CZ20011608A3 - Nukleotidové a proteinové sekvence genů Nogo a metody na nich zaloľené - Google Patents

Description

* · · · ···· • · · · ·

Nukleotidové založené a proteinové sekvence genů Nogo a metody na nich

Oblast techniky - ' - r f · '

Vynález popisuje gen Nogo a zvláště pak jím' kódované ---—proteinové - produkty-—Nogo,- -sté j-ně—-ja-ko jejich -deriváty - a analogy. Také se popisuje produkce proteinů Nogo", jejich derivátů a ‘ 'protilátek.· Vynález se dále týká terapeutických prostředků a způsobů diagnózy a terapie. . ’

Dosavadní stav techniky · U »·

V centrálním nervovém systému (CNS) vyšších obratlovců skoro nedochází po poranění k regeneraci axonů a strukturální plasticita je omezena. Je pravděpodobné, že inhibitory růstu spojené s myeliriem GNS maj.í -důležitou .ú.lohu. Tato skutečnost se dokazuje monoklonálnínii protilátkami- (mAb) IN-1, . které neutralizují protein myelin', jenž 'silně 'inhibuje růst neuritů, čímž podněcuje po lézích ...mozku a-"míchy, regeneraci axonů a-zesiluje kompenzační plasticitu: ' ‘V Řada pozorování in vitro a ln vivo ukazuje nový aspekt regulace růstu neuritů, kterým je přítomnost repulzivních a inhibičních. signálů a faktorů (popisuje, se v publikaci Keunes and Cook, 1995, Curr.' Opin. Neurosci. 5:' 75-82). Zdá se, že většina těchto . signálů jsou proteiny nebo glykoproteiny.. Prvním důležitým úspěchem při identifikaci faktorů je izolace a klonování , cDNA . molekuly vyvolávající kolaps růstu neuronovývh kónusů.; .získaných z mozku kuřete, ktero.u je kolapsin-1 nazývájící se' také semaforin 3A.

Druhá skupina ;repulzivních řídících, molekul, které· se nedávno izolovaly a' klonovaly, jsou efriny. Jsou· to ligandy rodinu Eph receptorových^tyrozinových kináz. Efrin-A5 a efrin A2 se , ’exprimuj í jakogradienty ·ve zrakovém tektumu ' kuřecího 2 . embrya a jejich ektopická exprese a delece způsobuje chyby 'růstu retinálních axonů. Podobně jako semaforiny také rodina * - * * efrinů má 15 až 20. členů, přičemž každý vykazuje komplexní a.* dynamickou expresi uvnitř a vně nervového systému. Funkce · » \ , * -r ' . ; většiny z'těchto molekul.se musí ještě zkoumat. ϊ * 1 ' ' ; ^ Třetí—-skupinou- - říd-ící-ct—faktorů-/-"—které--mohou—za-brá-n-i-t-'— -——— růstu axonů a exprimují se ve vyvíjejícím se nervovém systému jsou netrihy*. *' Netrin se .izoloval j.ako chemoatraktarit • komišurálních 'axonů v. časné fázi vývoje' míchy podobně jako ._________ orrholog unc-6__mikroorganizmu C. ele.gans. Netrin-1 . naopak ; . . _______ vykazuje repulzivní ..účinky v případě jistých typů neuronů v závislosti na , typu receptoru přítomném na cílových neuronálních růstových kónusech (Tessier-Lavigne et al., 1996, .•Science 274: 112 3-33) . Dříve se silná inhibiční aktivita růstu*neuritů spojéná s s oligodendrocyty a myelinem · GNS•.^dospělých -'jedinců popisuje v publikaci Canoni and Schwab, ' 1988,. J. Celí Biol.' 106: 1281-1288) . Hlavní · konstituent je membránový protein s vysokou molekulovou hmotností (NI-250,_ s menším - komponentem NI-35, vyskytuje se u krys), který se nedávno izoloval a který je předmětnou věcí vynálezu a váže se na neutralizační monoklonální protilátky IN-1 (popisuje se v publikaci Canoni and Schwab, 1988, J. Cell Biol. 106: 1281-1288, US patent č. 5,684,133, 5,250,414, přihláška PCT WO 93/00427).

Inhibitory růstu neuritů spojené s myelinem mají důležitou úlohu při prevenci' tvorby porušených axonů CNS. Jestliže se u krys a kuřat blokuje vývoj oligodendrycytů a tvorba myelinu, pak se prodlouží regenerační permisivní doba následující po lézích CNS. Tvorba myelinu se shoduje s koncem období vývoje, kdy CNS vykazuje · vysokou .strukturální plasticitu a vysoký potenciál regenerace.

-4 _ ' '

Je pravděpodobné, ?že molekuly NI-250 a NI-35 jsou hlavními * komponenty inhibice růstu spojené s myelinem, což se může dokázat aplikací · in vivo IN-1_ při lezích míchy' u dospělých krys, což vyvolává regeneraci kortikospihálňich axonů na velkou vzdálenost a umožňuje "obnovení motorických funkcí a funkcí chování zvláště s ohledem na pohyb. Podobné experimenty se -zrakovým · nervem a cholinergní\ dráhou septo-hippocampušu také demonstrují . význam in vivď antigenu rozeznávaného, protilátkou , IN-1, což je NI-35/250 "(popisuje se v publikaci Schnell and Schwab, 1990, Nátuře 343: '269-272, Bregman et al., 1995, Nátuře 378 : "498-501) . ....." ......'

Vláknité systémy, které nevykazují léze také odpovídají za neutralizaci inhibitorů růstu neuritů pomocí protilátek IN-1. 'Nedávné experimenty ukázaly, ' že po selektivní lézi kortikospinální dráhy (pyramidotomy) se v přítomnosti IN-1 neporušená vlákna tlačí 'skrz střední část míchy a · mozkového kmene a tvoří bilaterální inervační patern ' dopróvázaný skoro plným navrácením funkcí chování a přesného pohybu* (popisuje se v publikaci Z'Graggen et"-al·.,, 1998, J. Néuroscience 18(12): * » ^ „ * 4744-4757). - ‘ ’’

Izolace genu, který kóduje protein inhibující růst neuritů poskytuje řadu možností pro vývoj produktů použitelných při regeneraci neuronů a při léčbě různých neurologických poruch, mezi něž patří také nádorý.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nukleotidové sekvence genu Nogo (lidské, krysí a bovinni geny Nogo a homology genů Nogo jiných druhů) a aminokyselinové sekvence jejich kódovaných proteinů stejně jako derivátů '(například fragmentů) a jejich analogů. Také se popisují nukleové , kyseliny hybridizovatelné nebo komplementární s .cizorodými nukleotidovými. , sekvencemi . Ve specifickém provedeni vynálezu protein Nogo představuje krysí, bovinní nebo lidský protein. -

Vynález také popisuje způsob identidikace genů, které interagují s genem Nogo. _ Gen___Nogo je.gen podle vynálezu identifikovaný způsobem podle vynálezu, který kóduje a interaguje s proteiny regulujícími růst neuronů, .

Vynález také popisuje deriváty a analogy genu Nogo podle vynálezu, které^ jsou funkčně aktivní. To znamená, že jsou schopny vykazovat jednu nebo více funkčních aktivit spojených s přirozeně se vyskytujícím proteinem Nogo. Mezi aminokyselinami 542 * až 722 se identifikovala hlavní inhibiční obiast. Takové funkční aktivity zahrnují, ale nejsou omezeny na. neuritovou růstovou inhibici neurálních buněk, rozptýlení a migraci f ibr.oblas.tů nebo . libovolné. ' buňky vykazuj ící neoplastický růst, schopnost interagovat s proteiny ·* ' ** - regulujícími neurální růst nebo soutěžit o interakci s těmito· proteiny, antigenicitu, což je schopnost vázat se . (nebo' soutěžit s proteinem Nogo o navázání) na protilátku vytvořenou., proti proteinu Nogo, imunogenicitu, což je schopnost, generovat protilátku, která se váže na protein Nogo. Tyto protilátky vykazují potenciál· indukovat růst neuritů nebo předcházet poklesu růstu ganglií dorzálních kořenů čípku inhibici funkce proteinu Nogo a jeho funkčních fragmentů nebo derivátů, které mají schopnost inhibovat růst neuritů.

Vynález dále popisuje fragmenty (a jeho deriváty a analogy) proteinu Nogo, které obsahují jednu nebo více oblastí proteinu Nogo, jako je kyselý a na prolin bohatý N-konec (například aminokyseliny 31 až 58 sekvence SEQ ID NO: 2), vysoce konzervativní C-konec a dva hydrofóbní pruhy tvořené 35 a 36 aminokyselinami, krysího proteinu Nogo, které se vyskytují také na-C-konci (například aminokyseliny '988 až 1023 a 1090 až 1125 sekvence'SEQ ID NO: 2) . Dále se popisují protilátky vytvořené proti různým proteinům Nogo a jejich derivátům a analogům. Získaly se dvě protilátky. První protilátka .se nazývá AS 472 a získala se v p ř í pad ě ·,......-kdy- -se ·—j ako ^, imun o gen - · pcuž il -.syncetic ký peptid odpovídající aminokyselinám 623 až 640 sekvence SEQ ID NO: 2 a sekundární protilátka, která se nazývá, . AS .Bruna", se vytvořila proti.. C-konci, který obsahuje aminokyseliny ^ 762 až" 1 . 163 sekvence SEQ ID. NO: 2 ^proteinu .Nogo--------------------- _ . ......._.

Popisují se také způsoby produkce .proteinů Nogo, jeho derivátů a analogů, například rekombinantními způsoby.

Vynález .také popisuje terapeutické a. diagnostické způsoby a prostředky založené na proteinech Nogo a na jeho nukleových kyselinách.· Terapeutické prostředky - podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na proteiny Nogo, jeho'analogy a . deriváty (zahrnují fragmenty), protilátky,, nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, analogy nebo. derivát a ribozymy Nogo nebo „anťisense" nukleové kyseliny. ' ..

Vynález také popisuje terapeutické a diagnotické metody a prostředky založené na proteinech Nogo a, nukleových kyselinách a anti-Nogo protilátkách. Vynález popisuje léčbu nádorů CNS a neurálních nádorů aplikací sloučenin, které podporují aktivitu Nogo (například proteiny Nogo a jejich funkčně aktivní analogy a deriváty zahrnující jejich fragmenty, nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, jejich analogy nebo deriváty, agonisty proteinů Nogo).

Vynález dále' popisuje léčbu onemocnění, poruch nebo poškození, které hlavně vedou k poškození nervového systému. Taková onemocnění, poruchy nebo poškození zahrnují, ale nejsou omezeny na traumata centrálního nervového - systému ' (CNS) 6 6 ·« «··· « · • ♦ * • · • ···· C ♦ « » · • * · · • · · · · «·· ··* * ♦· ♦ ·· ··« (například poranění míchy nebo mozku) , infarkt, infekce, maligní nádory, působení toxických činidel, nedostatečnou výživu, paraneoplastické syndromy a degenerativní nervové onemocnění (zahrnující, ale není omezeno na Alzheimerovu nemoc, Parkinsonovu nemoc, Hungtintovu choreu, roztroušenou sklerózu/ amyotrofní laterální sklerózu a progresivní supra-nukleární paralýzu) aplikací 'sloučenin7~ které' " Iňt¥řTěřujX ~š aktivitou * Nogo (například dominantní negativní· derivát proteinu Nogo, .protilátky proti proteinu, :Nogo, „antisense nukleové kyseliny genu Nogo, ribozymy Nogo a chemické skupiny, které'se ‘vá‘žoů nafáktivhí místo' proteinu Nogo)".

Vynalez dále popisuje zvířecí modely, diagnostické metody a testovací metody vhodné pro zjišťování dispozic pro vhodné “poruchy a způsoby identifikace a hodnocení agonistů a antagonistů proteinu Nogo.

Definice i.

Podtržený nebo italikou napsaný.název genu indikuje gen, naopak jím kódovaný proteinový produkt je označen jménem napsaným normálním písmem. Termín „Nogo" znamená gen Nogo, zatímco termín „Nogo" označuje proteinový produkt genu Nogo.

Vynález popisuje nukleotidové sekvence genů Nogo a aminokyselinové sekvence jimi kódovaných proteinů. Vynález dále popisuje fragmenty, jejich deriváty a analogy proteinů Nogo. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny kódující takové fragmenty nebo deriváty. Vynález popisuje geny Nogo a jejich kódované proteiny řady různých druhů. Geny Nogo podle vynálezu zahrnují lidský, -krysí a bovinní gen Nogo a příbuzné geny (homology) v jiných druzích. Vynález také popisuje bovinní subsekvence doložené v publikaci, Spillman et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 19283-19293. Ve -specifických provedeních geny Nogo aproteiny pocházejí z obratlovců nebo zvláště .ze savců. V preferovaném provedení vynálezu geny Nogo a jejich proteiny jsou lidského původu. Vynález dále popisuje produkci následujících/ proteinů .a derivátů, ' například .metodami* rekombinace. .

Vynález popisuje1 gen Nogo, molekuly nukleových kyselin kódující tři izoformy 'proteinu Nogo' jmenovitě pak protein·, Nogo A, Nogo—B· · a · Nogg —C.—Gen_—Nocc zahrnuje—molekuly- —nukíeové kyseliny kódující- všechny tři izoformy, pokud není uvedeno jinak. Protein Nogo ‘"zahrnuje všechny- tři izoformy proteinu. , '* * ’ ' X .

Nogo, není-li uvedeno jinak. Proteiny Nogo podle vynálezu -mohou předcházet', regeneraci neuronů v míše nebo mozku. . (to .je nepermisivní vlastnosti substrátu), , inhibovat růst neuřitů ga-nglií ' dorzálních kořenů, indukovat zpomalení růstu ..kónusu ganglií dorz.álních -kořenů, blokovat rozšíření buněk NIK' 3T3, “blokovat růst' neuritů PC12 atd. ,. -

Proteiny Nogo, jejich .fragmenty a deriváty neobsahují žádný myelinový materiál-, centrálního j nervového systému'. Zvláště pak neobsahují .žádný myelinový materiál centrálního nervového- systému, se kterým je protein" Nogo* přirozeně spojen. Takový materiál -může zahrnovat/ jiné myelinové proteiny CNS, lipidy a uhlovodíky. Upřednostňuje se, aby proteiny Nogo, jejich fragmenty a deriváty podle vynálezu také neobsahovaly žádná činidla používaná při izolaci -z biologického materiálu, jako jsou například detergenty.

Ve specifickém provedení podle vynálezu se popisují rekombinanntí proteiny, jejich fragmenty a deriváty připravené metodami podle vynálezu, jako je exprese genu Nogo v geneticky upravené buňce.

Vynález také zahrnuje deriváty Nogo a analog * podle vynálezu, které jsou funkčně aktivní. To znamená, že jsou schopny vykazovat jednu nebo více známých funkčních aktivit spojených s plnou délkou proteinu Nogo' (divokýv typ) . Takové :furikční aktivity zahrnují, ale nejsou , omezeny na schopnost interagovat (nebo soutěžit s navázáním).s regulačními proteiny neurálního růstu, antigenicitou (schopnost vázat se /nebo . soutěžit s Nogo o navázání,) ' na * anti-Nogo protilátky/, ' imunogenicitou (schopnost vytvořit protilátky, které se váží na Nogo), předcházet regeneraci neuronu v míše nebo ‘ v mozku, propůjčit substrátu vlastnost omezení růstu, rozšíření a migrace neurálních buněk-" a ne op1as ti c kých.....bune ky~ inhibxci růstu neuritů ganglií dorzálních kořenů, vyvolání .zpomalení růstu kónusu ganglií.dorzálních ·kořenů, blokování rozšíření in vitro buněk NIH 3T3, blokování.; růstu neuritů PC12, restrikci neUfáihí plaštičityatd. . ......" *·*·.' ' * - *" .....

Vynález dále popisuje" .'fragmenty (jejich deriváty a analogy) proteinu Nogo, které obsahuji jednu nebo více oblastí '.proteinu Nogo. ‘

Popisují se protilátky, proti proteinu. Nogo,_ jeho deriváty * a analogy. · · -¾ : · .·"

Vynález dále popisuje terapeutické.a diagnostické metody a prostředky založené, na proteinech .Nogo a nukleových kyselinách * a anti-Nogo protilátkám. Vynález popisuje, léčbu poruch růstu regulovaných buněk nebo orgánů aplikací· sloučenin, které podporují aktivitu Nogo. (například proteiny Nogo a funkčně aktivní analogy a’ jejich deriváty (zahrnující fragmenty), nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, analogy nebo deriváty, nebo agonisty proteinu Nogo).

Vynález také popisuje metody léčby poškození nebo poruchy nervového systému aplikací sloučenin, které antagonizují nebo inhibují funkci proteinu Nogo (například protilátky, antisense - : 1 nukleové kyseliny Nogo, antagonistické deriváty proteinu Nogo) . - · · ·. • · • ·

• · · ·' • · · · · • · · · * ·· ···

Vynález také popisuje zvířecí, modely, diagnostické metody a testovací metody · -vhodné pro stanovení predispozice * * ' k poruchám. . ‘ ,

Izolace genů Nogo ’ _ ·' - y'. - Vynález popisuje . nukleotidové sekvence genů Nogo nebo "nukleove-^ :'kyseTÍrfy7 V~ jPdňom provedeni -^vyň^ůre_z'U'^~^h'U'kl“eOvé“ kyseliny Nogo obsahují sekvence krysí cDNA uvedené na obrázku ; ** . č. -2á (SEQ ID .NO: 1) označené jako Nogo A, jak je .zobrazeno na obrázku č. 1b nebo jejich kódující Oblasti ,nebo nukleotidové sekvence kódující protein Nogo obsahující 1' 163 aminokyselin- nebo jeho . libovolný funkční fragment nebo derivát (například protein vykazující sekvenci SEQ ID NO: 2, jak je zobrazeno na obrázku č. 2a) ., --..-.- V jiném provedení vynálezu nukleové. kyseliny Nogo obsahují nukleovou · sekvenci kódující :protein/ Nogo. B‘,. zatímco, protein. Nogo s B je ekvivalentní’:s 172 amiňol^seíInami N-konce fúzovanými s 188 aminokyselinami C-konce' proteinu Nogo A, přičemž vzniká zkrácený protein obsahující 360 aminokyselin. Transkripty proteinu Nogo B vznikly ' jako výsledek alternativního sestřihu, který odstraní- intervenující nukleotidovou kódující sekvenci. V dalším provedení vynálezu nukleové kyseliny Nogo obsahují nukleotidové sekvence kódující protein Nogo C, zatímco protein Nogo C obsahuje na svém N-konci 11 aminokyselin, které nejsou přítomny v proteinu Nogo A a 188 aminokyselin C-konce proteinu Nogo A a B.- Protein Nogo C obsahuje 199 aminokyselin. Transkript kódující Nogo C je výsledkem transkripce z alternativního promotoru Nogo. V jiném specifickém provedení, vynálezu se popisují • e sekvence nukleových kyselin bovinního Nogo (SEQ ID NO: 28). 10 ····

V jiném provedeni vynálezu se popisuji nukleotidové sekvence kódující lidský .protein 'Nogo a fragmenty lidských proteinů Nogo .zahrnující lidské ekvivalenty s krysím proteinem Nogo A, Nogo B a Nogo C. Sekvence .^nukleové kyseliny Nogo se objasnila za použití transkriptu krysího Nogo A jako templátu -a pestřiháyají dohromady 'lidskou exprimovanou sekvenci tags. (EST)aby' vznikla 'kontinuální nukleotidová sekvence. Krysí a bovinní aminokyselinové sekvence Nogo také poskyťují informace o správném třanslačním čtecím rámci tak, že. .se . dedukovala aminokyselinová sekvence lidského ' Nogo. Vynález.také popisuje aminokyselinové sekvence fragmentů lidského.genu Nogo.

Vynález také popisuje izolované nukleové kyseliny -alespoň 8 nukleotidů (to je hybridizovate.lná část) sekvence Nogo. Ψ jiném provedení nukleové kyseliny obsahují alespoň 25 {kontinuálních) nukleotidů, 50 nukleotidů, 100 nukleotidu,. 150 nukleotidů, 20 nukleotidů,' 500 nukleotidů, 700 nukleotidů.'nebo 800 nukleotidů sekvence, geny Nogo nebo kódující sekvence Nogo plné délky. V jiném provedení'vynálezu, nukleové kyseliny jsou menší než 35 000 nebo 500 nukleotidů. Nukleová kyselina může být . jedno- nebo dvouřetězčová. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny hybridizovatelné - nebo komplementární s dále v textu uvedenými, sekvencemi. Vynález popisuje nukleové kyseliny, které .. obsahuj í sekvenci komplementární, s alespoň 10, 25, .50, 100 nebo 200 nukleotidy nebo kódující oblast genu Nogo.

Specifické provedení - vynálezu popisuje nukleovou kyselinu, která hybridizuje s nukleovou kyselinou Nogo (má například sekvenci SEQ ID NO: 2, obrázek č. 2a) nebo s nukleovou kyselinou kódující derivát Nogo za málo přísných podmínek. Postupy při kterých.se používá takových málo přísných podmínek se popisují v publikaci Shilo and Weinberg, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 78:. 6789-6792 a jsou·, následující: Filtry obsahuj ící DNA' se k předem, "ošetřily po dobu 6" hodin při teplotě ' : * . · 4 '· ' Γ *

40 °C v roztoku, který obsahuje 35 % fromamidu/.. 5x SSC,; 50 mM

Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1 % PVP, 0,1 % fikol 1 % BSA a 500 μg/ml denaturované DNA spermatu·,lososa. Hybridizace probíhají ve stejném roztoku s následující modifikací: 0,02 % PVP, 0,02 % fikolu, 0,2 % BSA, 100 μς/πιΐ DNA spermatu lososa, 10 % (hmotnost/objem) sukfátu dextranu a použije se 5 až 20 x 106 cpm sondy značené 32P. Filtry se inkubovaly v hybridizačni směsi po dobu 18 až 20 hodin při teplotě 40 °C a pak se promyly po dobu 1,5 hodiny při teplotě '60 °C. Filtry se přenášely suchým způsobem a podrobily se autoradiografii. Jestliže je to nezbytné, filtry se promyly třikrát při teplotě 65 až 68 °C a znova se exponoval . film. Další podmínky při nízké přísnosti jsou dobře známé v oboru _ (například jak še používá při hybridizaci mezi specie, jak se popisuje shora v textu). V jiném specifickém provedení. vynálezu se popisuje nukleová kyselina, která je hybridizovatelná s nukleovou kyselinou Nogo za podmínek s vysokou přís.ností.. Ppstupy, . při kterých se používají takové přísné podmínky, jsou- následující: Prehybridizace filtrů, obsahující. DNA probíhá po dobu 8 hodin přes noc při teplotě' 65 °C v pufru, 'který se skládá z 6x koncentrovaného rozotoku SSC, 50· mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 % PVP, 0,02 % fikol, 0,02 % BSA a 500 μρ/ιηΐ DNA spermatu lososa. Filtry se hybridizovaly po dobu 48 hodin při teplotě 65 °C v prehybridizační.směsi, která obsahuje 100 μg/ml denaturované DNA spermatu lososa a 5 až 20xl06 cpm sondy značené 32P. Promývání filtrů se provedlo při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny v roztoku, který obsahuje 2x koncentrovaný SSC, 0,01 % PVP, 0,01 % fikol a 0,01% BSA. Pak následuje promytí v pufru 0, 1 x koncentrovaném' SSC při teplotě 50 °C po dobu 45 minut a pak následuje autoradiografie. Dále se mohou použít jiné podmínky s vysokou přísností, které jsou dobře známy v oboru. 12

V jiném specifickém provedeni vynálezu se popisuje nukleová kyselina, která > může hybridizovat s nukleovou kyselinou Nogo za podmínek upravené přísnosti. Postupy za použití takových podmínek upravené přísnosti jsou následující. Filtry obsahující DNA se předem ošetřovaly po dobu 6 hodin při teplotě 55 °C v roztoku, který obsahuje 6x koncentrovaný SSC, 5x koncentrovaný Denhartův roztok, 0,5 % SDS a· 100 'jlg/iňT- denaturované DNA spermatu lososa. Hybridizace se provedly ve’ stejném roztoku a použila se sonda 5 až 20 x 106 cpm značená 32P. Filtry’ se inkubovaly v hybridizační směsi po dobu 18 až 20 hodin při teplotě 55 °C a pak se promýly dvakrát po dobu 30 minut při teplotě 60 °C v roztoku obsahujícím 1-x koncentrovaný SSC a 0,1 % SDS. Filtry se pak přenesly suchým způsobem ' a ..vystavily se autoradiograf ii. Jiné podmínky upravené ‘přísnosti, které se mohou použít jsou dobře známy v oboru. Promývání filtrů se provedlo při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny v roztoku, , který·obsahuje 2x koncentrovaný .roztok SSC, 0,1 % SDS. Takové přísné podmínký jsou vhodné pro izolaci molekul nukleové kyseliny obsahující sekvence . genu Nogo u jiného druhu, například za použití krysích. " nebo bovinních klonů cDNA Nogo, jako sondu pro izolaci lidské cDNA Nogo. Řada lidských exprimovaných značících sekvencí (EST) popisovaných v publikované databázi sekvence nukleové kyseliny vykazuje vysoký stupeň shody sekvence ve srovnání se segmenty sekvencí genu Nogo podle vynálezu. Identifikoval se předběžný seznam lidského ETS a jsou uvedeny přístupová čísla v Genbank: AA158636 (SEQ ID NO: .35), AA333267 (SEQ ID NO: 36), AA081783 (SEQ ID NO: 37), AA167765 (SEQ ID NO: 38), AA322918 (SEQ ID NO: 39), AA092565 (SEQ ID NO: 40), AA081525 ' (SEQ ID NO: 41) a AA081840 (SEQ ID NO: 42) za použití ENTREZ Nucleotide Query. Před tímto vynálezem nikdo necharakterizoval shora v textu uvedené EST s ohledem na aminokyselinové sekvence, které uvedené EST mohou kódovat in vivo. Nic není známo o funkci

13 proteinů, které obsahuji předpovězené aminokyselinové sekvence lidských EST. Dále EST, .jako je AA158636, které souhlasí s 5'koncem cDNA Nogo a jiným EST nebo AA081840, který souhlasí s 3'koncem krysí cDNA nepřesahuje a není chápána jako součást stejné sekvence lidské cDNA. —j--^Z-ai-o-ž-eno— na—sekvencích · genu—Λ/ogo-podle vynálezu—se-.-věří-,- že tyto lidské EST reprezentují části lidského genu 'Nogo, které se exprimují v tkáni, ze které se získal EST. Vynález dálé popisuje molekuly nukleové kyseliny obsahující dvě nebo více shora identifikovaných lidských. EST. EST se mohou exprimovat ve- stejné lidské tkáni nebo v jiných lidských tkáních. Upřednostňuje se, aby molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu obsahovaly nukleotidové sekvence alespoň, dvou llidských EST, které . se vzájemně .nepřekrývají nebo sé nepřekrývají s třetím ani dalším lidským EST. . ·

Protože shora v textu identifikované lidské EST se "nyní identifikovaly· jako ^ fragmenty lidského „genu Nogo, . což se provedlo klonováním nukleovýčh kyselin. Uvažuje, se, “že 'lidské EST má podobné funkce vp srovnání . s jinými , molekulami nukleovýčh kyselin Nogo při různých metodách podle vynálezu, jako je například exprese lidských polypeptidů Nogo, hybridizační testy a inhibice exprese Nogo jako molekul antisense nukleové kyseliny atd..

Vynález však poskytuje a zahrnuje . předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského proteinu Nogo a jeho fragmenty. Jak je zobrazeno na obrázku č. 13, aminokyselinová sekvence krysího proteinu Nogo. (obrázek č. 2a, SEQ ID NO: 2) se uspořádává s předpokládanou aminokyselinovou sekvencí lidského proteinu Nogo (obrázek č. 13, SEQ ID NO: 30). Vynález popisuje . lidské proteiny Nogo obsahující předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského proteinu Nogo, obrázek č. 13 a SEQ ID NO: ' 30 nebo .subsekvence předpokládané aminokyselinové sekvence lidského Nogo, který obsahuje alespoň aminokyselinové zbytky nebo jeden nebo více následujících předpokládaných aminokyselinových sekvencí lidských fragmentů Nogo. Jsou to MEDLDQSPLVSSS (lidský protein Nogo, odpovídající aminokyselinám 1 až 13 se sekvencí SEQ ID NO: 43) , KIMDLKEQPGNTISAG (lidský protein Nogo odpovídající aminokyselinám 187 až 203 se sekvencí SEQ ID NO: 44), KEDEVVSSEKAKDSFNEKR (lidský protein Nogo odpovídající aminokyselinám 340 až. 358 se sekvencí SEQ ID NO: 45), QESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSÁVPSAGASVIQPSS (lidský protein Nogo 'odpovídající aminokyselinám 570 až 619) se sekvencí SEQ ID NO: 46). Přirozeně se vyskytující lidský protein Nogo a rekombinantní lidský protein Nogo a jeho fragmenty mají aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou •aminokyselinovým sekvencím, jak se popisuj i ' shora " v textu a jsou schopny se vázat na protilátky řízené proti proteinů Nogo podle vynálezu. ,

Vynález dále popisuje molekuly nukleové .kyseliny, které kódují lidský protein Nogo, který má aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci zobrazené ' na obrázku č. 13 (obrázek č. 13, SEQ ID NO: 30). Ve specifickém provedení vynálezu molekuly nukleové kyseliny kódující fragmenty lidského proteinu Nogo mají aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci, jak je zobrazeno na obrázku č. 13 (SEQ ID NO: 30) s tou výjimkou, že takové molekuly nukleové kyseliny neobsahují nukleotidovou sekvenci shora identifikovaných lidských EST.

Aminokyselinová sekvence se zdá být v podstatě podobná předpokládané aminokyselinové sekvenci lidského proteinu Nogo, když více než 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, r," 4 90 %, 95 % nebo 97. % aminokyselinových zbytků ve dvou molekulách je', shodných, když se použije počítačový algoritmus, kde uspořádání se provede počítačovým programem, ' který je dobře znám v oboru například když se použije vyhledávací program BLAST (popisuje se v publikaci Altschul et al. , 1994, Nátuře Genet. 6:.119-129). * r

Použitelné počítačové homologické programy zahrnují: program „Basic ’ Local Alignment Search' Tool (BLAST)

·. (-www-m-cbi—n-l-m—n-i-h—go-v-)-—(popisuje se—v publikaci Altschul et al., 1990, J. of Moíec. Bio!., 215: ' 403-410, „ The BLAST

Algorithm" ., Altschul et al., 1997, Nucl Acids. Res. 2.5:. 3389-3402) . heuristický vyhlédavací algoritmus.·‘ určený pro vyhledávání podobnosti sekvencí.· V publikaci Karlin and Altschul 1990,- Proč. Nati. Acaď. Sci. USA, 87: 2264-68, 1993, Přoc. Nati. Acad.; Sci. USA 90: 5-873-77 se popisuje důležitost důležitost statistických metod. Pět specifických programů plní následující úkoly: ' ' 1) Prográm BLASTP porovnává . aminokyselinovou sekvenci ' t * .» , ' s databází proteinových sekvencí.’ ‘; í. · · · : ' 2) Program BLASTN porovnává šesti rámcové pojmové translační produkty nukl.eotidové zkoumané 'sekvence (oba řetězce) s databází nuleotidovýčh"'sekvě'neí; 3) Program BLASTX porovnává šesti rámcové pojmové translační produkty nukleotidové. zkoumané sekvence (oba řetězce) s databází proteinových sekvencí. 4) Program BLASTN porovnává proteinovou zkoumanou sekvenci s databází nukleotidových sekvencí přeložených do všech šesti čtecích rámců (oba řetězce). 5) Program BLASTX porovnává , šestirámcové translace nukleotidové zkoumané sekvence se šesti rámcovými translacemi nukleotidové sekvenční databáze.

Program BLASTN se používá pro identifikaci nukleových kyselin s požadovaným procentem shody a program BLASTP se může zvláště použít k identifikaci aminokyselinových sekvencí - s požadovaným procentem shody. ···· ·« ···· ·· · • ·· · t · ··

,·

Smith-Waterman ' (databáze: European Bioinformatics

Institute wwwz.ebi.ac.uk/bic-sw/) (popisuje se v publikaci Smith-Waterman, 1981, J. of Molec. Bioi.,. 147: 195-197) je matematicky * rigorózní algoritmus vhodný pro uspořádání sekvencí. ' * FASTA (popisuje se v publikaci Pears.onjet al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA,·. 85: 2444-2448) je ..heuristické přiblížení Smith-Watermanovu algoritmu. V případě. obecné diskuse postupu a výhod algoritmů BLAŠT, Smith-Waterman a_ FASTA (popisuje se v publikaci Nicholas et al., 1998,· „A Tutoriál on. Searching Séquence Databases and Sequence Scori-ng · .Methods" (www.psc.edu) . . :

.* * ' - # . .Použití předpokládaných aminokyselinových^· sekvencí lidského proteinu· Nogo nebo nukleotidových. sekvencí 'lidského EST zahrnujicí ·. vytvoření . . sekvence . .kóduj íc.í předpokládanou aminokyselinovou sekvenci· lidského Nogo použitelnou pro izolaci a identifikaci lidského genu Nogo,. fragmentů.přirozeně se vyskytujících mutantů a jejich variant.. - Tákové- -použití, které je známé v oboru, zahrnuje, ale není omezeno na použití informace pro přípravu sond nukleové kyseliny pro testování knihovny DNA, amplifikaci DNA, genetickému testování lidské populace a pro přípravu syntetických peptidů pro vytvoření protilátek. Dále v textu se popisují taková použití.

Popisují se nukleové kyseliny kódující deriváty a analogy proteinů Nogo a antisense nukleových kyselin Nogo. Je zřejmé, že termín „nukleová kyselina kódující fragment nebo část proteinu Nogo" je nukleová kyselina kódující pouze tento uvedený fragment nebo část proteinu Nogo a nikoli jiné kontinuální části proteinu Nogo jako kontinuální sekvenci,. V tomto kontextu část 'znamená jednu nebo více aminokyselin.

17 ·· ··♦

Vynález také popisuje fragmenty níiklepvých kyselin Nogo obsahující oblasti konzervativní mezi (vykazující homologií s) jinými nukleovými kyselinami Nogo stejného nebo odlišného druhu. Nukleové kyseliny kódující jeden nebo více oblastí Nogo j.sou ' zobrazeny na obrázku č. 2a. Je to například konzervativní 'oblast C-konce. krysího proteinu Nogo, která obsahuje přibližně 180 aminokyselin * a je kódována·; přibližně 540 nukleotidy ..kódující sekvence před stop kodonem.. 'Také se .popisuji nuklectidové a aminokyselinové sekvence dvou hydrofóbních oblastí v konzervativní oblasti. C-kónce, to znamená od aminokyselin 988 do 1 023 a od aminokyseliny 1 090 do ,1 125 v 'krysím proteinu Nogo A. Dále se popisují nukleotidové a • aminokyselinové sekvence . kyselé " oblasti N.-konce krysího proteinů Nogo A od zbytku 31 do zbytku 5:8.

Aby se uskutečnila funkční analýza - různých · oblastí, proteinu Nogo, provedla se série delécí v genu ,Nogo a ten se klonoval do expresívníhó vektoru' metodou rekombinace 1 DNA a exprimovál se jako ’fúzní protein. · Popisují sé. ~ nukleové kyseliny, které' kódují fragment proteinu Nogo, Jsou to například nukleové kyseliny, které kódují aminokyselinové zbytky 1 až 171, 172 až 974, 259 až 542, 542 až 722, 172 až 259, 7’22 až 974 nebo 975 až 1 162 SEQ ID NO: 2 nebo jejich kombinace a nukleové kyséliny, které kódují aminokyselinové zbytky 1 až 131, 132 až 939, 206 až 501, 501 až 680, 132 až 206, 680 až 939 a 940 až 1127 SEQ ID NO: 30 nebo jejich kombinace. Některé deleční konstrukce obsahují zkrácené části proteinu Nogo a další nukleotidové sekvence kódující hexahistidinovou značku a/nebo T7-tag. Vynález 'popisuje nukleové kyseliny kódující zkrácené proteiny Nogo, kterým chybí aminokyselinové zbytky 172 až . 259, aminokyselinové zbytky 974 až 1162 nebo aminokyselinové zbytky' 172 až 259 .a 974 až 1162. sekvence SEQ ID NO: 2, ale v. jiném případě obsahuje -zbytek sekvence SEQ ID NO: 2 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939 až 1 127 nebo t

aminokyselinové zbytky 132 až '206 a .939 až 1 127 sekvence SEQ - i* " · * < ID NO: 30, ale v jiném případě obsahuje zbytek sekvence SEQ,ID NO: 30. Struktura příkladu delečních' 'konstrukcí je zobrazena na obrázku č. 18. Dele.ční konstrukce,, když se zavedou do buňky produkují fragmenty nebo zkrácené 'části proteinu Nogo... Biologické aktivity těchto mutantů se testovaly v různých funkčních testech, .jak se popisuje v tabulce č. 2.

Specifická prďvedení klonování genu Nogo jsou následující: V případě exprese klonů (metoda, běžně známá v oboru) se zkonstruovala expresní knihovna metodami,"· které jsou dobře známy v oboru. Izolovala se například mRNA (lidská), vytvořila se cDNA a ligovala do expresívního vektoru (například odvozeného z bakteri.ofága) tak, že je možné ji exprimovat v hostitelské buňce, do ..které se pak vektor zavede. Aby se vybral exprimovaný produkt Nogo je: možné použít'různé testy. V jednom provedení vynálezu,, se při selekci' mohou použít protilátky proti proteinu Nogo,"' V, jiném provedení vynálezu -se* před·, “selekcí při .amplifikaci požadované sekvence , v genómóvé knihovně .nebo ·: v’ knihovně cDNA použije polymerázová řetězcová reakce . (PCR) . 01'igonukleotidové primery reprezentující známé sekvence Nogo ' se mohou použít jako primery při reakci PCR. V preferovaném provedení oligonukleotidové primery reprezentují alespoň část konzervativních segmentů Nogo se silnou homologií mezi geny Nogo různých druhů. Syntetické oligonukleotidy se mohou využívat jako primery při amplifikaci PCR sekvencí ze zdroje (RNA nebo DNA), přičemž se upřednostňuje knihovna cDNA. PCR se provedla například za použití teplotního cyklovače Perkin-Elmer Cetus a T.a'q. polymerázy (Gene Amp™j . DNA, která se může amplifikovat, zahrnuje mRNA nebo cDNA nebo genomovou DNA z libovolných eukaryontů. Je možné syntetizovat několik různých degenerátivnich primerů, které jsou vhodné pro- použití t » · 3 , v reakcích ,. PCR. Je .také , možné měnit přísnost' podmínek

19 • · ·· · ·· ··♦· «· • · ♦ · · • · • · • · · • · ·· · • · • *· • · hybridizace při navázáni v reakcích PCR, což umožňuje dosažení vyššího , nebo nižšího stypně podobnosti mezi. známou nukleotidovou sekvencí Nogo homologem nukleové kyseliny, která se má izolovat. Při hybridizaci, která se provádí mezi jednotlivými druhy, se preferují mírně přísné podmínky. ---. Po. · úspěšné—amplifikaci- -segmentu—homol o gu—Nogo, přičemž segment se může molekulárně klonovat a sekvenovat a využívat jako sonda .při izolaci celkové cDNA nebo genomového klonu. To naopak, umožní stanovení celé nukleotidové sekvence genu, analýzu její exprese a produkci jejího proteinového produktu ' ‘ř při funkční analýze, jak se popisuje dále v textu. ' Tímto způsobem se mohou identifikovat další geny kódující proteiny Nogo a jejich.analogy. , •Shora v textu popsané metody neomezují následující obecný popis metod, které umožňují získání klonů. Nogo.,

Libovolná eukaryontní buňka může sloužit jako zdroj nukleové kyseliny .pro molekulární klonování genu .. Nogo. Sekvence nukleové kyseliny kódující protein Nogo se mohou izolovat z obratlovce, savce , člověka , prasete, myši, skotu, kočky, ptáka, koně, psa stejně jako z primáta nebo hmyzu atd.. DNA se může získat standardním postupem, který je dobře znám v oboru, z klonované DNA (například z knihovny DNA), chemickou syntézou, klonováním cDNA nebo klonováním genomické DNA nebo jejích fragmentů, které se získaly izolací z požadované buňky (popisuje se na příklad v publikaci Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Glover, D. M. (ed.), 1985, DNA Clonning : A Particular Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). Klony odvozené z genomové DNA mohou vedle kódujících oblastí obsahovat regulační a intronové oblasti DNA.' Klony- získané z cDNA budou obsahovat pouze exonové sekvence. Nehledě na zdroj se gen může 20 • ···· ·· ♦♦♦· . ·· . é .- ·♦ · · · · · · *·· I « · · ♦ ··· • · · · · ♦ ·· · ' · ♦ · ··· ··· ··· t ·♦ · ·· ··· molekulárně klonovat do vhodného vektoru za . účelem propagace genu. · . ? ‘ Při molekulárním klonování genu z genómové DNA se vytvořily genomové fragmenty, kdý nekterý z nich bude kódovat požadovaný .gen. DNA se může štěpit ve specifických místech za použití- r ůzných—res-tr ikčn ioh—enzymů. V jiném případě .se může použít " DNáza v přítomnosti manganu, přičemž 'dojde k. fragmentaci DNA nebo DNA se může - fyzikálně, nastříhat, ' . ► · . · · · A-' ‘ například sonikací. Lineární fragmenty DNA se pak mohou separovat /podle velikosti standardní metodou, která zahrnuje elektroforézu ' na . aga.rózovém a polyakrylamidovém gelu a kolonovou chromáto.grafii. .· ? · · ‘ Λ .. * ‘ % m +

Po té, co . še vytvořily fragmenty DNA,může se provést identifikace specifického DNA fragmentu, který obsahuje požadovaný gen, řadou způsobů.,. Jestliže například množství části genu Nogo (libovolného druhu)-"nebo"; jeho' specifická RNA nebo jeho fragment j.sou dostupné a mohou se- čistit a značit, vytvořené .fragmenty DNA se mohou testovat’’ hybridizací nukleové kyseliny značenou sondou (popisujé* ‘.se v publikaci Benton, W and Davis, R. 1977, Science 196: 180, Grunstein, M. and

Hogness, D.;, 1975, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72: 3961). Tyto fragmenty DNA · budou h.ybridizovat se sondou s podstatnou homologií. Je také. možné identifikovat vhodný fragment štěpením rěstrikčním enzymem a porovnat· velikost fragmentů s těmi, které se očekávaly podle známé restrikční mapy, v případě, že je taková mapa dostupná. Další selekce se může provést na základě vlastností genu. V jiném případě se přítomnost genu může detekovat testy založenými na fyzikálních, chemických nebo imunologických vlastnostech svého exprimovaného produktu. Mohou se vybrat klony .cDNA nebo DNA, které produkují" protein, který například vykazuje podobnou nebo identickou elektrcforetickou 'migraci,. • ·#·· •9 #·♦·

izoelektrickou fokusující reakci, mapy proteolytického štěpení, post-translační úpravy, kysělé a bazické vlastnosti nebo antigenní vlastnosti, které jsou známy v případě proteinu Nogo. Protilátky proti proteinu Nogo jsou dostupné a jsou to IN-1 a IN-2 (US patent č. 5,684,133), AS Bruna a AS 472; Příprava protilátek AS Bruna a AS 472 se popisují dále v te~xúuT~Trotein Nogo se může identifikovat navázáním značené protilátky na putativně syntetizující klony Nogo v testu ELISA nebo westernovým přenosem čištěných nebo celobuněčných extraktů. Může se také identifikovat gen . Nogo selekcí mRNA hybridizací nukleové kyseliny, která následuje po translaci i-n vitro. Při tomto postupu se používají fragmenty pr.o . izolaci .komplementární mRNA pomocí hybridizace. Takové fragmenty DNA ".mohou reprezentovat dostupnou izolovanou. DNA Nogo jiných druhů (například myší, lidská) . Imunoprecipitační ' analýza nebo funkční testy (například schopnost tvorby agregátů ‘ in vitro, navázání na receptor) translačních produktů in vitro izolovaných produktů izolované .mRNA identifikuje mRNA a proto komplementární fragmenty DNA, které obsahují požadované sekvence. Navíc specifická mRNA se může vybrat na základě adsorpce polyzomů izolovaných z buněk, aby se imobilizovaly protilátky specificky řízené proti proteinu Nogo. Radioaktivně značená cDNA Nogo se může syntetizovat za použití vybrané mRNA (z adsorbovaných polyzómů) jako templát. Radioaktivně značená mRNA nebo cDNA se může pak použít jako sonda při identifikaci fragmentů DNA Nogo mezi jinými fragmenty genomové DNA.

Alternativy pro izolaci genomové DNA Nogo zahrnují, ale nejsou omezeny na chemickou syntézu samotné genové sekvence ze známé sekvence nebo vytvořením cDNA z mRNA, která kóduje protein Nogo. RNA vhodná pro klonování cDNA .genu Nogo se může izolovat z buněk, které exprimují Nogo. , Je možné použít i jiné metody podle vynálezu. *·

Identifikovaný a izolovaný gen se pak může začlenit do vhodného klonovaciho vektoru. Může se použit velký ..počet systémů vektor-hostitel, které jsou známy v oboru. Možné vektory zahrnuji, ale nejsou omezeny na plazmidy nebo upravené viry, ale vektorový systém, musí být kompatibilní s použitou

hostitelskou buňkou___Takové......vektory zahrnují, ale nejfsotT omezeny na bakteriofágy, jako jsou deriváty lambda nebo plazmidy, jako jsou deriváty plazmidu p3R322 nebo pUC nebo vektor Bluescript (Stratagene). . Ve specifickém příkladu vynálezu se gen, Nogo klonuje do pcDNA3 s. epitopem tag, čímž se zjednoduší analýza exprese proteinu.

Začlenění do klonovaciho vektoru se může například uskutečnit ligací fragmentu DNA do klonovaciho vektoru, který •má komplementární kohezivní konec. Jestliže však komplementární .restrikční -místa používaná ve fragmentu DNA nejsou přítomny v klonovacím vektoru, pak konce molekul DNA se mohou enzymaticky upravit. V jiném případě libovolné požadované místo se může produkovat ligací nukleotidových sekvencí, (linkerů) na konec *DNA. Tyto ligované linkery mohou obsahovat specificky chemicky syntetizované oligonukleotidy kódující sekvence, které rozeznávají restrikční endonukleázy. Při alternativní metodě se štěpený vektor a gen Nogo může modifikovat homopolymérním zakončením. Rekombinantní molekuly se mohou zavést do hostitelských buněk prostřednictvím transformace, transfekce, infekce, elektroporace atd., tak, že se vytvoří řada kopií genových sekvencí. Při jiné metodě se požadovaný gen může identifikovat a izolovat po začlenění do vhodného klonovaciho vektoru pomocí „děla". Obohacení požadovaným genem například frakcionací podle velikosti se může provést 'před začleněním do klonovaciho vektoru. 23

·««· ·· ·««· ·· « % « · » · · > · # * · t ·

Ve specifickém provedeni vynálezu . transformace hostitelských buněk rekombinantních molekul, -DNA, ' které začleňuji izolovaný gen .Nogo, -cDNA nebo syntetizovanou sekvenci DNA umožňuje vytvoření, v.élké' množství kopií genu. Gen se tak může získat ve. velkém množství pomocí rostoucích trans formantů, izolací molekul rekombinantní- .DNA z^transformantů a jestliže to je nutné, izolací začleněného genu z' izolované'’.rekombinantní DNA. · ' ...

Sekvence Nogo podle vynálezu zahrnuji tyto nukleotidové sekvence, kódující v podstatě stejné aminokyselinové sekvence, jak se vyskytují v přirozených proteinech Nogo a ty kódované aminokyselinovými · sekvencemi s funkčně ekvivalentními aminokyselinami stejně jako sekvencemi, které kódují deriváty :nebó analogy Nogo, jk.k se· popisuje dále v textu. v. případě derivátů a analogů Nogo. ‘ . ... '.· ' '.*.· ·.'.' » * «. . *

Exprese' genů · Nogo . ’ , * .. ♦ ^Nukleotidová sekvence kódující protein Nogo nebo funkčně ' ; * / _ ' ·_ - . -* ' , · - aktivní analog nebo fragment nebo -jiný jeho derivát (zobrazeno ria obrazcích č. ;lb á 2a,i popisuje · se dále * v textu)*- se může začlenit, do vhodného expresívního vektorů, .to znamená do vektoru, který obsahuje nezbytné elementy ’ vhodné \ pro transkripci a translaci začleněné sekvence kódující protein. Nezbytné transkripční a translsční signály se* mohou také poskytnout přirozeným genem Nogo a/nebo její . lemující sekvencí. Kódující sekvence se může také značit sekvencí, která kóduje dobře popsaný antigen nebo biologickou molekulu, která má známé vazebné vlastnosti s vazebným partnerem (například epitop myc, histidinovou značku, epitop T7 atd., zobrazeno na obrázku č. ’ 11a až 11c dále v textu) . Tato další sekvence se může využít při izolaci proteinu Nogo, proteinového fragmentu 'nebo derivátu za použití 'interakce vazebné skupiny s odpovídajícím partnerem, který je přichycen na pevný podklad, v ·<.. i 24

• 1 2·»· ·· I t· 2··· •. · v#· ·

. * ·% · » · ·· • « t « 2 · * · · »4 ··· Různé systémy hostitel-vektor·.se mohou využít, k expresi, sekvence kódující 'protein. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na ' savčí buněčné systémy infikované virem (například virus vakcínie, ‘adenovirus , atd.), . systémy, hmyzích buněk infikované virem i (například bakulovirus) ,. mikroorganizmy, 1 takové jako jsou kvasinky_ab.s.ahuj-í-cí-.—k-va^s-i-n-k-o-v-é—vektory—nebo bakterie transformované bakt-eriofágem, - DNA, plazmidová DNA nebo.·, kosmidová DNA. Expresivní elementy, vektorů se liší v jejích intenzitě a specifitě. V· závislosti ha využívaném systému, vgktoř-hostitel ' se může použít libovolný z počtu vhodných transkripčních . a translačničh elementů. Ve specifických . provedeních vynálezu se exprimuje lidský gen Nogo, buď jako Nogo A, Nogo B nebo Nogo C (zobrazeno na obrázku č. lbj . V jiném provedení vynálezu se exprimuje fragment Nogo obsahující oblast proteinu Nogo. 2

Termín '„buňka se transformovala nukleovou kyselinou" znamená, že taková buňka obsahuje . po zavedení nukleové kyseliny do buňky nebo do její rodičovské buňky například transfekcí, elektroporací, transdukcí atd., nukleovou kyselinu, která není přirozeně přítomna v buňce,

Vynález ,popisuje nukleotidové sekvence kódující fragmenty lidského Nogo A obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 131, 132 až 939, 206 až 501, 501 až 680, 132 až 206, 680 až 939 a 940 až 1127 sekvence SEQ ID NO: 30. Také se popisují nukleotidové sekvence, které kódují zkrácené oblasti lidského proteinu Nogo A, zkráceným proteinům chybí aminokyselinové zbytky ·. 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939 až 1127 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206·· a- 939- až 1127 sekvence SEQ ID NO.: .30, ale jinak obsahují zbytek sekvence ,SEQ ID NO: 30. ' 7 , ' £' .<7, . . ·...·

Libovolné dříve popsané metody vhodné . „pro2 - začlenění fragmentů DNA do vektoru·- se 'mohou použít 1 ke ‘.konstrukci 25 • MI9 ·· «··· ·· • · • · • • - * ·· • · ' • .. · . · • • ' é • · « 9 i • • • ·· · t ·# ·· expresívních vektorů, které obsahuji chimérický gen obsahující vhodný transkripční/tránslační kontrolní signály a proteinové kódující sekvence. Tyto metody mohou zahrnovat rekombina.ntní DNA in vitro a ^syntetické metody a-: in .vivo . rekombinanty (genetická rekombinace)Exprese' sekvence nukleo.yé kyseliny kódující protein Nogo -· nebo peptidový fragment se může regulovat druhou 'sekvencí nllkleové kyseliny tak, že protein 'nebo. . .peptid Nogo se exprimuje v hostiteli transformovaném s molekulou rekqmbinantní DNA. Exprese proteinu Nogo se může. řídit libovolným elementem promotoru/zesilovače, který je znám v oboru. V příkladném provedení vynálezu je vhodné použít jeden z přirozených- promotorů Nogo, buď PÍ nebo P2, který se popisuje dále v textu. Může se také použít nepřirozený promotor. Promotory, které se mohou použít, řídí expresi genu s Nogo a zahrnuji,, ale nejsou omezeny na oblast časného promotoru SV40 ^popisuje se v, publikaci'Bernoist and Chambon, 1981, Nátuře 290: 304-310),, promotor obsažený v dlouhé terminální repetici 3'konce viru Rousova sarkomu (popisuje se v publikaci Yamámótg, et al., . 1980, Cell 22: 787-797), promotor thymidinové kinázy virů' herpes (popisuje se v publikaci Wagňer et al., 1981, -Proč. Nati. Acad. Sci U.S.A. 78: 1441-1445), regulační sekvence genu metalothioneinu (popisují se v publikaci Brinster et al., 1982, Nátuře 296: 39-42), prokaryontní expresívrií vektory, -jako jsou promotor β-laktamázy (popisuje se v publikaci Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731) nebo promotor tac (popisuje se v publikaci DeBoer et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21-25, „Useful proteins from recombinantn bacteria" .Scientific American, 1980, 242: 74-94), rostlinné exprešívní vektory, obsahující oblast promotoru nopalinové syntetázy (Herrera-Estrella et al., Nátuře 303: 209-213) nebo 35.S RNA promotor květákového mozajkového viru (popisuje se v publikaci Gerdner, .et ‘al., 1981, Nucl. Acids

Res. 9: 2871) a- promotor fotosyntetické enzymové ribulózoyé • · · · • · · · 2 6 • · · · • · · bifosfátové karboxylázy (popisuje se v publikaci > Heřrera-Estrella et al·., 1984, Nátuře 310: 115-120), promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, takové jako je promotor Gal 4, promotor ADC (dehydrogenáza alkoholu), promotor.. PGK * c ' ^ . (fosfogl.ycerolová kináza) , promotor alkalické fosfatázy . a t ... následující zvířecí ; transkripční řídící "oblasti, které vykazuji · tkáňovou specif ítu a využívají se u transgehních zvířat: řídící oblast genu elastázý I, která je aktivní v pankreatických acinárních buňkách (popisuje se v publikaci Swift‘et al.,· 1984, Cell 38: 639-646,- Orniťz et al., 1986,

Cold- Spring. Harbor Syirtp. Quant. Biol. 50: 399-409, MacDonald, 1987, Hapato.logy, 7: 425-515)·, oblast řídící gen inzulínu, která je aktivní v pankreatických buňkách .beta (Hanahan, 1985, Nátuře 3Í5: 115-122), řídící oblast, genu imunoglobulinu, která je . aktivní v lymfoidních buňkách’ (popisuje * se v publikaci

Grosscheld et al., 198 4, Cell 38: 647-658, · Adames et al., 1985., Nátuře 318: 533-538, Alexander ét al., 1987, Mol. Cell. f-i * * ^ x - * * - ' ^: ·

Biol. 7: .1436-1444), řídící oblast virunádoru prsní žlázy u myší, která je aktivní v testikulárních, .prsních, lymfoidních * . * 1 a žírnych buňkách (popisuje se v publikací., Leder· et al., 1986,

Cell 45: 485-495), oblast řídící gen albuminu, která je aktivní v játrech (popisuje se v publikaci Pinkert et al., 1987 , Genes and Devel. 1: 268-27 6), oblast řídící gen alfa- fetopřoteinu, která je aktivní v játrech (popisuje se v publikaci Krumlauf et al. , 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639- 1648, Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58) oblast řídící gen alfa 1-antitrypsin, který je aktivní v játrech (popisuje se v publikaci Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161- 171), oblast kontrolující gen beta-globinu., která je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315: 338- 340, Kollias et al. , 1986, Cell 46: 89-9.4, oblast řídící gen myelinového základního' proteinu,. který je . aktivní v oligodendrocytěch v mozku (popisuje se v publikaci Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712), oblast řídící gen myosinového lehkého řetězce 2, která je, aktivní .'v kosterním svalu (popisuje se v publikaci Sani, 1985, Nátuře 314: 283-286) a .oblast řídící gen uvolnění gonadotropičkého hormonu, který- je jaktivní v hypotalamu (popisuje ; se v publikaci Mason et al.·, 1986, * science 234: 1372-1378). ' ‘ i .· •'ví* Λ . Ť ’ ; Ve specifickém provedeni—..vynálezu —používaný-—vektor obsahuje promotor operativně spojený s nukléovou kyselinou kódující Nogo, jeden nebo více počátku "replikace a jeden nebo yíce selekčních markérů ' (například' gen - rezistence. - na :antibiotika) . . „ - ' . *- Ve specifickém' provedení vynálezu se expresívní konstrukce připravila , subklonováním ' sekvence kódující- Nogo do restrikčního : mísťa enzymu EcoRI každého ze tří vektorů pGEX. (expresívní vektory -glutathionové S tranferázy, popisuje se v publikaci Smith and Johnson, 1988, Gene 7: 31-40). To umožňuje expfimovat protein'- Nogo ze subklonu'. ve správném 'čtecím rámci.''·, 1 '

Expresívní vektorý Obsahující inzerty genu Nogo se mohou identifikovat třemi obecnými přístupy a) hybridizací nukleové kyseliny, /b) přítomností nebo absencí funkcí „markerového" genu a c) expresí začleněných; sekvencí. V prvním přístupu přítomnost genu Nogo začleněného do expresívního vektoru se může detekovat hybridizací nukleové kyseliny za použití sond, které obsahují sekvence homologní se začleněným genem Nogo. Ve druhém přístupu se může identifikovat a vybrat rekombinantní vektor/hostitelský systém na základě přítomnosti nebo absence jistých markerových genových funkcí (například aktivity thymidin kinázy, rezistence na antibiotika, transformační fenotyp, vytvoření- okluze v bakuloviru atd.), což je způsobeno inzercí genu Nogo ~ do., vektoru. Jestliže se gen Nogo začlenil do sékvence markerového (genu vektoru, mohou se rekombinanty ' r obsahující inzert Nogo identifikovat nepřítomností funkce

HSHHE

markerového genu. Rekombinantní expresívní vektory se mohou identifikovat testováním ^produktu '-t Nogo „exprimovaného rekombinantem. Takové testy mohou být založeny na· fyzikálních a funkčních vlastnostech, proteinu Nogo V testovacích systémech in viťro například navázáním na protilátky proti Nogo.

' · V i *" . v · Po té. co' se identifikovala a—i-z-oiov-a-l-a—rekombinantní molekula DNA, může se pro její propagaci použít několik metod, které jsou dobré známy' v oboru'. Po té, co. je zaveden vhodný hostitelský systém a růstové ' podmínky, rekombinantní expresívní vektory se. mohou propagovat .a ..připravovat ve velkém' množství . Jak . už se vysvětlilo dříve·' v textu, expresívní vektory, které se mohou využít zahrnují,· ale nejsou omezeny na následující vektory nebo jejich deriváty: lidské a zvířecí •viry, jako je virus vakcínie a adenovirus, hmyzí viry, jako je bakulovirus,^ kvasinkové vektory, bakteriofágové vektory (například lambda) a:. plazmidoyé nebo kozmidové DNA vektory.

Navíc se může vybrat kmen hostitelské buňky, ", který upravuje exprese začleněných sekvencí nebo upravuje a zpracovává .genový produkt požadovaným .specifickým způsobem. Exprese z jistých promotorů může zesílit v přítomnosti jistých indukčních činidel, čímž je možné řídit expresi geneticky manipulovaného proteinu Nogo. Různé' hostitelské buňky dále vykazují charakteristické a specifické mechanizmy pro translační a post-translační postup a úpravu (například glykosylaci, fosforylaci proteinů) . Vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy se mohou vybrat k zajištění požadované modifikace a zpracování exprimovaného cizorodého proteinu. Například exprese bakteriálního systémů se může použít k produkci neglykosylovaného jaderného proteinového produktu. Exprese v kvasinkách bude produkovat glykosylační produkt. Exprese v savčích buňkách se, může použít k zajištění přirozené glykosyláce heterolpgního proteinu. Různé vektorové/éxpresívní systémyrmohou ovlivňovat reakce zpracování v různém rozsahů. . 29 * * * V jiných· provedeních vynálezu protein' Nogo, fragment, s analog nebo derivát se může exprimovat jako fúze nebo produkt chimérového proteinu (obsahující protein, fragment, analog nebo derivát spojený prostřednictvím peptidové vazby na heterologní proteinovou sekvenci (odlišného proteinu)). Takový chimérový produkt se může připravit. ligací—vhodn-ých- -sek-veneí- -nukleové kyseliny, t t které kóduji sekvence požadované aminokyseliny, metodami, .které .jsou dobře známy v.oboru. To probíhá ve vhodném kódujícím rámci a.exprimuje- se chimérový produkt vyrobený syntézou proteinu,' například použitím .syntetizéru.peptidu. - . ·

Sekvence cDNA a genomové sekvence se mohou klonovat a exprimovat. . ·. ' · ·'·,- ·'

Identifikace a izolace produktů genu No.go .Vynález poskytuje aminokyselinové i sekvence Nogo, * ' ·* přednostně lidské Nogo a jeho fragmenty á : deriváty, které obsahují antigenní determinantu (to znamená, že mohou být rozeznány protilátkou) nebo které jsou jinak, funkčně aktivní, stejně jako jejich sekvence nukleových kyselin. Termín „funkčně aktivní” materiál Nogo znamená, že materiál vykazuje jednu nebo více známých funkčních aktivit spojených s plnou délkou (divoký typ) proteinu Nogo A, například vlastnosti nepermisivního substrátu, kolaps růstu ganglií dorzálních kořenů, inhibice rozšíření buněk NIH 3T3, inhibice nadměrného růstu neuritů, navázání na substrát Nogo nebo vazebného partnera Nogo, antigenicita (navázání na protilátky proti Nogo), imunogenicita atd..

Ve specifických provedeních podle vynálezu fragmenty proteinu Nogo obsahují alespoň 6 aminokyselin, 10 aminokyslein, . 17 aminokyselin, 50 aminokyselin, · 100 aminokyselin .nebo alespoň· 220 aminokyslein. .V jiném provedení

podle vynálezu. \ proteiny obsahují podstatně vysoce konzervativní oblast C-konce proteinu Nogo (188 aminokyselin C-ko.nce proteinu Nogo A) .. Vynález dále popisuje fragmenty nebo proteiny obsahující .fragmenty,. kterým chybí konzervativní oblast.· C-konce nebo. hydrófobní - části C-konce nebo aminoterminální · kyselé oblasti .nebo aminoterminální poly-"prolinovou oblast nebo její libovolnou kombinaci nebo protein Nogo. Vynález také popisuje nukleové^kyseliny kódujíc uvedené oblasti, fragmenty a proteiny. - . .

Po . té, co . se identifikoval rekombihant,' který exprimuje sekvenci genu Nogo, analyzoval se genový produkt. Toho se dosáhlo · testy .založenými na fyzikálních a funkčních vlastnostech produktu, které zahrnují radioaktivní značení produktu následované analýzou gelovou elektroforézou, imunitnímtestem atd.. . .

Po té, co se. identifikoval protein Nogo;, - může se izolovat '* ' í a čistit standardními metodami, které .zahrnují chromotagrafii (například chromátografii s výměnou'· 'iontů,' afinitní chromatografii ' a kolonovou Chromátografii dělící podle velikosti), centrifugaci, dělení na základě rozdílné rozpustnosti nebo jinými standardními metodami čištění proteinů. Funkční vlastnosti se mohou hodnotit za použití libovolného vhodného testu zahrnující snížení růstu ganglií dorzálních kořenů, inhibici rozšíření buněk NIH 3T3, inhibici regenerace neuritů ve zrakovém nervu (popisuje se dále v textu). V jiném případě, vynálezu po identifikaci proteinu Nogo produkovaného rekombinantem se může odvodit aminokyselinová sekvence proteinu z. nukleotidové sekvence chimerového genu obsaženého v rekómbinantu. Protein se: může syntetizovat pomocí standardních chemických' metod, které jsou dobře známy v oboru 31 ·· ··♦♦ ·· • V · · · · ·, (popisuje se například v publikaci Hunkapiller, M.> et al., 1984, Nátuře 310: 105-111). V jiném alternativním provedení vynálezu se může přirozený Nogo C izolovat z přirozených zdrojů standardními metodami, které se popisují . shora v textu (například .imunoafinitním čištěním) . , ·,— -----—-———· ^ ^-------------

Ve specifickém*provedení vynálezu takové proteiny Nogo, ať už , jsou produkovány metodou rekombinace DNA^ nebo metodami chemické syntézy' nebo čištěním přirozených, proteinů zahrnují primární . aminokyselinovou sekvenci, všechny nebo část aminokyselinové sekvence,, jak je znázorněna na obrázku č. 2a (SEQ IĎ NO: 2), bovinní sekvenci znázorněnou na obrázku č. 12 ·'·(SEQ ID NO: 29) nebo. ..lidskou sekvenci znázorněnou .na1 obrázku :č.. 13 (SEQ ID NO:.· 30), stejně jako" fragmenty 'nebo’ jiné deriváty 1 (které jsou. například znázorněny na obrázku č. 18) a , , . ' -,. ι·· : ί '··· . jejich analogy, které, zahrnují' jejich ./homologni. proteiny. Upřednostňuje :se, aby': proteiny Nogo neobsahovaly, žádný . volný CNS myelinový materiál se kterým '.je v normálním případě spojen. ‘ ^ . V" .' ': ·

Struktura genu a proteinu Nogo

Struktura genu a.proteinu Nogo se může analyzovat různými metodami, kt.eré jsou dobře známy v oboru a několika dalšími metodami, které se popisují v následujícím textu.

Genetická analýza

Klonovaná DNA nebo cDNA odpovídající genu Nogo se může analyzovat metodami zahrnuj íčími Soutehrnovu hybridizaci (Southern, E. M., <.1975, J. Mol. Biol·.. 98: -503-517), northernovu hybridizaci·(napříkladFréeman etal., 1983, proč. Nati. Acad, Sci. U. S. A.. 80: 4094-409.8) , mapování pomocí restrikčních endoňukleáz "(popisuje se ·v publikaci Maniatis, J, 32 • · T., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York) a analýza sekvence DNA. Polymerázová řetězcová reakce (PCR, popisuje se v dokumentu US patent č.' 4,683,202, 4,683,195 a 4,889,818, ^Gyllenstein et al., 1988, Proč. Nati. 'Acad. Sci. U.S.A. 85:' 7 652-7 656, Ochman et al., 1988, Gentics '120: 621-623,. 1 Loh ět al.,.' 1989, Science 24 3: 217-220) následovaná Southernovcu hybridizaci se sondou specifickou pro Nogo umožňuje' detekci genu Nogo· v DNA pocházející z různých, buněčných typůl .Mohou se také použít metody amplifikace, které jsou jiné než PCR. V.jednom provedení vynálezu se může použit Southernovy hybridizace, aby se stanovilo genetické spojení' , » i; , genu Nogo.. Analýza northernovou hybridizaci se může použít ke stanovení exprese genu Nogo. V různých · buněčných " týpech v různém .stádiu vývoje nebo aktivity se, může testovat,; Izda *· doičhází k expresi genu Nogo. Přísnost hybridižačních podmínek při Southernově a .'nor.thernově hybridizaci se ;může. ovlivňovat,, aby se zajistila detekce nukleových kyselili, s požadovaným stupněm vztahu k používané specifické sonděNogo. Může’ se ' · - * ' * · Λ ' v4 · 1 pouzxt modifikace, těchto metod a jiných metod,, které jsou dobře známy v oboru. · . - * .... .··.

Mapování .restřikčními endonukleázami se může .použít při hrubém stanovení genetické struktury genu Nogo. Restrikční mapy získané štěpením restrikčními endonukleázami se mohou potvrdit analýzou sekvence DNA. >. .

Analýza sekvence DNA se může uskutečnit libovolnou metodou známou v oboru, která zahrnuje, ale neomezuje se na metodu podle Maxama a Gilberta (popisuje se v publikaci Maxam and Gilbert et al., 1980, Meth. Enzymol. .65: 499-560), Sangeřovu

dideoxy metodu .(popisuje se v publikaci Sanger, F., et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463), použití DNA «V) ’ polymerázy T7 (popisuje se v publikaci Tábor and Richardsón, dokument US patent' č: 4,795,699) nebo'použití automatizováného sekvenátoru DNA (například Applied. Biosystems, Foster City, i CA) . ' · ť „

Analýza proteinů *( ,

Aminokyselinová sekvence proteinu: No'go se může odvodit dedukcí—ze—sekvence' DNA -nebo v-jiném- případě—přímou—sekvenací proteinu například automatickým'sekvenátorem aminokyselin. ΐ r' * ,

Sekvence proteinu Nogo "se, může dále charakterizovat analýzou -hydrofility (popisuje se v publikaci Hopp, T. and Woods, K. , 1981', Proč. Nati. Acad: Sci. . U. S. A. 78: 3824).

Profil hydrofility se může použít k identifikaci hydr.ofóbních a hydrof ilních oblastí proteinu Nogo a odpovídá j ícírn,· oblastem •genové sekvence,, která, kóduje takové oblasti. Může · se také. provést analýza .struktury, (popisuje se v publikaci Chou, P. and. Fasman,. G., 1974,' Biochemistry 13: 222), abý se identifikovalyoblasti Nogo, . které "předpokládají specifickou sekundární strukturu'. ' .

Manipulace, translace, a předpoklad sekundární struktury, předpoklad a vynesení otevřeného čtecího rámce, stejně jako stanovení sekvenční homologie se může také uskutečnit použitím počítačových programů, které jsou dostupné v oboru.

Mohou se také,, použít také jiné metody strukturální analýzy. Ty zahrnují krystalografii pomocí paprsků X (popisuje se v publikaci Engstom, A., 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13) a počítačové modelování (popisuje se v ublikaci

Fletterick, R. ^ and Žoller, M. (eds.), 1986, Computer Graphics and Molecular -Modeiing, Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) . . · ' '· · . Λ - ;.y· ^ . i ...' ' *

Vytvoření protilátek proti proteinům Nogo a'jejich.deriváty

Protein Nogo, jeho fragment nebo jiné, -deriváty nebo analogy se mohou použit jako imúnogen při vzniku "protilátek, které 1 imunospecificky· váži na r takový imunogert*. .Takové * .**„··· * * * protilátky zahrnuji, * ale' nejsou omezeny ná polyklonální, monoklonálni, chimérické protilátky, ‘ jednotlivé řetězce., fragmenty—Fab a expresí-vní-- knihovnu —Fab. Produkuji-se protilátky řízené proti rekombinantnímu fragmentu krysího nebo bovinního proteinu Nogo (popisuje se dále v textu), přičemž tyto protilátky také zkříženě reagují s epitopy jiných druhů. V jiném provedení vynálezu, . "fragmenty proteinu Nogo. identifikované ,.jako hydrofilní se ' také používají jako imunogeny při produkci protilátek. Při produkci.polyklonálních protilátek proti proteinu Nogo nebo derivátu -nebo analogu se mohou použít různé postupy, které jsou dobře známy v oboru. V,určitém provedení vynálezu se mohou získat králičí polyklonální' protilátky vůči .epitopu proteinu Nogo kódované sekvencí S.EQ ID NO: 2 na obrázku č. 2a, ‘SEQ ID NO: 2 9: na obrázku č. ,12,· SEQ- ID NO: 32 na obrázku č. 14 nebo SEQ ID. NO: , 30' na obrázku č. 13 (krysí portein Nogo A, bovinní protein Nogo, krysí protein Nogo C nebo lidský protein Nogo) nebo jeho subsekvence. Při produkci protilátky se různí zvířecí hostitelé mohou imunizovat injekcí s přirozeným proteinem Nogo nebo s jeho syntetickou verzí nebo derivátem (například fragment), který zahrnuje králíky, myši, krysy atd. . Ke zvýšení imunologické odezvy se mohou použit různá adjuvans v závislosti na druzích hostitele. Tato adjuvans zahrnují Freundovo adjuvans (úplné nebo neúplné), minerální gely, jako jsou•například hydroxid,hlinitý, povrchově akitvní činidla, jako je lyzolecitin, pluronní polyol.y,' polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyaniny přílipkovitých^ plžů, dinitrofenol a potencionálně použitelné lidské .adjuvans, - jako je BCG (bacil Calmétte-Guerin) a corynobacterium parvum. #* ···· #* ····

. · · · · · * ······ 35 · · '· · ···· ·· · Při přípravě monoklonálních protilátek určených proti sekvenci proteinu Nogo nebo·jeho analogu se může použít libovolný způsob, při kterém dochází' k produkci molekul protilátek kontinuálními buněčnými liniemi. f Může se například použít metoda hybridomů podle Kohlera a -Milsteina (popisuje se V publikaci Kohler and Milstein, 1975, Nátuře 256: 495-497) stejně "j"ako metoda tribmů” metoda 'Irybridomů-^lidské B-buňky (popisuje se .publikaci Koznor et al., -1983, .Immunology Today 4: -72) a metoda EBV-hybridomu,. . přičemž -vznikají lidské monoklonální protilátky (popisuje se v publikaci Cble et al., 1985, Mo.noclonal' Antibodies and Cancer Tharepy, Alan ,R. Liss, lne.', pp.... 77-96) . Monoklonální protilátky se mohou produkovat u zvířat·, která neobsahují . parazity za použití jisté technologie popsané v dokumentu PCT/US9Ó/0-2545. Podle ' vynálezu •se mohou lidské protilátky použít a získat 'za . použití lidských hybridomů (popisuje .. se ,v publikaci'' Cote ' et -al·. , 1983, Proč.

Nati.. Acad. Sci. U.S.A. 80: 202 6-2030)' ’ nebe transformací . *·. -.-¾, i · , lidských B buněk virem EBV in vitr-o (popisuje se v publikaci Cole et al,. , 1985, Monočlonal Antibodies and Cancer Therapy,

Alan R. Liss, pp. 77-96). Ve skutečnosti podlé vynálezu metoda vyvinutá pro produkci „chimérových protilátek" ..".(popisujé se v publikaci Morrison et al., 1984, Proč. Nati.- Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855, Neuberger et al., Ntaure '312: 604-608,

Takeda et al., 1985, Nátuře 314: 452-454) sestřihává geny z myší molekuly protilátek, která je specifická pro protein Nogo spolu se geny z lidské protilátkové molekuly vhodné biologické akitvity. Takové protilátky jsou také předmětnou věcí vynálezu. ...

Postup vhodný pro produkci jednořetězcových protilátek (popisuje se v publikaci US patent č.. 4,946,778)'. se může upravit tak, aby se produkovaly jednořetězcové protilátky specifické pro protein' Nogo'. Mohou se· také použit metody popsané -pro' konstrukci expresivní. knihovny Fab· (popisuje se v publikaci Huse et al., 1989,- Science 246: 1275-1281)-,. což

umožňuje rychlou .“.a jednoduchou identifikaci monoklonálnich , ψ fragmentů Fab s požadovanou specifitou'v případě proteinu Nogo nebo jeho analogů nebo derivátů..

Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekuly, se 'mohou vytvořit známou: metodou. Takové- fragmenty .například ·- zahůmujTT, áÍe“íie]"sOTrnom-e_zeny—na—f-ragmen-1r^F-(-abř-)-2-,—ki-e-rý-^se—může____ produkovat štěpením pepsinem molekuly protilátky, fragmenty F(ab')2,. které se mohou vytvořit. redukcí .disulfidových můstků fragmentu F(ab-)2/ fragmenty Fab, které se mohou vytvořit ošetřením molekulou protilátky g papainem a redukčním činidlem a fragmenty’Fv. . . Při produkci protilátek sé může . uskutečnit’ testování .žádaných protilátek metodu, která je dobře .známa-' voboru. Touto., .metodou- je například test1. EL ISA. .Aby . se -vybraly protilátky, ’ které rozeznávaj í specif ickou'oblášt proteinu Nogo,· je možné testovat vytvořené ' hybridomý za^ůče-lem . z j ištění přítomnosti produktu, . který se . váže_ na' fragment Nogo obsahující uvedenou oblast. ,Při selekci protilátky, která se specificky váže na první homolog proteinu Nogop 'ale. která se neváže specifiky na odlišný homolog Nogo, je možné zvolit na základě pozitivního navázání prvního homologu Nogo a chybějícímu navázání druhého homologu Nogo.

Vynález také popisuje protilátky specifické pro oblast proteinu Nogo.

Cizorodé protilátky se mohou použít při metodě, která je známa v obořu a vztahuje se k lokalizaci a aktivitě sekvencí proteinu Nogo podle vynálezu. Je to například zviditelnění

Jr těchto proteinů, měření jejich množství ve vhodných fyzikálních vzorcích ,a to například při diagnostické metodě atd.. · ' v

37 . · ·♦*· ·*··«'* ·· « ·· · « · · · · ·* • · · · · · * · · ··· ·. ·· · ·· ·*·

Protilátky proti Nogo a jeho fragmentům, které obsahuji vazebnou oblast,· se mohou použit jako terapeutika.

Proteiny Nogo, jeho deriváty a analogy

Vynález dále popisuje proteiny Nogo a deriváty (zahrnující fragmenty) a analogy, protein-ů—No go-.— - Popisuj i—se nukleóvé .kyseliny kódující' protein Nogo, deriváty a proteinové analogy. V jednom provedení vynálezu se proteiny Nogo kódují nukleovými kyselinami Nogo popsanými shora v textu. Proteiny Nogo A, Nogo B: nebo Nogo' C a déřiváty a analogy jsou zvířecí proteiny a jsou popisovány vynálezem. Mezi uvedená zvířata patří myš, krysa, prase, kráva, pes,’opice, člověk, moucha· nebo žába.

Vynález také popisuje produkci a použití derivátů a analogů příbuzných proteinu Nogo.-· Ve specifickém provedení vynálezu jě,derivát i analog funkčně aktivní, to znamená, že je schopný vykazovat- jednu :nebo. více funkčních aktivit spojených· s proteinem Nogo divokého typu v plné délce. Mohou se použít deriváty a analogy, které vykazují požadovanou imunogenicitu^ nebo antigeničitu- v imunologických testech, při-imunizaci, .při' inhibici aktivity Nogo atd.. Deriváty nebo analogy,, který si ponechávají nebo v jiném případě jim chybí nebo inhibují požadované vlastnosti proteinu Nogo (například navázání na vazebného partnera proteinu Nogo se mohou použít jako indukční činidla nebo inhibitory takových vlastností. Specifické provedení vynálezu popisuje fragment proteinu Nogo, který se váže na protilátky proti Nogo. U derivátů a analogů proteinu Nogo se může testovat požadovaná aktivita postupem, který je znám v oboru, který zahrnuje testy popsané shora v textu.

Za účelem '.mapovat aktivňí oblasti proteinu Nogo se připravila série., . delečníčh mutantů· Nogo pomocí metody rek.ombinacé ONA, ja;k se popisuje "dále ^ v textu. Oblasti Nogo,

í •t ' · ·« · « ♦ ·· • « < 38 ··· • · · · » · Μ · »· ·«· • které jsou ‘přítomny v delečních mutantech jsou zobrazeny· na tobrázku č. 18. Ve specifickém provedeni vynálezu se_ popisují . fragmenty proteinu Nógo, například fragmenty obsahující' ’ . .aminokyseliny proteinu Nogo A (SEQ ID -NO: 2). čísla 1 až 171, . *- 172 až 974, 259 až 542*, 542 až 722, 722 až 974, 172 až ' 259 ' . nebo 975 až1162 nebo jejich kombinaci. Vynález dále popisuje· '.•• zkrácené ^mutant.y proteinu Nogo. néobsahujTcI ' amlno"kysBlrřny— ''čísla 172 až ‘259 a/nebo 975 až.»1162 sekvence ,.SEQ ID .NO: 2, přičemž uvedené oblasti se jeví být Ufnepodstathé. a rmohou sé odstranit, aniž se ovlivní biologická aktivita. Popisují se také. odpovídající fragmenty lidského .proteinu Nogo A obsahující aminokyseliny číslo 1 až 131, 132 až 939, 206 až 501, 501 až 680, 132 až 206, 680 až 939 nebo 940 až 1127 sekvence SEQ ID NO: 30.· Vynález dále popisuje.zkrácené mutanty lidského proteinu Nogo A, kterým chybí aminokyseliny číslo 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939 , až 1127 nebo aminokyselinové zbytky 132 až 206.,:.a 939 vajž'"1127 sekvence SEQ ID NO: 30. , · '* .».* Ve specifickém ' provedení vynálezu , fragmenty neobsahují Žádný volný CNS myelinový materiál a/nebo vykazují vykazují inhibiční aktivitu -proteinu Nogo. Vynález dále popisuje fúzní proteiny obsahující' jeden nebo více shora popsaných fragmentů fúzovaných se sekvencí, který není sekvencí proteinu Nogo. Deriváty genu Nogo se mohou připravit změnou sekvence genu Nogo substitucemi, adicemi nebo delecemi, které poskytují funkčně ekvivalentní molekuly. Vzhledem k degeneraci nukleotidových kódujících sekvencí jiné sekvence DNA, které kódují v.podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako je gen Nogo, se mohou použít při praktickém použití vynálezu. Tyto sekvence, zahrnují, ale nejsou omezeny na nukleotidové sekvence obsahující.·' celou - nebo části genů Nogo, které se změnily substitucí,, různých kodonů, které kódují funkčně, ekvivalentní .· aminokyselinový zbytek v sekvenci, čímž dochází

39 • ···« ·· ···* ·· • ·· • • « · * · • · • • • · · • · * i • • • • · · • f • ··« • ·· · ·· « · · k’tiché změně. Deriváty Nogo podle vynálezu zahrnuji, ale

V .nejsou omezeny na primární aminokyselinovou sekvenci, 'celou nebo část aminokyselinové sekvence proteinu Nogo, která zahrnuje změněné sekvence, ve které funkčně ekvivalentní’ .aminokyselinové zbytky se substituovaly za zbytky v sekvenci, což vede k tichým změnám. Jeden nebo’ více' aminokyselinových zbytků v sekvenci se může konzervativně subslTiTTUbvaJ: jinou .aminokyselinou s podobnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent, což vede k tiché změně. Substituenty aminokyseliny v sekvenci se mohou', vybrat z jiných členů třídy, do které aminokyselina patří. Monopolární (hydrofóbní) aminokyseliny zahrnují alanin, leucin, izoleucin, ' valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionirí. Polární neutrální ^aminokyseliny zahrnují glycln, serin, treonin, cystein, tyrozin, aspargin a glutamin. Pozitivně nabité';· (bazické) aminokyseliny zahrnují ar.ginin, · l.yzin ayhistidin^JNegativně nabité (kyselé) aminokyseliny zahrnuj í kyselinu’’* áspartovou 'a glutamovou. \ . .· ; .

Ve specifickém·· provedení vynálezu .proteiny’' obsahují fragment . proteinu Nogo, . který zahrnuje alespoň 10 kontinuálních aminokyselin proteinu Nogo. V jiných provedeních vynalezu takové fragmenty nejsou větší než 35, 100 nebo 200 aminokyselin. Deriváty nebo analogy proteinu Nogo zahrnují, ale nejsou omezeny na molekuly obsahující oblasti, které jsou v podstatě' homologní s proteinem Nogo nebo s jeho fragmenty (například v různých provedeních vynálezu se pomocí počítačového programu zjistilo alespoň 60 % nebo 70 % nebo 80 % nebo 90 %. nebo 95 % shody v aminokyselinové sekvenci shodné velikosti nebo když se porovnává s uspořádanou sekvencí, ve které se uspořádání provede počítačovým programem, který je dobře znám v oboru; je to například počítačový program BLAST (popisuje se v publikaci Altschul et al., 1994, Nátuře Genet. 6: 119-129)),· nef$o jejichž kódující nukleová -kyselina je

schopná hybridizovat s kódující sekvencí Nogo za přísných, mírně přísných a mírných podmínek. Dále se popisují molekuly obsahující fragmenty Nogo, které například obsahují uhlovodíkové vazby s jinými částmi, které zahrnují značky nebo bioaktivná části.

Deriváty·· a analogy Nogo podle vynálezu, se mohou produkovat různými metodami,, které j.sou známy v oboru. Manipulace, které vedou k produkci derivátů a nebo analogů Nogo se mohou vyskytovat na .úrovni genu nebo proteinu. Klonovaná sekvence genu. Nogo se může upravit libovolným počtem strategií, které jsou známy v oboru {popisuje se v publikaci Maniatis, T. / 1990·, Molecular Cloning, ,'A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor, New York). Sekvence se může štěpit ve vhodných místech restrikčními endonukleázami a pak 'následují, ' jestliže je to nutné, další úpravy enzymy, izolace a ligace in vitro. Při produkci genu, který kóduje derivát’ nebo “analog"'proteinu Nogo, by se mělo zajistit, aby upravený gen zůstal ve stejném tránslačním čtecím, rámci jako Nogo,' nepřerušily se stop signály - translace v genové oblasti, kde se. kóduje požadovaná aktivita proteinu Nogo.

Navíc sekvence nukleové kyseliny kódující protein Nogo se může mutovat in vitro nebo in vivo, přičemž vzniká a/nebo zaniká translačni, iniciační a/nebo terminační sekvence nebo vznikají variace v kódujících oblastech a/nebo se tvoří nová místa rozeznávaná restrikčními endonukleázami nebo se odstraňuji dříve existující místa, přičemž to umožňuje další modidikace in vitro. Může se použít libovolná metoda mutageneze, která je. známa v oboru, přičemž jsou zahrnuty chemická mutageneze, . in vitro místně řízená mutageneze (popisuje se ;v publikaci Hutchinson, C., et- al., 1978, J. Biol. Chem 253: 6551) , použití linkerů TAB® (Pharmacia) atd. .

Manipulace sekvence Nogo se může také vytvořit na úrovni proteinu. Vynález· popisuje fragmenty proteinu Nogo nebo jeho deriváty nebo analogy, které’ se během nebo .po translaci odlišně upravuji, například . glykosylací, acetylací, . * fosforylací, amidací, derivatizací známými ochrannými nebo blokačními skupinami, proteolytickým štěpením, navázáním na „ molekulu protilátek "nebo jiného buněčného, ligandu aťd. .. . Libovolný počet chemických modifikací se může provést pomocí metod dobře ' známých v oboru, · které", zahrnují specifické chemické štěpení . cyanogenbromidem, trypsinem, chymotripsynem, papainerri, ' protěázou V8, NaBH4, acetylací, formylací, oxidací, redukcí, metabolickou syntézou v přítomnosti tunikamycinu atd.

Navíc analogy a deriváty Nogo se mohou syntetizovat chemicky. Peptid odpovídající· části proteinu Nogo, který obsahuje požadovanou oblast nebo.. 'který zprostředkovává požadovanou aktivitu ín‘ vitro ^se . může syntetizovat .použitím peptidového syntezátoru. Dále, je-li*, -.to nutné, do sekvence * * ' * Nogo se . mohou zavést jako' substituce nebo adice neklasické aminokyseliny nebo 'chemické analogy aminokyselin. Neklasické aminokyseliny zahrnují, ale nejsou limitovány na D-izoméry běžných aminokyselin, α-aminobutyrová kyselina, Abu, 2-aminobutyrová kyselina, γ-Abu, ε-Ahx, β-aminohexanová kyselina, Aib, 2-aminoizobutyrová kyselina, 3-aminopropanová kyselina, ornitin, norleucin, norvalin, hydroxyprolin, sarkosin, citrulin, kyselina cysteová, t-butylglycin, t-butylalanin, fenylglycin, cyklohexylalanin, β-alanin, fluoro-aminokyselina, navržené aminokyseliny, jako je β-metylaminokyseliny, Ga-metylaminokyseliny, Να-metylaminokyseliny a aminokyselinové analogy obecně’. Aminokyselina může být D (pravotočiváj. nebo L (levotočivá) ; - .

•42 • · •42 • · • ··' • · · · ·* · ·

Ve specifickém provedeni < vynálezu, derivát Nogo je chimérový nebo fúzni protein obsahující protein Nogo nebo jeho fragment (upřednostňuje se, aby obsahoval alespoň oblast nebo motiv proteinu Nogo nebo alespoň 10’ aminokyselin proteinu Nogo) spojených svým amino- nebo karboxylovým koncem v * 1 prostřednictvím peptidové -vazby k ” aminokyselinové sekvenci' odlišného proteinu. V jednom ^ provedení vynálezu ťakdvý- chimérový protein vzniká rekombinantní ,expresí nukleové kyseliny -kódující _protein (obsahující sekvenci kódující Nogo spojenou v rámci s kódující sekvencí různého proteinu). Takový chimérový produkt se může připravit vzájemnou ligací vhodných sekvencí- nukleové kyseliny, .která kóduje · požadované aminokyselinové sekvence, metodami, ' které jsou - dobře známy - v oboru, ve vhodném čtecím rámci . a expresí chimérověho produktu metodami, které jsou'., dobře .známy ’-ν’oboru. V jiném případě takový chimérový produkt' se* může připravit metodou * . ' ř e? syntézy proteinu, například použitím peptidového, syntetizéru., ;-f "p- -V-*· - - ^ *· v -v-í- - · - \

Mohou se zkonstruovat chimérové geny obsahující s.části Nogo, fúzbvané s libovolnými 1 heterolognímů .. sekvencemi kódujícími protein. Takové heterologní sekvence kódující protein z.ahrnují například hexahistidinovou značku a značku- T7; Specifické provedení vynálezu se vztahuje na chimérový protein obsahující fragment Nogo, který zahrnuje alespoň šest aminokyselin. . p :» ' V jiném specifickém provedení vynálezu derivát. Nogo je molekula obsahující oblast homologie s proteinem Nogo. V preferovaném provedení vynálezu jsou deriváty Nogo (například fragmenty) proteiny, které se neobjevují přirozeně. V jiném specifickém provedení vynálezu deriváty a analogy se popisují dále v textu v sekci příkladů.-

Deriváty Nogo obsahující·jednu nebo více' oblastí proteinu

Ve specifickém provedeni vynálezu se popisuji .deriváty a analogy * Nogo, zvláště pák fragmenty a deriváty’ Nogo jako jsou fragmenty, které obsahuji nebo v jiném, případě se skládají ζ,-jedné nebo '.více oblastí' proteinu Nogo, které ’zahrnuj í konzervativní hydrofóbní-· oblasti *C-konce nebo “'kyselé oblasti N-konce bohaté na polyprolin nebo j'ejich funkční fragmenty (například vazebné) nebo jejich libovolnou kombinaci. .· Specifické provedení podle vynálezu 'zahrnuje (specifické fragmenty.proteinu Nogo, což jsou ty fragmenty proteinu Nogo, které jsou nejvíce homologní ke specifickým fragmentům krysího nebo bovinního proteinu Nogo. Fragment obsahující oblast » . í homologu Nogo' se může identifikovat metodami- analýzy ^proteinu, jak se popisuje dále v textu. ' V jiném specifickém provedená vynálezu .. se., popisuje molekula, která obsahuje, jeden- nebo více-'oblastí (nebo jejích funkčních částí) proteinu" Nogov"1 ale 'které^t-aké· •'chybí _ jedna nebo více oblastí (nebo j,ejích „funkčních částí)' .proteinu 'Nogo. V jiném provedení vynálezu se popisuj,e\ molekula,. · - která obsahuje jednu nebo více.'Oblastí (nebo . jejích” funkčních částí) proteinu 'Nogo -a .která vykazuje jedenr nebo více mutantních (mutace je například způsobena delecí nebo bodovou mutací) oblastí proteinu Nogo (například tak, že u mutantní oblasti se zesílila funkce).

Testy proteinů Nogo, jejich derivátů a analogů

Funkční aktivita proteinů Nogo, derivátů a analogů se může testovat . různými metodami. Popis , funkčních testů v následujících sekcích neznamená jejich omezení, ale mohou se použít jiné testy, které jsou dobře známy v oboru.

Testy Nogo in vitro inhibice růstu neúritů ’

Ve specifickém provedeni vynálezu se mohou proteiny'Nogo, deriváty a analogy testovat, zda inhibuji rozšířeni buněk NIH 3T3 nebo, nadměrný růst , neuritů PC.12 za .použiti tkáňových kultur in v i t ro. ‘ V alternativním provedení vynálezu.proteiny Nogo, deriváty a analogy se~mohOu^pou-žit—p-ř-i—te-stsy-á-ri-í—k©l.apsu^rů.s±u_koJxusú_ explantovaných ganglií idorzálních* .kořenu u kuřete, což se idnukuje 'přítomností proteinu Nogo.· Podobně uuproteinu Nogo se může testovat inhibice nadměrného růstu explantovaných ganglií-dořzálních kořenů u kuřete (popisuje se v publikaci Spillman et al., 1998 J. Biol. Chem. 273:. 19283-19293).

Testy funkčních vlastností Nogo in vivo V V jednom příkladu vynálezu antagonisté proteinů Nogo, deriváty a analogy, se mohou použít ..pří testech funkce in vivo • ' ř. -v za, použití zvířecího modelu regenerace kOrtikospinální dráhy (CST) na dlouhou vzdálenost a navrácení chování.

f , J V jednom1 - provedení. . vynálezu . . je kortikospinální dráha poškozena chirurgickou resekcí nebo kontuzí míchy a zvířeti se aplikuje antagonista proteinu' Nogo. Neurální plasticita, regenerace a návrat funkce se -porovnává se kontrolními zvířaty, která nebyla ošetřena uvedeným způsobem, nebo sekontrolními zvířaty, která se ošetřila aplikací protilátky. Anatomickými metodami se sleduje strukturální plasticita nebo regenerace a to hlavně značením definovaných neurálních drah. Navrácení funkce se měří testy pohyblivosti a elektrofyziologické dovednosti, které se provádějí na hlodavcích (například test lepivého papíruj test dosažení potravy atd.) (popisuje se v publikaci Thallmair et al., 1998, Nat. Neuroscience 1(,2).: -124-131). * v- '

Inhibice navázání 1’igandu Nogo, a její testováni, , · 45

V jednom provederií vynálezu se testuje schopnost' vázat’ se nebo soutěžit proteinem Nogo divokého typu ' o navázání na protilátku proti’ Nogo. V tomto případě se mohou použít různé imunitní testy, které jsou dobře známy v oboru a zahrnují kompetetivní a nekompetetivní testovací .systémy za použití met od ko je r a di-o-imunete st y-,—E-LTSA, sendvičové imuno t est y, imunoradiometrické testy, gelové difúzní precipitinové reakce, imunodifúzní testy, in^situ imunotesty (za použití koloidního zlata, enzymatických nebo ’ radioizotopových značek) westernový bloty, precipitační · reakce, aglutiriační testy . (například gelové aglutinační testy, hemaglutinačhí testy), testy fixace komplementu, imunofluorescenční testy, testy s proteinem A a imunoelektroforetické testy atd.. V jednom provedení podle .vynálezu se navázání protilátek detekovalo detekcí . značky na primárních; protilátkách. V jiném, provedení vynálezu se primární protilátky, detekovaly détekcí· navázání sekundární protilátky nebo, činidla na primární protilátku. V jednom provedení vynálezu jsou značeny sekundární4protilátky. V oboru je známo řada metod detekce navázání v- imunotestu a tyto metody jsou předmětnou věcí vynálezu. V jiném provedení vynálezu, kde se identifikoval protein vázající Nogo,' se může navázání například testovat například způsobem dobře známým v oboru. V jiném provedení vynálezu' se mohou testovat fyziologické koreláty navázání Nogo na jeho substrát.

Vynález dále popisuje jiné metody, které jsou dobře známy v oboru.

Terapeutické použití

Vynález popisuje léčbu a prevenci různých onemocnění a poruch aplikací terapeutické sloučeniny (terapeutické činidlo). Takové .terapeutická činidla zahrnují, .ale nejsou • ·

«··· ·« · · · · *ft • · · · · · · omezeny na proteiny Nogo a jejich _ analogy a deriváty (zahrnující. fragmenty) (například jak se popisuje shora v textu), jejich protilátky (jak se popisuje shora .v textu), nukleové kyseliny kódující proteiny Nogo, analogy a deriváty (jak se popisuje shora v textu), antisense nukleové kyseliny.

Nogo a agonisty a antagonisty. proteinu Nogo. Poruchy zahrnuj ící deregulovaný bu něč“ný~rusir, například nádory CNS,—s.e_ ošetřují nebo se jim předchází aplikací terapeutických činidel, které podporují funkci Nogo. Poruchy, při kterých je růst , regenerace ’ a udržování neuritů deficitní nebo se požaduje, se léčí aplikací' terapeutického činidla, které antagonizuje (inhibuje) funkci Nogo. Tato skutečnost se popisuje dále v textu. * V obecném případě se preferuje aplikace produktů druhového původu nebo druhové réaktivity (v případě protilátky) stejného f druhu, do kterého patří pacient. V preferovaném provedení vynálezu se tak lidský protein Nogo, derivát nebo analog nebo i * , nukleová kyselina nebo protilátka proti lidskému proteinu Nogo aplikuje pacientovi-. Léčba a prevence poruch zahrnující deregulovaný buněčný růst

Onemocnění a poruchy zahrnující deregulaci buněčného růstu se ošetřily nebo se jim předchází aplikací terapeutických činidel, které podporují (to znamená zvyšují nebo propůjčují) funkci Nogo. Příklady takových terapeutických činidel zahrnují, ale nejsou omezeny na proteiny Nogo, deriváty nebo fragmenty, které jsou' funkčně aktivní, zvláště které jsou aktivní při inhibici extenze neuritů nebo inhibice buněčného růstu (například jak se demonstruje v testech in vítr o nebo ve zvířecích modelech) a. nukleové kyseliny kódující protein Nogo nebo jeho funkčně aktivní derivát nebo fragment (například při použití genové, terapie). Upřednostňuje se, aby proteiny, f* deriváty nebo fragmenty Nogo neobsahovaly· žádný volný CNS-

47 ♦ 47 ♦ • · • · · myelinový. materiál, který je. přirozeně asociován.. Mohou se také použit jiná . .terapeutická*1 činidla. Jsou to například agonisty Nogo, které se ' mohou identifikovat, za použití testů in vitro nebo zvířecích modelů, příklady se popisují dále v textu. f “ Ve"—s pe cl-f-i-ek-ýoh—w-pr-O-veden íoh vynálezu se terapeutická činidla, která.podporuj i funkci Nogo, se aplikuj i' terapeuticky (což zahrnuje .‘také,, profylaxi) : (1) u.i onemocnění a· poruch, která zahrnují absenci nebo snížení., (vztaženo na normální nebo požadované množství)., množství proteinu Nogo nebo zeslabení funkce například u pacientů, kterým chybí protein Nogo.-nebo je geneticky ' defektní nebo · není biologicky, aktivní nebo - .vykazuje nízkou aktivitu- nebo je jeho exprese '.zeslabena, nebo (2) u ".'.onemocnění nebo poruch kde testy . in vitro (nebo in vivo) (popisuje se dále v textu) indikuj i,využití -aplikace agonisty Nogo. nepřítomnost nebo snížení množství”·· proteinu Nogo ' nebo * ' ’* λ"' , *. · :ί *T ·* jeho· funkce je možné snadno· ’ detě kovat,'nápříkíad získáním' vzorku pacientovy \ tkáně (například;· tkáně >z. biopsie) a testováním in vitro množství' RNA nebo ! proteinu, struktury a/nebo aktivity exprimované RNÁ- Nogo* nebo proteinu.· -Tak je v .·,·< » možné použít řady metod, které se- v oboru považují za standardní a které zahrnují, ale neomezují se na kinázové testy, imunotesty vhodné pro detekci a/nebo Λ vizualizaci proteinu Nogo (například westernův blot, imunoprecipitace následovaná elektroforézou na polyakrylamidovém gelu SDS, imunocytochemickým testem atd.) a/nebo hybridizačními testy, které jsou vhodné pro detekci exprese pomocí detekce a/nebo vízualizace mRNA Nogo (například northernovými testy, testy dot blot, hybridizacíin šitu) atd..

Onemocnění’.a poruchy, které zahrnují deregulovaný buněčný růst a které- se “dají léčit nebo se jim dá předcházet, zahrnují,' ale ' nejsou omezeny na proliferativní poruchy, ···♦

48 • ♦ ··

maligní nádory, nádory.,nervového systému atd.. Příklady jsou uvedeny dále v textu.

Neroplastický růst -

Neoplastický růst a příbuzné poruchy', které se mohou léčit . > ' nebo- se j im—může^předeházet—aplikací . terapeutického činidla, , · i ~ ’ které podporuje funkci Nogo,, zahrnují, ale nejsou -omezeny na onemocnění uvedené v tabulce č. 1 (takové poruchy se také popisují v publikaci Fishman et_ al., 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Líppincott Co., Philadelphia) :

Tabulka č: 1: Neoplastický růst a příbuzné poruchy pevné nádory ’ . . - '1 V* -· ··; sarkomy .a karcinomy : . . . . glidm, clicbiastcm . . astrccytorr. jS ·... V“T ,V\ ' · · '*1 “·' " ' : ' ' ‘ ‘ meduloblastom ' * , kraniof aryngiom ' V'., ependymom _ v ý ý" pinealom hemangiomblastom sluchový neurom oligodendrogliom menangiom neuroblastom retinoblastom

Ve specifických provedeních vynálezu malignantní nebo dysproliferativní (jako- jsou metaplázie a dysplázie) nebo hyperproliferativňí poruchy se ošetřují nebo se jim předchází v centrálním nervovém systému, v míše nebo v .libovolné neurální tkáni. “ *. .

• V 49 ···· ·« ···· • f · ·

.Premaligní stavy

Aby se léčily premaligní stavy a.předcházelo se postupu do neoplastického nebo maligního stádia onemocněni ' uvedených v tabulce č. 1, mohou se· také aplikovat terapeutická činidla 1 * podle vynálezu, která podporují, aktivitu proteinu j.Nogo. Takové léčebné nebo profylaktické—použití ....se.... indikuje*, .u___stavů,._u kterých se očekává postup do stádia ňeoplázie nebo karcinomu, zvláště tam, kde růst buněk, který není .neoplastickýf zahrnuje hyperplázii,. metaplázii nebo dysplázii (abnormální stavy růstu se popisují v publikaci Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. -Saunders Co., Philadelphia, pp. 68- ' -f .79). Hypérplázie je . 'forma řízené buněčné . ‘proliferace zahrnující zvýšení počtu buněk v tkáni nebo orgánu, aniž se podstatně změní jeho funkce nebo struktura. Metaplázie je forma řízeného růstu buněk, při němž jeden .typ dospělých nebo t zcela diferenciovaných buněk substituuje jiný .typ dospělých buněk. Metaplázie se může vyskytovat, v epiteliálních nebo pojivových tkáňových buňkách. Netypická .ňeoplázie zahrnuje libovolný mimořádně metaplastický epitel. Dysplázie často předchází stádiu karcinomu a vyskytuje se hlavně v epitelu. Jde . většinou 1 netypickou formu růstu buněk, · který není neoplastický, a zahrnuje ztrátu jednotnosti jednotlivých buněk a architektonickou orientaci buněk. Buňky tvořící dysplázie jsou často abnormálně velké, jádro je tmavě zbarveno a vykazují pleomorfizmus. Výskyt dysplázie je charakteristický pro místa s chronickým drážděním nebo zánětem. V alternativním případě nebo vedle přítomnosti abnormálního růstu buněk, který se charakterizuje jako hyperplázie, metaplázie nebo dysplázie, přítomnost jedné nebo více charakteristik -transformovaného fenotypu nebo maligního fenotypu vyjádřeného in vivo nebo in vitro ve vzorku buněk pacienta může indikovat požadavek profylaktické/terapeutické aplikace terapeutického činidla, které podporuje funkci 50 '· « }· proteinu Nogo. Jak se uvádí shora v textu, takové charakteristiky.' transformovaného ' fenotypu . zahrnují morfologické změny, dochází k odloučení od. 'spodní vrstvy,, ztrátu kontaktní inhibice, ztrátu kotvící závislosti,.uvolnění proteáz, zvýšený transport cukrů, snížení .sérových požadavků, -expresi fetálních antígenů, vymizení buněčnéhopovrchového proteinu o molekulové hmotnosti ’2”5"0 OTTCT (popisuje se dále-v textu ve spojení s charakteristikami ' .souvisejícími-s transformovaným, nebo maligním fenotypem) . . V jiných 'provedeních vynálezu se popisuje léčba pacienta, 'který vykazuje jeden nebo více z následujícich predispozicnich faktorů .. maligních nádorů, aplikací účinného -množství terapeutického činidla: . neurofibromatóza Von Recklinghausěn mebo retinoblastom (popisuje se v publikaci Robbins and 'Angell, 1976, Basic Pathoiógy, 2d Ed., W.B. Saundérs Co., Philadelphia, pp. 112-113) . ·' ' ·-, i‘ V jiném specifickém "provedení vynálezu se ‘ terapeuitcké činidlo podle vynálezu ·aplikuje lidskému pacientovi, aby se předešlo postupu '»zhoubnému, bujeni ledvin, chrupavky - (prsní kosti), kůže, skeletového svalu, plic nebo sleziny, melanomu nebo sarkomu.

Hyperproliferativní a dysproliferativní poruchy V jednom provedení vynálezu se terapeutická činidla, které podporují aktivitu Nogo, používají k léčbě- nebo prevenci hyperproliferativních nebo benigních dysproliferativních poruch. Specifická provedení vynálezu jsou použita při léčbě a prevenci ciřhózy ijater (podmínky, kdy zjizvení předčilo normální regenerační proces), při léčbě keloidních formací (hypertrofní jizvy) . (dochází k deformaci kůže, kdy proces tvorby jizvy interferujes normálním obnovením), lupénky (což jsou běžné stavy kůže- charakterizované 'nadměrnou proliferací 51

·· ·

kůže a oddálení správné buněčné determinace)', benigní nádory, fybrocystické stavy a tkáňová hypertrofie (například prostatická hyperplázie) . .· , - . ?

Genová terapie ^--Ve—specifickém—provedení—nukleové—kyseliny—-obsahující sekvenci kódující protein- Nogo nebo jeho funkční derivát se aplikovaly, aby. se podpořila -funkce 'Nogo cestou,, '.genové terapie. Genová 'terapie se uskutečnila aplikací nukleové kyseliny subjektu. V tomto provedení vynálezu nukleová kyselina produkuje svůj kódovaný ; protein, který zprostředkovává terapeutický účinek při vyvolání funkce Nogo. .Libovolná z metod geňové terapie dostupná v oboru se může .použít podle vynálezu. Příklady· metod, se popisují dále v textu. :

Obecné metody v genové' terapii ' se ...popisují v publikaci Goldspiel et al., ,1993,. Clinical Pharmacy* 12: 488-505, Wu and Wu, 199.1,· Biotherapy 3: 87-9.5, · Tolstošhev, 1993, Ann.. rev.

Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596, Mulligan, 1993, Science 260, 926-932 a Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217, May, 1993, TIBTECH 11(5): 155-215). Používané metody běžně známé v oboru technologie rekombinace DNA se popisují v publikaci Ausubel et al., 1993, Current Protocols in

Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY a Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY. - , V preferovaném provedení vynálezu se popisuje terapeutické činidlo obsahující .nukleovou kyselinu. Nogo, která je součástí expresivního vektoru, -jenž exprimuje protein Nogo nebo jeho . ; i.-» ' * * \ fragment nebo chimérový protein ve vhodném hostiteli. Taková nukleová •kyselina' vykazuje promotor operativně spojený s kódující, oblastí Nogo, přičemž uvedený promotor je ««·· 1« · + · · ·· 52 • · · · · t · • · · * · · • V · · « ·*« · t · · · · · • · · · · · · · indukovatelný nebo konstitutivní*' a může být tkáňově specifický. V'jiném určitém provedeni vynálezu, se používá molekula' núkleové kyseliny, ve.které kóduj ící. sekvence Nogo a ' * > libovolné jiné požadované sekvence jsou lemovány oblastmi, i ' i · které .podporují, homologní rekombinaci v poradovaném místě v genomu, přičemž poskytují intrachromozomální "expresi p _________i _ ,_1_ _ ___ ** '· núkleové. kyseliny ^Nogó (popisujme "se* v publikaci Kóller ^and Smithies, 1989, " Proč. Nati. Acad. Scí. „USA 8 6: 8932-8935,

Zijlstra et al., 1989,'-Nátuře 342: 435-438). · - ·

Zavedení núkleové kyseliny do pacienta se může provést buď přímo, .přičemž.-"se·. pacient přímo vystaví núkleové kyselině nebo vektoru., který ,nese· nukleovou kyselinu nebo nepřímo, kdy buňky se.'nejdříve .transformovaly nukleovou kyselinou in vitro a pak se* transplantovaly do.- pacienta. -Tyto dva přístupy jsou známy jako in vivo nebo ex vivo genová terapeie. *:

Ve specifickém provedení vynálezu se nukl-eová kysleina přímo aplikuje in vivo, kde se exprimuje, aby se produkoval kódovaný produkt . Toho j.e - móžne- dosáhnout libovolným počtem metod známých V Oboru, například konstrukcí, kdy je součástí expresívního vektoru vhodné;núkleové kyseliny a její aplikací, která se provede tak, aby se stala vnitrobuněčnou, například infekcí za ' použití de.fektivního nebo atenuovaného retrovirového nebo jiného virového vektoru (popisuje se například v dokumentu US' patent č. 4,980,286) nebo přímým zavedením injekcí samotnou DNA nebo použitím bombardováním partikulemi (například genové dělo, Biolistic Dupont) nebo potažení lipidy nebo buněčnými povrchovými receptory nebo transfekčními činidly, kapsualizací v lipozómech , mikročásticemi nebo mikřokapsulemi nebo aplikací ve spojení s peptidem, který- je .znám tím, že vstupuje do jádra, ve spojení ·'·. ’ s ligandem, - čímž se vystavuje / endocytóze zprostředkované ' receptórem (popisuje se například "v. publikaci Wu and Wu, 1987, J. ‘Bio!..' Chem. 262:, 4429-4432) ikteřa· se.může

53 ♦ ··*· '·· ··%· Φ· · ·♦· · « t · · ť ·· • * . * ··..· ·· ·

♦ ~· · t ·· ·.· · I •· · · · · · · · «·· · ·· · ·· ♦♦· použít v případě cílových buněčných typů, které, specificky exprimují receptory) atd..· V jiném provedení vynalezu se tvoří '' i , komplex nukleová kyselina-ligand, kde ligand obsahuje fúzogenní virový ‘ peptid . za účelem porušení endozómů, což umožňuje nukleové kyselině zabránit' lysozomálnímu rozpadu. V jiném provedení vynálezu nukleová kyselina se :může . cílit -in vivo za ůcělem- spec ifického buněčného pohlceni a exprese cílením specifického receptoru (popisuje se v PCT dokumentu WO 92/06180 s datem 16. 'dubna 1992 (Wu et al.), -WO '92/22635 ,s datem 23. prosince.1992 (Wilson et al.,), WO92/20316 s datem 26. listopadu 1992 (Findeis et al..,), W093/14188 s datem -22. červenec 1993r; (Clarke et al.,) WO 93/20221 s datem 14. října 1993) (Young)) . V jiném případě nukleová kyselina se může zavést do buňky a začlenit se hostitelské buňky vhodné pro jeíji expresi . homologní· rekombinací (popisuje se v publikaci Koller and Smithies, 1989,. .Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 86: 8932-8935, Zijlstra et al.,. Ί989, /Nátuře' 342 : 435-438).

Ve specifickém . provedeni, * se .. používá * virový vektor, který obsahuje nuklěovou kyselinu Xogc. Může .?se například použít retrovirový vektor, (popisuje se ' v· publikaci Miller et al., 1993-, Meth. Enzymol. 217: 581-599),. Tyto retrovirové vektory se mohou modifikovat, aby se deletovaly retrovirové sekvence, které nejsou nezbytné pro zabalení virového' genomu a začlenění DNA do hostitelské buňky. Nukleová kyselina Nogo, která se může použít při genové terapii, se klonuje do vektoru, který umožňuje začlenění .genu do pacienta. Více detailů o retrovirových vektorech je možné nalést v publikaci Bosen et al., 1994, . Biotherapy 6: 291-302, kdé se popisuje použtrovirového vektoru pro zavedení genu mdrl do hematopoietických' kmenových buněk, aby;se kmenové buňky staly více rezistentní vůči- chemoterapii. Retrovirové vektory , * ' 'V. použitelné v genové ‘terapii se dále popisují v publikaci Clowes et al.,. 1994, J. Clin. Invest. ,93:11.644-651, Kiem. et al., 1994, Blood* 83: '1467-1473, Salmons^ ánd Gunzberg,. 1993,

54

♦ ·

Human Gene Therapy 4: .129-141 a Gros smán 'and Wilson, Ί993,

Curr. Opin.,' Genetics and Devel. 3: 110-114.

Adenoviry jsou další' virové vektory., které se moHou použít při genové terapii·. Adenoviry .jsou - zvláště. . .atraktivní při· i zavedení . genů 'do' centrálního nervového systému. Adenoviry p-ři-re-z-eně—in-ři-k-ug-í—respiračr.í epitel,_Jcde_cz.půso_bujJL__lehké onémocnění. Jiným cílem, pro zaváděcí* systémy založené na adenóvirech . jsou játra, respirační épiťel, ‘ --endoteliálni buňky a ..svaly. Adenoviry ..jsou výhodné tím,, že dokáží infikovat buňky, které -se nedělí. V publikaci Kozarsky and Wilson 1993, Currént Opinion in .Genetics and Developmen 3: 499-503 poskytuje 'přehled genové 'terapie založené na adenovirech. V publikaci· Bouť et· al . , 1994, Human Gen Therapy 5: 3-10 ukazuje použití adenovirových vektorů pro transfer genů do t řespiračního epitelu opice rhesus. Jiné příklady použití adenoviru při genové terapií se popisují v publikacích Rosenfeld et . al · / · 1991, Science 252: 431-434, Rosenfe.ld et al., 1992, Cell 68: '143-155 and Mastrangeli et al., 19.93, J. Clin. Invest. 91: 225-234.

Vedle adenovirů adenbasocíováný virus (AAV) je také možné použít při genové/terapii (Walsh et al., 1993, Proč. Soc. Exp. Biol·. Med.· 204: 289-300).

Další přístup genové terapie zahrnuje transfer genu do buněk v tkáňové kultuře metodami, jako jsou elektroporace, lipofekce, transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým nebo virovou infekcí.. Způsob transferu zahrnuje v obvyklém případě transfer selektovatelného markéru do buněk. Buňky se pak umístí do selekčního prostředí, aby sé daly izolovat ty buňky, které pohltily DNA, a exprimují transferovaný gen. Takové buňky sej pak .zavedou do pacienta. ,! - '·'*'. 1 . > V tomto· provedení vynálezu se nukleová · kyselina zavede .do ·-·.-.· ·'» · buňky ..dřivě'' než se \aplikuje in vivo výsledná rekombinantní 55 55 • ··*· ·» ···· » t · » 9 · > 9 · » 9 9 ·♦ · buňka. Takové zavedeni se může provést libovolnou metodou známou v oboru, které, zahrnuji, ale nejsou omezeny na· transfekci, elektroporaci, mikroinjekci, infekci , s virovým nebo bakteriofágovým vektorem, který obsahuje sekvence nukleové kyseliny, buněčnou ' fúzi, transfer genů zprostředkovaný . chromozómem, transfer genů zprostředkovaný mikrobuňkou, sféroplastovou fúzi-'aťcT.7 Výboru'"-je zrraffio řada metod, které jsou vhodné pro zavedeni cizorodých.‘genů do buněk (popisuje se například v publikaci Loeffler and Behr, 1993,

Meth. Enzymol. 217: 599-618, Cohen et al., 1993, Meth.

Enzymol. 211: 618-644, Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69-92) a mohou se použít v souladu , s přítomným vynálezem, což ukazuje, že nezbytné vývojové a fyziologické 'funkce recípíentní buňky nejsou poškozeny. Metoda by měla poskytnou stabilní transfer nukleové kyseliny do buňky tak, že nukleová x, - . - kyselina se exprimuje buňkou a přednostně se ědí a exprimuje. na její potomstvo. * Výsledné , rekombinantní buňky se se mohou · zavést do pacienta různými metodami - známými -v oboru. V preferovaném provedení vynálezu še epiteliální buňky se zavedly podkožní injekcí. V jiném provedení vynálezu se mohou pacientovi aplikovat rekombinantní kožní buňky jako kožní štěpy. Rekombinantní krevní buňky (například hematopoietické kmenové nebo progenitorové buňky) se přednostně aplikují intravenózně. Množství buněk určených pro použití závisí na požadovaném účinku, stádiu onemocnění pacienza atd. a odborník je může snadno stanovit. ·

Buňky, do kterých je možné zavést nukleovou kyselinu pro účely genové terapie zdůrazňují libovolný požadovaný dostupný buněčný typ a zahrnují, ale nejsou, omezeny na epiteliální ϊ i buňky, endoteliální buňky,- keratinocyty,· fibroblasty, svalové buňky, hepatocyty, krevní buňky, jako jsou T lymfocyty,. B lymfocyty, monocyty, makrofágy, . neutrofily, eosinifilý, *56 • ···· ·· ,%··* ·» * •·· · , ·' · · ,·-·# »· • · · * · · · 9 • · * · · ··· *·· · ·· t ·· ··· megakaryocyty, granulocyty, "různé kmenové ,nebo progenitorové. ; . ' buňky, zvláště hematopoietické’ kmenove nebo progenitorové * r . - « buňky například získané -z kostní dřeně, z púpečníkové krve, periferní krve, fetálnícK jater atd. . . · ,·; f V preferovaném provedení buňka užívaná při genové terapii je pro pacienta autologní.—— —--——^___________ V provedení vynálezů, ve kterém sé .rekombinantní buňky ’ používají v genové terapii se nukleová kyselina Nogo zavede do buněk tak, že jí buňky nebo jejich potomstvo exprimuje ‘ a rekombianntí buňky sě pak aplikují in vivo pro terapeutický účinek. Ve specifickém '''provedení vynálezu se mohou použít kmenové nebo progenitorové-.buňky. Libovolné kmenové a/nebo progenitorové buňky, které, se mohou izolovat a udržovat in vitro se mohou potencionálně použít v souladu s tímto provedením vynálezu..Takové'kmenové buňky zahrnují, ale nejsou omezeny na neurální kmenové buňky (Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 97 3-98 5) . * * r .Ve specifickém provedení vynálezu nukleová kyselina, která se zavedla* pro .účely, genové terapie obsahuje indukovatelný promotor operativně spojený s kódující oblastí tak, že exprese nukleové kyseliny je řiditelná tak, že se řídí přítomnost nebo absence vhodného induktoru transkripce.

Další metody se mohou upravit při použití pro zavedení nukleové kyseliny kódující protein Nogo nebo funkční derivát. Léčba a prevence poruch, při kterých protein Nogo blokuje regeneraci. ' .

Onemocnění a .poruchy, při kterých je nutné zvětšení neuritů, jejichž růst a. regenerace, se ošetřují aplikací terapeutického, činidla, který antagcnizuje (inhibuje) funkci proteinu Nogo.· Onemocnění, poruchy .nebo poškození, které vedou·

i *> k poškozeni nervového systému zahnrují^ ale nejsou omezeny na trauma·centrálního nervového systému (CNS) (například poranění , · . ·> ·· . i míchy nebo mozku),- infarkt, infekce, maligní, nádory, vystavení toxickým . činidlům a degenerativní nervové onemocnění (zahrnující Alzheimerovu nemoc, · Parkinsonovu ..nemoc;. Huiitingtonovu Choreu, 'roztroušenou sklerózu, * amyotrofní ' i . * laterál nH sklerózu a progresivní supra-jadernou paraftýzujv-aplikací. sloučenin, které interferují s aktivitou Nogo, (například dominantní negativní derivát..':Nogo, protilátky.'proti proteinu Nogo, Anti-sense nukleové kyseliny, které kódují-protein Nogo, ribozymy nebo chemické skupiny, které se vážou na aktivní místa proteinu Nogo). r s. '

Terapeutická činidla, která' se mohou použít,, zahrnují, ale neg-sou omezeny na antisense nukleovou. kyselinu Nogo, .která je dysfunkční, (-což je například způsobeno heterologní inzercí » . · (sekvence, která není sekvencí Nogo) ’ do sekvence kódující Nogo), které se používají· k vyjmutí endogenní funkce Nogo homologní rekombinací (popisuje se například v publikaci Capecchi·, 1989, Science 24’4.: 1288^1.292). Protilátky proti proteinu- Nogo (jejich fragmenty a ďeřivátyobsahující jejich vazebnou oblast) se mohou použít jako antagonisti proteinu Nogo. Ve specifickém provedení vynálezu nukleová kyselina obsahující část genu Nogo, ve kterém sekvence Nogo lemují (na 5' i 3'konci) odlišnou genovou sekvenci se používá jako antagonist Nogo, aby podpořil deaktivaci genu Nogo homologní rekombinací (popisuje se také v publikaci Koller and Smithies, 1989, Proč. Nati. Acad.' Sci. USA 86: 8932-8935, Zijlstra et al., 1989, Nátuře 342: 435-438). Jiná .terapeutická činidla, která inhibují funkci^ Nogo se mohou identifikovat použitím známých vhodných testů. in vitro například založených na jejich schopnosti inhibovat navázání .proteinu ;Nogo na jiný protein nebo inhibqyat libovolnou známou . funkci .Nogo, jak se přednostně .testuje .in vitro nebo* v buněčné kultuře ačkoli se mohou také použít genetické testy. Upřednostňuje se vhodné, in vitro nebo in vivo testy se využívají ke stanovení účinku specifického terapeutického činidla a ačkoli jeho aplikace je indikována pro léčbu postižené tkáně/ .,·

Ve specifickém provedení vynálezu. terapeutická činidla, která inhibugí funkciNogo, se aplikují terapeuticky (zahrnují -p-ro-fy-l-a^k-G-iú-:^(-l-)—p-ř-i^-o.nemo-cn-ění^nebo_pdr-U.chá.c.h-,^_které zahrnuj i zvýšené, množství' * (vztaženo k normálnímu/'nebo 'požadovanému) proteinu Nogo nebo funkci, například u. pacientů, kde protein 4 . * ·’* ·

Nogo je nadměrně reaktivní, nebo se nadměrně exprimuje nebo (2) při onemocnění. . nebo poruchách, kde in vitro testy, (nebo in vivo) -(popisuje se shora v textu) indikují, že využitelnost aplikace antagonisty . Nogo. Snadno detekovatelné je zvýšené množství proteinu Nogo nebo funkce, například kvantifikací proteinu 'a/nebo RNA - získáním vzorku· pacientovi tkáně (například' z biopsie-t tkáně) ’ a jejím testováním in vitro za účelem zjištění množství RNA nebo proteinu,.: struktury a/nebo aktivity exprimované. RNA Nogo nebo proteinu. Může se použít řada metod, které se považují v oboru za - standardní. Jsou to například kinázdvé testy, imunologické testy za účelem detekce a/nebo vizualizace proteinu Nogo (například westernův přenos, imunoprecipitace, po níž následuje elektroforéza na SDS polyakrylamidovém gelu, imunocytochemie, atd..) a/nebo hybridizační testy za účelem detekce exprese Nogo detekcí a/nebo vizualizací mRNA Nogo (napřikla northernovy testy, dot bloty, hybridizace in sítu atd.). „Antisense" regulace exprese genu Nogo

Ve specifickém provedení vynálezu se funkce Nogo inhibuje použitím „antisense".. núkleové kyseliny Nogo. Vynález poskytuje terapeutické nebo' prdfylaktické použití nukleových kyselin, * ' * , které obsahuje alespoň -šest nukleotidů, ktere vystupuji jako pozitivní vůči genu· nebo cDNA kódující Nogo nebo jeho . část. Kódující nukleová kyselina Nogo je r.uklecvá ..kyselina schopná 59 % ·♦·· • · * · ** ···* » · · • · ,# • · • · ·· • · ♦ ♦ ' Φ • · · ·♦ · • · ·· ·· hybridizovat ' s části RNA Nogo (upřednostňuje se mRNA)- na základě sekvenční' komplementarity. „Antisense" nukleové kyselina může . být komplementární s kódující a/nebo nekódující oblastí mRNA Nogo. Takové^ „antisense" nukleové kyseliny se mohou použít jako- terapeutická činidla, která inhibuji funkci Nogo a mohou se použít" při léčbě nebo prevenci" poruch popsaných shora v textu;. „Antisense" . nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být oligonukleotidy, které jsou jeclnořetězcové nebo dvouřetězcové, RNA nebo DNA nebo jejich modifikace nebo deriváty, které se mohou přímo apli-kovat do buňky nebo které se mohou produkovat vnitrobuněčně transkripcí exogenních zavedených sekvencí.

Ve specifickém pro.védení vynálezu se „antisense" nukleové kyseliny Nogo mohou použit-, k podpoře regenerace neuronů centrálního, nervového systému zvláště zahrnující regeneraci kortikospinální dráhy, plasticitu--během získávání, opětný růst neuronů... a hojení poškození spojeného ,>s·. traumatickým poraněním, \ s . mrtvice- a neurodegenerativní j onemocnění .

Vynález dále popisuje farmáceutické prostředky obsahující účinné' množství antisense nukleové kyseliny Nogo podle vynálezu na farmaceuticky přijatelném nosiči jak se popisuje dále v textu. V jiném provedení vynálezu se popisují metody inhibující expresi sekvence nukleové kyseliny Nogo v prokaryontní nebo eukaryontní buňce obsahující buňku s. účinným množstvím prostředku, který obsahuje „antisense" nukleovou kyselinu Nogo podle vynálezu, „Antisense" nukleové. kyseliny Nogo a jejich použití se * popisují dále v textu. . ··',''· Λ.' ' - 1 ' „Antisense" nukleové kyseliny Nogo ’ ' ‘ ' '· - ř

> ·% 60 ··.' t · , • t , „Antisense" nukleové kyseliny Nogo obsahují alespoň šest nukleotidů a jsou to přednostně oligonukleotidy (v rozsahu 6 až přibližně ’ 50 oligonukleotidů)'. Ve specifických 'případech oligonukleotid obsahuje’ alespoň 10 nukleotidů, alespoň 15 nukleotidů, . , alespoň 100 · nukleotidů . nebo alespoň 200 · * , V·. ' , .. nukleotidů___01 i aonukleoti dv mohou být DNA .nebo RNA. nebo chimérové směsi nebo deriváty nebo ijejich modifikované verze,. ,V ' 4 r jednořetězcové.^ neboý:dvouřetězcoyé. Oligonukleotid .se může modifikovat. v. části báze, v části cukru,nebo fosfátové kostry'. Oligonukleotid může zahrnovat další připojené skupiny, jako jsou peptidy nebo činidla . umožňující transport skrz buněčnou v v. t ·*

membránu, (popisuje se' například v publikaci Letsinger et al., 1989, Proč. Natl.‘Acád. Sci.U.S.A. 86: 6553-6556, Lemaitre et :al.·, , 1987,_ Proč. 'Nati. Acad. Sci. 84: .648-652, dokument PCT v'vO88'/0 981C publikovaný. Í5. prosince 1.988). nebo bariéra krev- ** 5 mozek' (popisuje :se například v dokumentu PCT č. WO89/10134 publikovaný -25. dubna 1988), štěpící' činidla podněcovaná hybridizací (popisuje se ' například v publikaci Krol et al., ‘1988, BioTechniques '" 6.: 958-976) 'nebo .interkalační činidla (popisují se v publikaci Zon, 1988, Pharrn. Res. 5: 539-549).

Vynález dále1 popisuje „antisense" oligonukleotid Nogo, přičemž se upřednostňuje jednořetězcová DNA. Dále se uvádí, že takový nukleotid obsahuje „antisense" sekvenci vzhledem k sekvenci blízko jedné ze dvou .promotorových sekvencí genu Nogo nebo sekvenci kódující C-terminální část genu Nogo. Může být nutné, aby se selektivně inhibovala exprese jedné z izoformy- Nogou Oligonukleotid se může upravit v libovolné poloze na své struktuře pomocí substituentů,1 které jsou obecně známy v oboru. . „Antisense", oligonukleotid může obsahovat alespoň jednu část modifikované- baže,' která se vybrala ze;jškupiňy zahrnující například ' 5-fluořouracil, 5-bromoúřacil, b-chlorOuracil·, »5-

·· ·«·· 61 ··« • · ·· * jodouracil, hypoxantin, xantin, 4-acetylcytozin, 5-(karboxy hydroxylmetyí) uráčil, 5-karboxymetylaminometyl-2-thiouridin, t 5-karboxymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D- galaktosylkveozin, Inozin, N6-izopentenyladenin, .. 1- metylguanin, 1-metylihozin, 2,2-dimetylguanin, 2-metyladenin, 2-metyladenin, 2-metylguanin, 3-rmetylcytozin, 5-metylcytozin, ’ ' : ' 5- N6-adenin, •7 -met y lguanin, 5-metylaminometyluraclT, metoxyaminometyl-2-thiouracil, · beta-D-manosylkveozin, 5'-metoxykarboxymetyluracil, 5-metoxyuracil, · 2-metylthio-N6-izopentenyladenin, . kyselina uracil-5-oxyoctová(v), wybutoxozin, pseudouracil, kveozin, 2-thiocytozin, 5-metyl-2-thiouracil/ 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-metyluracil, metylester kyseliny urácil-5-oxyoctoyé, kyselina uracil-5-oxyoctová(v), . 5-metyl-2-thiouracil, . 3-(3-amino-3-A-2- karboxypropyl)uráčil, (acp3)w a 2,6-diaminopurin. V jiném provedeni vynálezu oligonukleotid·.obsahuje alespoň * . · · jednu upravenou . cukernou‘část vybranou'.ze skupiny zahrnující-například íárabinózu, 2-fluoroarabinózu, xylulózu a hexózu.. V jednom' provedení podle vynálezu oligonukleotid obsahuje alespoň jednu upravenou fosfátovou kostru vybranou ze skupiny obsahující fosforothioát, fosforodithioát, fosforamidothioát, fosforamidát, fosfordiamidát, metylfosfonát, alkylfosfo-triester a formacetyl nebo jeho 'analog. V dalším provedení vynálezu oligonukleotid je a-anomérní oligonukleotid. α-anomérní oligonukleotid tvoří specifické dvouřetšzcové hybridy s komplementární RNA, ve které na rozdíl od obvyklých β-jendotek, se řetězce vyskytují paralelně jeden k druhému (popisuje se- v publikaci Gautier et al., 1987, Nucl. Acids, Res. 15: 6625-6641).

Oligonukleotid. může konjugovat s jinou molekulou.například s peptidem, hybridizací. podněcovaným síťovácím . činidlem, 62 • *··· ’ #· ···· ·· ·. 4 - 4 • • • 4 *. • - 4 • • • · $ • *· 4 4* • 4 · • · . transportním .činidlem, hybridizací podněcovaným štěpícím činidlem atd. . « '' " . . « - * *. •Oligonukleotidy podle- vynálezu se- mohou syntetizovat standardními metodami, které jsou dobře známy v oboru, například použitím automatického syntetizéru DNA (který je napříkT~a“d--běžně— dostupný-----u--f.ixmy Biosearch, _App 1 ied

Biosystems, atd..)· Fosforothioátové oligonukleotidy se mohou syntetizovat způsobem popsaným v publikaci Stein et al., 1988,'

Nucl. Acids Res. 16: 3209), metylfosf onátoyé. oligonukleotidy κ ' - se mohou připravit za použití, pórového skleněného polymérového . · : ♦ "* + podkladu (popisuje se v publikaci Sarin et a-1. , 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A.' 85: 7448-7451) atd..

Ve specifickém provedeni vynálezu antisense oligonukleotid Nogo obsahuje katalytickou RNA nebo ribozym (popisuje se například v P'CT mezinárodní přihlášce WO 90/11364 publikované 4,. října 1990., Sarvel et al., 199-0," Science 247: 1222-1225). ’Ψ f V. jiném .provedení vynálezu oligonukleotid je 2'-0- metylribonukleptid (popisuje se v publikaci Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) nebo chimérový analog RNÁ-DNA (popisuje se v publikaci Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330). V jiném provedení vynálezu „antisense" nukleová kyselina Nogo podle vynálezu se produkuje vnitrobuněčně transkripcí z exogenní sekvence. Vektor je možné například zavést in vivo tak, že je pohlcen buňkou, ve které je vektor nebo jeho část přepsána za vzniku antimediátorové nukleové kyseliny (RNA) podle vynálezu. Takový vektor bude obsahovat sekvenci kódující „antisense" nukleovou kyselinu Nogo. Uvedený vektor může zůstat epizomální nebo - se. může začlenit do chromozomu. Pokud se vektor přepisuje vzniká požadovaná "antímediátorová RNA. Takové vektory" se mohou konstruovat technologií rekombinace DNA, která se v oboru považuje za standardní. .Vektory mohou • #··· • #···

62 • · · být plazmidy, viry nebo jiné dobře známé v.oboru, které se používají při replikaci a expresi v savčích buňkách.

Exprese sekvence kódující antimediátorovou RNA Nogo se může řídit pomocí libovolného promotoru známého v oboru,, který působí v. savčích, 'upřednostňuje se v lidských., buňkách. Takové promotory mohou—být · indukovatelné , nebe kcns.titutivní . Uvedené promotory zahrnují, ale nejsou omezeny na oblast časného promotoru SV40 (popsiuje se v publikaci Bernoist and Chambon, 1981, Natu.re 290: 304-310), promotor obsahoval na 3' konci dlouhou opakovanou repetici viru Rousova sarkomu (popisuje se v publikaci Yamamoto et al.,' 1980, Cell 22: 787-797), promotor thymidinové kinázy víru herpes (popisuje se .v publikaci. Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), «regulační sekvence metallothioneinového genu (popisuje se v ppblikaci Brinster et al., 1982, Nátuře 296:- 39-42) atd. . „Antisense" nukleové kyseliny podle : vynálezu, ' .obsahují sekvenci komplementární s alespoň jednou částí transkriptu RNA genu Nogo, upřednostňuje' se lidský gen LNogo. Avšak absolutní komplemehtarita, ačkoli se preferuje, není nutná. Termín sekvence „komplementární s alespoň částí RNA" znamená sekvenci vykazující dostatečnou komplementaritu, aby byla schopná hybridizovat s RNA, která tvoří stabilní duplex. V případě dvouřetězcových „antisense" nukleových kyselin Nogo se může tak testovat jediný řetězec duplexní DNA nebo se může testovat triplexová formace. Schopnost hybridizovat bude záviset na stupni komplementarity a délce „antisense" nukleové kyseliny. V obecném případě delší hybridizujíčí nukleové kyselina tvořící více chybných párů s RNA Nogo může obsahovat a stále tvořit stabilní duplex (nebo triplex podle danného případu). Odborník může stanovit tolerovatelný stupeň nesprávných ‘ párů použitím standardních postupů za ' účelem . stanovení *bodu denaturece hybridizovaného komplexu.· - ··· · . ·· · ·· ···

Terapeutické použiti .„antisense" nukleových kyselin Nogo

Antisense nukleóvé kyseliny Nogo se mohou použit k.léčbě « * ' * " (nebo prevenci) poruch typu buněk, které .exprimují. _ nebo · i V * přednostně- nadměrně exprimují, gen Nogo. Ve specifickém provedeni, vynálezu* taková porucha je růstová proliferativnl porucha . 1 V preferovaném- —provedení--vynálezu .......se., . použíyá jednořetězcový DNA „antisense" oligonukleotid Nogo.'’ '· * . · ř

Buněčné typy, které exprimují nebo nadměrně exprimují RNA Nogo, se mohou, identifikovat různými metodami,' které jsou dobře známy v oboru. Takové metody zahrnují, ale nejsou omezeny' na hýbridizaci s nukleovou kyselinou, která jé specifická pro ,.gen Nogo (například northeřnova hybridizace, . ,,„dot . blot" hybridizace, hybridizace in. si tu), pozorování 'schopnosti RNA pocházející z buněčného., typu být přeložena in vitro na Λprotein Nogo, imunotésťý atd. . V preferovaném provedení , vynálezu se popisuje, “že ·* u primární tkáně pocházející z:'pacienta "se může testovat,-.zda dochází před léčbou k expresi, například za použití* imunocytochemických metod r.ebc' hybrid;žací in šitu. "

Farmaceutické prostředky podle vynálezu' obsahující účinné množství „antisense"' nukleóvé kyseliny Nogo ve farmaceuticky přijatelném nosiči se mohou aplikovat pacientovi, který trpí onemocněním nebo poruchou, což je typ, kde dochází k expresi nebo k nadměrné expresi RNA Nogo nebo proteinu.

Množství „antisense" nukleóvé kyseliny Nogo, která bude účinná při léčbě určité poruchy nebo stavu, "bude záviset na podstatě poruchy nebo podmínek a může- se stanovit standardní klinickou poruchou. .Kde je to možné, je nutné ' stanovit \ ‘ ' „antisense"' toxicitu, typu nádoru, který se,.bude .léčit, in vitro a pak'"v použitelných zvířecích modelových systémech dříve než se otestují a použiji na lidech1. ·

Ve specifickém provedeni vynálezu farmaceutické prostředky obsahující „antisense" nukleové kysleiny Nogo se aplikují prostřednictvím lipozómů, mikročástic nebo mikrokapsulí. V různých provedeních . vynálezu se mohou použít takové prostředky, . aby se dosáhlo nepřerušovaného uvolnění „antisense" nukleových kyselin Nogo. Ve specifickém provedení vynálezu může být nutné využít li pozornými 1 élTé^prbsíiřěcirrictv ím~ protilátek na specifické identifikovatelné nádorové antigeny (popisuje se v publikaci Leonetti et ,· al., 1990, Proč. Nati.

Acad.· Sci. .'U. S. A. 87: 2448-2451, Renneisen' et al., 1990, J.

Biol.-Chem. 265: 16337-16342).

Demonstrace terapeutického a profylaktického použiti ' U terapeutických činidel se přednostně testuje požadovaná terapeutická nebo . profylaktická aktivita před . použitím v případě člověka in vitro a pak in vivo.· Testy, in vitro, které se mohou použít při stanovení, zda se indikovala aplikace specifického terapeutického prostředku, . zahrnuje 4 testy in vitro buněčné kultivace,' kde rostou v kultuře tkáňové vzorky pacienta, a vystavují se působení terapeutického činidla nebo terapeutické činidlo se aplikuje jiným způsobem. Pozoruje se účinek uvedeného terapeutického činidla na vzorek tkáně. Terapeutické činidlo, které je inhibitor funkce Nogo, se může například testovat měřením opětného růstu neuritů nebo funkční návrácení motoriky u pacienta. V různých specifických provedeních vynálezu se mohou provádět testy in vitro s reprezentativními buňkami buněčných typů, které jsou zahrnuty v pacientově poruše, aby se stanovilo, zda terapeutické činidlo vykazuje požadovaný účinek na takové buněčné typy.

Sloučeniny vhodné pro použití při terapii se mohou testovat ve vhodných zvířecích modelových systémech dříve, než • » • »

• · βδ l » · · · · se testuji na lidech. Tyto zvířecí modely zahrnují krysy, myši, kuřata, krávy, , opice, králíky atd.. Při testování in vívo, dříve než se aplikují člověku, se„může použít libovolný zvířecí modelový systém. ‘ * t *

Terapeutická/profylaktická aplikace a prostředky '* · ý

Vynález popisuje’ způsoby ' léčby (a profylaxe) - aplikací' subjektu účinhého množství . terapeutického činidla‘ podle vynálezu. , V preferovaném provedení ' vynálezu · ‘se používají' v podstatě čistá terapeutická činidla. Subjektem je přednostně zvíře, -které zahrnuje například krávy, prasata, koně, kuřata, kočky.,, psi ,atd. a přednostně jsou to savci a· nejvíce se preferuje člověk. Ve .specifických; provedeních vynálezu subjektem je savec, nikoli však člověk.· Přípravky a metody aplikace, ' které se mohou použít, když terapeutické činidlo obsahu-je^nukleovou kyselinu, se popisují shora v textu. v i, - ♦ ' · -. (· - '

Jsou známy různé zaváděcí systémyía mohou se použít při aplikaci terapeutického činidla podle vynálezu. Je . to například · kapsualizace ‘v lipozómech, mikročástice, mikrokapsule, rékombiantní ' buňky schopné exprimovat terapeutické činidlo,, endocytóza zprostředkovaná receptorem (popisuje se v publikaci Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), konstrukce terapeutické nukleové kyseliny, jako část retrovirového nebo jiného vektoru atd.. Metody zavedení zahrnují, ale nejsou omezeny „ na intradermální, intramuskulární, .intraperitoneální, intravenózní, podkožní, intranasální, epidurální. nebo orální., Sločeniny se mohou aplikovat libovolným vhodným způsobem,‘například infuzí nebo jednorázovou ^ injekcí, ' absorbcí epiťelem' nebo sliznicí (například orální sliznicí, rektální a střevní sliznicí) a může se aplikovat spolu .s jinými biologicky aktivními-, činidly..

Aplikace může být systémová,nebo lokální. Navíc může být nutné zavést farmaceutické, kompozice podle vynálezu do centrálního nervového systému libovolnou vhodnou cestou, která zahrnuje intraventrikulární a intratekální injekci ..· Intraventrikulární injekce se může provést intravertikulárním katetrem například napojeným na rezervoár, jako" je rezervoár podle Ommaya.

Pulmorální aplikace se může použít například při použití inhalátoru a nebulizátoru a přípravků .s činidlem tvořící aerosol. - ''

Ve -specifické provedení vynálezu je možné aplikovat farmaceutické kompozice podle vynálezu lokálně v oblasti potřeby . léčby. Toho je' možné dosáhnout .například lokální a nfúzí během chirurgického. zákroku, povrchové aplikace například ve" spojení s obvazováním; ’ran po chirurgickém zákroku, injekcíkatetrem nebo způsoby . implantátu, přičemž uvedený implantát je porézní, ňepor.ézní.. ',1 nebo želatinový "· i materiál, který zahrnuje membrány,-·' jako·. jsou silastické membrány nebo vlákna. V jednom provedení -vynálezu se aplikace můžé provést přímo injekcí do místa' (nebo do předešlého místa) maligního nádoru nebo neoplastové nebo pre-neoplastové tkáně. V jiném provedení vynálezu terapeutické činidlo se může zavést do vezikuly, zvláště do lipozómu (popisuje v publikaci Langer, Science 249: 1527-1533 (1990), Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989), Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327). V jiném provedení vynálezu terapeutické činidlo se může zavést do systému -s. řízeným uvolňováním. V jednom provedení vynálezu se může. pro aplikaci použít pumpa, (popisuje se v publikaci Langer, Science 249: 1527-1533 (1990:), Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. „ Eng, 14: 201 (1987), Buchwald et al..;

Surgery^88: 507 (1980),. Saudek et al., N. Engi.„ů· Me.d^ 321:

63 :

574 (1989)). V jiném provedeni vynálezu se mohou použit polymérové materiály ' (popisuje^ se v publikaci Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Přes., Boča. Raton, Florida (1974), - Controlled Drug

Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Balí (eds.), Wiley, New York (1984), Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Re v. 'Macromol. "Chem.' 2ΤΓ "61 "(3:98317 -Levý—et al., Science 228: 190 (1985), During et al.,- Ann. Neurol. 25: 351 (1989), Howard et al., *J. Neurosurg. .71: .105 (1989)). V jiném provedeni vynálezu řizený uvolňovací systém se může umístit do blízkosti terapeutického cíle, to znamená mozku, což vyžaduje použití' pouze- části systémové dávky (popisuje se v publikaci ' Goodson., Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp,. 115-138 (1984)).

Jiné systémy s řízeným uvolňováním se popisují v publikaci Langer (Sciencé 249: 1527-15.33 (1990))·.

Ve specifickém ' provedení vynálezu, kde terapeutické činidlo je nukleová kyselina kódující proteinové terapeutické činidlo, nukleová kyselina se může aplikovat in vivo, aby se podpořila exprese kódovaného proteinu, přičemž se připraví konstrukce, ' kde vhodná nukleová kyselina je součásti expresívního vektoru a aplikuje se tak, že se stává vnitrobuněčnou, například použitím retrovirového vektoru (popisuje se v publikaci US patent č. 4,980,286) nebo přímou injekcí nebo použitím bombardováním mikročásticemi (například genovým dělem, Biolistic, Dupont) nebo potažením lipidy nebo buněčnými povrchovými receptory nebo transfekčními činidly nebo aplikací ve .spojení s peptidem, ’ který je podobný homeoboxu a který je» znám tím, že vstupuje do jádra (popisuje se například v publikaci Joliot et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868) atd. . V jiném případě nukleová kyselina . terapeutického činidla se může zavést do buňky a f ·#·· ♦ · ·

• · · • · • · · · · začlenit se do vDNA hostitelské buňky, aby došlo k expresi homologni rekombinací. - '

Vynález také popisuje farmaceutické kompozice. Takové kompozice obsahuji * terapeuticky ; aktivní množství terapeutického' činidla 'a ,· farmaceuticky p'řijatekný nosič. Ve

přijatelný" znamená, . že vyhovuje regulační agentuře 4fede.rální nebo státní vlády nebo je uveden ‘na seznamu 4 v U.S.

Pharmacopeia nebo v jiných obecně známých pharmacopoeia vhodných pro zvířataa zvláště pro lidi.'. Termín „nosič" znamená ředidlo, adjuvárís, ekcipient ‘ nebo vehikl, ve kterém se mohou 'aplikovat terapeutická ..činidla, takové farmaceutické nosiče mohou být -sterilní kapaliny, takové jako je voda nebo -oleje, které .zahrnují olej.,1 který je. zvířecího, rostlinného nebo syntetického, původu,v-jako' je- arašídový olej, sojový olej, minerální olej, sezamový; olej‘-1 a. podobně. Voda je preferovaný nosič v případě, že se farmaceutická '. kompozice aplikuje intravenózně. -Fyziologické roztoky a vodr.é roztoky dextrózy a glycerolu se mohou 'také použít - jako'.kaplané nosiče, zvláště pak 'injekťovatelné roztoky. Vhodní farmaceutičtí ekcipienti zahrnují škrob,, glukózu, laktózů, sacharózu, želatinu, slad, rýži, - mouku, · křídu, silika gel, stearát sodný, glycerol monoštearát, talek, chlorid sodný, sušené netučné mléko, glycerol, propylen, glykol, vodu, etanol a podobně. Kompozice, jestliže je to nutné, může také obsahovat malé množství zvlhčovacího nebo emulgačního činidla nebo činidla, která upravují pH. Tyto kompozice mohou být ve formě roztoků, suspenzí, emulze, tablet, pilulí, kapsulí, prášků, formulací pro nepřerušované; uvolňování a podobně. Orální formulace mohou zahrnovat standardní- nosiče, jako jsou manitol, laktóza, škrob, stearát hořěčnatý, sacharin sodíku, celulóza, uhličitan - t y hořěčnatý, které odpovídají farmaceutickému stupni čistoty atd.. Příklady vhodných farmaceutických nosičů se .popisují· v publikadř: „Remington/.s Pharmaceutical Science" ‘ -E.W. Martin

Takové kompozice budou obsahovat terapeuticky účinné množství, terapeutického činidla, které se přednostně vyskytuje v čisté formě spolu s vhodným množstvím nosiče, za vzniku formy, která je vhodná pro aplikaci pacientovi. Formulace by měla být aplikována pacientovi podle vhodného módu. -----—V- preferovaném provedení vynálezu se^kompozice_ tvoří podle vhodných postupů, jako farmaceutická 'kompozice upravená pro intravenózní aplikaci lidským jedincům. V .typickém případě * * kompozice pro intravenózní aplikaci jsou roztoky ve sterilním izotonickém vodném pufru. V případě, že je to nezbytné, kompozice může také zahrnovat rozpustné činidlo a lokální anestetikum,· jako je například lignokain, aby se -zmenšila bolest v místě aplikace injekce. V obecném případě se ingredience dodávají .buď odděleně nebo smíšené 'dohromady s jednotkovou -dávkovou 'formou -například jako suchý lyofilizovaný prášek,' nebo .bezvodý koncentrát v hermeticky uzavřeném kontejneru, jako jsou ampule nebo taštičky, ‘které indikují množství aktivního činidla.. V případě, že kompozice se má aplikovat infúzí, podává, se s infúzni lahve, která obsahuje sterilní vodu nebo fyziologický roztok farmaceutického stupně čistoty. V případě, že se kompozice aplikuje injekcí, ampule sterilní vody vhodné pro injekce nebo fyziologický roztok se může před aplikací smíchat.

Terapeutická činidla podle vynálezu se mohou vytvořit neutrální nebo solné formy.. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují ty, které se tvoří s volnými aminoskupinami, jako jsou ty odvozené od kyseliny chlorovodíkové, fosforečné, octové, oxalové, vinné atd.. ty jsou tvořené volnými karboxylovými skupinami, jako jsóu ty získané z hydroxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého, železitého, izopropylaminu, trietylaminu, 2-etylaminoetanolu, histidinu, prokainu atd.-. , ····

Množství terapeutického činidla podle vynálezu, které bude účinné při léčbě 'zvláštní poruchy 'nebo .stavu závisí na podstatě poruchy nebo stavu a může se - stanovit, standardní klinickou metodou. Navíc testy..* in vitro mohou pomoci identifikovat rozmezí optimální dávky. Přesná·1 použitelná dávka ve formulaci bude' také záviset na způsobu aplikace a vážnosti onemocnění nebo poruchy a měla by se určit na základě úvahy praktického lékaře a stavu pacienta. .Vhodné rozmezí dávky v případě intravenózní aplikace'je v .obecném případě přibližně 20 až 500 mikrogramů aktivní sloučeniny na kilogram tělesné hmotnostiRozmezí vhodné dávky při intranásální aplikaci je v obecném -případě přibližně 0,01 pg/kg tělesné hmotnosti až 1 mg/kg tělesné- hmotnosti. Účinné dávky. Se mohpu extrapolovat ‘ · ' - . "v .z,-křivky vyjadřující odezvu- na dávku získanou z testovacích rsystémů in' vitro nebo zvířecích modělů. '

Vynález také poskytuje farmaceutický. balíček nebo sadu, která obsahuje jeden nebo více kontejnerů -naplněných jednou nebo více ingredienci farmaceutických' kompozic podle vynálezu. Ve spojení s takovými" kontejnery je nuthé .poznamenat, že forma musí vyhovovat vládní agéntuře regulující- výrobu, použití nebo prodej léků nebo biologických produktů.,·,'které získaly povolení být aplikovány člověku.'

Diagnóza a testování

Proteiny Nogo, analogy, deriváty a jejich subsekvence, nukleové kysleiny IVogo (a s nimi komplementární sekvence) , protilátky proti Nogo nacházejí využití při diagnostice. Takové molekuly se mohou použít v testech, jako jsou imunologické testy, při. detekci, prpgnóze, diagnostice nebo monitorování různých· stavů, onemocnění. _ nebo- poruch, které ovlivňují expresi Nogo nebo monitorují j e j ich,. léčbu. Takové testy se. zvláště, provádějí způsobem, který zahrnuje kontakt vzorku . získaného z pacienta s protilátkami'·.. proti Nogo.:'' za podmínek, při kterých muže dojít k imunospecifickému navázání a detekci nebo měření množství libovolného imunospecifického navázání protilátek. Takové navázání protilátek v tkáňových sekcích se může použít při detekci lokalizace aberujícího proteinu Nogo nebo aberujícího množství proteinu Nogo (například malé množství, nebo v případě, že není přítomen) . Ve specifickém provedení vynálezu se protilaFlcy^prota proteíma" Nogo mohou použít při testu v pacientově tkáni nebo vzorku séra, kdy se testuje přítomnost proteinu Nogo, kde aberující množství proteinu Nogo je indikace stavu onemocnění. Termín ,,aberující množství" znamená zvýšené nebo snížené množství vztaženo na přítomné nebo standardní množství, které reprezentuje množství přítomné v analogickém vzorku z části těla nebo ze subjektu, který netrpí poruchou. .Používané imunologické testy zahrnují komptetetivní a nékompetetivní testovací systémy, které používají imunohistochemické, patologické metody, westernový přenosy, radioimunologické testy, test ELISA, sendvičové imunologické testy, imunoprecipitační testy, precipitační reakce, gelové difúzní precipitační reakce, imuriodifúzní testy, aglutínační testy, testy fixující komplement, imunoradiometrické testy, fluorescenční imunotesty, . imunohistochemické testy, imunotesty s proteinem A. V hybridizačních testech se mohou také použít geny Nogo a příbuzné sekvence a subsekvence nukleové kyseliny zahrnující komplementární sekvence. Sekvence nukleové kyseliny Nogo nebo jejich subsekvence obsahující přibližně alespoň 8. nukleotidů se mohou použít jako hybridizační sondy. Hybridizační testy se mohou použít při detekci, prognóze a diagnostice nebo monitorování stavů, poruch nebo stádia Onemocnění spojeného s aberujícímí změnami v expresi proteinu Nogo a v aktivitě, jak se popisuje shora v textu. Takový hybridizační test je* možné provést.· způsobem zahrnujícím kontakt vzorku, -který

7Θ*« obsahuje nukleovou kyselinu se sondou nukleové kyseliny, která • * *ř , ' je schopna hybridizovat DNA nebo RNA Nogo za podmínek, při kterých dojde k hybridizači a detekci’ nebo měření libovolné výsledné hybridizace. - -l " „ .. > f f·»

Ve specifických provedeních vynálezu se -.onemocnění . a / , poruchy zahrnující buněčný—růst a vývojové poruchy—mohou- diagnostikovat nebo se může. 'testovat jejich očekávaná . *

přítomnost nebo se může detekovat .ipredispo:zice pro vývoj • ' · * takových poruch detekcí zvýšeného množství proteinu Nogo, RNA

Nogo nebo funkční aktivity proteinu Nogo, jak ukazuje inhibice růstu nebo detekce mutací v RNA, DNA nebo proteinu Nogo (například translokace v nukleových kyselinách, zkrácení genu nebo proteinu Nogo, změny v nukleotidové nebo -aminokyselinové sekvenci vztažené k Nogo divokého typu), které způsobují zeslabení 'exprese ‘ nebo aktivity proteinu Nogo. Takové onemocnění nebo poruchy, zahrnují, ale nejsou omezeny na ty popsané shora v textu. Množství ' proteinu Nogo se může detekovat imunologickými testy, množstvím RNA Nogo se může detekovat hybridizačními testy (například northernův přenos, dot bloty), navázání Nogo na buněčné růstové inhibiční proteinové receptory- se může provést vazebnými testy, které jsou běžně známy v oboru, translokace a bodové mutace v nukleových kyselinách Nogo se mohou detekovat Southernovými přenosy, analýzou RFLP, PCR za použití primerů, které přednostně tvoří fragment, který zahrnuje alespoň většinu genu

Nogo, sekvenování genomové DNA nebo cDNA Nogo získané od pacienta atd..

Také se popisují sady pro diagnostické’ použití, které obsahují jeden nebo více kontejnerů protilátek proti Nogo a mohou obsahovat značeného partnera vázajícího se na protilátky . V j iném .'případě se. protiláky . proti proteinu Nogo mohou značit. (s derekovatelnou . .značkou, například chemoluminiscenční, enzýmatickou, 'fluorescenční nebo ,·)· ‘ . ' 1

radioaktivní částí)·. Také. se popisuje sada, která obsahuje v jecinom nebo ve" "více ‘ kontejnerech1 2 sondu nukleové kyseliny, která je schopna ‘ hybridizovat s RNA Nogo. Ve specifickém provedení sada může obsahovat v jednom, nebo více kontejnerech pár primerů (například v rozmezí veliksotí 6 ; ,až ‘30 nukleotidů), které jsou schopny "vyvolat amplifikaci . (například 1 po 1 ymerázovou řetězcovou reakcí (popisuje šé~v ’ publikaci'ť IhřTiš" et al.,.1990, PCR Protocols, Academie Press, Inc.,.San Diegp,

CA) , ‘ ligázová řetězcová reakce . (popisuje se v dokumentu · EP '320,308) používá replikázu ζ)β, cyklickou reakci se sondou nebo jiné metody známé'v oboru) za vhodných podmínek reakce alespoň části nůkléové kyseliny Nogo. Sada může dále v kontejneru obsahovat předem stanovené množství čištěného proteinu Nogo nebo jeho nukleové 'kyseliny například jako standardní / nebo 2 < 2 kontrolní.

Testování ágonistů a antagonistů. Nogo ' .

Nukleové kyseliny, proteiny a., deriváty Nogo 2 se také používají v testech' vhodných pro' detekci molekul, které specificky váží nukleové kyseliny, proteiny nebo deriváty Nogo a ·.. tak mají potencionální použití jako agonisté nebo antagonisté. Nogo,·. zvláště molekuly, které tak regulují buněčný růst. V preferovaném provedení ' vynálezu testy slouží k testování molekul s potencionálním použitím jako neurální růstové promotory při vývoji léků. Vynález tak popisuje testy vhodné pro detekci molekul, které se specificky váží na nukleové kyseliny, proteiny Nogo nebo jejich deriváty. Rekombinantní buňky'.exprimující nukleové kyseliny Nogo se mohou použít při · r.ekombinantní ‘produkci proteinů Nogo v uvedených testech, .'•přičemž se ; testují molekuly, které se váží na protein · Nogo.: Molekuly (například putativní vazební partneři proteinu . Nogo) ...přijdou. do kontaktu s proteinem Nogo (nebo s, jeho'·'fragmentem) ' zaf podmínek ; podporující navázání , a • ·94· ,·· «

pak , se, identifikuji molekuly, které se specificky , váži na protein Nogo. Podobné metody se i mohou -použit k testováni molekul, které se váži na deriváty Nogo nebo _ nukleové kyseliny. Metody, které se mohou použit, -jsou dobře známy v oboru. - Různé knihovny._jako je náhodná.péptidová nebo kombinačni peptidová nebo nepeptídová·" knihovna se mohou testovat, zá . v - » účelem zjištěni přítomnosti molekul, které se specificky váží na protein^ Nogo. Může 'se použít řada knihoven, které jsou dobře známy v oboru% Jsou to například chemicky syntetizovaná knihovna, r ekcmb i na n t n i (například knihovna vykazujícího fága) a knihovna založená^na translaci ín vitro. Příklady ' chémicky syntetizovaných knihoven se popisují v publikaci Fodor et. al., 1991, Science1 251: 767-773, Houghten et al.,. 1991, Nátuře 354: 84-86, Lam. et al., 1991, Nátuře 354: 82-84, Medynski, 1994, Bio/Technology .,,.12 : ,.709-710, Gallop et al., 1994, J. Medicíně -Chemistr.y 37 (9) Y 1233-1251, Ohlmeyer et al., 1993, porc. Nati. -Acad. Sci. USA . 90: 10922-10926, Erb et al.,, 1994, Porc. Nati. Acad. * Sci. USA 91: 11422-11426,

Houghten et al., 1992, Biotechniques 13: 412, Jayawickreme et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 1614-1618, Salmon et al., 1993, Proč.,Nati. Acad. Sci. USA 90: 11708-11712, přihláška PCTč. WO 93/20242 a Brenner and Lerner, 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5381-5383. Příklady· knihovny, která vykazuje fága, se popisuje v publikaci Scott and Smith,· 1990, Science 249: 386-390, Devlin et al., 1990,. Science, 249: 404-406, Christian,; R.B., et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 711-718), Lenstra, 1992, J.

Immunol. Meth. 152: 149-157, Kay et al., 1993, Gene 128: 59-65 a přihláška PGT čy WO 94/18318 s datem 18. srpna 1994.

Knihovny 'založené na translaci- in ' vitro se popisují v dokumentů; přihláška · PCT č. WO 91/05058 s datem Ί8. dubna

1991 a v publikaci Mattheakis et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci USA 91:· 9022-9026. ' * t *

Nepeptidové. knihovny, jako je například benzodiazepinová knihovna (popisuje se _ například v publikaci Bunin et al..,. 1994,? Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 4708-4712), se mohou upravovat,—-aby-, byly vhodné, pro __d.a.l_ší_ponži t i". Dále se mohou také použít peptoidové' knihovny (popisuje se v.publikaci Simon' .et al., . 1992·, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9367-9371) . Může se .použít jiný" příklad knihovny, -kde amidové funkce í -Λ , v . Γ v peptidech. se předem metylovaly za vzniku chemicky transformované kombinační knihovny, jak se popisuje,

v publikaci Ostresh et .al., 1994, Proč. Nati'. Acad. Sci. USA 91: 11138-11142), , V ’ . v 0

Testování knihoven - se 'může provést libovolnou z běžně známých .metod.’ Testování peptidových knihoven se popisuje v publikaci Parmléy and Smith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol,. 251: 215-218, Scott and Smith, 1990, Science 2491 386-390, Fowlkes et al., .1992, BioTechniques 13: .422-427:, Oldenburg et al., 1992,· Proč, Nati. Acad. Sci. USA 89: 5393-539.7, Yu et al., 1994, .cell 76: 933-945,· S.taudt et al., 1988 , Science 241: 577-580, Bock et al·.*, 1992, Nátuře 355: 564-566, Tuerk et al., 1992, Porc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 6988-6992, Ellington et al., 1992, Nátuře’ 355: 850-852, U.S. patent č. 5,096,815, US patent č. 5,223,409 a US patent č. 5,198,346, Ladner et al., Rebar and Pabo, 1993, Science 263: 671-673 a přihláška PCT č. WO 94/18318.

Ve specifickém provedení vynálezu se může provést testování tak, , že še -členové knihovny dostanou do kontaktu s proteinem Nogp (nebo· nukleovou kyselinou nebo derivátem) imobilizovaným na -pevné fázi a izoluje se ta knihovna, jejíž členové se vážou na protein (nebo nukleovou' kyselinu nebo derivát). Příklady 'takových testovacích metod se popisuje ha

·♦ Ψ · 11' é 1 2 ·«· příklad v publikaci Parmley and Smith, 1988, Gene 73: 305.,-318, Fowlkes et al., 1992, BioTechniques 13: 422-427, přihláška PC.T WO 94/18318. ' .. -V ·. 2 "'V jiném provedení vynálezu se popisuje dvouhybridní systém vhodný pro - selekci interakčního proteinu. v kvasinkách’

1 (popisuje se v publikaci Fields—and—Song-,_1989, Nátuře,2 340: 245-246, Chien et al., 1991, Proč. Nati. Acad. .Ser. USA 88. 9578-9582), který je' možné použít k .identifikaci molekul, které se specificky váží na protein nebo derivát Nogo. . Zvířecí modely.

Vynález· také popisuje zvířecí’ modely, které zahrnují -modely myší, křečků, ovce, ' prasete, telete a upřednostňují se savci, kterým není člověk. . - . · ·· V jednom provedení vynálezu se popisují zvířecí modely onemocnění nebo poruch, které' zahrnují pomnožení, růst a regeneraci n.euritů. Takové zvíře 'může vznikat vyvoláním homologní rekombinace mezi genem Nogo ve svém chromozomu a

Iexogenním genem Nogo, který ' není biologicky . aktivní (upřednostňuje se začlenění heterologní sekvence například gen rezistence na antibiotika). V preferovaném provedení vynálezu 2 se homologní rekombinace provede transformací kmenových buněk získaných z embrya (ES) vektorem, který obsahuje inzercí deaktivovaný gen Nogo, přičemž dochází . k homologní rekombinaci, pak se buňky ES zavedou injekcí do· blástocytu a blastocyty se implantují do náhradní matky. Pak následuje v narození chimérického zvířete („knockoutovárté zvíře"), kde gen

Nogo se deaktivoval (popisuje se v publikaci' Capecchi,· 1989, Y Science 244: 1288-1292). Chimérické zvíře še může křížit za vzniku dalších „knockoutovaných" zvířat. Mezi taková zvířata patří myši, „křečci, ovce, prasata, telata atd. a preferují se 78··· •r ···· • · · « · ... · * · · t · · ·· * ·· · • ·· • · ·# * «*· savci, - kteří nejsou člověkem. Ve specifickém provedeni, vynálezu se produkuje „knockoutovaná" myš. ··· Očekává se, že u takových zviřať dojde k vývoji onemocněni nebo poruch nebo taková1 zvířata maji-, predispozice k vývoji uvedeného onemocnění , která zahrnuj i· centrální nervový systém a--tak se mohou použít_rjako_zvířecí_modely vhodné pro takové onemocnění a poruchy,. .například .při testování . molekul (například potencionální terapeutická .'.činidla .pro léčbu poruchy· nervového·,/, systému) za účelem. zjištění jejich schopnosti .inhibovat nádory nervové tkáně a. tak léčit nebo předcházet takovým^onemocněním nebo poruchám. ' V ' Přehled obrázků na výkrese ...»

Obrázek č...la .až lb: (a.) klony cDNA Nogo: '„CPW1-3 je klon bovinní cDNA. izolovaný při testováni knihovny cDNA bílé hmoty bovinní míchy s degenerovanými ”oligonukleotidy ,.MSC5-8 (dané dohromady) a -MSC9. Komplementární RNA ·získaná z tohoto klonu se následně použila přitestování' knihovny, krysí cDNA. 0li3 a 01i8 se " izolovaly ' z knihovny . krysích ^ · oligodendrocytů s vneseným oligo d(T). R1-3U21, - R018U1 a Ř018U37-3 se t! izolovaly z knihovny krysího mozkového kmene/michy s vnesenými hexanukleotidy (Stratagene). Polohy šestí bovinních peptidových sekvencí NI220 (bNI220) se označily na CWP1-3 a R13U21. Sekvence ve spojení různých exonů jsou označeny na vrcholu každého klonu.. Otazníky u R018U1 identifikují sekvenci na tomto klonu, který se napáruje se sekvencemi s libovolného jiného klonu Nogo. R018U37-3 se sekvenoval pouze z 5'-koncea nesekvenovaná část je . označena tečkami. (b.) Schémata demonstrují hypotetický mechanizmus tvorby tří transkriptů Nogo. Pl a P2 reprezentují putativní lokaci alternativních promotorů. Pro vytvoření tří transkriptů je nutný minimální počet tří exonů, ačkoli každý exori by mohl být potencionálně rozdělen na více exonů. - • · · · · · 79

Obrázek č. 2a až 2b: (a) Nukleotidové (SEQ ID NO: 1) a aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 2) transkriptu A -genu Nogol (sekvence vytvořená spojením sekvenci cDNA R018U37-3, 01x18 a R1-3U21) . Oválný rámeček: předpokládaný iniciační kodon, podtrženo tečkami: kyselý pruh, Opotencionální místa PKC, V: potencionální místa kaš eincvé kinázy II,—· tlustě podtrženo: hydrofóbní oblasti C-konce a potencionální transmembránové oblasti, tence podtrženo: potencionální místa A-glykosylace. (b) Porovnání peptidové sekvence mezi sekvenovanými, izolovanými*· bovinními sekvencemi NI220 (bNI220, SEQ ID NO·: 3- a'ž 8) a odpovídajícími bovinními -sekvencemi (SEQ ID NO: 9 až 14) a krysími sekvencemi (SEQ ID NO: 15 až 20) překládanými ž krysí a bovinní cDNA. Krysí a bovinní aminokyselinové sekvence, 'které se nepárují s peptidovými sekvencemi bN.I220 jsou v nižším rámečku'.

Obrázek č. 3a až 3b: (á)’ Porovnání -aminokyselinové sekvence 180 " aminokyselinových oblastí C-konce NSP (lidská, SEQ ID NO: 21j , S-REX (krysí) SEQ ID-NO: 22), CHS-REX (kuřecí, SEQ ID NO: 23), NOGOBOV (bovinní, SEQ ID NO: 24), NOGORAT (krysí , SEQ ID NO: 25) a klon EST. . E. elagans (W06A7A, SEQ ID NO: 26) a klon EST D.melanogaster (US51048, SEQ ID NO: 27). (b) Evoluční konzervovanost dvou hydrofóbních oblastí. Na obrázku je zobrazeno procento podobnosti s jinými druhy nebo v jednom druhu běžných hydrofóbních oblastí, Stínovaným písmem: konzervativní aminokyseliny.

Obrázek č. 4a až 4c: (a) .Northernova hybridizace různých tkání s běžnou sondou Nogo. Běžná sonda obsahuje transkript A sekvence mezi nukleotidy 2583 až 4678. Zkratka ON znamená zrakový nerv a zkratka SC znamená míchu.' Symbol C znamená cerebrální kortex. Zkratka DRG znamená dorzální kořeny ganglí. Zkratka SN znamená .ischiatický nerv. PC12 označuje buněčnou linii PC12. (b) NorthérnOva.hybridizace RNA' míchy a buněk PC12 • 9 • · · ·· • · • · # · · · · · 80 ·· ··· ··· ··· · ·.* · ·· ··· se sondou specifickou pro exon 1 (levý panel) a zadní mozek a » (HB) a RNA skeletálního svalu (M) se specifickou' sondou exonu 2 (pravý panel). (c) Northernova „hybridizače se sondou běžnou pro Nogo. Symbol K znamená ledviny. Symbol B znamená chrupavku z prsní kosti). Zkratka Sk znamená kůži. Symbol M. znamená skeletální sval. Symbol' Lu znamená plíce. Symbol Li znamená játra a symbol Sp znamená slezinu”, Označily ~se . tři~dďlavnT transkripty (4,6. kb, 2,6 kb a 1,7 kb). .Symbol V . značí -difúzní, ale' konzistentní pruh o^přibližné velikosti 1,3 kb.

Obrázek č. 5a až 5f: Hybridizače in, šitu míchy a .sekcí malého mozku dospělých krys. (a,d> Řadu oligodendrocytů (OL) v míše a v bílé hmotě malého mozku je možné vidět po. označení Nogo „antisense"· běžnou ribosondou. To je velmi podobné pro sáijgnály detekované v případě,· že konzekutivní sekce míchy hybridizovaia s „antisense" ribosondou (b). (c). Neurony všedé kůře (GM) jsou také značeny Nogo „antisense" .běžnou ribosondou. Zkratka WM znamená bílou mozkovou hmotu. Jasné pole a fluorescenční. pohled sekce malého mozku dvojitě značené Nogo „antisense" běžné ribosondy (e·) a anti-GFAP protilátkou (f) . Buňky Perkiňje (dvojitá šipka) jsou silně' značeny sondou Nogo, zatímco astrocyty (černobílá šipka) jsou negativní. Několik buněk granulární buněčné vrstvy (Gr) je také značeno sondou Nogo. Symbol m znamená molekulovou vrstvu. Měřítko: a, b, d-f: 50 p.m.' a c: 280 p.m.. ...

Obrázek č. 6a až 6i: In sítu hybridizače zrakových nervů v různých dnech postnatálního (a, f: PO, b, g: P3, c, h: P7, d, e, i: P22) období buď se sondami Nogo nebo plp (antisense nebo sense) . (a-d) antisense sonda Nogo, (e) sense sonda Nogo, (g-i) antisense sonda plp, (f) sense sonda plp. -Exprese .genu Nogo v prekurzorech oligodendrocytů se může detekovat už v časové fázi PO, zatímco, exprese plp začíná být detekovatelná už ve fázi ,.P3 ve zrakovém nervu blízko chiazma (g) . 81 • ·*·· ·· ···· ·· ·· · ·· · · · ·

Obrázek č. 7: Protilátky AS Bruna a AS 472 rozeznávají protein myelin o přibližné velikosti 200 kD. Příprava extraktu krysího proteinu myelin a bovinního proteinu q-pool · se popisuje v publikaci Spillmenn. et al., 1998, J. Biol. Chem., 273(30): 19283-19293. Protilátky AS Bruna a AS· 472 rozeznávají pruh o velikosti 200 kD, stejně jako několik menších 'pruhů v bovihním^'mýelinu," které se ‘mohou sHěpTt produkty bNI220.' Protilátky AS Bruna obarvily v krysím,.. proteinu. myelin pruh odpovídající velikosti200 kD. Symbol I znamená . protilátky AS Bruna. Symbol P označuje protilátky AS "Bruna preimunizační sérum. Symbol E značí protilátky AS 472 čištěné na základě afinity.

Obrázek č. 8a -až 8i: ' Imunohistochemie provedená s krysí

míchou a malým mozkem za použití protilátek IN-1 (a-e), AS

Bruna (d-f) a AS' 472 (g-i)·, jak je zobrazeno na levé části každého panelu. Silné zbarvení 'proteinu myelin se pozorovalo v obou tkáních za použití všech tří protilátek, kdy zmražené' ♦ sekce se fixovaly se směsí etanolu/kyseliny octové (a, b, c, d, e,. ‘g, h) . Ošetření sekcí metanolem odstranilo obarveni myelinem· s výjimkou těla buněk eligodendrocyťů (šipky, c, f, i). Hrot špičky: buňky Purkinje, WM, bílá -hmota; GM, šedá hmota, DR: dorzální kořeny; Gr vrstva granulárních buněk; m, molekulární vrstva. Měřítko: a, d, g: 415 μιη, b, c, e, f, h, i: 14 3 μιη.

Obrázek č. 9a až 9d: Obrázky znázorňují >· neutralizační aktivitu protilátek AS 472 a AS Bruna v různých biotestech. (a) Fibroblasty NIH 3T3 se nanesly na buněčné kultivační misky s proteinem q-pool a předem ošetřené protilátkou IN-1, AS Bruna, AS 472 nebo odpovídajícím pre-imunitním sérem. Polyklonální - sérum vykazuje dokonce , o trochu lepší neutralizaci · inhibičního substrátu ve srovnání s protilátkou IN-1. Pre-imunitní séra nevykazují podstatný * účinek na .rozšíření buněk NIH 3T3. Přidání přebytku peptidu (P472), který se*' použil ke vzniku protilátek AŠ 472 soutěžil s neutralizační aktivitou, zatímco nespecifický . peptid (Px) nevykazoval žádný, účinek. (b) Když se inhibiční substrát ošetřil předem protilátkami AS Bruna nebo AS 472 vedlo to. ke * vzniku výrůstků neuritů DRG, který ‘je srovnatelný s tím, co se pozorovalo na laminárním 'substrátu. Příklady vyrůstání neuritů "z. DRG na^^-^doT^preděm oš^trenýňT^PBS" (c, skoPe^^^TDj^a^pŤedenr se. ošetřil protilátkami AS Bruna (d,. skoré = 4).

Obrázěk č. 10a až lOd: Injekce explantátů zrakového nervu s .AS 472 vede k růstu axonů. (a) Získaly se.páry zrakových

nervů dospělé krysy, injekcí se do nich zavedla protilátka AS 472 nebo preimunní sérum a umístily nechaly se kultivovat tak, že' jeden konec nervů byl v . kontaktu s disociovanými PO krysích

DRG. neuronů, (b) Po d,vou týdnech in vitro se .odřízly . sekce EM nervů ve vzdálenosti 3,5 mm od místa odříznutého místa (šipky * v panelu A a systematicky se hledaly neporušené axony (3 experimenty). (c) Snopce regeherovanýčh .áxonů (šipky) prorůstají . degenerovaným zrakovým nervem po · injekci s protilátkami AS 472. (d) Regenerujíci axony v. kontaktu s proteinem myel.in.. Zvětšení: c, 12 000 x , ď: 35 000x1'.

Obrázek č. 11a až 11c: Exprese rekombinantního proteinu Noho A v transfekovaných buňkách COS. (a) Western blot vykazující imunireaktivitu protilátek AS Bruna

s rekombinan.tním proteinem Nogo A (dráha 2) a endogenní Nogo A z primárních kultivovaných krysích oligodendrocytů (dráha 3) . Hybnost těchto dvou proteinů je na 5 % denaturačním gelu SDS skoro shodná s fragmenty o velikosti 200 kD. Kontrolní vzorek transfekovaný . konstrukcí LacZ (dráha 1) nevykazuji imunoreaktivitu s protilátkou AS Bruna. Stejný blot se také testoval protilátkou anti-myc 9E10. Pruh, který reagoval s protilátkou AS. Bruna také reagoval .s protilátkou anti-myc tag 9E10 (dráha 5) , zatímco endogenní protein Nogo A

nereagoval (dráha 6) . ' Kontrolní vzorek transfekce LacZ ..- 83

vykazoval očekávaný pruh o přibližné velikosti· 118 kD (dráha 4). Buňky COS dočasně transfekované konstrukcí Nogo -A s dvojitě obarvily'protilátkou AS Bruna (b) a IN-.l (c) . Buňky pozitivně obarvené protilátkou As Bruna byly také pozitivní s protilátkou IN-1. ' ·. -....... Obrázek . ..č . 1.2-:^N-U.kle-0-t.ido-vá se,kv_ence (SEP ID NO: . 281 ' _ , ; " * . g . 't, i , ' \ bovinní’cDNA genu Nogo'. t ' ' ' j'-·

Obrázek č. 13: Aminokyselinová sekvence krysího proteinu Nogo A (SEQC ID NO: 2) se porovnávala s teoretickou aminokyselinovou . sekvenci lidského Nogo (SEQ ID NO: 30) . Aminokyselinová' sekvence lidského proteinu Nogo ..se odvodila z uspořádání'exprimované·sekvence tags (EST) spolu se sekvencí krysího Nogo a překládala se do uspořádaného lidského ETS za použití krysího Nogo jako templátu.

Obrázek č. 14 zobrazuje sekvenci nukleové kyseliny krysího Nogo . C (SEQ ID.,NO: 31) . a jeho, odpovídající aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO: 32) ' v r· ' · · Obrázky č. 15a až 15e zobrazují, žé protein Nogo A je přítomen v plazmatické · membráně oligodendrocytů, jak se prokazuje imunocytochemií a biotinylací buněčného povrchu oligodendrocytů v kultuře.

Imunocytochemie (a-d): Oligodendrocyty získané ze zrakového nervu krys P10 se. disociovaly a kultivovaly po dobu dvou dní. Barvení živých· buněk . monoklonální protilátkou In-1 (a) nebo AS 472 ;(c) vykazují imunoreaktivitu ne těla oligodendrocytů. .V přítomnosti soutěžícího peptidu P472, As 472 došlo pouze k zabarvení pozadí (všechny typy buněk) (d) .

Podobné nespecifické', barvení bylo možné vidět, když se ^ ^ * vynechaly primární protilátky (b).

Hodnocení: Destičky zakódované číslem se náhodně mixovaly a, klasifikovaly třemi nezávislými pozorováními. Osm z deseti' ''84

destiček, se. správně klasifikovaly jako AS, 472 pozitivní, ,IN-1 pozitivní a v případě všech (tří.> pozorování . se provedly • kontroly. ‘

Biotinylace (e) : Kultury celého·'mozky krys P4 bohaté na oligodendrocyty se na, buněčném povrchii značily biotinem či nidlem, které po sedmi" ..dnech -v kultuře prochází membránou. .Následné sě~ buněčné-^ homogenaty ' ._ošétřTly Dynaberads se streptavidinem. Sraženina ,a supernatant (šup) testovaly na. ^membráně protilátkou AS 472, přičemž' vykazují odlišný proteinový patern: Buněčný; povrchový protein' Nogo A zjištěný ve sraženině vykazuje· vyšší zjevnou molekulovou hmotnost ve srovnání S vnitrobuněčným proteinem Nogo A. Tento posun je pravděpodobně · .způsoben glykosylací. Luminální ER protein BiP a většina β-tubúlinu se mohou, zjistit pouze ve vnitrobuněčné frakci. .

Obrázek č.16a až "16j·:'-.-Funkční testy ukazují přítomnost proteinu Nogo A na íbuněčné membráně oligodendrocytů.

Preinkubace kultur zrakového .nervu s protilátkou AS 472 (a, b) umožňuje fibroblasty NIH 3T3 rozšířit se přes vysoce větvené oligodendrocyty, „ které jsou nastíněny imunofluorescenčním barvením, kdy se testuje přítomnost GalC (pro.tilátky 01) (a). Šipky v odpovídající fázi kontrastního zobrazení (b) indikují fibroblasty NIH 3T3 rozseté na povrchu oligodendrocytů (c, d) : kdy protilátka AS 472 se přidala spolu s P472, přičemž fibroblasty NIH 3T3 se striktně vyhýbají oblastem oligodendrocytů pozitivních na GalC (šipka) (popisuje se v publikaci Caroni and Schwab, 1388 Neuron 1: 85-96). (e, f) : V přítomnosti protilátky AS 472 PO krysí, disociované DRG neurony jsou schopny rozšířit neurity pes oblast vysoce rozvětvených oligodendrocytů (šipka na obrázku 16f) . (g, h) :

Peptid P472 účinně soutěží s neutralizační .-aktivitou AS 472: neurity se zcela vyhýbají oligodendrocytům. Protilátka AS 472 užívaná v těchto experimentech se. vytvořila proti krysí • · · u ^ . ·· · · · · · · ·· · · ·· '« ·· · · · peptidové sekvenci 472. (i, j): Kvantifikace těchto výsledků (jak se popisuje v metodách) semonstruje silnou neutralizační aktivitu protilátek AS 472 v obou typech testů. Měřítko 40 μτη.

Obrázek č. 17a až 17e: Rekombinantní protein Nogo A je inhibiční substrát a jeho inhibiční aktivita je neutralizována' mono kloná-l-n-í- protilátkou In-1.—Extrakty—bohaté na RecNogoA pocházející ze stabilních buněčné linie CHO-Nogo A nebo β-galaktozidáza izolovaná paralelně ze . stabilní buněčné linie CHO-LacZ se použily v případě testů nanesení fibroblastů NIH 3T3 a růstu neuritů DRG. (a) Stříbrný . gel myc-his-značený

recLacZ (dráha 1) a recNogo A (dráha 2)" vykazuje pruh Nogo A o velikosti 180 kD. 'Shoda, pruhu Nogo A sepotvrdila westernovým přenosem inkubovaným s protilátkou AS Bruna (dráha 3) a anti-myc. protilátkou 9E10 (dráha 4). (b) Plotny potažené RecNogo A jasně inhibovaly rozšíření buněk NIH ·3Τ3. Předchozí inkubace s monoklonální protilátkou. IN-1 nebo s AS Bruna vedla k vysoce podstatné' neutralizaci (p je menší než 0,01) inhibiční aktivity. 1 gm kontrolních, monoklonálních protilátek Ol a preimunní séra . nebyla . účinná. Extrakt CHO-LacZ vykazuje částečně inhibiční účinek na buňky NIH 3T3, což je pravděpodobně způsobeno endogenními proteiny CHO. Tato inhibiční aktivita nebyla ovlivněna předchozí inkubací s protilátkou. (c) Při růstových testech neuritů DRG se smíchal s lamininem stejný proteinový materiál jako v případě (b) a a směs se použila k potažení. RecNogo A vykazuje velmi silný inhibiční účinek na růst neuritů v disociovaném DRG způsobem závislým na dávce. Aktivita se neutralizovala monoklonální protilátkou IN-1 (p je menší než 0,001), ale nikoli kontrolní monoklonální protilátkou 01. Proteinový materiál z buněk CHO-LacZ nepůsobil inhibičně v libovolné použité koncentraci. Příklady skóre jsou zobrazeny na .obrázku (d) : 1 μg recNogo A, 86 • · i ···· ·· ···· ψ · ' · • · ··» žádné nebo krátké neurity (šipka), skóre 2 ,a na 'obrázku (e): 1 ,μς CHO-LacZ, "dlouhé, V větvené neurity (šipka) skóre 5 až -6. Statistická, analýza, za použiti Studentského testu t. Měřítko je 280 μιη. . . ·. \ .7 ,. ·

Na obrázku č. 18 je znázorněna .funkční analýza mutantů s tíelecí 'NogpTr"Následuj ící 'deleční' -konstrukce kóduj ící—fúzní proteiny obsahující ‘fragmenty Nogo .nebo zkrácené části Nogo .(jak. se. uvádí dálé v .textu) se vytvořily “.jak;,.se ..popisuje v sekci 6.2.7 dále v textu. *

Nogo-A: * His-tag/T7-tag/vektor/Nogo-A seq. aki-1162

Nogg-B: ' His-tag/T7-tag/vektor/Nogo-A seq ak-171 + 975-1162 · Nogo-C: His-tág/T.7-tag/Nogó-C N-konec (11 ak) + .Nogo-A seq a k 97 5-.1.16 2

NiÁext:· .His-tag/T7-tag/vektor/Nogo-A séq ak974/T7-tag .

NiR: . ,His-tag/.T7-tag/vek tor/Nogo-A seq akl-171/vektor

NiG: His-tag/T7-tag/Nogo-A .seq akl72-974/His-tag EST: /His-1 a g/. T 7-tag/Nogo-A seq ak760-1162 ’

NiG-Dl: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-908/vektor NÍG-D2: His-tag/Ť7-tag/Nogo-A seq akl72-866/his-tag NÍG-D3: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-723/His-tag N1G-D4 : His-t-ag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-646/vektor NÍG-D5: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak291-646/His-tag NÍG-D7: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-234+292-974/His-tag NÍG-D8: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-628 NÍG-D9: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-259+646-974/His-tag

NiG-DlO: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak291-974/His-tag NÍG-D14 : His-tag/T7‘-tag/Nogo-A seq akl72-259 NÍG-D15: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-189+491-974/His-tag NÍG-D16: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq ak!72-189+619-974/His-tag NÍG-D17: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-189+257-974/His-tag i. * NÍG-D18: His-tag/T7-tag/Nogo-A seq akl72-189+261-974/His-tag NÍG-D20:. His-1ag/.T7-1ag/Nogo-A seq ak542-7Ž2/His-tag

Τ’" 87 v ···· • · ··· · · · • ·· · ·· · ·« ·«· Čisla aminokyselin (ak) jsou založena na 'číslováni aminokyselinové sekvence Nogo A (SEQ ID^ NO: 2) začínající prvním metioninem. His-tag a T7-ťag obsahuje 34 ,aminokyselin. N-a C-terminální ‘vektorové sekvence se získaly z expresívního * ,, - t ..... vekotru pEŤ28. : .· · Příklady provedení vynálezu ' ' “ _ " v Příklad 1:. Charakterizace nukleotidu a proteinového, produktu ><· . · genu Nogo . · ’ "

Zde popsané ...příklady . demonstruj í, že klonovaný gen . Nogo kóduje protein, který je silný »inhibitor růstu ••neurálních buněk ; a jé také rozeznáván 'monoklonálními protilátkami pxopsanými v dokumentu^ Schwab et al. ,'US patent č. 5, 684,133. v- ‘ M 4

Materiály a-metody V následující sekci: ‘ se’ popisují materiály a metody používané podle vynálezu.· Odborník ví, že uvedené materiály a metody, jsou toliko ilustrativní a je možné provést jejich modifikace. Takové ; modifikace jsou také předmětnou věcí vynálezu.

Izolace bovinního proteinu Nogo z myelinu Všechny kroky čištění se provádějí při teplotě 4 °C a inhibiční aktivita substrátu získaných frakcí se rutině stanovily rozšířením buněk NIH 3T3 a testem nadměrného růstu neuritů PC12 (popisuje se dále v textu). Z tkáně bovinní míchy se opatrně odstranily mozkové blány a nakrájela se na malé kousky. Myelin se pak extrahoval v extrakčním pufru (60 mM CHAPS, 100 mM' Tris-KCl, pH8,0, 10 mM pufr EDTA pH8,0, 2,5 mM jodaceťamid, 1 . mM fenylmetylsplfonylfluorid, · 0,1 -/^g'/ml' aportininu, 1 μg/ml ieupeptinu, 1 μg/mlpeptstaťinu ·!)·. - } . · 88

·· ·· • ·

Aby se získal míšní’ extrakt, tkáň se homogenizovala přímo v extrakčním pufru' CHAPS v poměru /1:1, hmotnost:objem) r " . * -\f - ' . .*

Homogenát se centrifugoval dvakrát při 100 ' 000 . x "g (Kontrón,· typ: K50.13, fixovaný .úhel rotoru) po dobu. , jedné hodiny .při teplotě. 4 °C. Čistý .superriatant (extrakt) se bezprostředně apilkova'.. na .kolonu '.O.-sef.aró.za_(2,6’ x . 11.5 cm). a uvedl, se do ř- ^ rovnováhy pufrem A (20. mM . · Tris-Cl, pH8,0, 0,5 %(hmotnost/objem) CHAPS). Vázané proteiny, .se eluovaly pětinásobným, objemem lineárního gradientu od 0 do 1 M NaCl v pufru A (100. ml gradient v 50 minutách). Aktivní frakce obsahující bovinní NI220 se eluovaly při přibližné koncentraci 0/4 M NaCl a slily se (q-pool 1) a pak se nanesly na .kolonu Superdex 200 (2,6 x 60..cm), která se uvedla ' do rovnováhy pufrem' B (150 mM NaCl,. 20- mM Tris-Cl, pH8,0, 0,5 % (hmotnost/objem)‘ CHAPS) . ·

Aktivní frakce se'po gelové filtraci ;(s-pool 1) separovaly 6 % SDS-PAGE za redukčních podmínék a .s nízkou konstantní silou (2 waty na gel) při celkové hodnotě 2 500 kolt-hodin. pruhy a oblasti gelu se identifikovaly po obarvení Coomoassiovou. modří (θ', 1 % hmotnost/objem R250 v 50 % metanolu a 10 % kyselině octové), vyřízly se a extrahovaly se v 800 μΐ gelového elučního pufru (0,5 % (hmotnost/objem) CHAPS, 2.0 mM Tris-Cl, pH8,0, 10 mM EDTA, pH8,0, 2,5 mM jodacetamid, 1 mM f enylmetylsulfonylf luorid, 0,1 pg/ml aprotininu, 1 μρ/πιΐ leupeptinu, 1 μg/mlpéptstatinu A) po dobu alespoň 48 hodin při teplotě 4 °C.

Mikrosekvenace izolovaného proteinu Nogo ·

Na 10 % SDS- polyakrylamidovém gelu za redukčních podmínek se opětně provedla separace materiálu eluovaného z několika neutralizovatelných aktivních gelů IN-1 a .polyakrylové gely se· obarvily 0,1 % (hmotnost/objem)"Coomassieovou modří R250 v 50 % metanolu a . 10 % kyselinou octovou. Pruh o molekulové,

» I hmotnosti 220 000 se vyřízl, a štěpení endoproteinázou Lys-C (v molárním poměru 1:50) se provedlo přímo >v gelu. . Vzorek se okyselil a aplikoval se na kolonu vysokovýkonné kapalinové chromatografie a peptidy se separovaly lineárním gradientem (0-100) 0,04 % kyseliny ^.trifluorooctové a- 80 % 'acetónitrilem a'

Konstrukce knihovny cDNA se uskutečnila - za použiti sady Uni-,ZAP (Stratagene) podle ' instrukcí výrobce;. Komplexnost knihovny byla 'větší, než 4 x 10,6 jednotek tvořících plaky celkem a průměrná velikost "inzertů byla přibližně 1,8 kilobáze. • Degenerované oligonukleotidy MSG5-8 '(MSC5: . ' ‘ . T . i " ’ T CIGTIGG Y AAIÁCIGCIGG Y AART C (SEQ ID ŇO:47); MSC6:-------------- TCIGTIGGIAGIACIGCIGGYAAYTC (SEQ ID NO:48);. MSC7: · *·' TCIGTIGGYAAIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:49); MSC8: . TCIGTIGGIAGIACIGCIGGIAGRTC (SEQ ID NO:50)) se ' vytvořily ze., sekvence peptidu 1 bNI220 a MSC9 (GARATHGCIGAIATHCARGAYGGIGA· (SEQ ID NO: 51)j .. se vytvořily ze sekvence peptidu 2 bNI220. Oligonukleotidy se .syntetizovaly pomocí MWG Biotech .(Munchenstein, Švýcarsko) a značily se znáčícím", .kitem ' „DIG ' DNA 3,_end"*. Ribonukleové sondy se syntetřzóval.y z.a použití značící sady . DIG RNA . (Boehringer Mannheim). . · ..

Použila se hybridizace sondy a podmínky promývání, jak je popisuje výrobce (MSC5-8' a MSC9 se použily při hybridizaci a teplota promývání je' 57 °Č) . Detekce' sondy se uskutečnila za použití systému CDP-star (Boehringer Mannheim). Používání a testování knihovny cDŇA se ‘provádí podle protokolů vhodných pro knihovny cDNA lambda ZAP (Stratagene). Při přenosu plaků se použily nylonové membrány „Genescreen" (DunPont).

Sekvenování DNA

Oba řetězce CWP1-3, 01118, 01i3 a R1-3U21 se sekvenovaly za použtií systému ..Perkin Elmer AB1377 pomocí Microsynth (Balgach, Švýcarsko). Sekvence DNA se analyzovaly pomocí programu DNASIS · (hitachi). Vyhledávání v databázi se provedlo za použití programu BLAST (NCBI).

Analýza RNA

Celková RNA a poly(A)+RNA se .extrahovaly z tkáni za použiti „RNAgent" . (Promega) nebo sady · „FastTrack" (Invitrogen).. RNA . Se' separovaly elektroforézou na 1% formaldehydovém gelu á přenesly' · se ' na membrány Genescreen. Bloty se hybriďizovaly.-* s antisense ribonukleovými, sondami, _kterě se vytvořily'; pomocí značícího křtu DIG · RNA—(Boehringer Mannheim) 1 z relevantních plazmidů. Hybridizace blotů, promývání a podmínky detekce za použití kitu „CDP-star" jsou popsány výrobcem. „Běžná" sonda .EST111410 (TIGR, ATCC, Rodkville, 'MD^- ^USAj'-'obsahuje transkript - A sekvence mezi nukleotidy -2535-4678, sonda specifická' pro exon 1 obsahuje transkript A. sekvence mezi nukleotidy 65^-769 a sonda specifická pro. exon. 2 . obsahuje .'transkript A sekvence mezi nukleotidy. 815-3183. . . ' ; v . - · á \ ' -

Produkce antiséra , i. 'V '

Antisérum 472 (AS 472) se připravilo ’ ve firmě Research Genetics, lne. (Huntsville AL, USA) proti syntetickému peptidu P472,' SYDSIKLEPENPPYEEA (bovinní sekvence, SEQ ID NO: 33) , který odpovídá aminokyselinové sekvenci krysího proteinu Nogo v poloze 623 až 640 SEQ ID NO: 2 se třemi nesprávnými páry.

Antisérum Bruna (AS Bruna) se vytvořilo proti fragmentu rekombinantního proteinu Nogo, který se;’ exprimuje v mikroorganizmu E. coli jako fúzní protein. Specificky C- konec nukleotidové sekvence krysího Nogo A kódující aminokyseliny 7 62 až 1 163 sekvence SEQ ID NO: 2 (exprimovaný v mikroorganizmu E. coli za použití systém Novagen pET) se použil při tvorbě antiséra A*Bruna:proti proteinu Nogo.

Elektroforéza a we.sternůý'přenos SDS-PAGE á w.es.ternův. .přenos.; se ,'provedl za použití standardních metod, které jsou dobře známy v oboru.,Protilátky 92 • · ♦ ««! ·* ·♦ •· ♦ ♦ · ♦ · · ♦ · se ředily * následovně: AS Bruna 1:7, 500, AS -472 1:2 000, anti-myc(9E10) 1:5 000 (Inyitrogen) , anti-BiP 2 pg/ml (Stressgen) , supernatant hybridomu mAb IN-1 se'’ použil neředěný. Jako^ sekundární protilátky se použily:· antikráličí protilátky konjugované s HRP (Pierce, 1:20 000), antimyší IgM (1:50 000) a' anti-myší protilátky konjugovné .s alkalickou fosfatázou ( Analytica AG,.La Roche, Švýcarsko, 1:5 000). . . , ·

Imundhistochemické metody_ · *

Z dospělých krys se rychle- vyňala* mícha--a·- cerebellum, ponořily se do OTC a zamrazily se při teplotě -40 °C. Dvacet posmrtných sekcí se nařezalo a fixovaly se směsí etanolu a kyseliny octové při teplotě .,,40 . °C. Provedlo se .imunologické barvení,*· jak se. popisuje v· publikaci Řubin· et .al·.," 1994, % J.

Neurocytol. 23: ' 209-217 - s výjimkou 'vypuštění? kroku rychlého' chlazeni. V jiném případě se tkáňové sekce .fixovaly metanolem (po dobu 2 minuty, při·' teplotě.' -20 ’°C) a. provedlo se imunologické barvení,, jak J se popísujé' v publikaci Rubin et al., 1994, ,. J. Neurocytol.’· 23: --209-217. Jako '"primární k » protilátky se použily (protilátka: , (ředění))': supernatant hybridomu .IN-1: (neředěno), AS -Bruna: (1:5 000) nebo afinitně čištěné AS 472 (1:50).

Test rozšíření fibroblastů NIH 3T3

Fibroblast NIH 3T3 se ..nanesly na kultivační plotny potažené 5, mikrogramy na jednu prohlubeň (=1 cm2) q-pool. Q-pool jsou smíchané aktivní frakce extraktu bovinní míchy separovaného na koloně Q sefaróza. IN-1 se použily jako \ neředěný supernatant kultury a AS 472 a pre-imunizované sérum se ředilo v poměru ’1:500 v PBS. Aby.se kompenzovaly výchylky ' ' -«ť * · i . aktivity u různých q-pool, množství buněk: nanesených na q-pool se normamizovalp'na .100 .% a na 0% nanesených na kontrolní pufr 93 • #«·· »· ··«# ·· ♦ · .· ·'· · ♦ .· · • · · · » · · · ··· f f· 9 99 999 (popisuje se v publikaci Spillman et al., 1998, J. Biol. Ghem. 273: 19283-93).

Test růstu neuritů DRG

Ganglie dorzálnich kořenů (DRG) se vyňaly z embryi kuřat

El6:’a daly" se ,do Hankova' roztoku s vyváženými solemi·-(HBSS)·,------ rozdělily se na části a nanesly se na plotny předem potažené q-pool ve 100 μΐ média F12 s 10 % ’(FCS) a 1% metocelem. Výrůstky' neuritů z jednotlivých ganglií dorzálnich kořenu se hodnotily po' 24 hodinách při teplotě 37 °G semi-kvantitati-vnim způsobem za použiti měřítka od ,0 (žádné výrůstky) do .4 (maximální výrůstky) · Ί

Ro-kultivačhí test ĎRG a zrakového nervu ‘

Zrakové ’ nervy, se vyňaly z dospělých krys, ozářily se 5 500 Gray a injekcí se aplikovalo s^érum AS' 472 nebo odpovídající preimunizované 'sérum (ředění 1:10)..Páry nervů se kultivovaly ve 3-komorových kulturách tak, že jeden, konec každého nervu dosahoval přes .silikonový tuk/tefionovou kruhovou bariéru do střední komory, kde .se* umístily disociované kultivované primární neurony DRG z krys PO. Po dvou týdnech v kultuře se tyto nervy fixovaly metodami, které jsou dobře známy v oboru a fixovaly se způsobem vhodným pro elektronovou mikroskopii (EM) a připravily se ultratenké sekce ve vzdálenosti 3,5 mm DRG exponovaného kořene. Sekce se systematicky analyzovaly za účelem zjištění přítomnosti znovu rostoucích axonů za použití mikroskopu Zeiss EM 902.

Exprese Nogo v buňkách COS

Otevřený čtecí rámec Ňogo A se subklonoval do vektoru pcDNA3.lmychis " (Invitrogen) za použití standardních klonovacích metod, které jsou dobře známy v oboru. .Výsledný 9 9 9 9 9 w Λ w ' 9. 9 9, 94 · · ·.··* · · l ···.· ··· ·· ··» plazmid (N0G0-mycl9) dává vzniku rekombinantnímu proteinu, který obsahuje sekvenci Nogo A* fúzovanou s myc-his Tag (21 aminokyselin) . Nogo-mycl'9 (2 μg DNA’ na'plotnu o -průměru 35- mm)' nebo kontrolní plazmid (pcDNAmychisLacZ) se transfekovaly do buněk COS za -použiti kitu „Superfect" (Qiagenj podle protokolu i 1 · · .„ výrobce".* ,_Na základě imunofluorescenčního barvení s protilátkou anti-myc a enzymatickou barevnou reakcí s β-galaktozidázou se odhadl průměrný poměr transfekce na ’ hodnotu přibližně 20 %.

Transfekované buňky . COS se fixovaly směsí .'95 % etanolu a 5% kyselinou octovou : (při ; teplotě 4' . 0O po' dobu' 25 minut), blokovaly se směsí PBS a 10 %. FCS a inku.bovaly se sérem AS Bruna .(v ředění 1:200)- nebo IN-I (v ředění .1:2) po dobu 2 hodin· ve' směsi .:PBS a 1% FCS při· teplotě místnosti. Buňky se pr.omyly PBS a t při detekci, IN-1 se použily, kozí protilátky a.nti-myš-TRlTC (popisuje se ’ v publikaci Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, PA).

Kultury oligodendrocytů . Oligodendrocyty izolované z mozku nově narozených krys se umístily do polylyzinových nádob o objemu 75 cm2 (Sigma, St. v

Louis, MO) a kultivovaly se po dobu 10 až 12 dní v DMEM doplněném 5 % FCS. Obohacená -smáčená populace oligodendrocytů a jejich potomci se uvolnily z astrocytové monovrstvy mícháním přes noc při 210 otáčkách za minutu v orbitální míchačce. Buňky se nanesly na plotnu při hustotě 1 až 2 x 106 buněk o ploše 35 cm2 potažené, polylyzinem. Potomstvo se nechalo diferenciovať v chemicky definovaném médiu (CDM) po dobu 3 až 4 dni.

Biotinylace buněčného povrchu . Připravily,-· se. kultury' celého mozku krys P4, jak se popisuje’ v publikaci van‘der Haar, et al., 1998,. J. Neurosci·.'

Res. 51: 371-81). V děn 7" in vitro se biotinylovaly s EZ-LINK- 9 ·#%· ym*' ·· 95

9 * · ···

Sulfo-NHS-LC-Bio.tin (Pier.ce) , který nevstupuje do buněk podle popsaného postupu s výjimkou, že. všechny kroky.',; se- prováděly při teplotě 15°C a buňky se lyžovaly v 1 ml lyzačniho pufru (0,05 M NaH2P04 pH 8,0, 0^15 M NaCl, 0,5% .CHAPS (Sigma)·, 2,5 mM jodacetamid, lmM fenylmetylsulfonylfluorid, 0., 1- 1 2 3 μg/ml * 2 2 12 # pepstatinu A) . Bio.tinylované proteiny Se imunologicky, srážely 1 pomoci, přípravku Dunabeads M-280 Streptavidin (Dynal) provedl se s nimi analýza· SDS-Page a přenesly se ,na . nitrocel.ulózové. membrány, které se' testovaly použitím.' AS472, a-BiP a α-β- 2 · t "2· tubulinu. Membrány se. s^tripovaly za použití sady Re-Blot Western..Blbt ;Recyckling (Chemicon) . .’ · 3 a “ 2 a - -

Imunocytochemické metody k Oligodendrocyty zrakového nervu se připravily způsobem, který se popisuje v publikaci Achwab and Caroni, 1988, J. ' · r .

Neurosci. 8: 2381-2393). Dva dny staré kultury se inkubovaůy • » ' < '. se sérem AS 472 (v . ředění 1:200) nebo monoklonální látky ' IN-1 (v ředění 1:3) po dobu 25 minut při teplotě místnosti (RT) . Kultury se promyly, fixovaly směsí 4 % paraformaldehydu a 5 % v ... ' . , sacharóz.ý v PBS a blokovaly se směsí 0,1 M kyseliny maleové a 2% blokačního činidla (Boehringer Mannheim) po dobu 1 hodiny. Sekundární protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (Milan Analytica) se použily v ředění 1:7 500 ve směsi 0,1 M kyseliny maleiové a 1% blokačního činidla (po dobu jedné hodiny a při teplotě místnosti). Transfekované buňky COS se fixovaly směsí 95 % etanolu a 5% kyseliny octové (při teplotě 4 °C, po dobu 25 minut) , blokovaly se a inkubovaly se sérem AS Bruna (v ředění 1:200) nebo s mAb IN-1 po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Buňky se nechaly reagovat s kozími anti-králičími-FITC protilátkami a kozími anti-myšími-TRITC protilátkami (Jackson Immuno'Research Lab) . r . · * $

Komora vhodná pro zrakový nerv ·' · 96 ·♦ ·♦*· * ·· ···· ·« ♦ * · % · # ·.·'+· · · ··· ♦ Páry zrakového nervu se . kultivovaly ,v. 3-komorovém kultivačním, systému, jak se popisuje v publikaci Schwab eť al., 1988, J. Neurosci. "8: 2381-2393) a injekcí se aplikovalo * , , í * AS·472 nebo odpovídající preimunizované sérum (v ředění 1:10). + » , . '

Zrakové nervy· se fixovaly způsobem vhodným pro elektronovou IrTikr os kopií , (EM)-—a- připrav-il-y-—-se——ultratenké , sekce ,ve vzdálenosti 3,5 mm-,DRG exponovaného kořene. -Sekce . ’ sé- . ' ** r- ···».' systematicky, analyzovaly -za účelem zjištění .přítomnosti znovu * % ' - -s . j * 1 . - ' rostoucích axonů za použití mikroskopu Zeiss EM 902. > . ^ i Výsledky experimentů . - ; t ' ·* ' Dále'v textu se uvádějí~experimentální výsledky získané za .použití metod popsaných shora v textu.

Izolace cDNA Nogo ·. ' ··

Bovinní homolog krysího N1-250 .se čistil a štěpením. prot.eiriázou se připravily peptidy - čištěného proteinu. Podle * .1 * » šesti různých peptidových sekvencí bNI220 se připravilo velké množství . 'degenerovaných oligonukleotidů značených digoxygeninem. Několik -klonů cDNA se izolovalo při testování knihovny bovinní.bílé hmoty za použití těchto oligonukleotidů. Inzert nej delšího klonu (CWPl-3, zobrazený na obrázku č. la) se požil k syntéze sond v případě následného testování krysí cDNA knihovny. Vybrané klony z takového .testování se zobrazily na obrázku č. la. Analýza DNA sekvence těchto klonů cDNA naznačuje, že tři různé transkripty pocházejí z jednoho genu a tento gen se označil.jako gen Nogo. Odlišné transkripty jsou pravděpodobně výsledkem alternativního použití, promotorů a alternativního sestřihů (Nogo A, Nogo B a Nogo C, zobrazeno na obrázku č.' lb) .' Sekvence DNA se /kompilovaly z klonů ' . -í · -.· , * ’ < ' zobrazených na’ obrázků č. 1A za.vzniku transkriptu A, přičemž sekvence DNA uvedeného transkriptu je uvedena’ na obrázku č. 2a.

Pojmová translace tři transkriptů vede ke vzniku ' proteinových produktů označených Nogo A *(1163 aminokyselin) , i v

Nogo B (360 aminokyselin)* a’ Nogo C (199 .aminokyselin) . Protože- * · · t* ‘

Nogo. A—obsahuje všech šest—peptidovýoh sekvenci získaných z čištěných bNI220r (zobrazeno na obrázku č. 2b), je . pravděpodobně' ekvivalentní s čištěným profeéiném. i krys i NI-250. Nogo A, B- a C vykazuje běžný C-konec 188 aminokyselin (běžná • obiastr)—* !a , Nogo * A -· a · B-* .sdílí, N-konec. . .obsahující _ .172 aminokyselin.. Nogo A. je delší než Nogo B'o, „8.03 aminokyselin, což.způsobuje alternativní sestřih. ' Žádné z izoforem Nogo nevykazuje. hydrofóbní pruh atrii no kyselin na N-konci, který by se mohl.-použít jako běžný signální peptid. Avšak popsaly se proteiny, ‘kterým chybí běžný signální peptid, ale stále procházejí 'membránami, jako je například fibroblastový růstový ·- faktor ' (popisuje se v publikaci Elorki.ewicz et al., 1995, J. Cell. Physiology 162: 388-399), ciliární neurotrofický faktor (popisuje se v publikaci Sendtner et al., 1994, J. Neurobiology 25: 1436- 1353) . a interleukin-1 (popisuje se v publikaci Rubartelli et al., 1990, EMBÓ J. 9: 1503-1510). Membránové proteiny, jako je například „commissure.less" (popisuje se v publikaci Tear et al. , 1996, Neuron 16: 501-514), které také nevykazují signální peptid, se začlenily do membrány. Ačkoli v putativní 5'nepřekládané oblasti neexistuje stop kodon, který by jednoznačně definoval počáteční kodon, následující důkaz ' naznačuje, že methionin indikovaný na obrázku č. 2a je počáteční kodon Nogo A a Nogo B: (1) sekvence kolem uvedeného„ předpokládaného startovaciho kodonu souhlasí se sekvencí ; počátečních míst translace (GCCGCC*. A/,G CCATGG, SEQ ID NO: 39),/--(2). ..Velké úsilí se věnovalo vyhledávání . více • 98 • + *·« ·· «·♦· ·· · » · • • · · • · ·· • -· • · . t • • • · · • · · ·· · • ·· ·', ·· ··

„upstream" ‘sekvenci tetsovánim knihovny a 5'-Race. Žádný z ’ těchto průzkumů nevedl k identifikaci více „upstream" sekvenci, a (3) eukaryontní' rekombinannťí protein Nogo A se,ěxprimoval ze shora uvedeného methioninua vykazuje zjevnou molekulovou hmotnost okolo 200 000, jak se odhaduje pomoci testu SDS· PAGE, který se může odlišit od endogenního proteinu Nogo A, jenž pochází z krysích oligodendrocytů (zobrazeno na obrázku "čT 11a)·. , ' ’ * :: " ' . .. '·

Analýza 'sekvence Nogo "

Protein Nogo A obsahuje potencionální N-glykósylační místa, avšak biochemickýdůkaz indikuje, .že portein .Nogo' A nevykazuje hlavní : polysacharidový komponent. .Portein· Nogo A také vykazuje devatenáct míst, které rozeznává. PKC a sedm míst, které rozeznává -.kaseinov.á kináza .11 . (obrázek . č. 2a). Všechny tři'-proteiny Nogo ;mají dvě.běžné.hydřofóbní oblasti C-konce, které obsahují 35 a:'36-aminokyselin.-' Libovolriá z nich nebo obě se mohou použít jako 'trans- nebo intramembárnóvé oblasti, které jsou kdnzistentní s vharakterizací bNI220, jako integrálový membránový portein. Protein Nogo .„A (stejně jako Nogo B a C) neobsahuje žádné motivy známých buněčných adhezívních molekul, proteiny extrabuněčné matrice nebo jiné molekuly.

Sekvence Nogo se použily k průzkumu různých databází za účelem vyhledání homologních genů. Běžná oblast C-konců tří produktů Nogo je podobná (62,5 %) s identifikovaným lidským genem nsp (cll3 a s-rex u krys a chs-rex u kuřat) (zobrazeno na obrázku č. 3) . EST z mikroorganizmu C.'elegans a Drosophila melanogaster EST také vykazuje podstatnou podobnost (16,6 % a 13,6 % ) s oběma, geny Nogo a nsp v této stejné oblasti. 180 aminokyslein oblastí C-konce obou protein Nogo a Nsp jsou vysoce konzervativní ve-všech druzích savců (98,3 % a. 97,3 %), což naznačuje, že že mohou' uskutečňovat stejné a podstatné 99 Ι· ΜΙ· « ···· • · · · · • · · • · · · · · · 1·· -

* Μ ·»« funkce. Mimo tuto oblast podobnost s daným proteinem mezi druhy je také vysoká (73' % mezi krysím a bovinním proteinem Nogo A, 76,2 % mezi NSP-A a S-rexb, 50 % 'mezi Chs-rexb a NSP-A nebo S-rexb). Podobnost mezi NSP a Nogo je však - omezená na· jejich hydrofóbní, běžnou oblast C-konce (obrázek či 3a) a na kyselou podstatu proteinů vně této konzervativní oblasti. NSP (NSP-A, -B. a -C)se už drive popisují jako neuro-endoícrinní specifické produkty se známými funkcemi. Hybr.idizace . in šitu a imunohistologie vykazuje neuronální lokalizaci NSP v nervovém systému. Identifikoval se jiný lidský gen nsp-like-l, který také obsahuje C-terminální hydrofóbní oblast s 50 % podobností s Nsp a Nogo.

Exprese proteinu Nogo, v’ tkáni

Expresívní patern Nogo se testoval northernovým přenosem a hybridizací in šitu. Když se použila běžná· sonda (popisuje se shora v textu) detekovaly, .se ve zrakovém nervu, míše a v mozkové kůře tři hlavní transkripty Nogo (označené : A, 4,6 kb, B, 2,6 kb a _ C,1,7 kb) (zobrazeno na obrázku č. 4a). V gangliích dorzálriích kořenů se detekovaly pouze dva větší transkripty. Hlavní transkript obsahující 2,6 kb se detekoval v buňkách PC12, zatímco pruh obsahující 4,6 kb se detekoval pouze po dlouhé expozici (zobrazeno na obrázku č. 4a). U sciatického nervu se detekovalo menší množství transkriptů, přičemž pruh odpovídající velikosti 2,6 kb byl hlavním transkriptem. Když se poly(A)+RNA míchy· a buněk PC12 hybridizovaly se sondou specifickou pro exon· 1 detekovaly se pouze transkripty odpovídající 4,6 kb a 2,6. V případě, že se hybridizovala poly(A)+RNA zadního mozku a skeletálního svalu se sondou specifickou pro- exon 2, detekoval se pouze transkript odpovídající 4*,6 kb (zobrazeno na obrázku č. 4b). Tyto výsledky potvrdily transkripční mapu zobrazenou na obrázku č. 1B,. Výsledky northernova blotu však ukazují,.že exprese proteinu Nogo není omezena na nervový systém (zobrazeno na • ·· ···.1 2 • ·· ···· • 2 · · ·· · • · ·· ·- .100 ··♦ - · • • · ♦ ·· · • ♦ · ·· ··

obrázku' č. ' 4c)'. Transkripty Nogo'r se také detekovaly' 2 v skeletovém svalu (odpovídá velikosti 1,7 kb), v ledvinách 1(2,6 kb a 1,7 kb), ' v chrupavce (pocházející z. prsní kosti, < odpovídá 1,7 kb),' v kůži (odpovídá velikosti 21,7 kb), v plicích (odpovídá velikosti 2,6 kb), , a slezině (odpovídá( '' . _ velikosti 2,6 kb). S výjimkou skeletálního · svalu, ve kterém·.

I 1 dochází k expresi transkriptů Nogo C ''ve velkém množství, ·'' množství transkriptů Nogo'· vně nervového systému je nižší než je množství transkriptů v nervovém 'systému. -Zdá se, že .·. -. ' transkripty Nogo ‘ A· Odpovídající velikosti 4,6 kb se jeanoznačně přepisují v nervovém systému. 2 , % Při hybridizacích in sítu sekce . tkáně CNS dospělých ' krys za. použití běžné sondy vykazovaly slabé. . značení čar v těle buňky v bílé hmotě ...různých částí mozku ,a míchy. Toto uspořádání .Toto .uspořádání je typické pro . interfasciculární .oligódendrocyty- (obrázek ‘ č. 5a,d). Vedle, oligodendrocytů několik typůneuronů .také exprimuje transkripty_Nogo ve vysokém množství (obrázek č. 5c^ e) . V. případě‘ malého mozku dvakrát barvené sekce s protilátkou anti-GFAP a in šitu hybridizace jasně vykazují silné značeni buněk Purkinje sondou Nogo, zatímco astrocyty nebyly značeny (zobrazeno na obrázku č. 5e,f). Při vyvíjení zrakových nervů se detekovaly transkripty Nogo už v postnatální den 0· (PO), to znamená několik dní před tím, než se mohly detekovat mRNA hlavních myelinových proteinů proteolipidového proteinu (PLP) a myelinového základního proteinu (MBP) (zobrazeno na obrázku č. 6). Uvedené načasování je konzistentní s-objevením prvních oligodendrocytů, které jsou pozitivní na galaktocerebrozid a exprimůjí inhibiční aktivitu růstu neuritů,- která může být neutralizována IN-1.

Vytvořilo·· „ se. . antisérum proti .syntetickému peptidu . založenému na specifické' :sekvenci bovinního proteinu Nogo A (AS 472) a proti re.kombinantnímu, částečnému· krýsímu. proteinu Nogo A. o molekulové hmotnosti 45 000 (AS· Bruna);. Sérum AS 472

i ,.a AS Bruna.rozeznává protein' o· přibližné molekulové hmotnosti 200 000· v bovinnim, .myelinu . a sérum 'AS' Bruna rozeznává dále krysí myelinový protein o molekulové hmotnosti 200 . 000 na jí , westernových blotech· (zobrazeno na obrázku Č. 7) .,' Sekce míchy a malého mozku z dospělých krys se'barvily pomocí AS 472, AS Bruna a IŇ-1. Když ’se sekce 'fixovaly, směsí, etanolu a kyseliny octové· (dříve zobrazený postup se zdá být.- nutný při ochráněna dostupnosti antigenů -IN-1) ·silné obarvení bílé hmoty/myélinu se dosáhlo .z apoužiťí všech tří protilátek (zobrazeno na obrázku č. 8). Barvení těl oligodendrocytových buněk bylo zvláště zřetelné se sérem AS Bruna· Ošetření čerstvých zmražených sekcí metanolem místo směsi etanol a kyslein aoctová se dosáhlo obarvení myelinu s výjimkou těl olígodnedrocytových buněk. .. . Sérum .AS Bruna a AS 47.2 také r: obarvilo některé typy neuronů,”"které' zahrnují .řídící neurony v míse a garnulární a molekulovou vrstvu v malém mozku. Buňky Purkinje se silně obarvily pomocí AŠ 472 a As Bruna,.. ale nedošlo k detekci barvením s IN-1. v ' ·

Protilátky Nogo inhibují in vitro inhibici růstu indukovaný Nogo Přípravek semičištěné bovinní míchy NI-220 (q-pool) může předcházet rozšíření fibroblastů NIH 3T3 a tvorbě výrůstků neuritů. V přítomnosti antiséra Nogo se snížila inhibiční aktivita buď AS Bruna, AS 472 nebo IN-1, . q-pool.' To znamená, že fibroblasty NIH 3T3 se rozšířily a neurity ganglií dorzálních kořenů (DRG) rostly na, plotnách potažených q-pool (zobrazeno na obrázku č.‘ 9). Spécificta se projevila přidáním peptidu P472, kterým.byl peptid používaný k vytvoření AS 472 (popisuje se shora v textu).. P472 úspěšně blokuje inhibiční účinek AS 472,..' zatímco kontrolní peptid neměl účinek na inhibici. ' · ' * :»f 102

« ' ' · · . 4 ' . v Přítomnost proteinu Nogo A na oligodenrocyty na bunecnem . 1 povrchu" se demonstroval imunbcytochemicky, funkčně . -"a biochemicky za, použití· AS 472. Když se, živé primárně kultivované oligodendrocyty obarvily buď mAb IN-1 nebo AS 472,, pozorovalo u se relativně slabé (ve srovnání

oligodendrocytech (zobrazeno na obrázku č. 15 a, c) ., 'Vedle konkurenčního peptidu "(P 472) v případě AS 472 nebo vynechání primární . protilátky se.. . eliminovalo specifické. barvení (zobrazeno na obrázku č. „ 15b, d) . Biotinylace buněčného povrchu, a následná, precipitace streptavidinem dále prokázala přítomnost porteinu Nogo A v plazmatické membráně

ů. Ve sraženině. AS’ 472. detekoval pruh, který se nachází : nad intracelulárním, ’ pravděpodobně nezpracovaným a neglykosy.loyaným; ·AS 4 72 imunopozitýním 'pruhem. ER protein BiP by se .· nemohl 'detekovat v biotinýlbvahé , frakci (zobrazeno na obrázku č.. 15e) . * ' '1, ·

Protein Nogo A jako povrchová molekula oligodendrocytu se také funkčně analyzoval. Společná, kultivace oligodndrocytů a. * ř V* fibroblastů NIH 3T3 nebo oligodenrocytů a neuronů DRGjasně ukazují inhibiční vlastnosti zralých oligodendrocytu. Tyto testy demonstrují, že fibroblasty NIH 3T3 a neurity DRG, silně vyhýbaly oblasti oligodendrocytů, přičemž tento účinek se neutralizoval monoklonální protilátkou In-1. V přítomnosti AS 472 se tato inhibice redukovala rovnou měrou (zobrazeno a aobrázku č. 16a, b, c a e, f) , zatímco preinkubace AS 472 s P472 obnovila' 'inhibici zprostředkovanou oligodendrocyty (zobrazeno na obrázku č. 16 c, d a g, ’h),. Kvantifikace vykázala vysoce ' podstatnou .neutralizační. kapacitu monoklonálnich protilátek IN-1 a AS 472 v jbbou typech testů (zobrazeno na obrázku 16i a j).

• · · · 103 ·-·'1 2· ·· .2· ·.· ^ ···· ··· ····· ’ · ' · 2 i .;·

RecNogo-A (obrázek č. 17a) produkovaný stabilně transfekovanou buněčnou linii CHO se testoval za účelem zjištěni jeho aktivoty . na rozšířeni řibroblastů. NIH 3T3 a aatvorbu výrůstků DŘG neuritů.·. Rekombinantně produkovaná β-galaktozidáza -izolovaná· ze stabilní buněčné' linie CHO (CHO-lacZ) ’se obohatila paralelně recNogo-A a . použila se jako kontola- .inhibiční aktivity endogeriníčh.. proteinů . CHO v obou testech.. V testu rozšíření fibroblastů NIH 3T3 extrakt CHO obsahující recNogo-A (Nogo A: přibližně .1 až .5.'% .celkového proteinu, obrázek č. 9á) vykazoval jasné inhibiční účinky na

1 rozšíření buněk při·hustotě· 10 μς/οΜ2 . (zobrazeno na obrázku č. 17b) . Tento účinek ;závisí -na dávce: při-hustotě. 20 ^g/cm2 byla 2 ř .-2'2· - 2 Λ inhibiční aktivita vyšší,.zatímco při hustotě 5 ^g/cm nedošlo k .žádné inhibici (data . nej sou uvedeny) . Inhibiční aktivita by se mohla neutralizovat'-na- úroveň pozadí, preinkubací potaženého proteinu s monoklonální protilátkou^ IN-1 nebo AS Bruna, - ' r zatímco kontrolní ' protilátky proti ' 'preimunímu séru galaktocerebrozidu. (mAb 01)v nebo AS Bruna2 neměly žádný účinek (zobrazeno na obrázku č. 17b). ·" .

Vedle silného účinku na rozšíření fibroblastů NIH 3T3 , CHO extrakt obsahující recNogo-A, ale nikoli .-extrakt CHO-LacZ vykazují potencionální inhibiční účinek na růst neuritů z primárních kultivovaných neuroů: Disocióvané neurony DRG se inhibovaly pomocí recNogo-A způsobem, 'který je závislý na dávce (zobrazeno na obrázku č. 17c). Tato inhibiční aktivita by se mohla neutralizovat monoklonálnimi protilátkami In-1, ale nikoli kontrolní monoklonální protilátkou Ol (zobrazeno na obrázku č. 17c až e). Rekombinantní protein izolovaný z CHO-LacZ nevykazoval inhibici v množství 1 a 5 mikrogramů a vedle monoklonálních protilátek Ol nebo IN-1 neměly žádný účinek na vytvoření výrůstků neuritů.

Opětný růst neuritů in vitro .. ’

Zkoumala se schopnost nově narozených krysích DRG neuritů regenerovat a, prorůstat dospělou tkání CNS. Páry zrakových nervů se*, vyňaly z dospělých krys . a kultivovaly se ve speciálním komorovém · kultivačním systému: tak, že - DRG neurity-měly přístup k' jednomu konci každého’" nervu (zobrazeno *na Obr a zku^č; ' 10a) :—V každé kultu ře se do- jendoho z nervů inj ekcí aplikovalo preimunizované králičí .sérum .a 'do druhého -nervu se ,injekcí aplikovalo sérum AS 472, které ' je také přítomné v bořné komoře okolo nervu. Následují dva týdny in vitor -v přítomnosti. NGF, · kultury se fixovaly, rozebraly, a fixovaly se" za- účelem zkoumání elektronovou mikroskopií (EM) . EM sekce šé odebraly ve vzdálenosti 3,5' mm od konce nervu v(kontaktu s neurony DRG. Nervy, kterým · se injekcí aplikovalo preimunizované, sérum, theobsahov.aly. nebo obsahovaly pouze několik.- axonů (zobrazeno na obrázku č. 10b) /- . Později se nalezly pouze: ve: spojení,. z bazální membránou a astrocyty na povrchu nervů. Naopak . .většině optických nervů' se , zavedlo injekcí AS 472 obsahovalo- podstatné množství axonů, často až několik stovek. Také je často -možné' vidět kontakt, s -myelinem (zobrazeno na obrázku č. 10c, d) .

Rekombintní Nogo na rozeznávání pomocí IN-1 V případě, že se Nogo A exprimoval jako karboxyterminální rekombinantní protein značený myc-his v transfekovaných buňkách COS, wetsernův přenos za.použití protilátek proti' myc a AS Bruna demonstrovaly, že rekombinanntí Nogo A má zjevnou molekulovou' hmotnost přibližně 200 000,' což se zjistilo na denaturačnim S.DS gelu,, (zobrazeno na obrázku č. 11a).- Na-stejném blotu se detekoval v primární kultuře -krysích oliodendrocytů pruh -se stejnou mobilitou: za pomocí séra AS Bruna, což naznačilje, že rekombinantní - Nogo A má skoro identickou molekulovou hmotnost jako /endogenní·'. Nogo A z oligodendrocytů (zobrazeno na obrázku, č. la) . · Když se 105

transfekované buňky obarvily imunofluorescenči pomocí In-1 a AS Bruna, IN-1 a 'AS Bruna- rozeznávaly stejné transfekované buňky (zobrazeno na · obrázku ‘ č. . 11b, . , c) . Většina imunoreaktivity se lokalizovala uvnitř v buňce a byla dostupná' pouze po permeabiližaci.

Mapování aktivní oblastijí).Nogo · Série delečních mutantů Nogo se vytvořila, za účelem mapování inhibiční oblasti(íj proteinu Nogo. Deleční konstrukce genu -Nogo —se -- vytvoř-i 1a - : -použitím .. .vnitřního'„i. restrikčního místa, štěpením exoríukleázou III z fazolí mungo a polymerázovou řetězcovou reakcí. Popis* utací se popisuje na obrázku č. 18 a shora v textu.’ Většina, konstrukci má N-konec . označený T7 za účeišem .identifikace monoklonálními protilátkami, proti :T7 a dále obsahuje N- nebo C-terminálni heKahistidinovou značku („His-tag"), která .se využívá _pri. čištění imobilizovanou i i · ’ o

Co(II)-afinitní chromatografií. Deleční mutanti Nogo, které se nazývají NiG-Dl, NÍG-D2 až NÍG-D20 sé také- testovaly za použití testu rozšíření· fibroblast. NIH ' 3T3,1 aby se stanovila inhibiční·. aktivita. .Někteří mutanti se testovaly při tvorbě výrůstků neuritů PC12, ' při tvorbě· výrůstků disociovaných krysích DRG neuritů nebo testů za použití retinálních ganglií. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 2 dále v textu..

Tabulka č. 2: Funkční aktivity delečních mutantů Nogo 3T3 PC12 DRG RGC Nogo-A ++ + "f Nogo-B + Nogo-C - > - NiAext + + + + EST + /- · , ’ i NiR + ..." f **

• ' · • · ·,

106 J*

NiG ++ ' . · 1 ‘ . * * NiG-Dl + i NÍG-D2 + . / * NÍG-D3 + + y NÍG-D4 + ' NÍG-D5 ·' NÍG-D7 + ; . NÍG-D8 NÍG-D9 + ·v ; 4 NiG-DlO + /- _ , ί ΐ NÍG-D14 . ‘ NiG-Dl5- ' : +" NiG-Dl6 .+ * F NiG-Dl7 . «i - 1 + , · NiG-Dl8 + NÍG-D20 ++ v*

Pozitivní .výsledek v testu fibroblastů NIH 3T3 (3T3) nebo v testu PC12 se- hodnotil/ když se' inhibovalo rozšíření fibroblastů.nebo buněk PC12 na plotně potažené přípravkem Nogo získaného z deléčniho mutantu. Pozitivní výsledek y testu růstu ganglionu dorzálních kořenů embrya kuřete (DRG) nebo testu růstu kónusu ganglionu (RGC) indikuje, že růst neuritů se inhibuji nebo že růst je zpomalen v přítomnosti přípravku Nogo, který se získal z delečního mutantu.

Data naznačují, že hlavní inhibiční oblast se identifikovala ve specifické oblasti Nogo-Δ z aminokyselin čísla 172 až 974, zvláště aminokyselin čísla 542 až 722. Navíc A-terminální sekvence. Nogo.A a Nogo-B (aminokyseliny číslo 1 až 171) také inhibuji· rozšíření 3T3. Na základě výsledků oblasti Nogo obsahující aminokysleiny číslo 172 až 259 a975 až 1162 se jeví být * nepodstatné a mohou se odstranit, aniž dojde/ ke ztrátě, aktivity. ' 1 * : 107 • · ··· ··· ···· ·· · 4·· ··· Přiklad 2': . Nukleové kyseliny lidského Nogo a proteiny, deriváty a fragmenty

Vynález popisuje nukleotidové sekvence kóduj. ící lidský protein Nogo a fragmenty, lidských .proteinů Nogo, které zahrnu j i—lidské ^ekvivalenty “S- krysím proteinem Nogo A, —Nogo- B- a ,část Nogo C.. Lidská' .aminokyselinová sekvence Nogo je * .znázorněna na .obrázku č. 13 a je zobrazena v. sekvenci SEQ ID NO: 30.

Vynález dále popisuje nukleotidové sekvence fragmentů lidského genu Nogo. Nukleotidové sekvence ..lidského Nogo se může 'stanovit .za ‘použití krysího transkriptu Nogo A s cílem uspořádat a sestřihem . upravit dohromady .lidské exprimované sekvence .tag (EST), které jsou homologní ^se -sekvencí krysí nebo bovinní cDNA. EST AA0817 8 3 a AA333267 (popisuje se shora v textu) se vzájemně překrývají ·. a odpovídají nůkleové kyselině krysího proteinu Nogo A (Obrázek č. 2a,. .SEQ ID NO: 1) v polohách 765 až 1 272. EST AA322592, AA092565 a ΆΑ081525 (popisuje se. shora v textu) se také vzájemně překrývají a a překrývající se sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 642 až 2 131. Tyto dvě nezávislé sady překrývájících . se ESR se nemohou uspořádat za vzniku lidské sekvence, aniž se provede přímé porovnání za použití počítače s nukletidovou sekvencí krysího nbeo bovinního Nogo podle vynálezu. V případě počátečního počítačového uspořádání se preferuje ENTREZ Nucleotide QUERY. Jiné počítačové programy pro uspořádání se popisují shora v textu jako alternativní příklady, přičemž neomezují výběr programů, které, se mohou použít pro tyto účely. 7 i .

Diskuze

Klonování inhibitoru růstu neuritů Nogo

108 «· ···· ·· • · + · · • · · · · ·· · ·· ···

Protein Nogo A má řadu vlastnosti, které podporuji to, co se dříve napsalo o krysím NI-250, což je hlavní inhibiční protein růstu . neuritů CNS myelinu a o antigenu IN-1. Na molekulové úrovni všech šest peptidů se původně získalo sekvenováním bNI-220, což je nejvíce .inhibiční komponent • 'bovinního míšního -myelinu.· Na-'úrovni - exprese oligodendrocyty. jsou hlavní buněčný typ u dospělého CNS v případě exprese "Nogo A a načasování -exprese Nogo ve zrakovém -nervu souhlasí s dřívějším, popisem IN-1 neutralizované myelinové 'inhibiční 1 akcivicy • růstu neuritů......Westernův - přenos ’ .ukázal přítomnost porteinu Nogo A v aktivních frakcích q-pool a bílá hmota z různých .oblastí CNS se obarvila sérem AS Bruna, stejně jako s . AS· .4.72 (specifické pro protein Nogo A) u pacienta identického S'·.·’pacientem IN-1, . Obě tyto skutečnosti souhlasí s interpretací, že Nogo .A.je NI-250. . - Dvě antiséra vytvořená proti sekvencím Nogo A, což jsou AS Bruna a AS 472, velice snižují inhibiční aktivitu částečně čištěného bovinního míšního přípravku (q-pool). Sérum AS 472 také umožní'· prorůstání velkého množství axonů ganglií dorzálních kořenů do e.xplantátů dospělého zrakového nervu, což je velmi podobné jako v případě IN-1. Ačkoli vypočítaná molekulová hmotnost proteinu Nogo A je přibližně 140 000, vykazuje zjevnou molekulovou hmotnost na denaturačním gelu SDS přibližně 200 000, což je v rozmezí předchozího odhadu hodnoty okolo 250 000. Aberující pohyblivost Nogo A na gelech SDS je pravděpodobně způsobena svou kyselou povahou spíše než post-translační modifikací. Aberující pohyblivost proteinů na SDS-Page se také stanovila pro jiné vysoce kyselé proteiny , jako je s růstem spojený protein GAP-43, stejně jako NSP-A. Bakteriálně exprimovaný rekombinantní Nogo A vykazuje' stejnou zjevnou molekulovou hmotnost jako je' hmotnost endogenního Nogo A exprimovaného 109 • ·♦·· ·« 9000 ·· · ·· · · · · 0 9 00 • · ···♦·· . · · · · ♦ 0 0 0 0·0· 09 0 09 909 krysími oligodendrocyty: To namítá proti hlavním modifikacím proteinu Nogo A mechanizmem, jako je glykosylace.

Nogo bráni regeneraci a omezuje plasticitu dospělého CNS

Exprese proteinu Nogo v oligodendrocytech krysího op ti ckého - ner vu - z PO— souhlas í — s dř i věj ším - z j ištěním,-- že IN-1 neutralizuje inhibi-ční akťivitu rlstu neuritů. Tato exprese předstihuje expresi hlavních myelinových proteinů a' tvorbu kompaktního myelinu -o několik- dní. Výskyt .proteinu -Nogo pravděpodobně jako odezva -na axonální signály. může... předcházet axonovému růstu v odpovídajících vláknitých drahách (maximální počet axonů při E20 v krysím zrakovém nervu). Protein Nogo může také inhibovat kolaterální formaci a tím stabilizovat •obecnou strukturu diferenciovaného CNS. V šedé hmotě mozkové různých oblastí ČNS obsah myelinu a IN-1 imunoreaktivita koreluje nepřímo s množstvím GAP-43 a s-potenciálem plasticity dané obTasti. Protilátky IN-1 aplikované do dospělého CNS umožní, že. se ' v mozkovém kmenu objeví klíčení a plasticita a mícha se prodlouží, což je známo pouze u CNS novorozenců. Velké obnovení funkcí, což' ·přichází paralelně s plasticitou, indikuje, že klíčící, axony jsou schopny tvořit funkčně vhodné propojení. Dříve se ukázalo, že odezva neuronů na inhibiční proteiny Nogo se liší podle stáří neuronů. To je způsobeno diferenciální expresí receptorů, které budou snad brzy charakterizovány. Jako v případě Netrinů a řady. růstových fakotrů existence různých receptorů Nogo, které způsobují různé odezvy, zůstává možnost. Skutečnost, že proteiny Nogo se také exprimují v některých typech neuronů, zdůrazňuje možné interakce mezi stejnými a různými izoformami Nogo.

Nogo patří do nové rodiny molekul regulující neurity • • · • ·♦·· • • ·♦ ··Φ ♦ • ♦ · • · · «1 • « ·· * · · 110 • ··· • • • ♦ ♦ ·· · • · · • Φ ··

Sekvenční analýza proteinu^ Nogo ukázala neznámé motivy buněčných povrchových a matricových proteinů, které . se podílejí na-axonálním řízení (repulživní .nebo atraktivní). To znamená, že se nenašel žádný imunoglobulin, fibrinektin typu III nebo oblasti EGF. , Ani neexistuje homologie s popsanými inhibitory •neurálního růstu, se' semaforiny, netriny " ani ^__v; .♦ __* , · _ _ ._ _- __· v . * efriny. .

Proteiny Nogo .tvoří nové rodiny se skupinou současně popsaných proteinů ” založené na podobnosti jejich karboxyteminálnich—180' Λ aminokyselin_____Jsou to proteiny NSP/s- rex a NSP-like 1. Jako' v případě Nogo použití alternativního promotoru '(gen .Nsp a Nsp-like 1) a alternativní sestřih (pouze Nsp) j sou odpovědné, za produkci a.lteraritivních, proteinových produktů s běžným karboxylovým koncem, který obsahuje dva pruhy hydrofóbních aminokyselin. -NSP. ·. (neuroendokrinní

e" , . 1 · 'v ’ ' " : !·' . V specifické proteiny) se exprimují -převážně v neuronech a v několika typech endokrynních buněk. ·- Lokalizují se hlavně ' -Τ' ' i 4 uvnitř buněk ve spojení; s e ndop 1 a zrna r. i c k ým r e t i ku i em. Funkce rodiny NSP ani. Nsp-like 1' nejsou .známy. Skutečnost,' že potencionální' ortológy existují jak u organizmu C. elegans a Drgsophila ' mal.anogaster naznačují,· že' Nogo se schopností regenerovat nervy a vykazovat inhibiční aktivitu se můžezahrnout do rodiny NSP a stát se nepopsaným členem této rodiny.

Nogo v tkáních, které nejsou neurální

Transkript Nogo se exprimuje ;v kosterních svalech v množství, které je srovnatelné s množstvím exprimovaným v nervovém systému. Jednou z představitelných - funkcí svalového proteinu Nogo C odstranit motorické axony a omezit je na ' ' ·... * motorickou oblast. Slabá exprese Nogo se může také detekovat- v jiných., tkáních, -které nejsou nervové; tkáně. Pozorovaná inhibice , rozšíření' fibroblastů a astrpcytů ' myelinovým 111 • - - 00 ···· 00 ‘ • ♦ » • • · · • • t « · • • • • • · • · 0 00 ,0 00 « extraktem a NI—250 naráží na-přítomnost receptorů a’mečhanizmů odezvy ná proteiny' Nogo v těchto buňkách'. To naznačuje pravděpodobné obecné funkce proteinu Nogo při kontaktní i.nhibici pohybu buněk. . : %

\

i Ί

Claims (34)

1. • · ♦ · - « JL ·♦ · - ·· ' #f .PATENTOVÉ N Á R O K .Y ··# « (U

   1. Protein Nogo, který neobsahuj e( žádný'" myelinový .' materiál . -- --centrálniho - nervového—:-systému7;—se - kterým· je · přirozeně . spojen. j -· · #· ' · i
2. 2. - Protein, podle nároku 1, který se , vybral -ze skupiny zahrnující Nogo A a Nogo B.
3. 3. Protein podle nároku 2, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 2). ♦ 4. :í - -Protein podle . nároku 2, kde aminokyselinová sekvence uvedeného proteinu obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující zbytky 1 až 1 163 zobrazené na obrázku č. 2a (SEQ ID„ NO: 2) a zbytky 1 až 172 fúzované se zbytky· 975 až, 1 163 zobrazené na obrázku 2 (SEQ ID NO: 2). ; · - v 5. 'Čištěný protein Nogo C.
4. 6. Protein podle. nároku 5., který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 32 znázorněnou na obrázku č. 14. 7 . Protein podle nároku 5, jehož aminokyselinová sekvence obsahuj e SEQ ID NO: 32 znázorněnou na obrázku č. 14. 8. Protein podle nároku 2 nebo 5, který se produkuje re kombinací. _
5. 9. Protein podle nároku 2 nebo 5, který má' sekvenci savčího proteinu. , . '
6. 10. Protein podle nároku 1, 2- nebo, 5,·" který vykazuje .sekvenci lidského, proteinu.. ' . 113- ' . 113-

   « • ♦
7. 11. Protein obsahující .^aminokyselinovou sekvenci, , která vykazuje alespoň -jednu konzervativní substituci aminokyseliny v aminokyselinové sekvenci '.znázorněné na obrázku č. 2a (SEQ ID NO: 2), na obrázku č. Í3 (ŠEQ ID.NO:· . 30' nebo na obrázku č. 14 (SEQ ID NO;, 3.2) ,a Ičterá je schopna • *· ý " ^ * '» * · . i ^S'e^yáz-ah--protd-á-á;tknu~ -ř-l·zenθu--prΘti-rp-rΘ-tei-nu^~Nogoy^-.kter-ý~Γ-má------- aminokysleinovou ysekvenci ;vybranouze 'skupiny, r zahrnuj ící " , zbytky 1 až 1...163 SEQ ID NO:- 2, zbytky' 1 až 17.2 "fúzované se . zbytky 975 až .1 163 SEQ ID NO: 2 a zbytky 1 až 199' sekvence - -SEQ ID NO: 32 .---------1___________________ ’_________... ___________....______
8. 12. Protein podle nároku 1, .který obsahuje., aminokyselinovou -. sekvenci, .která vykazuje vyšší, něž -.50 % homologii

   i-.’ " ' 0 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO;_ 2, 'jak se stanovilo pomocí počítačového algoritmu BLAST. *, ·- 13'. Protein podle nároku 1, který j e x kódován . první nukleovou kyselinou, která je schopna hybridizovat-s druhou nukleovou, kyselinou vykazující nukleotidoyou sekvenci uvedenou na obrázku $2a (SEQ. ID NO: 51) nebo na obrázku č. 12 (SEQ ID NO: '28) . * - ' 141 Čištěný fragment proteinu podle nároku 1, který je schopný vázat se na protilátky řízené proti'proteinu Nogo a uvedený izolovaný fragment neobsahuje žádný myelínový materiál centrálního nervového systému. 15. Čištěný fragment proteinu podle nároku 5 nebo 11, který je schopný se vázat, na protilátku řízenou proti proteinu Nogo. 16. Čištěný protein 'obsahující' fragment proteinu Nogo zahrnující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny;.*, která zahrnuje ·,zbytky 31 až 57 znázorněné na' obrázku č.' 2a .. \ ^ k (SEQ ID NO:' 2), zbytky .11 až 191 znázorněné na obrázku 'č. . 14 ‘(SEQ ID NO: 32); zbytky 988· až 1 023 znázorněné ýa

   114 • · · ··· · ·· obrázku č. 2a (SEQ ID' NO: 2) a zbytky 1 090 až 1 125 znázorněné na obrázku č. 2a (SEQ ID.NO: 2), zbytky 994 až 1 ;174 znázorněné na obrázku č. 13 (SEQ ID NO: 30), zbytky 977 áz 1 012 znázorněné na obrázku č. 13 (SEQ ID NO: 30) a zbytky 1 079 až 1 114 znázorněné’ na obrázku č. 13 (SEQ ID NO: 30) . ' ,. - V; 1 ' ·-' . - 17, Čištěný neglykosylovaný protein, který .se' vybral ze skupiny ’ obsahující Nogo A, Nogo B a Noho C. ' '18. Čištěny, protein, ktérý neobsahuje žádný -mýelinový materiál • centrálního nervového systému. ,· a , je, kódován první nukíeotidovou sekvencí, která je ..'schopna ' hybridizovat s druhou nukleovou kyselinou, -přičemž /druhá nukleová kyselina vykazuje nukíeotidovou sekvenci ^.znázorněnou na obrázku č. 2a (SEQ ID NO; 1) nebo nukíeotidovou sekvenci znázorněná· na obrázku č. 12 (SEQ ID NO: '28) , a protein je schopný, se vázat na protilátky ř-ízené proti druhému proteinu, který má - aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku č. 2a ' (SEQ ID NO: 2) . '
9. 19. Chimérický protein obsahující fragment proteinu podle nároku 2,· 5 nebo 11, který je schopný se vázat na protilátky řízené proti proteinu Nogo, fúzovaný kovalentni vazbou alespoň k části druhého proteinu, přičemž uvedený druhý protein se liší od uvedeného fragmentu proteinu podle nároku 2, 5 nebo 11. 20. Čištěná molekula obsahující fragment proteinu podle nároku 1, který je schopný se vázat na protilátky řízené proti proteinu Nogo, a kde uvedená izolovaná molekula neobsahuje žádný mýelinový materiál centrálního nervového systému. 21. Čištěná molekula obsahující fragment proteinu podle nároku 5 nebo 11, který -je schopný se vázat na protilátku řízenou , proti proteinu Nogo. ; * . 115

   f * . ;
10. 22. Izolovaná nukleová 'kyselina obsahující nukleotidovou ... 'sekvenci vybranou ze;· skupiny- zahrnující SEQ ID NO: ,2 a SEQ . .ID NO: 33. ' v i- ' '
11. 23. Izolovaná nukleová kyselina obsahující , . ; a)"" nukleotidovou seřve ňci,~ k ter á kóduje -polypeptid‘- výkazuj lei aminokyselinovou sekvenci vybranou ze . skupiny obsahující * T zbytky 1 až , Γ 163 znázorněné na obrázku č. 2a (SEQ ID NO: 2) , zbytky 1 až 172 fúzované, se zbytky 975 .až 1 163 -p——znázorněné—iia—robVá-z-ku^ě--2-a--{-SEQ -ID- HO: 2± -a -zbytky 1 --a-ž-199 znázorněné na obrázku č. 14 (SEQ ID NO: 32) nebo b)- komplement nukíeotidové skeyer.ee popsané v odstavci a). Έ'’4 . Izolovaná první nukleová kyselina schopná hybridizovat s druhou nukleóvou kyselinou, která vykazuje nukleotidovou sekvenci komplementární s nukleotidovou sekvencí, která kóduj e polypeptid vykazující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující zbytky 1 až. 1 163 znázorněné na obrázku č. 2a (SEQ ID' NO: 2) , zbytky 1 až 172 fúzované se zbytky 975 až 1 163 znázorněné na obrázku č. 2a (SEQ ID NO: 2). 'a zbytky 1 až 199 znázorněné na obrázku č. 14 (SEQ ID NO: 32), a kóduje přirozeně se vyskytující protein, který je schopný se vázat protilátkou na protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
12. 25. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 24, který kóduje' přirozeně se vyskytující lidský protein Nogo.
13. 26. Izolovaná první nukleová kyselina, která může hybridizovat s druhou nukleovou kyselinou, která vykazuje -nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obrázku č. 2a (SEQ ID NO: 1) nebo na obrázku č. 12 (SEQ‘ ID NO: 28), a kde' uvedená první nukleová kyselina kóduje první protein, který, je schopný se .vázat na protilátku řízenou proti druhému- proteinu, který

    116 ·· ····

    ' má aminokyselinovou sekvenci -znázorněnou na obrázku č. 2a . (SEQ ID NO: 2) ., * . -
14. 27. Izolovaná .nukleová -kyselina, která kóduje přirozeně· ..se vyskytující protein,. · jenž je schopný se vázat na protilátky . :proti proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci' SEQ ID k-t-e-r-ý-^—v-y-ka-zuje—=-homolo.gl.i-.—nu.kleo-tid.ov-é^^sekvenQ_er...,JT. s nukleotidovou .' sekvencí, .. . která . kóduje polypeptid s aminokyselinovou·sekvencí vybranou .ze. .skupiny—.zahrnující . zbytky 1 až 1 163 SEQ. I.D NO:· 2, zbytky 1 až 172 ‘fúzované se ___zb.yt ky__.97 5 až 1 163 sekvence SEP.· ID/ŇO:. 2 a zbýt.kv 1._až__ 199_____ sekvence SEQ ' ID NO: 32, " vyšší jak 70 %, což se stanovilo počítačovým algoritmem BLAST.
15. 28.. Nukleová kyselina podle nároku 27, přičemž přirozeně se . vyskytující protein je lidský protein.
16. 29. Izolovaná nukleová kyselina ..obsahující . nukleotidovou sekvenci, kódující fragment proteinu 'Nogo, který vykazuje jednu nebo více funkčních aktivit proteinu Nogo, kde . uvedený protein Nogo není lidský protein Nogo, ani protein' Nogo organizmu Drosophiia ani protein Nogo organizmu Caenorhabditis elegar.s.
17. 30. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, která vykazuje vyšší než 50 % homologii s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 30, jak se stanovilo počítačovým algoritmem BLAST.
18. 31. Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje alespoň 220 kontinuálních aminokyselinových zbytků aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:, 2. · ’ ’ ·**’.·* ’ ·
19. 32. Izolovaná nukleová _ kyselina, . která obsahujg nukleotidove sekvence alespoň . ' dvou nepřekrývajících 'lidských . . · * * * : :, * ‘i ’ . . f J J '* r **-,· - \ 117 exprimovaných sekvenčních značek vybraných ze skupiny zahrnující'.AA158636', (SEQ ID NO: 35), AA333267 (SEQ ID NÓ: 36), AAÓ81783 (SEQ ID -NO: 37), AA167765' (SEQ' ID NO: 38) , AA322918. (SEQ ID NO: 39), AA092565 . ' (SEQ ID NO: 40) , .AA081525 (SEQ ID NO:·41) a AA081840 (SEQ ID' NO: 42). : * SS-r^Ve ktor cb s-ahu j í c ^•--•-n-u kl-e o-v-ou ----kyš e-li-nu™ ^podle^—li b-ovól ného^ .z nároků 22, 23, 24 a 25 operativně -sp.ój ený. s nepři rozeným r i f *' »- rprómotorem. - '* ·. 1 _ ·' · i ..
20. 34. Exprěsívní vektor obsahující nukleovou kyselinu libovolného z' nároků 22, 23', 24 ;a 25. 35. Řekómbinantní buňka 'transformovaná . nukleovou kyselinou podle·libovolného z nároků' 22, 23> 24 a 25. '36. Řekómbinantní buňka podle nároku 35, která je prokaryontní řekómbinantní.. buňkou. " - ' i . ’ 37. Řekómbinantní buňka podle nároku. 35" která je eukaryontní řekómbinantní buňkou. 1 r · ; A ·
21. 38.. Způsob ' produkce rekorabinantního proteinu, ' vyz-načující se tím, ·. že zahrnuje kultivaci řekómbinantní buňky transformované nukleovou kyselinou podle nároku 22, 23, 24 nebo 25 tak, že protein kódovaný nukleovou kyselinou se exprimuje buňkou, a získání exprimovaného proteinu.
22. 39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že řekómbinantní buňka je prokaryontní buňka.
23. 40. Způsob podle- nároku 38, vyznačující setím, ž. :e řekómbinantní buňka je eukarýontní řekómbinantní-buňka. - t · 118 • ···· ·· M·· ·· · • · • · · • · · · • · • · * • " · · • · · ·« · • · · ·
24. 41. Způsob léčby subjektu trpícího. neoplástickým onemocněním centrálního nervového systému, _ vyzná *čuj ící se t í m, že zahrnuje aplikaci subjektu terapeuticky účinného. množství' proteinu Nogo. nébo j eho fragmentu, který ňeobsahuje . žádný myelinový materiál centrálního nervového s'ystému, se kterým je protein Nogo přirozeně asociován, ^ přičemž uvedený fragment je aktivní při' inhibici"buněčné prdliferacei · v .· ; *··
25. 42. Způsob *' podle nároku 42, vyznačuj ící . .1 s_e _t_í _ m; ^ž_é.; ·.,' ,.ríeopXa.s.tické._.__onemocnění- —jje_______g.li om, . glioblastom, meduloblastom, kraniofaryngiom, ependyom, pinealom, * ►hemangioblastom, akustický neurom, oligodendrogliom, menagiom, neuroblastom nebo retinoblastom.
26. 43. Způsob .-podle nároku 42, v y .z n a...č u j í c í se t í m, ž e subjekt --je člověk.
27. 44. Způsob léčby subjektu..s poškozením centrálního nervového systému, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci subjektu terapeutického účinného množství ribozymu nebo „antisense" nukleové kysleiny Nogo, která inhibuje u subjektu produkci Nogo.
28. 45. Způsob indukující u subjektu regeneraci a dorůstání neuronů, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci subjektu terapeuticky účinného množství ribozymu nebo antisense nukleové kyseliny Nogo, která inhibuje u subjektu produkci Nogo.
29. 46. Způsob podporující strukturální , plasticitu centrálního nervového^ -.systému subjektu, vyznačuj ící s e t í m, ž e zahrnuje' aplikaci subjektu, kde se požaduje -strukturální -'plasticita centrálního nervového systému,' terapeuticky .účinné ' množství ribozymu nebo „a.ntisense". nukleové kyseliny Nogo, která inhibují u subjektu produkci Nogo. . '* . * .. · . } ' * 4 i,
30. 47. Rekombinantní zvíře, kterým není’ . člověk, je produktem . postupu, který zahrnuje zavedení nukleové kyseliny kódující alespoň oblast proteinu Nogo do genomu zvířete nebo do. -‘potomstva· uvedeného- zví řete .——----- -— .............·· ··—.
31. 48. Rekombinantní zvíře., kterým . není člověk a u.t.kterého se deaktivoval nebo deletoval gen Nogo. 4 9. "Z víře podle na r o kď7 A 8 , u"" ’kt éreho’ se déákt i vova 1 gen Nogo’ způsobem, .který zahrnuje . zavedení nukleové .kyseliny do •zvířete nebo j ého předka; přičemž nukleová kyselina ; obsahuje sekvenci,, která-není sekvencí genu Nogo, lemovanou j. sekvencemi ·- genu Nogo, ·. · ' které ' podporují homologní rekombinaci. 50. Čištěný, fragment .proteinu Nogó ·, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou zě skupiny zahrnující aminokyselinové zbytky 1 až 171, 172 až' 974, 259· až/542, 542 až 722, 172 až 259, 722 až 974' a 975· až 1 162 sekvence SEQ ID NO: 2, který neobsahuje žádný myelinový materiál centrálního nervového systému ' i 51. Čištěný fragment proteinu Nogo, kterému chybí aminokyselinové zbytky 172 až 259, 9.74 až 1 162 nebo 172 až 259 a 974 až 1 162 SEQ ID NO: 2, ale.jinak obsahuje zbytek sekvence SEQ ID NO:· 2 a neobsahuje žádný myelinový materiál centrálního nervového systému. 52. Čištěný fragment proteinu Nogo obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou .. ze skupiny, obsahující aminokyselinové zbytky 1 až 131, 132'áž 939, 206 až 50Ϊ, 501 až 680, 132.až 206/ 680 až 939 'a' 940 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: . 30> 120 ··· · 'který neobsahuje . žádný myelinový materiál centrálního nervového systému. " . 53. Čištěný fragment proteinu. Nogo, 'kterému chybí aminokyselinové zbytky 132 až 206, aminokyselinové zbytky 939‘až 1 127 nebo . aminokyselinové zbytky 132 až 206 a 939 až“-“l—12-7- - se-kve-noé—S-EQ—I-D -NQ :--30,- ale - jinak .obsahu j e zbytek -sekvence' SEQ ' ID NO: 30 a négbsahuje žádný myelinový materiál centrálního nervového jsystému.. 54 . .'Čištěný protei;n.( obsahuj íci fragment proteinu Nogo, ktérému
32. 58. Izolovaná nukleová kyselina kódující protein, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující aminokyselinové zbytky 1 až 131, 132 až 939,. '206 až 501, 501 až 680, 132 až‘206, 690 až 939 a 940 až 1 127 sekvence SEQ ID NO: 30.
33. 59 .-Izolovaná -nukleová kysel ina, která- kóduj e .protein, --kterému chybí aminokyselinové zbytky 132 až· 206, 939 až.1.127 nebo 132.až 206 a 939 až 1 127 sekvence SEQ.ID1NO: .30, ale jinak obsahuje zbytek sékvence SEQ ID NO: 30.
34. 60. Vektor obsahující nukléovou kyselinu podle libovolného *· · . » . z nároků 56, 57, 58 a 59. 61. •Rekombiriantní buňka transformovaná "nukléovou 'kyselinou podle libovolného·z nároků 56, 57, 58 a 59* 62. Túz'ní protein obsahující fragment podle nároku 52, 53 nebo 55 fúzovaný s ,aminokyselinovou sekvencí proteinu, kterým není protein Nogo.'