CN1379786A - 用于免疫治疗的修饰肽和肽类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由H－Arg－Ser－Phe－Thr－Leu－Ala－Ser－Ser－Glu－Thr－Gly－Val－Gly－OH衍生的修饰的肽,其具有通式II:Q－A1－A2－A3－A4－A5－A6－A7－A8－A9－A10－A11－A12－A13－Z。在通式II中,A1至A13对应于通式I的氨基酸,Q对应于H,Z对应于OH。根据本发明的修饰选自以下a、b或c中的一个或多个:a)A1－A13中1－6个、优选地1－4个氨基酸被非天然氨基酸或β氨基酸取代;b)一个或多个酰胺键被还原的酰胺键或乙烯等排物取代;c)Q和/或Z处的取代,和任选地,d)总共可达6个修饰的天然氨基酸的取代。这些肽能用于在自身免疫病患者中诱导耐受。
Description
本发明涉及基于HC gp-39(263-275)的修饰的肽，包含这些肽的药用组合物，以及这些肽在诱导自身免疫病患者耐受中的用途。
根据受外来抗原(非自我抗原)和自身抗原(自我抗原，来自个体本身)的区别原则建立免疫***，这通过对自身抗原的内在耐受实现。
免疫***通过激活特异性细胞(如T和B淋巴细胞)并产生可溶性因子(如白介素、抗体和补体因子)保护个体免于外来抗原，并对接触外来抗原起反应。免疫***起反应的抗原被抗原递呈细胞(APCs)降解，抗原的片段在细胞表面表达，与主要组织相容性复合物(MHC)II类糖蛋白结合。MHC-糖蛋白-抗原-片段复合物被递呈给T细胞，依赖其T细胞受体识别与MHC II类蛋白结合的抗原片段。T细胞被激活，即，增殖和/或产生白介素，导致在遭受攻击下针对抗原的激活淋巴细胞的扩充(Grey等人，Sci.Am.，261：38-46，1989)。
自身抗原也被连续加工并作为抗原片段由MHC糖蛋白递呈给T细胞(Jardetsky等人，Nature 353：326-329，1991)。因此自我识别是免疫***所固有的。在正常环境下，免疫***耐受自身抗原，避免了这些自身抗原激活免疫应答。
当对自身抗原的耐受丧失时，免疫***对一种或多种自身抗原激活，导致自身反应性T细胞的激活和自身抗体的产生。这种现象被称为自身免疫。由于免疫应答一般是破坏性的，即，意味着破坏侵入的外来抗原，因此自身免疫反应能引起身体自身组织的破坏。
已经在几次研究中确定了T细胞对于自身免疫病的作用。对于小鼠，实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)由十分有限的一组T细胞介导，它们由于对与MHCII类分子复合的髓磷脂碱性蛋白(MBP)单表位的特异性连接。对于Lewis大鼠——对多种自身免疫病高度易感的一个物种，已经显示疾病由T细胞介导。对于人类，自身免疫病也被认为与自身侵入性T细胞的发育有关。
许多疾病(如类风湿性关节炎(RA))涉及破坏性自身免疫反应，其中由于存在大量激活的淋巴细胞和MHCII类表达细胞引起的慢性炎症过程破坏了关节软骨。软骨的存在对于保持局部炎症反应似乎是必需的：曾经提出，RA中软骨降解与软骨应答性自身反应性T细胞的活性有关(Sigall等人，Clin.Exp.Rheumat.6：59，1988；Glant等人，Biochem.Soc.Trans.18：796，1990；Burmester等人，Rheumatoid arthritis Smolen，Kalden，Maini(编)Springer-Verlag Berlin Heidelberg，1992)。而且，通过手术从RA患者中除去软骨可减少炎症过程(R.S.Laskin，J.Bone JointSurgery(Am)72：529，1990)。软骨蛋白因此被认为是能刺激T细胞的靶自身抗原。这些自身反应性T细胞的激活导致自身免疫病的发展。然而，在类风湿性关节炎发作中起作用的自身抗原成分的鉴定迄今仍不清楚。
导致软骨破坏的炎症反应能用几种药物(如类固醇药物)治疗。但是，这些药物通常是免疫抑制药，是非特异性的，并且具有毒副作用。非特异性免疫抑制的缺点使其成为十分不理想的治疗。
抗原特异的、无毒的免疫抑制治疗是非特异免疫抑制的一种十分有吸引力的代替。这种抗原特异的治疗包括用靶自身抗原或来自靶自身抗原的合成T细胞反应性肽治疗患者。这些合成肽对应于自身抗原的T细胞表位，能用来诱导对它们自身和对自身抗原的特异性T细胞耐受。免疫***的脱敏或免疫耐受基于长期观察到的一种现象，即，饲养或吸入一种抗原或表位的动物当通过全身(systemic)途径导入该抗原或表位时基本不能发展对该抗原或表位的***性免疫应答。
类风湿性关节炎是一种在HLA-DR4-阳性个体中常发生的自身免疫病。该疾病相关性可表明，DR4分子将自身抗原递呈给T细胞。该自身免疫病的靶标是关节软骨细胞存在一种可产生在基质中组织化产物的独特细胞型的关节。RA中见到的关节破坏被认为是由软骨特异的自身反应性T细胞介导的。软骨衍生的蛋白质——人软骨gp-39(HC gp-39)最近已被确定为RA中的一种候选自身抗原。HC gp-39蛋白的一种主要表位——包括263-275序列的肽——在RA患者中优先识别，表明该表位是类风湿性关节炎中自身免疫攻击的一个靶标。18名RA患者中的8名对该肽起反应，而在健康供体组中没有发现反应者(Verheijden等人，ArthtritisRheum.40：1115，1997)。因此，这些数据强烈提示，该肽或HC gp-39蛋白是关节中免疫识别的一个靶标。
HC gp-39在Balb/c小鼠中的致关节炎作用进一步证明了它对于关节炎的重要性。在胸区一次注射μg水平的与IFA混合的蛋白质可诱导RA的慢性关节炎症记忆。
通过在用HC gp-39免疫之后，由DRB1*0401-转基因小鼠产生一组DRB1*0401-限制的、肽特异的T-T杂交瘤，进一步检测了对HC gp-39肽263-275的反应。确定并比较了肽263-275特异的杂交瘤在DR4(DB1*0401)范围内的精确特异性。结果，鉴定出3种杂交瘤，它们在识别由DRB1*0401编码的分子递呈的263-275表位方面不同。(当用263-275序列内的N-端和C-端截短肽刺激不同杂交瘤时，所用的3种杂交瘤之间表位识别的差异变得明显)。发现5G11杂交瘤对265-275序列有最佳反应。相反，8B12杂交瘤的识别以264-274序列为中心，而14G11杂交瘤对264-275有最佳反应性。
HC gp-39(263-275)-反应性T细胞的耐受对于RA患者可能是有利的。本发明提供基于HC gp-39(263-275)序列的修饰的肽衍生物，它们在诱导免疫应答的能力和致耐受能力上出色。
惊奇地发现，基于HC gp-39(263-275)的特异性肽修饰对于一组HCgp-39(263-275)肽特异的T细胞杂交瘤是对抗性的，并且在刺激(在用包括263-275表位序列的肽刺激后产生的)两种人T细胞克隆方面优越。而且，这些修饰的肽显示优秀的体内致耐受能力。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种修饰的肽，其来自H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(通式I；SEQ ID NO：1)，具有通式Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z(通式II)。在通式II中，A1到A13对应于通式I的氨基酸，Q对应于H，Z对应于OH。根据本发明的修饰选自：
a)A1-A13中1-6个、优选地1-4个氨基酸被非天然氨基酸或β氨基酸替换，
b)一个或多个酰胺键被还原的酰胺键或乙烯等排物取代，
c)Q和/或Z处的取代。
选自其中一个或多个的修饰的数量可达1-6个。另外，氨基酸也可被其它天然氨基酸替换，只要修饰总数不超过6。
C-端和/或N-端修饰可稳定基于通式I的修饰的肽(HC gp-39(263-275))，这将减少外肽酶催化的水解。这些修饰可包括N端酰化(例如，乙酰化＝Ac-肽)、C端酰胺引入(例如肽-NH2)、乙酰化与酰胺引入的组合(例如Ac-肽-NH2)和，例如，D-氨基酸而不是L-氨基酸的引入。其它修饰集中于内肽酶防止水解。
表1.肽键
这些修饰的例子有D-氨基酸而不是L-氨基酸的引入、修饰的氨基酸、肽内环化、修饰肽键(如还原肽键ψ[CH2NH])和类肽(N-烷基化甘氨酸衍生物)的引入。
其它肽类似物可与通式I或通式II的肽有关，而不是常规的-NH-C(O)-肽键，可以用表1所示的键或其任意组合代替各种-NH-C(O)-键。如果去除N端氨基酸(例如，通式II中A1＝脱氨基精氨酸)，通式II中的Q对应于无原子。
根据本发明的优选的肽是如下的肽，其中Q是H、(C1-6)烷基、甲酰基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)链烯氧基羰基、(C6-14)芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，则不含Q；
Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基，(C2-6)链烯基、(C6-14)芳基(C1-4)烷基、(C6-14)(C4-13)杂芳基(C1-6)烷基，或NR1R2，其中R1和R2分别选自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基；
和任选地，Q和Z还含有紧邻位置A1和/或A13的总共可达10个氨基酸。优选地在不超过4个、更优选地不超过2个位置处进行一个或多个其它天然氨基酸对A1-A3的替换。
在根据本发明的肽中，通式II的下列替换是优选的：
Q是H、(C1-6)烷基、甲酰基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)链烯氧基羰基、(C6-14)芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)，HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，则不含Q。更优选的是以下替换，其中Q为H、(C1-6)烷基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1为H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，则不含Q。更优选的是如下的肽，其中Q是H、甲基；乙酰基；羧基亚甲基、甲氧基羰基；CH3(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-、D-1-葡糖基、1-甲基-吡啶鎓-3-羰基或1-甲基-吡啶鎓-4-羰基，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-则不含Q。
A1是L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lys、L-Ala、D-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(R)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)。优选地A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)。更优选地，A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-。
A2是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)。优选地，A2是L-Ser、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)。更优选地，A2是L-Ser、L-Ala或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-。
A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)、D-Phe(X)，其中X分别选自(C1-4)烷基、羟基、卤素、(C1-6)烷基羰基氨基、氨基或硝基、L-Hfe、D-Hfe、L-Thi、D-Thi、L-Cha、D-Cha、L-Pal(3)、D-Pal(3)、L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal、D-2-Nal、L-Ser(Bzl)、D-Ser(Bzl)、(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}中的一种或多种。优选地，A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)或D-Phe(X)(其中X是卤素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha、L-Pal(3)、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}。更优选地，A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)(其中X是卤素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha，L-Pal(3)、L-1-Nal，L-2-Nal或L-Ser(Bzl)。
A4是L-Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly。优选地，A4是L-Thr或L-Ala。
A5是L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、L-Val、D-Val-、L-Nva、D-Nva、L-Ala、D-Ala、Gly、(R)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}。优选地，A5是L-Leu、L-Ala或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}。
A6是L-Ala、D-Ala或Gly。优选地，A6是L-Ala或Gly。
A7是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly。优选地，A7是L-Ser或L-Ala。
A8是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly。优选地，A8是L-Ser或L-Ala。
A9是L-Glu、D-Glu、L-Asp、D-Asp、L-Ala、D-Ala或Gly。优选地，A9是L-Glu或L-Ala。
A10是L-Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly。优选地，A10是L-Thr或L-Ala。
A11是Gly、L-Ala、D-Ala或-NH-CH2-CH2-。优选地，A11是Gly、L-Ala或-NH-CH2-CH2-。
A12是L-Val、D-Val、L-Nva、D-Nva、L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、(R)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(RR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(RS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(SR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-或(SS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}。优选地，A12是L-Val或(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}。
A13是Gly、L-Ala或D-Ala。优选地，A13是Gly或L-Ala。
此外，在根据本发明的肽中，Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基、(C2-6)链烯基、(C6-14)芳基(C1-4)烷基、(C4-13)杂芳基(C1-6)烷基或NR1R2，其中R1和R2分别选自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基。优选地，Z是OR，其中R是H或NR1R2，其中R1和R2分别选自H或(C1-6)烷基。更优选地，Z是OH、NH2或NHEt。
根据本发明的肽任选地可在N端和C端(即，紧接A1和/或A13)延伸几个氨基酸。优选地，它们可延伸达10个氨基酸。因此，Q和Z可另外含有紧接位置A1和/或A13的总共可达10个氨基酸。
这些肽可在几个位置上不同于通式I，但优选地，它们在1-4位，更优选地在2-3位修饰。
在此使用时，术语(C1-6)烷基是指含有1-6个碳原子的分支或不分支的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基和己基。最优选的是含有1-4个碳原子的烷基。
术语(C1-4)烷基是指含有1-4个碳原子的分支或不分支的烷基。
术语(C2-6)链烯基是指含有2-6个碳原子的分支或不分支的链烯基，如乙烯基、2-丁烯基等。(C1-4)链烯基是优选的，(C1-3)链烯基是最优选的。
术语(C1-6)烷基羰基是指与一个羰基连接的、含有1-6个碳原子的分支或不分支的烷基，例如乙酰基。最优选的是含有1-4个碳原子的烷基。
术语羧基-(C1-6)烷基是指与含有1-6个碳原子的分支或不分支烷基连接的羧基。最优选的是含有1-4个碳原子的烷基。
术语(C1-6)烷氧基羰基是指与一个氧基羰基连接的分支或不分支的烷基，例如甲氧基羰基-或叔丁氧基羰基-(Boc-)。最优选的是含有1-4个碳原子的烷基。
术语(C2-6)链烯氧基羰基是指与一个氧基羰基连接的如前所述含有2-6个碳原子的分支或不分支的链烯基，例如烯丙氧基羰基。(C1-4)链烯基是优选的，(C1-3)链烯基是最优选的。
术语(C1-6)(二)烷基氨基是指含有1-6个碳原子的二烷基氨基，其烷基部分具有前述相同的含义。优选的是含有1-4个碳原子的烷基。
术语氨基(C1-6)酰基是指用氨基功能化的含有1-6个碳原子的酰基。优选的是含有1-4个碳原子的酰基。
术语(C6-14)芳基是指含有6-14个碳原子的芳烃基，如苯基、萘基、四氢萘基、茚基、蒽基，它们任选地可在邻位和/或间位被一个或多个取代基取代，这些取代基例如但不限于：羟基、卤素、硝基、氰基、氨基((C1-6)酰基)或(二)(C1-6)烷基氨基，酰基和烷基部分具有前述相同的含义。(C6-10)芳基是优选的，苯基是最优选的。
术语(C4-13)杂芳基(C1-6)烷基是指与含有1-6个碳原子的分支或不分支烷基连接的、含有4-13个(优选地4-9个)碳原子的取代或未取代的芳基，至少含有一个选自N、O和/或S的杂原子。杂芳基上的取代基可选自对于芳基列出的取代基。含氮杂芳基可通过碳原子或氮原子与烷基连接。对于烷基，含有1-4个碳原子的烷基是优选的。
术语(C1-6)烷基(C6-14)芳基是指与前述芳基连接的如前所述的分支或不分支的烷基。(C6-10)芳基是优选的，苯基是最优选的。对于烷基，含有1-4个碳原子的烷基是优选的。
术语(C6-14)芳基(C1-6)烷基是指一种芳基烷基，其中烷基是(C1-6)烷基，芳基是如前所述的(C6-14)芳基，例如苄基-(Bzl)或三苯甲基(Trt)。(C6-10)芳基是优选的，苯基是最优选的。对于烷基，含有1-4个碳原子的烷基是优选的。
术语(C1-6)烷基羰基氨基是指一种烷基羰基氨基，其烷基含有1-6个碳原子，具有与前述相同的含义。含有1-4个碳原子的烷基是优选的。
术语(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基是指与烷氧基羰基连接的(C6-14)芳基，其中的烷基是(C1-4)烷基，芳基如前所述，例如是苄氧基羰基-(Z)或芴基甲氧基羰基(Fmoc)。(C6-10)芳基是优选的，苯基是最优选的。
术语卤素是指F、Cl、Br或I。
天然存在的氨基酸用如下缩写(三字母编码)表示：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。对于所有氨基酸，立体化学定义为L-。
非天然氨基酸是任选地Nα-取代的α-氨基酸，其具有不同于天然氨基酸的化学结构。非天然氨基酸如Phe(X)(X是位于Phe的苯环对位的取代基)、hSer(2-氨基-4-羟丁酸)、正亮氨酸(Nle，2-氨基己酸)、正缬氨酸(NVa，2-氨基戊酸)、L-Hfe(L-α-高苯丙氨酸)，D-Hfe(D-α-高苯丙氨酸)、L-Thi(β-噻嗯基-L-丙氨酸)、D-Thi(β-噻嗯基-D-丙氨酸)、L-Cha(β-环己基-L-丙氨酸)、D-Cha(β-环己基-D-丙氨酸)、L-Pal(3)(β-3-吡啶基-L-丙氨酸)、D-Pal(3)(β-3-吡啶基-D-丙氨酸)、L-1-Nal(β-1-萘基-L-丙氨酸)、D-1-Nal(β-1-萘基-D-丙氨酸)、L-2-Nal(β-2-萘基-L-丙氨酸)、D-2-Nal(β-2-萘基-D-丙氨酸)、L-Ser(Bzl)(O-苄基-L-丝氨酸)、D-Ser(Bzl)(O-苄基-D-丝氨酸)和N-烷基甘氨酸衍生物，如NVal(N-异丙基甘氨酸)、NArg(N-(3-胍基丙基)甘氨酸)和NhSer(N-(2-羟乙基)甘氨酸)。这组氨基酸中也包括立体化学被定义为D-的天然存在的氨基酸。
应当理解，在掺入还原酰胺键的肽中，氨基酸的最初的羰基被替换为亚甲基。在掺入乙烯基等排物的肽中，最初的氨甲酰功能基(-C(O)-NR-)被替换为乙烯基(-CH＝CR-)。
术语序列中两个氨基酸残基之间的ψ[CH2NH]是指这些氨基酸残基之间的最初的酰胺键(-C(O)-NH-)被替换为还原酰胺键(-CH2NH-)。
通式I中所指的几个氨基酸优选地位于通式2的相应位置。因此，本发明的一个优选实施方案是具有通式Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z(通式III)的修饰肽，其中Q、A1、A2、A3、A11、A12和Z如前所述。通式III中最优选的取代是将A1取代为L-Arg、D-Arg、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)，或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-，将A2取代为L-Ser或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-，将A3取代为L-Phe、L-Phe(X)，其中X是卤素、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)、L-Thi、L-Cha或L-Pal(3)。
更优选的是根据通式III的肽，其中A1是Arg，A3是Phe，A11是Gly，产生通式IV：Q-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z，其中位置Q、A2、A12和Z如前所述。
最优选的肽选自：脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3-(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-ψ-[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ-[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、H-Arg-Ser-Phe(Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、(N-甲基-烟酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH。
合成N端修饰的修饰HC gp39(263-275)肽(如通式V所示)的合适的方法由通式VI的衍生物开始。修饰的肽通过常用的固相肽合成(SPPS)法合成(B.Merrifield，“固相肽合成”，《肽》1995，93-169，编者：B.Gutte，Academic，San Diego，California，USA；P.Lloyd-Williams，F.Albericio，E.Giralt，Tetrahedron 49：11065-11133，1993)。根据使用的接头的类型，肽链通过酯键(PAC接头)或酰胺键(PAL接头)与载体连接。
在使用偶联剂如HATU(L.Carpino，A.El-Faham，C.A.Minor，F.Albericio，J.CHem.Soc.，CHem.Comm.201-203，1994)或PyBOP(J.Coste，D.Le-Nguyen，B.Castro，Tetrahedron Lett.31：205-208，1990)和DiPEA将Fmoc-C端氨基酸鎓定于固体载体上后(m＝1，A-B＝Fmoc)，通过用适当保护的Fmoc-氨基酸衍生物连续酰化，随后用自动肽合成仪哌啶介导地去除Fmoc保护基(A-B＝H)，使链延长(m＝2-12)。此外，也可使用五氟苯基(Pfp)氨基酸活性酯(A.Dryland，R.C.Sheppard，Tetrahedron 44：859-876，1988)实现缩合。随后，用相同方法加入N端氨基酸B，去除Fmoc-基团。然后使这样获得的13-meric肽衍生物(A＝H，B＝N端氨基酸，m＝12)适于N端功能化。在N端加入另一个酰胺键(A＝烷基羰基)可如下实现：与希望的酸(X-OH)进行另一次HATU或PyBOP-介导的缩合，或在吡啶存在下与一种酰氯(X-Cl)偶联。带电荷的1-甲基吡啶鎓-4-羰基单位或1-甲基吡啶鎓-3-羰基单位可在从树脂上切下(见下文)后加入，(即通式V，A＝H，B＝N端氨基酸，Z＝OR，R＝H、烷基，或Z＝NR1R2，R1、R2＝H或烷基)，方法是完全去保护的肽的游离N端与N-甲基(异)烟酰羟基琥珀酰亚胺活性酯(M.L.Tedjamulia，P.C.Srivastava，F.F.Knapp，J.Med.CHem.，28：1574-1580，1985)在水介质中的DiPEA-介导的反应(比较通式V中A＝H向A＝N-甲基(异)烟酰的转化)。
N-烷化可通过还原性胺化实现，方法是在溶于DMF/HOAc(99/1，v/v)的NaBH(OAc)3的存在下，用合适的醛处理固定的肽(通式VI，A＝H转换为A＝烷基)。此外，在DiPEA存在下固定的肽(A＝H)与烷基卤的反应也可产生N-烷基化的肽(例如，与叔丁基溴乙酸反应)。游离NH2(通式VI中的A＝H)也可用氨甲酰基(例如甲氧羰基)通过与相应氨甲酰氯在CH2Cl2/DiPEA中反应功能化(通式VI中A＝H转化为A＝烷氧羰基)。在从固体载体上切下肽，同时用TFA/Et3SiH/茴香醚/ROH(R＝H、烷基)除去酸不稳定性的保护基后，通式V的肽(Z＝OR)通过RP-HPLC纯化。此外，在从树脂上切割期间，C端可具有酰胺功能(Z＝NR1R2，R1和R2＝H或烷基)。此时，在肽链(通式VI)与PEG-PS固体载体之间使用不同的接头(PAL：B.Merrifield，Peptides，93-169，1995)。如果PAL接头的游离氨基在与第一个(C端)氨基酸附着之前烷化，将在从聚合物载体上切下之后形成C端烷基酰胺。
利用相同的Fmoc-SPPS策略，可以获得含有非天然的但可购得的氨基酸(例如D-氨基酸或取代的苯丙氨酸衍生物)的肽。除此之外，N-烷基甘氨酸衍生物(类肽单体，通式V和VI中的Rn 1＝氨基酸侧链，Rn 2＝H)用文献报道的方法(J.A.Kruijtzer，L.J.F.Hofmeyer，W.Heerma，C.Versluis，R.M.J.Liskamp，Chem.Eur.J.4：1570-1580，1998)首先在溶液中合成。在SPPS之前，也按照已知的方法(H.M.M.Bastiaans，A.E.Alewijnse，J.L.van der Baan，H.C.J.Ottenheijm，Tetrahedron Lett.35：7659-7660，1994)在溶液中制备修饰的N-端氨基酸β-高-L-精氨酸[B＝NH-CH(CH2CH2CH2NH-CH(＝NH)NH2)-CH2-C(O)]。在用Fmoc保护基保护这样获得的单体氨基酸中的游离NH2基后，能用SPPS方法将化合物掺入到延伸的肽中(通式VI)。
最后一类修饰的肽包括含有一种或多种还原酰胺键的肽(通式V中的Rn 3＝H2)。这些衍生物可通过改良SPPS法得到(J.J.Wen，A.R.Spatola，J.Pept.Res.，49：3-14，1997)，在该方法中，延伸的链的游离N-端氨基酸(通式VI中的1＜m＜12)在还原条件下(NaBH3CN，DMF/HOAc，99/1，v/v)用加入的氨基酸醛烷化。需要的N-Fmoc保护的氨基酸醛可以购得，或者可用文献报道的方法获得(J.J.Wen，C.M.Crews，Tetrahedron：Asymmetry9：1855-1858，1998)。这样延伸的链(A-B＝Fmoc，Rn 1＝H，Rn 2＝氨基酸侧链，Rn 3＝H2)含有仲氨基功能基(Rn+1 1＝H)，随后用Boc基团保护。在除去Fmoc保护基团后，可用SPPS方法进一步延长肽链。
此外，也可在SPPS之前在溶液中合成具有通式VII的二聚体结构。然后用Fmoc保护的氨基酸醛(Fmoc-NH-CH(Rn 2)-C(O)H)还原性烷化(NaBH3CN，DMF/HOAc，99/1，v/v)合适的氨基酸苄酯(H2N-CH(Rn+1 2)-CO2Bzl)，产生二聚仲胺。在用Boc基团(Rn+1 1＝Boc)保护氨基功能，随后氢解苄酯后，形成具有通式VII的化合物，它可用SPPS方法掺入到延伸的链中。
根据本发明的肽能用作治疗物。更具体而言，它们能用于在自身免疫病(特别是关节炎)患者中诱导对自身抗原的特异性T细胞耐受。
基于MHC II类限制的T细胞表位结构、具有增强的体外刺激活性和增强的体内活性的修饰肽可以用周知的技术选择。
为了保持特定T细胞表位的竞争性质，不过多地干扰参与结合相关MHC分子的残基，也不过多地影响参与相关T细胞TCR契合的残基被认为是重要的。因此，竞争性修饰肽的选择将包括：
1)确定修饰肽结合相关MHC分子的亲和力，并与野生型、未修饰的肽表位的亲和力相比较
2)用体外试验(照射的抗原递呈细胞与肽抗原和特异性T细胞共温育)确定修饰肽的刺激活性，并与野生型、未修饰的肽活性相比较。优选地，应当评价大量具有不同TCR纯系(clonotype)型、但可与相同MHC II类分子中的相同表位反应的表位特异性、MHC II类限制性T细胞。为此可使用一系列特异性T细胞杂交瘤或特异性T细胞系/克隆。人用修饰表位的选择优选地需要使用人T细胞系/克隆保护选择的修饰表位对于人T细胞识别的相关性。
3)确定修饰肽的体内活性(任选地)。为此可使用不同的实验安排。
a)迟发性超敏反应试验
b)体内施用抗原(含或不含佐剂)后，离体的T细胞激活测定
c)通过施用修饰的肽抗原对自身免疫病实验模型中疾病的调节
优选地，将选择与野生型肽相比具有增强的体外竞争活性或具有增强的体内作用的化合物。
在小鼠中可被识别的各种HC gp-39衍生的肽预期将在鼻处理后下调对这些肽的反应性。测定这种反应性的方法包括用所述肽攻击动物，定量DTH反应引起的爪肿胀。Balb/c小鼠的肽免疫产生对HC gp-39肽263-275的免疫应答。因此，为了检测DTH反应，能用HC gp-39 263-275攻击HC gp-39免疫的小鼠。为了描述修饰的肽的体内致耐受性，可以每个鼻孔用不同浓度的HC gp-39 263-275或肽衍生物处理小鼠。在耐受诱导方面具有较好分布图的修饰的肽衍生物预计在比最初肽更低的浓度时在体内测定中有活性。为了能定量检测用天然肽相比修饰肽衍生物诱导耐受的作用，可测试不同施用方案和剂量。最后，可以在该模型中研究HC gp-39 263-275的修饰形式在下调HC gp-39 263-275诱导的DTH反应方面是否比天然263-275肽更有效。
施用高剂量或低剂量的耐受原或根据本发明的肽可实现耐受。耐受原或肽的量取决于施用途径、施用时间、患者年龄以及总体健康状况和饮食。
通常可使用每kg体重0.01-1000μg肽或蛋白质、优选地0.05-500μg、更优选地0.1-100μg肽或蛋白质的剂量。
本发明的另一方面在于含有一种或多种根据本发明的肽和一种药学可接受的载体的药用组合物。
药学可接受的载体为本领域技术人员所周知，包括，例如：无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、糊精、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。其它载体可以是，例如(如果希望包埋于脂质体中时)MHC II类分子。
另外，根据本发明的药用组合物也可含有一种或多种佐剂。合适的佐剂包括：氢氧化铝、磷酸铝、amphigen、生育酚、单苯膦基脂类A、胞壁酰二肽和皂甙如Quill A。佐剂的量取决于佐剂本身的性质。
此外，根据本发明的药用组合物也可含有一种或多种稳定剂，如碳水化合物，包括山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精和葡萄糖；蛋白质，如白蛋白或酪蛋白；缓冲液，如碱性磷酸盐。
合适的施用途径有肌内注射、皮下注射、静脉内注射或腹膜内注射、口服和鼻内施用。口报和鼻内施用是优选的施用途径。特别是，经粘膜(如鼻粘膜)施加抗原可产生抗原特异的调节细胞。粘膜施用抗原已显示可诱导对该抗原的免疫耐受。
根据本发明的肽也极适合于在诊断方法中使用，用以检测参与关节软骨慢性炎症的活化自身反应性T细胞的存在。
根据本发明的诊断方法包括下列步骤：
a)从个体的血样中分离外周血单核细胞(PBMC)，
b)在合适的条件下培养该PBMC，
c)在根据本发明的自身抗原或其衍生的一种或多种肽存在下，温育该PBMC培养物，和
d)检测T细胞反应，例如增殖反应，表明在个体中存在激活的自身反应性T细胞。
在通过测定自身反应性T细胞的增殖反应检测应答时，用放射性同位素(如3H-胸苷)的掺入测量增殖。PBMC中存在的自身反应性T细胞的应答也能通过用细胞因子特异的ELISA测定细胞因子释放或用51铬释放测定细胞毒性来检测。另一种检测方法是通过FACS分析测定激活标记物(如Il-2R)的表达。因此含有一种或多种根据本发明的肽和合适的检测剂的诊断组合物构成了本发明的一部分。根据检测类型，检测剂可以是放射性同位素、酶或细胞表面特异的抗体或激活标记物。
本发明的范围内也包括含有一种或多种根据本发明的肽的检测试剂盒。这些检测试剂盒适用于根据本发明的诊断方法。
因此，根据本发明，HC gp-39衍生的修饰肽能用来下调自身免疫病。
下列实施例是为了说明本发明，绝不应视为限制本发明的范围。
图例
图1
用照射的自体PBMC作为APC，在用先导肽或选择的修饰肽刺激后克隆235的增殖如实施例15所述测定。检测这些肽在0、0.4、2、10和50μg/ml浓度时的刺激活性。显示了用先导肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(实心圆形)、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(实心正方形)、Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(空心圆形)或Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(空心正方形)刺激后235克隆的应答。
表2
杂交瘤测定(第一组试验)：+＝化合物以相当于或优于未修饰的263-275肽的方式刺激所有3种杂交瘤。+*＝1种或2种杂交瘤但不是所有3种杂交瘤所证明的激动剂活性。人克隆的反应性(克隆235和243的增殖)的效价(类似物的刺激活性/先导肽的刺激活性；例如HC gp-39(263-275))。-＝效价＜0.6，+＝效价0.6-12，++＝效价＞12-100，+++＝效价＞100。检测了Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3(OCH2CH2)3-OCH2C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH结合HLA-DRB1*0401的亲和力，并与先导肽(H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH)的亲和力进行了比较。最具活性的化合物(Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2)显示与HLA-DRB1*0401结合的相对亲和力相当于最初的肽的亲和力。
实施例
实施例1
H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(1)
Millipore 9050 PepSynthesizer的反应容器加有在N-甲基-吡咯烷酮(NMP)中预溶胀的0.5g Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS(可从PerSeptiveBiosystems购得，0.20mmol/g)树脂。用哌啶/DMF(1∶4v/v)在每一偶联循环中去除Fmoc基团。通过光谱分析每次延伸步骤后的Fmoc-切割测定偶联效率。在每个偶联步骤中使用合适的酸不稳定的侧链保护Fmoc氨基酸的4个相当物。使用合成仪的双注射器模型，其中一个注射器含有0.50MHATU的DMF溶液，另一个注射器含有1.0MDIPEA的DMF溶液。主要洗涤液含有N-甲基-吡咯烷酮与0.1％HOBt。使用类似物合成方案。在除去最后的Fmoc基团后，从反应容器中取出含有固定肽的树脂，并用DMF(20mL)、CH2Cl2(20mL)、二***(20mL)、CH2Cl2(20mL)、二***(20mL)、CH2Cl2(20mL)和二***(20mL)顺序洗涤。固定的肽真空干燥过夜。然后用10mL混合物TFA(iPr)3SiH/茴香醚/H2O 88/5/5/2v/v/v/v切割肽3小时。在这一步骤中，也去除所有酸不稳定的侧链保护基。溶剂蒸发后，肽用200mL***沉淀。倾析***层，肽用额外量(2×200mL)的醚洗涤。粗肽然后用氮流干燥，并冻干。肽的纯化用PrepPak柱40-100mm Delta-PaKTMC1815μm100A反相柱通过HPLC层析进行。流动相由20％磷酸缓冲液pH2.1和乙腈梯度和水的混合物组成，如以下分析所示。肽用4‰乙酸水溶液通过HPLC脱盐。冻干纯化的产物。
流动相：A：0.5 moL/L NaH2PO4+H3PO4，pH＝2.1
B：H2O
C：CH3CN/H2O＝3/2(v/v)
梯度：A：20％；B：80％→20％；C：0％→60％40分钟。
产量：68mg；HPLC纯度：90.1％；MS：MW＝1346，这与分子式C55H89ClN16O21一致；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：74.8％；离子层析：磷酸盐：0.6％，乙酸盐：0.6％，氯化物：3.4％(w/w)。
实施例2
H2N-(CH2)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(2)
肽用固相肽化学合成，如同化合物1的合成中报道的(见上)。在这种情况中，使用可购得的Fmoc-氨基酸五氟苯基(Pfp)活性酯代替游离Fmoc-氨基酸和HATU/DIPEA。用由6-氨基-己酸获得的6-Fmoc-氨基-己酸作为N端氨基酸制备化合物，类似于文献报道的方法(A.Marston，E.Hecker，Z.Naturforsch.B Anorg.Chem.Org.Chem.，38：1015-1021，1983)。载体是Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS(0.75g，0.170mmol/g)，使用合适的Pfp酯的3种相当物。为了偶联6-Fmoc-氨基-己酸，用PyBOP作为偶联剂(199mg)。标准方法(实施例1)中报道的操作产生168mg粗产物。通过HPLC纯化(磷酸盐***pH＝2.1，CH3CN-H2O梯度)。产物用5‰乙酸水溶液通过HPLC脱盐，冻干，得到34mg需要的肽。
HPLC纯度：99.6％；MS：MW＝1268，这与分子式C55H89N13O21一致；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：67.3％；离子层析：磷酸盐：10％(w/w)。
实施例3
H2N-(CH2)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(3)
肽3以与N端同系物2相同的方法制备，使用7-Fmoc-氨基-庚酸(3a，类似于化合物2a制备的：A.Marston，E.Hecker，Z.Naturforsch.BAnorg.Chem.Org.Chem.，38：1015-1021，1983)作为N端氨基酸。载体是Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS(1.0g，0.17mmol/g)。如标准方法(实施例1)中报道的操作、HPLC纯化和脱盐产生45mg需要的肽。
HPLC纯度：95.0％；MS：MW＝1282，这与分子式C56H91N13O21一致；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：87.4％；离子层析：乙酸盐：0.2％(w/w)。
实施例4
(N-甲基-烟酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(4)
在制备肽4之前，用文献报道的方法(M.L.Tedjamulia，P.C.Srivastava，F.F.Knapp；J.Med.Chem.28：1574-1580，1985)合成原材料N-琥珀酰亚胺(1-甲基-3-吡啶并)碘甲酸(4a)。化合物4的合成在溶液中进行。通过实施例1的SPPS法制备的肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(4b，26mg，0.02mmol)在DMF/H2O(1/99v/v，10mL)中溶解，加入DIPEA/DMF(1/1，v/v)使pH＝9。然后分两部分加入N-琥珀酰亚胺(1-甲基-3-吡啶并)碘甲酸(4a，0.056g.0.15mmol)。加入几滴DIPEA/DMF(1/1，v/v)使pH保持在pH＝9。混合物在室温下搅拌4个小时，然后用10mL H2O和5mL磷酸缓冲液pH＝2.1稀释。立即用如前所述(实施例1)的磷酸盐缓冲液***经HPLC纯化产物。用5‰乙酸溶液脱盐和冻干产生14mg需要的肽4。
HPLC纯度：98.1％；MS：MW＝1430；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：56.3％；离子层析：氯化物：1.4％，磷酸盐：1.0％，三氟乙酸盐：0.8％，乙酸盐：0.3％(w/w)。
实施例5
脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(5)
肽5按照以上对于化合物1所述的方法合成，使用Fmoc-保护的氨基酸、HATU、DIPEA和1.0g Fmoc-Gly-PAC-PEG-PS-树脂，载体负载0.17mmol/g。在最后一个步骤中，脱氨基-Arg(Adoc)2-OH(5a)与固定的肽链偶联。按照已知的方法制备羧酸5a(R.Presentini，G.Antoni，Int.J.Pept.Protein Res.，27：123-126，1986)。操作和纯化条件与肽1相同。
产量：58mg；HPLC纯度：91.1％；MS：MW＝1296；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：76.2％；离子层析：磷酸盐：0.4％，三氟乙酸盐：0.6％，乙酸盐：0.2％(w/w)。
实施例6
脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(6)
肽6的装配以类似于前述肽5的方式进行，使用PAL-PEG-PS树脂(0.17mmol/g)代替PAC-PEG-PS作为固体载体。在这种情况中，从可购得的(PerSeptive Biosystems)Fmoc-PAL-PEG-PS树脂上除去Fmoc基团，得到的H-PAL-PEG-PS载体与Fmoc-Gly-OH在HATU/DIPEA的介导下缩合。在与实施例1所述相同的条件下延长肽链并随后从树脂上切下后，获得需要的氨甲酰C端。操作和纯化条件与肽1相同。
产量：43 mg；HPLC纯度：91.3％；MS：MW＝1295；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：76.5％；离子层析：氯化物：0.5％，乙酸盐：4.0％(w/w)。
实施例7
CH3(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(7)
为了合成肽7，首先按照文献报道的方法(A.H.Haines，P.Karntiang，Carbohydr.Res.，78：205-211，1980)制备原材料CH3(OCH2CH2)3-OCH2-CO2H(7a)。保护的和固定的肽H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(7b)的合成如实施例2所示用氨基酸Pfp酯进行。树脂上的肽(7b)在NMP中预溶胀，加入142mg(0.64mmol)CH3(OCH2CH2)3-OCH2CO2H(7a)，以及169mg(0.64mmol)偶联剂TFFH(四甲基氟-甲酰氨鎓(formamidinium)六氟磷酸盐)。合并的试剂在de Pepsynthesizer中循环60分钟。从树脂上的切割和操作如实施例5所述进行。粗肽然后用实施例1所述的***和溶剂通过HPLC纯化。产物用2.5‰AcOH在HPLC柱上脱盐。
产量：120mg；HPLC纯度：78％；MS：MW＝1515；离子层析：氯化物：0.1％，磷酸盐：0.3％，三氟乙酸盐：4.0％，乙酸盐：0.3％(w/w)。
实施例8
D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(8)
在装配N端修饰的肽8之前，根据实施例1制备肽H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS(8a)，其具有与肽7b相同的序列，但接头类型不同(PAC代替PAL)。用NaBH(Oac)3(212mg，1.0mmol)作为还原剂，通过用固定的溶于DMF/HOAc(99/1，v/v，10mL)的肽8a(500mg，0.2mmol/g)过夜处理6-O-三苯甲基-α/β-D-吡喃葡萄糖(8b，422mg，1.0mmol，T.Utamura，K.Kuromatsu，K.Suwa，K.Koizumi，T.Shingu，Tetsuro；Chem.Pharm.Bull.34：2341-2353，1986)，实现还原性胺化。然后利用实施例1所述的条件，从树脂上切下产生的完全保护的衍生物(6-O-三苯甲基-D-1-葡糖基)-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS，同时除去三苯甲基和所有的氨基酸保护的基团，在通过制备HPLC纯化并用5‰ HOAc水溶液脱盐后得到38mg靶肽8。
HPLC纯度：84.7％；MS：MW＝1475；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：61.0％；离子层析：氯化物：0.1％，乙酸盐：1.7％(w/w)。
实施例9
MeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(9)
通过将固定的肽H-Arg(Pmc)-Ser(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAC-PEG-PS (8a)悬浮在二噁烷中，并冷却到0℃，开始肽9的合成。向该悬液中加入100μl 4N NaOH水溶液和100μl氯甲酸甲酯。反应混合物搅拌16小时，随后用EtOH/H2O、EtOH、CH2Cl2和***洗涤树脂。真空干燥后，从树脂上切下产物，如以前肽合成(实施例1)所述纯化。最后，肽用5‰乙酸水溶液经HPLC脱盐，然后冻干，得到肽9。
产量：11mg；HPLC纯度：96.8％；MS：MW＝1368；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：60.5％；离子层析：氯化物：2.0％，磷酸盐：0.2％，乙酸盐：0.4％(w/w)。
实施例10
Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(10)
在合成肽10之前，用已知的方法(J.-P.Meyer，P.Davis，K.B.Lee，F.Porreca，H.I.Yamamura，V.Hruby，J.Med.Chem.38：3462-3468，1995)制备需要的氨基酸醛构件Fmoc-Leu-H(10a)。使用没有进一步纯化的化合物10a。根据实施例1所述的方法，树脂用一个8-氨基酸肽链功能化，产生H-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(10b)。固定的衍生物(1g，0.2mmol/g)在5mL1％乙酸DMF溶液中悬浮。制备两种溶液：148mg Fmoc-Leu-H(10a)在2.5mL DMF中的溶液和30mg NaCNBH3在2.5mL DMF中的溶液。合并这两种溶液，加入肽10b的悬液中。混合物在室温下搅拌过夜。随后，用Boc2O和吡啶保护这样获得的中间物Fmoc-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(10c)的新引入的仲胺功能基。将树脂结合的肽10c在10mL干CH2Cl2中悬浮，加入35mg(0.16mmol)Boc2O和13μl(0.16mmol)吡啶。pH保持在pH＝8，吡啶和混合物搅拌过夜。操作包括用CH2Cl2、EtOH、CH2Cl2、醚洗涤树脂并真空干燥。用Fmoc氨基酸和以NMP作为溶剂的HATU/DIPEA方法(实施例1)通过SPPS继续合成。最后一步包括与4-硝基苯乙酸偶联，引入N端乙酰基。在如实施例1所述的操作后，经HPLC纯化粗肽，用5‰乙酸脱盐，冻干，得到靶肽10。
产量：28mg；HPLC纯度：76.3％；MS：MW＝1339；离子层析：三氟乙酸盐：1.2％，乙酸盐：2.0％(w/w)。
实施例11
Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(11)
肽11的合成包括Fmoc-Phe-H(11a，J.-P.Meyer，P.Davis，K.B.Lee，F.Porreca，H.I.Yamamura，V.Hruby，J.Med.Chem.，38：3462-3468，1995)与通过实施例1所述SPPS方法获得的树脂结合的保护肽H-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS(11b)还原性偶联。肽11b(1.0g，0.2mmol/g)和醛11a(200mg)在5mL1％乙酸/DMF中悬浮，立即加入溶于5mL DMF中的30mg(0.48mmol)NaCNBH3。搅拌混合物16小时，导致Fmoc-Phe-ψ[CH2NH]-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-PAL-PEG-PS的形成。然后利用实施例8所述的HATU/DIPEA SPPS方法用合适的Fmoc-氨基酸和N端乙酰化剂延长肽链。操作、HPLC-纯化和脱盐如实施例1所述进行。
产量：52mg；HPLC纯度：97.9％；MS：MW＝1338；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：92.4％；离子层析：乙酸盐：2.5％(w/w)。
实施例12
Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(12)
对于该化合物的合成，在树脂上用Fmoc-Val-H进行还原性烷化是不可能的。因此，在固定于树脂上之前，在溶液中制备二肽类似物Fmoc-Val-ψ[CH2NH]-Gly-OH(12d)。
Fmoc-Val-ψ[CH2NH]-Gly-Obzl(12c)
Fmoc-Val-H(12a，3.16g，10mmol，按照T.Moriwake，S.-I.Hamano，S.Saito，S.Torii，S.Kashino，J.Org.Chem.，54：4114-4120，1989制备)在EtOH/HOAc(80mL，99/1，v/v)中溶解，加入HCl.H-Gly-Obzl(12b，2.02g，10mmol)，随后加入NaCNBH3(0.94g，15mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。随后，加入5％NaHCO3水溶液(20mL)，中和反应混合物。然后真空浓缩该混合物，用CH2Cl2抽提残余物。合并的有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，在Na2SO4上快速干燥，过滤，蒸发溶剂，产生黄色的油。在通过硅胶层析纯化后(洗脱液：CH2Cl2中的0-4％甲醇)，分离化合物12c，为白色固体。产量：1.85g(39％)。分析：TLC：(硅，CH2Cl2/MeOH 98/2)Rf＝0.45，MS：MW＝472。
Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-Obzl(12d)
Fmoc-Val-ψ[CH2NH]-Gly-Obzl(12c，0.910g，1.93mmol)、Boc2O(0.420g，1.93mmol)和DIPEA(0.336g，1.93mmol)溶解于无水CH2Cl2(20mL)中。加入DIPEA使pH保持碱性，混合物在室温下搅拌过夜。然后加入10％KHSO4酸化反应混合物。加入水，用CH2Cl2抽提水层。合并的有机层用饱和NaCl水溶液洗涤，在MgSO4上快速干燥，蒸发溶剂，得到0.96g(97％)12d。分析：TLC：(硅，CH2Cl2/MeOH 98/2)Rf＝0.55；MS：MW＝572。
Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-OH(12e)
Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-Obzl(12d，0.97g，1.70mmol)溶解在MeOH/EtOAc(1/1，v/v，100mL)混合液中，在正常压力下用10％Pd/C氢化2小时。过滤掉钯催化剂，浓缩滤液，得到为淡黄色油的羧酸12e。产量：0.661g(81％)。分析：TLC(硅，CH2Cl2/MeOH/AcOH 90/9/1)Rf＝0.42；MS：MW＝482。
利用HATU/DIPEA双注射器模式并与HATU/DIPEA双偶联的肽合成仪，将化合物Fmoc-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-OH(12e)(0.661g，1.37mmol)加到PAL-PEG-PS树脂上(1.5g，0.15mmol/g，0.225mmol)。取代水平用标准Fmoc切割方法测定，为0.13mmol/g加样树脂(产量：87％)。用HATU/DIPEA SPPS法(实施例1)，经过对于每种Fmoc-氨基酸60分钟的双浓缩步骤，使得到的肽H-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS(12f)进一步延长。类似于肽9和肽11，用4-硝基苯乙酸引入N端乙酰基。操作、纯化和脱盐如实施例1所述进行。
产量：17mg；HPLC纯度：80.1％；MS：MW＝1338；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：63.7％；离子层析：氯化物：1.0％，磷酸盐：0.2％，乙酸盐：0.2％(w/w)。
实施例13
Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2(13)
为了合成肽13，首先制备必需的类肽单体Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13e)。
Z-2-氨基乙基-叔丁醚(13a)
将3.25g MgSO4(27mmol)悬浮于80mL CH2Cl2(干)中。在N2下加入1.5mL浓H2SO4(方法：S.W.Wright，D.L.Hageman，A.S.Wright，L.McClure，Tetrahedron Lett.，38：7345-7348，1997)。混合物搅拌15分钟，之后加入溶解于CH2Cl2(20mL)中的叔BuOH(12.9mL)和可购得的Z-2-氨基乙醇(5.28g，27mmol)。搅拌5天后，向反应混合物中加入200mL 5％NaHCO3水溶液，搅拌直到所有MgSO4溶解。分离层，CH2Cl2层用盐水洗涤。有机层在MgSO4上干燥，过滤，蒸发溶剂，产生5.6g粗13a。产物经柱层析纯化(洗脱液：庚烷/EtOAc 3∶1v/v)。产量为5.00g(78％)。1HNMR(CDCl3)δ：1.15(s，9H，tBu)，3.3-3.5(dt，4H，2×CH2)，5.1(bs，2H，CH2Bzl)，7.4(m，5H，Ar).
2-氨基乙基-叔丁醚.HCl(13b)
向5.00g苄酯13a在乙酸乙酯(150mL)的溶液中加入225mg 10％Pd/C，用H2鼓泡2小时。过滤掉催化剂，加入15mL 1M HCl水溶液。蒸发溶剂，加入小体积的***。过滤出沉淀的产物13b，真空干燥。产量：2.35g(77％)。NMR(CDCl3)δ：1.20(s，9H，tBu)，3.15(t，2H，CH2)，3.65(t，2H CH2)，8.1-8.4(bs，2H，NH2)
N-(2-叔丁氧基乙基)-甘氨酸(H-NhSer(tBu)-OH)(13c)
向13b(2.30g，15mmol)在25mL H2O的溶液中加入1.40g(15.2mmol)二羟乙酸.H2O。用1.0M NaOH水溶液将pH调节为pH＝6。向该溶液中加入230mg Pd/C，以45psi H2压力搅拌该反应混合物过夜。过滤掉催化剂，用5mL H2O洗涤。在下一步中使用未进一步纯化的含有13c的滤液。
Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)
用1N NaOH使溶解于H2O中的反应产物13c达到pH＝9.5。碱性溶液用25mL丙酮稀释，逐滴加入溶解于25mL丙酮中的5.40g(16mmol)Fmoc-Osu。用1N NaOH使pH保持在pH＝9.5。在搅拌过夜后，将反应混合物浓缩为150mL，用2×50mL***/庚烷(1/1，v/v)洗涤。H2O层用20％柠檬酸酸化为pH＝2.5，并用100mL乙酸乙酯抽提3次。合并有机层，并在Na2SO4上干燥。蒸发溶剂，产物经柱层析纯化(硅，CH2Cl2/MeOH5/1，v/v)并冻干。产量：5.44 g(91％)。1H NMR(CDCl3)δ：1.20(s，9H，tBu)，3.2(dt，2H CH2)，3.6-3.7，(dt，2H，CH2)，4.05(s，2H，CH2CO2H)，4.2(b，1HFmoc)，4.4-4.6(2H，2×d，Fmoc)，7.3-7.8(m，8H，ArH，Fmoc).
肽13的合成如前所述(实施例1)用双注射器技术在Pepsynthesizer上进行。载体是Fmoc-PAL-PEG-PS(1.0 g，0.15 mmol/g)，用NMP作为溶剂。对所有氨基酸都使用双偶联(偶联时间60分钟)，包括Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)。用4-硝基苯乙酸引入N端乙酰基。操作和从树脂上切除和保护基团以标准方法(实施例1)进行。粗肽经HPLC纯化，并用5‰乙酸水溶液脱盐。
产量：50mg；HPLC纯度：98.6％；MS：MW＝1366；氨基酸分析：发现需要量的所有氨基酸；肽含量：82.1％；离子层析：氯化物：0.3％，乙酸盐：1.3％(w/w)。
实施例14
Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(14)
用HATU/DIPEA方案在Pepsynthesizer上进行合成(实施例1)。前述功能化的树脂H-Val-ψ[CH2N(Boc)]-Gly-PAL-PEG-PS(12f)和保护的类肽Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)用作构件。如前所述，使用双注射器技术和每次偶联60分钟的双偶联。在Fmoc-NhSer(tBu)-OH(13d)偶联之前终止合成仪上的肽链延长，该氨基酸在与固定的肽链(H-Phe-Thr(tBu)-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-PAL-PEG-PS)偶联之前通过超声处理溶解在DMSO中。通过剩余的(Arg)氨基酸的缩合和利用4-硝基苯乙酸的乙酰化完成合成。肽的操作、纯化和脱盐为标准方法，如实施例1所述。冻干产生47mg肽14。
HPLC纯度：72.9％；MS：MW＝1352；离子层析：三氟乙酸盐：5.5％(w/w)。
实施例15
利用抗原特异的T细胞杂交瘤对激动剂肽的预选择(第一组试验)
为了检测修饰的肽的激动剂活性，使用3种不同的HC gp-39(263-275)-特异性杂交瘤细胞系(5G11、8B12和14G11)。具有DRB1*0401特异性的5×104个杂交瘤细胞和2×105个照射的(12000 RAD)EBV-转化的B细胞在圆底微量板孔中以150μl体积中温育。向双份孔中加入50μl的肽抗原(HC gp-39(263-275)和修饰的肽)。48小时后利用使用小鼠IL-2特异的Pharmingen抗体的夹心ELISA测定100μl培养上清液的抗原特异性IL-2的产生。
利用抗原特异性T细胞克隆对激动剂肽的选择(第二组试验)
从来自肽263-275的RA反应者的肽特异性T细胞系中分离243 T细胞克隆(RA患者243)。在DRB1*0401匹配的PBMC的存在下，经过用HC gp-39(263-275)肽4次重复刺激获得这些克隆。从获自HLA-DRB1*0401-阳性供体的肽刺激的T细胞系中分离H235 T细胞克隆。在DRB1*0401匹配的PBMC的存在下用肽HC gp-39(261-275)2次刺激后，通过PHA克隆获得这些克隆。发现克隆243和235在肽抗原识别方面是HLA-DRB1*0401限制性的。在每次实验中，在刺激后的第10-14天使用这些细胞。
通过在平底微量板中在150μl含10％正常人集合血清的培养基中(NHS，CLB，Amsterdam，荷兰)中，将2×104个T细胞与105个DRB1*0401-匹配的(3,000 Rad照射的)PBMC温育，测定克隆243或克隆235的增殖反应。50μl抗原溶液(含有263-275序列或如述的修饰)分配于三份孔中。在温育的第2天或第3天加入3H-胸苷。在玻璃纤维滤器上收集细胞，测定掺入的放射性。
结果
表2所列的大多数修饰的肽能以相当于先导肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH的方式刺激所有3种T细胞杂交瘤。然而，某些肽不能刺激所有3种杂交瘤，这说明了使用的杂交瘤在特异性上的不同。
当检测这些激动剂刺激两种人T细胞克隆的能力时，所测化合物在效价上的不同变得明显(表2)。大多数修饰的化合物诱导克隆235和克隆243的反应。一种化合物(Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2)不能诱导任一种克隆的增殖反应。三种化合物(H-β高精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-ψ[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2)只对一种克隆(克隆243或235)有活性。三种化合物(H-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H-D-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH和CH3OC(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH)可诱导两种克隆的增殖反应，其数量级与先导肽H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH诱导的反应相同。7种化合物(Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3(OCH2CH2)3-OCH2C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、(N-甲基-烟酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2)在诱导一种或两种克隆的增殖反应方面优秀。最有效的化合物鉴定是Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2和Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2(表2和图1)。
实施例16
大约8-10周龄的雌性Balb/c小鼠(德国Charles River或法国CharlesRiver)在第0天用完全弗氏佐剂(IFA；Sigma Chemicals，St.Louis，USA)中的100μl抗原制品(50μg HC gp-39 263-275)免疫。在小鼠胸区的两个部位皮下施以抗原。在第7天，用0.9％NaCl(NPBI，Emmer Compascuum，荷兰)稀释的抗原制品(HC gp-39(263-275))攻击小鼠，体积为50μl 1mg/ml明矾(Pharmacy Donkers-Peterse，Oss，荷兰)，部位在足垫单侧(左爪)；另一个(右)足垫注射50μl明矾在0.9％NaCl中的溶液作为对照。在第8天测定迟发型超敏反应(平均％特异肿胀)，方法是用室内设计的测微计，测量左后足垫相对于右后足垫的足垫厚度的增加(左侧肿胀(mm)-右侧肿胀(mm)/右侧肿胀(mm)×100％)。
在第0天用含有IFA中的50μg HC gp-39 263-275的100μl抗原制品免疫前(第-5天)，在异氟烷(Forene，Abbott BV，Amstelveen，荷兰)麻醉下鼻施用抗原制品(50、10、2或0.4μg(或更低浓度的))HC gp-39(263-275)或修饰的肽衍生物。在这些实验中，用HC gp-39 263-275免疫和攻击小鼠，并如上所述测定DTH反应。
利用上述测定***，其中Balb/c小鼠用对HC gp-39(263-275)起反应的IFA中的HC gp-39(263-275)免疫，能研究鼻施用HC gp-39(263-275)与施用修饰的肽衍生物相比，对耐受诱导的可能作用。用HC gp-39(263-275)预处理可下调HC gp-39(263-275)特异的DTH反应；这种作用取决于预处理过程中使用的肽的剂量。利用相对较高的肽浓度(50μg/小鼠)，鼻施用一剂HC gp-39(263-275)可完全消除DTH反应，而一剂2μg/小鼠无效。因此，建立一种方法在HC gp-39(263-275)特异的DTH测定***中区别肽的有效(致耐受)和无效剂量。假定基于HC gp-39(263-275)的修饰的肽衍生物在比初始肽更低的浓度下可以有活性，这些肽预计可在相对较低的肽浓度时诱导耐受。按照这一假设，在这一耐受诱导方法中测试了一系列修饰的肽。在该实验中(其中诱导可靠的HC gp-39(263-275)反应，用50μg而不是2μg HC gp-39(263-275)预处理能下调这种反应)，显示该肽的特异性修饰在诱导耐受中特别有活性，而其它的没有(见表3)。表2在第一组(杂交瘤测定)和第二组(人克隆增殖测定)试验中获得的结果的概述
表3 DTH试验
1)半致耐受剂量：DTH反应(特殊实验中的最大DTH)50％抑制的测试剂量。-：不致耐受，ND：未进行。
| 所检测的肽 | 杂交瘤测定 | 人克隆的反应性 | |
| 235 | 243 | ||
| H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-Arg-Ser-Phe(4Br)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-Arg-Ser-Cha-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHAc-(D-Arg)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHAc-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHCH3-(OCH2CH2)3-OCH2C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2D-Glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(N-Me-烟酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHMeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-β高精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHAc-Arg-Ser-Phe-ψ[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-ψ[CH2NH]-Val-Gly-NH2Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-NhSer-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2 | ++++++++++++++*+*+[*++++ | ++ndnd+ndnd+++++++++-+nd+++-++++++ | ++ndnd+ndnd++++++++++-nd-nd+++-++++++ |
| 所检测的肽 | 测试剂量(DTH)(μg第-5天) | 半致耐受剂量(μg)l) |
| H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-Arg-Ser-Phe(4Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-Arg-Ser-Phe(4Br)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-Arg-Ser-Cha-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHAc-(D-Arg)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHAc-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHCH3-(OCH2CH2)3-OCH2C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2D-Glucityl-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-ThrGly-Val-Gly-OH(N-Me-烟酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHMeO-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHH-β高精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OHAc-Arg-Ser-Phe-ψ[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-ψ[CH2NH]-Val-Gly-NH2Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2Ac-Narg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-NhSer-Phe-The-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2Ac-Arg-NhSer-Phe-The-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ[CH2NH]-Gly-NH2 | 50，10，2，0.450，10，250，10，2，0.450，10，250，10，2，0.450，10，250，10，2，0.450，10，2，0.450，10，2，50，10，2，0.450，10，2，0.450，10，2，0.4ND50，10，2，0.450，10，2ND50，10，2，0.4，0.08，0.016，0.0032ND50，10，2，0.4，0.08，0.016，0.003250，10，2，0.4，0.08，0.016，0.0032 | 10＜22-1050-50-10＜0.4-＜2＜0.410-502-10＜0.410-500.080.016-0.080.0032 |
Claims (16)
1.一种由H-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH(通式I)衍生的修饰的肽，其具有通式Q-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-Z(通式II)，其中A1至A13对应于通式I的氨基酸，Q对应于H，Z对应于OH，其特征在于1-6个修饰选自以下a、b或c中的一种或多种：
a)A1-A13中1-6个、优选地1-4个氨基酸被非天然氨基酸或β氨基酸替换；
b)一个或多个酰胺键被还原的酰胺键或乙烯等排物取代；
c)Q和/或Z处的取代；和任选地，
d)总共可达6个修饰的天然氨基酸的取代。
2.根据权利要求1的肽，其中
Q是H、(C1-6)烷基、甲酰基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)链烯氧基羰基、(C6-14)芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，则不含Q；
Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基、(C2-6)链烯基、芳基(C1-4)烷基、(C4-13)杂芳基(C1-6)烷基，或NR1R2，其中R1和R2分别选自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基；和任选地，Q和Z还含有紧邻位置A1和/或A3的总共达10个氨基酸。
3.根据权利要求1或2的肽，其中在不超过4个、优选地不超过2个位置处发生一个或多个天然氨基酸对A1-A3的取代。
4.根据权利要求1-3的肽，其中
Q是H、(C1-6)烷基、甲酰基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、(C2-6)链烯氧基羰基、芳基(C1-6)烷基；(C6-14)芳基(C1-4)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，则不含Q；
A1是L-Arg、D-Arg、L-Lys、D-Lys、L-Ala、D-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(R)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)，或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)；
A2是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)；
A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)、D-Phe(X)，其中X独立地选自(C1-4)烷基、羟基、卤素、(C1-6)烷基羰基氨基、氨基或硝基、L-Hfe、D-Hfe、L-Thi、D-Thi、L-Cha、D-Cha、L-Pal(3)、D-Pal(3)、L-1-Nal、D-1-Nal、L-2-Nal、D-2-Nal、L-Ser(Bzl)、D-Ser(Bzl)、(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(R)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}中的一个或多个；
A4是L-Thr、D-Thr-L-Ser-、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly；
A5是L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、L-Val、D-Val-、L-Nva、D-Nva、L-Ala、D-Ala、Gly、(R)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}；
A6是L-Ala、D-Ala或Gly；
A7是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly；
A8是L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Thr、D-Thr、L-Ala、D-Ala或Gly；
A9是L-Glu、D-Glu、L-Asp、D-Asp、L-Ala、D-Ala或Gly；
A10是L-Thr、D-Thr、L-Ser、D-Ser、L-hSer、D-hSer、L-Ala、D-Ala或Gly；
A11是Gly、L-Ala、D-Ala或-NH-CH2-CH2-；
A12是L-Val、D-Val、L-Nva、D-Nva、L-Leu、D-Leu、L-Ile、D-Ile、(R)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH2CH3]-CH2-}、(R)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(S)-{-NH-CH[CH2CH(CH3)2]-CH2-}、(RR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(RS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}、(SR)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-，或(SS)-{-NH-CH[CH2(CH(CH3)-CH2CH3]-CH2-}；
A13是Gly、L-Ala或D-Ala，和
Z是OR，其中R是H、(C1-6)烷基、(C2-6)链烯基、(C6-14)芳基(C1-4)烷基、(C4-13)杂芳基(C1-6)烷基或NR1R2，其中R1和R2独立地选自H、(C1-6)烷基或(C6-14)芳基(C1-6)烷基，任选地Q和Z还含有紧邻位置A1和/或A3的总共可达10个氨基酸。
5.根据权利要求1-4的肽，其中
Q是H、(C1-6)烷基、(C1-6)烷基羰基、羧基(C1-6)烷基、(C1-6)烷氧基羰基、CH3(OCH2CH2)n-OCH2-C(O)-(其中n＝1-10)、HOCH2-(CHOH)m-CH2-(其中m＝3-4)；1-甲基-吡啶鎓-3-羰基、1-甲基-吡啶鎓-4-羰基或Lys，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)，则不含Q；
A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-5)、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝2-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}(其中n＝2-5)或-N[(CH2)n-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-(其中n＝2-5)；
A2是L-Ser、L-Ala、D-Ala、Gly或-N[(CH2)n-OH]-CH2-C(O)-(其中n＝2-5)；
A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)或D-Phe(X)(其中X是卤素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha、L-Pal(3)、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)或(S)-{-NH-CH(CH2-芳基)-CH2-}；
A4是L-Thr或L-Ala；
A5是L-Leu、L-Ala或(S)-{-NH-CH(CH2-CH(CH3)2)-CH2-}；
A6是L-Ala或Gly；
A7是L-Ser或L-Ala；
A8是L-Ser或L-Ala；
A9是L-Glu或L-Ala；
A10是L-Thr或L-Ala；
A11是Gly、L-Ala或-NH-CH2-CH2-；
A12是L-Val或(S)-{-NH-CH[CH(CH3)2]-CH2-}；
A13是Gly或L-Ala，和
Z是OR，其中R是H或NR1R2，其中R1和R2独立地选自H或(C1-6)烷基，任选地，
Q和Z还含有紧邻位置A1和/或A3的总共可达10个氨基酸。
6.根据权利要求1-5的肽，其中
Q是H、甲基；乙酰基；羧基亚甲基、甲氧基羰基；CH3(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-、D-1-葡糖基、1-甲基-吡啶鎓-3-羰基或1-甲基-吡啶鎓-4-羰基，或者如果A1是H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-则不含Q；
A1是L-Arg、D-Arg、L-Ala、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)、(S)-{-NH-CH[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]-CH2-C(O)-}或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-；
A2是L-Ser、L-Ala或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-；
A3是L-Phe、D-Phe、L-Phe(X)(其中X是卤素或硝基)、L-Hfe、L-Thi、L-Cha、L-Pal(3)、L-1-Nal、L-2-Nal或L-Ser(Bzl)，和
Z是OH、NH2或NHEt，任选地
Q和Z还含有紧邻位置A1和/或A3的总共可达10个氨基酸。
7.根据权利要求1-6的肽，其中通式是Q-A1-A2-A3-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-A11-A12-Gly-Z(通式III)。
8.具有1-4个修饰的根据权利要求1-7的肽。
9.具有2-3个修饰的根据权利要求8的肽。
10.根据权利要求7的肽，其中
A1是L-Arg、D-Arg、H2N-C(＝NH)NH-(CH2)4-C(O)-、H2N-(CH2)n-C(O)-(其中n＝5-7)，或-N[(CH2)3-NH-C(＝NH)-NH2]CH2C(O)-，
A2是L-Ser或-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-，
A3是L-Phe、L-Phe(X)(其中X是卤素)、L-1-Nal、L-2-Nal、L-Ser(Bzl)、L-Thi、L-Cha或L-Pal(3)。
11.根据权利要求9或10的肽，其中通式是is Q-Arg-A2-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-A12-Gly-Z(通式IV)。
12.一种选自下列的肽：脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、脱氨基精氨酰-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3-(OCH2CH2)3-OCH2-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、D-1-葡糖基-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、CH3O-C(O)-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、Ac-Arg-Ser-Phe-ψ-[CH2NH]-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-ψ-[CH2NH]-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-NH2、Ac-Arg-N[(CH2)2-OH]-CH2-C(O)-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-ψ-[CH2NH]-Gly-NH2、H-Arg-Ser-Phe(Cl)-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)5-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、H2N-(CH2)6-C(O)-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH、(N-甲基-烟酰)+-Arg-Ser-Phe-Thr-Leu-Ala-Ser-Ser-Glu-Thr-Gly-Val-Gly-OH。
13.根据权利要求1-12任一项的肽，用作治疗物。
14.含有一种或多种根据权利要求1-12的肽和一种药学可接受的载体的药用组合物。
15.一种或多种根据权利要求1-12的肽在药剂生产中的用途，该药剂用于在自身免疫病，更具体地是关节炎患者中诱导对自身抗原的特异性T细胞耐受。
16.含有一种或多种根据权利要求1-12任一的肽和一种检测剂的诊断组合物。
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