SK287146B6

SK287146B6 - Spôsob prípravy rekombinantného choriogonadotropínu - hCG zo vzorky

Info

Publication number: SK287146B6
Application number: SK1206-2002A
Authority: SK
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Laboratoires Serono Sa
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2010-01-07
Also published as: HUP0204231A3; IL151308A; EA200200892A1; JP4588960B2; KR20030001359A; DE60135541D1; EP1257564A1; RS50741B; MEP38908A; HUP0204231A2; EA006605B1; CZ20022855A3; BG65807B1; US7297777B2; HK1052016A1; PL205149B1; NO20023985D0; AU2680401A; SI1257564T1; HU1300063D0

Abstract

Je opísaný spôsob prípravy rekombinantného hCG so špecifickou bioaktivitou v rozsahu 23 000 až 28 000 IU/mg, ktorý zahŕňa kroky: (a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého; (b) elúciu vzorky na ionomeničovom chromatografickom stĺpci; (c) elúciu na druhom ionomeničovom chromatografickom stĺpci; (d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou; a (e) po podrobenie sa eluátu chromatografii rozlišujúcej podľa veľkosti.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu čistenia choriogonadotropínu, najmä čistenia rekombinantného ľudského choriogonadotropínu (hCG) zo vzorky surového rekombinantného hCG. Uvedený spôsob zahŕňa použitie iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou.

Doterajší stav techniky

Choriogonadotropm je heterodimér pozostávajúci z nekovalentne viazaných a a β podskupín.

Choriogonadotropm sa podáva ženám na vyvolanie ovulácie po stimulácii folikulámeho vývoja folikuly stimulujúcim hormónom alebo ľudskými menopauzálnymi gonadotropínmi pri liečbe anovulárnej neplodnosti v dôsledku nízkych koncentrácií gonadotropínov. Jednotlivé dávky 5 000 až 10 000 jednotiek sa podávajú intramuskuláme injekciami na napodobenie stredového maxima cyklu luteinizačného hormónu, ktorý normálne stimuluje ovuláciu. Choriogonadotropm sa podáva tiež v spojení s menotrofmom a niekedy tiež s citrátom klomifénu (orig.: clomiphene) ako doplnok k in vitro fertilizačným postupom a v ďalších asistovaných koncepčných technikách, zahŕňajúcich superovuláciu a zber oocytov. U mužov sa používa v liečbe prepubertálneho kryptorchízmu. Režimy podávania sú v širokom rozmedzí, ale dávky sú zvyčajne v rozmedzí od 500 do 4 000 jednotiek intramuskulámou injekciou tri razy za týždeň.

Uvedená látka sa podáva tiež pri mužskej neplodnosti spojenej s hypogonadotrópnym hypogonadizmom. Aj v tomto prípade môže byť režim podávania veľmi rozdielny a dávky majú byť v rozmedzí od 500 do 4 000 jednotiek dva až tri razy za týždeň. Na umožnenie normálnej spermatogenézy sa často pridáva látka s folikulárne stimulujúciou aktivitou, ako je menotrofín. Na oligospermiu možno využiť dávky až do 3 000 jednotiek choriogonadotropínu týždenne s menotrofmom alebo iným folikulárne stimulujúcim prostriedkom. V liečbe oneskorenej puberty spojenej s hypogonadizmom u mužov sa podáva dávka 500 až 1 500 jednotiek dva razy za týždeň; uvedená dávka má byť nastavená v závislosti od koncentrácie testosterónu v plazme.

Na izoláciu a čistenie hCG zo vzoriek surového moču sa používajú rôzne spôsoby (Birken a ďalší, Endocrinology, 133(3), 1390 až 1397 (1993); Sakakibara a ďalší, Chem. Pharm. Bull., 35(5), 1414 až 1416 (1990); Dinini a ďalší, Acta Endocrinol. 73(1), 133 až 145 (1973)). Na čistenie hCG z moču boli nedávno vyvinuté a použité rôzne spôsoby afinitnej chromatografie, nazvané membránová filtračná afinitná chromatografia (Xu a ďalší, Proteín Expression and Purification 16, 221 až 223 (1999)). Uvedený spôsob obchádza používanie Sepharose aktivovanej s BrCN ako tuhej fázy pre stĺpcovú afinitnú chromatografiu a predstavuje úpravu zvyčajných spôsobov čistenia hCG afinitnou chromatografiou zo vzoriek moču. Imunoaktivita týmto spôsobom čisteného hCG bola 8 554 IU.mg’¹.

Huth et al., Endocrinology 1994, zv. 135(3), str. 911-918 opisuje purifikáciu /3 podjednotky hCG produkovaného v bakteriálnom expresnom systéme, zostavenie rekombinatnej hCG β podjednotky a hCG a podjednotky z moču, a purifikáciu diméru prostredníctvom aniónovej výmennej chromatografie.

WO 98/56808, zverejnená v decembri 1998, opisuje spôsob purifikácie anti CD-18 prekurzorovej protilátky, ktorý zahŕňa iónovú výmennú chromatografiu ako aj hydrofóbnu interakčnú chromatografiu (HIC).

WO 98/56808, zverejnená v septembri 1990, opisuje modifikované formy reprodukčných hormónov a farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú.

Prednosťou rekombinantného hCG je, že neobsahuje iné gonadotrópne hormóny a nečistoty ľudského pôvodu, najmä tie, ktoré sú obsiahnuté v ľudskom moči. Surové preparáty rekombinantného hCG obsahujú ale všetky ďalšie proteíny a nečistoty z buniek, použitých v procese rekombinantnej prípravy a preto je veľmi naliehavá požiadavka na spôsob, ktorým by sa dosiahla úplná čistota rekombinatného choriogonadotropínu.

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že surový preparát hCG, odvodený z koncentrovanej vzorky kultivačného prostredia z rekombinantného procesu alebo zo surového koncentrátu moču tehotných žien, možno čistiť tak, že výsledný hCG prakticky neobsahuje proteíny alebo iné znečisťujúce látky, obsiahnuté v surovom preparáte hCG.

Uvedený spôsob čistenia je založený na použití iónovo-výmennej chromatografie a HPLC s reverznou fázou. Možné použitie ďalšej kolóny na veľkostné vylúčenie umožňuje odstránenie všetkých zvyškov znečistenín. Optimálne výsledky sa dosiahnu pri použití najmenej dvoch stupňov iónovo-výmennej chromatografie.

Spôsob podľa tohto vynálezu možno použiť na čistenie rekombinantného hCG zo surového preparátu kultivačného prostredia, získaného z rekombinantného procesu. Takto získaný r-hCG má vysoký stupeň čistoty a vysokú špecifickú bioaktivitu (v romedzí 23 000 až 28 000 IU.mg’¹), je prakticky bez prosteínov fetálneho bovinného séra (FBS), ak bolo prítomné v kultivačnom prostredí, a nukleových kyselín alebo iných nečistôt, obsiahnutých v hostiteľských bunkách, použitých v rekombinantnom procese.

SK 287146 Β6

Spôsob podľa tohto vynálezu možno použiť tiež na čistenie hCG získaného z moču, pričom sa vychádza zo surového koncentrátu moču tehotných žien; ďalej ho možno použiť na čistenie CG z iných druhov cicavcov vrátane, napríklad kráv, koní, bravov, oviec a opíc.

Podstatou vynálezu je spôsob prípravy rekombinantného hCG, majúceho špecifickú bioaktivitu v rozsahu 23 000 až 28 000 IU/mg, ktorý zahŕňa kroky: (a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého; (b) elúciu vzorky na ionomeničovom chromatografickom stĺpci; (c) elúciu na druhom ionomeničovom chromatografickom stĺpci; (d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou; a (e) podrobenie sa eluátu chromatografii rozlišujúcej podľa veľkosti.

Aby sa dosiahli optimálne výsledky spôsobu čistenia, je výhodné uskutočniť dva kroky iónovo-výmennej chromatografie, každý v iných podmienkach. Výhodné uskutočnenie uvedeného spôsobu podľa tohto vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého;

(b) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci DEAE Sepharose;

(c) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci CM-Sepharose;

(d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou C₎₈ oxidu kremičitého a (e) elúciu na chromatografickom stĺpci Sephacrylu na vylúčenie podľa veľkosti.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa elúcia ionomeničového stĺpca DEAE Sepharose výhodne uskutočni tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 7,5.

Elúcia ionomeničového stĺpca CM-Sepharose sa výhodne uskutoční tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 6.

HPLC s reverznou fázou (krok (d)) sa výhodne uskutoční s 2-propanol/Tris-fosforečnanovým tlmivým roztokom ako mobilnou fázou.

Uvedený CG podľa tohto vynálezu je výhodne ľudský CG a najvýhodnejšie je to rekombinantný hCG, odvodený z kultivačného prostredia CHO buniek, použitých v rekombinantnom procese.

Vynález sa týka spôsobu čistenia hCG, najmä spôsobu čistenia rekombinantného hCG zo surového preparátu z kultivačného prostredia rekombinantného procesu. Uvedený r-hCG sa získa vo vysokom stupni čistoty a s vysokou špecifickou bioaktivitou (v rozmedzí 23 000 až 28 000 IU.mg'¹) a je prakticky bez proteínov fetálneho bovinného séra, ktoré sú prítomné v kultivačnom prostredí a bez nukleových kyselín alebo iných nečistôt, obsiahnutých v hostiteľských bunkách, použitých v rekombinantnom procese. Vynález je zameraný najmä na využitie v oblasti biologických materiálov, bližšie na využitie pri čistení surových zmesí obsahujúcich hCG a znečisťujúce proteíny; uvedené biologické materiály sa v ďalšom texte označujú ako východiskové materiály. V ďalšom podrobnejšie uvedené príklady využívajú východiskové materiály obsahujúce r-hCG, získané zo supematantov z prostredia bunkových kultúr z bioreaktora. Alternatívne sa ako východiskový materiál použije surový koncentrovaný moč tehotných žien.

Východiskový materiál tvorí čerstvo oddelený supematant prostredia bunkovej kultúry po dvoch dňoch prechodov bioreaktorom. Supematant sa výhodne číri filtráciou. Ak treba, surový roztok sa skoncentruje a chromatografuje na C₄ oxide kremičitom na odstránenie nečistôt pochádzajúcich z bunkovej kultúry.

Polovyčistený výťažok, po ultrafiltrácii, sa potom podrobí iónovo-výmennej chromatografií, ktorá sa výhodne raz opakuje a výhodne pri rôznych podmienkach; nasleduje HPLC s reverznou fázou. Prvý krok s DEAE Sepharose iónovo-výmennou chromatografiou možno uskutočniť ako v podstate hCG „prietokový“ krok (orig.: „Flow-through“ step), v ktorom sa eliminuje veľká časť ne-hCG proteínov a DNA. Druhý ionomeničový krok, výhodne na stĺpci CM-Sepharose, je hCG väzbovým krokom a odstraňujú sa pri ňom zvyšky DNA a hostiteľských buniek alebo proteínových nečistôt z prostredia. Vo výhodnom uskutočnení sa tento krok uskutoční pri približne 5 °C elúciou tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH približne 6.

Chromatografia s reverznou fázou na stĺpci C_]8 oxidu kremičitého účinne odstraňuje zvyšné stopové množstvá nukeových kyselín a znečistenín pochádzajúcich z bunkových kultúr. Elúcia stĺpca sa výhodne uskutoční 2-propanolom/Tris-fosforečnanovým tlmivým roztokom ako mobilnou fázou. Zachytený roztok sa potom výhodne podrobí 10 kD deliacej ultrafiltrácii, skoncentruje sa a môže sa spracovať s hydrogenuhličitanom amónnym pri pH 8. Koncentrovaný produkt sa potom spracuje chromatografickým delením podľa veľkosti na stĺpci Sephacrylu S200 HR. V tomto kroku sa delenie založené na veľkosti molekuly dosiahne elúciou hydrogenuhličitanom sodným pri pH 8 a odstránia sa ešte možné stopové množstvá znečistenín z bunkovej kultúry, potenciálne agregáty a voľné hCG podskupiny. Eluát sa môže potom podrobiť dialýze ultrafiltráciou na membránach s 10 kD hranou, výhodne v tlmivom roztoku fosforečnanu sodného pri pH 7. Po filtrácii sa vyčistená dávka hCG výhodne uchováva v sterilných flaštiČkách pri nízkej teplote.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Reakčné činidlá:

amoniak, analytickej čistoty, hydrogenuhličitan amónny, analytickej čistoty (B. P.), hydrogenfosforečnan disodný, analytickej čistoty, absolútny denaturovaný etanol, kyselina fosforečná, analytickej čistoty, (Ph. Eur.), 2-propanol, analytickej čistoty (Ph. Helv.), chlorid sodný, analytickej čistoty (Ph. Eur.), dihydrogénfosforečňan sodný, analytickej čistoty, hydroxid sodný, peletky, analytickej čistoty (Ph. Eur.), trifluóroctová kyselina (TFA), čistota pre HPLC, tris-(hydroxymetyl)aminometán, analytickej čistoty.

Prehľadný vývojový diagram čistiaceho procesu

Východiskový materiál získaný z procesu kultivácie buniek sa čistí a skoncentruje v piatich postupných chromatografických krokoch.

Ďalej uvedený vývojový diagram (tabuľka 1) zhŕňa výhodné uskutočnenie procesu čistenia r-hCG, zahŕňa živiče použité pri stĺpcovej chromatografii a zahŕňa princípy operácií v jednotlivých krokoch.

Tabuľka 1

Prehľad procesu čistenia r-hCG - vývojový diagram

Krokl	kultivačné prostredie z bioreaktora I chromatografia na C₄ oxide kremičitom (eluát obsahuje r-hCG) I ultrafiltrácia s hranou 10 kD (retentát obsahuje r-hCG) I skoncentrovaný surový r-hCG I
Krok II	DEAE Sepharose FF (Neviazaná frakcia obsahuje r-hCG) I
Krok III	CM Sepharose FF (eluát obsahuje r-hCG) I
Krok IV	RP-HPLC na C₁₈-oxide kremičitom (eluát obsahuje r-hCG) I ultrafiltrácia (10 kD)
Krok V	Sephacryl S-200 HR (eluát obsahuje r-hCG) I roztok získaného r-hCG

Podrobný opis vývojového diagramu a opis postupu sa uvádza v ďalšom texte. Podmienky v kroku viazania (Krok I) sú také, aké sa bežne používajú v prípadoch, keď východiskový surový materiál má rekombinantný pôvod.

Krok I (krok viazania)

V tomto kroku (Krok I) sa dosiahne predbežná koncentrácia a vymení sa tlmivý roztok, aby bolo zaručené zloženie. Tento krok začína pri teplote miestnosti (chromatografia na C₄ oxide kremičitom) a potom pokraču je pri približne +5 °C. Výhodný rozsah teplôt je 5 ± 3 °C. Tento krok sa jednotlivo opakuje pre každý zber počas produkčného cyklu bioreaktora.

(i) Čírenie medziproduktu

Čerstvo oddelené kultivačné prostredie z bioreaktora sa zvyčajne najprv číri filtráciou.

(ii) Chromatografia na C₄ oxide kremičitom

Po vyčirení sa medziprodukt čistí chromatografiou na stĺpci C₄ oxidu kremičitého; kolóna sa vopred uvedie do rovnováhy s 25 mM roztokom fosforečnanu sodného pri pH 7. Výhodná oblasť pH je od 6,6 do 7,7. Stĺpec sa premyje 25 mM roztokom fosforečnanu sodného, až sa monitorovaný UV signál vráti na úroveň pozadia. Produkt sa eluuje 34,2%-ným (hmotnostné) 2-propanolom v 25 mM roztoku fosforečnanu sodného.

(iii) Spracovanie s amoniakom

Potom sa do roztoku pridá amoniak, až sa dosiahne konečná koncentrácia 1 M. Táto zmes sa 6 hodín inkubuje. Roztok sa potom dvojnásobne zriedi vodou, pH sa upraví na 7,5 pomocou kyseliny fosforečnej (85 %-nej). Výhodná oblasť pH je 7,5 ± 0,2.

(iv) Skoncentrovanie a dialýza

Membrány s hranou 10 kD, uchovávané medzi jednotlivými násadami v prostredí 0,05 M roztoku hydroxidu sodného, sa zvlhčia čistenou vodou, až pH klesne na hodnotu približne 8. Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou na 10 kD membráne), aby sa odstránili látky s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 10 kD, a aby sa eliminovali zvyšky 2-propanolu, a aby sa amónny roztok zmenil na 40 mM roztok fosforečnanu sodného s pH 7,5. Výhodná oblasť pH je 7,5 ± 0,2. Výsledný retentát sa získa z membrány pôsobením 40 mM roztoku fosforečnanu sodného tak, aby sa získala cieľová koncentrácia proteínu 3 až 15 mg.mľ¹. Tento roztok sa potom filtruje a výsledný koncentrát sa uchováva zmrazený pri približne -15 °C.

Krok II (Filtrácia a iónovo-výmenná chromatografia na DEAE Sepharose FF)

Tento chromatografický krok je r-hCG „prietokový“ krok, v ktorom sa odstráni veľká časť nie r-hCG proteínov a nukleových kyselín. Filtrácia sa uskutoční pri teplote miestnosti, ale chromatografický krok sa uskutoční v chladnej miestnosti, pričom produkt prechádza kolónou.

(i) Roztápanie a združovanie surových koncentrátov r-hCG

Zmrazené koncentráty sa roztopia a združujú. Z viacerých čistených surových koncentrátov r-hCG, pripravených z rovnakej pracovnej banky buniek sa združí násada, ktorá sa ďalej spracuje. Združovanie rôzneho počtu surových koncentrátov závisí od maximálnej proteínovej väzbovej aktivity (4 mg celkových proteínov na 1 mg živice) nasledujúceho chromatografického kroku čistiaceho procesu.

(ii) Čírenie filtráciou

Uvedený roztok r-hCG sa výhodne prepustí filtračným zariadením a filtre sa premyjú 40 mM roztokom fosforečnanu sodného (pH 7,5). Prefiltrovaný roztok a premývacie roztoky sa spoja.

(iii) Iónovo-výmenná chromatografia na DEAE Sepharose FF

Kolóna plnená ionexom so slabým nábojom, dietylaminoetán (DEAE) Sepharose, s rýchlym prietokom (Fast Flow, FF) sa uvedie do rovnováhy so 40 mM roztokom fosforečnanu sodného (pH 7,5). Potom sa na kolónu privedie roztok r-hCG.

Do kolóny sa nasadí 40 mM roztok fosforečnanu sodného pH 7,5. Chromatografický proces sa monitoruje spektrofotometricky pri 280 nm. Počiatočný podiel až do začiatku výtoku elúcie r-hCG sa vyleje. Zachytáva sa neviazaná frakcia obsahujúca r-hCG.

Krok III (chromatografia na CM Sepharose FF)

V tomto chromatografickom kroku sa odstráni veľká časť hostiteľských buniek. Tento chromatografický krok sa uskutoční pri približne +5 °C. Výhodné teplotné rozmedzie jc 5 ± 3 °C.

(i) Riedenie eluátu z DEAE Sepharose FF

K eluátu z DEAE Sepharose FF sa pridá voda v čistote na injekcie. pH sa upraví na 6 kyselinou fosforečnou (85%-nou). Výhodné rozmedzie pH je 6 ± 0,1.

(ii) Iónovo-výmenná chromatografia na CM Sepharose FF

Kolóna plnená ionexom so slabým nábojom, karboxymetyl (CM) Sepharose, s rýchlym prietokom (FF) sa uvedie do rovnováhy s 20 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6). Výhodné rozmedzie pH je 6 + 0,1. Potom sa na kolónu privedie roztok r-hCG.

Kolóna sa premyje 20 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pH 6. Chromatografický proces sa monitoruje spektrofotometricky pri 280 nm.

Produkt sa eluuje 130 mM tlmivým roztokom fosforečnanu sodného (pH 6). Počiatočný podiel až do začiatku výtoku elúcie r-hCG sa vyleje. Zachytáva sa celý podiel eluátu obsahujúci r-hCG. Získaný produkt možno v tejto etape voliteľne filtrovať na odstránenie kontaminácie vírusmi.

Krok IV (RP-HPLC na C₁₈ oxide kremičitom)

Tento RP-HPLC chromatografický krok na C|₈ oxide kremičitom účinne odstraňuje stopové množstvá znečistenín z bunkových kultúr, zvyšky nukleových kyselín a endotoxíny. Po chromatografickom kroku nasleduje ultrafiltrácia s hranou 10 kD a voliteľne filtrácia.

(i) Príprava alikvotných podielov pH hodnoty alikvotných podielov sa nastavia na 5 a pridá sa 2-propanol až do výslednej koncentrácie 15 % (objemových);

(ii) RP-HPLC chromatografia na C₁₈ oxide kremičitom

Kolóna plnená C|₈ oxidom kremičitým sa najprv uvedie do rovnováhy s 15%-ným (objemovo) roztokom 2-propanolu v tlmivom 0,5 M roztoku Tris-fosforečnanu.

Prvý alikvotný podiel sa privedie na kolónu a priebeh chromatograficého procesu sa monitoruje UV spektrofotometriou.

Kolóna sa premýva rovnakým tlmivým roztokom ako pri ustálení rovnováhy.

Elúcia r-hCG sa potom uskutoční s použitím lineárneho gradientu 2-propanolu od 15 % do 25 % (objemových) v Tris-fosforečnanovom 0,5 M tlmivom roztoku ako mobilnej fázy. Zachytáva sa eluát, v ktorom sa identifikoval príslušný spektrofotometrický pík (A₂₈o)· Jednotlivé podiely, ktorých absorbancia je väčšia ako 65 % z maximálnej výšky piku v zvyšujúcej sa časti a väčšia ako 20 % z maximálnej výšky piku v klesajúcej časti, sa spoja.

Štyri spojené podiely obsahujúce r-hCG sa potom združia a zriedia rovnakým objemom vody pre injekcie (water for injection, WFI).

Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou na 10 kD membráne) proti WFI na odstránenie materiálov s molekulovou hmotnosťou nižšou ako 10 kD a na elimináciu 2-propanolu.

Produkt sa potom dialyzuje ultrafiltráciou proti tlmivému 0,1 M roztoku hydrogenuhličitanu amónneho (pH 8).

Výsledný medziprodukt sa uchováva pri približne +5 °C alebo ak sa vyžaduje, uchováva sa zmrazený. Výhodné teploty na skladovanie sú 5 ± 3 °C a rovnajúce sa alebo nižšie ako -15 °C.

Krok V (chromatografia na stĺpci Sephacrylu S-200 HR na veľkostné vylúčenie)

Tento chromatografický krok na veľkostné vylúčenie umožňuje odstránenie všetkých zvyškov znečistenín z bunkovej kultúry, potenciálnych agregátov a/alebo voľných podskupín. Po ňom nasleduje ultrafiltrácia s hranou 10 kD. Uvedené operácie chromatografia na Sephacrylu S-200 HR a ultrafiltrácia sa uskutočnia pri +5 °C. Výhodné teplotné rozmedzie je 5 ± 3 °C.

(i) Vylúčenie podľa veľkosti na Sephacrylu S-200 HR

Kolóna naplnená živicou Sephacryl S-200 HR sa uvedie do rovnováhy s 0,5 M roztokom hydrogenuhličitanu amónneho (pH 8). Výhodné rozmedzie hodnôt pH je 8 ± 0,2.

Roztok r-hCG sa privedie na kolónu a elúcia sa začína použitím 0,5 M roztoku hydrogenuhličitanu amónneho pH 8. Výhodné rozmedzie hodnôt pH je 8 ± 0,2.

Zber frakcií s r-hCG sa začína od začiatku piku a trvá až do poklesu na 50 % maximálnej výšky piku.

(ii) Ultrafiltrácia s hranou 10 kD

Medzi jednotlivým použitím sa 10 kD membrány uchovávajú v 0,05M roztoku hydroxidu sodného a pred použitím sa premyjú WFI až do poklesu pH na asi 8.

Produkt sa skoncentruje a dialyzuje (ultrafiltráciou) proti WFI.

Produkt sa potom dialyzuje (ultrafiltráciou) proti tlmivému 0,01 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 7) a záverečné skoncentrovanie sa uskutoční tak, aby sa dosiahla cieľová konečná koncentrácia 3,5 mg.mľ¹.

Výsledný roztok r-hCG sa výhodne uchováva zmrazený pri -15 °C.

Chromatografické živice

V uvedenom procese čistenia možno použiť nasledujúce chromatografické živice alebo tiež im rovnocen-

né živice:
krokl	C₄ oxid kremičitý, 250 Ä - 50 pm
krok II	DEAE Sepharose FF
krok 111	CM Sepharose FF
krok IV	C₁₈ oxid kremičitý, 300 Ä - 20 pm
krok V	Sephacryl S-200 HR

(Matrex®, Milipore), (Pharmacia), (Pharmacia), (Vydac), (Pharmacia).

Dodávatelia živíc v súčasnosti sú:

Amersham Pharmacia Biotech

Bjorkgatan 30, S-751 84, Uppsala, Švédsko

Millipore Corporation

Cherry Hill Dnve, Danvers, MA 01 923, USA

Vydac, The Separations Group,

434 Mojave St„ Hesperia, CA 92 345, USA.

Výsledky • Molekulová hmotnosť a veľkosť

SDS-PAGE

Pomerná molekulová hmotnosť r-hCG, získaného spôsobom čistenia podľa tohto vynálezu, sa určovala spôsobom SDS-PAGE proti štandardnému proteínu so známou molekulovou hmotnosťou.

Farbenie Coomassiho brilantnou modrou po neredukčnej SDS-PAGE poskytlo jeden široký pás pre r-hCG heterodimér približne pre molekulovú hmotnosť 70 kD (rozmedzie 65 až 75 kD). Identita pásu sa potvrdila pijakovaním (Westem blotting).

• Biologická účinnosť

Biologická účinnosť viacerých násad r-hCG po čistení spôsobom podľa tohto vynálezu sa uvádza v tab. 2. Koncentrácia proteínu sa stanovila spektrofotometricky pri 276,5 nm, a - 0,616.

Stredná špecifická aktivita preparátu r-hCG je mimoriadne vysoká, dosahuje až približne 25 000 IU.mg¹.

Tabuľka 2

Násada r-hCG	Špecifická bioaktivita (IU.mg¹)
BCEA 9901	24 427
BCEA 9902	26 868
BCEA 9903	25 636
BCEA 9904	27 152
BCEA 9905	23 729

• Farmaceutické prostriedky

S vysoko vyčisteným rekombinantným hCG podľa tohto vynálezu sa vyvinuli kvapalné a vymrazovaním sušené prostriedky.

Kvapalný prostriedok

V skúmavkách podľa DIN 2R sa pripravili dva kvapalné prostriedky s 10 000 IU.mg¹ s použitím manitolu alebo sacharózy ako nosiča; pripravené prostriedky sa podrobili skúškam stálosti pri 50, 40, 25 a 4 °C. Zloženie prípravkov sa uvádza v tabuľke 3 a 4.

Tabuľka 3

Zložka	Jednotky	Množstvo
r-hCG	IU.mg	10 000
sacharóza	mg.mľ¹	102,6
kyselina «-fosforečná	mg.mľ¹	0,98
hydroxid sodný		podľa potreby na pH 7,0

Objem plnenia: 0,5 ml.

Tab. 4

Zložka	Jednotky	Množstvo
r-hCG	IU.mg¹	10 000
manitol	mg.mľ¹	54,6
kyselina «-fosforečná	mg.mľ¹	0,98
hydroxid sodný		podľa potreby na pH 7,0

Objem plnenia: 0,5 ml.

Výsledky skúšok stálosti, uskutočnené pomocou Bioassay, SE/HPLC a RP-HPLC, ukázali, že manitolový prostriedok bol stálejší ako sacharózový. Skladovanie bolo výhodnejšie v chladnom prostredí, čím sa minimalizovala oxidácia proteínu a vznik voľných podskupín.

Prostriedok s vymrazovaním

V skúmavkách podľa DIN 2R sa vymrazovaním pripravil prostriedok s aktivitou 5 000 IU; skúšky stálosti sa uskutočnili pri 50, 40, 25 a 4 °C s použitím sacharózy ako nosiča. Zloženie sa uvádza v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Zložka	Jednotka	Množstvo
r-hCG	IU.mg ¹	5000
sacharóza	mg	30
kyselina o-fosforečná	mg	0,98
hydroxid sodný		podľa potreby na pH 7,0

Výsledky skúšok stálosti, uskutočnené pomocou Bioassay, SE/HPLC a RP-HPLC, ukázali, že tento vymrazovaný prostriedok bol pri 40 a 50 °C stály najmenej počas 19 týždňov. Skúšky stálosti pri 25 a 4 °C sa uskutočnili až do 6 mesiacov a ukázali, že nenastal rozklad účinnej látky.

Claims

1. Spôsob prípravy rekombinantného hCG, majúceho špecifickú bioaktivitu v rozsahu 23 000 až 28 000 IU/mg, zo vzorky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky: a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého; b) elúciu vzorky na ionomeničovom chromatografickom stĺpci; c) elúciu na druhom ionomeničovom chromatografickom stĺpci; d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou; a e) podrobenie sa eluátu chromatografií rozlišujúcej podľa veľkosti.

2. Spôsob prípravy rekombinantného hCG podľa nároku 1 zo vzorky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky: a) elúciu vzorky na chromatografickom stĺpci oxidu kremičitého; b) elúciu vzorky na ionomeničovom chromatografickom stĺpci DEAE Sepharose; c) elúciu na ionomeničovom chromatografickom stĺpci CM-Sepharose; d) elúciu na HPLC kolóne s reverznou fázou C]₈ oxidu kremičitého; a e) podrobenie sa eluátu chromatografií na Sephacryle rozlišujúcej podľa veľkosti.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že elúcia na DEAE Sepharose iónovovýmennej živici sa uskutočňuje tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH 7,5.

4. Spôsob podľa nároku 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že elúcia na CM-Sepharose iónovo-výmennej živici sa uskutočňuje tlmivým roztokom fosforečnanu sodného pri pH 6.

5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že HPLC krok (d) s reverznou fázou sa uskutočňuje s tlmivým roztokom 2-propanol/tris-fosforečnan ako mobilnou fázou.

6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že krok (e), chromatografia rozlišujúca podľa veľkosti, sa uskutočňuje s tlmivým roztokom hydrogenuhličitanu amónneho ako mobilnou fázou.

7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že vzorkou je kultivačné prostredie z CHO buniek.

Koniec dokumentu