorov. Antigén, na ktorý odpovedá imunitný systém, sa degraduje antigén prezentujúcimi bunkami (APCs) a fragment antigénu sa exprimuje na bunkovom povrchu spojený s glykoproteínom hlavného histokompatibilného komplexu (MHC) II. triedy. Komplex MHC-glykoproteínu a antigénového fragmentu sa prezentuje T bunke, ktorá prostredníctvom svojho T bunkového receptora rozoznáva antigénový fragment spolu s MHC proteínom

II. triedy, na ktorý sa naviaže. T bunka sa stáva aktivovanou, tzn. proliferuje a/alebo produkuje interleukíny, čoho výsledkom je expanzia aktivovaných lymfocytov nasmerovaných proti antigénu, na ktorý sa útočí (Grey a ďalší, Sci. Am., 261:38-46, 1989).

Aj vlastné antigény sú kontinuálne spracovávané a prezentované ako antigénové fragmenty MHC glykoproteínmi T bunkám (Jardetsky a ďalší, Náture ++353: 326-329, 1991). Takže rozoznávanie vlastného je súčasťou imunitného

-2systému. Za normálnych okolností imunitný systém toleruje vlastné antigény a je vylúčená aktivácia imunitnej odpovede týmito vlastnými antigénmi.

Keď a stratí tolerancia voči vlastným antigénom, imunitný systém sa aktivuje proti jednému alebo viacerým vlastným antigénom, že vedie k aktivácii autoreaktívnych T buniek a k produkcii autoprotilátok. Tento fenomén sa označuje ako autoimunita. Keďže imunitná odpoveď je vo všeobecnosti deštruktívna, tzn. ničí invazívny cudzí antigén, môžu autoimunitné odpovede spôsobovať deštrukciu telu vlastného tkaniva.

Podiel T buniek na autoimunitných ochoreniach bol stanovovaný v niekoľkých štúdiách. U myší je experimentálna autoimunitná encefalomyelitída (EAE) sprostredkovaná veľmi obmedzenou skupinou T buniek, ktoré sú charakteristické ich špecificitou pre jediný epitop myelínového bázického proteínu (MBP) v komplexe s MHC molekulou II triedy. U Lewis potkana, druh s vysokou náchylnosťou na rôzne autoimunitné ochorenia, sa ukázalo, že choroba je sprostredkovaná T bunkami. Myslí sa, že aj u ľudí sú autoimunitné ochorenia spojené s vývojom auto-agresívnych T buniek.

Deštruktívna autoimunitná odpoveď sa podieľa na rôznych ochoreniach, ako napríklad na reumatoidnej artritíde (RA), pri ktorej sa deštruuje integrita kĺbovej chrupavky chronickým zápalovým procesom, ktorý je výsledkom prítomnosti veľkého počtu aktivovaných lymfocytov a buniek exprimujúcich MHC II. triedy. Ukázalo sa, že samotná prítomnosť chrupavky je nevyhnutná na nepretržitú lokálnu zápalovú odpoveď: bolo navrhnuté, že degradácia chrupavky je spojená s aktivitou na chrupavku odpovedajúcich autoreaktívnych T buniek pri RA (Sigall a ďalší, Clin. Exp. Rheumat. 6: 59, 1988; Glant a ďalší, Biochem. Soc. Trans. 18: 796, 1990; Burmester a ďalší, Rheumatoid arthritis Smolen, Kalden, Maini (vyd) SpringerVerlag Berlín Heidelberg, 1992). Okrem toho sa ukázalo, že chirurgické odstránenie chrupavky z RA pacientov redukuje zápalový proces (R. S. Laskin, J. Bone Joint Surgery (Am) 72: 529, 1990). Chrupavkové proteíny sú preto považované za cieľové autoantigény, ktoré sú kompetentné na stimuláciu T buniek. Aktivácia týchto autoreaktívnych T buniek vedie k vývoju autoimunitného ochorenia. Avšak identifikácia autoantigénnych komponentov, ktoré hrajú úlohu pri nástupe reumatoidnej artritídy doteraz stále uniká.

-3Zápalovú odpoveď, ktorej výsledkom je deštrukcia chrupavky, je možné liečiť niekoľkými liekmi, ako napríklad steroidnými liekmi. Avšak tieto lieky sú Často imunosupresívnymi liekmi, ktoré sú nešpecifické a majú toxické vedľajšie účinky. V dôsledku nevýhodnosti nešpecifickej imunosupresie je táto terapia veľmi nevýhodná.

Antigénovo špecifická, netoxická, imunosupresívna terapia poskytuje veľmi atraktívnu alternatívu voči nešpecifickej imunosupresii. Táto antigénovo špecifická terapia zahŕňa liečbu pacientov s cieľovým autoantigénom alebo so syntetickými peptidmi, odvodenými od cieľového autoantigénu, reagujúcimi s T bunkami. Tieto syntetické peptidy zodpovedajú T bunkovým epitopom autoantigénu a môžu byť použité na indukciu špecifickej T bunkovej tolerancie tak voči sebe samým, ako aj voči autoantigénu. Znecitlivovanie alebo imunologická tolerancia imunitného systému sú založené na dlho pozorovanom fenoméne, že zvieratá, ktoré boli kŕmené antigénom alebo epitopom alebo inhalovali antigén alebo epitop, sú menej schopné vyvíjať systémovú imunitnú odpoveď voči uvedenému antigénu alebo epitopu, keď sa tento antigén alebo epitop zavádza systémovým spôsobom.

Reumatoidná artritída je autoimunitné ochorenie, ktoré nastáva častejšie u HLA-DR4 pozitívnych jedincov. Z tohto prepojenia ochorenia môže vyplývať, že DR4 molekuly prezentujú autoantigény T-bunkám. Cieľom tohto ochorenia je kĺb, kde kĺbová chrupavka predstavuje unikátny bunkový typ produkujúci produkty organizované v matrici. Myslí sa, že deštrukcia kĺbu, ako je pozorovaná pri RA, je sprostredkovaná chrupavkovo špecifickými, autoreaktívnymi T-bunkami. Chrupavkový proteín, ľudský chrupavkový gp-39 (HC gp-39), bol v súčasnosti identifikovaný ako kandidátsky autoantigén pri RA. Dominantný epitop HC gp-39 proteínu, peptid zahŕňajúci 263-275 sekvenciu, bol preferenčne rozoznávaný u RA pacientov, z čoho vyplýva, že tento epitop je cieľom autimunitného útoku pri reumatoidnej artritíde. Osem z 18 RA pacientov odpovedalo na tento peptid a žiadne odpovede sa nezistili u zdravej donorovej skupiny (Verheijden a ďalší, Arthtritis Rheum. 40: 1115, 1997). Takže údaje silne naznačujú, že tento peptid alebo HC gp-39 proteín sú cieľom imunitného rozoznávania v kĺbe.

-4Význam HC gp-39 pre artritické ochorenie bol demonštrovaný aj jeho artritogénnosťou u Balb/c myší. Jediná injekcia do hrudnej oblasti s μg množstvami proteínu zmiešanými v IFA, indukovala chronický kĺbový zápal pripomínajúci RA.

Odpoveď na HC gp-39 peptid 263-275 sa ďalej skúmala generovaním sady DRB1 *0401-obmedzených, peptidovo špecifických T-T hybridómov z DRB 1*0401 transgénnych myší po imunizácii s HC gp-39. Definovala sa a porovnávala sa jemná špecificita hybridómov špecifických pre peptid 263-275 v kontexte DR4 (DB1*0401). Výsledkom bola identifikácia 3 hybridómov líšiacich sa rozoznávaním 263-275 epitopu prezentovaného DRB1*0401 kódovanými molekulami. (Rozdiely v rozoznávaní epitopu medzi troma použitými hybridómami sa stali viditeľnými, keď sa na stimuláciu rozličných hybridómov použili peptidy v rámci 263-275 sekvencie skrátené na N- a C-konci). Zistilo sa, že 5G11 hybridom optimálne odpovedá na 265-275 sekvenciu. Na rozdiel od toho bolo rozoznávanie 8B12 hybridómom centrované okolo sekvencie 264-274, zatiaľ čo 14G11 hybridom bol optimálne responzívny voči 264-275.

Pre RA pacientov môže byť užitočné indukovanie tolerancie HC gp-39 (263275)-reaktívnych T buniek. Predložený vynález poskytuje modifikované peptidové deriváty založené na HC gp-39 (263-275) sekvencii, ktoré sú vynikajúce z hľadiska ich schopnosti indukovať imunitnú odpoveď a z hľadiska ich schopnosti indukovať toleranciu.

Prekvapujúco sa zistilo, že špecifické peptidové modifikácie založené na HC gp-39 (263-275) sú agonistické voči sade T bunkových hybridómov špecifických pre HC gp-39 (263-275) peptid a vynikajúce na stimuláciu dvoch ľudských T bunkových klonov generovaných po stimulácii s peptidmi obsahujúcimi 263-275 epitopovú sekvenciu. Okrem toho vykazovali tieto modifikované peptidy vynikajúcu schopnosť indukovať toleranciu in vivo.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je modifikovaný peptid odvodený od H-Arg-Ser-Phe-ThrLeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (vzorec I; sekv. č. 1) všeobecného vzorca Q-A¹ -A²-A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸-A⁹-A¹⁰-A¹¹-A¹²-A¹³-Z (vzorec II). Vo všeobecnom vzorci

II, A¹ až A¹³ zodpovedajú aminokyselinám vzorca I, Q znamená H a Z znamená OH. Modifikácie podľa predloženého vynálezu sú vybrané zo skupiny, ktorá obsahuje:

a) substitúciu 1 až 6, výhodne 1 až 4 aminokyselín, v A¹ až A¹³ inými ako prirodzenými aminokyselinami alebo β aminokyselinami,

b) substitúciu jednej alebo viacerých amidových väzieb redukovanými amidovými väzbami alebo etylénovými izostermi,

c) substitúcie v Q a/alebo Z.

Počet modifikácií; ktoré sa majú vybrať z jednej alebo viacerých týchto skupín je 1 až 6. Okrem toho môžu byť aminokyseliny substituované inými prirodzenými aminokyselinami, s podmienkou, že celkové množstvo modifikácií nepresiahne číslo 6.

Modifikované peptidy založené na vzorci I (HC gp-39 (263-275)) môžu byť stabilizované C- a/alebo N-koncovými modifikáciami, ktoré budú znižovať hydrolýzu katalyzovanú exopeptidázou. Takéto modifikácie môžu zahŕňať N-koncovú acyláciu (napr. acetyláciu = Ac-peptid), začlenenie amidu na C-koniec (napr. peptid-NH₂), kombinácie acylácie a začlenenia amidu (napr. Ac-peptid-NH₂) a napr. začlenenie D-aminokyselín namiesto L-aminokyselín. Iné modifikácie sú zamerané na prevenciu hydrolýzy endopeptidázami.

Tabuľka 1

Spojenia peptidov

Štruktúra	Názov
R' n R³ h'VyS'Y H 0 _r! ^H 0	peptid
R' R³ X. H ’ H R²	redukovaný peptid

R’ H 9 ⁰ R²	vinylové peptidy
R² o R’ ° R^{3 0}	peptoid
R’ HO o R³ VyWy OH 0 _Rj OH 0	/\/-hydroxy-peptid
^R’ ° R² H ^v Ν^ΛΖ^χΟ^Ν^Λ^°γ^Ν^ H g ^H 0	oligokarbamáty
9 ^R1 H H V H H II _r2	oligomočovina
f h r h r π^'ν-'ΐ'Ύ R1 0 _R3 0 _R5	hydrazinopeptidy
% T i n^O ¹ R^{1 0} R³	Oligosulfón
o R’ o „R¹ H H	peptidosulfónamidy
R¹ R³ R²	etylénizoster

Príkladmi týchto modifikácií je zavedenie D-aminokyselín namiesto

L-aminokyselín, zavedenie modifikovaných aminokyselín, cyklizácia vo vnútri

-7peptidu, zavedenie modifikovaných peptidových väzieb, napr. redukovaných peptidových väzieb ψ[ΟΗ₂ΝΗ], a peptoidy (N-alkylované glycínové deriváty).

Iné peptidové analógy môžu mať vzťah k peptidom vzorca I alebo všeobecného vzorca I, ale namiesto bežných -NH-C(O)- peptidových väzieb môžu byť použité spojenia uvedené v tabuľke 1 alebo akákoľvek ich kombinácia namiesto jednotlivých -NH-C(O)- väzieb. Ak je odstránená aminoskupina na N-konci (napr. A¹znamená desaminoarginín vo vzorci II), Q vo vzorci II nezodpovedá žiadnemu atómu.

Výhodnými peptidmi podľa vynálezu sú peptidy, v ktorých Q znamená H, (Ci-6)alkyl, formyl, (C^ejalkylkarbonyl, karboxy(Ci_₆)alkyl, (Ci_₆)alkyloxykarbonyl, (C₂-6)alkenyloxykarbonyl, (C₆-i4)aryl(Ci_₆)alkyl; (C₆.i₄)aryl(Ci.₄)alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)n-OCH₂-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 alebo 4; 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl, 1-metyl-pyridínium-4-karbonyl alebo Lys alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5;

Z znamená OR, kde R znamená H, (Ci^)alkyl, (C₂.6)alkenyl, (C^i₄)aryl(C-i4)alkyl, (C4-i3)heteroaryl(C₁.₆)alkyl alebo NR¹ R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané z H, (C-i-ejalkyl alebo (C₆.₁₄)aryl(Ci^)alkyl;

a voliteľne Q a Z obsahujú navyše spolu do 10 aminokyselín umiestnených vedľa polohy A¹ a/alebo A¹³. Substitúcia v A¹ až A¹³ jednou alebo viacerými inými prirodzenými aminokyselinami sa výhodne uskutočňuje nie viac ako štvormo, výhodnejšie v dvoch polohách.

V peptidoch podľa vynálezu sú výhodnými nasledujúce substitúcie vo všeobecnom vzorci II:

Q znamená H, (C^alkyl, formyl, (C^alkylkarbonyl, karboxyíC^alkyl, (C^alkyloxykarbonyl, (C₂.₆)alkenyloxykarbonyl, (C₆-i4)aryl(Ci_6)alkyl; (C₆-i₄)aryl(CM)alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH₂)n-OCH₂-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 alebo 4; 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl, 1-metyl-pyridínium-4-karbonyl alebo Lys alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodnejšie sú substitúcie, kde Q znamená H, (Ci.₆)alkyl, (Ci-6)alkylkarbonyl, karboxy(Ci-6)alkyl, (Ci-6)alkyloxykarbonyl, ΟΗ₃(ΟΟΗ₂ΟΗ₂)_η-ΟΟΗ2-0(0)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)m-CH₂-, kde m je 3 alebo 4; 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl, 1-metyl-pyridínium-4-karbonyl alebo Lys alebo Q chýba, ak A¹ znamená

-8H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5. Ešte výhodnejšie sú peptidy, kde Q znamená H, metyl; acetyl; karboxymetylén, metoxykarbonyl; CH₃(OCH₂CH₂)₃OCH₂-C(O)-, D-1-glucityl; 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl alebo 1-metyl-pyridinium-4karbonyl alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-.

A¹ znamená L-Arg, D-Arg, L-Lys, D-Lys, L-Ala, D-Ala, H2N-C(=NH)NH-(CH2)n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H2N-(CH2)n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (R)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(=NH)NH2]-CH2-C(O)-}, kde n je 2 až 5, alebo (S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(=NH)-NH2]-CH2C(O)-}, kde n je 2 až 5, alebo -N[(CH2)n-NH-C(=NH)-NH2]-CH2-C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodne A¹ znamená L-Arg, D-Arg, L-Ala, H2N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂JCH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5, alebo -N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodnejšie A¹ znamená L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 5 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-} alebo -N[(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-.

A² znamená L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala, Gly alebo -N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodne A² znamená L-Ser, L-Ala, D-Ala, Gly alebo -N[(CH2)_n-OH]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5. Výhodnejšie A²znamená L-Ser, L-Ala alebo -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-.

A³ znamená L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X), kde X nezávisle znamená jeden alebo viacero z (C-M)alkyl, hydroxy, halogén, (Ci-6)alkylkarbonylamino, amino alebo nitro, L-Hfe, D-Hfe, L-Thi, D-Thi, L-Cha, D-Cha, L-Pal(3), D-Pal(3), L-1-Nal, D-1-Nal, L-2-Nal, D-2-Nal, L-Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), (R)-{-NH-CH(CH2-aryl)-CH2-) alebo (S){-NH-CH(CH2-aryl)-CH2-} alebo (K)-{-NH-CH(CH2-aryl)-CH2-} alebo (S)-(-NH-CH(CH2-aryl)-CH2-}. Výhodne A³ znamená L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X), kde X znamená halogén alebo nitro, L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl) alebo (S)-{-NH-CH(CH2-aryl)-CH₂-}. Výhodnejšie A³ znamená L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), kde X znamená halogén alebo nitro, L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal alebo L-Ser(Bzl).

A⁴ znamená L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala alebo Gly. Výhodne A⁴ znamená L-Thr alebo L-Ala.

-9A⁵ znamená L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Ala, D-Ala,

Gly, (R)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-} alebo (S)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-}.

Výhodne A⁵ znamená Ľ-Leu, L-Ala alebo (S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH₃)2)-CH₂-}.

A⁶ znamená L-Ala, D-Ala alebo Gly. Výhodne A⁶ znamená L-Ala alebo Gly.

A⁷ znamená L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala alebo Gly.

Výhodne A⁷ znamená L-Ser alebo L-Ala.

A⁸ znamená L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala alebo Gly. Výhodne A⁸ znamená L-Ser alebo L-Ala.

A⁹ znamená L-Glu, D-Glu, L-Asp, D-Asp, L-Ala, D-Ala alebo Gly. Výhodne A⁹znamená L-Glu alebo L-Ala.

A¹⁰ znamená L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala alebo Gly. Výhodne A¹⁰ znamená L-Thr alebo L-Ala.

A¹¹ znamená Gly, L-Ala, D-Ala alebo -NH-CH₂-CH₂-. Výhodne A¹¹ znamená Gly, L-Ala alebo -NH-CH2-CH2-.

A¹² znamená L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva-, L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, (R)-{-NHCH[CH(CH₃)2]-CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH2-}, (R)-{-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]-CH₂-}, (R)-{-NH-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH₂-}, (S){-NH-CH[CH₂CH(CH₃)₂]-CH2-}, (RRH-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH2CH₃]-CH2-}, (RS){-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (SR)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)CH₂CH₃]-CH₂-} alebo (SS)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}. Výhodne A12 znamená L-Val alebo (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}.

A¹³ znamená Gly, L-Ala alebo D-Ala. Výhodne A¹³ znamená Gly alebo L-Ala.

Okrem toho, v peptidoch podľa vynálezu Z znamená OR, kde R znamená H, (Ci.₆)alkyl, (C₂.₆)alkenyl, (C₆-i4)aryl(Ci^)alkyl, (C₄.i3)heteroaryl(Ci^)alkyl alebo NR¹ R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané z H, (Ci^alkyl alebo (C6-i4)aryl(Ci-6)alkyl. Výhodne Z znamená OR, kde R znamená H alebo NR¹R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané z H, (Ci^)alkyl. Výhodnejšie Z znamená OH, NH₂ alebo NHEt.

Peptidy podľa vynálezu môžu byť voliteľne predĺžené na N a C konci, tzn. vedľa A¹ a/alebo A¹³, niekoľkými aminokyselinami. Výhodne môžu byť predĺžené až o 10 aminokyselín. Takže Q a Z môžu spolu navyše obsahovať až 10 aminokyselín umiestnených vedľa polohy A¹ a/alebo A¹³. Peptidy sa môžu líšiť od všeobecného

-10vzorca I v niekoľkých polohách, ale výhodne sú modifikované v 1 až 4 polohách, výhodnejšie v 2 až 3 polohách.

Tak ako sa používa tu, znamená výraz (Ci^)alkyl rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu majúcu 1 až 6 atómov uhlíka, napríklad metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, sek-butyl, ŕerc-butyl a hexyl. Najvýhodnejšie sú alkylové skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (Ci^)alkyl znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu majúcu 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (C2-6)alkenyl znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkenylovú skupinu majúcu 2 až 6 atómov uhlíka, ako napríklad etenyl, 2-butenyl, atď. (C-m)alkenylové skupiny sú výhodné, (Ci_3)alkenylové skupiny sú najvýhodnejšie.

Výraz (Ci-6)alkylkarbonyl znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu majúcu 1 až 6 atómov uhlíka, ktoré sú pripojené na karbonylovú skupinu, napríklad acetylovú skupinu. Najvýhodnejšie sú alkylové skupiny majúce 1 až 4 atómov uhlíka.

Výraz karboxy-(Ci-6)alkyl znamená karboxy skupinu pripojenú na rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu majúcu 1 až 6 atómov uhlíka. Najvýhodnejšie sú alkylové skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (Ci.₆)alkyloxykarbonyl znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu pripojenú na oxykarbonylovú skupinu, napríklad metoxykarbonylalebo ŕerc-butyloxykarbonyl (Boe-) skupinu. Najvýhodnejšie sú alkylové skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (C2-6)alkenyloxykarbonyl znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkenylovú skupinu majúcu 2 až 6 atómov uhlíka, ako bola definovaná vyššie, pripojenú na oxykarbonylovú skupinu, napríklad alyloxykarbonylovú skupinu. Výhodné sú (Ci^)alkenylové skupiny, najvýhodnejšie sú (Ci-3)alkenylové skupiny.

Výraz (Ci-6)(di)alkylamino znamená (di)alkylaminoskupinu majúcu 1 až 6 atómov uhlíka, pričom alkylová časť má rovnaký význam ako bolo definované vyššie. Výhodné sú alkylové skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz amino(Ci-6)acyl znamená acylovú skupinu majúcu 1 až 6 atómov uhlíka funkcionalizovaných s aminoskupinou. Výhodné sú acylové skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

-11 Výraz (C6-i4)aryl znamená aromatickú uhľovodíkovú skupinu majúcu 6 až 14 atómov uhlíka, ako napríklad fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, indenyl, antracyl, ktorá môže byť voliteľne substituovaná v orto a/alebo metá polohe jedným alebo viacerými substituentami, ako napríklad, ale bez obmedzenia, s hydroxy, halogénom, nitro, kyano, amino(Ci-6)acyl) alebo (di)(Ci-6)alkylamino, pričom acylová a alkylová časť majú rovnaký význam ako bolo definované vyššie. Výhodné sú (C6-io)-arylové skupiny, najvýhodnejší je fenyl.

Výraz (C4-i3)heteroaryl(Ci.6)alkyl znamená substituovanú alebo nesubstituovanú aromatickú skupinu majúcu 4 až 13 atómov uhlíka, výhodne 4 až 6, ktorá zahŕňa aspoň jeden heteroatóm vybraný z N, O a/alebo S, spojenú s rozvetvenou alebo nerozvetvenou alkylovou skupinou majúcou 1 až 6 atómov uhlíka. Substituenty na heteroarylovej skupine môžu byť vybrané zo skupiny substituentov uvedenej pre arylovú skupinu. Heteroarylové skupiny obsahujúce dusík môžu byť pripojené na alkylovú skupinu buď cez uhlíkový, alebo cez dusíkový atóm. Z alkylových skupín sú výhodné skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (Ci-6)alkyl(C6-i4)aryl znamená rozvetvenú alebo nerozvetvenú alkylovú skupinu definovanú vyššie pripojenú na vyššie definovanú arylovú skupinu. Výhodné sú (C6-io)arylové skupiny, najvýhodnejší je fenyl. Z alkylových skupín sú výhodné skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (C6.i4)aryl(Ci.6)alkyl znamená arylalkylovú skupinu, v ktorej je alkylovou skupinou (Ci-6)alkylová skupina a arylovou skupinou (C6-i4)aryl ako sú definované vyššie, napríklad benzyl- (Bzl) alebo trifenylmetyl- (Trt) skupina. Výhodné sú (C6-io)arylové skupiny, najvýhodnejší je fenyl. Z alkylových skupín sú výhodné skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (Ci-6)alkylkarbonylamino znamená alkylkarbonylamino skupinu, ktorej alkylová skupina obsahuje 1 až 6 atómov uhlíka a má rovnaký význam ako bolo definované vyššie. Výhodné sú alkylové skupiny majúce 1 až 4 atómy uhlíka.

Výraz (C₆-i4)aryl(C₁^)alkyloxykarbonyl znamená (C6-i4)arylovú skupinu spojenú s alkyloxykarbonylovou skupinou, pričom alkylovou skupinou je (C-m)alkylová skupina, a arylová skupina je definovaná vyššie, napríklad benzyloxykarbonyl- (Z) alebo fluorenylmetoxykarbonyl- (Fmoc) skupinu. Výhodné sú (Οθ-ιο)arylové skupiny, najvýhodnejší je fenyl.

-12Výraz halogén znamená F, Cl, Br alebo I.

Prirodzené aminokyseliny sú uvádzané prostredníctvom použitia ich skratiek (trojpísmenový kód) nasledovne: alanín (Ala), arginín (Arg), asparagín (Asn), kyselina asparágová (Asp), cysteín (Cys), glutamín (Gin), kyselina glutámová (Glu), glycín (Gly), histidín (His), serín (Ser), izoleucín (lle), leucín (Leu), lyzín (Lys), metionín (Met), fenylalanín (Phe), prolín (Pro), treonín (Thr), tryptofán (Trp), tyrozín (Tyr) a valín (Val). Stereochémia všetkých aminokyselín je definovaná ako L-.

Iná ako prirodzená aminokyselina je, voliteľne Λ/α-substituovaná, a-aminokyselina, ktorej chemická štruktúra sa líši od štruktúry prirodzených aminokyselín. Iné ako prirodzené aminokyseliny sú napr. Phe(X), kde X je substituent umiestnený v para polohe fenylového kruhu Phe, hSer (kyselina 2-amino-4-hydroxybutánová), norleucín (Nie, kyselina 2-aminohexánová), norvalín (Nva, kyselina 2-aminopentánová), L-Hfe (L-a-homofenylalanín), D-Hfe (D-a-homofenylalanín), L-Thi (βtienyl-L-alanín), D-Thi (β-tienyl-D-alanín), L-Cha (β-cyklohexyl-L-alanín), D-Cha (βcyklohexyl-D-alanín), L-Pal(3) (β-3-pyridyl-L-alanín), D-Pal(3) (β-3-pyridyl-D-alanín), L-1-Nal (β-1-naftyl-L-alanín), D-1-Nal (β-1-naftyl-D-alanín), L-2-Nal (β-2-naftyl-Lalanín), D-2-Nal (β-2-naftyl-D-alanín), L-Ser(BZL) (O-benzyl-L-serín), D-Ser(Bzl) (0benzyl-D-serín) a /V-alkylglycínové deriváty, ako napríklad NVal (/V-izopropylglycín, NArg (/\/-(3-guanidinopropyl)glycín) a NhSer (/V-(2-hydroxyetyl)glycín). Do tejto skupiny aminokyselín sú zahrnuté aj prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny, ktorých stereochémia je definovaná ako D-.

Musí sa brať do úvahy, že v peptide obsahujúcom redukovanú amidovú väzbu bola pôvodná karbonylová skupina aminokyseliny nahradená metylénovou skupinou. V peptide obsahujúcom etylénový izoster bola pôvodná karboxamidová funkčná skupina (-C(O)-NR-) nahradená etylénovou skupinou (-CH=CR-).

Vzorec ψ[ΰΗ₂ΝΗ] medzi dvoma aminokyselinovými zvyškami v sekvencii znamená, že pôvodná amidová väzba (-C(O)-NH-) medzi týmito aminokyselinovými zvyškami bola nahradená redukovanou amidovou väzbou (-CH₂NH-).

Je výhodné, aby niekoľko aminokyselín, ako sú uvedené vo vzorci I, bolo fixovaných v zodpovedajúcich polohách vo všeobecnom vzorci 2. Takže výhodným uskutočnením vynálezu je modifikovaný peptid všeobecného vzorca Q-A²-A²-A³

-13Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A¹¹-A¹²-Gly-Z (vzorec II), kde Q, A¹, A², A³, A¹¹, A¹² a Z sú definované vyššie. Najvýhodnejšie substitúcie vo všeobecnom vzorci III sú pre A¹ L-Arg, D-Arg, H2N-C(=NH)NH-(CH2)4-C(O)-, H2N-(CH2)n-C(O)-, kde n je 5 až 7, alebo -N[(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2]CH2C(O)-, pre A² Ľ-Ser alebo -N[(CH2)₂-OH]-CH₂C(O)-, a pre A³ L-Phe, L-Phe(X), kde X znamená halogén, L-1-Nal, L-2-Nal, LSer(Bzl), L-Thi, L-Cha alebo L-Pal(3).

Výhodnejšie sú peptidy všeobecného vzorca II, v ktorých A¹ znamená Arg, A³znamená Phe a A¹¹ znamená Gly, čo predstavuje všeobecný vzorec IV: Q-Arg-A²Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A¹²-Gly-Z, v ktorom sú polohy Q, A², A¹² a Z definované vyššie.

Najvýhodnejšie peptidy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej: desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃-(OCH₂CH₂)₃-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-ValGly-NH₂, D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-\HCH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-^/-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\HCH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-v[CH₂NH]-Gly-NH₂, H-Arg-Ser-Phe(CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₅-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (/V-metyl-nikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH.

Vhodná metodológia na syntézu modifikovaných HC gp39 (263-275) peptidov s /V-koncovými modifikáciami, ako je znázornené vo vzorci V, vychádza z derivátov vzorca VI. Modifikované peptidy sa syntetizujú bežne používanou metódou peptidovej syntézy na tuhej fáze (SPPS) (B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis, Peptides 1995, 93-169, vydavateľ: B. Gutte, Academic, San

-14Diego, Kalifornia, USA; P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, Tetrahedron 49: 11065-11133, 1993). V závislosti na type použitého spojovníka sa peptidový reťazec pripája na podklad buď prostredníctvom esterovej (PAC spojovník), alebo prostredníctvom amidovej (PAL spojovník) väzby.

(V)

jspojovník|— m

= polyetylénglykol(PEG)(VI) polystyrénový (PS) tuhý podklad

Po ukotvení Fmoc-C-koncovej aminokyseliny na tuhý podklad (m = 1, A-B znamená Fmoc) napr. použitím párovacieho činidla HATU (L. Carpino, A. ElFaham, C.A. Minor, F. Albericio, J. Chem. Soc., Chem. Comm. 201-203, 1994) alebo PyBOP (J. Coste, D. Le-Nguyen, B. Castro, Tetrahedron Lett. 31:205-208, 1990 a DIPEA sa reťazec predlžuje (m = 2 až 12) postupnou acyláciou s vhodne chránenými Fmoc-aminokyselinovými derivátmi, po ktorej nasleduje odstránenie Fmoc ochrannej skupiny (A-B znamená H), použitím automatického peptidového syntezátora. Alternatívne sa môžu na uskutočňovanie kondenzácií použiť pentafluórfenylové (Pfp) aminokyselinové aktívne estery (A. Dryland, R.C. Sheppard, Tetrahedron 44: 859-876, 1988). Následne sa použitím rovnakého protokolu zavádza A/-koncová aminokyselina B a odstraňuje sa Fmoc skupina. Takto získaný 13-mémy peptidový derivát (A znamená H, B znamená /V-koncová aminokyselina, m = 12) je potom prístupný na funkcionalizáciu N-konca. Začlenenie ďalšej amidovej väzby na N-koniec (A znamená acylkarbonyl) sa môže uskutočniť prostredníctvom inej HATU- alebo PyBOP-sprostredkovanej kondenzácie so želanou kyselinou· (X-OH) alebo párovaním s acylchloridom (X-CI) v prítomnosti

-15pyridínu. Nabitá 1-metylpyridínium-4-karbonylová jednotka alebo 1-metylpyridínium-

3-karbonylová jednotka sa môžu začleniť po vyštiepení (vide infra) zo živice (tzn. vzorec V, A znamená H, B znamená N-koncová aminokyselina, Z znamená OR, kde R znamená H, alkyl, alebo Z znamená NR¹R², kde R¹, R² znamenajú H alebo alkyl) DIPEA sprostredkovanou reakciou voľného N-konca peptidu úplne zbaveného ochrannej skupiny s A/-metyl(izo)nikotinium hydroxysukcinimidovým aktívnym esterom (M. L. Tedjamulia, P. C. Srivastava, F, F. Knapp, J. Med. Chem., 28:15741580, 1985) vo vodnom médiu (konverzia A znamená H na A znamená /V-metyl(izo)nikotinium vo vzorci V).

/V-alkylácia sa môže uskutočňovať redukčnou amináciou ošetrením imobilizovaného peptidu príslušným aldehydom (vzorec VI, konverzia A znamená H na A znamená alkyl) v prítomnosti NaBH(OAc)₃ v DMF/HOAc (99/1, objem.). Alternatívne poskytuje prístup k A/-alkylovaným peptidom aj reakcia imobilizovaného peptidu (A znamená H) s alkylhalidom v prítomnosti DiPEA (napr. reakcia s tercbutyl brómacetátom). Voľná NH₂ skupina (A znamená H vo vzorci VI) môže byť funkcionalizovaná aj s karbamoylovou skupinou (napr. metoxykarbonylom) reakciou so zodpovedajúcim karbamoylchloridom v CH₂CI₂/DiPEA (konverzia A = H na A = alkyloxykarbonyl vo vzorci VI). Po odštiepení peptidu z tuhého podkladu a súčasnom odstránení ochranných skupín labilných v kyslom prostredí použitím TFA/Et3SiH/anizol/ROH (R znamená H, alkyl) sa peptidy všeobecného vzorca V (Z znamená OR) purifikujú použitím RP-HPLC. Alternatívne je možné C-koniec vybaviť amidovou funkčnou skupinou (Z znamená NR¹R², kde R¹ a R² znamenajú H alebo alkyl) v priebehu odštepovania zo živice. V takom prípade sa používa odlišný spojovník (PAL: B. Merrifield, Peptides, 93-169, 1995) medzi peptidovým reťazcom (vzorec VI) a PEG-PS tuhým podkladom. Keď sa pred pripojením prvej (C-koncovej) aminoskupiny alkyluje PAL spojovník, po odštiepení z polymérneho podkladu sa vytvoria C-koncové alkylové amidy.

Použitím rovnakej Fmoc-SPPS stratégie sú dostupné peptidy, ktoré obsahujú neprirodzené, ale komerčne prístupné aminokyseliny (napr. D-aminokyseliny alebo substituované fenylalanínové deriváty). Okrem toho sa v roztoku najprv syntetizujú glycínové deriváty (péptoidové monoméry, R_n ¹ znamená aminokyselinový reťazec, R_n ² znamená H vo vzorcoch V a VI) použitím postupov opísaných v literatúre (J. A.

-16Kruijtzer, L. J. F. Hofmeyer, W. Heerma, C. Versuluis, R. M. J. Liskamp, Chem. Eur. J. 4:1570-1580, 1998). Aj modifikovaná W-koncová aminokyselina β-homo-L-arginín [B znamená NH-CH(CH₂CH2CH₂NH-CH(=NH)NH2)-CH2-C(O)] sa pred SPPS pripravuje v roztoku v súlade so známymi postupmi (H.M.M. Bastiaans, A.E. Alewijnse, J. L. van der Baan, H. C. J. Ottenheijm, Tetrahedron Lett. 35: 7659-7660, 1994). Po ochrane voľnej NH₂ skupiny v takto získaných monomérnych aminokyselinách s Fmoc ochrannou skupinou sa zlúčeniny môžu začleniť do predlžujúceho sa peptidu (vzorec VI) použitím SPPS protokolu.

Konečná trieda modifikovaných peptidov obsahuje peptidy obsahujúce jednu alebo viacero redukovaných amidových väzieb (R_n ³ znamená H2 vo vzorci V). Tieto deriváty sú dostupné (J. J. Wen, A. R. Spatola, J. Pept. Res., 49: 3-14, 1997) prostredníctvom modifikovaného SPPS protokolu, v ktorom sa voľná /V-koncová aminokyselina rastúceho reťazca (1 < m < 12 vo vzorci VI) alkyluje vstupujúcim aminokyselinovým aldehydom v redukčných podmienkach (NaBHaCN, DMF/HOAc, 99/1, objem, pomer). Potrebné /V-Fmoc chránené aminokyselinové aldehydy sú buď komerčne dostupné alebo sú dostupné prostredníctvom metód opísaných v literatúre (J. J. Wen, C. M. Crews, Tetrahedron: Asymmetry 9: 1855-1858, 1998). Takto predlžovaný reťazce (A-B znamená Fmoc, Rn¹ znamená H, Rn² znamená amino-kyselinový vedľajší reťazec, Rn³ znamená H2) obsahuje sekundárnu aminofunkčnú skupinu (R_n+1 ¹ znamená H), ktorá je následne chránená Boe skupinou. Po odstránený Fmoc ochrannej skupiny sa môže peptidový reťazec ďalej predlžovať použitím SPPS protokolu.

_c ^^Ν·ν^Ν

Fmoc j j o 2 R

Rn ^Rn+1

OH (VII)

Alternatívne sa môže pred SPPS v roztoku syntetizovať dimérna štruktúra všeobecného vzorca VII. Takže príslušný aminokyselinový benzylester (H₂NCH(R_n+i²)-CO₂Bzl) sa redukčné alkyluje (NaBHaCN, DMF/HOAc, 99/1, objem.) s Fmoc chráneným aminokyselinovým aldehydom (Fmoc-NH-CH(R_n )-C(O)H), čím

-17vznikne dimérny sekundárny amín. Po pripojení Boe ochrannej skupiny na amino funkčnú skupinu (R_n+i¹ znamená Boe) a následnej hydrogénolýze benzylového esteru sa vytvorí zlúčenina vzorca VII, ktorá môže byť začlenené do rastúceho reťazca použitím SPPS postupu.

Peptidy podľa vynálezu môžu byť použité ako terapeutická látka. Konkrétnejšie, môžu byť použité na indukciu špecifickej T bunkovej tolerancie voči autoantigénu u pacientov, ktorí trpia na autoimunitné poruchy, konkrétnejšie artritídu.

Použitím známych technológií je možné vybrať modifikované peptidy založené na T-bunkovej epitopovej štruktúre definovanej MHC molekulou II. triedy do zosilnenou stimulačnou aktivitou in vitro a zosilnenou aktivitou in vivo.

Na udržanie agonistických vlastností daného T-bunkového epitopu, sa považuje za nevyhnutné, aby veľmi neinterferovali ani so zvyškami podieľajúcimi sa na viazaní na relevantnú MHC molekulu, ani veľmi neovplyvňovali zvyšky podieľajúce sa na TCR začlenení relevantných T buniek. Takže selekcia agonistických modifikovaných peptidov by zahŕňala:

1) definíciu väzobnej afinity modifikovaného peptidu voči relevantnej MHC molekule a porovnanie s afinitou nemodifikovaného peptidového epitopu divého typu,

2) definíciu stimulačnej aktivity modifikovaného peptidu a porovnanie s aktivitou nemodifikovaného peptidu divého typu použitím in vitro testu (ožiarené antigén prezentujúce bunky inkubované spolu s peptidovým antigénom a špecifickými T bunkami). Výhodne by mal byť hodnotený široký panel epitopovo špecifických T buniek definovaných MHC molekulou II. triedy s rozličnými TCR klonotypmi, ktoré ale reagujú s rovnakým epitopom v kontexte rovnakej MHC molekuly II. triedy. Na tento účel je možné využiť panel špecifických T-bunkových hybridómov alebo špecifických T-bunkových línií/klonov. Selekcia modifikovaného epitopu na humánnu aplikáciu bude výhodne vyžadovať použitie humánnych T-bunkových línií/klonov, aby sa zabezpečila relevantnosť vybraných modifikovaných epitopov pre rozoznávanie humánnych T-buniek.

3) definíciu aktivity modifikovaného peptidu in vivo (voliteľne). Na tento účel je možné použiť rozličné experimentálne postupy:

a) test hypersenzitívnosti oddialeného typu

b) test ex vivo T-bunkovej aktivácie po podaní antigénu (s alebo bez adjuvans) in vivo

c) modulácia ochorenia na experimentálnych modeloch autoimunitného ochorenia podávaním modifikovaného peptidového antigénu.

Selektovať sa musia výhodné zlúčeniny so zosilnenou agonistickou aktivitou in vitro v porovnaní s divým typom peptidu alebo so zosilnenými in vivo účinkami.

Očakáva sa, že jednotlivé HC gp-39 odvodené peptidy, ktoré sa majú nájsť v myšiach znižujú reaktivitu voči týmto peptidom po nazálnom ošetrení. Takúto reaktivitu je možné merať stimulovaním zvieraťa s testovaným peptidom a kvantifikáciou opuchu končatín ako výsledku DTH odpovede. Peptidové imunizácie v Balb/c myšiach vedú k imunologickým odpovediam na HC gp-39 peptid 263-275. Takže myši imunizované s HC gp-39 môžu byť stimulované s HC gp-39 peptidom 263-275, aby sa detegovala DTH odpoveď. Na podrobné znázornenie tolerogénnosti modifikovaných peptidov in vivo sa myši môžu ošetrovať aplikáciou rôznych koncentrácii HC gp-39 263-275 alebo peptidových derivátov do nozdier. Očakáva sa, že modifikované deriváty s vynikajúcim profilom čo sa týka indukcie tolerancie budú aktívne v tomto in vivo teste pri nižších koncentráciách ako originálny peptid. Aby bolo možné kvantitatívne detegovať účinky indukcie tolerancie s natívnym peptidom versus modifikovanými peptidovými derivátmi, je možné testovať rôzne aplikačné schémy a dávky. Nakoniec je možné skúmať, či modifikované formy HC gp-39 263-275 sú na tomto modeli účinnejšie pri oslabovaní HC gp-39 263-275 indukovaných DTH odpovedí, ako natívny 263-275 peptid.

Toleranciu je možné dosiahnuť podávaním vysokých alebo nízkych dávok tolerogénu alebo peptidov podľa vynálezu. Množstvo tolerogénu alebo peptidu bude závisieť na spôsobe podávania, čase podávania, veku pacienta, ako aj na všeobecnom zdravotnom stave a diéte.

Vo všeobecnosti je možné použiť dávku 0,01 až 1000 μg peptidu alebo proteínu na kg telesnej hmotnosti, výhodne 0,05 až 500 μg, výhodnejšie 0,1 až 100 μρ peptidu alebo proteínu.

Iným predmetom vynálezu sú farmaceutické prostriedky obsahujúce jeden alebo viacero peptidov podľa vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič.

-19Farmaceuticky prijateľné nosiče sú pre priemerného odborníka v oblasti dobre známe a zahŕňajú napríklad sterilný fyziologický roztok, laktózu, sacharózu, fosforečnan vápenatý, želatínu, dextrín, agar, peptín, arašidový olej, olivový olej, sezamový olej a vodu. Iné nosiče môžu byť, napr. MHC molekuly II. triedy, ak je to želateľné, obalené v lipozómoch.

Okrem toho môže farmaceutický prostriedok podlá vynálezu obsahovať jeden alebo viacero adjuvans. Vhodné adjuvans zahŕňajú, medzi iným, hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, amfigén, tokofenoly, monofosfenyl lipid A, muramylový dipeptid a saponíny, ako napríklad Quill A. Množstvo adjuvans závisí na povahe samotného adjuvans.

Okrem toho môže farmaceutický prostriedok podľa vynálezu obsahovať jeden alebo viacero stabilizátorov ako napríklad uhľovodíky vrátane sorbitolu, manitolu, škrobu, sacharodextrínu a glukózy, proteíny, ako albumín alebo kazeín, a tlmivé roztoky, ako alkalické fosfáty.

Vhodnými spôsobmi podávania sú intramuskulárne injekcie, subkutánne injekcie, intravenózne injekcie alebo intraperitoneálne injekcie, orálne a intranazálne podanie. Orálne a intranazálne podanie sú výhodnými spôsobmi podávania. Najmä modulátorové bunky špecifické pre antigén by mohli byť generované aplikáciou antigénu cez sliznicu, napríklad nosnú sliznicu. Ukázalo sa, že podávanie antigénov cez sliznicu indukuje imunologickú toleranciu takýchto antigénov.

Peptidy podľa vynálezu sú veľmi vhodné aj na použitie v diagnostickom spôsobe na detekciu prítomnosti aktivovaných autoreaktívnych T buniek podieľajúcich sa na chronickom zápale kĺbovej chrupavky.

Diagnostický spôsob podľa vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky:

a) izoláciu periférnych krvných mononukleárnych buniek (PBMC) zo vzoriek krvi jedinca,

b) kultiváciu PBMC vo vhodných podmienkach,

c) inkubovanie PBMC v prítomnosti autoantigénu alebo jedného alebo viacerých od neho odvodených peptidov podľa vynálezu a

d) detekciu odpovede T buniek, napríklad proliferatívnej odpovede, z ktorej vyplýva prítomnosť aktivovaných autoreaktívnych T buniek u jedinca.

V prípade detekcie odpovede meraním proliferatívnej odpovede autoreaktívnych T buniek je mierou proliferácie inkorporovanie rádioaktívneho izotopu, ako napríklad ³H-tymidínu. Odpoveď autoreaktívnych T buniek nachádzajúcich sa v PBMC je možné detegovať aj meraním vylučovania cytokínu s cytokín-špecifickou ELISA, alebo meraním cytotoxicity prostredníctvom vylučovania ⁵¹chrómu. Inou detekčnou metódou je meranie expresie aktivačných markerov prostredníctvom FACS analýzy, napríklad II-2R. Takže časť vynálezu je tvorená diagnostickým prostriedkom obsahujúcim jeden alebo viacero peptidov podľa vynálezu a vhodné detekčné činidlo. V závislosti na type detekcie môže byť detekčným činidlom rádioaktívny izotop, enzým alebo protilátky špecifické voči bunkovému povrchu alebo aktivačné markery.

Do rozsahu vynálezu spadajú aj testovacie kity, ktoré obsahujú jeden alebo viacero peptidov podľa vynálezu. Tieto kity sú vhodné na použitie v diagnostickom spôsobe podľa vynálezu.

Takže podľa predloženého vynálezu je možné HC gp-39 odvodené modifikované peptidy použiť na oslabenie autoimunitného ochorenia.

Nasledujúce príklady ilustrujú vynález a žiadnym spôsobom nemajú byť interpretovanie ako obmedzenie rozsahu vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok

Proliferácia klonu 235 po stimulácii s vedúcim peptidom alebo vybranými modifikovanými peptidmi použitím ožiarených, autológnych PBMC ako APCs sa merala ako je opísané v príklade 15. Peptidy sa testovali z hľadiska ich stimulačnej aktivity v koncentráciách 0, 0,4, 2, 10 a 50 μg/ml. Znázornené sú odpovede 235 klonu po stimulácii s vedúcim peptidom H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-GluThr-Gly-Val-Gly-OH (vyplnené krúžky), po stimulácii s Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-AlaSer-Ser-Glu-Thr-Gly-Val^[CH2NH]-Gly-NH₂ (vyplnené štvorčeky), po stimulácii s Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ (prázdne krúžky) alebo po stimulácii s Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Valvp[CH2NH]-Gly-NH₂ (prázdne štvorčeky).

-21 Tabuľka 2

Hybridómový test (prvolíniový test): + znamená, že zlúčenina stimuluje všetky tri hybridómy spôsobom porovnateľným alebo lepším ako nemodifikovaný 263-275 peptid. +* znamená, že bola demonštrovaná agonistická aktivita pre 1 alebo 2 hybridómy, ale nie pre všetky tri. Reaktivita ľudských klonov (proliferácia klonu 235 a 243) vyjadrená ako potenciál (stimulačná aktivita analógu/stimulačná aktivita vedúceho peptidu; napr. HC gp-39 (263-275)). - znamená potenciál < 0,6, + znamená potenciál 0,6 až 12, ++ znamená potenciál > 12 až 100, +++ znamená potenciál > 100. Testovali sa Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-GlyVal-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-y[CH₂NH]-GlyNH₂, D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃(OCH₂CH₂)3-OCH₂C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂a H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH z hľadiska ich väzobnej aktivity voči HLA-DRB1*0401 a porovnávali sa s afinitou vedúceho peptidu (H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH). Najaktívnejšie zlúčeniny (Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-ArgSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\|/[CH₂NH]-Gly-NH₂) vykazovali relatívnu väzobnú afinitu voči HLA-DRB 1*0401, ktorá bola porovnateľná s afinitou pôvodného peptidu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (1)

Reakčná nádoba Millipore 9050 PepSynthesizer-a sa naplnila 0,5 g FmocGly-PAC-PEG-PS živice (komerčne dostupná od PerSeptive Biosystems, 0,20 mmol/g), ktorá bola vopred napučaná v /V-metyl-pyrolidinóne (NMP). Odstraňovanie Fmoc skupiny sa v každom párovacom cykle uskutočňovalo so zmesou piperidínu a DMF (1:4, objem.). Účinnosti párovania sa stanovovali po každom elongačnom kroku spektroskopickou analýzou Fmoc-štiepenia. V každom párovacom kroku sa

-22použili 4 ekvivalenty aminokyseliny s bočným reťazcom labilným v kyslom prostredí a chráneným Fmoc. Použil sa dvojstriekačkový modus syntezátora, pri ktorom jedna striekačka obsahovala 0,50 M HATU v DMF p.a. a druhá striekačka obsahovala 1,0 M DIPEA v DMF p.a. Hlavný premývací roztok obsahoval /V-metyl-pyrolidinón s 0,1% HOBt. Použil sa Analog Synthesis protokol. Po odstránení poslednej Fmoc skupiny sa živica s imobilizovaným peptidom vybrala z reakčnej nádoby a postupne sa premyla s DMF (20 ml), CH2CI2 (20 ml), dietyléterom (20 ml), CH2CI2 (20 ml), dietyléterom (20 ml), CH₂CI₂ (20 ml) a dietyléterom (20 ml). Imobilizovaný peptid sa cez noc sušil vo vákuu. Peptid sa potom 3 hodiny štiepil 10 ml zmesi TFA/(iPr)3SiH/anizol/H₂O, 88/5/5/2, objem, pomer. V tomto kroku sa odstránili aj všetky ochranné skupiny bočných reťazcov labilné v kyslom prostredí. Po evaporácii rozpúšťadla sa peptid precipitoval s 200 ml dietyléteru. Éterová vrstva sa dekantovala a peptid sa premyl ďalším množstvom (2 x 200 ml) éteru. Surový peptid sa potom vysušil prúdom dusíka a lyofilizoval sa. Purifikácia peptidu sa uskutočňovala HPLC chromatografiou na PrepPak, kartridž 40-100 mm, Delta-Pak® C18 15pm 100A reverznej fázovej kolóne. Mobilná fáza bola tvorená zmesou 20% fosfátového tlmivého roztoku, pH 2,1 a gradientom acetonitrilu a vody, ako je uvedené v analýze nižšie. Peptid sa zbavil solí na HPLC použitím 4%o vodnej kyseliny octovej. Purifikovaný produkt sa lyofilizoval.

Mobilná fáza: A: 0,5 mol/l NaH₂PO₄ + H3PO4, pH = 2,1

B: H₂O

C: CH3CN/H2O = 3/2 (objem, pomer) gradient: A: 20 %; B: 80 % -> 20 %; C: 0 % 60 % v priebehu 40 min.

Výťažok: 68 mg; HPLC čistota: 90,1 %; MS: MW = 1346, čo zodpovedá molekulovému vzorcu C55H89CIN16O21; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 74,8 %; iónová chromatografia: fosfát: 0,6%, acetát 0,6 %, chlorid: 3,4 % (hmotn.).

Príklad 2

H₂N-(CH₂)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (2)

-23Peptid sa syntetizoval použitím tuhej fázovej peptidovej chemickej metódy, ako je opísané pri syntéze zlúčeniny 1 (pozri vyššie). V tomto prípade sa namiesto voľných Fmoc-aminokyselín a HATU/DIPEA použili komerčne dostupné Fmocaminokyselinové pentafluórfenylové (Pfp) aktívne estery. Zlúčenina sa pripravovala použitím kyseliny 6-Fmoc-aminohexánovej ako N-koncovej aminokyseliny, ktorá sa získala z kyseliny 6-amino-hexánovej analogickým spôsobom ako je postup opísaný v literatúre (A. Marston, E. Hecker, Z. Naturforsch. B Anorg. Chem. Org. Chem., 38: 1015-1021, 1983). Podkladom bol Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS (0,75 g, 0,170 mmol/g) a použili sa 3 ekvivalenty príslušných Pfp esterov. Na pripájanie kyseliny 6-Fmocaminohexánovej sa aplikoval PyBOP ako párovacie činidlo (199 mg). Výsledkom postupu uvedeného v štandardnej procedúre (príklad 1) bolo 168 mg surového produktu. Ten sa purifikoval prostredníctvom HPLC (fosfátový systém, pH = 2,1, s CH3CN-H2O gradientom). Produkt sa zbavil solí na HPLC s 5%o vodnou kyselinou octovou a vysušil sa vymrazením, čím vzniklo 34 mg požadovaného peptidu.

HPLC čistota: 99,6 %; MS: MW = 1268, čo zodpovedá molekulovému vzorcu C55H89N13O21; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 67,3 %; iónová chromatografia: fosfát: 10 % (hmotn.).

Príklad 3 H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (3)

Peptid 3 sa pripravil rovnakým spôsobom ako jeho N-koncový homológ 2, použitím kyseliny 7-Fmoc-aminoheptánovej (3a, pripravená analogicky ako zlúčenina 2a: A. Marston, E. Hecker, Z. Naturforsch. B. Anorg. Chem. Org. Chem., 38: 1015-1021, 1983) ako N-koncovej aminokyseliny. Podkladom bol Fmoc-GlyPAC-PEG-PS (1,0 g, 0,17 mmol/g). Výsledkom spracovania, HPLC purifikácie a odstránenia solí podľa štandardného postupu (príklad 1), bolo 45 mg požadovaného peptidu.

HPLC čistota: 95,0 %; MS: MW = 1282, čo zodpovedá molekulovému vzorcu 056ΗβιΝ₁₃Ο₂ι; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v

-24požadovaných množstvách; obsah peptidu: 87,4 %; iónová chromatografia: acetát: 0,2 % (hmotn.).

Príklad 4 (/V-metyl-nikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (4)

Pred prípravou peptidu 4 sa syntetizoval východiskový materiál Nsukcínimidyl-(1-metyl-3-pyridinio)formát-jodid (4a) postupom opísaným v literatúre (M.L. Tedjamulia, P.C. Srivastava, F.F. Knapp; J. Med. Chem. 28: 1574-1580, 1985). Syntéza zlúčeniny 4 sa uskutočňovala v roztoku. Peptid H-Arg-Ser-Phe-ThrLeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (4b, 26 mg, 0,02 mmol), pripravený SPPS spôsobmi podľa príkladu 1, sa rozpustil v DMF/H2O (1/99, objem, pomer, 10 ml) a pridal sa DIPEA/DMF (1/1, objem, pomer), aby sa získalo pH = 9. Potom sa v dvoch častiach pridal A/-sukcínimidyl-(1-metyl-3-pyridinio)formát-jodid (4a, 0,056 g, 0,15 mmol). pH sa udržiavalo na pH = 9 pridávaním niekoľkých kvapiek DIPEA/DMF (1/1, objem, pomer). Zmes sa miešala pri laboratórnej teplote 4 hodiny a potom sa nariedila 10 ml H₂O a 5 ml fosfátového tlmivého roztoku, pH = 2,1. Produkt sa okamžite purifikoval prostredníctvom HPLC s fosfátovým tlmivým systémom, ako bolo uvedené vyššie (príklad 1). Odstránenie solí s 5%o vodnou kyselinou octovou a lyofilizácia poskytli 14 mg požadovaného peptidu 4.

HPLC čistota: 98,1 %; MS: MW = 1430; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 56,3 %; iónová chromatografia: chlorid: 1,4 %, fosfát: 1,0 %, trifluóracetát: 0,8 %, acetát: 0,3 % (hmotn.).

Príklad 5 Desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (5)

Peptid 5 sa syntetizoval podľa vyššie opísaného postupu pre zlúčeninu 1 použitím Fmoc-chránených aminokyselín, HATU, DIPEA a 1,0 g Fmoc-Gly-PACPEG-PS-živice; nanášanie na podklad 0,17 mmol/g. Vo finálnom kroku sa desamino-Arg(Adoc)2-OH (5a) pripojil na imobilizovaný peptidový reťazec. Karboxylová

-25kyselina 5a sa pripravila známym postupom (R. Presentini, G. Antoni, Int. J. Pept. Proteín Res., 27: 123-126, 1986). Spracovávacie a purifikačné podmienky boli rovnaké ako podmienky pre peptid 1.

Výťažok: 58 mg; HPLC čistota: 91,1 %; MS: MW = 1296; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 76,2 %; iónová chromatografia: fosfát: 0,4 %, trifluóracetát: 0,6 %, acetát: 0,2 % (hmotn.).

Príklad 6 Desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2 (6)

Zostavovanie peptidu 6 sa uskutočňovalo podobným spôsobom ako zostavovanie vyššie opísaného peptidu 5 použitím PAL-PEG-PS živice (0,17 mmol/g) namiesto PAC-PEG-PS ako tuhého podkladu. V tomto prípade sa Fmoc skupina z komerčne dostupnej (PerSeptive Biosystems) Fmoc-PAL-PEG-PS živice odstránila a výsledný H-PAL-PEG-PS podklad sa kondenzoval s Fmoc-Gly-OH pôsobením HATU/DIPEA. Po predĺžení peptidového reťazca a jeho následnom odštiepení od živice, v rovnakých podmienkach ako sú opísané v príklade 1, sa získal požadovaný karboxamidový C-koniec. Spracovávacie a purifikačné podmienky boli rovnaké ako podmienky pre peptid 1.

Výťažok: 43 mg; HPLC čistota: 91,3 %; MS: MW = 1295; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 76,5 %; iónová chromatografia: chlorid: 0,5 %, acetát: 4,0 % (hmotn.).

Príklad 7 CH₃(OCH2CH2)3-OCH₂-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-ValGly-NH₂ (7)

Na syntézu peptidu 7 sa najprv pripravil východiskový materiál CH₃(OCH₂CH2)3-OCH2-CO₂H (7a) postupom opísaným v literatúre (A.H. Haines, P. Kamtiang, Carbohydr. Res., 78: 205-211, 1980). Syntéza chráneného a imobilizovaného peptidu H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)

-26Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (7b) sa uskutočňovala ako je uvedené v príklade 2 použitím aminokyselinových Pfp esterov. Peptid na živici (7b) sa vopred napučiaval v NMP a pridalo sa 142 mg (0,64 mmol) CH3(OCH₂CH2)3-OCH2-CO₂H (7a) spolu s 169 mg (0,64 mmol) párovacieho činidla TFFH (tetrametylfluórformamídiniumhexafluórfosfát). Kombinované reakčné činidlá cirkulovali počas 60 minút v Pepsyntezátori. Odštiepenie od živice a spracovávanie sa uskutočňovali ako je opísané v príklade 5. Surový peptid sa potom purifikoval prostredníctvom HPLC so systémom a rozpúšťadlami uvedenými v príklade 1. Produkt sa zbavil solí na HPLC kolóne použitím 2,5%o AcOH.

Výťažok: 120 mg; HPLC čistota: 78 %; MS: MW = 1515; iónová chromatografia: chlorid: 0,1 %, fosfát: 0,3 %, trifluóracetát: 4,0 %, acetát: 0,3 % (hmotn.).

Príklad 8 D-1-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (8)

Pred zostavením peptidu 8 modifikovaného na N-konci sa pripravil podľa príkladu 1 peptid H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS (8a), ktorý má rovnakú sekvenciu ako peptid 7b, ale líši sa typom spojovníka (PAC namiesto PAL). Cez noc sa uskutočňovala redukčná aminácia reakciou 6-O-trityl-a/p-D-glukopyranózy (8b, 422 mg, 1,0 mmol, T. Utamura, K. Kuromatsu, K. Suwa, K. Koizumi, T. Shingu, Tetsuro; Chem. Pharm. Bull. 34: 2341-2353, 1986) s imobilizovaným peptidom 8a (500 mg, 0,2 mmol/g) v DMF/HOAc (99/1, objem, pomer, 10 ml) použitím NaBH(OAc)3 (212 mg, 1,0 mmol) ako redukčného činidla. Následné odštiepenie výsledného kompletne chráneného derivátu (6-O-trityl-D-1-glucityl)-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-PheThr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS od živice použitím podmienok opísaných v príklade 1 a súčasné odstránenie tritylovej skupiny a všetkých skupín chrániacich aminokyseliny poskytlo 38 mg cieľového peptidu 8 po purifikácii preparatívnou HPLC a odstránení solí s 5%o vodnou HOAc.

-27HPLC čistota: 84,7 %; MS: MW = 1475; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 61,0 %; iónová chromatografia: chlorid: 0,1 %, acetát: 1,7 % (hmotn.).

Príklad 9 MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (8)

Syntéza peptidu 9 sa uskutočňovala suspendovaním imobilizovaného peptidu H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS (8a) v dioxáne a ochladením na 0 °C. Do tejto suspenzie sa pridalo 100 μΙ 4N vodného NaOH a 100 μΙ metyl chlórformátu. Reakčná zmes sa pretrepávala 16 hodín a následne sa živica premyla s EtOH/FkO, EtOH, CH2CI2 a éterom. Po vysušení vo vákuu sa produkt odštiepil od živice a purifikoval sa ako je opísané pri syntéze vyššie uvedeného peptidu (príklad 1). Nakoniec sa peptid zbavil solí na HPLC použitím 5%o vodnej kyseliny octovej a potom sa lyofilizoval, čím vznikol peptid 9.

Výťažok: 11 mg; HPLC čistota: 96,8 %; MS: MW = 1368; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 60,5 %; iónová chromatografia: chlorid: 2,0 %, fosfát: 0,2 %, acetát: 0,4 % (hmotn.).

Príklad 10 Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-7-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2 (10)

Pred syntézou peptidu 10 sa pripravil požadovaný aminokyselinový aldehydový stavebný blok Fmoc-Leu-H (10a) známym postupom (J.-P. Meyer, P. Davis, K. B. Lee, F. Porreca, H. I. Yamamura, V. Hrubý, J. Med. Chem. 38: 34623468, 1995). Zlúčenina 10a sa použila bez ďalšej purifikácie. V súlade so spôsobom opísaným v príklade 1 sa na živicu pripojil 8-aminokyselinový peptidový reťazec ako funkčná skupina, čím vznikol H-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (10b). Posledne menovaný imobilizovaný derivát (1 g, 0,2 mmol/g) sa suspendoval v 5 ml 1% kyseliny octovej v DMF. Pripravili sa

-28dva roztoky, 148 mg Fmoc-Leu-H (10a) v 2,5 ml DMF a 30 mg NaCNBHs v 2,5 ml DMF. Oba roztoky sa spojili a pridali sa ku suspenzii peptidu 10b. Zmes sa cez noc pretrepávala pri laboratórnej teplote. Následne sa takto získaný medziprodukt LeuV-[CH₂NH]-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (10c) chránil novo zavedenou sekundárnou amínovou funkčnou skupinou s BOC2O a pyridínom. Na živicu naviazaný peptid 10c sa suspendoval v 10 ml suchého CH2CI2 a pridalo sa 35 mg (0,16 mmol) BOC2O a 13 μΙ (0,16 mmol) pyridínu. pH sa udržiavalo pyridínom na pH = 8 a zmes sa cez noc pretrepávala. Spracovanie zahŕňalo premývanie živice s CH2CI2, EtOH, CH2CI2, éterom a vysušenie vo vákuu. Syntéza pokračovala prostredníctvom SPPS použitím Fmoc aminokyselín a HATU/DIPEA protokolu s NMP ako rozpúšťadlom (príklad 1). Posledný krok zahŕňal spájanie s 4-nitrofenylacetátom na zavedenie N-koncovej acetylovej skupiny. Po spracovaní ako je opísané v príklade 1 sa surový peptid purifikoval prostredníctvom HPLC, zbavil sa solí s 5%o kyselinou octovou a vysušil sa mrazením, čím vznikol cieľový peptid 10.

Výťažok: 28 mg; HPLC čistota: 76,3 %; MS: MW = 1339; iónová chromatografia: trifluóracetát: 1,2 %, acetát: 2,0 % (hmotn.).

Príklad 11 Ac-Arg-Ser-Phe-iHCH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ (11)

Syntéza peptidu 11 zahŕňalo redukčné spájanie Fmoc-Phe-H (11a, J.-P. Meyer, P. Davis, K. B. Lee, F. Porreca, H. I. Yamamura, V. Hrubý, J. Med. Chem., 38: 3462-3468,1995) s na živicu naviazaným chráneným peptidom H-Thr(tBu)-LeuAla-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS (11b) získaným prostredníctvom SPPS protokolu opísaného v príklade 1. Peptid 11b (1,0 g, 0,2 mmol/g) a aldehyd 11a (200 mg) sa suspendovali v 5 ml zmesi 1% kyseliny octovej a DMF a okamžite sa pridalo 30 mg (0,48 mmol) NaCNBH3 rozpusteného v 5 ml DMF. Zmes sa miešala 16 hodín, čo viedlo k vytvoreniu Fmoc-Phe-\|/-[CH₂NH]Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS. Peptidový reťazec sa potom predlžoval s príslušnými Fmoc-aminokyselinami a N-koncovým acetylačným činidlom použitím HATU/DIPEA SPPS protokolu, ako je

-29opisané v príklade 8. Spracovanie, HPLC-purifikácia a odstraňovanie solí, sa uskutočňovalo ako je opísané v príklade 1.

Výťažok: 52 mg; HPLC čistota: 97,9 %; MS: MW = 1338; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 92,4 %; iónová chromatografia: acetát: 2,5 % (hmotn.).

Príklad 12 Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val^-[CH₂NH]-Gly-NH2(12)

Pri syntéze tejto zlúčeniny nebolo možné uskutočňovať redukčnú alkyláciu s Fmoc-Val-H na živici. Preto sa pred imobilizáciou na živicu pripravil v roztoku dipeptidový analóg Fmoc-Val^-[CH₂NH]-Gly-OH (12d).

Fmoc-Val^-[CH₂NH]-Gly-Obzl (12c)

Fmoc-Val-H (12a, 3,16 g, 10 mmol, pripravený podľa T. Moriwake, S.-l. Hamano, S. Saito, S. Torii, S. Kashino, J. Org. Chem., 54: 4114-4120, 1989) sa rozpustil v EtOH/HOAc (80 ml, 99/1, objem, pomer) a pridal sa HCI.H-Gly-Obzl (12b, 2,02 g, 10 mmol) a nasledovalo pridanie NaCNBH₃ (0,94 g, 15 mmol). Reakčná zmes sa miešala cez noc pri laboratórnej teplote. Následne sa pridal 5% vodný NaHCO₃ (20 ml), aby sa neutralizovala reakčná zmes. Zmes sa potom vo vákuu zakoncentrovala a zvyšok sa extrahoval s CH₂CI₂. Spojené organické vrstvy sa premyli s nasýteným vodným NaCl, rýchlo sa vysušili na Na₂SO4, prefiltrovali sa a rozpúšťadlo sa odparilo, čím vznikol žltý olej. Po purifikácii silikagélovou chromatografiou (eluent: 0 až 4% metanol v CH₂CI₂) sa izolovala zlúčenina 12c vo forme bielej tuhej látky. Výťažok: 1,85 g (39 %). Analýza: TLC: (kremičitan, CH₂CI₂/MeOH 98/2) Rf = 0,45, MS: MW = 472.

Fmoc-Val-_V-[CH₂N(Boc)]-Gly-Obzl (12d)

Fmoc-Val-\]/-[CH₂NH]-Gly-Obzl (12c, 0,910 g, 1,93 mmol), Boc₂O (0,420 g,

1,93 mmol) a DIPEA (0,336 g, 1,93 mmol) sa rozpustili v suchom CH₂CI₂ (20 ml). pH sa udržiavalo zásadité pridávaním DIPEA a zmes sa miešala cez noc pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom okyslila pridaním 10% KHSO4.

Pridala sa voda a vodná vrstva sa extrahovala s CH2CI2. Spojené organické vrstvy sa premyli s nasýteným vodným NaCI, rýchlo sa vysušili na MgSO₄ a rozpúšťadlo sa odparilo, čím vzniklo 0,96 g (97 %) 12d. Analýza: TLC: (kremičitan, CH₂CI₂/MeOH 98/2), Rf = 0,55; MS: MW = 572.

Fmoc-Val^-[CH₂N(Boc)]-Gly-OH (12e)

Fmoc-Val^-[CH₂N(Boc)]-Gly-Obzl (12d, 0,97 g, 1,70 mmol) sa rozpustil v zmesi MeOH/EtOAC (1/1, objem, pomer, 100 ml) a hydrogenoval sa pri normálnom tlaku s 10% Pd/C počas 2 hodín. Paládiový katalyzátor sa odfiltroval a filtrát sa zakoncentroval, čím vznikla karboxylová kyselina 12e vo forme jemne žltého oleja. Výťažok: 0,661 g (81 %)'. Analýza: TLC: (kremičitan, CH₂CI₂/MeOH/AcOH 90/9/1) Rf = 0,42; MS: MW = 482.

Použitím peptidového syntezátora s HATU/DIPEA dvojitým striekačkovým režimom a s dvojitým spájaním s HATU/DIPEA sa zlúčenina Fmoc-Val-ψ[CH₂N(Boc)]-Gly-OH (12e) (0,661 g, 1,37 mmol) naniesla na PAL-PEG-PS živicu (1,5 g, 0,15 mmol/g, 0,225 mmol). Úroveň substitúcie sa merala štandardným Fmoc štiepiacim postupom a bola 0,13 mmol/g nanesenej živice (výťažok: 87 %). Výsledný peptid Fmoc-Val-M/-[CH₂N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS (12f) sa ďalej predlžoval použitím HATU/DIPEA SPPS protokolu (príklad 1) s dvojitými kondenzačnými krokmi trvajúcimi 60 minút pre každú Fmoc-aminokyselinu. Podobne ako pri peptidoch 9 a 11 sa N-koncová acetylová skupina zaviedla použitím 4-nitrofenylacetátu. Spracovávanie, purifikácia a odstraňovanie solí sa uskutočňovalo ako je opísané v príklade 1.

Výťažok: 17 mg; HPLC čistota: 80,1 %; MS: MW = 1338; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 63,7 %; iónová chromatografia: chlorid: 1,0 %, fosfát: 0,2 %, acetát: 0,2 % (hmotn.).

Príklad 13 Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ (13)

-31 Na syntézu peptidu 13 sa najprv pripravil potrebný peptoidný monomér

Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13e).

Ζ-2-aminoetyl-ŕerc-butyl éter (13a)

3,25 g MgSO₄ (27 mmol) sa rozsuspendovalo v 80 ml CH2CI2 (suchý). V N₂sa pridalo 1,5 ml koncentrovanej H₂SO₄ (postup: S.W. Wright, D.L. Hageman, A.S. Wright, L. McCIure, Tetrahedrom Lett., 38: 7345-7348, 1997) Zmes sa miešala 15 minút a potom sa pridal terc-BuOH (12,9 ml) a komerčne dostupný Ζ-2-aminoetanol (5,28 g, 27 mmol) rozpustený v CH₂CI₂ (20 ml). Po 5-dňovom miešaní sa pridalo 200 ml 5% vodného NaHCO3 do reakčnej zmesi, ktorá sa miešala, až kým sa nerozpustil všetok MgSO₄. Vrstvy sa oddelili a CH₂CI₂ vrstva sa premyla so soľným roztokom. Organická vrstva sa vysušila na MgSO₄, prefiltrovala sa a rozpúšťadlo sa odparilo, čím sa získalo 5,6 g surového 13a. Produkt sa purifikoval kolónovou chromatografiou (eluent: heptán/EtOAc 3:1 objem, pomer). Výťažok 5,00 g (78 %). ¹H NMR (CDCI3) δ: 1,15 (s, 9H, tBu), 3,3-3,5 (dt, 4H, 2 x CH₂), 5,1 (bs, 2H, CH₂Bzl),

7,4 (m, 5H, Ar).

2-aminoetyl-ŕerc-butyl éter.HCI (13b)

K roztoku 5,00 g benzylesteru 13a v etylacetáte (150 ml) sa pridalo 225 mg 10% Pd/c a 2 hodiny cez neho prebublával H₂. Katalyzátor sa odfiltroval a pridalo sa 15 ml 1M vodnej HCI. Rozpúšťadlo sa odparilo a pridal sa malý objem éteru. Precipitovaný produkt 13b sa odfiltroval a vysušil vo vákuu. Výťažok 2,35 g (77 %). NMR (CDCI3) δ: 1,20 (s, 9H, tBu), 3,15 (t, 2H, CH₂), 3,65 (t, 2H, CH₂), 8,2-8,4 (bs, 2H, NH₂).

A/-(2-terc-butoxyetyl)-glycín (H-NhSer(tBu)-OH) (13c)

K roztoku zlúčeniny 13b (2,30 g, 15 mmol) v 25 ml H₂O sa pridalo 1,40 g (15,2 mmol) kyseliny glyoxylovej.H₂O. pH sa nastavilo na pH = 6 s 1,0M vodným NaOH. Do tohto roztoku sa pridalo 230 mg Pd/C a reakčná zmes sa pretrepávala pri 45 psi H₂ tlaku cez noc. Katalyzátor sa odfiltroval a premyl s 5 ml H₂O. Filtrát obsahujúci 13 c sa použil bez ďalšej purifikácie v nasledujúcom kroku.

-32Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13d) pH reakčného produktu 13, ešte rozpusteného v H2O, sa upravilo na pH =

9,5 s 1N NaOH. Zásaditý roztok sa nariedil 25 ml acetónu a po kvapkách sa pridalo 5,40 g (16 mmol) Fmoc-Osu rozpusteného v 25 ml acetónu. pH sa udržiavalo na

9,5 s 1N NaOH. Po miešaní cez noc sa reakčná zmes zakoncentrovala na 150 ml a premyla sa 2 x 50 ml zmesi éteru a heptánu (1/1, objem, pomer). H2O vrstva sa okyselina na pH = 2,5 pridaním 20% kyseliny citrónovej a 3 x sa extrahovala so 100 ml etylacetátu. Organické vrstvy sa spojili a vysušili na Na2SO4. Rozpúšťadlo sa odparilo a produkt sa purifikoval kolónovou chromatografiou (kremičitan, CH₂Cl2/MeOH, 5/1, objem, pomer) a vysušil sa vymrazením. Výťažok 5,44 g (91 %). ¹H NMR (CDCI3) δ: 1,20 (s, 9H, tBu), 3,2 (dt, 2H, CH₂), 3,6-3,7 (dt, 2H, CH₂), 4,05 (s, 2H, CH2CO2H), 4,2 (b, 1H Fmoc), 4,4-4,6 (2H, 2 x d, Fmoc), 7,3-7,8 (m, 8H, ArH, Fmoc).

Syntéza peptidu 13 sa uskutočňovala na Pepsyntezátori použitím duálnej striekačkovej techniky opísanej vyššie (príklad 1). Podkladom bol Fmoc-PAL-PEGPS, (1,0 g, 0,15 mmol/g) s NMP ako rozpúšťadlom. Pre všetky aminokyseliny sa používalo dvojité párovanie (párovací čas 60 minút) vrátane Fmoc-NhSer(tBu)-OH (13d). N-koncová acetylová skupina sa zavádzala použitím 4-nitrofenylacetátu. Spracovanie a odštiepenie od živice a odštiepenie ochranných skupín sa uskutočňovalo štandardným spôsobom (príklad 1). Surový peptid sa purifikoval prostredníctvom HPLC a zbavil sa solí 5%o vodnou kyselinou octovou.

Výťažok: 50 mg; HPLC čistota: 98,6 %; MS: MW = 1366; aminokyselinová analýza: všetky aminokyseliny boli prítomné v požadovaných množstvách; obsah peptidu: 82,1 %; iónová chromatografia: chlorid: 0,3 %, acetát: 1,3 % (hmotn.).

Príklad 14 Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\|/[CH₂NH]-Gly-NH₂ (14)

Syntéza sa uskutočňovala použitím HATU/DIPEA protokolu na Pepsyntezátori (príklad 1). Ako stavebné bloky sa použili vyššie opísaná funkcionalizovaná živica Fmoc-Val-M/-[CH₂N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS (12f) a chránený peptoid FmocNhSer(tBu)-OH (13d). Ako je opísané vyššie, použila sa duálna striekačková

-33technika a dvojité párovania pričom jedno trvalo 60 minút. Predlžovanie peptidového reťazca na syntezátori sa zastavilo pred pripojením Fmoc-NhSer(tBu)OH (13d) a táto aminokyselina sa rozpustila v DMSO a sonifikovala sa pred pripojením na imobilizovaný peptidový reťazec (H-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val^[CH₂NH]-Gly-PÄĽ-PEG-PS). Syntéza sa ukončila kondenzáciou zvyšnej (Arg) aminokyseliny a acetyláciou použitím 4-nitrofenylacetátu. Spracovanie, purifikácia a odsolenie boli štandardné, ako je uvedené v príklade 1. Lyofilizácia poskytla 47 mg peptidu 14.

HPLC čistota: 72,9 %; MS: MW = 1352; iónová chromatografia: trifluóracetát:

5,5 % (hmotn.).

Príklad 15

Predselekcia agonistických peptidov použitím antigén špecifických T-bunkových hybridómov (prvolíniový test)

Na testovanie agonistickej aktivity modifikovaného peptidu sa použili 3 rozličné HC gp-39 (263-275)-špecifické hybridómové bunkové línie (5G11, 8B12 a 14G11). 5 x 10⁴ hybridómových buniek a 2 x 10⁵ ožiarených (1200 RAD), EBVtransformovaných B buniek nesúcich DRB1*0401 špecificitu sa inkubovalo v 150μΙ objemoch v jamkách mikrotitračnej platne s okrúhlym dnom. Pridal sa peptidový antigén (HC gp-39 (263-275) a modifikované peptidy) v 50μΙ objemoch do duplikátnych jamiek. O 48 hodín neskôr sa testovalo 100 μΙ kultivačného supernatantu z hľadiska produkcie antigén špecifického IL-2 použitím sendvičovej ELISA s Pharmingen protilátkami špecifickými pre myšací IL-2.

Výber agonistických peptidov použitím antigén špecifických T-bunkových klonov (druholíniový test)

243 T-bunkový kloň sa izoloval z peptidovej špecifickej T-bunkovej línie získanej od RA odpovedajúceho na peptid 263-275 (RA pacient 243). Klony sa získali po štyroch opakovaných stimuláciách s HC gp-39 (263-275) peptidom v prítomnosti DRB1*0401 zodpovedajúcich PBMC. H235 T-bunkový kloň sa izoloval z peptidom stimulovanej T-bunkovej línie získanej od HLA-DRB1 *0401-pozitívneho

-34darcu. Po 2 stimuláciách s peptidom HC gp-39 (263-275) v prítomnosti DRB1*0401 zodpovedajúcich PBMC sa PHA klonovaním získali klony. Zistilo sa, že oba klony 243 aj 235 sú DRB1*0401 obmedzené pri rozoznávaní peptidového antigénu. V každom experimente sa použili bunky na 10 až 14 deň po stimulácii.

Proliferatívne odpovede klonu 243 a klonu 235 sa merali inkubovaním 2 x 10⁴ T-buniek a 10⁵ DRB1*0401-zodpovedajúcich (3000 RAD ožiarených) PBMC v 150μΙ objemoch média s 10% normálnym ľudským sérom (NHS, CLB, Amsterdam, Holandsko) v mikrotitračných platniach s plochým dnom. 50 μΙ antigénového roztoku (obsahujúceho 263-275 sekvenciu alebo modifikácie, ako je uvedené) sa distribuovalo trojmo v jamkách. Pridal sa ³H-tymidín na 2. alebo 3. deň po inkubovaní. Bunky sa izolovali na sklenené vláknité filtre a merala sa inkorporovaná rádioaktivita.

Výsledky

Väčšina modifikovaných peptidov uvedených v tabuľke 2 bola schopná stimulovať všetky tri T-bunkové hybridómy spôsobom podobným s vedúcim peptidom H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH. Avšak niektoré peptidy nestimulovali všetky tri hybridómy, čo je príkladom rozdielnej špecificity použitých hybridómov.

Keď boli tieto agonisty testované z hľadiska ich schopnosti stimulovať dva ľudské T-bunkové klony, bol zrejmý jasný rozdiel v potenciále testovaných zlúčenín (tabuľka 2). Väčšina modifikovaných zlúčenín indukovala odpoveď na kloň 235 a 243. Jedna zlúčenina (Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-GlyNH₂) neindukovala proliferatívnu odpoveď ani u jedného klonu. Tri zlúčeniny (H-betahomoarginyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-ArgSer-Phe-i|/-[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-SerPhe-Thr-Leu^-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂) boli aktívne len na jednom klone (buď klone 243 alebo klone 235). Tri zlúčeniny H-Arg-Ser-Phe(4CI)Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H-D-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-SerSer-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH a CH₃OC(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-GluThr-Gly-Val-Gly-OH) indukovali proliferatívnu odpoveď u oboch klonov, pričom táto odpoveď bola rovnakého rozsahu ako odpoveď indukovaná vedúcim peptidom

-35H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH. Sedem zlúčenín (AcArg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃(OCH₂CH₂)₃-OCH₂C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2, D-1 -glucityl-ArgSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (A/-metyl-nikotinoyl)⁺-ArgSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-LeuAla-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-_V[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-AlaSer-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-GluThr-Gly-Val^[CH₂NH]-Gly-NH₂) bolo vynikajúcich pri indukcii proliferatívnej odpovede jedného alebo oboch klonov. Najúčinnejšími identifikovanými zlúčeninami boli Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-PheThr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\|/[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-NhSer-Phe-ThrLeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂ a Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-SerSer-Glu-Thr-Gly-Val-\|/[CH₂NH]-Gly-NH₂ (tabuľka 2 a obrázok).

Príklad 16

Samičky Balb/c myší staré približne 8 až 10 týždňov (Charles River Nemecko alebo Charles River Francúzsko) sa imunizovali v deň 0 100 μΙ antigénového prípravku (50 μg HC gp-39 263-275) v nekompletnom Freundovom adjuvnas (IFA+ Sigma Chemicals, St. Louis, USA). Antigén sa podával subkutánne v dvoch častiach do oblasti hrudníka myší. Na 7. deň sa myši stimulovali antigénovým prípravkom (HC gp-39 (263-275) nariedeným v 0,9% NaCI (NPBI, Emmer Compascuum, Holandsko) v objeme 50 μΙ v 1 mg/ml kamenca (Pharmacy DonkersPeterse, Oss, Holandsko) unilaterálne do zadnej nohy (ľavej labky); do druhej (pravej) zadnej labky sa injekčné podalo 50 μΙ kamencového roztoku v 0,9% NaCI ako kontrola. Na 8. deň sa stanovoval oddialený typ hyersenzitívnych odpovedí (priemerné % špecifického opuchnutia) meraním zväčšenia hrúbky ľavej zadnej nohy v porovnaní s pravou zadnou nohou (napuchnutie ľavej nohy (mm) napuchnutie pravej nohy (mm)/napuchnutie pravej nohy (mm) x 100 %) použitím súkromne skonštruovaného mikrometra.

Nazálna aplikácia antigénového prípravku (50, 10, 2 alebo 0,4 μρ (alebo nižšie koncentrácie)) HC gp-39 (263-275) alebo modifikovaných peptidových

-36derivátov sa uskutočňovala v izofluránovej (Forene®, Abbott BV, Amstelveen,

Holandsko) anestézii raz (deň -5), pred imunizáciou v deň 0, 100 μΙ antigénového prípravku obsahujúceho 50 μ9 HC gp-39 263-275 v IFA. V týchto experimentoch sa myši imunizovali a stimulovali s HC gp-39 263-275 a DTH odpovede sa stanovovali ako bolo opísané vyššie.

Použitie vyššie opísaného testovacieho systému, v ktorom Balb/c myši imunizované s HC gp-39 (263-275) v IFA odpovedali na HC gp-39 (263-275), umožnilo štúdium potenciálnych účinkov indukcie tolerancie nazálnou aplikáciou HC gp-39 (263-275) v porovnaní s potenciálnymi účinkami modifikovaných peptidových derivátov. Predošetrenie s HC gp-39 (263-275) tlmilo HC gp-39 (263-275) špecifickú DTH reakciu; tento účinok bol závislý na dávke peptidu, ktorá bola zahrnutá v predošetrovacej procedúre. Použitím relatívne vysokej peptidovej koncentrácie (50 pg/myš) nazálna aplikácia jednej dávky HC gp-39 (263-275) úplne zrušila DTH reakciu, zatiaľ čo dávka 2 pg/myš bola neúčinná. Takže bol ustanovený protokol na rozlišovanie medzi účinnými (tolerogénnymi) a neúčinnými dávkami peptidu v HC gp-39 (263-275) špecifickom DTH testovacom systéme. Predpokladajúc, že modifikované peptidové deriváty založené na HC gp-39 (263-275) môžu byť aktívne v nižších koncentráciách ako originálny peptid, očakávalo sa, že takéto peptidy budú indukovať toleranciu pri relatívne nízkych peptidových koncentráciách. V súlade s týmto predpokladom sa testovali série modifikovaných peptidov podľa tohto protokolu na indukciu tolerancie. V tomto experimente (pri ktorom bola indukovaná spoľahlivá HC gp-39 (263-275) odpoveď, ktorá mohla byť tlmená predošetrením s 50 pg, ale nie s 2 pg HC gp-39 (263-275)) sa ukázalo, že špecifické modifikácie peptidu boli veľmi aktívne pri indukciu tolerancie, zatiaľ čo iné neboli (pozri tabuľku 3).

-37Tabuľka 2

Zhrnutie výsledkov získaných prvolíniovým (hybridómovým testom) a druholíniovým testom (testom proliferácie ľudských klonov)

Reaktivita ľudsk. klonov

243

+

nd

+

nd

+++

+ +

+

1

nd

235

+

n c

nd

+

i nd

nd

+++

+

+ +

+

1

+

Hybr. test

+

♦ +

* +

Testované peptidy

H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

H-Arg-Ser-Phe(4Br)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

H-Arg-Cha-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

Ac-(D-Arg)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

OJ r z 0 1 CD > 1 0 l— .C H ZJ 0 <D ω ΰΦ ω cb < 1 z> Φ _1 1 L_ 2Z F 1 Φ -CZ Q. 1 k_ Φ ω 1 >» C C cn Lro o c: E CD ω Φ °

Desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

OJ I z 0 1 CO > 0 J. XZ i- 1 ZJ 0 1 LΦ ω 1 L·. Φ ω CD < 1 D Φ _J LJZ 1— 1 Φ JZ Q. 1 L_ Φ ω cn < 1 o 0 σι I o o 1 OJ T. u OJ T o o 1 co T o

D-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

(/\/-Me-nikotininoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Ľeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH

H-betahomoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH 1

OJ z: z >» 0 t CD > 0 č. JZ H ži 0 iL Φ ω φ ω 1 CD < □ Φ —1 JZ H T Z OJ T o 1 Φ xz Οι Φ ω 1 σ> L_ < ύ <

σι T Z >σ 0 1 CD > 0 1 JZ 1- 1 Ώ 0 íl Φ ω Λ Φ ω 1 CD < I Ρ· Ί τ ζ OJ τ ο 1 ζ> φ _j u. Η φ χζ 0. φ ω 1 σ> 1— < ύ <

38Tabuľka 2 - pokračovanie

σ c	+++		+ + +	+++
Ό
	+		+	+
	+		+	+
	+	1	+	+
*
	+	+	+	+
				CM
				X
CM	CM			z 1
X	X
z 1	Gly-N			0
0			x
]-Val-	x z CM	CM X z	X z 1 >1	z CM X o
T z	X 0	l-Gly-	0 1	1
X	B-	«J	ra
o	1	ro	>	>
(TJ	> 1 >% 0		r-Gly-
1 >t	> 1 >>	0 1
0	0 1 L_		x	x
	x:	F	F
.c	X	F	zj O 1	“Ί
f— 1 3	*7 ZD	0 1	r-Gli
0	0	Φ	φ
d-	iL	Φ	CO	U)
Φ	Φ	co	ú-	d-
co	co	I	Φ	Φ
d.	J.	Φ	CO	U)
-Se	-Se	a-S	(0 <	ro <
<	-Ala	< D	1 3 Φ	1 n Φ
o	D	Φ	—1	—1
Φ	Φ	—1	iL	ó
—1	—1	d.	.C.	x
1	1	x	F	F
x:	x	F	d)	(D
F	F	CD	x:	x
φ	Φ	x	CL	Q.
x:	x	CL	d.	d.
CL	CL	1	Φ	Φ
ó		Φ	CO	co
a;	Φ	co	x:
co	co	t O)	z	Z
É	Ó) u.	k- 05	é⁵	σ> u.
<	<	z	<	<
ώ	ύ	6'	ύ	o
<	<	<	<	<

Tabuľka 3 DTH testy

2 1 ° >· O -fi CL Ό	o	<2	2-10	50	1	50-10	<0,4	1	CM V	<0,4 1___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________	10-50	2-10		o V	10-50		CD O O
Testovaná dávka (DTH) (gg i.n. deň -5)	50, 10, 2,0,4	50, 10,2	50, 10, 2, 0,4	50,10,2	50, 10, 2, 04	50,10, 2	50, 10, 2, 0,4	50, 10, 2, 0,4	50, 10,2	50, 10, 2, 0,4	50, 10, 2, 0,4	50, 10, 2, 0,4	nd	50, 10, 2, 0,4	50, 10,2	nd	50,10,2,0,4,0,08,0,016,0,0032	nd
Testované peptidy	H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	H-Arg-Ser-Phe(4CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	H-Arg-Ser-Phe(4Br)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	H-Arg-Cha-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	Ac-(D-Arg)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	Desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂	Desaminoargininy!-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Giy-OH	Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	CN X Z 0 1 co > >» 0 1 L·JZ 11 D 0 ll Φ co tl Φ co ώ < 1 3 Φ —1 1 x F 1 Φ X Οι Φ co 1 CD k— < O o CM I o o CN I O CN □ľ O o 1 CO X o	D-glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	x o >1 0 1 ro > 1 >1 0 d .c 1- 1 D 0 1 k. Φ co k_ φ CO 1 co < 1 3 Φ —1 1 X F 1 Φ X CL 1 L— Φ <0 1 B⁵< 1 + >N O c X O 'c 1 Φ s š	MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-A!a-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	H-betahomoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH	CM X z 0 1 ro > 0 tl -C 1— 1 □ 0 kl Φ CO tl φ CO 1 co < t 3 Φ —1 tl x: F X Z CN X o B- 1 Φ X Οι k_ Φ CO 1 CD k— O <	CN X z >, 0 1 > >, 0 kl xz F 1 □ 0 tl Φ co 1φ CO co < X Z CN X o > 1 3 Φ —1 11 x F 1 Φ _c Q. 1 k— Φ CO 1 CD k_ < ύ <	CM X z 1 >> 0 1 ro > 1 x z CM X o B- 1 0 1 k_ X F 1 3 0 1 k— Φ CO 1 k— Φ CO ró < 1 3 Φ —1 il x F 1 Φ X CL Φ CO 1 CD k_ < ώ <	CM X z 1 0 x z CN X O B- 75 > >1 0 u. X F 1 3 0 11 Φ co tl Φ CO 1 (D < 3 Φ —1 1 k_ X F 1 Φ X 0L 1 k_ Φ CO 1 CD t— < ύ <	CM X z >k 0 1 ro > >. 0 tl x F e □ 0 11 Φ CO il Φ CO 1 ro < 1 3 Φ _) 1 k_ _Cľ F 1 Φ -C CL tl Φ CO É (0 z 1 Q <

Tabuľka 3 - pokračovanie

0,016-0,08	0,0032
CN	CN
CQ	CQ
O	O
O	O
O	o
co	co
O	o
o	o
00	co
o	o
o	o
-N-	N⁷
o	o
CN	CN
O	o

o	o
lO	io
	CM
	T
	z
	>1
	0

CM T	T
z
z	I
>.	0
CD
CO	ra
>	>
>1	>1
CD	0
U-	iL
x:	-C
H	H
Ž}	i
0	CD
U.	L—
Φ	Φ
ω	ω
lL	tL
0)	Φ
ω	ω
rá	(D
<	<
i
φ	φ
—1	—1
11	11
x:	x:
1-	1-
Φ	Φ
x:	xz
Q.	Ol
L—	íl
Φ	Φ
0	U)
x:	C
z	z
CD	CD
<	<
O	ώ
<	<

-41 Zoznam sekvencií <110> AKZO NOBEL N. V.

<120> Modifikované peptidy a peptidomimetiká na použitie v imunoterapii <130>

<140>

<141 >

<160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210>2 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Xaa v polohe 1 znamená desaminoargininyl; na C-koncový Gly je pripojené NH₂ <400> 2

Xaa Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

-42<210>3 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Xaa v polohe 1 znamená desaminoargininyl <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 3

Xaa Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210>4 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Na N-koniec je pripojený CH3-(OCH2CH3)3-C(O); na C-koniec je pripojené

NH₂ <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 4

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10

-43<210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Na N-koniec je pripojený D-1 -glucityl <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 5

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210>6 <211>13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Na N-koncovej polohe peptidu: CH₃O-C(O) <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 6

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210>7

-44<211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Na N-konci je pripojené Ac; na C konci je pripojené NH₂; Xaa v polohe 3 znamená NH-CH(CH₂Ph)-CH₂ <400> 7

Arg Ser Xaa Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210>8 <211>13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Na N-konci je pripojené Ac; na C konci je pripojené NH₂; Xaa v polohe 5 znamená NH-CH(CH₂CH(CH₃)₂)-CH₂ <400> 8

Arg Ser Phe Thr Xaa Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

-45<210>9 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Na N-konci je pripojené Ac; na C konci je pripojené NH₂; Xaa v polohe 12 znamená NH-CH(CH(CH₃)₂)-CH₂ <400>9

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Xaa Gly

10 <210> 10 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Na N-konci je pripojené Ac; na C konci je pripojené NH₂; Xaa v polohe 2 znamená N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O) <400> 10

Arg Xaa Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

-46<210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Na N-konci je pripojené Ac; na C konci je pripojené NH₂; Xaa v polohe 2 znamená N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O); Xaa v polohe 12 znamená NHCH(CH(CH₃)₂)-CH₂ <400> 11

Arg Xaa Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Xaa Gly 15 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Xaa v polohe 3 znamená Phe(CI) <400> 12

Arg Ser Xaa Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

5

-47<210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Xaa v polohe 1 znamená H₂N-(CH2)5-C(O) <400> 13

Xaa Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> Xaa v polohe 1 znamená H₂N-(CH₂)6-C(O) <400> 14

Xaa Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210> 15 <211> 13

-48<212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <220>

<223> na N-koniec je pripojený (/\/-metyl-nikotinoyl)⁺ <400> 15

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Xaa v polohe 3 znamená Phe(4Br) <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 16

Arg Ser Xaa Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly <210> 17 <211> 13 <212> PRT

-49<213> Umelá sekvencia <220>

<223> Xaa v polohe 3 znamená cyklohexylalanín <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 17

Arg Ser Xaa Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Xaa v polohe 1 znamená H-betahomoargininyl <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 18

Xaa Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly

10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia

-50<220>

<223> Na N-koniec je pripojené Ac; na C-koniec je pripojené NH₂; Xaa v polohe 11 znamená NH-CH₂-CH₂ <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 19

Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Xaa Val Gly 15 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Na N-koniec je pripojené Ac; na C-koniec je pripojené NH₂; Xaa v polohe 1 znamená N(CH₂CH₂CH₂NH-C(=NH)-NH₂)-CH₂-CO <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetický peptid <400> 20

Xaa Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Xaa Val Gly

Claims

PATENTOVÉ NÄROKY

1. Modifikovaný peptid, odvodený od H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-SerGlu-Thr-Gly-Val-Gly-OH (vzorec I), všeobecného vzorca Q-A¹-A²-A³-A⁴-A⁵-A⁶-A⁷-A⁸A⁹-A¹⁰-A¹¹-A¹²-A¹³-Z (vzorec II), kde A¹ až A¹³ zodpovedajú aminokyselinám vzorca I, Q znamená H a Z znamená OH, pričom 1 až 6 modifikácii je vybraných z jednej alebo viacerých skupín a), b) alebo c) pozostávajúcich z:

a) substitúcií 1 až 6, výhodne 1 až 4 aminokyselín, v A¹ až A¹³ inými ako prirodzenými aminokyselinami alebo β aminokyselinami,

b) substitúcií jednej alebo viacerých amidových väzieb redukovanými amidovými väzbami alebo etylénovými izostermi,

c) substitúcie v Q a/alebo Z; a voliteľne,

d) substitúcií prirodzenými aminokyselinami do celkového počtu 6 modifikácií.
2. Peptid podľa nároku 1, kde Q znamená H, (C-i_6)alkyl, formyl, (C-i-síalkylkarbonyl, karboxyľC^alkyl, (Ci-6)alkyloxykarbonyl, (C2-6)alkenyloxykarbonyl, (C6-i4)aryl(Ci.₆)alkyl; (C₆-i4)aryl(Ci-4)alkyloxykarbonyl, ΟΗ₃(ΟΟΗ₂ΟΗ₂)η-ΟΟΗ2-0(0)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 alebo 4; 1-metyl-pyridínium-3karbonyl, 1-metyl-pyridínium-4-karbonyl alebo Lys alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)n-C(O)-, kde n je 2 až 5;

Z znamená OR, kde R znamená H, (Ci-6)alkyl, (C₂-6)alkenyl, (C₆.₁₄)aryl(Ci^)alkyl, (C4-i₃)heteroaryl(Ci.₆)alkyl alebo NR¹R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané z H, (C^alkylu alebo (C6-i4)aryl(Ci.₆)alkylu;

a voliteľne Q a Z obsahujú navyše spolu do 10 aminokyselín umiestnených vedľa polohy A¹ a/alebo A¹³.
3. Peptid podľa nároku 1 alebo 2, kde substitúcie prirodzenými aminokyselinami v A¹ až A¹³ nenastávajú vo viac ako 4, výhodne vo viac ako 2 polohách.
4. Peptid podľa nárokov 1 až 3, kde

Q znamená H, (Ci_₆)alkyl, formyl, (Ci-6)alkylkarbonyl, karboxy(Ci-6)alkyl, (C₁_₆)alkyloxykarbonyl, (C₂.6)alkenyloxykarbonyl, aryl(Ci-6)alkyl; (C₆.i4)aryl(C-i^)alkyloxy-52karbonyl, CH₃(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 alebo 4; 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl, 1-metyl-pyridínium-4-karbonyl alebo Lys alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)n-C(O)-, kde n je 2 až 5;

A¹ znamená L-Arg, D-Arg, L-Lys, D-Lys, L-Ala, D-Ala, H2N-C(=NH)NH-(CH2)n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H2N-(CH2)n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (/?)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(=NH)NH2]-CH2-C(O)-}, kde n je 2 až 5, alebo (δ)-{-ΝΗ-ΟΗ[(ΟΗ2)η-ΝΗ-Ο(=ΝΗ)-ΝΗ2]-ΟΗ2C(O)-}, kde n je 2 až 5, alebo -N[(CH2)n-NH-C(=NH)-NH2]CH2-C(O)-, kde n je 2 až 5. A² znamená L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala, Gly alebo -N[(CH2)_n-OH]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5;

A³ znamená L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X), kde X nezávisle znamená jeden alebo viacero z (CM)alkyl, hydroxy, halogén, (Ci.6)alkylkarbonylamino, amino alebo nitro, L-Hfe, D-Hfe, L-Thi, D-Thi, L-Cha, D-Cha, L-Pal(3), D-Pal(3), L-1-Nal, D-1-Nal, L-2-Nal, D-2-Nal, L-Ser(Bzl), D-Ser(Bzl), (R)-{-NH-CH(CH2-aryl)-CH₂-} alebo (S){-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-} alebo (F?)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-} alebo (S)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-};

A⁴ znamená L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala alebo Gly;

A⁵ znamená L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva, L-Ala, D-Ala, Gly, (R)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)2)-CH2-} alebo (S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH₃)2)-CH2-};

A⁶ znamená L-Ala, D-Ala alebo Gly;

A⁷ znamená L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala alebo Gly;

A⁸ znamená L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Thr, D-Thr, L-Ala, D-Ala alebo Gly;

A⁹ znamená L-Glu, D-Glu, L-Asp, D-Asp, L-Ala, D-Ala alebo Gly;

A¹⁰ znamená L-Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser, L-hSer, D-hSer, L-Ala, D-Ala alebo Gly;

A¹¹ znamená Gly, L-Ala, D-Ala alebo -NH-CH₂-CH₂-;

A¹² znamená L-Val, D-Val, L-Nva, D-Nva-, L-Leu, D-Leu, L-lle, D-lle, (f?)-{-NHCH[CH(CH₃)₂]-CH2-}, (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH2-}, (RH-NH-CH[CH₂CH₂CH₃]CH₂-}, (S)-{-NH-CH[CH₂CH2CH₃]-CH2-}, (R)-{-NH-CH[CH₂CH(CH₃)2]-CH2-}, (S){-NH-CH[CH₂CH(CH₃)2]-CH₂-}, (RR)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (RS){-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]-CH₂-}, (S/?)-{-NH-CH[CH₂(CH(CH₃)-CH₂CH₃]CH₂-} alebo (SSH-NH-CH[CH₂(CH(CH₃>CH₂CH₃]-CH2-};

A¹³ znamená Gly, L-Ala alebo D-Ala; a

-53Z znamená OR, kde R znamená H, (C₁_₆)alkyl, (C₂.₆)alkenyl, (C₆.i₄)aryl(CM)alkyl, (C4.i3)heteroaryl(Ci.₆)alkyl alebo NR¹ R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané z H, (Ci.₆)alkyl alebo (C₆.i4)aryl(Ci.₆)alkyl;

a voliteľne Q a Z obsahujú navyše spolu do 10 aminokyselín umiestnených vedľa polohy A¹ a/alebo A¹³.
5. Peptid podľa nárokov 1 až 4, kde

Q znamená H, (Ci.₆)alkyl, (Ci.₆)alkylkarbonyl, karboxy(Ci.₆)alkyl, (C-i_₆)alkyloxykarbonyl, CH₃(OCH₂CH2)n-OCH2-C(O)-, kde n je 1 až 10, HOCH₂-(CHOH)_m-CH₂-, kde m je 3 alebo 4; 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl, 1-metyl-pyridínium-4-karbonyl alebo Lys alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5;

A¹ znamená L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 5, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 2 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)n-NH-C(=NH)-NH2]CH₂-C(O)-}, kde n je 2 až 5, alebo N[(CH₂)_n-NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5;

A² znamená L-Ser, L-Ala, D-Ala, Gly alebo -N[(CH₂)_n-OH]CH₂-C(O)-, kde n je 2 až 5;

A³ znamená L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), D-Phe(X), kde X znamená halogén alebo nítro, L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal, L-Ser(Bzl) alebo (S)-{-NH-CH(CH₂-aryl)-CH₂-};

A⁴ znamená L-Thr alebo L-Ala;

A⁵ znamená L-Leu, L-Ala alebo (S)-{-NH-CH(CH₂-CH(CH₃)₂)-CH₂-};

A⁶ znamená L-Ala alebo Gly;

A⁷ znamená L-Ser alebo L-Ala;

A⁸ znamená L-Ser alebo L-Ala;

A⁹ znamená L-Glu alebo L-Ala;

A¹⁰ znamená L-Thr alebo L-Ala;

A¹¹ znamená Gly, L-Ala alebo -NH-CH₂-CH₂-;

A¹² znamená L-Val alebo (S)-{-NH-CH[CH(CH₃)₂]-CH₂-}.

A¹³ znamená Gly alebo L-Ala; a

Z znamená OR, kde R znamená H alebo NR¹ R², kde R¹ a R² sú nezávisle vybrané z H, (Ci.₆)alkyl;

-54a voliteľne Q a Z obsahujú navyše spolu do 10 aminokyselín umiestnených vedľa polohy A¹ a/alebo A¹³.
6. Peptid podľa nárokov 1 až 5, kde

Q znamená H, metyl; acetyl; karboxymetylén, metoxykarbonyl; CH3(OCH₂CH₂)3OCH2-C(O)-, D-1-glucityl, 1-metyl-pyridínium-3-karbonyl alebo 1-metyl-pyridínium-4karbonyl alebo Q chýba, ak A¹ znamená H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-;

A¹ znamená L-Arg, D-Arg, L-Ala, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)4-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je 5 až 7, (S)-{-NH-CH[(CH₂)3-NH-C(=NH)-NH₂]-CH2-C(O)-} alebo N[(CH₂)₃NH-C(=NH)-NH₂]-CH₂-C(O)-;

A² znamená L-Ser, L-Ala alebo -N[(CH₂)2-OH]-CH2-C(O)-;

A³ znamená L-Phe, D-Phe, L-Phe(X), kde X znamená halogén alebo nitro, L-Hfe, L-Thi, L-Cha, L-Pal(3), L-1-Nal, L-2-Nal alebo L-Ser(Bzl); a

Z znamená OH, NH₂ alebo NHEt;

a voliteľne Q a Z obsahujú navyše spolu do 10 aminokyselín umiestnených vedľa polohy A¹ a/alebo A¹³.
7. Peptid podľa nárokov 1 až 6, všeobecného vzorca Q-A^{7 8 9 1}-A²-A³-Thr-LeuAla-Ser-Ser-Glu-Thr-A¹¹-A¹²-Gly-Z (vzorec III).
8. Peptid podľa nárokov 1 až 7, ktorý má 1 až 4 modifikácie.
9. Peptid podľa nároku 8, ktorý má 2 alebo 3 modifikácie.
10. Peptid podľa nároku 7, kde

A¹ znamená L-Arg, D-Arg, H₂N-C(=NH)NH-(CH₂)₄-C(O)-, H₂N-(CH₂)_n-C(O)-, kde n je

5 až 7, alebo -N[(CH₂)3-NH-C(=NH)-NH2]-CH₂-C(O)-;

A² znamená L-Ser alebo -N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-;

A³ znamená L-Phe, L-Phe(X), kde X znamená halogén, L-1-Nal, L-2-Nal, LSer(Bzl), L-Thi, L-Cha alebo L-Pal(3).
11. Peptid podľa nároku 9 alebo 10, všeobecného vzorca Q-Arg-A²-Phe-ThrLeu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A¹²-Gly-Z (vzorec IV).
12. Peptid vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje: desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2, desaminoargininyl-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH3-(OCH2CH₂)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-ValGly-NH₂, D-1-glucityl-Arg-SerrPhe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, CH₃O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, Ac-Arg-Ser-Phe-\j/-[CH₂NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-\|/-[CH₂NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-v|/-[CH₂NH]-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH₂, Ac-Arg-N[(CH₂)₂-OH]-CH₂-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-\p[CH₂NH]-Gly-NH₂, H-Arg-Ser-Phe(CI)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, H₂N-(CH₂)₆-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH, (A/-metyl-nikotinoyl)⁺-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH.
13. Peptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na použitie ako terapeutická látka.
14. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viacero peptidov podľa nárokov 1 až 12 a farmaceutický prijateľný nosič.
15. Použitie jedného alebo viacerých peptidov podľa nárokov 1 až 12 na výrobu farmaceutického prostriedku na indukciu špecifickej T-bunkovej tolerancie voči autoantigénu u pacientov trpiacich autoimunitnými poruchami, konkrétnejšie artritídou.
16. Diagnostický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viacero peptidov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 a detekčné činidlo.