SK287323B6 - Nogo proteín, jeho purifikovaný fragment, chimérny proteín a purifikovaná molekula s jeho obsahom, izolovaná nukleová kyselina, vektor s jej obsahom, rekombinantná bunka, spôsob produkcie rekombinantného proteínu a jeho použitie - Google Patents

Abstract

Je opísaný gén Nogo a produkt kódovaný týmto génom, ako aj ich deriváty a analógy. Poskytnutá je aj produkcia Nogo proteínov, derivátov a protilátok. Tiež sú opísané terapeutické prostriedky a použitie na diagnostikovanie a liečenie.

Description

Predložený vynález sa týka génu Nogo, a najmä Nogo, produktu kódovaného týmto génom, ako aj ich derivátov a analógov. Poskytnutá je aj produkcia Nogo proteínov, derivátov a protilátok. Vynález sa ďalej týka terapeutických prostriedkov a spôsobov diagnostiky a terapie.

Táto prihláška si nárokuje prioritu z US prihlášky 60/107446, podanej 6. novembra 1998, ktorá je tu začlenená jej citáciou.

Doterajší stav techniky

V centrálnom nervovom systéme (CNS) vyšších stavovcov regenerácia axónov po poranení takmer neexistuje a štrukturálna plasticita je obmedzená. Je pravdepodobné, že dôležitú úlohu hrajú rastové inhibítory spojené s CNS myelínom. To je dokázané prostredníctvom monoklonálnej protilátky (mAb), IN-1, ktorá neutralizuje účinný neuritový rastový inhibičný myelínový proteín, a tým podporuje regeneráciu axónov do veľkej vzdialenosti a zosilňuje kompenzačnú plasticitu nasledujúcu po miechových a mozgových léziách pri dospelých potkanoch.

Množstvo in vitro a in vivo pozorovaní sa týkalo nových aspektov regulácie rastu neuritov, týkajúcich sa negatívnych a inhibičných signálov a faktorov (Keynes a Cook, 1995, Curr. Opin. Neurosci. 5:75-82). Zdá sa, že väčšina týchto signálov sú proteíny alebo glykoproteíny. Prvým prelomom smerom k identifikácii týchto faktorov bola purifikácia a klonovanie cDNA molekuly indukujúcej kolaps rastu vrcholov, izolovanej z kuracieho mozgu, kolapsínu-1, ktorý sa teraz nazýva semaforín 3 A.

Druhá skupina negatívnych navádzacích podnetov, ktoré sa v súčasnosti purifikovali a klonovali, je teraz označovaná ako efriny. Sú to ligandy Eph receptorovej tyrozínkinázovej rodiny. Efrín-A5 a Efrín-A2 sa exprimujú vo forme gradientu v očnom tekte kuracieho embrya a ich ektopická expresia alebo delécia spôsobuje chyby v navádzaní vrastania sietnicových axónov. Podobne ako semaforíny, má efrínová rodina 15 až 20 členov, z ktorých každý sa komplexne a dynamicky exprimuje vnútri a mimo nervového systému. Ešte stále nie sú analyzované funkcie väčšiny týchto molekúl.

Treťou skupinou navádzacích podnetov, ktoré môžu brzdiť rast axónov, a ktoré sa exprimujú vo vyvíjajúcom sa nervovom systéme, sú netríny. Netrín bol purifikovaný ako od platničkového dna odvodený chemoatraktant pre komisurálne axóny v skorej mieche, podobne ako jeho C. elegans ortológ unc-6. Ukázalo sa, že nektrín-1 má negatívne účinky na určité typy neurónov v závislosti od typu receptora, ktorý sa nachádza na cieľových neuronálnych rastových vrcholoch (Tessier-Lavigne a ďalší, 1996, Science 274: 1123-33).

V minulosti bola publikovaná účinná neuritová rastová inhibičná aktivita asociovaná s dospelými CNS oligodendrocytmi a myelínom v publikácii Canoni a Schwab (1988, J. Celí Biol. 106:1281-1288). Hlavnou zložkou je membránový proteín s vysokou molekulovou hmotnosťou (NI-250, s menším komponentom, NI-35, pri potkanovi), ktorý bol v súčasnosti purifikovaný, a ktorý sa týka predmetu predloženého vynálezu a je viazaný neutralizačnou protilátkou mAb, IN-1 (Canoni a Schwab, 1988, J. Celí Biol. 106:1281-1288; US patenty č. 5684133; 5250414; PCT zverejnená prihláška WO 93/00427).

S myelínom asociované neuritové rastové inhibítory zohrávajú kľúčovú úlohu pri zabraňovaní regenerácii lézií CNS axónov. Keď sa kurčatám alebo potkanom blokuje vývoj oligodendrocytov a vytváranie myelínu, predĺži sa regeneračný permisívny čas nasledujúci po CNS léziách. V skutočnosti je vytváranie myelínu v časovom súlade s koncom vývojovej periódy, v ktorej majú CNS vysokú štrukturálnu plasticitu a vysoký regeneračný potenciál.

Je pravdepodobné, že NI-250 a NI-35 sú hlavnými zložkami rastovej inhibície asociovanej s myelínom, ako je dokázané in vivo aplikáciou IN-1 na lézie miechy dospelých potkanov, ktorá indukovala regeneráciu kortikospinálnych axónov na dlhé vzdialenosti a umožnila motorické a behaviorálne funkčné zotavenie, najmä čo sa týkalo lokomócie. Aj podobné experimenty s očným nervom a cholinergickou septo-hipokampálnou dráhou demonštrovali in vivo význam ΓΝ-1 rozoznávaného antigénu, NI-35/250 (Schnell a Swab, 1990, Náture 343:269-272; Bregman a ďalší, 1995, Náture 378:498-501).

Aj vláknité systémy bez lézií odpovedajú na neutralizáciu neuritových rastových inhibítorov prostredníctvom IN-1. Súčasné experimenty presvedčivo dokázali, že v prítomnosti IN-1 po selektívnej lézii kortikospinálneho traktu (pyramidotómia) vyrašia neporušené vlákna krížom cez stredovú čiaru v mieche a mozgovom kmeni a ustanoví sa bilaterálny inervačný vzor, ktorý je sprevádzaný takmer úplným behaviorálnym zotavením jemných pohybov (Z’Graggen a ďalší,1998, J. Neuroscience 18(12):4744-4757).

Izolácia génu, ktorý kóduje neuritový rastový inhibičný proteín, poskytuje množstvo príležitostí na vývoj produktov užitočných na neuronálnu regenaráciu a na liečbu rôznych neurologických porúch, vrátane CNS nádorov.

Uvedené citácie a publikácie nesmú byť brané ako predchádzajúci stav techniky vo vzťahu k predloženému vynálezu.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú nukleotidové sekvencie Nogo génov (ľudského, potkanieho a hovädzieho Nogo a Nogo homológov iných druhov) a amino-kyselinové sekvencie proteínov kódovaných týmito génmi, ako aj ich deriváty (napr. fragmenty) a analógy. Poskytnuté sú aj nukleové kyseliny, ktoré hybridizujú alebo sú komplementárne s uvedenými nukleotidovými sekvenciami. V konkrétnom uskutočnení je Nogo proteín potkaní, hovädzí alebo ľudský proteín.

Vynález sa týka aj spôsobu identifikácie génov, ktoré interagujú s Nogo.

Nogo je gén poskytnutý predloženým vynálezom, identifikovaný spôsobom podľa vynálezu, ktorý tak kóduje, ako aj interaguje s neurálnymi rastovými regulačnými proteínmi.

Vynález sa týka aj Nogo derivátov a analógov podľa vynálezu, ktoré sú funkčne aktívne, t. j. sú schopné mať jednu alebo viac známych funkčných aktivít spojených s prirodzene sa vyskytujúcim Nogo proteinom. Bola napríklad identifikovaná hlavná inhibičná oblasť medzi aminokyselinami 542 až 722. Takéto funkčné aktivity zahŕňajú, ale nie sú obmedzené, na inhibíciu rastu neurónov nervových buniek, rozširovanie a migráciu fibroblastov alebo akýchkoľvek buniek majúcich neoplastický rast, schopnosť interagovať s alebo konkurovať interakcii s nervovými rastovými regulačnými proteínmi, antigenicitu, ktorá je schopnosťou viazať (alebo konkurovať Nogo pri viazaní) anti-Nogo protilátku, imunogenicitu, ktorá je schopnosťou generovať protilátku, ktorá sa viaže na Nogo. Tieto protilátky sú schopné indukovať vyrastanie neuritov alebo zabrániť kolapsu rastu vrcholov dorzálnych koreňových ganglií prostredníctvom inhibície funkcie Nogo a funkčných fragmentov alebo derivátov Nogo, ktoré majú schopnosť inhibovať vyrastanie neuritov.

Vynález sa ďalej týka fragmentov (a ich derivátov alebo analógov) Nogo, ktoré obsahujú jednu alebo viac domén Nogo proteínu, ako napríklad kyslý a na prolín bohatý amino-koniec (napr. aminokyseliny 31 až 58 sekvencie SEQ ID NO:2), vysoko konzervovaný karboxy-koniec a dva hydrofóbne pásy s dĺžkou 35 a 36 aminokyselín v potkaňom Nogo, ktoré sú tiež na karboxy-konci (napr. aminokyseliny 988 až 1023 a 1090 až 1125 v SEQ ID NO:2)

Okrem toho sú poskytnuté protilátky proti rôznym Nogo a Nogo derivátom a analógom. Najmä, ako príklad, boli odvodené dve protilátky, prvá protilátka, označená AS 472, bola odvodená použitím syntetického peptidu zodpovedajúceho aminokyselinám 623 až 640 v SEQ ID NO:2, ako imunogénu, a druhá protilátka, označená ako AS Braňa, bola generovaná proti karboxy-koncu Nogo, amino-kyselinám 762 až 1163 v SEQ ID NO:2.

Poskytnuté sú aj spôsoby produkcie Nogo proteínov, derivátov a analógov, napr. rekombinantnými prostriedkami.

Predložený vynález sa týka aj terapeutických a diagnostických spôsobov a prostriedkov založených na Nogo proteínoch a nukleových kyselinách. Terapeutické zlúčeniny podľa vynálezu zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na Nogo proteíny a ich analógy a deriváty (vrátane fragmentov); protilátky proti nim; nukleové kyseliny kódujúce Nogo proteíny, analógy alebo deriváty; a Nogo ribozýmy alebo Nogo antisense nukleové kyseliny.

Predložený vynález sa týka aj terapeutických a diagnostických spôsobov a prostriedkov založených na Nogo proteínoch a nukleových kyselinách a anti-Nogo protilátkach. Vynález poskytuje liečbu CNS a nervových nádorov podávaním zlúčenín, ktoré podporujú Nogo aktivitu (napr. Nogo proteínov a ich funkčne aktívnych analógov a derivátov vrátane fragmentov; nukleových kyselín kódujúcich Nogo proteíny, analógy alebo deriváty, Nogo agonistov).

Vynález poskytuje aj liečbu chorôb, porúch alebo poškodení, ktoré nakoniec vedú k poškodeniu nervového systému. Takéto choroby, poruchy alebo poškodenia zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na traumu centrálneho nervového systému (CNS) (napr. poranenia miechy alebo mozgu), infarkt, infekciu, malígne nálezy, vystavenie toxickým činidlám, výživovú nedostatočnosť, paraneoplastické syndrómy a degeneratívne nervové ochorenia (vrátane alebo bez obmedzenia na Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu choreu, sklerózu multiplex, amyotrofickú laterálnu sklerózu a progresívne supra-nukleárne ochrnutie); podávaním zlúčenín, ktoré interferujú s Nogo aktivitou (napr. dominantne negatívneho Nogo derivátu; protilátok proti Nogo; antisense nukleových kyselín proti Nogo, Nogo ribozýmov alebo chemických skupín, ktoré sa viažu na aktívne miesto Nogo).

Vynález poskytuje aj živočíšne modely, diagnostické spôsoby a spôsoby skríningu na predispozíciu proti poruchám, a spôsoby na identifikáciu a zhodnotenie Nogo agonistov a antagonistov.

Definície

Tak ako sa používa tu, označuje podčiarknutie alebo kurzíva mena génu gén, na rozdiel od jeho kódovaného proteínového produktu, ktorý je označený menom génu bez toho, aby bol podčiarknutý alebo napísaný kurzívou. Napríklad, „ Nogo “ znamená Nogo gén, zatiaľ čo „Nogo“ označuje proteínový produkt Nogo génu.

Podrobný opis vynálezu

Predložený vynález sa týka nukleotidových sekvencii Nogo génov a sekvencii nimi kódovaných proteínov. Vynález sa ďalej týka fragmentov a iných derivátov a analógov Nogo proteínov. Aj nukleové kyseliny kódujúce takéto fragmenty alebo deriváty spadajú do rozsahu vynálezu. Vynález poskytuje Nogo gény a nimi kódované proteíny mnohých odlišných druhov. Nogo gény podľa vynálezu zahŕňajú ľudské, potkanie a hovädzie Nogo a príbuzné gény (homológy) pri iných druhoch. Hovädzie subsekvencie opísané v Spillman a ďalší, 1998, J. Biol. Chem. 273: 19283-19293, nie sú nárokované ako časť predloženého vynálezu. V konkrétnych uskutočneniach sú Nogo gény a proteíny zo stavovcov alebo výhodnejšie cicavcov. Vo výhodných uskutočneniach podľa vynálezu sú Nogo gény a proteíny ľudského pôvodu. Poskytnutá je produkcia uvedených proteínov a derivátov, napr. rekombinantnými metódami.

Nogo gén, ako je poskytnutý predloženým vynálezom, zahŕňa molekuly nukleových kyselín, ktoré kódujú tri izoformy Nogo; konkrétne Nogo A, Nogo B a Nogo C. Odvolanie sa na gén „Nogo zahŕňa molekuly nukleových kyselín kódujúce všetky tri izoformy, ak nie je uvedené inak. Podobne, odvolanie sa na Nogo proteín zahŕňa všetky tri izoformy Nogo, ak nie je uvedené inak. Nogo proteíny podľa vynálezu môžu predchádzať regenerácii neurónov v mieche alebo mozgu (t. j. nepermisívne substrátové vlastnosti), inhibovať vyrastanie neuritov dorzálnych koreňových ganglií, indukovať kolaps rastu vrcholov dorzálnych koreňových ganglií, blokovať šírenie NIH 3T3 buniek, blokovať PC 12 vyrastanie neuritov atď.

Nogo proteíny, fragmenty a ich deriváty sú bez akéhokoľvek myelínového materiálu centrálneho nervového systému; najmä bez akéhokoľvek myelínového materiálu centrálneho nervového systému, s ktorým je Nogo proteín prirodzene asociovaný. Takýto materiál môže zahŕňať iné CNS myelínové proteíny, lipidy a uhľovodíky. Nogo proteíny, fragmenty a ich deriváty podľa vynálezu sú výhodne aj bez reakčných činidiel používaných na ich purifikáciu z biologických vzoriek, ako napríklad detergentov.

V konkrétnom uskutočnení poskytuje vynález rekombinantné Nogo proteíny, ich fragmenty a deriváty pripravené spôsobmi známymi v oblasti, ako napríklad exprimovaním Nogo génu v geneticky skonštruovanej bunke.

Vynález sa týka aj Nogo derivátov a analógov podľa vynálezu, ktoré sú funkčne aktívne, t. j. sú schopné mať jedno alebo viac funkčných aktivít asociovaných s Nogo proteínom s úplnou dĺžkou (divým typom). Takéto funkčné aktivity zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na schopnosť interagovať (alebo konkurovať viazaniu) s nervovými rastovými regulačnými proteinmi, antigenicitu (schopnosť viazať sa na (alebo konkurovať Nogo pri viazaní sa na) anti-Nogo protilátku), imunogenicitu (schopnosť generovať protilátku, ktorá sa viaže na Nogo), zabraňovanie regenerácii neurónov v mieche alebo mozgu, poskytnutie takých vlastností substrátu ako je reštrikcia rastu, šírenia a migrácie nervových buniek a neoplastických buniek, inhibícia vyrastania neuritov dorzálnych koreňových ganglií, indukcia kolapsu rastu vrcholov dorzálnych koreňových ganglií, blokovanie šírenia NIH 3T3 buniek in vitro, blokovanie PC 12 neuritového vyrastania, reštrikcia nervovej plasticity atď.

Vynález sa ďalej týka fragmentov (a ich derivátov a analógov) Nogo, ktoré obsahujú jednu alebo viac domén Nogo proteínu.

Okrem toho sú poskytnuté protilátky proti Nogo a ich deriváty a analógy.

Predložený vynález sa týka aj terapeutických a diagnostických spôsobov a prostriedkov založených na Nogo proteínoch a nukleových kyselinách a anti-Nogo protilátkach. Vynález poskytuje liečbu porúch rastu regulovaných buniek alebo orgánov prostredníctvom podávania zlúčenín, ktoré podporujú Nogo aktivitu (napr. Nogo proteínov a ich funkčne aktívnych analógov a derivátov (vrátane fragmentov); nukleových kyselín kódujúcich Nogo proteíny, analógy alebo deriváty, agonistov Nogo).

Vynález poskytuje aj spôsoby liečby poškodenia alebo poruchy nervového systému podávaním zlúčenín, ktoré antagonizujú alebo inhibujú Nogo funkciu (napr. protilátok, Nogo antisense nukleových kyselín, Nogo antagonistických derivátov).

Vynález poskytuje aj zvieracie modely, diagnostické metódy a skríningové metódy vzhľadom na predispozíciu proti poruchám.

Kvôli jasnosti opisu, a nie ako spôsob limitácie, je podrobný opis vynálezu rozdelený na nasledujúce časti.

Izolácia Nogo génov

Vynález sa týka nukleotidových sekvencii Nogo génov alebo nukleových kyselín. V jednom uskutočnení obsahujú Nogo nukleové kyseliny potkaniu cDNA sekvenciu znázornenú na obrázku 2a (SEQ ID NO:1), označenú ako Nogo A, ako je znázornená na obrázku lb, alebo jej kódujúce oblasti, alebo nukleotidová sekvencie kódujúce Nogo proteín s dĺžkou 1163 aminokyselín, alebo akýkoľvek jeho funkčný fragment alebo derivát (napr. proteín, ktorý má sekvenciu SEQ ID NO:2, ako je znázornená na obrázku 2a).

V inom uskutočnení obsahujú Nogo nukleové kyseliny nukleotidovú sekvenciu kódujúcu Nogo B, pričom Nogo B proteín je rovnaký ako 172 amino-koncových aminokyselín fúzovaných so 188 karboxy-koncovými aminokyselinami Nogo A, čoho výsledkom je skrátený proteín s dĺžkou 360 aminokyselín. Transkripty Nogo

B vznikajú ako výsledok alternatívneho zostrihu, ktorý odstraňuje nukleotidovú kódujúcu sekvenciu nachádzajúcu sa uprostred.

V ešte inom uskutočnení predloženého vynálezu obsahujú Nogo nukleové kyseliny nukleotidové sekvencie kódujúce Nogo C, pričom Nogo C proteín obsahuje 11 aminokyselín na jeho amino-konci, ktoré sa nenachádzajú v Nogo A, a 188 karboxy-koncových aminokyselín z Nogo A a B. Nogo C proteín má 199 aminokyselín. Transkript kódujúci Nogo C je výsledkom transkripcie z alternatívneho Nogo promótora.

V ešte inom konkrétnom uskutočnení poskytuje predložený vynález hovädzie Nogo nukleokyselinové sekvencie (SEQ ID NO:28).

V ešte inom konkrétnom uskutočnení poskytuje predložený vynález nukleotidové sekvencie kódujúce ľudský Nogo a fragmenty ľudských Nogo proteinov, vrátane ľudských ekvivalentov potkanieho Nogo A, Nogo B a Nogo C. Ľudská Nogo nukleokyselinová sekvencia je objasnená použitím potkanieho Nogo A transkriptu ako templátu a zostrihu spolu s ľudskými exprimovanými sekvenčnými príveskami (EST) na odhalenie kontinuálnej nukleotidovej sekvencie. Potkanie a hovädzie aminokyselinové sekvencie Nogo tiež poskytli informácie o správnom translačnom čítacom rámci, tak, aby bola vydedukovaná aminokyselinová sekvencia ľudského Nogo. Predložený vynález poskytuje aj aminokyselinové sekvencie fragmentov ľudského Nogo génu.

Vynález poskytuje aj purifikované nukleové kyseliny pozostávajúce z najmenej 8 nukleotidov (t. j. hybridizovateľnú časť) Nogo sekvencie. V iných uskutočneniach pozostávajú nukleové kyseliny najmenej z 25 (po sebe idúcich) nukleotidov, 50 nukleotidov, 100 nukleotidov, 150 nukleotidov, 200 nukleotidov, 500 nukleotidov, 700 nukleotidov alebo 800 nukleotidov Nogo sekvencie, alebo z kompletnej Nogo kódujúcej sekvencie. V inom uskutočnení sú nukleové kyseliny menšie, dlhé napríklad 35, 200 alebo 500 nukleotidov. Nukleové kyseliny môžu byť jednovláknové alebo dvojvláknové. Vynález sa týka aj nukleových kyselín hybridizovateľných alebo komplementárnych s uvedenými sekvenciami. V konkrétnych uskutočneniach sú poskytnuté nukleové kyseliny, ktoré obsahujú sekvenciu komplementárnu s najmenej 10, 25, 50, 100 alebo 200 nukleotidmi alebo celou kódujúcou oblasťou Nogo génu.

V konkrétnom uskutočnení je poskytnutá nukleová kyselina, ktorá je hybridizovateľná s Nogo nukleovou kyselinou (napr. má sekvenciu SEQ ID NO:2; obrázok 2a) alebo s nukleovou kyselinou kódujúcou Nogo derivát, v podmienkach nízkej prísnosti. Ako príklad, ale nie ako obmedzenie, nasledujú postupy využívajúce takéto podmienky nízkej prísnosti (pozri aj Shilo a Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792): Na filtre obsahujúce DNA sa vopred pôsobí 6 hodín pri 40 °C roztokom obsahujúcim 35 % formamid, 5xSSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % PVP, 0,1 % Ficoll, 1 % BSA a 500 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií. Hybridizácie sa uskutočňujú v rovnakom roztoku s nasledujúcimi modifikáciami: použije sa 0,02 % PVP, 0,02 % Ficoll, 0,2 % BSA, 100 pg/ml DNA z lososích spermií, 10 % (hmotnosť/objem) dextránového sulfátu a 5-20x10⁶ cpm ³²P-značenej sondy. Filtre sa inkubujú v hybridizačnej zmesi 18 až 20 hodín pri 40 °C a potom sa 1,5-hodiny premývajú pri 55 °C v roztoku obsahujúcom 2xSSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA a 0,1 % SDS. Premývací roztok sa nahradí čerstvým roztokom a inkubuje sa ďalšiu 1,5-hodinu pri 60 °C. Filtre sa vysušia a exponujú sa na autorádiografiu. Ak je to nevyhnutné, filtre sa premývajú tretíkrát pri 65 až 68 °C a reexponujú sa na film. V oblasti sú veľmi dobre známe aj iné málo prísne podmienky, ktoré môžu byť použité (napr. podmienky využité na medzidruhové hybridizácie, ako je demonštrované v príklade v príkladovej časti 1.1.)

V inom konkrétnom uskutočnení je poskytnutá nukleová kyselina, ktorá je schopná hybridizovať s Nogo nukleovou kyselinou vo veľmi prísnych podmienkach. Ako príklad, ale nie ako obmedzenie, sú postupy využívajúce takéto veľmi prísne podmienky nasledovné: Predhybridizácia filtrov obsahujúcich DNA sa uskutočňuje 8 hodín až celú noc pri 65 °C v tlmivom roztoku obsahujúcom 6xSSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02 % PVP, 0,02 % Ficoll, 0,02 % BSA a 500 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií. Filtre sa hybridizujú 48 hodín pri 65 °C v predhybridizačnej zmesi obsahujúcej 100 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií a 5 až 20xl0⁶ cpm ³²P-značenej sondy. Premývanie filtrov sa uskutočňuje pri 37 °C 1 hodinu v roztoku obsahujúcom 2xSSC, 0,01 % PVP, 0,01 % Ficoll a 0,01 % BSA. Potom nasleduje premývanie v 0,lxSSC pri 50 °C počas 45 minút pred autorádiografiou. V oblasti sú dobre známe aj iné veľmi prísne podmienky, ktoré môžu byť použité.

V inom konkrétnom uskutočnení je poskytnutá nukleová kyselina, ktorá je schopná hybridizovať s Nogo nukleovou kyselinou v mierne prísnych podmienkach. Ako príklad, ale nie ako obmedzenie, sú postupy využívajúce takéto mierne prísne podmienky nasledovné: Filtre obsahujúce DNA sa vopred ošetrujú 6 hodín pri 55 °C v roztoku obsahujúcom 6xSSC, 5x Denhartov roztok, 0,5 % SDS a 100 pg/ml denaturovanej DNA z lososích spermií. Hybridizácia sa uskutočňuje v rovnakom roztoku a používa sa 5-20 xlO⁶ cpm ³²P-značená sonda. Filtre sa inkubujú v hybridizačnej zmesi 18 až 20 hodín pri 55 °C a potom sa dvakrát premývajú 30 minút pri 60 °C v roztoku obsahujúcom lxSSC a 0,1 % SDS. Filtre sa vysušia a exponujú na autorádiografiu. V oblasti sú dobre známe aj iné mierne prísne podmienky, ktoré je možné použiť. Premývanie filtrov sa uskutočňuje pri 37 °C 1 hodinu v roztoku obsahujúcom 2xSSC, 0,1 % SDS. Takáto prísnosť podmienok je vhodná na izoláciu nukleokyselinových molekúl, ktoré obsahujú sekvencie Nogo génu v iných druhoch, napr. na izoláciu ľudskej Nogo cDNA použitím potkaních alebo hovädzích Nogo cDNA klonov.

Množstvo ľudských exprimovaných sekvenčných príveskov (ESTs) publikovaných vo zverejnených nukleokyselinových sekvenčných databázach má vysoký stupeň sekvenčnej zhody v porovnaní so segmentami Nogo génových sekvencií podľa vynálezu. Nasledujúci predbežný zoznam ľudských ESTs bol identifikovaný a uvedený pod ich Genbank prístupovými číslami: AA158636 (SEQ ID NO:35), AA333267 (SEQ ID NO:36), AA081783 (SEQ ID NO:37), AA167765 (SEQ ID NO:38), AA322918 (SEQ ID NO:39), AA092565 (SEQ ID NO:40), AA081525 (SEQ ID NO:41) a AA081840 (SEQ ID NO:42) použitím ENTREZ Nucleotide Query. Pred predloženým vynálezom nebol žiadny z uvedených ESTs charakterizovaný s ohľadom na to, čo môžu aminokyselinové sekvencie týchto ESTs kódovať in vivo. Nič nebolo známe o funkcii týchto proteínov obsahujúcich predpokladané aminokyselinové sekvencie ľudských ESTs. Navyše, EST, ako napríklad AA158636, zosúladený s 5’ koncom potkanej Nogo cDNA, a iný EST, ako napríklad AA081840, zosúladený s 3’ koncom potkanej cDNA, sa neprekrývajú, a nepredpokladalo by sa, že sú časťou rovnakej ľudskej cDNA sekvencie.

Na základe Nogo génových sekvencií podľa predloženého vynálezu sa verí, že tieto ľudské ESTs predstavujú časti ľudského Nogo génu, ktorý sa exprimuje v tkanivách, z ktorých sa ESTs získali. Z toho vyplýva, že predložený vynález zahŕňa nukleokyselinové molekuly obsahujúce dva alebo viac z uvedených ľudských ESTs. ESTs sa môžu exprimovať v rovnakom ľudskom tkanive alebo v rozličných ľudských tkanivách. Výhodne obsahujú nukleokyselinové molekuly podľa vynálezu nukleotidové sekvencie najmenej dvoch ľudských ESTs, ktoré sa navzájom neprekrývajú, a ktoré sa neprekrývajú s tretím alebo ďalším ľudským EST.

Keďže uvedené ľudské ESTs boli teraz identifikované ako fragmenty ľudského Nogo génu vďaka klonovaniu hovädzích a potkaních Nogo nukleových kyselín, predpokladá sa, že ľudské ESTs majú podobné funkcie ako iné Nogo nukleokyselinové molekuly v rôznych spôsoboch podľa vynálezu, ako napríklad, ale bez obmedzenia pri expresii ľudských Nogo polypeptidov, pri hybridizačných testoch a pri inhibícii Nogo expresie ako antisense nukleokyselinové molekuly atď.

Okrem toho predložený vynález poskytuje a zahŕňa predpokladané amino-kyselinové sekvencie ľudského Nogo proteínu a jeho fragmentov. Ako je znázornené na obrázku 13, aminokyselinová sekvencia potkanieho Nogo proteínu (obrázok 2a; SEQ ID NO:2) je zosúladená s predpokladanou aminokyselinovou sekvenciou ľudského Nogo proteínu (obrázok 13; SEQ ID NO:29). Z toho vyplýva, že vynález zahŕňa ľudské Nogo proteíny obsahujúce predpokladanú amino-kyselinovú sekvenciu ľudského Nogo, obrázok 13 a SEQ ID NO:29, alebo subsekvencie predpokladanej aminokyselinovej sekvencie ľudského Nogo, pozostávajúce z najmenej 6 aminokyselinových zvyškov, alebo jednu, alebo viac z nasledujúcich predpokladaných aminokyselinových sekvencií ľudských Nogo fragmentov: MEDLDQSPLVSSS (ľudský Nogo, zodpovedá aminokyselinám 1 až 13 v SEQ ID NO:43), KIMDLKEQPGNTISAG (ľudský Nogo zodpovedajúci amino-kyselinám 187 až 203 v SEQ ID NO:44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (ľudský Nogo zodpovedajúci aminokyselinám 340 až 358 v SEQ ID NO:45), GESLYPAAGLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSS (ľudský Nogo zodpovedajúci aminokyselinám 570 až 619 v SEQ ID NO:46). Do rozsahu vynálezu spadá prirodzene sa vyskytujúci ľudský Nogo a rekombinantný ľudský Nogo a ich fragmenty, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu v podstate rovnakú ako opísané aminokyselinové sekvencie, a ktoré sú schopné viazať sa protilátkou nasmerovanou proti Nogo proteínu.

Predložený vynález ďalej poskytuje nukleokyselinové molekuly, ktoré kódujú ľudský Nogo proteín majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate podobná s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obrázku 13 (obrázok 13; SEQ ID NO:29). V konkrétnych uskutočneniach sa berú do úvahy nukleokyselinové molekuly kódujúce fragmenty ľudského Nogo proteínu majúce aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je v podstate podobná s aminokyselinovou sekvenciou znázornenou na obrázku 13 (SEQ ID NO:29) s podmienkou, že takéto molekuly nukleových kyselín neobsahujú nukleotidovú sekvenciu uvedených ľudských ESTs.

Aminokyselinová sekvencia sa považuje za v podstate podobnú s predpokladanou aminokyselinovou sekvenciou ľudského Nogo proteínu, keď viac ako 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % alebo 97 % aminokyselinových zvyškov v dvoch molekulách je rovnakých, keď sa použije počítačový algoritmus, v ktorom sa uskutoční zosúladenie počítačovým homologickým programom známym v oblasti, napríklad použitím BLAST počítačového vyhľadávania (Altschul a ďalší, 1994, Náture Genet. 6:119-129).

Ako príklad, ale nie ako obmedzenie, zahŕňajú užitočné počítačové homológové programy nasledovné: Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul a ďalší, 1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410, „The BLAST Algorithm; Altschul a ďalší, 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402), heuristický vyhľadávací algoritmus navrhnutý na vyhľadávanie sekvenčnej podobnosti, ktorý pripisuje význam použitiu štatistických metód podľa Karlina a Altschula 1990, Proc. Naťl Acad. Sci. USA, 87:3364-68; 1993, Proc. Naťl Acad. Sci. USA 90:5873-77. Päť špecifických BLAST programov uskutočňuje nasledujúce úlohy:

(1) BLASTP program porovnáva zadanú sekvenciu s proteínovou sekvenčnou databázou.

(2) BLASTN program porovnáva zadanú nukleotidovú sekvenciu s nukleotidovou sekvenčnou databázou.

(3) BLASTX program porovnáva šesťrámcové konceptuálne translačné produkty zadanej nukleotidovej sekvencie (obe vlákna) s proteínovou sekvenčnou databázou.

(4) TBLASTN program porovnáva zadanú proteínovú sekvenciu s nukleotidovou databázou translatovanou do všetkých šiestich čítacích rámcov (obe vlákna).

(5) TBLASTX program porovnáva šesťrámcové translácie zadanej nukleotidovej sekvencie so šesťrámcovými transláciami nukleotidovej sekvenčnej databázy.

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že najmä TBLASTN program je užitočný na identifikáciu nukleových kyselín s požadovaným percentom zhody a BLASTP je užitočný najmä na identifikáciu aminokyselinových sekvencií s požadovaným percentom zhody.

Smith-Waterman (databáza: European Bioinformatics Inštitúte, wwwz.ebi.ac.uk/bic_sw/) (Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Biol., 147:195-197) je matematický rigorózny algoritmus na zoskupovania sekvencií.

FASTA (pozri Pearson a ďalší,1988, Proc. Naťl Acad. Sci. USA, 85:2444-2445) je heuristická aproximácia Smith-Watermanovho algoritmu. Všeobecnú diskusiu postupov a výhod BLAST, Smith-Waterman a FASTA algoritmov pozri v Nicholas a ďalší, 1998, „A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods“ (www.psc.edu) a tam citované publikácie.

Do rozsahu vynálezu spadajú použitia predpokladaných aminokyselinových sekvencií ľudského Nogo alebo nukleotidových sekvencií ľudských ESTs, vrátane degenerovaných sekvencií kódujúcich predpokladanú aminokyselinovú sekvenciu ľudského Nogo, na izoláciu alebo identifikáciu ľudského Nogo génu, jeho fragmentov, prirodzene sa vyskytujúcich mutantov a variantov. Takéto použitia, ktoré budú pre priemerného odborníka v oblasti známe, zahŕňajú, ale bez obmedzenia, použitie informácií na prípravu nukleokyselinových sond na skríning DNA knižnice, DNA amplifikáciu, genetický skríning ľudskej populácie a na prípravu syntetických peptidov na výrobu protilátok. Podrobný opis niektorých takýchto použití je poskytnutý v tomto opise v neskorších častiach.

Okrem toho sú poskytnuté nukleové kyseliny kódujúce deriváty a analógy Nogo proteinov a Nogo antisense nukleové kyseliny. Ako je zrejmé, tu používaný výraz „nukleová kyselina kódujúca fragment alebo časť Nogo proteínu“ musí byť braný sám osebe, ktorý znamená nukleovú kyselinu kódujúcu len uvedený fragment alebo časť Nogo proteínu, a nie iné následné časti Nogo proteínu, ako kontinuálnu sekvenciu. V tomto kontexte znamená časť jednu alebo viac aminokyselín.

Poskytnuté sú aj fragmenty Nogo nukleových kyselín obsahujúce oblasti konzervované v rámci (homologické s) iných Nogo nukleových kyselín z rovnakého druhu alebo z odlišných druhov. Nukleové kyseliny kódujúce jednu alebo viac Nogo domén sú poskytnuté na obrázku 2a, napríklad konzervatívna karboxykoncová doména potkanieho Nogo, ktorá má približne 180 aminokyselín a je kódovaná poslednými 540 nukleotidmi kódujúcej sekvencie pred stop kodónom. Poskytnuté sú aj nukleotidové a aminokyselinové sekvencie dvoch hydrofóbnych domén vnútri konzervatívnej domény na karboxy-konci, t. j. od aminokyseliny 988 po aminokyselinu 1023 a od aminokyseliny 1090 po aminokyselinu 1125 v potkaňom Nogo A. Poskytnuté sú aj nukleotidové a aminokyselinové sekvencie amino-koncovej kyslej domény potkanieho Nogo A, od zvyšku 31 po zvyšok 58.

Na uskutočňovanie funkčnej analýzy rôznych oblastí Nogo sa generovali a klonovali do expresného vektora technikami rekombinantnej DNA série delécií v Nogo géne a exprimovali sa ako fúzovaný proteín. Poskytnuté sú nukleové kyseliny, ktoré kódujú fragment Nogo proteínu, napr. nukleové kyseliny, ktoré kódujú aminokyselinové zvyšky 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 172-259, 722-974 alebo 975-1162 sekvencie SEQ ID NO:2 alebo ich kombinácie; a nukleové kyseliny, ktoré kódujú aminokyselinové zvyšky 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 a 940-1127 sekvencie SEQ ID NO:29, alebo ich kombinácie. Niektoré delečné konštrukty obsahujú skrátené časti Nogo a ďalšie nukleotidové sekvencie kódujúce hexahistitídový prívesok a/alebo T7 prívesok. Poskytnuté sú nukleové kyseliny kódujúce skrátené Nogo proteíny, ktorým chýbajú aminokyselinové zvyšky 172-259, aminokyselinové zvyšky 974-1162 alebo aminokyselinové zvyšky 172-259 a 974-1162 sekvencie SEQ ID NO:2, ale inak obsahujú zvyšnú sekvenciu SEQ ID NO:2; alebo aminokyselinové zvyšky 132-206, aminokyselinové zvyšky 939-1127, alebo aminokyselinové zvyšky 132-206 a 939-1127 sekvencie SEQ ID NO:29, ale inak obsahujú zvyšok sekvencie SEQ ID NO:29. Štruktúra príkladných delečných konštruktov je znázornená na obrázku 18. Keď sa zavedú do bunky, produkujú delečné konštrukty fragmenty alebo skrátenú časť (časti) Nogo. Biologické aktivity týchto mutantov boli testované v rôznych funkčných testoch, ako je opísané v tabuľke 2 v príkladovej časti 2.7.

Nasledujú konkrétne uskutočnenia klonovania Nogo génu, ktoré sú prezentované ako príklady, a nie ako obmedzenie:

Na expresné klonovanie (technika bežne známa v oblasti) sa skonštruuje metódami známymi v oblasti expresná knižnica. Napríklad sa izoluje mRNA (napr. ľudská), vytvorí sa cDNA a liguje sa do expresného vektora (napr. bakteriofágového derivátu) tak, aby bola schopná exprimovať sa v hostiteľskej bunke, do ktorej sa potom zavedie. Na selekciu exprimovaného Nogo produktu sa potom použijú rôzne skríningové testy. V jednom uskutočnení môžu byť na selekciu použité anti-Nogo protilátky.

V inom uskutočnení sa použije polymerázová reťazová reakcia (PCR) na amplifikáciu požadovanej sekvencie v genomickej alebo cDNA knižnici pred selekciou. Oligonukleotidové priméry predstavujúce známe Nogo sekvencie môžu byť použité ako priméry na PCR. Vo výhodnom uskutočnení predstavujú oligonukleotidové priméry aspoň časť Nogo konzervovaných segmentov so silnou homológiou medzi Nogo odlišných druhov. Syntetické oligonukleotidy môžu byť využívané ako priméry na amplifikáciu PCR sekvencií zo zdroja (RNA afebo DNA), výhodne z cDNA knižnice, o ktorý je potenicálny záujem. PCR sa môže uskutočňovať napr. použitím Perkin-Elmer Cetus termálneho cyklera a Taq polymerázy (Gene Amp™). DNA, ktorá sa má amplifikovať, môže zahŕňať mRNA alebo cDNA alebo genomickú DNA z akéhokoľvek eukaryotického druhu. Je možné zvoliť syntetizovanie niekoľkých rôznych degenerovaných primárov na použitie v PCR reakciách. Je možné aj meniť prísnosť hybridizačných podmienok použitých na primovanie PCR reakcií, aby sa umožnil vyšší alebo nižší stupeň nukleotidovej sekvenčnej podobnosti medzi známou Nogo nukleotidovou sekvenciou a nukleokyselinovým homológom, ktorý sa má izolovať. Málo prísne podmienky sú výhodné na medzidruhovú hybridizáciu. Na hybridizácie niektorých druhov sú výhodné mierne prísne podmienky.

Po úspešnej amplifikácii segmentu Nogo homológu môže byť tento segment molekulárne klonovaný a sekvenovaný a využitý ako sonda na izoláciu kompletnej cDNA alebo genomického klonu. Toto na druhej strane umožní determináciu úplnej nukleotidovej sekvencie génu, analýzu jeho expresie a produkciu zodpovedajúceho proteínového produktu na funkčnú analýzu, ako je opísané. Týmto spôsobom je možné identifikovať ďalšie gény kódujúce Nogo proteiny a Nogo analógy.

Uvedené metódy nie sú mienené ako obmedzenie nasledujúceho všeobecného opisu spôsobov, ktorými je možné získať klony Nogo.

Akákoľvek eukaryotická bunka môže potenciálne slúžiť ako zdroj nukleovej kyseliny na molekulárne klonovanie Nogo génu. Nukleokyselinové sekvencie kódujúce Nogo môžu byť izolované zo stavovca, cicavca, človeka, ošípanej, hlodavca, hovädzieho dobytka, mačky, vtáka, koňa, psa, ako aj ďalších primátov, hmyzu atď. DNA sa môže získať štandardnými postupmi známymi v oblasti z klonovanej DNA (napr. DNA „knižnice“), chemickou syntézou, cDNA klonovaním alebo klonovaním genomickej DNA, alebo jej fragmentov, purifikovaných z požadovanej bunky. (Pozri napríklad Sambrook a ďalší, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (vyd.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, UK. zv. I, II.). Klony odvodené od genomickej DNA môžu okrem kódujúcich oblastí obsahovať regulačné a intrónové DNA oblasti; klony odvodené od cDNA budú obsahovať len exónové sekvencie. Bez ohľadu na zdroj by sa mal gén molekulárne klonovať do vhodného vektora na pomnoženie génu.

Molekulárnym klonovaním génu z genomickej DNA sa generujú DNA fragmenty, z ktorých niektoré budú kódovať požadovaný gén. DNA sa môže poštiepiť v špecifických miestach použitím rôznych reštrikčných enzýmov. Alternatívne je možné použiť DNAázu v prítomnosti mangánu na fragmentáciu DNA, alebo DNA je možné fyzikálne postrihať, ako napríklad sonifíkáciou. Lineárne DNA fragmenty sa potom môžu rozdeliť podľa ich veľkosti štandardnými technikami, vrátane, ale bez obmedzenia, agarózovej a polyakrylamidovej gélovej elektroforézy a stĺpcovej chromatografie.

Po vygenerovaní DNA fragmentov je možné množstvom spôsobov uskutočniť identifikáciu špecifického DNA fragmentu, ktorý obsahuje požadovaný gén. Napríklad, ak je dostupné množstvo častí Nogo (z akéhokoľvek druhu) génu alebo jeho špecifickej RNA, alebo ich fragmentov (pozri príkladovú časť 1.1) a tieto je možné purifikovať a značiť, môžu byť generované DNA fragmenty skrmované prostredníctvom nukleokyselinovej hybridizácie so značenou sondou (Benton, W. a Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. a Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961). Hybridizovať budú tie fragmenty, ktoré sú podstatne homologické so sondou. Príslušný fragment je možné identifikovať aj štiepením (štiepeniami) reštrikčným enzýmom a porovnaním veľkostí fragmentov s veľkosťami očakávanými na základe známej reštrikčnej mapy, ak je dostupná. Ďalšia selekcia sa môže uskutočňovať na základe vlastností génu.

Alternatívne sa prítomnosť génu môže detekovať testami založenými na fyzikálnych, chemických alebo imunologických vlastnostiach jeho exprimovaného produktu. Napríklad, môžu byť selektované cDNA klony alebo DNA klony, ktoré hybridizujú selektívne so správnymi mRNAs, ktoré produkujú proteín, ktorý napr. má podobnú alebo identickú elektroforetickú migráciu, správanie pri izoelektrickej fokusácii, proteolytické štiepne mapy, post-translačné modifikácie, kyslé alebo bázické vlastnosti alebo antigénne vlastnosti známe pre Nogo. Dostupné sú protilátky proti Nogo, ako napríklad IN-1 a 1N-2 (US. patent č. 5684133), AS Bruna a AS 472. Príprava AS Bruna a AS 472 je opísaná v príkladovej časti 1.7. Nogo proteín je možné identifikovať naviazaním značenej protilátky na pravdepodobné Nogo syntetizujúce klony v postupoch ELISA (s enzýmom spojený imunoabsorpčný test) typu alebo Westem blotingom purifikovaného alebo celobunkového extraktu.

Nogo gén sa môže identifikovať aj mRNA selekciou prostredníctvom nukleokyselinovej hybridizácie nasledujúcej po in vitro translácii. V tomto postupe sa fragmenty používajú na izoláciu komplementárnych mRNAs hybridizáciou. Takéto DNA fragmenty môžu predstavovať dostupné, purifíkované Nogo DNA iných druhov (napr. myšacie, ľudské). Imunoprecipitačná analýza alebo funkčné testy (napr. agregačná schopnosť in vitro; väzba na receptor; pozri neskôr) in vitro translačných produktov izolovaných produktov izolovaných mRNAs identifikuje mRNA, a tým komplementárne DNA fragmenty, ktoré obsahujú požadované sekvencie. Okrem toho je možné selektovať špecifické mRNAs adsorpciou polyzómov izolovaných z buniek na imobilizované protilátky špecificky nasmerované proti Nogo proteínu. Rádioaktívne značená Nogo cDNA sa môže syntetizovať použitím vybranej mRNA (z adsorbovaných polyzómov) ako templátu. Rádioaktívne značená mRNA alebo cDNA sa potom môže použiť ako sonda na identifikáciu Nogo DNA fragmentov medzi inými genomickými DNA fragmentmi.

Alternatívy k izolácii Nogo genomickej DNA zahŕňajú, ale nie sú obmedzené, na chemické syntetizovanie samotnej génovej sekvencie zo známej sekvencie alebo vyrábanie cDNA k mRNA, ktorá kóduje Nogo proteín. Napríklad, RNA pre cDNA kódujúcu Nogo gén môže byť izolovaná z buniek, ktoré exprimujú Nogo. Možné sú aj iné spôsoby a tieto spadajú do rozsahu vynálezu.

Identifikovaný a izolovaný gén sa potom môže začleniť do vhodného klonovacieho vektora. V oblasti je známe a môže byť použité veľké množstvo systémov vektor-hostiteľ. Možné vektory zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na plazmidy alebo modifikované vírusy, ale vektorový systém musí byť kompatibilný s použitým hostiteľom. Takéto vektory zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na bakteriofágy, ako napríklad deriváty lambda fága, alebo plazmidy, ako napríklad pBR322, alebo deriváty pUC plazmidu alebo Bluescript vektor (Stratagene). V konkrétnom príklade sa Nogo klonuje do pcDNA3 s epitopovými príveskami na uľahčenie analýzy expresie proteínu (príkladová časť 1.10).

Inzercia do klonovacieho vektora sa môže uskutočniť napríklad ligáciou DNA fragmentu do klonovacieho vektora, ktorý má komplementárne kohézne konce. Ale, keď sa v klonovacom vektore nenachádzajú komplementárne reštrikčné miesta použité na fragmentáciu DNA, je možné konce DNA molekúl enzymaticky modifikovať. Alternatívne môže byť vyprodukované akékoľvek požadované miesto ligáciou nukleotidových sekvencií (linkerov) na DNA konce; tieto ligované linkery môžu obsahovať špecifické chemicky syntetizované oligonukleotidy kódujúce sekvencie rozoznávané reštrikčnými endonukleázami. V alternatívnom spôsobe môžu byť poštiepený vektor a Nogo gén modifikované pridaním homopolymérneho chvosta. Rekombinantné molekuly môžu byť zavedené do hostiteľských buniek transformáciou, transfekciou, infekciou, elektroporáciou atď., tak, aby sa generovalo veľa kópií génovej sekvencie.

V alternatívnom spôsobe sa požadovaný gén môže identifikovať a izolovať po zavedení do vhodného klonovacieho vektora „shot gun“ prístupom. Pred zavedením do klonovacieho vektora sa môže uskutočniť obohatenie o požadovaný gén, napríklad veľkostnou frakcionalizáciou.

V konkrétnych uskutočneniach umožňuje transformácia hostiteľských buniek s rekombinantnými DNA molekulami, ktoré obsahujú izolovaný Nogo gén, cDNA alebo syntetizovanú DNA sekvenciu, generovanie množstva kópií génu. Takže je možné získať gén vo veľkých množstvách pestovaním transformantov, izolovaním rekombinantných DNA molekúl z transformantov, a ak je to nevyhnutné, vybraním začleneného génu z izolovanej rekombinantnej DNA.

Nogo sekvencie poskytnuté predloženým vynálezom zahŕňajú tie nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú v podstate rovnaké aminokyselinové sekvencie, ako sú sekvencie nachádzajúce sa v prirodzených Nogo proteínoch, a tie sekvencie, ktoré kódujú iné Nogo deriváty alebo analógy, ako je opísané v príkladových častiach 2.1. a 2.2 pre Nogo deriváty a analógy.

Expresia Nogo génov

Nukleotidová sekvencia kódujúca Nogo proteín alebo jeho funkčne aktívny analóg alebo fragment, alebo iný derivát (pozri obrázky lb a 2a; príkladové časti 2.1 a 2.2) sa môže začleniť do príslušného expresného vektora, vektora, ktorý obsahuje nevyhnutné elementy na transkripciu a transláciu začlenenej proteín-kódujúcej sekvencie. Nevyhnutné transkripčné a translačné signály môžu byť poskytnuté aj prirodzeným Nogo génom a/alebo jeho ohraničujúcimi oblasťami. Kódujúca sekvencia môže tiež byť na konci spojená so sekvenciou, ktorá kóduje dobre opísaný antigén alebo biologickú molekulu, ktorá má známe väzobné vlastnosti proti väzobnému partnerovi (napr. myc epitopový prívesok, histidínový prívesok, T7 epitopový prívesok atď., pozri príkladovú časť 2.6 a obrázky 1 la až 1 lc). Táto ďalšia sekvencia sa potom môže využiť na purifikáciu Nogo proteínu, proteínového fragmentu alebo derivátu použitím interakcie väzobnej skupiny s jej zodpovedajúcim partnerom, ktorý je pripojený na tuhú matricu.

Na expresiu proteín-kódujúcej sekvencie môžu byť využité rôzne systémy hostiteľ-vektor. Tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na cicavčie bunkové systémy infikované vírusom (napr. vakcinia vírusom, adenovírusom atď.); hmyzie bunkové systémy infikované vírusom (napr. bakulovírusom); mikroorganizmy, ako napríklad kvasinky obsahujúce kvasinkové vektory, alebo baktérie transformované bakteriofágovou DNA, plazmidovou DNA alebo kozmidovou DNA. Expresné elementy vektorov sú rôzne, čo sa týka ich sily a špecificity. V závislosti od využívaného systému hostiteľ-vektor, môže byť použitý akýkoľvek z množstva vhodných transkripčných a translačných elementov. V konkrétnych uskutočneniach sa exprimuje ľudský Nogo gén alebo sekvencia kódujúca funkčne aktívnu časť ľudského Nogo, ako konkrétny príklad sa exprimuje buď Nogo

A, alebo Nogo B, alebo Nogo C (obrázok lb). V ešte inom uskutočnení sa exprimuje fragment Nogo obsahujúci doménu Nogo proteínu.

Tak ako sa používa tu, bunka je „transformovaná“ nukleovou kyselinou, keď takáto bunka obsahuje nukleovú kyselinu, ktorá sa prirodzene v bunke nevyskytuje, po zavedení nukleovej kyseliny do bunky alebo jej predka, napr. transfekciou, elektroporáciou, transdukciou atď.

Poskytnuté sú aj nukleotidové sekvencie kódujúce fragmenty ľudského Nogo A obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny, ktorá obsahuje aminokyselinové zvyšky 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 a 940-1127 sekvencie SEQ ID NO:29. Poskytnuté sú aj nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú skrátené časti ľudského Nogo A; skráteným proteínom chýbajú aminokyselinové zvyšky 132-206, aminokyselinové zvyšky 939-1127 alebo aminokyselinové zvyšky 132-206 a 939-1127 sekvencie SEQ ID NO:29, ale inak obsahujú zvyšok sekvencie SEQ ID NO:29.

Akýkoľvek z opísaných spôsobov na zavedenie DNA fragmentov do vektora môže byť použitý na konštrukciu expresných vektorov obsahujúcich chimérny gén, ktorý pozostáva z príslušných transkripčných/translačných riadiacich signálov a proteín-kódujúcej sekvencie. Tieto spôsoby môžu zahŕňať in vitro rekombinantné DNA techniky a syntetické techniky a in vivo rekombinanty (genetickú rekombináciu). Expresia nukleokyselinovej sekvencie kódujúcej Nogo protein alebo peptidový fragment sa môže regulovať druhou nukleokyselinovou sekvenciu tak, aby sa Nogo protein alebo peptid exprimoval v hostiteľovi transformovanom rekombinantnou DNA molekulou. Napríklad, expresia Nogo proteínu sa môže riadiť akýmkoľvek promótorovým/zosiľovacím elementom známym v oblasti. Príkladným uskutočnením je použitie jedného z Nogo prirodzených promótorov, buď Pl, alebo P2, čo je diskutované v príkladovej časti 2.1. Použiť sa môže aj neprirodzený promótor. Promótory, ktoré môžu byť použité na riadenie Nogo expresie zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na SV40 skorú promótorovú oblasť (Bemoist a Chambon, 1981, Náture, 290:304-310), promótor obsahujúci 3’ dlhé koncové opakovanie vírusu Rousovho sarkómu (Yamamoto a ďalší, Celí 22:787-797), promótor herpesovej tymidín kinázy (Wagner a ďalší, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1441-1445), regulačné sekvencie metalotioneínového génu (Brinster a ďalší, 1982, Náture 296:39-42; promótory prokaryotických expresných vektorov ako napríklad β-laktamázový promótor (Villa-Kamaroff a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3727-3731) alebo tac promótor (DeBoer, a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25); pozri aj „Useful proteins fŕom recombinant bacteria“ v Scientific Američan, 1980, 242:74-94; rastlinné expresné vektory obsahujúce promótorovú oblasť nopalín syntetázy (Herrera-Estrella a ďašli, Náture 303:209-213) alebo 35S RNA promótor vírusu mozaiky karfiolu (Gardner a ďalší, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) a promótor fotosyntetického enzýmu ribulóza bifosfát karboxylázy (Herrere-Estrella a ďalší,

1984, Náture 310:115-120); promótorové elementy z kasiniek alebo iných húb, ako napríklad Gal 4 promótor, ADC (alkoholdehydrogenázový) promótor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promótor, promótor alkalickej fosfatázy a nasledujúce živočíšne transkripčné riadiace oblasti, ktoré majú tkanivovú špecificitu a boli použité v transgénnych zvieratách: riadiaca oblasť génu pre elastázu I, ktorá je aktívna v bunkách pankreatickej žľazy (Swift a ďalší, 1984, Celí 38:639-646; Omitz a ďalší, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-525); riadiaca oblasť inzulínového génu, ktorá je aktívna v pankreatických beta bunkách (Hanahan, 1985, Náture 315:115-122), riadiaca oblasť imunoglobulínového génu, ktorá je aktívna v lymfoidných bunkách (Grosschedl a ďalší, 1984, Celí 38:647-658; Adames a ďalší,

1985, Náture 318:533-538; Alexander a ďalší, 1987, Mol.Celí. Biol. 7:1436-1444), riadiaca oblasť vírusu spôsobujúceho nádor mliečnej žľazy myší, ktorá je aktívna v semeníkových, prsných, lymfoidných bunkách a mastocytoch (Leder a ďalší, 1986, Celí 45:485-495), riadiaca oblasť albumínového génu, ktorá je aktívna v pečeni (Pinkert a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1:268-276), riadiaca oblasť génu pre alfa-fe-toproteín, ktorá je aktívna v pečeni (Krumlauf a ďalší, 1985, Mol. Celí. Biol. 5:1639-1648; Hammer a ďalší, 1987, Science 235:53-58); riadiaca oblasť pre gén alfa l-antitrypsínu, ktorá je aktívna v pečeni (Kelsey a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1:161-171), riadiaca oblasť beta-globínového génu, ktorá je aktívna v myeloidných bunkách (Mogram a ďalší, 1985, Náture 315:338-340; Kollias a ďalší, 1986, Celí 46:89-94); riadiaca oblasť myelínového základného proteínu, ktorá je aktívna v oligodendrocytových bunkách v mozgu (Readhead a ďalší, 1987, Celí 48:703-712); riadiaca oblasť myozínového ľahkého reťazca-2, ktorá je aktívna v kostrových svaloch (Sani, 1985, Náture 314:283-286) a riadiaca oblasť génu na vylučovanie gonadotropného hormónu, ktorá je aktívna v hypotalame (Mason a ďalší, 1986, Science 234:1372-1378).

V konkrétnom uskutočnení je použitý vektor, ktorý obsahuje promótor operabilne spojený s Nogo-kódujúcou nukleovou kyselinou, jeden alebo viac počiatkov replikácie a voliteľne jeden alebo viac selektovateľných markerov (napr. gén antibiotikovej rezistencie).

V konkrétnom uskutočnení je možné vytvoriť expresný konštrukt subklonovaním Nogo kódujúcej sekvencie do EcoRI reštrikčného miesta každého z troch pGEX vektorov (Glutatión S-Transferázové expresné vektory; Smith a Johnson, 1988, Gene 7:31-40). To umožňuje expresiu Nogo proteínového produktu zo subklonu v správnom čítacom rámci.

Expresné vektory obsahujúce Nogo génové inzerty sa môžu identifikovať troma všeobecnými prístupmi: (a) nukleokyselinovou hybridizáciou, (b) prítomnosťou alebo absenciou funkcií „markerového“ génu a (c) expresiou začlenených sekvencii. V prvom prístupe sa prítomnosť Nogo génu začleneného do expresného vektora môže detegovať nukleovokyselinovou hybridizáciou použitím sond, ktoré obsahujú sekvencie homologické so začleneným Nogo génom. V druhom prístupe je možné identifikovať a selektovať systém rekombinantný vektor-hostiteľ na základe prítomnosti alebo neprítomnosti určitých „markerových“ génových funkcií (napr. tymidín kinázovej aktivity, rezistencie na antibiotiká, na základe transformačného fenotypu, vytvárania oklúznych teliesok v bakulovíruse atď.), ktoré sú spôsobené začlenením Nogo génu do vektora. Napríklad, ak sa Nogo gén začlení do sekvencie markerového génu vo vektore, rekombinanty obsahujúce Nogo inzert je možné identifikovať absenciou markerovej génovej funkcie. V treťom prístupe sa môžu rekombinantné expresné vektory identifikovať testovaním Nogo produktu exprimovaného rekombinantom. Takéto testy môžu byť založené napríklad na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach Nogo proteínu v in vitro testovacích systémoch, napr. viazanie anti-Nogo protilátkou.

Keď sa konkrétna rekombinantná DNA molekula identifikuje a izoluje, na jej šírenie je možné použiť niekoľko metód známych v oblasti. Keď sa ustanoví vhodný hostiteľský systém a rastové podmienky, je možné množiť rekombinantné expresné vektory a pripraviť ich vo veľkom množstve. Ako bolo vysvetlené, expresné vektory, ktoré môžu byť použité, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na nasledujúce vektory alebo ich deriváty: ľudské alebo živočíšne vírusy, ako napríklad vakcinia vírus alebo adenovírus; hmyzie vírusy, ako napríklad bakulovírus; kvasinkové vektory; bakteriofágové vektory (napr. lambda) a plazmidové a kozmidové DNA vektory, pričom vymenovaných bolo len niekoľko.

Okrem toho môže byť zvolený hostiteľský bunkový kmeň, ktorý moduluje expresiu včlenených sekvencii alebo modifikuje a spracováva génový produkt požadovaným špecifickým spôsobom. Expresia z určitých promótorov môže byť zvýšená v prítomnosti určitých induktorov; takže je možné kontrolovať expresiu geneticky skonštruovaného Nogo proteínu. Navyše, odlišné hostiteľské bunky majú charakteristické a špecifické mechanizmy na translačné a post-translačné spracovávanie a modifikáciu (napr. glykozyláciu, fosforyláciu proteínov). Je možné zvoliť vhodné bunkové línie alebo hostiteľské systémy na zabezpečenie požadovanej modifikácie a spracovania cudzieho proteínu, ktorý sa exprimuje. Napríklad, expresia v bakteriálnom systéme môže byť použitá na produkciu neglykozylovaného jadrového proteínového produktu. Expresia v kvasinkách vyprodukuje glykozylovaný produkt. Expresia v cicavčích bunkách môže byť použitá na zaistenie „prirodzenej“ glykozylácie heterológneho proteínu. Navyše rôzne expresné systémy vektor/hostiteľ môžu ovplyvňovať spracovávacie reakcie v rozličnej miere.

V iných konkrétnych uskutočneniach môže byť Nogo proteín, fragment, analóg alebo derivát exprimovaný ako fúzia alebo ako chimémy proteínový produkt (obsahujúci proteín, fragment, analóg alebo derivát spojený peptidovou väzbou s heterológnou proteínovou sekvenciou (odlišným proteínom)). Takýto chimémy produkt je možné vytvoriť vzájomnou ligáciou vhodných nukleokyselinových sekvencii, ktoré kódujú požadované aminokyselinové sekvencie, v oblasti známymi spôsobmi, v správnom čítacom rámci, a expresiou chimémeho produktu spôsobmi bežne známymi v oblasti. Alternatívne je takýto chimémy produkt možné vytvoriť proteínovými syntetickými technikami, napr. použitím peptidového syntetizéra.

Klonované a exprimované môžu byť tak cDNA, ako aj genomické sekvencie.

Identifikácia a purifikácia Nogo génových produktov

V konkrétnych uskutočneniach vynález poskytuje aminokyselinové sekvencie Nogo, výhodne ľudského Nogo, a jeho fragmentov a derivátov, ktoré obsahujú antigénový determinant (t. j. môžu byť rozoznávané protilátkou), alebo ktoré sú inak funkčne aktívne, ako aj ich kódujúce nukleokyselinové sekvencie. Tak ako je používaný tu, znamená „funkčne aktívny“ Nogo materiál materiál majúci jednu alebo viac funkčných aktivít, o ktorých je známe, že sú asociované s Nogo A proteínom s úplnou dĺžkou (divým typom), napr. nepermisívne substrátové vlastnosti, kolaps rastu vrcholov dorzálnych koreňových ganglií, inhibícia šírenia NIH 3T3, inhibícia vyrastania neuritov, viazanie sa na Nogo substrát alebo Nogo väzobného partnera, antigenicita (viazanie sa na anti-Nogo protilátku), imuno-genicita atď.

V konkrétnych uskutočneniach vynález poskytuje fragmenty Nogo proteínu pozostávajúce z najmenej 6 aminokyselín, 10 aminokyselín, 17 aminokyselín, 50 aminokyselín, 100 aminokyselín alebo z najmenej 220 aminokyselín. V iných uskutočneniach proteíny obsahujú alebo pozostávajú z podstate vysoko konzervatívnej Nogo karboxy-koncovej domény (karboxy-koncových 188 aminokyselín Nogo A). Poskytnuté sú aj fragmenty alebo proteíny obsahujúce fragmenty, ktorým chýba konzervatívna karboxy-koncová doména, alebo hydrofóbne karboxy-koncové vlákna alebo amino-koncová kyslá doména, alebo amino-koncová polyprolínová oblasť, alebo akákoľvek ich kombinácia, Nogo proteínu. Poskytnuté sú nukleové kyseliny kódujúce uvedené sekvencie.

Keď sa identifikuje rekombinant, ktorý exprimuje Nogo génovú sekvenciu, je možné analyzovať génový produkt. To sa dosahuje testami založenými na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach produktu, vrátane rádioaktívneho značenia produktu, po ktorom nasleduje analýza gélovou elektroforézou, imunologickým testovaním atď.

Keď sa identifikuje Nogo proteín, môže sa izolovať a purifikovať štandardnými metódami vrátane chromatografie (napr. iónovej výmennej, afmitnej chromatografie a chromatografie na kolóne rozdeľujúcej podľa veľkosti), centrifugácie, rozdielnej rozpustnosti alebo akoukoľvek inou štandardnou technikou na purifikáciu proteínov. Funkčné vlastnosti môžu byť zhodnotené použitím akéhokoľvek vhodného testu vrátane testovania kolapsu rastu vrcholov dorzálnych koreňových ganglií, inhibície šírenia NIH 3T3, inhibície regenerácie neuritov v očných nervoch (pozri príkladové časti 2.4. až 2.5).

Alternatívne, keď sa identifikuje Nogo proteín vyprodukovaný rekombinantom, je možné odvodiť aminokyselinovú sekvenciu proteínu z nukleotidovej sekvencie chimémeho génu nachádzajúceho sa v rekombinante. Ako výsledok môže byť proteín syntetizovaný štandardnými chemickými metódami známymi v oblasti (napr. pozri Hunkapiller, M., a ďalší, 1984, Náture 310:105-111).

V inom alternatívnom uskutočnení sa prirodzený Nogo C môže purifikovať z prirodzených zdrojov štandardnými metódami, ktoré sú opísané napríklad skôr (napr. imunoafinitná purifíkácia).

V konkrétnom uskutočnení podľa predloženého vynálezu takéto Nogo proteíny, či už produkované technikami rekombinantnej DNA, alebo metódami chemickej syntézy, alebo purifikáciou prirodzených proteinov, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na proteíny obsahujúce ako primárnu aminokyselinovú sekvenciu, celú alebo časť aminokyselinovej sekvencie v podstate znázornenej na obrázku 2a (SEQ ID NO:2), hovädzej sekvencie na obrázku 12 (SEQ ID NO:24) alebo ľudskej sekvencie na obrázku 13 (SEQ ID NO:29), ako aj ich fragmenty a iné deriváty (ako napríklad, ale bez obmedzenia tie, ktoré sú znázornené na obrázku 18), a ich analógy, vrátane proteínov, ktoré sú s nimi homologické. Výhodne sú Nogo proteíny podľa vynálezu bez akéhokoľvek CNS myelínového materiálu, s ktorým sú normálne asociované.

Štruktúra Nogo génu a proteínu

Štruktúru Nogo génu a proteínu je možné analyzovať rôznymi metódami známymi v oblasti a niekoľko z týchto metód je opísaných v ďalších častiach.

Genetická analýza

Klonovanú DNA alebo cDNA zodpovedajúcu Nogo génu je možné analyzovať spôsobmi, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na Southem hybridizáciu (Southem, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517), Northem hybridizáciu (pozri napr. Freeman a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4094-4098), mapovanie reštrikčnými endonukleázami (Maniatis, T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) a DNA sekvenčnú analýzu. Polymerázová reťazová reakcia (PCR; US patenty č. 4683202, 4683195 a 4889818; Gyllenstein a ďalší, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:7652-7656; Ochman a ďalší, 1988, Genetics 120:621-623; Loh a ďalší, 1989, Science 243:217-220), po ktorej nasleduje Southem hybridizácia s /Vogo-špecifickou sondou, môže umožniť detekciu Nogo génu v DNA z rôznych typov buniek. Známe sú bežne aj iné spôsoby amplifikácie ako PCR a môžu byť využité. V jednom uskutočnení sa Southem hybridizácia môže použiť na stanovenie genetickej väzby Nogo. Northem hybridizačná analýza môže byť použitá na stanovenie expresie Nogo génu. Nogo expresiu je možné testovať v rôznych typoch buniek, v rôznych štádiách vývoja alebo aktivity. Prísnosť hybridizačných podmienok, tak pri Sourthem, ako aj pri Northem hybridizácii, sa môže upravovať, aby sa zaistila detekcia nukleových kyselín s požadovaným stupňom príbuznosti s použitou špecifickou Nogo sondou. Je možné použiť modifikácie týchto spôsobov a iné spôsoby, ktoré sú bežne známe v oblasti.

Na hrubé stanovenie genetickej štruktúry Nogo génu môže byť použité mapovanie reštrikčnými endonukleázami. Reštrikčné mapy vytvorené na základe štiepenia reštrikčnými endonukleázami sa môžu overiť DNA sekvenčnou analýzou.

DNA sekvenčná analýza sa môže uskutočňovať akoukoľvek technikou známou v oblasti, vrátane, ale bez obmedzenia spôsobu podľa Maxama a Gilberta (1980, Meth. Enzymol 65:499-560), Sangerovej dideoxy metódy (Sanger, F., a ďalší, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463), použitia T7 DNA polymerázy (Tábor a Richardson, US patent č. 4795699) alebo použitím automatického DNA sekvenátora (napr. Applied Biosystems, Foster City, CA).

Proteínová analýza

Aminokyselinová sekvencia Nogo proteínu sa môže odvodiť dedukciou z DNA sekvencie alebo, alternatívne, priamym sekvenovaním proteínu, napr. automatickým aminokyselinovým sekvenátorom.

Nogo proteínová sekvencia sa môže ďalej charakterizovať analýzou hydrofilnosti (Hopp, T. a Woods, K., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3824). Profil hydrofilnosti sa môže použiť na identifikáciu hydrofóbnych a hydrofilných oblastí Nogo proteínu a zodpovedajúcich oblastí génovej sekvencie, ktorá kóduje takéto oblasti.

Za druhé je možné uskutočniť aj štrukturálnu analýzu (Chou, P. a Fasman, G., 1974, Biochemistry 13:222) na identifikáciu oblastí Nogo, v ktorých sa predpokladajú špecifické sekundárne štruktúry.

Použitím počítačových softvérových programov dostupných v oblasti je možné uskutočniť aj manipuláciu, transláciu a predpovedanie sekundárnej štruktúry, predpovedanie a znázornenie otvorených čítacích rámcov, ako aj determináciu sekvenčných homológií.

Využité môžu byť aj iné spôsoby štrukturálnej analýzy. Tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na rôntgenovú kryštalografiu (Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11:7-13) a počítačové modelovanie (Fletterick, R. a Zoller, M. (vyd.), 1986, Computer Graphics and Molecular Modeling, v Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Generovanie protilátok proti Nogo proteínom a ich derivátom

Podľa vynálezu môže byť Nogo proteín, jeho fragmenty alebo iné deriváty alebo analógy použité ako imunogén na generovanie protilátok, ktoré imuno-špecificky viažu takýto imunogén. Takéto protilátky zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na polyklonálne, monoklonálne, chimérne, jednoreťazcové protilátky, Fab fragmenty a Fab expresnú knižnicu. Produkované sú protilátky nasmerované proti rekombinantnému fragmentu potkanieho a hovädzieho Nogo (príkladová časť 1.7). Tieto protilátky krížovo reagujú aj s epitopmi iných druhov. V inom uskutočnení sú na produkciu protilátok použité ako imunogény fragmenty Nogo proteínu identifikované ako hydrofilné.

Rôzne postupy známe v oblasti môžu byť použité na produkciu polyklonálnych protilátok proti Nogo proteínu alebo derivátu, alebo analógu. V konkrétnom uskutočnení je možné získať králičie polyklonálne protilátky proti epitopu Nogo proteínu kódovanému sekvenciou SEQ ID NO:2 na obrázku 2a, SEQ ID NO:24 na obrázku 12, SEQ ID NO:32 na obrázku 14 alebo SEQ ID NO:29 na obrázku 13 (sekvencie zodpovedajúce v uvedenom poradí potkaniemu Nogo A, hovädziemu Nogo, potkaniemu Nogo C a ľudskému Nogo) alebo ich subsekvenciami. Na produkciu protilátky je možné imunizovať rôzne hostiteľské zvieratá injekčným podaním prirodzeného Nogo proteínu alebo jeho syntetickej verzie alebo derivátu (napr. fragmentu), vrátane, ale bez obmedzenia na králiky, myši, potkany atď. Na zvýšenie imunologickej odozvy je možné použiť rôzne adjuvans, v závislosti od hostiteľského druhu, a vrátane, ale bez obmedzenia na Freudovo adjuvans (kompletné alebo nekompletné), minerálne gély, ako napríklad hydroxid hlinitý, povrchovo aktívne látky, ako napríklad lyzolecitín, plurónové polyoly, polyanióny, peptidy, olejové emulzie, hemocyanín zo svätojánskej mušky, dinitrofenol a potencionálne užitočné ľudské adjuvans, ako napríklad BCG (Bacil Calmet-Guerin) a Corynebacterium parvum.

Na prípravu monoklonálnych protilátok nasmerovaných proti Nogo proteínovej sekvencii alebo proti jej analógu môže byť použitá akákoľvek technika, ktorá poskytuje produkciu protilátkových molekúl kontinuálnymi bunkovými líniami v kultúre. Napríklad, hybridómová technika pôvodne vyvinutá Kohlerom a Milsteinom (1975, Náture 256:495-497), ako aj triómová technika, ľudská B-bunková hybridómová technika (Rozbor a ďalší, 1983, Immunology Today 4:72) a EBV-hybridómová technika na produkciu ľudských monoklonálnych protilátok (Cóle a ďalší, 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str. 77-96). Monoklonálne protilátky môžu byť produkované v živočíchoch bez zárodočných buniek využívajúc súčasnú technológiu (PCR/US90/02545). Podľa vynálezu môžu byť ľudské protilátky použité a získané použitím ľudských hybridómov (Cote a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:2026-2030) alebo transformovaním ľudských B buniek EBV vírusom in vitro (Cóle a ďalší, 1985, v Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77-96). V skutočnosti môžu byť podľa vynálezu použité techniky vyvinuté na produkciu „chimémych protilátok“ (Morrison a ďalší, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855; Neuberger a ďalší, 1984, Náture 312:604-608; Takeda a ďalší, 1985, Náture 314:452-454) zostrihávaním génov z myšacej protilátkovej molekuly špecifickej pre Nogo spolu s génmi z ľudskej protilátkovej molekuly s príslušnou biologickou aktivitou; takéto protilátky spadajú do rozsahu tohto vynálezu.

Podľa vynálezu môžu byť na produkciu Nogo-špecifických jednoreťazcových protilátok adaptované techniky opísané na produkciu jednoreťazcových protilátok (US patent č. 4946778). Techniky opísané na konštrukciu Fab expresných knižníc môžu byť tiež využité (Huse a ďalší, 1989, Science 246:1275-1281) na umožnenie rýchlej a jednoduchej identifikácie monoklonálnych Fab fragmentov s požadovanou špecificitou proti Nogo proteínom, derivátom alebo analógom.

Známymi technikami môžu byť generované protilátkové fragmenty, ktoré obsahujú idiotyp molekuly. Takéto fragmenty zahŕňajú, ale nie sú obmedzené napríklad na: F(ab’)₂ fragment, ktorý sa môže vyprodukovať pepsínovým štiepením protilátkovej molekuly; Fab' fragmenty, ktoré sa môžu generovať redukovaním disulfidových mostíkov F(ab’)₂ fragmentu, Fab fragmenty, ktoré sa môžu generovať ošetrením protilátkovej molekuly papaínom a redukčným činidlom, a Fv fragmenty.

Pri produkcii protilátok sa skríning na požadovanú protilátku môže uskutočňovať technikami známymi v oblasti, napr. ELISA (s enzýmom spojený imuno-absorpčný test). Napríklad, na selekciu protilátok, ktoré rozoznávajú špecifickú doménu Nogo proteínu sa môžu testovať generované hybridómy na produkt, ktorý sa viaže na Nogo fragment obsahujúci takúto doménu. Na selekciu protilátky, ktorá sa špecificky viaže na prvý Nogo homológ, ale ktorá sa neviaže špecificky na odlišný Nogo homológ, sa môže selektovať na základe pozitívneho viazania na prvý Nogo homológ a neviazania na drahý Nogo homológ.

Poskytnuté sú aj protilátky špecifické proti doméne Nogo proteínu.

Predchádzajúce protilátky môžu byť použité v spôsoboch známych v oblasti týkajúcej sa lokalizácie a aktivity Nogo proteínových sekvencii podľa vynálezu, napr. na zobrazenie týchto proteínov, meranie ich hladín v príslušných fyziologických vzorkách, v diagnostických metódach atď.

Anti-Nogo protilátky a ich fragmetny obsahujúce väzobnú doménu sú terapeutickými činidlami.

Nogo proteíny, deriváty a analógy

Vynález sa ďalej týka Nogo proteínov a derivátov (vrátane, ale bez obmedzenia na fragmenty) a analógov Nogo proteínov. Poskytnuté sú aj nukleové kyseliny kódujúce Nogo proteínové deriváty a proteínové analógy. V jednom uskutočnení sú Nogo proteíny kódované opísaným Nogo nukleovými kyselinami. V konkrétnych uskutočneniach spadajú do rozsahu vynálezu Nogo A, Nogo B alebo Nogo C proteíny a deriváty alebo analógy zo živočíchov, napr. myši, potkana, ošípanej, kravy, psa, opice, človeka, muchy alebo žiab.

Do rozsahu predloženého vynálezu spadá aj produkcia a použitie derivátov a analógov týkajúcich sa Nogo. V konkrétnom uskutočnení je derivát alebo analóg funkčne aktívny, t. j. je schopný mať jednu alebo viac funkčných aktivít asociovaných s Nogo proteínom divého typu s úplnou dĺžkou. Ako jeden príklad, takéto deriváty alebo analógy, ktoré majú požadovanú imunogénnosť alebo antigénnosť, môžu byť použité napríklad v imunologických testoch, na imunizáciu, na inhibiciu Nogo aktivity atď. Deriváty alebo analógy, ktoré zachovávajú alebo, alternatívne, nemajú alebo inhibujú požadovanú Nogo vlastnosť, o ktorú je záujem (napr. viazanie Nogo väzobného partnera), môžu byť použité ako induktory, respektíve inhibítory takejto vlastnosti a jej fyziologických následkov. Špecifické uskutočnenie sa týka Nogo fragmentu, ktorý sa môže viazať antiNogo protilátkou. Deriváty alebo analógy Nogo sa môžu testovať z hľadiska požadovanej aktivity postupmi známymi v oblasti, vrátane, alebo bez obmedzenia na testy opísané v príkladových častiach 1.10 až 1.12.

Aby sa zmapovala aktívna oblasť (oblasti) Nogo, pripravili sa série Nogo delečných mutantov technikami rekombinantnej DNA, ako sú opísané v príkladovej časti 2.7. Časti Nogo, ktoré sa nachádzajú v delečných mutantoch, sú znázornené na obrázku 18. V konkrétnom uskutočnení vynález poskytuje fragmenty Nogo, napr. fragmenty obsahujúce (alebo, alternatívne pozostávajúce z) Nogo A (SEQ ID NO:2) aminokyseliny číslo 1-171, 172-974, 259-542, 542-722, 722-974, 172-259 alebo 975-1162, alebo ich kombinácie. Poskytnuté sú aj skrátené mutanty Nogo, v ktorých chýbajú aminokyseliny čísla 172-259 a/alebo 975-1162 sekvencie SEQ ID NO:2, keďže tieto oblasti sa nezdajú byť podstatnými a môžu byť z Nogo odstránené bez ovplyvnenia biologickej aktivity. Poskytnuté sú zodpovedajúce fragmenty ľudského Nogo A obsahujúce (alebo alternatívne pozostávajúce z) aminokyseliny číslo 1-131, 132-939, 206-501, 501-680, 132-206, 680-939 alebo 940-1127 sekvencie SEQ ID NO:29. Poskytnuté sú aj skrátené ľudské Nogo A, ktorým chýbajú aminokyseliny čísla 132-206, aminokyselinové zvyšky 939-1127 alebo aminokyselinové zvyšky 132-206 a 939-1127 sekvencie SEQ ID NO: 29.

V konkrétnom uskutočnení sú fragmenty bez akéhokoľvek CNS myelínového materiálu a/alebo majú inhibičný účinok Nogo. Poskytnuté sú aj fúzované proteíny obsahujúce jeden alebo viac uvedených fragmentov fuzovaných s inou ako Nogo sekvenciou.

Nogo génové deriváty môžu byť vyrobené menením Nogo sekvencii substitúciami, adíciami alebo deléciami, ktoré poskytujú funkčne ekvivalentné molekuly. V dôsledku degenerovanosti nukleotidových kódujúcich sekvencii, môžu byť na uskutočňovanie predloženého vynálezu použité iné DNA sekvencie, ktoré kódujú v podstate rovnakú aminokyselinovú sekvenciu ako Nogo gén. Tieto zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na nukleotidové sekvencie obsahujúce celé alebo časti Nogo génov, ktoré sú zmenené substitúciou odlišných kodónov kódujúcich funkčne ekvivalentné aminokyselinové zvyšky vnútri sekvencie, a tak vytvárajúce tichú zmenu. Podobne, Nogo deriváty podľa vynálezu zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na deriváty, ktoré ako primárnu aminokyselinovú sekvenciu obsahujú celú alebo časť aminokyselinovej sekvencie Nogo proteínu obsahujúcu zmenené sekvencie, v ktorých sú funkčne ekvivalentné aminokyselinové zvyšky substituované zvyškami vo vnútri sekvencie, ktoré vedú k tichej zmene. Napríklad, jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov v sekvencii môže byť konzervatívne substituovaných inou aminokyselinou s podobnou polaritou, ktorá slúžia ako funkčný ekvivalent, vedúci k tichej zmene. Substitujúce aminokyseliny vnútri sekvencie môžu byť vybrané z iných členov triedy, do ktorej patrí aminokyselina. Napríklad, nepoláme (hydrofóbne) aminokyseliny zahŕňajú alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryptofán a metionín. Poláme neutrálne aminokyseliny zahŕňajú glycín, serín, treonín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamín. Pozitívne nabité (bázické) aminokyseliny zahŕňajú arginín, lyzín a histidín. Negatívne nabité (kyslé) aminokyseliny zahŕňajú kyselinú asparágovú a kyselinu glutámovú.

Konkrétne uskutočnenie vynálezu poskytuje proteíny pozostávajúce z alebo obsahujúce Nogo proteín, ktorý pozostáva z najmenej 10 (po sebe idúcich) aminokyselín Nogo proteínu. V iných uskutočneniach fragment pozostáva z najmenej 17 až 50 aminokyselín Nogo proteínu. V konkrétnych uskutočneniach nie sú takéto fragmenty dlhšie ako 35, 100 alebo 200 aminokyselín. Deriváty alebo analógy Nogo zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na tie molekuly, ktoré obsahujú oblasti, ktoré sú v podstate homologické s Nogo alebo jeho fragmentmi (napr. v rôznych uskutočneniach najmenej 60 % alebo 70 %, alebo 80 %, alebo 90 %, alebo 95 % zhoda s aminokyselinovou sekvenciou s rovnakou veľkosťou alebo pri porovnávaní so zosúladenou sekvenciou, pričom zosúladenie sa uskutoční počítačovým homológovým programom známym v oblasti, napríklad BLAST počítačovým vyhľadávaním (Altschul a ďalší, 1994, Náture Genet. 6:119-129)), alebo ktorých kódujúca nukleová kyselina je schopná hybridizovať s kódujúcou Nogo sekvenciou v prísnych, miernych alebo neprísnych podmienkach.

Poskytnuté sú aj molekuly obsahujúce Nogo fragmenty, napr. obsahujúce uhľovodíkové väzby s inými časťami, vrátane značiek alebo biologicky aktívnych častí.

Nogo deriváty a analógy podľa vynálezu sa môžu produkovať rôznymi spôsobmi známymi v oblasti. Manipulácie, ktorých výsledkom je ich produkcia, môžu nastať na génovej alebo na proteínovej úrovni. Napríklad, klonovaná Nogo génová sekvencia môže byť modifikovaná ktoroukoľvek z mnohých stratégií známych v oblasti (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Sekvencia môže byť v príslušných miestach poštiepená reštrikčnou endonukleázou (reštrikčnými endonukleázami), po ktorých, ak je to želateľné, nasleduje ďalšia enzymatická modifikácia, môže sa izolovať a ligovať in vitro. Pri produkcii génu kódujúceho derivát alebo analóg Nogo by sa malo dbať o to, aby sa zaistilo, že modifikovaný gén ostane vnútri rovnakého translačného čítacieho rámca ako Nogo, neprerušený translačnými stop signálmi v oblasti génu, v ktorej je kódovaná požadovaná Nogo aktivita.

Okrem toho môže byť Nogo-kódujúca nukleokyselinová sekvencia mutovaná in vitro alebo in vivo, aby sa vytvorili a/alebo zrušili translačné, iniciačné a/alebo terminačné sekvencie, alebo aby sa vytvorili rôzne obmeny kódujúcich oblastí, a/alebo aby sa vytvorili nové miesta pre reštrikčné endonukleázy, alebo aby sa zrušili existujúce miesta pre reštrikčné endonukleázy, aby sa uľahčila ďalšia in vitro modifikácia. Použitá môže byť akákoľvek technika mutagenézy známa v oblasti, vrátane, ale bez obmedzenia na chemickú mutagenézu, in vitro miestne špecifickú mutagenézu (Hutchinson, C., a ďalší, 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), použitia TAB® linkerov (Pharmacia), atď.

Manipulácie Nogo sekvencie sa môžu uskutočniť aj na proteínovej úrovni. Do rozsahu vynálezu spadajú Nogo proteínové fragmenty alebo iné deriváty, alebo analógy, ktoré sú odlišne modifikované počas alebo po translácii, napr. glykozyláciou, acetyláciou, fosforyláciou, amidáciou, vytváraním derivátov známymi ochrannými/blokujúcimi skupinami, proteolytickým štiepením, pripojením na protilátkovú molekulu alebo na iný bunkový ligand atď. Akákoľvek z mnohých chemických modifikácii sa môže uskutočniť známymi technikami, vrátane, ale bez obmedzenia na špecifické chemické štiepenie kyanogénovým bromidom, trypsínom, chymotrypsínom, papaínom V8 proteázou, NaBH₄; acetylácie, formylácie oxidácie, redukcie; metabolickej syntézy v prítomnosti tunikamycínu atď.

Okrem toho sa môžu Nogo analógy alebo deriváty chemicky syntetizovať. Napríklad, peptid zodpovedajúci časti Nogo proteínu, ktorá obsahuje požadovanú doménu, alebo ktorá sprostredkúva požadovanú aktivitu in vitro, sa môže syntetizovať použitím peptidového syntezátora. Navyše, ak je to želateľné, môžu sa zaviesť neklasické aminokyseliny alebo chemické analógy aminokyselín ako substitúcie alebo adície do Nogo sekvencie. Neklasické aminokyseliny zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na D-izoméry bežných aminokyselín, kyselinu α-aminoizobutyrovú, kyselinu 4-aminobutyrovú, Abu, kyselinu 2-aminobutyrovú, γ-Abu, ε-Ahx, kyselinu 6-aminohexánovú, Aib, kyselinu 2-aminoizobutyrovú, kyselinu 3-aminopropiónovú, omitín, norleucín, norvalín, hydroxyprolín, sarkozín, citrulín, kyselinu cysteínovú, terc-butylglycín, terc-butylalanín, fenylglycín, cyklohexylalanín, β-alanín, fluóramínové kyseliny, skonštruované aminokyseliny, ako napríklad β-metyl aminokyseliny, Ccc-metyl aminokyseliny, Να-metyl aminokyseliny, a amino-kyselinové analógy vo všeobecnosti. Okrem toho môžu byť aminokyseliny D (pravotočivé) alebo L (ľavotočivé).

V konkrétnom uskutočnení je Nogo derivát chimémy alebo fúzovaný proteín obsahujúci Nogo proteín alebo jeho fragment (výhodne pozostávajúci najmenej z domény alebo motívu Nogo proteínu alebo najmenej 10 aminokyselín Nogo proteínu) spojený na svojom amino- alebo karboxy-konci prostredníctvom peptidovej väzby s aminokyselinovou sekvenciou odlišného proteínu. V jednom uskutočnení sa takýto chimémy proteín produkuje ako rekombinantná expresia nukleovej kyseliny kódujúcej proteín (obsahujúcej Nogo-kódujúcu sekvencie spojenú v čítacom rámci s kódujúcou sekvenciou odlišného proteínu). Takýto chimémy produkt sa môže vyrobiť vzájomnou ligáciou príslušných aminokyselinových sekvencií, ktoré kódujú želané aminokyselinové sekvencie, spôsobmi známymi v oblasti, v správnom kódujúcom rámci a exprimovaním chimémeho produktu spôsobmi bežne známymi v oblasti. Alternatívne sa takýto chimémy produkt môže vyrobiť proteínovými syntetickými technikami, napr. použitím peptidového syntezátora. Môžu byť skonštruované chimérne gény obsahujúce časti Nogo fúzované s akýmikoľvek heterológnymi sekvenciami kódujúcimi proteín. Takéto heterológne sekvencie kódujúce proteín zahŕňajú napríklad hexahistidínový prívesok a T7 prívesok. Špecifické uskutočnenie sa týka chimémeho proteínu obsahujúceho fragment Nogo s dĺžkou najmenej šesť aminokyselín.

V inom konkrétnom uskutočnení je Nogo derivát molekula, ktorá obsahuje oblasť homologickú s Nogo proteínom.

Vo výhodnom uskutočnení sú Nogo deriváty (napr. fragmenty) proteíny, ktoré sa prirodzene nevyskytujú.

Iné špecifické uskutočnenia derivátov a analógov sú opísané v nasledujúcej časti a v uvedených príkladoch.

Deriváty Nogo obsahujúce jednu alebo viac domén proteínu

V konkrétnom uskutočnení sa vynález týka Nogo derivátov a analógov, najmä Nogo fragmentov a derivátov takýchto fragmentov, ktoré obsahujú alebo, alternatívne, pozostávajú z jednej alebo viacerých domén Nogo proteínu vrátane, ale bez obmedzenia konzervovanej karboxy-koncovej domény a hydrofóbnej domény alebo amino-koncovej kyslej domény alebo domény bohatej na polyprolín, funkčných (napr. väzobných) fragmentov ktorejkoľvek z predchádzajúcich alebo akékoľvek kombinácie uvedeného.

Konkrétne uskutočnenie sa týka molekúl obsahujúcich špecifické fragmenty Nogo, čo sú tie fragmenty v príslušnom Nogo proteíne, ktoré sú najhomologickejšie so špecifickými fragmentmi potkanieho alebo hovädzieho Nogo proteínu. Fragment obsahujúci doménu Nogo homológu sa môže identifikovať metódami proteínovej analýzy, ako je opísané v príkladových častiach 1.2, 1.8, 1.9, 1.10, 1.11 alebo 1.12.

V inom konkrétnom uskutočnení je poskytnutá molekula, ktorá obsahujje jednu alebo viac domén (alebo ich funkčnú časť) Nogo proteínu, ale aj neobsahuje jednu alebo viac domén (alebo ich funkčných častí) Nogo proteínu. V inom uskutočnení je poskytnutá molekula, ktorá obsahuje jednu alebo viac domén (alebo ich funkčných častí) Nogo proteínu, a ktorá má jednu alebo viac mutantných (napr. v dôsledku delécie alebo bodovej mutácie (mutácií)) domén Nogo proteínu (napr. tak, že mutantná doména má zníženú funkčnosť).

Testy Nogo proteínov, derivátov a analógov

Funkčná aktivita Nogo proteínov, derivátov a analógov sa môže testovať rôznymi spôsobmi. Opis funkčných testov v nasledujúcich častiach nie je mienený ako obmedzujúci a môže zahŕňať iné testy známe pre priemerného odborníka v oblasti.

Testovanie Nogo inhibície rastu neuritov in vitro

V konkrétnom uskutočnení sa Nogo proteíny, deriváty a analógy môžu testovať z hľadiska inhibície šírenia NIH 3T3 alebo inhibície PC 12 vyrastania neuritov použitím in vitro tkanivovej kultúry (príkladová časť 1.10).

V alternatívnom uskutočnení sa Nogo proteíny, deriváty a analógy môžu použiť na testovanie kolapsu rastu vrcholov explantátových kuracích dorzálnych koreňových ganglií indukovaného prítomnosťou Nogo. Podobne, Nogo funkcia sa môže testovať z hľadiska inhibície vyrastania neuritov explantátových kuracích dorzálnych koreňových ganglií (Spillman a ďalší, 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-19293).

Testovanie funkčných vlastností Nogo in vivo

V jednom príklade môžu byť antagonisty Nogo proteínov, derivátov a analógov použité na in vivo testovanie funkcie použitím živočíšneho modelu regenerácie kortikospinálneho traktu (CST) na dlhé vzdialenosti a modelu behaviorálneho zotavenia.

Vo výhodnom uskutočnení sa hlodavčí kortikospinálny trakt poškodí chirurgickou resekciou alebo kontúziou miechy a zvieraťu sa podajú antagonisty Nogo. Monitoruje sa nervová plasticita, regenerácia a funkčné zotavenie v porovnaní s neošetrenými kontrolnými zvieratami alebo v porovnaní s kontrolnými zvieratami ošetrenými protilátkou, z hľadiska funkčnej plasticity alebo regenerácie, anatomickými technikami, najmä značením ohraničených nervových traktov. Funkčné zotavenie sa meria lokomočnými testami a testami elektrofyziologickej zručnosti, ktoré sa vykonávajú hlodavcami (napr. testom na lepkavom papieri, prostredníctvom úlohy, v ktorej sa dosahuje potrava atď.) (Thallmair a ďalší, 1998, Nat. Neuroscience 1(2):124-131).

Inhibícia viazania Nogo ligandu a jej testovanie

V jednom uskutočnení, pri ktorom sa testuje schopnosť viazať anti-Nogo protilátku alebo konkurovať viazaniu divého typu Nogo s anti-Nogo protilátkou, sa môžu použiť rôzne imunologické testy známe v oblasti, vrátane, ale bez obmedzenia na kompetitívne a nekompetitívne testovacie systémy použitím techník, ako sú napríklad rádioimunologické testovanie, ELISA (s enzýmom spojený imuno-absorpčný test), „sendvičové“ imunotesty, imunorádiometrické testy, gélové difúzne precipitínové reakcie, imunodifúzne testy, in situ imunologické testy (napríklad použitím koloidálneho zlata, enzymatických alebo rádioizotopových značiek), Westem bloty, precipitačné reakcie, aglutinačné testy (napr. gélové aglutinačné testy, hemaglutinačné testy), komplementové fixačné testy, imunofluorescenčné testy, testy s proteínom A imunoelektroforetické testy,atď. V jednom uskutočnení sa viaznaie protilátky deteguje detegovanim značky na primárnej protilátke. V inom uskutočnení sa primárna protilátka deteguje detegovanim viazania sekundárnej protilátky alebo reakčného činidla na primárnu protilátku. V ďalšom uskutočnení je sekundárna protilátka značená. V oblasti je známych mnoho prostriedkov na detekciu viazania v imunologických testoch a sú zahrnuté do rozsahu predloženého vynálezu.

V inom uskutočnení, v ktorom sa identifikuje Nogo-viažuci protein, sa môže viazanie testovať napr. prostriedkom známym v oblasti. V inom uskutočnení môžu byť testované fyziologické koreláty Nogo viazania na jeho substráty.

Pre priemerného odborníka v oblasti budú známe aj iné spôsoby, ktoré sú zahrnuté do rozsahu vynálezu.

Terapeutické použitia

Vynález poskytuje liečbu alebo prevenciu rôznych chorôb a porúch podávaním terapeutických zlúčenín. Takéto terapeutické činidlá zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: Nogo proteíny a ich analógy a deriváty (vrátane fragmentov) (napr. ako sú opísané); protilátky proti nim (ako sú opísané); nukleové kyseliny kódujúce Nogo proteíny, analógy alebo deriváty (napr. ako sú opísané); Nogo antisense nukleové kyseliny a Nogo agonisty a antagonisty. Poruchy zahŕňajúce dereguláciu bunkového rastu, napr. CNS nádory, sa liečia, alebo sa im predchádza podávaním terapeutických činidiel, ktoré podporujú Nogo funkciu. Poruchy, pri ktorých je nedostatočný alebo želateľný rast, regenerácia alebo pretrvávanie neuritov, sa liečia podávaním terapeutických činidiel, ktoré antagonizujú (inhibujú) Nogo funkciu. Uvedené je podrobne opísané v nasledujúcich častiach.

Vo všeobecnosti je výhodné, aby sa pacientovi podávali produkty pochádzajúce z toho istého druhu alebo majúce reaktivitu (v prípade protilátok) proti tomu istému druhu, ku ktorému patrí pacient. Takže vo výhodnom uskutočnení sa ľudskému pacientovi terapeuticky alebo profylaktický podáva ľudský Nogo protein, derivát alebo analóg alebo nukleová kyselina, alebo protilátka proti ľudskému Nogo proteínu.

Liečba a prevencia porúch zahŕňajúcich deregulovaný bunkový rast

Choroby a poruchy zahŕňajúce deregulovaný bunkový rast sa liečia alebo sa im predchádza podávaním terapeutických činidiel, ktoré podporujú (t. j. zvyšujú alebo poskytujú) Nogo funkciu. Príklady takýchto terapeutických činidiel zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na Nogo proteíny, deriváty alebo fragmenty, ktoré sú funkčne aktívne, ktoré sú najmä aktívne pri inhibícii predlžovania neuritov alebo inhibícii bunkového rastu (ako je demonštrované napr. v in vitro testoch alebo v živočíšnych modeloch), a nukleové kyseliny kódujúce Nogo protein alebo jeho funkčne aktívny derivát alebo fragment (napr. na použitie v génovej terapii). Výhodne sú Nogo proteíny, ich deriváty alebo fragmenty bez akéhokoľvek CNS myelínového materiálu, s ktorým sú prirodzene asociované. Iné terapeutické činidlá, ktoré môžu byť použité, napr. Nogo agonisty, môžu byť identifikované použitím in vitro testov alebo živočíšnych modelov, ktorých príklady sú opísané.

V konkrétnych uskutočneniach sa terapeutické činidlá, ktoré podporujú Nogo funkciu, podávajú terapeuticky (vrátane profylaktický): (1) pri ochoreniach alebo poruchách zahŕňajúcich absenciu alebo pokles (vo vzťahu k normálnej alebo želanej) úrovne Nogo proteínu alebo funkcie, napríklad pacientom, u ktorých chýba Nogo protein, je geneticky defektný alebo biologicky neaktívny, alebo málo aktívny, alebo sa nedostatočne exprimuje; alebo (2) pri chorobách alebo poruchách, kde in vitro (alebo in vivo) testy (pozri neskôr) indikujú využitie podania Nogo agonistu. Absenciu alebo pokles úrovne Nogo proteínu alebo funkcie je možné jednoducho detegovať, napr. získaním vzorky pacientovho tkaniva (napr. biopsiou tkaniva) a jej testovaním in vitro na prítomnosť RNA alebo úrovne proteínu, štruktúru a/alebo aktivitu exprimovanej Nogo RNA alebo proteínu. Využité môžu byť mnohé metódy štandardné v oblasti, vrátane, ale bez obmedzenia na kinázové testy, imunologické testy na detekciu a/alebo vizualizáciu Nogo proteínu (napr. Westem blot, imunoprecipitácia nasledovaná SDS (dodecylsulfát sodný) polyakrylamidovou gélovou elektroforézou, imunocytochémia atď.) a/alebo hybridizačné testy na detekciu Nogo expresie detegovaním a/alebo vizualizáciou Nogo mRNA (napr. Northem testy, dot bloty, in situ hybridizácia atď.) atď.

Choroby a poruchy zahŕňajúce deregulovaný bunkový rast, ktoré môžu byť liečené, alebo ktorým sa môže predchádzať, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na proliferatívne poruchy, malígne nádory, nádory nervového systému atď. Príklady týchto chorôb sú podrobne uvedené.

Neoplastický rast

Neoplastický rast a príbuzné poruchy, ktoré je možné liečiť, alebo ktorým je možné predchádzať podávaním terapeutického činidla, ktoré podporuje Nogo funkciu, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na poruchy uvedené v tabuľke 1 (zhrnutie takýchto porúch je uvedené vo Fishman a ďalší, 1985, Medicíne, 2. vyd., J. B. Lippincott Co., Philadelphia):

Tabuľka 1

Neoplastický rast a príbuzné poruchy

Tuhé nádory sarkómy a karcinómy gliómy, glioblastómy astrocytómy meduloblastómy kranio faryngiómy ependymómy pinealómy hemangiomblastómy akustické neurómy oligodendrogliómy menangiómy neuroblastómy retinoblastómy

V konkrétnych uskutočneniach sa liečia alebo sa predchádza malignite alebo dysproliferatívnym zmenám (ako napríklad metapláziám a dyspláziám) alebo hyperproliferatívnym ochoreniam v centrálnom nervovom systéme, mieche alebo v ktoromkoľvek nervovom tkanive.

Premalígne stavy

Terapeutické činidlá podľa vynálezu, ktoré podporujú Nogo aktivitu, môžu byť podávané aj na liečbu premalígnych stavov a na prevenciu progresie do neoplastického alebo malígneho stavu, ktorý zahŕňa, ale nie je obmedzený na poruchy uvedené v tabuľke 1. Takéto profylaktické alebo terapeutické použitie je indikované pri stavoch, o ktorých je známe, alebo ktoré sú podozrivé z predchádzajúcej progresie do neoplázie alebo rakoviny, najmä tam, kde nastal iný ako neoplastický rast buniek zahŕňajúci hyperpláziu, metapláziu, ale najmä dyspláziu (zhrnutie takýchto abnormálnych rastových stavov je uvedené v Robbins a Angell, 1976, Basic Pathology, 2. vyd., W.B. Saunders Co., Philadelphia, str. 68-79). Hyperplázia je forma kontrolovanej bunkovej proliferácie zahŕňajúcej zvýšenie počtu buniek v tkanive alebo orgáne bez významnej zmeny štruktúry alebo funkcie. Metaplázia je forma kontrolovaného bunkového rastu, pri ktorom je jeden typ dospelých alebo úplne diferenciovaných buniek nahradený iným typom dospelých buniek. Metaplázia môže nastať v epiteliálnych alebo spojivových tkanivových bunkách. Atypická metaplázia zahŕňa do určitej miery neusporiadaný metaplastický epitel. Dysplázia je často predchodcom rakoviny a nachádza sa najmä v epiteli. Je to najneusporiadanejšia forma iného ako neoplastického bunkového rastu, ktorá zahŕňa stratu individuálnej bunkovej uniformity a stratu architekturálnej orientácie buniek. Dysplastické bunky majú často abnormálne veľké, silno vyfarbené jadro a majú pleomorfizmus. Dysplázia sa charakteristicky vyskytuje tam, kde existuje chronické dráždenie alebo zápal.

Alternatívne, alebo okrem prítomnosti abnormálneho bunkového rastu charakterizovaného ako hyperplázia, metaplázia alebo dysplázia, môže požiadavku profylaktického/terapeutického podania terapeutických činidiel, ktoré podporujú Nogo funkciu, indikovať aj prítomnosť jednej alebo viacerých charakteristík transformovaného fenotypu alebo malígneho fenotypu, ktoré sú vykázané in vivo alebo in vitro v bunkovej vzorke pacienta. Ako bolo uvedené, takéto charakteristiky transformovaného fenotypu zahŕňajú morfologické zmeny, stratu pripojenia na substrát, stratu kontaktovej inhibície, stratu závislosti od ukotvenia, vylučovanie proteáz, zvýšený transport sacharidov, znížené sérové požiadavky, expresiu fetálnych antigénov, vytratenie bunkového povrchového proteínu s veľkosťou 250 000 daltonov atď. (pozri aj id. na str. 84-90, kde sú uvedené charakteristiky asociované s transformovaným alebo malígnym fenotypom).

V iných uskutočneniach sa pacient, ktorý má jednu alebo viac nasledujúcich predispozičných faktorov malignity, ošetruje podávaním účinného množstva terapeutických činidiel: neurofibromatóza podľa Von Recklinghausena alebo retinoblastómy; pozri Robbins a Angell, 1976, Basic Pathology, 2. vyd., W. B. Saunders Co., Philadelphia, str. 112-113) atď.).

V inom konkrétnom uskutočnení sa terapeutické činidlo podľa vynálezu podáva ľudskému pacientovi na predchádzanie progresie rakoviny, melanómu alebo sarkómu do obličiek, chrupavky (hrudnej kosti), kože, kostrového svalu, pľúc alebo sleziny.

Hyperproliferatívne a dysproliferatívne poruchy

V inom uskutočnení vynálezu sa terapeutické činidlo, ktoré podporuje Nogo aktivitu, používa na liečbu alebo prevenciu hyperproliferatívnych alebo benígnych dysproliferatívnych porúch. Konkrétne uskutočnenia sú nasmerované na liečbu alebo prevenciu cirhózy pečene (stav, pri ktorom vytváranie zrastov prevláda nad procesmi normálnej regenerácie pečene), na liečbu vytvárania keloidov (hypertrofných zrastov) (strata štruktúry pokožky, pri ktorej proces vytvárania zrastov interferuje s normálnym obnovovaním), psoriázy (bežný stav kože vyznačujúci sa nadmernou proliferáciou kože a oddialením správnej bunkovej koncovej determinácie), benígnych nádorov, fibrocystických stavov a tkanivovej hypertrofie (napr. prostatickej hyperplázie).

Génová terapia

V konkrétnom uskutočnení sú nukleové kyseliny obsahujúce sekvenciu, ktorá kóduje Nogo proteín alebo jeho funkčný derivát, podávané na podporu Nogo funkcie prostredníctvom génovej terapie. Génová terapia znamená terapiu uskutočňovanú podávaním nukleovej kyseliny subjektu. V tomto uskutočnení vynálezu nukleová kyselina produkuje jej kódovaný proteín, ktorý sprostredkúva terapeutický účinok podporou Nogo funkcie.

Akýkoľvek zo spôsobov génovej terapie dostupných v oblasti môže byť použitý podľa predloženého vynálezu. Príklady spôsobov sú opísané.

Všeobecné zhrnutie spôsobov génovej terapie je uvedené v Goldspiel a ďalší, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu a Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; a Morgan a Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; Máj 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Spôsoby bežne známe v oblasti technológie rekombinantnej DNA, ktoré môžu byť použité, sú opísané v Ausubel a ďalší, (vyd.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; a Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY:

Vo výhodnom uskutočnení obsahuje terapeutické činidlo Nogo nukleovú kyselinu, ktorá je časťou expresného vektora, ktorý exprimuje Nogo proteín alebo fragment, alebo jeho chimémy proteín vo vhodnom hostiteľovi. Takáto nukleová kyselina má najmä promótor, ktorý je operabilne spojený s Nogo kódujúcou oblasťou, pričom uvedený promótor je inducibilný alebo konštitutívny a voliteľne tkaní vo vo špecifický. V inom uskutočnení je použitá molekula nukleovej kyseliny, v ktorej sú Nogo kódujúce sekvencie a akékoľvek iné požadované sekvencie ohraničené oblasťami, ktoré napomáhajú homologickej rekombinácii v želateľnom mieste genómu, a tak poskytujú intrachromozomálnu expresiu Nogo nukleovej kyseliny (Koller a Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra a ďalší, 1989, Náture 342:435-438).

Dodanie nukleovej kyseliny pacientovi môže byť buď priame, v tom prípade je pacient priamo vystavený nukleovej kyseline alebo vektoru nesúcemu nukleovú kyselinu, alebo nepriamo, v tom prípade sa najprv transformujú bunky nukleovou kyselinou in vitro, a potom sa transplantujú pacientovi. Tieto dva prístupy sú známe ako in vivo, respektíve ex vivo génová terapia.

V konkrétnom uskutočnení sa nukleová kyselina podáva priamo in vivo, kde sa exprimuje, aby sa produkoval kódovaný produkt. To sa môže uskutočniť akýmkoľvek z množstva spôsobov známych v oblasti, napr. jej zakomponovaním do príslušného nukleokyselinového expresného vektora a podávaním tak, aby sa stala vnútrobunkovou, napr. infekciou použitím defektného alebo oslabeného retro-vírusového alebo iného vírusového vektora (pozri US patent č. 4980286) alebo priamou injekciou nahej DNA, alebo použitím bombardovania mikročasticami (napr. génové delo; Biolistic, Dupont) alebo nanášaním s lipidmi alebo bunkovými povrchovými receptormi, alebo transfekčnými činidlami, enkapsuláciou v lipozómoch, mikročasticami alebo mikrokapsulami, alebo jej podávaním v spojení s peptidom, o ktorom je známe, že vstupuje do jadra, podávaním v spojení s ligandovým subjektom na receptorom sprostredkovanú endocytózu (pozri napr. Wu a Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (ktoré môže byť použité na nasmerovanie do typov buniek, ktoré špecificky exprimujú receptory) atď. V inom uskutočnení sa môže vytvoriť komplex nukleová kyselina-ligand, v ktorom ligand obsahuje fuzogénny vírusový peptid na rozrušenie endozómov, čo umožňuje, aby sa nukleová kyselina vyhla lyzozomálnej degradácii. V ešte inom uskutočnení môže byť nukleová kyselina in vivo nasmerovaná na príjem špecifickými bunkami a expresiu prostredníctvom zacielenia špecifického receptora (pozri napr. PCT publikácie WO 92/06180 zo 16. apríla 1992 (Wu a ďalší); WO 92/22635 z 23. decembra 1992 (Wilson a ďalší); WO92/20316 z 26. novembra, 1992 (Findeis a ďalší); WO93/14188 z 22. júla, 1993 (Čiarke a ďalší), WO93/20221 zo 14. októbra, 1993 (Young)). Alternatívne sa môže nukleová kyselina zavádzať intraceluláme a začleniť sa do hostiteľskej bunkovej DNA na expresiu prostredníctvom homologickej rekombinácie (Koller a Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra a ďalší, 1989, Náture 342:435-438).

V konkrétnom uskutočnení sa používa vektor, ktorý obsahuje Nogo nukleovú kyselinu. Použitý môže byť napríklad retrovírusový vektor (pozri Miller a ďalší, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599). Tieto retrovírusové vektory boli modifikované deléciou retrovírusových sekvencií, ktoré nie sú nevyhnutné na zbaľovanie vírusového genómu a na integráciu do hostiteľskej bunkovej DNA. Nogo nukleová kyselina, ktorá sa má použiť na génovú terapiu, sa klonuje do vektora, ktorý uľahčuje dodanie génu do pacienta. Viac podrobností o retrovírusových vektoroch je možné nájsť v Boesen a ďalší, 1994, Biotherapy 6:291-302, kde je opísané použitie retrovírusového vektora na doručenie mdrl génu do hematopoetických kmeňových buniek, aby boli kmeňové bunky rezistentnejšie proti chemoterapii. Iné publikácie, ktoré ilustrujú použitie retrovírusových vektorov v génovej terapii sú: Clowes a ďalší, 1994, J. Clin. Invest. 93:644 651; Kiem a ďalší, 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons a Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; a Grossman a Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.

Adenovírusy sú iné vírusové vektory, ktoré môžu byť použité v génovej terapii. Adenovírusy sú výnimočne atraktívne vehikulá na doručovanie génov do centrálneho nervového systému. Adenovírusy prirodzene infikujú respiračné epitely, kde spôsobujú mierne ochorenie. Inými cieľmi dodávacích systémov založených na adenovírusoch sú pečeň, respiračné epitely, endoteliálne bunky a svaly. Adenovírusy majú výhodu v tom, že sú schopné infikovať nedeliace sa bunky. Kozarsky a Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and

Development 3:499-503 prezentujú zhrnutie génovej terapie založenej na adenovírusoch. Bout a ďalší, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 demonštrovali použitie adenovírusových vektorov na prenos génov do respiračných epitelov makakov. Iné príklady použitia adenovírusov v génovej terapii je možné nájsť v Rosenfeld a ďalší, 1991, Science 252:431-434; Rosenfeld a ďalší, 1992, Celí 68:143-155; a Mastrangeli a ďalší, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234.

Okrem adenovírusov bol na použitie v génovej terapii navrhnutý aj adeno-asociovaný vírus (AAV) (Walsh a ďalší, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300).

Iné prístupy génovej terapie zahŕňajú transfer génu do buniek v tkanivovej kultúre takými metódami, ako sú elektroporácia, lipofekcia, transfekcia sprostredkovaná fosforečnanom vápenatým alebo vírusová infekcia. Spôsob transferu zvyčajne zahŕňa prenos selektovateľného markera do buniek. Bunky sa potom selektujú, aby sa izolovali tie bunky, ktoré prijali a exprimujú prenášaný gén. Tie bunky sa potom dodajú pacientovi.

V tomto uskutočnení sa nukleová kyselina zavádza do bunky pred in vivo podaním výslednej rekombinantnej bunky. Takéto zavádzanie sa môže uskutočňovať akýmkoľvek zo spôsobov známych v oblasti, vrátane, ale bez obmedzenia na transfekciu, elektroporáciu, mikroinjekciu, infekciu s vírusovým alebo bakteriofágovým vektorom obsahujúcim nukleokyselinové sekvencie, bunkovú fúziu, chromozómom-sprostredkovaný génový transfer, mikrobunkami-sprostredkovaný génový transfer, sferoplastovú fúziu atď. V oblasti sú známe mnohé techniky na zavádzanie cudzích génov do buniek (pozri napr. Loeffler a Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-628; Cohen a ďalší, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) a môžu byť použité podľa predloženého vynálezu za predpokladu, že nie sú prerušené nevyhnutné vývinové a fyziologické funkcie recipientnej bunky. Technika by mala poskytovať stabilný transfer nukleovej kyseliny do bunky tak, aby bola nukleová kyselina bunkou exprimovateľná a výhodne dedične a exprimovateľná potomkami bunky.

Výsledné rekombinantné bunky sa môžu dodať pacientovi rôznymi spôsobmi známymi v oblasti. Vo výhodnom uskutočnení sa epiteliálne bunky injektujú napr. subkutánne. V inom výhodnom uskutočnení sa rekombinantné kožné bunky môžu aplikovať pacientovi ako kožný štep. Rekombinantné krvné bunky (napr. hemato-poetické kmeňové bunky alebo progenitomé bunky) sa výhodne podávajú intravenózne. Množstvo buniek odhadnuté na použitie závisí od požadovaného účinku, pacientovho stavu atď. a môže sa stanoviť priemerným odborníkom v oblasti.

Bunky, do ktorých sa môže zavádzať nukleová kyselina na účely génovej terapie, zahŕňajú akýkoľvek želateľný, dostupný bunkový typ, a zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na epiteliálne bunky, endoteliálne bunky, keratinocyty, fibroblasty, svalové bunky, hepatocyty; krvné bunky, ako napríklad T lymfocyty, B lymfocyty, monocyty, makrofágy, neutrofily, eozinofily, megakaryocyty, granulocyty; rôzne kmeňové alebo progenitorné bunky, najmä hematopoetické kmeňové alebo progenitomé bunky, napr. získané z kostnej drene, pupočníkovej krvi, periférnej krvi, fetálnej pečene atď.

Vo výhodnom uskutočnení sú bunky používané na génovú terapiu autológne voči pacientovi.

V uskutočnení, v ktorom sa rekombinantné bunky používajú na génovú terapiu, sa Nogo nukleová kyselina zavádza do buniek tak, že je exprimovateľná bunkami alebo ich potomkami, a rekombinantné bunky sa potom môžu in vivo podávať, aby sa získal terapeutický účinok. V konkrétnom uskutočnení sa používajú kmeňové alebo progenitomé bunky. Akékoľvek kmeňové a/alebo progenitomé bunky, ktoré je možné izolovať a udržiavať in vitro, sa môžu potenciálne použiť podľa tohto uskutočnenia predloženého vynálezu. Takéto kmeňové bunky zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na nervové kmeňové bunky (Stemple a Anderson, 1992, Celí 71:973-985).

V konkrétnom uskutočnení obsahuje nukleová kyselina, ktorá sa má zaviesť na účely génovej terapie, inducibilný promótor operabilne spojený s kódujúcou oblasťou tak, aby bola kontrolovateľná expresia nukleovej kyseliny kontrolovaním prítomnosti alebo absencie príslušného induktora transkripcie.

Ďalšie spôsoby môžu byť upravené na použitie na dodanie nukleovej kyseliny kódujúcej Nogo proteín alebo funkčný derivát.

Liečba a prevencia porúch, pri ktorých Nogo blokuje regeneráciu

Choroby a poruchy, pri ktorých je želateľné predlžovanie, rast alebo regenerácia neuritov, sa liečia podávaním terapeutických činidiel, ktoré antagonizujú (inhibujú) Nogo funkciu. Tieto choroby, poruchy alebo poškodenia, ktorých konečným výsledkom je poškodenie nervového systému, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na traumu centrálneho nervového systému (CNS) (napr. poranenia miechy alebo mozgu), infarkt, infekciu, malignitu, vystavenie toxickým činidlám, výživovú nedostatočnosť, paraneoplastické syndrómy a degeneratívne nervové ochorenia (vrátane, ale bez obmedzenia na Alzheimerovu chorobu, Parkinsonovu chorobu, Huntingtonovu choreu, sklerózu multiplex, amyotrofíckú laterálnu sklerózu a progresívne supra-nukleáme ochrnutie). Liečia sa podávaním zlúčenín, ktoré interferujú s Nogo aktivitou (napr. dominantne negatívneho Nogo derivátu; protilátok proti Nogo; anti-sense nukleových kyselín, ktoré kódujú Nogo; Nogo ribozýmov alebo chemických skupín, ktoré sa viažu na aktívne miesto Nogo).

Terapeutické činidlá, ktoré môžu byť použité, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na Nogo anti-sense nukleové kyseliny a Nogo nukleové kyseliny, ktoré sú dysfunkčné (napr. kvôli heterológnej (inej ako Nogo sekvencii) inzercii vnútri Nogo kódujúcej sekvencie), ktoré sa používajú na „knokaut“ endogénnej Nogo funkcie homologickou rekombináciou (pozri napr. Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). Anti-Nogo protilátky (a ich fragmenty a deriváty obsahujúce väzobnú oblasť) môžu byť použité ako antagonisty Nogo. V konkrétnom uskutočnení vynálezu sa používa ako Nogo antagonista nukleová kyselina obsahujúca časť Nogo génu, v ktorej sú Nogo sekvencie ohraničené (tak na 5’, ako aj na 3’ konci) odlišnými génovými sekvenciami, aby sa podporila Nogo inaktivácia homologickou rekombináciou (pozri aj Koller a Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra a ďalší, 1989, Náture 342:435-438). Iné terapeutické činidlá, ktoré inhibujú Nogo funkciu, sa môžu identifikovať použitím známych bežných in vitro testov, napr. na základe ich schopnosti inhibovať viazanie Nogo na iný proteín alebo inhĺbovať akúkoľvek známu Nogo funkciu, čo sa výhodne testuje in vitro alebo v bunkovej kultúre, hoci sa môžu využiť aj genetické testy. Výhodne sa využijú vhodné in vitro alebo in vivo testy na stanovenie účinku špecifického terapeutika a toho, čo je jeho podanie indikované na liečbu postihnutého tkaniva.

V konkrétnych uskutočneniach sa terapeutická, ktoré inhibujú Nogo funkciu podávajú terapeuticky (vrátane profylaktický): (1) pri chorobách alebo poruchách zahŕňajúcich zvýšenú (vzhľadom na normálnu alebo želanú) úroveň Nogo proteínu alebo funkcie, napríklad pacientom, u ktorých je Nogo proteín nadmerne aktívny alebo nadmerne exprimovaný; alebo (2) pri ochoreniach alebo poruchách, pri ktorých in vitro (alebo in vivo) testy (pozri neskôr) indikujú využitie podania Nogo antagonistu. Zvýšenie úrovní Nogo proteínu alebo funkcie sa môže jednoducho detegovať napr. kvantifikáciou proteínu a/alebo RNA, získaním vzorky pacientovho tkaniva (napr. biopsiou tkaniva) a jej in vitro testovaním RNA alebo proteínovej úrovne, štruktúry a/alebo aktivity exprimovanej Nogo RNA alebo proteínu. Využité môžu byť mnohé metódy štandardné v oblasti, vrátane, ale bez obmedzenia na kinázové testy, imunologické testy na detekciu a/alebo vizualizáciu Nogo proteínu (napr. Westem blot, imunoprecipitácia nasledovaná SDS (dodecylsulfát sodný) polyakrylamidovou gélovou elektroforézou, imunocytochémia atď.) a/alebo hybridizačné testy na detekciu Nogo expresie detegovaním a/alebo vizualizáciou Nogo mRNA (napr. Northem testy, dot bloty, in situ hybridizácia atď.) atď.

Antisense regulácia Nogo expresie

V konkrétnom uskutočnení sa Nogo funkcia inhibuje použitím Nogo antisense nukleových kyselín. Predložený vynález poskytuje terapeutické alebo profylaktické použitie nukleových kyselín s dĺžkou najmenej šesť nukleotidov, ktoré sú antisense proti génu alebo cDNA kódujúcej Nogo alebo jeho časť. Nogo „antisense“ nukleová kyselina tak, ako sa tu používa, znamená nukleovú kyselinu schopnú hybridizovať s časťou Nogo RNA (výhodne mRNA) prostredníctvom určitej sekvenčnej komplementarity. Antisense nukleová kyselina môže byť komplementárna s kódujúcou a/alebo nekódujúcou oblasťou Nogo mRNA. Takéto antisense nukleové kyseliny majú využitie ako terapeutické činidlá, ktoré inhibujú Nogo funkciu, a môžu byť použité na liečbu alebo prevenciu porúch, ako sú opísané.

Antisense nukleové kyseliny podľa vynálezu môžu byť oligonukleotidy, ktoré sú dvojvláknové alebo jednovláknové, RNA alebo DNA, alebo ich modifikácie alebo deriváty, ktoré môžu byť podávané priamo do bunky, alebo ktoré môžu byť produkované intraceluláme transkripciou exogénnych, zavedených sekvencii.

V konkrétnom uskutočnení môžu byť Nogo antisense nukleové kyseliny poskytnuté predloženým vynálezom použité na podporu regenerácie neurónov centrálneho nervového systému, najmä vrátane regenerácie kortikospinálneho traktu, plasticity počas zotavovania, opätovného rastu neurónov a hojenia poškodenia asociovaného s traumatickými poraneniami, porážkami a neurodegeneratívnymi ochoreniami.

Vynález ďalej poskytuje farmaceutické prostriedky obsahujúce účinné množstvo Nogo antisense nukleových kyselín podľa vynálezu vo farmaceutický prijateľnom nosiči, ako je opísané.

V inom uskutočnení je vynález nasmerovaný na spôsoby inhibície expresie Nogo nukleokyselinovej sekvencie v prokaryotickej alebo eukaryotickej bunke, ktoré zahŕňajú vybavenie bunky s účinným množstvom prostriedku obsahujúceho Nogo antisense nukleovú kyselinu podľa vynálezu.

Nogo antisense nukleové kyseliny a ich použitia sú podrobne opísané.

Nogo antisense nukleové kyseliny

Nogo antisense nukleové kyseliny majú dĺžku najmenej šesť nukleotidov a sú výhodne oligonukleotidy (dĺžka v rozsahu od 6 do približne 50 nukleotidov). V konkrétnych uskutočneniach má oligonukleotid dĺžku najmenej 10 nukleotidov, najmenej 15 nukleotidov, najmenej 100 nukleotidov alebo najmenej 200 nukleotidov. Oligonukleotidy môžu byť DNA alebo RNA, alebo ich chiméme zmesi alebo deriváty, alebo modifikované verzie, jednovlákonové alebo dvojvláknové. Oligonukleotid môže byť modifikovaný v bázovej časti, sacharidovej časti alebo vo fosfátovej kostre. Oligonukleotid môže zahŕňať iné pripojené skupiny, ako napríklad peptidy alebo činidlá uľahčujúce transport cez bunkovú membránu (pozri napr. Letsinger a ďalší, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553-6556; Lemaitre a ďalší, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT publikácia č. WO 88/09810, zverejnená 15. decembra 1988) alebo cez krvno-mozgovú bariéru (pozri napr. PCT publikáciu č. WO 89/10134, zverejnenú 25. apríla, 1988), štiepiace činidlá spúšťajúce hybridizáciu (pozri napr. Krol a ďalší, 1988, BioTechniques 6:958-976) alebo interkalačné činidlá (pozri napr. Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549).

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je poskytnutý Nogo antisense oligonukleotid, výhodne ako jednovláková DNA. V najvýhodnejšom uskutočnení obsahuje takýto oligonukleotid sekvenciu antisense proti sekvencii neďaleko jednej alebo dvoch promótorových sekvencií Nogo génu alebo neďaleko sekvencie kódujúcej karboxy-koncovú časť Nogo génu. Môže byť želateľné selektívne inhibovať expresiu jednej z Nogo izoforiem. Oligonukleotidy môžu byť v akomkoľvek mieste ich štruktúry modifikované substituentmi, ktoré sú v oblasti všeobecne známe.

Nogo antisense oligonukleotid môže obsahovať najmenej jednu modifikovanú bázovú časť, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej bez obmedzenia 5-fluóruracil, 5-brómuracil, 5-chlóruracil, 5-jóduracil, hypoxantín, xantín, 4-acetylcytozín, 5-(karboxyhydroxylmetyl)uracil, 5-karboxymetylaminometyl-2-tiouridín, 5-karboxy-metylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktozylkveozín, inozín, /V6-izo-pentenyladenín, 1-metylguanín, 1-metylinozín, 2,2-dimetylguanín, 2-metyladenín, 2-metylguanín, 3-metylcytozín, 5-metylcytozín, M)-adenín, 7-metylguanín, 5-metyl-aminometyluracil, 5-metoxyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-manozylkveozín, 5’-metoxykarboxymetyluracil, 5-metoxyuracil, 2-metyltio-/V6-izopentenyladenín, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), wybutoxozín, pseudouracil, kveozín, 2-tiocytozín, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny uracil-5-oxyoctovej, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-/V-2-karboxypropyl)uracil, (acp3)w a 2,6-diaminopurín.

V inom uskutočnení obsahuje oligonukleotid najmenej jednu modifikovanú sacharidovú časť vybranú zo skupiny zahŕňajúcej, ale nie obmedzenej na arabinózu, 2-fluóarabinózu, xylulózu a hexózu.

V ešte inom uskutočnení obsahuje oligonukleotid najmenej jednu modifikovanú fosfátovú kostu vybranú zo skupiny, ktorá zahŕňa fosforotioát, fosforoditioát, fosforamidotioát, fosforamidát, fosfordiamidát, metylfosfonát, alkylfosfotriester a formacetal alebo jeho analóg.

V ešte inom uskutočnení je oligonukleotid α-anomémy oligonukleotid. oc-Anomémy oligonukleotid vytvára špecifické dvojvláknové hybridy s komplementárnou RNA, v ktorých, na rozdiel od zvyčajných β-jednotiek, bežia vlákna navzájom paralelne (Gautier a ďalší, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641).

Oligonukleotid môže byť konjugovaný s inou molekulou, napr. peptidom, činidlom vytvárajúcim priečne väzby, ktoré spúšťa hybridizáciu, transportným činidlom, štiepiacim činidlom spúšťajúcim hybridizáciu atď.

Oligonukleotidy podľa vynálezu môžu byť syntetizované štandardnými metódami známymi v oblasti, napr. použitím automatizovaného DNA syntezátora (ako je napríklad syntezátor komerčne dostupný od Biosearch, Applied Biosystems atď.). Ako príklady, fosforotioátové oligonukleotidy sa môžu syntetizovať metódou Stein a ďalší (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), metylfosfonátové oligonukleotidy sa môžu pripraviť použitím sklenených polymémych podkladov s kontrolovanou veľkosťou pórov (Sarin a ďalší, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:7448-7451) atď.

V konkrétnom uskutočnení obsahuje Nogo antisense oligonukleotid katalytickú RNA alebo ribozým (pozri napr. PCT medzinárodnú publikáciu WO90/11364, zverejnenú 4. októbra 1990; Sarver a ďalší, 1990, Science 247:1222-1225).V inom uskutočnení je oligonukleotid 2’-O-metylribonukleotid (Inoue a ďalší, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148) alebo chimérny RNA-DNA analóg (Inoue a ďalší, 1987, FEBS Lett. 215:327-330).

V alternatívnom uskutočnení je Nogo antisense nukleová kyselina podľa vynálezu produkovaná vnútrobunkovo, transkripciou z exogénnej sekvencie. Napríklad, vektor sa môže zaviesť in vivo tak, že je prijatý bunkou, vnútri ktorej sa vektor alebo jeho časť transkribuje, pričom produkuje antisense nukleovú kyselinu (RNA) podľa vynálezu. Takýto vektor by obsahoval sekvenciu kódujúcu Nogo antisense nukleovú kyselinu. Takýto vektor môže ostať epizomálny alebo sa môže integrovať do chromozómu, pokiaľ sa môže transkribovať, aby produkoval želanú antisense RNA. Takéto vektory môžu byť konštruované metódami technológie rekombinantnej DNA, ktoré sú štandardné v oblasti. Vektory môžu byť plazmidové, vírusové alebo iné známe v oblasti, ktoré sa používajú na replikáciu a expresiu v cicavčích bunkách.

Expresia sekvencie kódujúcej Nogo antisense RNA sa môže uskutočňovať akýmkoľvek promótorom známym v oblasti, ktorý funguje v cicavčích, výhodne ľudských bunkách. Takéto promótory môžu byť inducibilné alebo konštitutívne. Takéto promótory zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na: SV40 skorú promótorovú oblasť (Bemoist a Chambon, 1981, Náture 290:304-310), promótor obsahujúci 3’ dlhé terminálne opakovania Rous sarkómového vírusu (Yamamoto a ďalší, 1980, Celí 22:787-797), promótor herpesovej tymidín kinázy (Wagner a ďalší, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), regulačné sekvencie metalotioneínového génu (Brinster a ďalší, 1982, Náture 296:39-42), atď.

Antisense nukleové kyseliny podľa vynálezu obsahujú sekvenciu komplementárnu aspoň s časťou RNA transkriptu Nogo génu, výhodne ľudského Nogo génu. Ale absolútna komplementarita, hoci je výhodná, nie je nevyhnutná. Tak ako je používanú tu, znamená výraz sekvencia „komplementárna aspoň s časťou RNA“ sekvenciu, ktorá má dostatočnú komplementaritu na to, aby bola schopná hybridizovať s RNA, vytvoriť sta bilný duplex; v prípade dvoj vláknových Nogo antisense nukleových kyselín môže byť teda testované jedno vlákno duplexovej DNA, alebo môže byť testované vytváranie triplexu. Schopnosť hybridizovať bude závisieť tak od stupňa komplementarity, ako aj od dĺžky antisense nukleovej kyseliny. Vo všeobecnosti, čím je dlhšia hybridizujúca nukleová kyselina, tým viac nespárovaných báz s Nogo RNA môže obsahovať a stále vytvára stabilný duplex (alebo triplex, podľa situácie). Priemerný odborník v oblasti môže upresniť tolerovateľný stupeň nespárovaných báz použitím štandardných postupov na stanovenie teploty topenia hybridizovaného komplexu.

Terapeutické použitie Nogo antisense nukleových kyselín

Nogo antisense nukleové kyseliny sa môžu používať na liečbu (alebo prevenciu) porúch toho typu buniek, ktoré exprimujú alebo, výhodne nadmerne exprimujú, Nogo. V konkrétnom uskutočnení je takouto poruchou rastová proliferatívna porucha. Vo výhodnom uskutočnení sa používa jednovláknový DNA antisense Nogo oligonukleotid.

Typy buniek, ktoré exprimujú alebo nadmerne exprimujú Nogo RNA, sa môžu identifikovať rôznymi spôsobmi známymi v oblasti. Takéto spôsoby zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na hybridizáciu s Nogo-špecifickou nukleovou kyselinou (napr. Northem hybridizáciou, dot blot hybridizáciou, in situ hybridizáciou), pozorovanie schopnosti RNA z bunkového typu byť translatovanou in vitro na Nogo imunotest, atď. Vo výhodnom uskutočnení sa môže pred ošetrením primáme tkanivo z pacienta testovať na Nogo expresiu, napr. imunocytochemicky alebo in situ hybridizáciou.

Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu, ktoré obsahujú účinné množstvo Nogo antisense nukleovej kyseliny vo farmaceutický prijateľnom nosiči, sa môžu podávať pacientovi, ktorý má chorobu alebo poruchu, pri ktorej sa exprimuje alebo nadmerne exprimuje Nogo RNA alebo proteín.

Množstvo Nogo antisense nukleovej kyseliny, ktoré bude účinné na liečbu konkrétnej poruchy alebo stavu, bude závisieť od povahy poruchy alebo stavu a môže byť stanovené štandardnými klinickými technikami. Kde je to možné, je želateľné pred testovaním a použitím u ľudí stanoviť antisense cytotoxicitu typu nádora, ktorý sa má liečiť, in vitro, a potom na užitočných živočíšnych modelových systémoch.

V konkrétnom uskutočnení sa farmaceutické prostriedky obsahujúce Nogo antisense nukleové kyseliny podávajú prostredníctvom lipozómov, mikročastíc alebo mikrokapsúl. V rôznych uskutočneniach vynálezu môže byť užitočné používať takéto prostriedky na dosiahnutie nepretržitého uvoľňovania Nogo antisense nukleových kyselín. V konkrétnom uskutočnení môže byť želateľné využívať lipozómy nasmerované prostredníctvom protilátok proti konkrétnym identifikovateľným nádorovým antigénom (Leonetti a ďalší, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2448-2451; Renneisen a ďalší, 1990, J. Biol. Chem. 265:16337-16342).

Demonštrácia terapeutického alebo profylaktického využitia

Terapeutiká podľa vynálezu sú výhodne testované in vitro a potom in vivo na požadovanú terapeutickú alebo profylaktickú aktivitu pred tým, ako sa použijú u ľudí. Napríklad, in vitro testy, ktoré môžu byť použité na stanovenie toho, či je indikované podanie konkrétneho terapeutika, zahŕňajú in vitro bunkové testy, v ktorých vzorka pacientovho tkaniva rastie v kultúre a je vystavená terapeutiku alebo je terapeutikum podané iným spôsobom a pozoruje sa účinok daného terapeutika na tkanivovú vzorku. Napríklad, terapeutikum, ktoré je inhibítorom Nogo funkcie, sa môže testovať meraním opätovného rastu neuritov alebo funkčným zotavením motorickej kontroly u pacienta.

V rôznych konkrétnych uskutočneniach sa in vitro testy môžu uskutočňovať s reprezentatívnymi bunkami bunkových typov, ktoré sa podieľajú na pacientovej poruche, aby sa stanovilo, či má terapeutikum požadovaný účinok na dané typy buniek.

Zlúčeniny na použitie na liečbu môžu byť testované pred testovaním na ľuďoch vo vhodných živočíšnych modelových systémoch vrátane, ale bez obmedzenia na potkany, myši, kurčatá, kravy, opice, králiky atď. Na in vivo testovanie pred podávaním ľuďom sa môže použiť akýkoľvek živočíšny modelový systém známy v oblasti.

Terapeutické/profylaktické podávanie a prostriedky

Vynález poskytuje spôsoby liečby (a profylaxie) podávaním účinného množstva terapeutika podľa vynálezu subjektu. Vo výhodnom uskutočnení je terapeutikum v podstate purifíkované. Subjektom je výhodne živočích, vrátane, ale bez obmedzenia na živočíchy ako kravy, ošípané, kone, kurčatá, mačky, psy atď, a výhodne cicavce, a najvýhodnejšie človek. V konkrétnom uskutočnení je subjektom nehumánny cicavec.

Formulácie a spôsoby podania, ktoré môžu byť využité, keď terapeutikum obsahuje nukleovú kyselinu, sú opísané. Ďalšie vhodné formulácie a spôsoby podania môžu byť vybrané spomedzi tých, ktoré sú opísané.

Rôzne dodávacie systémy sú známe a môžu byť použité na podávanie terapeutika podľa vynálezu, napr. enkapsulácia v lipozómoch, mikročastice, mikrokapsuly, rekombinantné bunky schopné exprimovať terapeutikum, receptorom sprostredkovaná endocytóza (pozri napr. Wu a Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), konštrukcia terapeutickej nukleovej kyseliny ako časti retrovírusového alebo iného vektora atď. Spôsoby za vedenia zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na intradermálny, intramuskulámy, intraperitoneálny, intravenózny, subkutánny, intranazálny, epidurálny alebo orálny spôsob. Zlúčeniny môžu byť podávané akýmkoľvek vhodným spôsobom, napríklad infúziou alebo bolusovou injekciou, absorpciou cez epiteliálne alebo mukokutánne náplasti (napr. orálnou sliznicou, rektálnou a črevnou sliznicou, atď.) a môžu byť podávané spolu s inými biologicky aktívnymi činidlami. Podávanie môže byť systémové alebo lokálne. Okrem toho môže byť želateľné zaviesť farmaceutické prostriedky podľa vynálezu do centrálneho nervového systému akýmkoľvek vhodným spôsobom vrátane intraventrikulárnej a intratekálnej injekcie. Intraventrikuláma injekcia môže byť uľahčená intraventrikulámym katétrom, pripojeným napríklad na rezervoár, ako Ommaya rezervoár. Využité môže byť aj pulmonáme podanie, napr. použitím inhalátora alebo nebulizátora a formulácie s aerosolizujúcim činidlom.

V konkrétnom uskutočnení môže byť želateľné podávať farmaceutické prostriedky podľa vynálezu lokálne, do oblasti, v ktorej je potrebná liečba. Toto sa môže dosiahnuť napríklad, ale bez obmedzenia, lokálnou infúziou počas chirurgického zákroku, topikálnou aplikáciou, napr. v spojitosti s úpravou rany po chirurgickom zákroku, injekciou prostredníctvom katétra alebo prostredníctvom implantátu, pričom uvedený katéter je z pórovitého, nepórovitého alebo želatínového materiálu, vrátane membrán, ako napríklad sialastických membrán alebo vlákien. V jednom uskutočnení sa podávanie môže uskutočňovať priamou injekciou do miesta (alebo bývalého miesta) malígneho nádora alebo neoplastického alebo pre-neoplastického tkaniva.

V inom uskutočnení sa terapeutikum môže dodávať vo vehikule, najmä lipozóme (pozri Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat a ďalší, v Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, LopezBerestein and Fifler (vyd.), Liss, New York, str. 353-365 (1989); Lopez-Berstein, ibid., str. 317-327, pozri všeobecne ibid).

V ešte inom uskutočnení sa terapeutikum môže dodávať v systéme s riadeným uvoľňovaním. V jednom uskutočnení môže byť použitá pumpa (pozri Langer, supra; Sefton, CDC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald a ďalší, Surgery 88:507 (1980); Saudek a ďalší, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). V inom uskutočnení môžu byť použité polyméme materiály (pozri Medical Applications of Controlled Release, Langer a Wise (vyd.), CRC Press., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen a Balí (vyd.), Wiley, New York (1984); Ranger a Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); pozri aj Levy a ďalší, Science 228:190 (1985); During a ďalší, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard a ďalší, J. Neurosurg. 71:105 (1989)). V inom uskutočnení môže byť systém s riadeným uvoľňovaním umiestnený v blízkosti terapeutického cieľa, t. j. mozgu, a tým je potrebná len časť systémovej dávky (pozri napr. Goodson, v Medical Applications of Controlled Release, supra, zv. 2, str. 115-138 (1984)).

Iné systémy riadeného uvoľňovania sú diskutované v zhrnutí Langera (Science 249:1527-1533 (1990)).

V konkrétnom uskutočnení, v ktorom je terapeutikom nukleová kyselina kódujúca proteínové terapeutikum, môže sa nukleová kyselina podávať in vivo, aby sa uskutočnila expresia ňou kódovaného proteínu tak, že sa nukleová kyselina zakomponuje ako časť príslušného nukleokyselinového expresného vektora a podá sa tak, aby sa stala intracelulámou, napr. použitím retrovírusového vektora (pozri US patent č. 4980286) alebo priamo injekciou, alebo použitím bombardovania mikročasticami (napr. génovým delom; Biolistic, Dupont), alebo poťahovaním s lipidmi, alebo bunkovými povrchovými receptormi, alebo transfekčnými činidlami, alebo podávaním v spojení s peptidom podobným homeoboxu, o ktorom je známe, že vstupuje do jadra (pozri napr. Joliot a ďalší, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) atď. Alternatívne môže byť nukleokyselinové terapeutikum zavedené intraceluláme a začlenené do hostiteľskej bunkovej DNA na expresiu prostredníctvom homologickej rekombinácie.

Predložený vynález poskytuje aj farmaceutické prostriedky. Takéto prostriedky obsahujú terapeuticky účinné množstvo terapeutika a farmaceutický prijateľný nosič. V konkrétnom uskutočnení výraz „farmaceutický prijateľný“ znamená potvrdený regulárnou agentúrou federálnej alebo štátnej vlády, alebo uvedený v US Farmakopei alebo v inej všeobecne uznávanej farmakopei na použitie u živočíchov a najmä ľudí. Výraz „nosič“ znamená riedidlo, adjuvans, excipient alebo vehikulum, s ktorým sa terapeutikum podáva. Takýmito farmaceutickými nosičmi môžu byť sterilné kvapaliny, ako napríklad voda a oleje, vrátane ropných olejov, olejov živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, ako napríklad oleja z burských orieškov, sójového oleja, minerálneho oleja, sezamového oleja a podobne. Voda je výhodným nosičom, keď sa farmaceutický prostriedok podáva intravenózne. Ako kvapalné nosiče môžu byť použité aj fyziologické roztoky a vodné dextrózové a glycerolové roztoky, najmä ako injektovateľné roztoky. Vhodné farmaceutické excipienty zahŕňajú škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatínu, slad, ryžu, múku, kriedu, silikagél, stearan sodný, monostearan glycerolu, mastenec, chlorid sodný, sušené odstredené mlieko, glycerol, propylénglykol, vodu, etanol a podobne. Prostriedok, ak je to želateľné, môže obsahovať aj minoritné množstvá zmáčacích a emulzifikačných činidiel, alebo činidiel tlmiacich pH. Tieto prostriedky môžu byť vo forme roztokov, suspenzií, emulzií, tabliet, piluliek, kapsúl, práškov, formulácií s trvalým uvoľňovaním a podobne. Orálna formulácia môže zahŕňať štandardné nosiče, ako napríklad farmaceutické stupne manitolu, laktózu, škrob, stearan horečnatý, sacharín sodný, celulózu, uhličitan horečnatý atď. Príklady vhodných farmaceutických nosičov sú opísané v „Remington’s Pharmaceutical Sciences“ E. W. Martinom. Takéto prostriedky budú obsahovať terapeuticky účinné množstvo terapeutika, výhodne v purifikovanej forme, spolu s vhodným množstvom nosiča, tak, aby sa poskytla forma vhodná na podanie pacientovi. Formulácia by mala byť vhodná na spôsob podania.

Vo výhodnom uskutočnení je prostriedok formulovaný podľa rutinných procedúr ako farmaceutický prostriedok prispôsobený na intravenózne podanie ľuďom. Typicky, prostriedky na intravenózne podanie sú roztoky v sterilnom izotonickom vodnom tlmivom roztoku. Keď je to nevyhnutné, môže prostriedok obsahovať solubilizujúce činidlo a lokálne anestetikum, ako napríklad lignokaín na zmiernenie bolesti v mieste injekcie. Vo všeobecnosti sa ingredienty dodávajú buď oddelene, alebo spolu zmiešané v jednotkovej dávkovej forme, napríklad ako suchý lyofilizovaný prášok alebo bezvodný koncentrát v hermeticky uzavretej nádobe, ako napríklad ampulke alebo vrecku, s vyznačeným množstvo účinného činidla. Tam, kde sa prostriedok musí podávať infúziou, môže byť dodávaný s infuznou fľašou obsahujúcou sterilnú farmaceutickú vodu alebo fyziologický roztok. Keď sa prostriedok podáva injekciou, môže byť poskytnutá ampulka sterilnej vody na injekciu alebo fyziologický roztok, aby sa ingredienty mohli zmiešať pred podaním.

Terapeutiká podľa vynálezu môžu byť formulované v neutrálnej forme alebo vo forme solí. Farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú soli vytvorené s voľnými aminoskupinami, ako napríklad soli odvodené od kyseliny chlorovodíkovej, fosforečnej, octovej, oxálovej, vínnej atď., a soli vytvorené s voľnými karboxylovými skupinami, ako napríklad soli odvodené od hydroxidu sodného, draselného, amónneho, vápenatého, železitého, izopropylamínu, trietylamínu, 2-etylamino-etanolu, histidínu, prokaínu atď.

Množstvo terapeutika podľa vynálezu, ktoré bude účinné na liečbu konkrétnej poruchy alebo stavu, bude závisieť od povahy poruchy alebo stavu a môže byť stanovené štandardnými klinickými technikami. Okrem toho sa môžu voliteľne použiť in vitro testy na pomoc identifikácii optimálnych dávkových rozsahov. Presná dávka, ktorá sa má využiť vo formulácii, bude závisieť aj od spôsobu podania a vážnosti ochorenia alebo stavu a mala by byť rozhodnutá v súlade s posúdením praktického lekára a v súlade s okolnosťami každého pacienta. Ale dávky vhodné na intravenózne podanie sú vo všeobecnosti v rozsahu od približne 20 do približne 500 pg účinnej zlúčeniny na kilogram telesnej hmotnosti. Dávky vhodné na intranazálne podanie sú vo všeobecnosti v rozsahu približne od 0,01 pg/kg telesnej hmotnosti do približne 1 mg/kg telesnej hmotnosti. Účinné dávky sa môžu extrapolovať z kriviek dávkovej odpovede odvodených z in vitro experimentov alebo živočíšnych modelových testovacích systémov.

Vynález poskytuje aj farmaceutický balíček alebo kit obsahujúci jednu alebo viac nádob naplnených jednou alebo viacerými zložkami farmaceutických prostriedkov podľa vynálezu. Voliteľne môže byť k nádobe (nádobám) pripojená správa vo forme predpísanej vládnou agentúrou, ktorá reguluje výrobu, používanie a predaj framaceutických látok alebo biologických produktov, pričom táto správa odráža povolenie danej agentúry na výrobu, používanie a predávanie na podávanie ľuďom.

Diagnostika a skríning

Nogo proteíny, ich analógy, deriváty a subsekvencie, Nogo nukleové kyseliny (a ich komplementárne sekvencie), anti-Nogo protilátky majú využitie v diagnostike. Takéto molekuly môžu byť použité v testoch, ako napríklad imunologických testoch, na detekciu, prognózu, diagnostiku alebo monitoring rôznych stavov, ochorení a porúch ovplyvňujúcich Nogo expresiu alebo na monitoring ich liečby. Takýto imunotest sa uskutočňuje najmä spôsobom zahŕňajúcim uvedenie vzorky odobranej pacientovi do kontaktu s anti-Nogo protilátkou v podmienkach, v ktorých nastáva imunošpecifické viazanie, a detekciu alebo meranie množstva akéhokoľvek imunošpecifického viazania protilátky. V konkrétnom uskutočnení môže byť takéto viazanie protilátky v tkanivových rezoch použité na detekciu aberantnej Nogo lokalizácie alebo aberantných (napr. nízkych alebo žiadnych) hladín Nogo. V konkrétnom uskutočnení môže byť protilátka proti Nogo použitá na testovanie vo vzorke pacientovho tkaniva alebo séra na prítomnosť Nogo, pričom aberantná hladina Nogo je indikáciou chorobného stavu. „Aberantnými hladinami“ sa mienia zvýšené alebo znížené hladiny vzhľadom na hladinu, ktorá sa nachádza v analogickej vzorke časti tela subjektu bez daného ochorenia.

Imunologické testy, ktoré môžu byť použité, zahŕňajú, ale nie sú obmedzené, na kompetitívne a nekompetitívne testovacie systémy použitím techník, ako napríklad imunohistochémia, patológia, Westem bloty, rádiologické imunotesty, ELISA (s enzýmom spojený imunoabsorbčný test), „sendvičové“ imunotesty, imunoprocipitačné testy, precipitínové reakcie, gélové difúzne precipitínové reakcie, imunodifúzne testy, aglutinačné testy, komplementové fixačné testy, imunorádiometrické testy, fluorescenčné imunologické testy, imunohistochemické testy, imunologické testy s proteínom A, pričom vymenovaných bolo len niekoľko.

V hybridizačných testoch môžu byť použité aj Nogo gény a príbuzné nukleokyselinové sekvencie a subsekvencie, vrátane komplementárnych sekvencií. Ako hybridizačné sondy môžu byť použité Nogo nukleokyselinové sekvencie alebo ich subsekvencie s dĺžkou približne najmenej 8 nukleotidov. Hybridizačné testy sa môžu používať na detekciu, prognózu, diagnostiku alebo monitoring stavov, porúch alebo chorobných stavov asociovaných s aberantnými zmenami v Nogo expresii a/alebo aktivite, ako je opísané. Takýto hybridizačný test sa uskutočňuje najmä spôsobom zahŕňajúcim uvedenie vzorky obsahujúcej nukleovú kyselinu do kontak tu s nukleokyselinovou sondou schopnou hybridizovať s Nogo DNA alebo RNA v podmienkach, v ktorých môže nastať hybridizácia, a detegovanie alebo meranie akejkoľvek výslednej hybridizácie.

V konkrétnych uskutočneniach môžu byť choroby a poruchy zahŕňajúce bunkové rastové a vývinové poruchy diagnostikované alebo môže byť skrínovaná ich predpokladaná prítomnosť, alebo môže byť detegovaná predispozícia na vývin takýchto porúch, detegovaním znížených úrovní Nogo proteínu, Nogo RNA alebo Nogo funkčnej aktivity, čo je demonštrované rastovou inhibíciou alebo detegovaním mutácií v Nogo RNA, DNA alebo proteíne (napr. translokácií v Nogo nukleových kyselinách, skrátení v Nogo géne alebo proteíne, zmien v nukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencií vzhľadom na divý typ Nogo), ktoré spôsobujú pokles expresie alebo aktivity Nogo. Takéto choroby a poruchy zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na tie, ktoré sú opísané v časti Podstata vynálezu a časti s názvom Neoplastický rast. Ako príklad môžu byť hladiny Nogo proteínu detegované imunologickým testom, hladiny Nogo RNA môžu byť detegované hybridizačnými testami (napr. Northem blotmi, dot blotmi), viazanie sa Nogo na bunkové rastové inhibičné proteínové receptory sa môže detegovať väzobnými testami bežne známymi v oblasti translokácie a bodové mutácie v Nogo nukleových kyselinách sa môžu detegovať Southem blotom, RFLP analýzou, PCR použitím primérov, ktoré výhodné generujú fragment zahŕňajúci aspoň väčšinu Nogo génu, sekvenovaním Nogo genomickej DNA alebo cDNA získanej od pacienta atď.

Poskytnuté sú aj kity na diagnostické použitie, ktoré obsahujú jednu alebo viac nádob s anti-Nogo protilátkou a voliteľne značeného väzobného partnera protilátky. Alternatívne môžu byť anti-Nogo protilátky značené (s detegovateľným markerom, napr. chemiluminiscentnou, enzymatickou, fluorescenčnou alebo rádioaktívnou časťou). Poskytnutý je aj kit, ktorý obsahuje jednu alebo viac nádob s nukleokyselinovou sondou schopnou hybridizovať s Nogo RNA. V konkrétnom uskutočnení kit môže obsahovať jednu alebo viac nádob s párom primérov (napr. každý s veľkosťou od 6 do 30 nukleotidov), ktoré sú schopné primovať amplifikáciu aspoň časti Nogo nukleovej kyseliny (napr. polymerázovou reťazovou reakciou (pozri napr. Innis a ďalší, PCR Protocols, Academic Press, Inc. Sand Diego, CA), ligázovou reťazovou reakciou (pozri EP 320308) použitím ζ)β replikázy, cyklickou sondovou reakciou alebo inými spôsobmi známymi v oblasti) v príslušných reakčných podmienkach. Kit môže voliteľne ďalej obsahovať v nádobe vopred určené množstvo purifikovaného Nogo proteínu alebo nukleovej kyseliny, napr. na použitie ako štandardu alebo kontroly.

Skríning na Nogo agonisty a antagonisty

Nogo nukleové kyseliny, proteíny a deriváty sa používajú aj na skríningové testy na detekciu molekúl, ktoré sa špecificky viažu na Nogo nukleové kyseliny, proteíny alebo deriváty, a tak majú potenciálne využitie ako agonisty alebo antagonisty Nogo, najmä molekuly, ktoré tak ovplyvňujú bunkovú rastovú reguláciu. Vo výhodnom uskutočnení sa takéto testy uskutočňujú na skríning molekúl, ktoré majú potenciálne využitie ako nervové rastové promótory na vývoj liečiv. Vynález tak poskytuje testy na detekciu molekúl, ktoré sa špecificky viažu na Nogo nukleové kyseliny, proteíny alebo deriváty. Napríklad, rekombinantné bunky exprimujúce Nogo nukleové kyseliny sa môžu použiť na rekombinantnú produkciu Nogo proteínov v týchto testoch, aby sa skrínovali molekuly, ktoré sa viažu na Nogo proteín. Molekuly (napr. pravdepodobní väzobní partneri Nogo) sa uvádzajú do kontaktu s Nogo proteínom (alebo jeho fragmentom) v podmienkach, ktoré vedú ku viazaniu, a potom sa identifikujú molekuly, ktoré sa špecificky viažu na Nogo proteín. Podobné metódy je možné použiť na skríning molekúl, ktoré sa viažu na Nogo deriváty alebo nukleové kyseliny. Spôsoby, ktoré je možné použiť na uskutočňovanie uvedeného, sú bežne známe v oblasti.

Ako príklad sa môžu skrínovať diverzitné knižnice, ako napríklad knižnice náhodných alebo kombinatoriálnych peptidov alebo nepeptidov na molekuly, ktoré sa špecificky viažu na Nogo. Mnohé knižnice sú známe v oblasti a môžu byť použité, napr. chemicky syntetizované knižnice, rekombinantné (napr. fágové displejové knižnice) a knižnice založené na in vitro translácii.

Príklady chemicky syntetizovaných knižníc sú opísané vo Fodor a ďalší, 1991, Science 251:767-773; Houghten a ďalší, 1991, Náture 354:84-86; Lam a ďalší, 1991, Náture 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallop a ďalší, 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9): 1233-1251; Ohlmeyer a ďalší, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb a ďalší, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten a ďalší, 1992, Biotechmques 13:412; Jayawickreme a ďalší, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon a ďalší, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT publikácia č. WO 93/20242; a Brenner a Lemer, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383.

Príklady fágových displejových knižníc sú opísané v Scott a Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin a ďalší, 1990, Science, 249:404-406; Christian, R.B., a ďalší, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay a ďalší, 1993, Gene 128:59-65; a PCT publikácii č. WO94/18318 z 18. augusta 1994.

Knižnice založené na in vitro translácii zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na knižnice opísané v PCT publikácii č. WO 91/05058 z 18. apríla 1991; a Mattheakis a ďalší, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026.

Ako príklady nepeptidových knižníc môžu byť na použitie adaptované benzodiazepínové knižnice (pozri napr. Bunin a ďalší, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712). Použité môžu byť aj peptoidové knižnice (Šimon a ďalší, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371). Iný príklad knižnice, ktorá môže byť použitá, v ktorej sú amidové funkčné skupiny v peptidoch permetylované, čím sa generuje chemicky transformovaná kombinatoriálna knižnica, je opísaný v Ostresh a ďalší (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142).

Skríning knižníc sa môže uskutočňovať akýmkoľvek z rôznych bežne známych spôsobov. Pozri napr. publikácie, ktoré opisujú skríning peptidových knižníc: Parmley a Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott a Smith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkes a ďalší, 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburg a ďalší, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu a ďalší, 1994, Celí 76:933-945; Staudt a ďalší, 1988, Science 241:577-580; Bock a ďalší, 1992, Náture 355:564-566; Tuerk a ďalší, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington a ďalší, 1992, Náture 355:850-852; US patent č. 5096815, US patent č. 5223409 a US patent č. 5198346 všetky v mene Ladner a ďalší; Rebar a Pabo, 1993, Science 263:671-673; a PCT publikácia č. WO 94/18318.

V konkrétnom uskutočnení sa skríning môže uskutočňovať uvedením členov knižnice do kontaktu s Nogo proteínom (alebo nukleovou kyselinou, alebo derivátom) imobilizovaným na tuhej fáze a zachytením tých členov knižnice, ktoré sa viažu na proteín (alebo nukleovú kyselinu, alebo derivát). Príklady takýchto skríningových metód, ktoré sa označujú ako „panningové“ techniky, sú uvedené napríklad v Parmley a Smith,

1988, Gene 73:305-318; Fowlkes a ďalší, 1992, BioTechniques 13:422-427; PCT publikácii č. WO 94/18318; a v citovaných publikáciách.

V inom uskutočnení môže byť na identifikáciu molekúl, ktoré sa špecificky viažu na Nogo proteín alebo derivát, použitý dvojhybridný systém na selekciu interagujúcich proteinov v kvasinkách (Fields a Song,

1989, Náture 340:245-246; Chien a ďalší, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582).

Živočíšne modely

Vynález poskytuje aj živočíšne modely vrátane, ale bez obmedzenia na modely v myšiach, škrečkoch, ovciach, ošípaných, hovädzom dobytku a výhodne nehumánnych cicavcoch.

V jednom uskutočnení sú poskytnuté živočíšne modely chorôb a porúch zahŕňajúcich predlžovanie, rast a regeneráciu neuritov. Takýto živočích sa môže najprv vyprodukovať podporou homologickej rekombinácie medzi Nogo génom na jeho chromozóme a exogénnym Nogo génom, ktorý sa biologicky inaktivoval (výhodne začlenením heterológnej sekvencie, napr. génu rezistencie na antibiotikum). Vo výhodnom uskutočnení sa táto homologická rekombinácia uskutočňuje transformovaním od embrya odvodených kmeňových buniek (ES) s vektorom obsahujúcim inzerčne inaktivovaný Nogo gén tým, že nastala homologická rekombinácia, nasleduje injekcia ES buniek do blastocytu a implantácia blastocytu do matky, ktorej sa narodí chimémy živočích („knokaut živočích“), v ktorom je Nogo gén inaktivovaný (pozri Capecchi, 1989, Science 244:12881292). Chimémy živočích sa môže krížiť, aby sa vyprodukovali ďalšie knokautové zvieratá. Takýmito zvieratami môžu byť myši, škrečky, ovce, ošípané, teľatá atď. a výhodne iné ako humánne cicavce. V konkrétnom uskutočnení sa produkuje knokautová myš.

Pri takýchto knokautových zvieratách sa predpokladá vývoj alebo predispozícia na vývoj ochorení alebo porúch zahŕňajúcich centrálny nervový systém a tak môžu byť použité ako živočíšne modely takých chorôb a porúch, napr. na skríning alebo testovanie molekúl (napríklad potenciálnych terapeutík porúch nervového systému) na schopnosť inhibovať nádory nervového tkaniva a tak liečiť alebo predchádzať takýmto chorobám alebo poruchám.

Rozsah vynálezu nie je obmedzený uloženými mikroorganizmami, ani tu opísanými konkrétnymi uskutočneniami. V skutočnosti budú pre priemerného odborníka v oblasti zrejmé z predchádzajúceho opisu a pripojených obrázkov rôzne modifikácie vynálezu okrem tých, ktoré tu boli opísané. Takéto modifikácie sú mienené ako modifikácie spadajúce do rozsahu pripojených nárokov.

Sú tu uvedené rôzne publikácie, ktorých obsahy sú tu kompletne zahrnuté ich citovaním.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok la-lb: (a) Nogo cDNA klony: CWP1-3 je hovädzí cDNA kloň izolovaný zo skríningu cDNA knižnice hovädzej miechovej bielej hmoty s degenerovanými oligonukleotidmi MSC5-8 (spojené) a MSC9. Komplementárna RNA odvodená od tohto klonu sa následne použila na skríning potkanej cDNA knižnice. Oli3 a O1Í18 sa izolovali z oligo d(T)-primovanej potkanej oligo-dendrocytovej knižnice. R1-3U21, RO18U1 a RO18U37-3 sa izolovali z hexa-nukleotidmi primovanej potkanej knižnice mozgového kmeňa a miechy(Stratagene). Polohy 6 hovädzích NI220 (bNI220) peptidových sekvencií sú označené na CWP1-3 a R13U21. Sekvencie v spojniciach dvoch odlišných exónov sú označené na vrchu každého klonu. Otázniky vyznačené na RO18U1 identifikujú sekvenciu tohto klonu, ktorá sa nezhoduje so žiadnou zo sekvencií aké hokoľvek iného Nogo klonu. RO18U37-3 bol sekvenovaný len z 5’ konca a neosekvenovaná časť je vyznačená bodkami, (b) Schémy demonštrujú hypotetický mechanizmus generovania troch Nogo transkriptov. PI a P2 označujú pravdepodobnú lokalizáciu alternatívnych promótorov. Minimálne tri exóny sú potrebné na generovanie troch transkriptov, ako je schematicky znázornené, hoci každý exón by mohol byť potenciálne rozdelený na viacero exónov.

Obrázok 2a-2b: (a) Nukleotidová (SEQ ID NO:1) a aminokyselinová (SEQ ID NO:2) sekvencia Nogo transkriptu A (sekvencia generovaná spojením RO18U37-3, Olil8 a R1-3U21 cDNA sekvencií). Oválny box: predpokladaný iniciačný kodón; bodkované podčiarknuté: kyslý pás; : potenciálne PKC miesta; Δ: potenciálne miesta kazeín kinázy II; hrubo podčiarknuté: karboxy-koncové hydrofóbne oblasti a potenciálne transmembránové domény; tenko podčiarknuté: potenciálne N-glykozylačné miesta, (b) Porovnanie peptidových sekvencií sekvenovaných purifikovaných hovädzích NI220 (bNI220; SEQ ID NOS:3-8) a zodpovedajúcich hovädzích (SEQ ID NOS:9-14) a potkaních (SEQ ID NOS: 15-20) sekvencií translatovaných z potkaních a hovädzích cDNAs. Malým písmom sú znázornené potkanie a hovädzie aminokyselinové sekvencie, ktoré sa nezhodujú s bNI220 peptidovými sekvenciami.

Obrázok 3a-3b: (a) Porovnanie aminokyselinovej sekvencie karboxy-koncových spoločných oblastí NSP s dĺžkou 180 aminokyselín (ľudská; SEQ ID NO: 21), S-REX (potkania) (SEQ ID NO:22), CHS-REX (kuracia; SEQ ID NO:23), BOGOBOV (hovädzia; SEQ ID NO:24), NOGORAT (potkania; SEQ ID NO:25) a C. elegans EST kloň (WO06A7A; SEQ ID NO:26) a D. melanogaster EST kloň (US51048; SEQ ID NO:27). (b) Evolučná konzervovanosť dvoch hydrofóbnych oblastí. Znázornené je percento podobnosti v rámci druhov a medzi druhmi v spoločných hydrofóbnych oblastiach. Vytieňované písmená: konzervované aminokyseliny.

Obrázok 4a-4c: (a) Northem hybridizácia rôznych tkanív s Nogo spoločnou sondou. Spoločná sonda obsahuje sekvenciu transkriptu A medzi nukleotidmi 2583 až 4678. ON: očný nerv, SC: miecha; C: mozgový kortex; DRG: dorzálne koreňové gangliá; SN: sedací nerv; PC12: PC 12 bunková línia, (b) Northem hybridizácia miechových a PC 12 bunkových RNA so sondou špecifickou pre exón 1 (ľavý panel) a Northem hybridizácia RNA zadného mozgu (HB) a RNA kostrových svalov (M) so sondou špecifickou pre exón 2 (pravý panel), (c) Northem hybridizácia s Nogo spoločnou sondou. K: obličky; B: chrupavka (z rebra); Sk: koža; M: kostrový sval; Lu: pľúca; Li: pečeň; Sp: slezina. Tri hlavné transkripty sú označené (4,6 kilobázy (kb), 2,6 kb a 1,7 kb). Δ: difúzny, ale konzistentný pás s veľkosťou približne 1,3 kb.

Obrázok 5a-5f: In situ hybridizácia rezov miechy a mozočka dospelého potkana, (a, d) Rady oligonendrocytov (OL) v mieche a bielej hmote mozočka je možné označiť Nogo antisense „spoločnou“ ribosondou. Toto je veľmi podobné signálom, ktoré boli detegované, keď sa po sebe idúce rezy miechy hybridizovali s antisense plop ribosondou (b), (c) Aj neuróny v sivej hmote (GM) boli značené Nogo antisense „spoločnou“ ribosondou. WM: biela hmota. Obraz na bielom poli, respektíve fluorescenčný obraz rezov mozočka dvojmo značených Nogo antisense „spoločnou“ ribosondou (e) a anti-GFAP protilátkou (f). Purkineho bunky (dvojité hlavičky šípok) sa silne značili s Nogo sondou, zatiaľ čo astrocyty (hlavičky šípok, čierna a biela) boli negatívne. Aj niekoľko buniek v granulárnej bunkovej vrstve (Gr) sa značilo s Nogo sondou, m: molekulová vrstva. Mierka: a, b, d-f: 50 p.m.; c: 280 p.m.

Obrázok 6a-6i: In situ hybridizácia očných nervov v rozličných postnatálnych dňoch (a, f: PO; b,g: P3; c, h: P7; d, e, i: P22) buď s Nogo, alebo s plp (antisense alebo sense) sondami, (a-d) Nogo antisense sonda; (e) Nogo sense sonda; (g-i) plp antisense sonda; (f) plp sense sonda. Nogo expresiu v oligodendrocytových prekurzoroch je možné detegovať už v PO, zatiaľ čo plp expresia len začínala byť detekovateľná v P3 v očných nervoch blízko chiazmy (g).

Obrázok 7: Tak AS Bruna, ako aj AS 427 rozoznávajú myelínový proteín s veľkosťou približne 200 kD. Extrakt potkanieho myelínu a hovädzí q-izolát sa pripravili podľa Spillmann a ďalší, 1998, J. Biol. Chem., 273(30): 19283-19293. Tak AS Bruna, ako aj AS 472 rozoznávali 200 kD pás, ako aj niekoľko nižších pásov v hovädzom myelíne, ktoré môžu byť produktmi štiepenia bNI220. AS Bruna farbila 200 kD pás v potkaňom myelíne. I: AS Bruna; P: AS Bruna, vopred imunizované sérum; E: AS 472 afinitne purifikované.

Obrázok 8a-8i: Imunohistochémia na potkanej mieche a mozočku použitím IN-1 (a-e), AS Bruna (d-f) a AS 472 (g-i), ako je uvedené na ľavej strane každého panelu. Silné farbenie myelínu sa pozorovalo v oboch tkanivách so všetkými troma protilátkami, keď boli mrazené rezy fixované so zmesou etanol/kyselina octová (a, b, d, e, g, h). Ošetrenie rezov s metanolom zrušilo farbenie myelínu s výnimkou oligodendrocytových bunkových teliesok (šípky; c, f, i). Hlavičky šípok: Purkineho bunky, WM: biela hmota; GM: sivá hmota, DR: dorzálny koreň; Gr, granuláma bunková vrstva; m: molekulová vrstva. Mierka: a, d, g: 415 pm: b, c, e, f, h, i: 143 pm.

Obrázok 9a-9d: Neutralizačná aktivita AS 472 a AS Bruna v rozličných biotestoch. (a) NIH 3T3 fibroblasty sa umiestnili na bunkové kultivačné platne pokryté q-izolátom a vopred ošetrené s IN-1, AS Bruna, AS 472 alebo zodpovedajúcim pre-imunitným sérom. Obe polyklonálne séra mali len mierne lepšiu neutralizáciu inhibičného substrátu ako IN-1. Vopred imunizované séra nemali žiadny významný účinok na šírenie NIH 3T3 buniek. Pridanie nadbytku peptidu (P472), ktorý bol použitý na vyvolanie AS 472, konkurovalo neutra lizačnej aktivite, zatiaľ čo nešpecifický peptid (Px) nemal žiadny účinok, (b) Výsledkom predošetrenia inhibičného substrátu s AS Bruna alebo AS 472 bol DRG neuritové vyrastanie porovnateľné s vyrastaním, ktoré bolo možné pozorovať na laminínovom substráte. Príklady nerutivého vyrastania z DRG na q-izoláte vopred ošetrenom s PBS (c; skóre = 0) a vopred ošetrenom s AS Bruna (d; skóre = 4).

Obrázok lOa-lOd: Výsledkom injekcie AS 472 do očných nervových explantátov je vrastanie axónov. (a) Vyrezal sa pár očných nervov potkana, injekčné sa doň zaviedla AS 472 alebo preimunitné sérum a umiestnil sa do komorových kultúr tak, aby bol jeden koniec nervov v kontakte s disociovanými PO potkaními DRG neurónmi, (b) Po dvoch týždňoch in vitro sa z miesta rezu (šípky na obrázku A) odobrali EM rezy nervov s dĺžkou 3,5 mm a systematicky sa skrínovali na prítomnosť intaktných axónov (3 experimenty), (c) Zväzky regenerovaných axónov (šípky) rastú cez degenerovaný očný nerv, do ktorého bola injektovaná AS 472. (d) Regenerujúce axóny v kontakte s myelínom. Zväčšenie: c: 12 OOOx; d: 35 OOOx.

Obrázok 11 a-11 c: Rekombinantná Nogo A expresia v transfekovaných COS bunkách, (a) Westem blot ukazujúci imunoreaktivitu AS Bruna proti rekombinantnému Nogo A (dráha 2) a endogénnemu Nogo A z primárnych kultivovaných potkaních oligodendrocytov (dráha 3). Mobilita týchto dvoch proteinov je prakticky rovnaká ako mobilita proteinov s hmotnosťou 200 kD na 5 % denaturačnom SDS géli. Kontrolná vzorka transfekovaná LacZ konštruktom (dráha 1) nevykazuje imunoreaktivitu s AS Bruna. Rovnaký blot bol sondovaný aj s anti-myc protilátkou, 9E10, ako je uvedené. Pás, ktorý reagoval s AS Bruna, reagoval aj s anti-myc príveskovou protilátkou, 9E10 (dráha 5), zatiaľ čo endogénny Nogo A nereagoval (dráha 6). Kontrolná vzorka transfekovaná s LacZ mala očakávaný pás s veľkosťou približne 118 kD (dráha 4). COS bunky prechodne transfekované s Nogo A konštruktom sa dvojmo farbili s AS Bruna (b) a IN-1 (c). Bunky, ktoré sa pozitívne farbili s AS Bruna, boli pozitívne aj s IN-1.

Obrázok 12: Nukleotidová sekvencia (SEQ ID NO:28) hovädzej Nogo cDNA.

Obrázok 13: Aminokyselinová sekvencia potkanieho Nogo A (SEQ ID NO:2) zarovnaná s teoretickou aminokyselinovou sekvenciou ľudského Nogo (SEQ ID NO:29). Ľudská Nogo aminokyselinová sekvencia sa odvodila zoradením exprimovaných sekvenčných príveskov (EST) podľa potkanej Nogo sekvencie a translatovaním zoradených ľudských ESTs použitím potkanieho Nogo ako navádzacieho templátu.

Obrázok 14: Potkania Nogo C nukleokyselinová (SEQ ID NO:31) sekvencia a jej zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia (SEQ ID NO:32).

Obrázok 15a-15e: Nogo A sa nachádza na oligodendrocytovej plazmatickej membráne, ako je demonštrované imunocytochemickou technikou a bunkovou povrchovou biotinyláciou oligodendrocytov v kultúre.

Imunocytochémia (a-d): Oligodendrocyty z očných nervov P10 potkanov sa disociovali a kultivovali sa 2 dni. Farbenie živých buniek s mAb IN-1 (a) alebo AS 472 (c) ukázalo imunoreaktivitu v oligodendrocytových bunkových telieskach a procesoch. V prítomnosti kompetičného peptidu P472 mala AS 472 len farbenie pozadia (všetky typy) (d). Podobné nešpecifické farbenie bolo vidieť, keď sa vynechali primáme protilátky (b). Zhodnotenie: Misky označené kódom boli náhodne zmiešané a klasifikované 3 nezávislými pozorovateľmi. 8/10 misiek bolo klasifikovaných správne, ako AS 472-pozitívne, mAb IN-1-pozitívne alebo kontroly, všetkými troma pozorovateľmi.

Biotinylácia (e): Potkanie P4 kultúry z celého mozgu obohatené o oligodendrocyty sa biotinylovali na bunkovom povrchu s membránovým nepermeabilným reakčným činidlom po siedmych dňoch v kultúre. Následne sa bunkové homogenáty ošetrili so streptavidín-Dynaguľôčkami. Precipitát (Ppt) a supematant (sup) sa blotovali s AS 472. Mali rozdielny proteínový vzor: Bunkový povrchový Nogo A nájdený v precipitáte mal vyššiu zdanlivú molekulovú hmotnosť ako vnútrobunkový Nogo A. Tento posun je pravdepodobne spôsobený glykozyláciou. Luminálny ER proteín BiP a veľkú väčšinu β-tubulínu bolo možné nájsť len vo vnútrobunkovej frakcii.

Obrázok 16a-16j: Funkčné testy dokazujú prítomnosť Nogo A na bunkovej membráne oligodendrocytov. Predinkubovanie očných nervových kultúr s AS 472 (a, b) umožnilo, aby sa NIH 3T3 fibroblasty rozšírili cez značne rozvetvené oligo-dendrocyty, ktoré sú zvýraznené imunofluorescenčným farbením s GalC (01 protilátka) (a). Šípky na zodpovedajúcom fázovom kontrastnom obraze (b) označujú NIH 3T3 fibroblasty rozšírené na vrchu oligodendrocytov. (c, d): Keď sa AS 472 pridala spolu s P472, NIH 3T3 fibroblasty striktne obchádzali teritóriá GalC-pozitívnych oligodendrocytov (hlavičky šípok) (Caroni a Schwab, 1988 Neurón 1:85-96). (e,f): V prítomnosti AS 472 boli PO potkanie disociované DRG neuróny schopné predlžovať neurity cez teritórium značne rozvetvených oligodendrocytov (šípky na f), (g,h): Peptid P472 účinne konkuroval neutralizačnej aktivite AS 472: neurity sa úplne vyhýbali oligodendrocytom. AS 472 používaná v týchto experimentoch bola generovaná proti potkanej 472 peptidovej sekvencií. (i,j): Kvantifikácie týchto výsledkov (ako je opísaná v metódach) demonštrovala silnú neutralizačnú aktivitu AS 472 v oboch typoch testov. Mierka: 40 pm.

Obrázok 17a-17e: Rekombinantný Nogo A je inhibičný substrát a jeho inhibičná aktivita je neutralizovaná s mAb IN-1. O RecNogo A obohatené extrakty zo stabilnej CHO-Nogo A bunkovej línie, alebo β-galaktozidáza, izolovaná súčasne zo stabilnej CHO-LacZ bunkovej línie sa naniesli na testovanie šírenia NIH 3T3 fibroblastov a na test DRG neuritového vyrastania, (a) Strieborný gél myc-his-príveskového recLacZ (dráha

1) a recNogo A (dráha 2) ukazuje Nogo A pás s veľkosťou 180 kD. Identita Nogo A pásu sa potvrdila Westem blot inkubovaním s AS Bruna (dráha 3) a anti-myc protilátkami 9E10 (dráha 4). (b) RecNogo A pokryté misky boli jasne inhibujúce pre šírenie NIH 3T3. Výsledkom predinkubovania s mAb IN-1 alebo AS Bruna bola veľmi významná (p < 0,01) neutralizácia inhibičnej aktivity. Kontrola lgM mAb 01 a pre-imunitné sérum boli neúčinné. CHO-LacZ extrakt mal čiastočný inhibičný účinok na NIH 3T3 bunky, pravdepodobne vďaka endogénnym CHO proteínom. Tento inhibičný účinok nebol ovplyvnený predinkubovaním s protilátkami.

(c) Na testy vyrastania DRG neuritov bol zmiešaný s laminínom a nanesený rovnaký proteínový materiál ako v (b). RecNogo A mal veľmi účinný inhibičný efekt na vyrastanie neuritov disociovaných DRG od dávky závislým spôsobom. Aktivita bola neutralizovaná s mAb IN-1 (p < 0,001), ale nie kontrolnou mAb 01. Proteínový materiál izolovaný z CHO-LacZ buniek nebol inhibičný v žiadnej z použitých koncentrácií, ani inkubovanie s protilátkami nemalo žiadny účinok na vyrastanie neuritov. Príklady určovania skóre sú uvedené na (d): 1 pg recNogo A, žiadne alebo krátke neurity (šípky), skóre: 2, a na (e): 1 pg CHO-LacZ, dlhé, rozvetvené neurity (hlavičky šípok), skóre: 5-6. Štatistická analýza sa uskutočňovala dvojitým Študentovým testom.

Obrázok 18: Funkčná analýza Nogo delečných mutantov. Nasledujúce delečné konštrukty kódujúce fúzované proteíny, ktoré obsahujú fragmenty Nogo alebo skrátené časti Nogo (ako sú uvedené), boli generované ako je opísané v príkladovej časti 2.7.

Nogo-A: His-prívesok/T7-prívesok/vektor/Nogo-A sekv. aal-1162

Nogo-B: His-prívesok/T7-prívesok/vektor/Nogo-A sekv. aal-171+975-1162 Nogo-C: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-C N-koniec (11 aa)+Nogo-A sekv. aa 975-1162 NiAext: His-prívesok/T7-prívesok/vektor/Nogo-A sekv. aal-974/T7-prívesok NiR: His-prívesok/T7-prívesok/vektor/Nogo-A sekv. aal-171/vektor NiG: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-974/His-prívesok EST: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aa760-1162

NiG-Dl: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-908/vektor NÍG-D2: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-866/His-prívesok NÍG-D3: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-723/His-prívesok NÍG-D4: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-646/vektor NÍG-D5: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aa291-646/His-prívesok NÍG-D7: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-234+292-974/His-prívesok NÍG-D8: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-628

NÍG-D9: IIis-prívesok^/T7-prívesok^/Nogo-A sekv. aal72-259+646-974/His-prívesok NiG-DlO: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aa291-974/His-prívesok NÍG-D14: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-259

NÍG-D15: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-189+491-974/His-prívesok NÍG-D16: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-189+619-974/His-prívesok NÍG-D17: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-189+257-974/His-prívesok NÍG-D18: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aal72-189+261-974/His-prívesok NÍG-D20: His-prívesok/T7-prívesok/Nogo-A sekv. aa542-722/His-prívesok

Čísla aminokyselín (aa) sú vztiahnuté na číslovanie potkanej Nogo A aminokyselinovej sekvencie (SEQ ID NO:2) začínajúcej prvým metionínom. His-prívesok a T7-prívesok pozostávajú z 34 aminokyselín. N- a C-koncové vektorové sekvencie sú odvodené od expresného vektora pET28.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Charakterizácia nukleotidového a proteínového produktu Nogo génu

Tu opísané príklady demonštrujú, že klonovaný gén Nogo kóduje proteín, ktorý je účinným nervovým bunkovým rastovým inhibítorom, a je aj rozoznávaný monoklonálnymi protilátkami opísanými v Schwab a ďalší, US patent č. 5684133.

Materiál a metóddy

Nasledujúce časti opisujú materiály a metódy používané v predloženom vynáleze. Priemernému odborníkovi v oblasti bude zrejmé, že tieto materiály a metódy sú len ilustrácie predloženého nárokovaného vynálezu a pôvodcovia berú do úvahy aj modifikácie. Takéto modifikácie sú mienené ako spadajúce do rozsahu pripojených nárokov.

1.1 Purifikácia hovädzieho Nogo z myelínu

Všetky purifikačné kroky sa uskutočňovali pri 4 °C a inhibičná substrátová aktivita získaných frakcií sa rutinne stanovovala testom NIH 3T3 šírenia a testom vyrastania neuritov PC12 (príkladová časť 1.10). Hovädzie miechové tkanivo sa opatrne očistilo odstránením meningov a porezalo sa na malé kúsky. Potom sa extrahoval myelín v extrakčnom tlmivom roztoku (60 mM CHAPS, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA tlmivý roztok, pH 8,0, 2,5 mM jódacetamid, 1 mM fenylmetyl-sulfonylfluorid, 0,1 pg/ml aprotínu, 1 pg/ml leupeptínu, 1 pg/ml pepstatínu A).

Na získanie miechového extraktu sa tkanivo homogenizovalo priamo v CHAPS extrakčnom tlmivom roztoku v pomere 1 : 1 (w : v). Homogenát sa dvakrát centrifugoval pri 100 OOOxg (Kontron typ: K.50-13, fixovaný uhol) 1 hodinu pri 4 °C. Čistý supematant (extrakt) sa okamžite naniesol na Q-Sepharose kolónu (2,6x11,5 cm), ekvilibrovanú v tlmivom roztoku A (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0,5 % (w/v) CHAPS). Naviazané proteíny sa eluovali päťnásobkom objemu kolóny lineárnym gradientom od 0 do 1 M NaCl tlmivým roztokom A (100 ml gradientu za 50 minút). Aktívne frakcie obsahujúce hovädzí NI220 eluovali okolo 0,4 M NaCl a spojili sa (q-pool 1) na ďalšie nanesenie na Superdex 200 (2,6 x 60 cm) kolónu, ekvilibrovanú v tlmivom roztoku B (150 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,5 % (w/v) CHAPS).

Aktívne frakcie sa po gélovej filtrácii (s-pool 1) oddelili prostredníctvom 6 % SDS-PAGE v redukčných podmienkach pri nízkom konštantnom príkone (2 W/gél) celkovo 2500 volt-hodín. Pásy a gélové oblasti sa identifikovali po farbení s Coomoassie Blue (0,1 % w/v R250 v 50 % metanole a 10 % kyseline octovej), vyrezali sa a extrahovali sa v 800 μΐ gólového elučného tlmivého roztoku (0,5 % (w/v) CHAPS, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, pH 8,0, 2,5 mM jódacetamid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,1 pg/ml aprotínu, 1 pg/'ml leupeptínu, 1 pg/ml pepstatínu A) najmenej 48 hodín pri 4 °C.

1.2 Mikrosekvenovanie purifikovaného Nogo

IN-1 neutralizovateľný aktívny gélom eluovaný materiál niekoľkých gélov sa opäť zbehol na 10 % SDS-polyakrylamidovom géli v redukujúcich podmienkach a vyfarbil sa s 0,1 % (w/v) Coomassie Blue R250 v 50 % metanole a 10 % kyseline octovej. 220kDa pás sa vyrezal a uskutočnilo sa priamo štiepenie s endoproteinázou Lys-C (1:50 molámy pomer) v géli. Vzorka sa okyslila a naniesla sa na kolónu na uskutočňovanie reverznej fázovej chromatografie s vysokou rozlišovacou schopnosťou, kde sa peptidy odseparovli s lineárnym gradientom (0-100 %) 0,04 % kyseliny trifluóroctovej a 80 % acetonitrilu a frakcie obsahujúce jednopeptidové vzorky sa podrobili automatizovanej Edmanovej degradácii.

1.3. Elektroforéza purifikovaného Nogo

SDS-PAGE s vysokou rozlišovacou schopnosťou sa uskutočňovala použitím 6 % (w/v) SDS-polyakrylamidových gélov (10x24x0,01 cm) v redukčných podmienkach (10 mM ditiotreitol). Transfer na ImmobilonP membrány (Millipore) sa uskutočňoval v 20 mM Tris báze, 192 mM glycíne, pH 8,3, 0,037 % (w/v) SDS, 20 % metanole so semi-suchou transferovou aparatúrou (Bio-Rad, Trans Biot SD). Transferový čas bol 2 hodiny pri 0,8 fliA/cm². Blokovacím reakčným činidlom (1 hodinu pri laboratórnej teplote) bola 3 % želatína v PBS (fosfátom tlmený fyziologický roztok, pH 7,2, 8 g NaCl, 0,2 g KH₂PO₄, 2,8 g Na₂HPO₄.12H₂O a 0,2 g KC1 rozpustených v 1 litri vody) a premývací roztok obsahoval 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl a 0,4 % Tween (3x10 minút pri laboratórnej teplote). Inkubačný čas pre prvú protilátku (na riedenie s 1 % gelatínou v PBS) bol zvyčajne cez noc pri 4 °C. Anti-myšia IgG sekundárna protilátka konjugovaná s chrenovou peroxidázou (1 : 2000) sa inkubovala hodinu pri laboratórnej teplote. Na detekciu sa používal ECL chemiluminiscenčný systém (Amersham Pharmacia Biotech).

1.4 Sondovanie cDNA knižnice

Z hovädzej miechy sa čerstvo izolovala biela hmota a extrahovala sa poly(A)⁺ RNA použitím FastTrack kitu (Invitrogen). Konštrukcia cDNA knižníc sa uskutočňovala použitím UniZap kitu (Stratagene) podľa inštrukcií výrobcu. Komplexnosť knižníc bola celkovo vyššia ako 4xl0⁶ plak vytvárajúcich jednotiek a priemerná veľkosť inzertov bola približne 1,8 kilobáz.

Degenerovaná oligonukleotidy MSC5-8,

MSC5: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGYAARTC (SEQ ID NO:47);

MSC6: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID NO:48); MSC7: TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:49);

MSC8: TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:50) sa navrhli na základe sekvencie bNI220 peptidu 1 a

MSC9: GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA (SEQ ID NO:51) sa navrhla na základe sekvencie bNI220 peptidu 2. Oligonukleotidy sa syntetizovali prostredníctvom MWG Biotech (Munchenstein, Švajčiarsko) a značili sa s DIG DNA 3’-koncovým značkovacím kitom. Ribosondy sa syntetizovali použitím DIG RNA značkovacieho kitu (Boehringer Mannheim).

Podmienky na hybridizáciu sondy a na premývanie opisuje výrobca (MSC5-8 a MSSC9 sa používali pri hybridizačnej a premývacej teplote 57 °C). Detekcia sondy sa uskutočňovala použitím CDP-star systému (Boehringer Mannheim). Práca s cDNA knižnicou a jej skríning sa uskutočňovali podľa protokolov pre lambda ZAP cDNA knižnice (Stratagene). Na liftovanie plakov boli použité Genescreen (DuPont) nylonové membrány.

1.5 DNA sekvenovanie

Obe vlákna CWP1-3, Olil8, Oli3 a R1-3U21 sa sekvenovali s Perkin Elmer AB1377 systémom prostredníctvom Microsynth (Balgach, Švajčiarsko). DNA sekvencie sa analyzovali programom DNASIS (Hitachi). Prieskum databáz sa uskutočňoval programom BLAST (NCBI).

1.6 Analýza RNA

Celková RNA a poly(A)⁺ RNA sa extrahovli z tkanív použitím RNAgent (Promega) kitu, respektíve Fastľrack kitu (Invitrogen). RNAs sa oddelili elektroforézou na 1 % formaldehydových géloch a preniesli sa na Genescreen membrány. Bloty sa hybridizovali s antisense ribosondami, ktoré boli generované s DIG RNA značkovacím kitom (Boehringer Mannheim) z relevantných plazmidov. Podmienky hybridizácie blotov, premývania a CDP-star detekcie sú opísané výrobcom. „Spoločná“ sonda EST111410 (TIGR, ATCC, Rockville, MD, USA) obsahuje transkript A sekvencie medzi nukleotidmi 2535 a 4678, exón 1 špecifická sonda obsahuje transkript A sekvencie medzi nukleotidmi 65 a 769, a exón 2 špecifická sonda obsahuje transkript A sekvencie medzi nukleotidmi 815 a 3183.

1.7 Produkcia antisér

Antisérum 472 (AS 472) sa generovalo spoločnosťou Research Genetics, Inc. (Huntsville Al, USA) proti syntetickému peptidu P472, SYDSIKLEPENPPPYEEA (hovädzia sekvencia; SEQ ID NO:33), ktorý zodpovedá potkanej Nogo aminokyselinovej sekvencií od 623 do 640 SEQ ID NO:2, s troma nespárovaniami.

Antisérum Bruna (AS Bruna) sa generovalo proti fragmentu rekombinantného Nogo proteínu exprimovanému v E. coli vo forme fúzovaného proteínu. Konkrétne, karboxy-koniec potkanej Nogo A nukleotidovej sekvencie kódujúcej aminokyseliny 762 až 1163 sekvencie SEQ ID NO:2 (exprimovanej v E. coli použitím Novagen pET systému) sa použil na generovanie AS Bruna anti-Nogo antiséra.

1.8 Elektroforéza a Westem Bloting

SDS-PAGE a Wester bloting sa uskutočňovali štandardnými spôsobmi, ktoré sú dobre známe pre priemerného odborníka v oblasti. Protilátky boli riedené nasledovne: AS Bruna 1:7500; AS 472 1:2000; anti-myc (9E10) 1:5000 (Invitrogen); anti-BiP 2 Lig/ml (Stressgen); mAb IN-1 hybridómový supematant sa používal neriedený. Sekundárne protilátky boli: HRP konjubovaná anti-králičia (Pierce; 1:20000); anti-myšia IgM (1:50000); a anti-myšia konjugovaná s alkalickou fosfatázou (Milan Analytica AG, La Roche, Švajčiarsko; 1:5000).

1.9 Imunohistochémia

Miecha alebo malý mozog dospelých potkanov sa rýchlo vyrezali a zapustili sa v OTC zlúčenine a zmrazili sa pri -40 °C. Dvadsať post mortem rezov sa porezalo a fixovalo v zmesi etanolu a kyseliny octovej pri -40 °C. Imunologické farbenie sa uskutočňovalo, ako je opísané v Rubín a ďalší, 1994, J. Neurocytol. 23:209-217, s tou výnimkou, že sa vynechal potlačovací krok. Alternatívne sa tkanivové rezy fixovali v metanole (2 minúty pri -20 °C) a imunologické farbenie sa uskutočňovalo ako v Rubín a ďalší. Použitými primárnymi protilátkami boli: (Protilátka: (riedenie)): Hybridómový supematant IN-1: (neriedený); AS Bruna: (1:5000); alebo afinitne purifikovaná AS 472: (1:50).

1.10 Test šírenia NIH 3T3 fibroblastov

NIH 3T3 fibroblasty sa naniesli na kultivačné platne, na ktoré bol vopred nanesený v množstve 5 iig/jamku (= 1 cm²) q-pool. Q-pool predstavuje spojené aktívne frakcie hovädzieho miechového extraktu separovaného na Q Sepharose kolóne. IN-1 bola použitá ako neriedený kultúrny supematant (1-10 pg/ml), AS Bruna a pre-imúnne sérum boli riedené na 1:1000 v PBS a AS 472 a pre-imúnne sérom boli riedené na 1:500 v PBS. Aby sa kompenzovali variácie aktivity v rozličných q-poolových prípravkoch, počet inhibovaných, guľatých buniek umiestnených na q-pool sa normalizoval na 100 % a na 0 % umiestnených na kontrole z tlmivého roztoku (Spillman a ďalší, 1998, J. Biol. Chem. 273:19283-93).

1.11 Test DRG neuritového vyrastania

Dorzálne koreňové gangliá (DRG) sa vyrezali z E16 embryonických kurčiat v Hankovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS), rozdelili sa na dve časti a umiestnili sa na platne, na ktoré bol vopred nanesený q-pool v 100 μΐ F12 média s 10 % FCS a 1 % metocelom. Vyrastanie neuritov z jednotlivých DRGs sa počíta lo po 24 hodinách inkubácie pri 37 °C semi-kvantitatívnym spôsobom využitím stupnice od 0 (žiadne vyrastanie) do 4 (maximálne vyrastanie).

1.12 Test spoločnej kultivácie DRG a očných nervov

Očné nervy sa vypitvali z dospelých potkanov, ožiarili sa s 5500 Grays a injekčné sa do nich zaviedla buď AS 472, alebo zodpovedajúce pre-imúnne sérum (1:10 riedenie). Páry nervov sa kultivovali v 3-komorových kultúrach tak, že jeden koniec každého nervu dosahoval cez silikónovú mazivovú/teflónovú kruhovú bariéru do stredu komory, kde sú umiestnené kultivované primáme DRG neuróny z PI potkanov. Po dvoch týždňoch kultivácie sa nervy fixovali štandardnými technikami známymi v oblasti a vsadili sa na elektrónovú mikroskopiu (EM) a odobrali sa ultratenké rezy so vzdialenosťou približne 3,5 mm DRG-exponovaného výstupku. Rezy sa systematicky analyzovali na prítomnosť znovu vyrastených exónov použitím Zeiss EM 902.

1.13 Nogo expresia v COS bunkách

Nogo A otvorený čítací rámec sa subklonoval do pcDNA3.1mychis vektora (Invitrogen) použitím štandardných klonovacích techník známych v oblasti. Výsledný plazmid (Nogo-mycl9) zabezpečil vznik rekombinantného proteínu obsahujúceho Nogo A sekvenciu fúzovanú s myc.his príveskom (21 aminokyselín). Nogo-mycl9 (2 pg DNA na 35 mm misku) alebo kontrolný plazmid (pcDNAmychisLacZ) sa transfekovali do COS buniek použitím superfect (Qiagen) podľa protokolu výrobcu. Transfekované bunky sa zbierali 36 až 48 hodín po transfekcii. Na základe imunofluorescenčného farbenia s anti-myc protilátkou a na základe enzymatickej β-galaktozidázovej farebnej reakcie sa odhadol priemerný podiel transfekcie na približne 20 %. Transfekované COS bunky sa fixovali zmesou 95 % etanolu a 5 % kyseliny octovej (4 °C, 25 minút), blokovali sa v zmesi PBS a 10 % FCS a inkubovali sa s AS Bruna (1 : 200) alebo IN-1 (1 : 2) 2 hodiny v zmesi PBS a 1 % FCS pri laboratórnej teplote. Bunky sa premyli s PBS a reagovali so sekundárnymi protilátkami (kozou anti-králičou-FITC pre AS Bruna a kozou anti-myšou-TRITC na IN-1 detekciu, Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, PA).

1.14 Oligodendrocytové kultúry

Oligodendrocyty izolované z mozgu novonarodeného potkana sa umiestnili na 75 cm² polylyzínové fľaše (Sigma, St. Louis, MO) a kultivovali sa 10 až 12 dní v DMEM doplnenom s 5 % FCS. Obohatené, zmiešané populácie oligodendrocytov a ich pôvodcov sa odizolovali od asterocytovej monovrstvy pretrepávaním cez noc pri 210 ot./min. v orbitálnej trepačke. Bunky sa umiestnili na 35 cm² misky s hustotou l-2xl0⁶ buniek na polylyzínom potiahnutú platňu. Pôvodcovia sa nechali diferencovať v chemicky definovanom médiu (CDM) 3 až 4 dni.

1.15 Bunková povrchová biotinylácia

P4 potkanie celkové mozgové kultúry sa pripravili, ako je opísané vo Van der Haar a ďalší, (1998, J. Neurosci. Res. 51:371-81). Na 7. deň in vitro sa biotinylovali s bunkovo nepermeabilným EZ-LINK-Sulfo-NHS-LC-Biotínom (Pierce), ako je opísané s tou výnimkou, že všetky kroky sa uskutočňovali pri 15 °C a bunky sa lyžovali v 1 ml lyzačného tlmivého roztoku (0,05M NaH₂PO₄ pH 8,0, 0,15M NaCl, 0,5 % CHAPS (Sigma), 2,5 mM jódacetamid, 1 mM fenylsulfonylfluorid, 0,1 pg/ml aprotínu, 1 pg/ml leupeptínu, 1 pg/ml pepstatínu A). Biotinylované proteíny sa imunoprecipitovali s Dynabeads M-280 Streptavidínom (Dynal), podrobili sa SDS-PAGE a preniesli sa na nitrocelulózové membrány, ktoré sa sondovali s AS472, α-BiP a ccβ-tubu-línom. Membrány sa stiahli s Re-Blot Westem Biot Recycling kitom (Chemicon).

1.16 Imunocytochémia

Očné nervové oligodendrocyty sa pripravili, ako je opísané v Schwab a Caroni (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393). Dva dni staré kultúry sa inkubovali s AS 472 (1 : 200) alebo mAb IN-1 (1 : 3) v médiu 25 minút pri laboratórnej teplote (rt). Kultúry sa premyli, fixovali so zmesou 4 % paraformaldehydu a 5 % sacharózy v PBS a blokovali sa v zmesi 0,lM kyseliny maleínovej a 2 % blokovacieho reakčného činidla (Boehringer Mannheim) 1 hodinu. Sekundárne protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (Milan Analytica) sa použili v pomere 1 : 7500 v zmesi 0,lM kyseliny maleínovej a 1 % blokovacieho reakčného činidla (1 hodina, rt). Transfekované COS bunky sa fixovali so zmesou 95 % etanolu a 5 % kyseliny octovej (4 °C, 25 minút), blokovali sa a inkubovali sa s AS Bruna (1 : 200) alebo mAb IN-1 2 hodiny pri rt. Bunky reagovali s kozou anti-králičou-FITC a kozou anti-myšou TRITC (Jackson Immuno Research Lab).

1.17 Komora s očnými nervami

Páry očných nervov sa kultivovali v 3-komorovom kultivačnom systéme, ako je opísané v Schwab a ďalší (1988, J. Neurosci. 8:2381-2393), injekčné sa do nich zaviedli a vystavili sa buď AS 472, alebo zodpoveda júcemu pre-imúnnemu séru (1 : 10). Očné nervy sa zaliali na elektrónovú mikroskopiu (EM) a urobili sa ultratenké rezy vo vzdialenosti približne 3,5 mm od DRG-exponovaného výčnelku. Rezy sa systematicky analyzovali z hľadiska prítomnosti znovu vyrastených axónov použitím Zeiss EM 902 mikroskopu.

2. Experimentálne výsledky

Nasledujúca časť opisuje experimentálne výsledky získané spôsobmi uvedenými v príkladovej časti 1 a jej podčastiach.

2.1 Izolácia Nogo cDNA

Purifikoval sa hovädzí homológ potkanieho NI-250, bNI220 a peptidy purifikovaného proteínu sa generovali štiepením s proteázou. Navrhlo sa viacero digoxygenínom značených degenerovaných oligonukleotidov na základe šiestich odlišných bNI220 peptidových sekvencií. Niekoľko cDNA klonov sa izolovalo zo skríningu knižnice hovädzej bielej hmoty použitím týchto oligonukleotidov. Inzert najdlhšieho klonu (CQP1-3, obrázok la) bol použitý na syntetizovanie sond na následný skríning potkaních cDNA knižníc. Klony vybrané takýmito skríningami sú uvedené na obrázku 1 a. DNA sekvenčná analýza týchto cDNA klonov naznačila, že tri odlišné transkripty pochádzajú z jedného génu a tento gén bol označený ako Nogo. Odlišné transkripty sú pravdepodobne výsledkom tak alternatívneho využívania promótorov, ako aj alternatívneho zostrihu (Nogo A, Nogo B a Nogo C; obrázok lb). DNA sekvencie boli kompilované z klonov znázornených na obrázku 1A, aby sa vytvoril transkript A, ktorého DNA sekvencia je znázornená na obrázku 2a.

Koncepčnou transláciou troch transkriptov vznikli produkty označené ako Nogo A (1163 amiinokyselín), Nogo B (360 aminokyselín) a Nogo C (199 aminokyselín). Keďže Nogo A obsahuje všetkých šesť peptidových sekvencií získaných z purifikovaného bNI220 (obrázok 2b), pravdepodobne je ekvivalentom purifikovaného potkanieho proteínu NI-250. Nogo A, B a C majú spoločný karboxy koniec s dĺžkou 188 aminokyselín (spoločná doména) a Nogo A a B zdieľajú amino koniec s dĺžkou 172 aminokyselín. Nogo A je dlhší ako Nogo B o 803 aminokyselín v dôsledku alternatívneho zostrihu.

Žiadna z Nogo izoforiem nemá hydrofóbnu sekvenciu aminokyselín na N-konci, ktorá by mohla byť používaná ako konvenčný signálny peptid. Ale boli opísané proteíny, ktoré nemajú konvenčný signálny peptid, a predsa sú prenášané cez membrány, napríklad fibroblastový rastový faktor (Florkiewicz a ďalší, 1995, J. Celí. Physiology 162:388-399), riasinkový neurotrofický faktor (Sendtner a ďalší, 1994, J. Neurobiology 25:1436-1353) a interleukín-1 (Rubartelli a ďalší, 1990, EMBO J. 9:1503-1510). Membránové proteíny, ako napríklad komisúry (Tear a ďalší, 1996, Neurón 16:501-514), tiež nemajú konvenčný signálny peptid, a predsa sú začleňované do membrány.

Hoci v pravdepodobnej 5'-neprekladanej oblasti nie je žiadny stop kodón v čítacom rámci, ktorý by jednoznačne definoval štartovací kodón, nasledujúce dôkazy naznačujú, že metionín označený na obrázku 2a je štartovací kodón pre Nogo A a Nogo B: (1) Sekvencie okolo tohto predpokladaného štartovacieho kodónu sa dobre zhodujú s konsenzus sekvenciou translačných štartovacích miest (GCCGCC A/G CCATGG; SEQ ID NO:34). (2) Značná snaha bola vynaložená na prehľadávanie vyššie položených (upstream) sekvencií pri oboch skríningoch knižnice a 5’-RACE. Žiadny z týchto prehľadávaní neviedol k identifikácii vyššie lokalizovaných sekvencií; a (3) eukaryotický rekombinantný Nogo A exprimovaný z uvedeného metionínu má zdanlivú molekulovú hmotnosť približne 200 kD, ako bola odhadnutá prostredníctvom SDS-PAGE, pričom je táto zdanlivá molekulová hmotnosť nerozoznateľná od hmotnosti endogénneho Nogo A z potkaních oligodendrocytov (obrázok 11a).

2.2 Nogo sekvenčná analýza

Nogo A obsahuje sedem potenciálnych N-glykozylačných miest, ale biochemické dôkazy naznačujú, že Nogo A nemá hlavný polysacharidový komponent. Nogo A obsahuje aj 19 rozoznávacích miest pre PKC a sedem rozoznávacích miest pre kazeín kinázu II (obrázok 2a). Všetky tri Nogo majú dve spoločné karboxy koncové hydrofóbne domény s dĺžkou 35, respektíve 36 aminokyselín. Každá z nich, alebo obe môžu byť použité ako trans- alebo intra-membránové domény, čo je v súlade s vlastnosťou bNI220 ako integrálneho membránového proteínu. Nogo A (ako aj Nogo B a C) nemá žiadne motívy známe pre bunkové adhézne molekuly, extracelulárne matricové proteíny alebo iné vedúce molekuly.

Nogo sekvencie boli použité na prehľadávanie rozličných databáz, aby sa vyhľadali homologické gény. Karboxy koncová spoločná doména troch Nogo produktov je podobná (62,5 %) s identifikovaným ľudským génom nsp (cll3 a s-rex pri potkanovi a chs-rex pri kurčatách) (obrázok 3). EST z C. elegans a Drosophila melanogaster boli tiež významne podobné (16,6 %, respektíve 13,6 %) s Nogo aj nsp v rovnakej oblasti. 180 aminokyselinové karboxy koncové domény tak Nogo proteínov, ako aj Nsp proteínov sú vrámci druhov cicavcov vysoko konzervované (98,3 %, respektíve 97,3 %), čo naznačuje, že môžu uskutočňovať podobné a esenciálne funkcie. Mimo tejto oblasti je podobnosť daného proteínu medzi druhmi tiež vysoká (73 % medzi potkaním a hovädzím Nogo A; 76,2 % medzi NSP-A a S-rexb; 50 % medzi Chs-rexb a NSP-A alebo S-rexb). Podobnosť medzi NSPs a Nogos je však obmedzená na ich karboxy koncovú hydrofóbnu spoločnú doménu (obrázok 3a) a na kyslú povahu proteínov mimo tejto konzervovanej oblasti. NSPs (NSP-A, -B a -C) boli predtým opísané ako neuro-endokrinne špecifické produkty s neznámymi funkciami. In situ hybridizácia a imunohistológia ukázali neurónovú lokalizáciu NSPs v nervovom systéme. V súčasnosti bol identifikovaný iný ľudský gén, nsp-like-1, ktorý má tiež karboxy koncovú hydrofógnu oblasť s 50 % podobnosťou tak s Nsp, ako aj s Nogo.

2.3 Nogo tkanivová expresia

Nogo expresný vzor bol skúmaný Northem blotom a in situ hybridizáciou. Keď sa použila „spoločná“ sonda (príkladová časť 1.6), tri hlavné Nogo transkripty (označené A, 4,6 kb; B, 2,6 kb; a C, 1,7 kb) sa detegovali v očnom nerve, mieche a mozgovom kortexe (obrázok 4a). V dorzálnych koreňových gangliách boli detegované len dva väčšie transkripty. 2,6kb hlavný transkript bol detegovaný v PC12 bunke, zatiaľ čo 4,6kb pás bol detegovaný len po dlhých expozíciách (obrázok 4a). V sedacom nerve boli detegované nižšie hladiny transkriptov, pričom hlavným transkriptom bol 2,6 kb pás. Keď sa miechová a PC12 bunková poly(A)⁺ RNA hybridizovali so sondou špecifickou pre exón 1, detegovali sa len 4,6kb a 2,6kb transkript; keď sa poly(A)⁺ RNA zo zadného mozgu a z kostrového svalu hybridizovali so sondou špecifickou pre exón 2, bol detegovaný len 4,6kb transkript v zadnom mozgu (obrázok 4b). Tieto výsledky overujú transkriptovú mapu znázornenú na obrázku IB. Ale výsledky Northem blotu demonštrovali aj to, že Nogo expresia nie je obmedzená na nervový systém (obrázok 4c); Nogo transkripty boli detegované aj v kostrovom svale (1,7kb), obličkách (2,6 kb a 1,7 kb), chrupavke (z prsnej kosti, 1,7 kb), pokožke (1,7 kb), pľúcach (2,6 kb) a slezine (2,6 kb). S výnimkou kostrového svalu, ktorý exprimuje Nogo C transkripty vo vysokej hladine, hladina Nogo transkriptov mimo nervového systému je nižšia ako hladina v nervovom systéme. Pokiaľ ide o 4,6kb Nogo A transkripty, zdá sa, že sú transkribované len v nervovom systéme.

In situ hybridizácie na CNS tkanivových rezoch dospelých potkanov použitím spoločnej sondy ukázali mierne značenie radov bunkových teliesok v bielej hmote rôznych častí mozgu a miechy. Toto rozmiestnenie je typické pre interfascikuláme oligodendrocyty (obrázky 5a, d). Okrem oligodendrocytov aj niekoľko typov neurónov exprimuje Nogo transkripty vo vysokých hladinách (obrázky 5c, e). V malom mozgu dvojité farbenie rezov s anti-GFAP protilátkou a in situ hybridizácia jasne ukázali silné značenie Purkineho buniek Nogo sondou, zatiaľ čo astrocyty sa neznačili (obrázky 5e, f). Vo vyvíjajúcich sa očných nervoch sa Nogo transkripty detegovali už v postnatálnom dni 0 (PO), t. j. niekoľko dní predtým, ako je možné detegovať mRNAs hlavných myelínových proteínov, proteolipidového proteínu (PLP) a myelínového bázického proteínu (MBP) (obr. 6). Toto načasovanie je v súlade s objavením sa prvých galaktocerebrozid-pozitívnych oligodendrocytov a expresiou neuritovej rastovej inhibičnej aktivity, ktorá môže byť neutralizovaná s IN-1.

Antiséra boli generované proti syntetickému peptidu založenému na hovädzej Nogo A špecifickej sekvencii (AS 472) a proti 45kD rekombinantnému čiastočne potkaniemu Nogo A (AS Bruna) (príkladová časť 1.7). AS 472, ako aj AS Bruna rozoznávajú proteín s veľkosťou približne 200 kD v hovädzom myelíne a AS Bruna navyše rozoznáva 200kD potkaní myelínový proteín na Westem blotoch (obrázok 7). Rezy miechy a malého mozgu dospelého potkana sa farbili s AS 472, AS Bruna a IN-1. Keď sa rezy fixovali so zmesou etanolu a kyseliny octovej (postup, ktorý sa predtým ukázal nevyhnutný na zachovanie a dostupnosť IN-1 antigénov), pozorovalo sa silné farbenie bielej hmoty/myelínu so všetkými troma protilátkami (obrázok 8). Farbenie oligodendrocytových bunkových teliesok bolo rozlíšiteľné najmä s AS Bruna. Ošetrenie čerstvo zmrazených rezov s metanolom namiesto zmesi etanolu a kyseliny octovej zrušilo myelínové farbenie s výnimkou oligo-dendrocytových bunkových teliesok.

AS Bruna a AS 472 farbili aj niektoré typy neurónov vrátane motorických neurónov v mieche a granulárne a molekulové vrstvy v malom mozgu. Purkineho bunky sa silno farbili s AS 472 a AS Bruna, ale sa vôbec nefarbili s IN-1.

2.4 Nogo protilátky inhibujú Nogo indukovanú rastovú inhibíciu in vitro

Semi-purifikované hovädzie miechové NI-220 prípravky (q-pool) môžu zabrániť šíreniu NIH 3T3 fibroblastov a vyrastaniu neuritov. V prítomnosti Nogo antisér, buď AS Bruna, alebo AS 472, alebo IN-1, sa znižovala q-pool inhibičná aktivita, t. j. NIH 3T3 fibroblasty sa šírili a z embryonických kuracích dorzálnych koreňových ganglií (DRG) vyrastali neurity na platniach pokrytých q-poolom (obrázok 9). Špecificita bola demonštrovaná pridaním peptidu P472, čo bol peptid použitý na vyvolanie AS 472 (príkladová časť 1.7). P472 úspešne blokoval inhibičný účinok AS 472, zatiaľ čo kontrolný peptid nemal žiadny účinok na inhibíciu.

Okrem toho bola prítomnosť Nogo A na bunkovom povrchu oligodendrocytov demonštrovaná imunocytochemicky, funkčne a biochemický použitím AS 472. Keď sa živé, primáme kultivované oligodendrocyty farbili buď s mAb IN-1, alebo AS 472, pozorovalo sa relatívne slabé (v porovnaní s imunocytochémiou na galakto-cerebrozide), ale jasné povrchové farbenie na diferencovaných oligodendrocytoch (obrázky 15a, c). Pridanie kompetičného peptidu (P472) pre AS 472, alebo vynechanie primárnej protilátky, zrušilo špecifické farbenie (obrázky 15b, d). Aj bunková povrchová biotinylácia a následná precipitácia so streptavidínom po tvrdila prítomnosť Nogo A na plazmatickej membráne oligodendrocytov. V precipitáte AS 472 detegovala pás bežiaci v oblasti zodpovedajúcej približne 40 kD nad intracelulámym, pravdepodobne nespracovaným a neglykozylovaným AS 472 imuno-pozitívnym pásom. V biotinylovanej frakcii nebolo možné detegovať ER proteín BiP (obrázok 15e).

Nogo A, ako oligodendrocytová bunková povrchová molekula, bol analyzovaný aj funkčne. Spoločná kultivácia oligodendrocytov a NIH 3T3 fibroblastov alebo oligodendrocytov a DRG neurónov ukázala jasné inhibičné vlastnosti zrelých oligodendrocytov. Tieto testy demonštrujú, že NIH 3T3 fibroblasty a DRG neurity striktne obchádzajú teritórium oligodendrocytov, pričom tento efekt bol neutralizovaný s mAb IN-1. V prítomnosti AS 472 bola táto inhibícia ekvivalentne redukovaná (obrázky 16a, b a e, f), zatiaľ čo predinkubovanie AS 472 a P472 znovu nastolilo oligodendrocytmi sprostredkovanú inhibíciu (obrázky 16c, d a g, h). Kvantifikácia odhalila vysoko signigikantnú neutralizačnú schopnosť mAb IN-1 a AS 472 v oboch typoch testov (obrázky 16i a j).

RecNogo-A (obrázok 17a) produkovaný stabilne transfekovanou CHO bunkovou líniou sa testoval z hľadiska účinku na šírenie NIH 3T3 fibroblastov a vyrastanie DRG neuritov. Rekombinantne produkovaná β-galaktozidáza izolovaná zo stabilnej CHO bunkovej línie (CHO-LacZ) sa paralelne obohatila s recNogo-A a použila sa ako kontrola inhibičnej aktivity endogénnych CHO proteínov v oboch testoch. V teste šírenia NIH 3T3 fibroblastov CHO extrakt obsahujúci recNogo-A (Nogo-1: približne 1 až 5 % celkových proteínov, obr. 9a) mal jasné inhibičné účinky na šírenie buniek v koncentrácii 10 pg/cm² (obrázok 17b). Tento účinok bol závislý od dávky: inhibičný účinok 20 pg/cm² bol vyšší, zatiaľ čo 5 pg/cm² nemalo žiadny inhibičný účinok (údaje nie sú znázornené). Inhibičná aktivita mohla byť neutralizované na úroveň pozadia predinkubáciou potiahnutého proteínu s mAb IN-1 alebo AS Bruna, zatiaľ čo kontrolná protilátka proti galaktocerebrozidu (mAb Ol) alebo AS Bruna preimúnne sérum nemali žiadny účinok (obrázok 17b).

Okrem silného účinku na šírenie NIH 3T3 fibroblastov mal CHO extrakt obsahujúci recNogo-A, ale nie CHO-LacZ extrakt, účinný inhibičný efekt na vyrastanie neuritov z primárnych kultivovaných neurónov. Disociované DRG neuróny boli inhibované recNogo-A od dávky závislým spôsobom (obrázok 17c). Táto inhibičná aktivita mohla byť neutralizovaná s mAb IN-1, ale nie kontrolnou mAb Ol (obrázky 17c až e). Rekombinantný proteín izolovaný z CHO-LacZ nemal inhibičný účinok v koncentrácii 1 a 5 pg a pridanie mAbs Ol alebo IN-1 nemalo žiadny účinok na vyrastanie neuritov.

2.5 Opätovné vyrastanie neuritov in vitro

Skúmala sa schopnosť DRG neuritov novonarodeného potkana regenerovať a rásť cez CNS tkanivo dospelých. Páry očných nervov sa vypitvali z dospelých potkanov a kultivovali sa v špeciálnom komorovom kultivačnom systéme tak, že DRG neurity mali prístup k jednému koncu každého nervu (obrázok 10a). V každej kultúre sa do jedného z dvoch nervov injektovalo pre-imúnne králičie sérum a nerv nemu bol vystavený, do druhého nervu sa injektovala AS 472, ktorá sa nachádzala aj v bočnej komore okolo nervu. Po dvoch týždňoch in vitro v prítomnosti NGF sa kultúry fixovali, rozložili sa a stabilizovali sa na elektrónovú mikroskopiu (EM). EM rezy sa odoberali vo vzdialenosti približne 3,5 mm od konca nervu, ktorý bol v kontakte s DRG neurónmi. Nervy injektované pre-imunitným sérom neobsahovali alebo obsahovali len málo axónov (obrázok 10b). Tých niekoľko neurónov sa nachádzalo výlučne asociovaných so základnými membránami a astrocytmi na povrchu nervov. Naopak, väčšina očných nervov injektovaných s AS 472 obsahovala značné množstvo axónov, často do niekoľko sto. Často bolo možné vidieť kontakt s myelinom (obrázky 10c, d).

2.6 Rozoznávanie rekombinantného Nogo A s IN-1

Keď sa Nogo A exprimoval ako rekombinantný proteín s karboxy koncovým myc-his príveskom v transfekovaných COS bunkách, demonštroval Westem blot použitím tak anti-myc protilátky, ako aj AS Bruna, že rekombinantý Nogo A proteín má zdanlivú molekulovú hmotnosť približne 200 kD na denaturačných SDS géloch (obrázok 11a). Na rovnakom blote bol detegovaný pás s podobnou mobilitou prostredníctvom AS Bruna v potkanej primárnej kultúre oligodendrocytov, čo naznačuje, že rekombinantný Nogo A má skoro rovnakú molekulovú hmotnosť ako endogénny Nogo A z oligodendrocytov (obrázok la). Keď sa transfekované COS bunky imunofluorescenčné farbili s IN-1 a AS Bruna, IN-1 a AS Bruna rozoznávali rovnaké, transfekované bunky (obrázky 1 lb, c). Väčšina imunoreaktivity bola lokalizovaná intracelulárne a bola dosiahnuteľná len po permeabilizácii.

2.7 Mapovanie Nogo aktívne oblasti (oblastí)

Generovali sa série delečných mutantov Nogo, aby sa mapovala inhibičná doména (domény) alebo oblasť (oblasti) Nogo. Delečné konštrukty Nogo génu boli generované použitím vnútorných reštrikčných miest, štiepeniami exonukleázou III z „mung“ fazule a polymerázových reťazových reakcií. Opis mutantov je poskytnutý na obrázku 18 a v Stručnom prehľade obrázkov. Väčšina konštruktov má N-koncový T7 prívesok na identifikáciu s anti-T7 monoklonálnymi protilátkami; a N- alebo C-koncový hexahistidínový prívesok („His-prívesok“) na purifikáciu použitím imobilizovanej-Co(II)-afinitnej chromatografie. Nogo delečné mu tanty, označené NiG-Dl, NÍG-D2 až NÍG-D20, boli všetky testované použitím testu šírenia NIH 3T3 fíbroblastov, aby sa stanovil inhibičný účinok. Niektoré mutanty boli testované v teste PC 12 vyrastania neuritov, teste vyrastania neuritov z disociovaných potkaních DRG alebo teste sietnicových gangliových pásov. Výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Funkčné aktivity Nogo delečných mutantov

	3T3	PC12	DRG	RGC
Nogo-A	++		+	+
Nogo-B	+
Nogo-C	-			-
NiAext	++	+		+
EST	+/-
NiR	+
NiG	++			+
NiG-Dl	+
NÍG-D2	+
NÍG-D3	++
NÍG-D4	+
NÍG-D5	-
NÍG-D7	+
NÍG-D8	+
NÍG-D9	+
NiG-DlO	+/-
NiG-Dl 4	-
NiG-Dl 5	+
NiG-Dl 6	+
NiG-Dl 7	+
NiG-Dl 8	+
NÍG-D20	++

V NIH 3T3 fíbroblastovom teste (3T3) alebo PC12 teste je výsledok odčítaný ako pozitívny, keď je šírenie fibroblastov alebo PC 12 buniek na platni pokrytej prípravkom Nogo získaným z delečného mutantu inhibované. Pozitívny výsledok v teste vyrastania neuritov embryonických kuracích dorzálnych koreňových ganglií (DRG) alebo teste kolapsu rastu vrcholov ganglií (RCG) indikuje, že vyrastanie neurónov je inhibované, alebo že je spôsobený kolaps rastu vrcholov v prítomnosti prípravku Nogo získaného z delečného mutantu.

Z údajov vyplýva, že hlavná inhibičná doména bola idetifikovaná v Nogo-A špecifickej oblasti od aminokyseliny č. 172 po aminokyselinu č. 974, najmä aminokyseliny čísla 542 až 722. Okrem toho bola aj N-koncová sekvencia Nogo-A a Nogo-B (aminokyseliny čísla 1 až 171) inhibičná pre 3T3 šírenie. Na základe týchto výsledkov sa oblasti Nogo aminokyselín číslo 172-259 a aminokyselín číslo 975-1162 zdajú byť neesenciálne a môžu sa odstrániť bez straty inhibičnej aktivity.

3. Ľudské Nogo nukleové kyseliny a proteíny, deriváty a fragmenty

Predložený vynález poskytuje nukleotidové sekvencie kódujúce ľudský Nogo protein a fragmenty ľudských Nogo proteínov, vrátane ľudských ekvivalentov potkanieho Nogo A, Nogo B a časti Nogo C. Ľudská Nogo aminokyselinová sekvencia je znázornená na obrázku 13 a bola označená ako SEQ ID NO:29.

Predložený vynález poskytuje aj nukleotidové sekvencie fragmentov ľudského Nogo génu. Ľudská Nogo nukleotidová sekvencia môže byť stanovená použitím potkanieho Nogo A transkriptu ako pomôcky na zoradenie a zostrih ľudských exprimovaných sekvenčných príveskov (EST), ktoré sú homologické s potkaňou alebo hovädzou cDNA sekvenciou.

Napríklad ESTs AA081783 a AA333267 (časť opisu s názvom Izolácia Nogo génov) sa navzájom prekrývajú a zodpovedajú potkanej Nogo A (obrázok 2a; SEQ ID NO:1) nukleovej kyseline v polohe 765 až 1272. ESTs AA322592, AA092565 a AA081525 (časť opisu s názvom Izolácia Nogo génov) sú tiež navzájom sa prekrývajúce sekvencie zodpovedajúce potkanej Nogo nukleovej kyseline v polohe 1642 až 2131. Tieto dve nezávislé súpravy prekrývajúcich sa ESTs nemôžu byť zoradené tak, aby poskytli ľudskú sekvenciu bez priameho počítačového porovnania s potkaňou alebo hovädzou Nogo nukleotidovou sekvenciou podľa predloženého vynálezu. Na začiatočné počítačové zoradenie je výhodný ENTREZ Nucleotide QUERY. Iné počítačové priraďovacie programy sú uvedené v časti opisu s názvom Izolácia Nogo génov ako alternatívne príklady a nie sú mienené ako obmedzujúce rozsah počítačových programov, ktoré môžu byť použité.

4. Diskusia

4.1 Klonovanie neuritového rastového inhibítora Nogo

Nogo A má mnoho vlastností, ktoré podporujú jeho predchádzajúce opísanie ako potkanieho NI-250, čo je hlavný inhibičný proteín vyrastania neuritov CNS myelínu a antigén IN-1. Na molekulovej úrovni obsahuje Nogo A šesť peptidov pôvodne získaných sekvenovaním bNI-220, čo je najinhibičnejší komponent hovädzieho miechového myelínu. Na úrovni expresie sú oligodendrocyty hlavným typom buniek v dospelom CNS, v ktorých sa exprimuje Nogo A, a načasovanie Nogo expresie v očných nervoch sa zhoduje s predtým opísaným IN-1 neutralizačným myelínovým inhibičným účinkom na rast neuritov. Navyše, Wester biot odhalil prítomnosť Nogo A v aktívnych q-poolových frakciách a biela hmota rôznych CNS oblastí sa farbila s AS Bruna, ako aj s AS 472 (špecifické pre Nogo A) spôsobom identickým s farbením s IN-1. Oba tieto fakty súhlasia s interpretáciou, že Nogo A je NI-250.

Dve antiséra vyvolané proti Nogo A sekvenciám, AS Bruna a AS 472, značne znížili inhibičný účinok čiastočne purifikovaného hovädzieho miechového prípravku (q-pool). AS 472 umožnila aj vrastanie veľkého počtu axónov dorzálnych koreňových ganglií v dĺžke niekoľko milimetrov do dospelých očných nervových explantátov, čo je veľmi podobné s IN-1.

Hoci vypočítaná molekulová hmotnosť Nogo A je približne 140 kD, má zdanlivú molekulovú hmotnosť na denaturovaných SDS géloch približne 200 kD, čo je v rozsahu predchádzajúceho odhadu približne 250 kD. Aberantná mobilita Nogo A v SDS géloch je pravdepodobne spôsobená skôr kyslou povahou, ako posttranslačnými modifikáciami. Aberantná mobilita proteínov na SDS-PAGE bola stanovená pre iné vysoko kyslé proteíny, ako napríklad proteín asociovaný s rastom GAP-43, ako aj NSP-A. Navyše bakteriálne exprimovaný rekombinantný Nogo A má rovnakú zdanlivú molekulovú hmotnosť ako endogénny Nogo A exprimovaný potkaními oligodendrocytami. To je argument proti veľkým modifikáciám Nogo A mechamizmami, akými je napríklad glykozylácia.

4.2 Nogo zabraňuje regenerácii a obmedzuje plasticitu dospelého CNS

Expresia Nogo v potkaních očných nervových oligodendrocytoch z PO dobre súhlasí so skoršími zisteniami, že IN-1 je schopná neutralizovať neuritovú rastovú inhibíciu. Zaujímavé je, že táto expresia predchádza o niekoľko dní expresii hlavných myelínových proteínov a vytváraniu kompaktného myelínu. Objavenie sa Nogo, možno ako odpoveď na axonálne signály, by mohlo brániť ďalšiemu rastu axónov v zodpovedajúcich fibrických traktoch (počet axónov dosahuje v potkaních očných nervoch vrchol v E20). Nogo by mohol inhibovať aj vytváranie kolaterál a tým stabilizovať všeobecnú štruktúru diferencovaného CNS. V sivej hmote diferencovaných CNS oblastí inverzne koreluje obsah myelínu a IN-1 imuno-reaktivita s hladinou GAP-43 a plastickým potenciálom daných oblastí. V skutočnosti, IN-1 protilátky aplikované na dospelú CNS umožňujú, aby nastal rast a plasticita v mozgovom kmeni a mieche v rozsahu, ktorý bol predtým známy len pri novorodeneckom CNS. Značné funkčné zotavenie, ktoré nastáva súčasne s touto plasticitou indikuje, že rast axónov je schopný vytvoriť funkčne vhodné spojenia.

Predtým bolo demonštrované, že odpovede neurónov na inhibičné Nogos sa líšia medzi rôzne starými neurónmi. Pravdepodobne je to v dôsledku odlišnej expresie receptorov, ktoré budú dúfajme skoro charakterizované. Podobne ako pre Netríny a mnohé rastové faktory ostáva možnosťou existenica rôznych Nogo receptorov, ktoré spúšťajú odlišné odpovede. Skutočnosť, že Nogos sú exprimované aj v niektorých typoch neurónovov, naznačuje možné interakcie medzi rovnakými a/alebo rôznymi Nogo izoformami.

4.3 Nogo patrí do novej rodiny neuritových regulačných molekúl

Sekvenčná analýza Nogo neodhalila žiadne známe motívy bunkových povrchových alebo matricových proteínov podieľajúcich sa na axonálnom riadení (repulzívnom alebo atraktívnom); t. j. nemohli byť identifikované žiadne imuno-globulínové domény, domény fibronektínu typu II ani EGF-domény. Neexistovala ani homológia s opísanými nervovými rastovými inhibítormi, seforínmi, netrínmi alebo efrínmi.

Nogos vytvárajú novú rodinu so skupinou v súčasnosti opísaných proteínov, NSP/s-rex a NSP-like 1 proteínmi, ktorá je založená na podobnosti ich karboxy koncových 180 aminokyselín. Podobne ako v prípade Nogo, tak alternatívne využívanie promótorov (tak Nsp, ako aj Nsp-like 1 génom), ako aj alternatívny zostrih (len Nsp) sú zodpovedné za produkciu alternatívnych proteínových produktov so spoločným karboxy koncom obsahujúcim dve sekvencie hydrofóbnych aminokyselín. Ako vyplýva z názvu, NSPs (neuroendokrinne špecifické proteíny) sú predominantne exprimované v neurónoch a niekoľkých typoch endokrinných buniek. Sú lokalizované najmä intraceluláme v spojení s endoplazmatickým retikulom. NSP-like 1 gén sa exprimuje predominantne v mozgu a svaloch. Funkcie NSP ani Nsp-like 1 rodín nie sú známe. Skutočnosť, že potenciálne ortológy existujú tak v C. elegans, ako aj v Drosophila melanogaster naznačuje, že Nogo so svojou aktivitou inhibujúcou nervovú regeneráciu a pučanie môže byť novo vyvinutým a tým neopísaným členom NSP rodiny.

4.4 Nogo v iných ako nervových tkanivách

Nogo C transkript sa exprimuje v kostrovom svale v hladine, ktorá je porovnateľná s hladinou v nervovom systéme. Jednou mysliteľnou funkciou svalového Nogo C je odpudzovanie motorických axónov a ich obmedzenie na motorickú okrajovú oblasť. Nízke hladiny Nogo expresie je možné detegovať aj v iných nenervových tkanivách. Pozorovaná inhibície šírenia fibroblastov a astrocytov myelínovým extraktom a NI-250 poukazuje na prítomnosť receptorov a responzívnych mechanizmov pre Nogo proteíny v týchto bunkách. To naznačuje možnú všeobecnú funkciu Nogos v kontaktovej inhibícii bunkového pohybu.

Predložený vynález nie je obmedzený na tu opísané špecifické uskutočnenia. V skutočnosti budú pre priemerného odborníka v oblasti zrejmé rôzne modifikácie vynálezu okrem tých, ktoré tu boli opísané na základe predchádzajúceho opisu a priložených obrázkov. Takéto modifikácie sú mienené ako spadajúce do rozsahu pripojených nárokov.

Claims (32)

1. Purifikovaný proteín, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z aminokyselinovej sekvencie, ktorá je viac ako na 90 % zhodná s celou SEQ ID No: 29, a tým, že je úplne zbavený všetkého myelínového materiálu centrálneho nervového systému, s ktorým sa prirodzene asociuje.

2. Purifikovaný proteín podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že pozostáva zo sekvencie SEQ ID NO: 29.

3. Purifikovaný proteín podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že je ním cicavčí proteín.

4. Purifikovaný proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že je ním humánny proteín.

5. Purifikovaný proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že pozostáva zo sekvencie SEQ ID NO: 29, v ktorej sú jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov substituované inou aminokyselinou s podobnou polaritou, ktorá slúži ako funkčný ekvivalent, čo vedie k tichej zmene.

6. Purifikovaný proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že je kódovaný prvou nukleovou kyselinou, ktorá je schopná hybridizovať s druhou nukleovou kyselinou pozostávajúcou z nukleotidovej sekvencie SEQ ID NO: 1.

7. Purifikovaný proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že je neglykozylovaný.

8. Fúziový proteín alebo chimémy proteín, vyznačujúci sa tým, že obsahuje proteín podľa nárokov 1 až 7.

9. Izolovaná nukleová kyselina, vyznačujúca sa tým, že kóduje proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8.

10. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že (a) je schopná hybridizovať s druhou nukleovou kyselinou, ktorá pozostáva z nukleotidovej sekvencie komplementárnej s nukleotidovou sekvenciou, ktorá kóduje polypeptid pozostávajúci z aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 29; (b) kóduje prirodzene sa vyskytujúci proteín, ktorý sa viaže na protilátku proti proteínu pozostávajúcemu z aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 29.

11. Izolovaná nukleová kyselina podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že kóduje prirodzene sa vyskytujúci humánny proteín.

12. Klonovací vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nukleovú kyselinu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 11, ktorá je operatívne spojená s iným ako natívnym promótorom.

13. Klonovací vektor podľa nároku 12,vyznačujúci sa tým, že je ním expresný vektor.

14. Rekombinantná bunka, vyznačujúca sa tým, že je transformovaná nukleovou kyselinou so SEQ ID NO: 1 alebo s vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 a 13.

15. Rekombinantná bunka podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že je ňou prokaryotická alebo eukaryotická rekombinantná bunka.

16. Spôsob výroby proteínu podľa nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa (a) kultiváciu bunky podľa nárokov 14 alebo 15; a (b) izoláciu proteínu.

17. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na použitie ako liečivo.

18. Ribozým alebo antisense nukleová kyselina, vyznačujúce sa tým, že špecificky inhibujú produkciu proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 u subjektu.

19. Ribozým alebo antisense nukleová kyselina podľa nároku 18 na použitie ako liečivo.

20. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, pričom tento proteín aktívne inhibuje bunkovú proliferáciu u subjektu, na výrobu liečiva na liečenie neoplastického ochorenia centrálneho nervového systému.

21. Použitie podľa nároku 20, pričom neoplastickým ochorením je glióm, glioblastóm, meduloblastóm, kraniofaryngióm, ependyóm, pinealóm, hemangioblastóm, akustický neuróm, eligodendroglióm, menangióm, neuroblastóm alebo retinoblastóm.

22. Použitie ribozýmu alebo antisense nukleovej kyseliny podľa nároku 18 na výrobu liečiva na liečenie poškodenia centrálneho nervového centra, na indukciu regenerácie pučiacich neurónov, alebo na podporu plasticity centrálneho nervového systému.

23. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 22, pričom subjektom je človek.

24. Monoklonálna protilátka, vyznačujúca sa tým, že sa imunošpecificky viaže na protein podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7.

25. Spôsob na získanie polyklonálnych protilátok proti proteínu podľa nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

(a) podanie imunogénneho množstva proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, zvieraťu;

(b) izoláciu polyklonálnych protilátok z tohto zvieraťa.

26. Vzorka izolovaného antiséra, vyznačujúca sa tým, že obsahuje polyklonálne protilátky vyrobené spôsobom podľa nároku 25, ktoré sa imunošpeciflcky viažu na SEQ ID NO: 29.

27. Monoklonálna protilátka podľa nároku 24 alebo antisérum podľa nároku 26, vyznačujúca sa t ý m , že sú terapeutickou protilátkou alebo terapeutickým antisérom.

28. Protilátka podľa nároku 24 alebo 27, vyznačujúca sa tým, že je humánnou protilátkou, chimémou protilátkou alebo jednoreťazcovou protilátkou.

29. Protilátka podľa nároku 24 alebo 27 až 28, alebo antisérum podľa nároku 26 na použitie ako liečivo.

30. Použitie protilátky podľa nároku 24 alebo 27 až 28, alebo antiséra podľa nároku 26, na výrobu liečiva na liečenie poškodenia centrálneho nervového systému, na indukciu regenerácie pučiacich neurónov alebo na podporu plasticity centrálneho nervového systému.

31. Použitie podľa nároku 30, pričom subjektom je človek.

32. Spôsob získavania monoklonálnych protilátok proti proteínu podľa nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

(a) podanie imunogénneho množstva proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 zvieraťu;

(b) produkciu molekúl monoklonálnej protilátky v kultúre, prostredníctvom kontinuálnych bunkových línií z tohto zvieraťa;

(c) izoláciu monoklonálnych protilátok z kultúry.