KR101685109B1 - 근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도 - Google Patents

Abstract

근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도에 관한 것이다. 노고-에이는 근육의 분화 또는 재생 정도, 또는 질환 상태를 확인하기 위해 이용될 수 있다.

Description

근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도{A use of Nogo-A related to differentiation, regeneration, or disease condition of muscle}

근육 분화, 재생, 또는 질환 상태와 관련된 노고-에이의 용도에 관한 것이다.

노고-에이(Nogo-A)는 노고 관련 세 가지 이성질체 중 가장 길이가 긴 단백질이다. 이들 세 이성질체는 유전자 전사과정 중 프로모터 혹은 스플라이싱의 차이로 인해 만들어지고, 이들은 3` 말단에 잘 보전된 공통된 부분을 가진다. 이를 제외한 5` 말단 부분은 이성질체 간에 차이를 가지고 있고, 이로 인해 이들의 작용 효과와 발현 양상은 크게 상이하게 된다.

본 발명에서 다룬 노고-에이는 중추 신경계에서의 작용 효과가 기존 연구들에 의해 잘 규명되어 있다. 중추 신경계에서 노고-에이는 희소돌기아교세포의 말이집 형성을 억제하고, 뉴론 축삭의 길이 성장을 방해하며, 신경 조직의 재생 효과를 저해하는 작용을 한다.

그러나 노고-에이의 신경계 외에서의 작용 효과에 대해선 잘 알려져 있지 않다. 흔히 루게릭병으로 알려진 근육위축가쪽경화증은 운동신경세포의 선택적 사멸로 인해 전신의 근육이 쇄약해지고 위축되는 질병인데, 이 질병 상태에 있는 근육에서 병증에 따라 노고-에이의 발현이 일치하는 경향을 보인다. 이처럼 근육에서의 노고-에이의 작용 또한 신경계와 관련되어 설명하는 수준에 그치고 있다. 온전히 근육 자체에서의 노고-에이의 발현에 대해선 현재 진행된 연구가 전무하다.

이에 본 발명자는 노고-에이의 근육에서의 발현 양상에 대한 내용을 제공하고, 근육 분화 및 재생 그리고 질환 상태 표지 인자로서의 새로운 기능을 제공한다.

일 양상은 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도 확인용 조성물 또는 키트를 제공한다.

다른 양상은 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도를 확인하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 손상된 근육의 재생 정도 확인용 조성물 또는 키트를 제공한다.

다른 양상은 손상된 근육의 재생 정도를 확인하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 근육 손상 질환 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.

다른 양상은 개체의 근육 손상 질환을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

일 양상은 노고-에이(Nogo-A) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도 확인용 조성물을 제공한다.

상기 노고-에이는 신경돌기성장 억제제 A(neurite outgrowth inhibitor A)로서, 레티쿨론 4(reticulon 4) isoform A, 또는 RTN4-A로 명명될 수 있다. 상기 노고-에이 유전자는 서열번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 노고-에이 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 전사체로 포함하는 것일 수 있다.

근육전구세포(precursor cell)는 근육세포로 발달 또는 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 근육전구세포는 근육 원조세포(progenitor cell) 및 근육 줄기세포를 포함한다. 근육전구세포는 위성세포(satellite cell) 또는 근모세포(myoblast)일 수 있다. 근육세포는 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)일 수 있다.

상기 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 용어 "프라이머(primer)"는 3' 말단에 자유 히드록실기를 갖고, 상보적인 서열을 갖는 주형과 염기쌍을 형성함으로써 주형 복제를 위한 시작점으로 기능하는 짧은 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 노고-에이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍의 각 서열, 중합효소연쇄반응 조건, 및 각 프라이머의 길이는 노고-에이 유전자의 뉴클레오티드 서열을 이용하여 통상의 기술자가 적절하게 설계 또는 변형시킬 수 있다.

용어 "프로브(probe)"는 시료 중 그의 서열과 상보적인 서열을 갖는 표적 뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있는 핵산 단편을 의미한다. 표지된 프로브를 단일가닥 핵산으로 변성시킨 후 표적 핵산과의 혼성화를 유도함으로써 표적 뉴클레오티드의 존재를 검출할 수 있다. 노고-에이 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 및 그의 표적 서열과의 혼성화 조건은 통상의 기술자가 적절하게 설계 또는 변형시킬 수 있다.

용어 "항체(antibody)"는 항원의 특정 부위를 인식하는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 노고-에이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 상기 단백질에 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체일 수 있다.

다른 양상은 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도 확인용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도 확인용 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 키트는 역전사 중합효소반응 키트, DNA 칩 키트, 또는 ELISA 키트일 수 있다. 상기 키트는 분석 방법에 따라 하나 이상의 다른 조성물, 용액, 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 역전사 중합효소반응 키트는 노고-에이 유전자에 특이적인 프라이머 쌍, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, 및 멸균수를 포함할 수 있다. 상기 DNA 칩 키트는 노고-에이 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 기판 및 표지된 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 및 효소를 포함할 수 있다. 상기 ELISA 키트는 노고-에이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

다른 양상은 근육전구세포에서 근육세포로 분화 중인 세포에서 노고-에이의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 근육전구세포 및 근육세포에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 발현 수준의 측정은, 노고-에이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 노고-에이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 항체에 대해서는 전술된 바와 같다. 상기 발현 수준의 측정은 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, 노던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 면역침전분석법, 또는 면역조직화학분석법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 측정 결과, 상기 분화 중인 세포에서의 노고-에이의 발현 수준이 대조군에서의 노고-에이의 발현 수준보다 높은 경우, 상기 세포는 대조군에 비해 분화가 더 진행된 세포인 것으로 결정할 수 있다. 또한, 상기 분화 중인 세포에서의 노고-에이의 발현 수준이 대조군에서의 노고-에이의 발현 수준보다 낮은 경우 상기 세포는 대조군에 비해 분화가 덜 진행된 세포인 것으로 결정할 수 있다.

다른 양상은 노고-에이 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 손상된 근육의 재생 정도 확인용 조성물을 제공한다. 상기 노고-에이 유전자 및 상기 제제에 대해서는 전술된 바와 같다.

다른 양상은 손상된 근육의 재생 정도 확인용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 손상된 근육의 재생 정도 확인용 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 키트는 역전사 중합효소반응 키트, DNA 칩 키트, 또는 ELISA 키트일 수 있다. 각 키트에 대해서는 전술한 바와 같다.

다른 양상은 손상된 근육으로부터 분리된 세포 또는 조직에서 노고-에이의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 손상된 근육의 재생 정도를 확인하는 방법을 제공한다.

상기 발현 수준의 측정은 노고-에이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 노고-에이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 프라이머, 프로브, 항체에 대해서는 전술된 바와 같다.

상기 측정 결과, 상기 손상된 근육으로부터 분리된 세포 또는 조직에서 노고-에이의 발현 수준이 대조군의 노고-에이의 발현 수준보다 낮은 경우, 상기 손상된 근육은 대조군에 비해 재생이 더 진행된 것으로 결정할 수 있다. 여기서 대조군은 손상 직후의 근육에서 분리된 세포 또는 조직일 수 있다.

다른 양상은 노고-에이 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육 손상 질환 진단용 조성물을 제공한다.

용어 "근육 손상 질환"은 근육조직 또는 근세포가 손상을 받으므로써 근육조직이 소실(loss)되는 모든 질환을 의미한다. 상기 근육 손상 질환은 근이영양증(muscular dystrophy), 근위축증(muscular atrophy), 근육염(myositis), 다발성 근육염(polymyositis), 말초혈관 질환(peripheral vascular disease), 또는 섬유증(fibrosis)일 수 있다. 상기 근이영양증은 예를 들면, 베커형 근이영양증(Becker's muscular dystrophy), 선천성 근이영양증(congenital muscular dystrophy), 뒤셴형근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 원위 근이영양증(distal muscular dystrophy), 에머리-드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 안면견갑상완 근이영양증, 지대형 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 안인두성 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 사르코글리칸증, 척수성 근육위축, 또는 BVVL(Brown-Vialetto-Van Laere syndrome)일 수 있다. 상기 노고-에이 유전자 및 상기 제제에 대해서는 전술된 바와 같다.

다른 양상은 근육 손상 질환 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 근육 손상 질환 진단용 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 키트는 역전사 중합효소반응 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 각 키트에 대해서는 전술한 바와 같다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에서 노고-에이 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 발현 수준을 대조군 시료에서의 노고-에이 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 개체의 근육 손상 질환을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 시료는 개체의 근육 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개, 또는 고양이일 수 있다.

상기 근육 손상 질환, 상기 노고-에이 유전자, 상기 발현 수준의 측정에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 대조군 시료는 근육 손상 질환을 갖지 않는 개체일 수 있다. 개체로부터 분리된 시료에서 노고-에이 발현 수준이 대조군 시료에서 노고-에이 발현 수준에 비해 증가된 경우, 상기 개체는 근육 손상 질환을 갖는 것으로 진단될 수 있다.

노고-에이는 근육의 분화 또는 재생 정도, 또는 질환 상태를 확인하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 근육의 생태병리학적인 이해를 넓히는 데에 기여할 수 있다.

도 1 및 2는 각각 분화 초기 단계 및 분화 후기 단계의 근육모세포에서 면역형광염색을 통해 노고-에이의 발현을 관찰한 결과이다.
도 3은 분화 과정 동안 노고-에이 및 다른 근육 분화 인자의 발현 양상을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 재생 중인 근육에서 노고-에이의 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4b는 질환 상태의 근육에서 노고-에이의 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 재생 중인 근육 및 질환 상태의 근육에서 노고-에이의 발현 수준을 q-PCR을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 근육모세포의 분화 과정 중 노고-에이 발현 분석

1. 근육모세포의 분화 유도

근육세포의 분화 실험을 하기 위해 마우스 유래 근육모세포주 C2C12를 사용하였다 (ATCC®, 미국). 고농도 글루코스-Dulbecco's Modified Eagle Medium (H-DMEM, Life technologies, 미국), 10% 우태혈청 (FBS, ATLAS, 미국), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (PS, Life technologies, 미국)이 함유된 일반증식조건 배지에서 증식을 유지하였다. 그 후 세포수가 80% 이상이 되었을 때, 저농도 글루코스-DMEM (L-DMEM, GE healthcare, 미국), 2% 말 혈청 (HS, Life technologies, 미국), 및 1% PS (Life technologies, 미국)이 함유된 분화조건 배지로 교체하여 분화를 유도하였다. 37℃, 5% CO₂ 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다. 하기와 같이 근육모세포의 분화 과정 동안의 노고-에이의 발현을 분석하였다.

2. 면역형광염색을 이용한 노고-에이 발현 분석

분화 조건 배지로의 교체 전과 교체 14일 후, 즉, 분화 초기 단계와 후기 단계의 근육모세포에 대하여 면역형광염색을 실시하였다. 근육 분화 단계를 대조하기 위해 Pax7, MyoD, Myogenin, MYH2 단백질을 같이 동시-염색하였다.

배양된 세포를 4% 파라포름알데히드 (Sigma, 미국)로 15분간 실온에서 고정한 후 0.01M 인산완충식염수 (PBS, Gendepot, 미국)로 5분간 3회 수세하였다. 그 후 고정된 세포를 메탄올로 -20℃에서 10분간 인큐베이션하였다. PBS로 5분간 3회 수세 후, 0.01M PBS 중 3% 소혈청알부민 (Sigma, 미국)으로 실온에서 1시간 블로킹하였다. 노고-에이 항체 (1:500; Abcam, 미국), Pax7 (1:50; Developmental Studies Hybridoma Bank, 미국), MyoD (1:200; Santacruz, 미국), Myogenin (1:20; DSHB, 미국), 및 MYH2 (1:200; Santacruz, 미국)를 각각 0.1% Triton X-100 (Sigma, 미국)이 첨가된 PBS (PBS/T)에 희석하였다. 준비된 세포들을 각각의 항체 희석액으로 4℃에 약 18시간 동안 염색하였다. PBS로 5분 3회 수세 후, 플루오레신 이소시아네이트 (FITC, 1:500; Life technologies, 미국) 및 테트라메틸로다민 (TRITC, 1:500; Life technologies, 미국)이 첨가된 PBS/T로 1시간 동안 실온에서 염색하였다. PBS로 5분간 3회 수세 후, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 0.1 ㎍/ml; Sigma, 미국)로 최종 염색하였다. 공초점 레이저 주사 현미경 (Carl zeiss, 독일)을 이용하여 사진 촬영을 하였다. Zen 2009 (Carl zeiss,독일) 소프트웨어로 이미지를 분석하였다.

도 1 및 2는 각각 분화 초기 단계 및 분화 후기 단계의 근육모세포에서 면역형광염색을 통해 노고-에이의 발현을 관찰한 결과이다. 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 노고-에이의 발현은 분화된 근육세포인 근육대롱(myotube)의 표지 단백질인 MYH2의 발현과 상당히 일치하였다. 이에 비해, 노고-에이의 발현은 분화 중인 근육세포 표지 단백질인 MyoD와 Myogenin과는 부분적으로 일치하고, 근육모세포 표지 단백질인 PAX7과는 일치하지 않았다.

3. RT - PCR 및 q- PCR 을 이용한 노고-에이 발현 분석

분화 유도된 근육모세포로부터 RNA를 1일 간격으로 추출하여 RT-PCR 혹은 q-PCR로 노고-에이의 발현을 관찰하였다

PCR 반응 조건은 다음과 같았다. AccuPower® PCR premix (Bioneer, 대한민국)에 조건당 노고-에이 프라이머 세트 (서열번호 3 및 4) 및 Gapdh 프라이머 세트 (서열번호 5 및 6) 각 1 ㎕, 1 ㎕ cDNA, 및 17 ㎕ 초순수를 혼합하였다. Biorad 사의 T100 기기를 이용하여, 95℃에서 4분 동안 반응 후, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 30초로 35회 반복하고, 72℃에서 7분 동안 반응시켰다.

qPCR 반응 조건은 다음과 같았다. 2X SYBR green master mix (TAKARA, 미국) 12.5 ㎕, 프라이머 세트 각 2.5 ㎕, cDNA 3 ㎕, 및 DEPC water 7 ㎕을 25 ㎕ 반응 용량으로 혼합하였다. 프라이머 세트는 노고-에이 (서열번호 7 및 8), Myogenin (Qiagen, 미국), MyoD (Qiagen, 미국), Gapdh (Qiagen, 미국)를 이용하였다. Qiagen 사의 Rotor-Gene Q를 이용하여 95℃에서 5분 동안 반응 후, 95℃에서 30초, 및 60℃에서 10초로 40회 반복하여 반응시켰다.

도 3은 분화 과정 동안 노고-에이 및 다른 근육 분화 인자의 발현 양상을 나타내는 그래프이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 분화가 진행됨에 따라 노고-에이 유전자 또한 Myogenin과 MyoD와 더불어 그 발현이 지속적으로 증가하는 경향을 나타내었다.

실시예 2: 근육의 재생 과정에서 노고- 에이의 발현 분석

1. 근육의 재생 과정 유도

근육의 재생 과정을 유도하기 위하여, Antonio S.J. Lee, BioArchithecture, 3:2, 25-37; 2013에 기재된 방법에 따라, 미오톡신(myotoxin)인 노텍신(notexin)을 근육에 주입하여 근육 손상을 유도하였다. 8주령 된 수컷 C57BL/6 마우스(n=9) (중앙실험동물, 대한민국)의 양쪽 하지 피부를 면도한 후, 정강이뼈 옆에 있는 앞정강근에 주사기로 노텍신 (Sigma-aldrich, 미국)을 5 mg/l로 생리식염수에 희석하여 한 다리당 20 ㎕씩 주입하였다 (0.1 ㎍/1 leg).

2. RT - PCR 및 q- PCR 을 이용한 노고-에이 발현 분석

노텍신 주입 후 6일, 9일, 및 12일차에 각각 3마리, 3마리, 및 2마리씩 부검하여 근육을 분리하였다. 분리된 근육 시료로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR 혹은 q-PCR로 노고-에이의 발현을 관찰하였다.

도 4a는 재생 중인 근육에서 노고-에이의 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이다. 음성 대조군인 온전한 근육 및 양성 대조군인 뇌조직은 각각 손상이 유도되지 않은 8주령 된 수컷 C57BL/6 마우스에서 분리된 근육 시료 및 뇌 조직이다.

도 5는 재생 중인 근육에서 노고-에이의 발현 수준을 q-PCR을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 손상된 근육의 재생이 진행됨에 따라 노고-에이의 발현이 감소하고, 손상 받지 않은 근육의 발현량에 가까워지는 경향을 나타내었다.

실시예 3: 질환 상태의 근육에서 노고- 에이의 발현 분석

질환 동물 모델인 3개월령, 6개월령, 또는 15개월령 수컷 MDX 마우스(n=3)에서(Jacques P.Tremblay Lab에서 분양), 실시예 2와 동일한 방법으로 근육 내 노고-에이의 발현을 RT-PCR 과 q-PCR을 이용하여 분석하였다. 대조군으로는 1개월령, 3개월령, 6개월령, 또는 15개월령된 수컷 C57BL/6 마우스와 그의 뇌 조직을 이용하였다.

도 4b는 질환 상태의 근육에서 노고-에이의 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 질환 상태의 근육에서 노고-에이의 발현 수준은 질환을 갖지 않는 대조군 근육에 비하여 높게 나타났다.

도 5는 질환 상태의 근육에서 노고-에이의 발현 수준을 q-PCR을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 질환을 갖는 근육에서 노고-에이의 발현은 질환을 갖지 않는 대조군의 근육에 비하여 높게 나타나는 것으로 확인되었다.

<110> Kyungpook National University industry academic cooperation foundation <120> A use of Nogo-A related to differentiation, regeneration, or disease condition of muscle <130> PN107894 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1162 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Ala Asp Ser 1 5 10 15 Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro 20 25 30 Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu 35 40 45 Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu 50 55 60 Ser Ala Ala Pro Val Pro Pro Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp Phe Ser 65 70 75 80 Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala Ala Pro 85 90 95 Pro Thr Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro Ala Ala 100 105 110 Ser Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser Lys Leu 115 120 125 Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Ala Pro Ala Gly Ala 130 135 140 Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro 145 150 155 160 Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu Pro 165 170 175 Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu Lys Ile Met Asp 180 185 190 Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly Gln Glu Asp Phe 195 200 205 Pro Ser Val Leu Phe Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro 210 215 220 Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu Gly Asn Leu Ser 225 230 235 240 Ala Val Ala Ser Thr Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr Leu Asn Glu Ala 245 250 255 Ser Arg Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe Val Asn Arg Glu 260 265 270 Ser Ala Glu Phe Ser Val Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe 275 280 285 Asn Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Met Leu Val Glu Asn Thr Lys 290 295 300 Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp Leu Val Cys Ser 305 310 315 320 Ala Ala Leu His Asn Pro Gln Glu Ser Pro Ala Thr Leu Thr Lys Val 325 330 335 Val Lys Glu Asp Gly Val Met Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe 340 345 350 Asn Glu Met Lys Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala 355 360 365 Asp Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu 370 375 380 Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Met Glu Ser Lys Val 385 390 395 400 Asp Lys Lys Cys Phe Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Gly His Gly Lys 405 410 415 Asp Ser Glu Ser Arg Asn Glu Asn Ala Ser Phe Pro Arg Thr Pro Glu 420 425 430 Leu Val Lys Asp Gly Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Asp Ser Phe Ser 435 440 445 Ser Ala Thr Glu Ser Thr Ala Ala Asn Ile Phe Pro Val Leu Glu Asp 450 455 460 His Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys Ile Glu Glu Arg Lys 465 470 475 480 Ala Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe 485 490 495 Leu Val Ala Ile His Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Asn 500 505 510 Leu Ser Lys Val Thr Glu Ala Val Val Ala Thr Met Pro Glu Gly Leu 515 520 525 Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala 530 535 540 Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr 545 550 555 560 Ser Glu Ala Ile Gln Glu Ser Ile Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro 565 570 575 Ser Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile 580 585 590 Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Leu Leu Pro Ser Thr Gly Ala Ser 595 600 605 Val Ala Gln Pro Ser Ala Ser Pro Leu Glu Val Pro Ser Pro Val Ser 610 615 620 Tyr Asp Gly Ile Lys Leu Glu Pro Glu Asn Pro Pro Pro Tyr Glu Glu 625 630 635 640 Ala Met Ser Val Ala Leu Lys Thr Ser Asp Ser Lys Glu Glu Ile Lys 645 650 655 Glu Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Ala Gln Glu Ala Glu Ala Pro Tyr 660 665 670 Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu 675 680 685 Pro Ser Pro Glu Phe Ser Asn Tyr Ser Glu Ile Ala Lys Phe Glu Lys 690 695 700 Ser Val Pro Asp His Cys Glu Leu Val Asp Asp Ser Ser Pro Glu Ser 705 710 715 720 Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln 725 730 735 Thr Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val 740 745 750 Ser Glu Thr Val Thr Gln His Lys His Lys Glu Arg Leu Ser Ala Ser 755 760 765 Pro Gln Glu Val Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu 770 775 780 His Ile Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Glu Ile Pro Thr Leu Thr Lys 785 790 795 800 Lys Glu Thr Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr 805 810 815 Ser Asn Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Met Lys Glu Ser 820 825 830 Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro 835 840 845 Thr Phe Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Glu Tyr Thr Asp Leu 850 855 860 Glu Val Ser Asn Lys Ser Glu Ile Ala Asn Val Gln Ser Gly Ala Asn 865 870 875 880 Ser Leu Pro Cys Ser Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn Thr 885 890 895 Tyr Pro Lys Asp Glu Ala His Val Ser Asp Glu Phe Ser Lys Ser Arg 900 905 910 Ser Ser Val Ser Lys Val Pro Leu Leu Leu Pro Asn Val Ser Ala Leu 915 920 925 Glu Ser Gln Ile Glu Met Gly Asn Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Thr 930 935 940 Lys Glu Ala Glu Glu Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg 945 950 955 960 Ser Leu Thr Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Asn Lys Thr Ser Val Val 965 970 975 Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly 980 985 990 Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser 995 1000 1005 Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe 1010 1015 1020 Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly 1025 1030 1035 1040 His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu 1045 1050 1055 Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser Thr 1060 1065 1070 Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser 1075 1080 1085 Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu 1090 1095 1100 Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser 1105 1110 1115 1120 Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu 1125 1130 1135 Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala 1140 1145 1150 Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu 1155 1160 <210> 2 <211> 6165 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 2 cccctgccgg gaaggtgagt cacgccaaac tgggcggaga gtctgccctc ctctctcagt 60 tgctcatctg ggcggcggcg gctgctgcaa ctgaggacag ggcgggtggc gcatctcgag 120 cgcggaggca ggaggagaag tcttattgtt cctggagctg tcgcctttgc gggttcctcg 180 gcttggttcg gccagcccgg cctctgccag tcctgcccaa cccccacaac cgcccgcggc 240 tctgaggaga agtggcccgc ggcggcagta gctgcagcat catcgccgac catggaagac 300 atagaccagt cgtcgctggt ctcctcgtcc gcggatagcc cgccccggcc cccgcccgct 360 ttcaagtacc agttcgtgac ggagcccgag gacgaggagg acgaggaaga cgaggaggag 420 gaggaggacg acgaggacct ggaggaattg gaggtgctgg agaggaagcc cgcagccggg 480 ctgtccgcgg ctccggtgcc ccccgccgcc gcaccgctgc tggacttcag cagcgactcg 540 gtgccccccg cgccccgcgg gccgctgccg gccgcgcccc ccaccgcccc tgagaggcag 600 ccgtcctggg aacgcagccc cgcggcgtcc gcgccatccc tgccgcccgc tgccgcagtc 660 ctgccctcca agctcccgga ggacgacgag cctccagcgc ggcctccggc gccagccggc 720 gcgagccccc tagcggagcc cgccgcgccc ccttccacgc cggccgcgcc caagcgcagg 780 ggctcgggct cagtggatga gacccttttt gctcttcctg ctgcatctga gcctgtgata 840 ccctcctctg cagaaaaaat tatggatttg aaggagcagc caggtaacac tgtttcgtct 900 ggtcaagagg atttcccatc tgtcctgttt gaaactgctg cctctcttcc ttctctatct 960 cctctctcaa ctgtttcttt taaagaacac ggataccttg gtaacttatc agcagtggca 1020 tccacagaag gaactattga agaaacttta aatgaagctt ctagagaatt gccagagagg 1080 gcaacaaatc catttgtaaa tagagagtca gcagagtttt cagtattaga atactcagaa 1140 atgggatcat ctttcaatgg ctccccaaaa ggagagtcag ccatgttagt agaaaacact 1200 aaggaagaag taattgtgag gagtaaagac aaagaggatt tagtttgtag tgcagccctt 1260 cataatccac aagagtcacc tgcgaccctt actaaagtgg ttaaagaaga cggagttatg 1320 tctccagaaa agacaatgga catttttaat gaaatgaaaa tgtcagtggt agcacctgtg 1380 agggaagagt atgcagattt taagccattt gaacaagcat gggaagtgaa agatacttat 1440 gagggaagta gggatgtgct ggctgctaga gctaatatgg aaagtaaagt ggacaaaaaa 1500 tgctttgaag atagcctgga gcaaaaaggt catgggaagg atagtgaaag cagaaatgag 1560 aatgcttctt tccccaggac cccagaactt gtgaaggacg gctccagagc gtacatcacc 1620 tgtgattcct ttagctcagc aaccgagagt actgcagcaa acattttccc tgtgctagaa 1680 gatcacactt cagaaaacaa aacagatgaa aaaaaaatag aagaaaggaa ggcccaaatt 1740 ataacagaga agactagccc caaaacgtca aatcctttcc ttgtagcaat acatgattct 1800 gaggcagatt atgtcacaac agataattta tcaaaggtga ctgaggcagt agtggcaacc 1860 atgcctgaag gtctaacgcc agatttagtt caggaagcat gtgaaagtga actgaacgaa 1920 gccacaggta caaagattgc ttatgaaaca aaagtggact tggtccagac atcagaagct 1980 atacaagagt caatttaccc cacagcacag ctttgcccat catttgagga agctgaagca 2040 actccgtcac cagttttgcc tgatattgtt atggaagcgc cattaaattc tctccttcca 2100 agcactggtg cttctgtagc gcagcccagt gcatccccac tagaagtacc gtctccagtt 2160 agttatgacg gtataaagct tgagcctgaa aatcccccac catatgaaga agccatgagt 2220 gtagcactaa aaacatcgga ctcaaaggaa gaaattaaag agcctgaaag ttttaatgca 2280 gctgctcagg aagcagaagc tccttatata tccattgcat gtgatttaat taaagaaaca 2340 aagctctcca ctgagccaag tccagagttc tctaattatt cagaaatagc aaaatttgag 2400 aagtcggtgc ctgatcactg tgagctcgtg gatgattcct cacccgaatc tgaaccagtt 2460 gacttattta gtgatgattc aattcctgaa gtcccacaaa cacaagagga ggctgtgatg 2520 ctaatgaagg agagtctcac tgaagtgtct gagacagtaa cacaacacaa acataaggag 2580 agacttagtg cttcacctca ggaggtagga aagccatatt tagagtcttt tcagcccaat 2640 ttacatatta caaaagatgc tgcatctaat gaaattccaa cattgaccaa aaaggagaca 2700 atttctttgc aaatggaaga gtttaatact gcaatttatt ccaatgatga cttactttct 2760 tctaaggaag acaaaatgaa agaaagtgaa acattttccg attcatctcc cattgagata 2820 atagatgagt ttcccacatt tgtcagtgct aaagatgatt ctcctaagga gtacactgac 2880 ctagaagtat ccaacaaaag tgaaattgct aatgtccaga gcggggccaa ttcgttgcct 2940 tgctcagaat tgccctgtga cctttctttc aagaatacat atcctaaaga tgaagcacat 3000 gtctcagatg aattctccaa aagtaggtcc agtgtatcta aggtgccctt attgcttcca 3060 aatgtttctg ctttggaatc tcaaatagaa atgggcaaca tagttaaacc caaagtactt 3120 acgaaagaag cagaggaaaa acttccttct gatacagaga aagaggacag atccctgaca 3180 gctgtattgt cagcagagct gaataaaact tcagttgttg acctcctgta ctggagagac 3240 attaagaaga ctggagtggt gtttggtgcc agcttattcc tgctgctgtc tctgacagtg 3300 ttcagcattg tcagtgtaac ggcctacatt gccttggccc tgctctctgt gactatcagc 3360 tttaggatat ataagggtgt gatccaagct atccagaaat cagatgaagg ccacccattc 3420 agggcatatt tggaatctga agttgccata tcagaggaat tggttcagaa atatagtaat 3480 tctgctcttg gtcatgtgaa cagcacaata aaagaattga ggcgtctctt cttagttgat 3540 gatttagttg attccctgaa gtttgcagtg ttgatgtggg tatttactta cgttggtgcc 3600 ttgttcaatg gtttgacact actgatttta gctctgatct cactcttcag tattcctgtt 3660 atatatgaac ggcatcaggc gcagatagat cattatctag gacttgcaaa caagagcgtt 3720 aaggatgcca tggccaaaat ccaagcaaaa atccctggat tgaagcgcaa agcagaatga 3780 aaaggcccca aacagtagac attcatcttt aaaggggaca ctcccttggt tacggggtgg 3840 gcgggtcagg ggtgagccct gggtggccgt gcagtttcag ttatttttag cagtgcactg 3900 tttgaggaaa aattacctgt cttgacttcc tgtgtttatc atcttaagta ttgtaagctg 3960 ctgtgtatgg atctcattgt agtcatactt gttttcccca gatgaggcac ttggtgaata 4020 aaggatgctg ggaaaactgt gtgttatatt ctgttgcagg tagtctggct gtatttggaa 4080 agttgcaaag aaggtagatt tgggggcagg aaaaacaacc cttttcacag tgtactgtgt 4140 ttggttggtg taaaactgat gcagattttt ctgaaatgag atgtttagat gagcatacta 4200 ctaaagcaga gtggaaaaat ctgtctttat ggtatgttct aggtgtattg tgatttactg 4260 ttagattgcc aatataagta aatatagaca taatctatat atagtgtttc acaaagctta 4320 gatctttaac cttgcagctg ccccacagtg cttgacctct gagtcattgg ttatacagtg 4380 tagtcccaag cacataaact aggaagagaa tgtatttgta ggagcgctac cacctgtttt 4440 caagagaaca tagaactcca acgtaaccgt catttcaaag atttactgta tgtatagttg 4500 attttgtgga ctgaatttaa tgcttccaaa tgtttgcagt taccaaacat tgttatgcaa 4560 gaaatcataa aatgaagact tataccattg tgtttaagct gtattgaatt atctgtggaa 4620 tgcattgtga actgtaaagc aaagtatcaa taaagcttat agacttacct ttgtgtttag 4680 tgttttagtt tcatgaatgc acagcaaaaa cacggtggta ggcttagaga gtggacacat 4740 ggtaacatgc ttttagaaag gttttagttc atgaaacagc ttaagaacaa agaatatatt 4800 tacatagtga gatttatttg actcataaca aaaggtttta aattatttta tactttgaaa 4860 ataaattcat gcaccaatat tttaacagaa tacagtgcaa gatttatgaa tatacataaa 4920 attacaccat ataaatttta caaataagac tttcaaagtc tttataacag acactattgc 4980 tcttcaaata tatacatata tcattgatta gtcagttgtt catccacatg gttacttaat 5040 gcaagatctg tctgaatgaa atgtcagtag tacaagacag gcagacacag tgatcactca 5100 gcatcaccag gtacagaaaa cagaatcagg gctgcatagg gctctactga ggacccagca 5160 acctgctagt gggttgatgt aaggcattaa taagttggcg tgtaaaatag cttaatgtgt 5220 aatctaattc ttttagaatg ctgaagcact tctgtggtaa atgttgataa tctattcttt 5280 aactgaaaat gcttatttca acctttctct aaaatggcaa cttcatataa ctagaaactc 5340 aaggtctaga attttagtgc acagactgga aggactcggt ggtgtgtgta ctcacgactc 5400 caactcccat cagccttctt aactaatagt cgtcaagtca cattctgtcc gacaactgac 5460 tggagaaact caaatactcc ttacagtggg gaatatgttc aagaggtttt taaaaatctg 5520 aatttaccct gcattaatca tctgaaatga gcagagccaa gccagtccta cccaagaggg 5580 tgtaaactaa acagcaagac agctcactcg tcacactgga gctttccctg ctttccgtgt 5640 tgctactttc tgtggagctg gactcttctt tgctgctcac cttataactg ctttcctaga 5700 gcaggacata gtggtgaatt tgctaatccc atagccctcc tcagttttga agttttagca 5760 ccatgtgaag gaagaagacg acatgggagg tgaggcagca gcccacacaa ctgggaactt 5820 tgaaggcact taatggatat aaaactgcaa atgaaacttt taaaaattaa cattttaaaa 5880 cttgtttata catggctcat ttagttttga aagctaaatg tggcaaacag ggtatttctg 5940 tacttaagtg cttccaactt acattgtgtc cagtgaacat tcttaaaata catagaaaca 6000 gaatagcaaa acacctttgt aaaagtctta atgcaaatta aacgctacat attggttagg 6060 gtaattgagg atgtaaattt tatctgtggg ctacatcatc ccaattttgc cgttagtgaa 6120 gttacaataa gtataggttt tagtctccag aacagaagca aacag 6165 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NogoA F <400> 3 caagctcccg gaggacgac 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NogoA R <400> 4 gccctctctg gcaattctct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh F <400> 5 actcacggaa aattcaacgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh R <400> 6 accagtggat gcagggatga 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qNogoA F <400> 7 ctcagtggat gagacccttt ttgc 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> qNogoA R <400> 8 cagtgttacc tggctgctcc t 21

Claims (20)

1. 노고-에이(Nogo-A) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도 확인용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것인 조성물.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도 확인용 키트.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 키트는 역전사 중합효소반응 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
6. 근육전구세포에서 근육세포로 분화 중인 세포에서 노고-에이의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 근육전구세포의 근육세포로의 분화 정도를 확인하는 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 발현 수준의 측정은 노고-에이 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브, 또는 노고-에이 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 방법.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 분화 중인 세포의 노고-에이의 발현 수준이, 대조군의 노고-에이의 발현 수준보다 높은 경우 상기 분화 중인 세포는 대조군에 비해 분화가 더 진행된 세포인 것으로 결정하고, 대조군의 노고-에이의 발현 수준보다 낮은 경우 상기 분화 중인 세포는 대조군에 비해 분화가 덜 진행된 세포인 것으로 결정하는 것인 방법.
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