CN101792481B

CN101792481B - 一种绒毛膜***的纯化方法

Info

Publication number: CN101792481B
Application number: CN 201010132780
Authority: CN
Inventors: 万龙岩; 陈辉; 阮振兴
Original assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Livzon Pharmaceutical Group Inc
Current assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Livzon Pharmaceutical Group Inc
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-03-12
Also published as: CN101792481A

Abstract

本发明提供一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜***的纯化方法。与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本方法具有收率更高的优点，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

Description

一种绒毛膜***的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种***的纯化方法，特别是涉及一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜***的纯化方法。

背景技术

***(gonadotropin，gonadotropic hormone)是指能够促进雌雄两种性腺的发育，增加性激素分泌的一类激素，如脑垂体前叶分泌的黄体生成激素(LH)和***(FSH)，人胎盘绒毛膜分泌的绒毛膜***(HCG)。其中HCG能刺激女性或男性的性腺活力，有促进体内性腺发育的作用，使性机能得到维持或兴奋，适量服用HCG后能使已衰退的或已出现病理性障碍的性分泌机能逐渐恢复正常。HCG由人类胎盘绒毛膜的合胞体滋层细胞合成和分泌，其大量存在于孕妇的尿液中。HCG的制备方法多以孕妇尿液作为原料，通过苯甲酸钠吸附、酒精抽提等过程得到大于120单位/mg的HCG粗品。而国内多采用一步阳离子交换树脂进行纯化得到单位效价大于2500iu/mg的精品，这些方法收率一般都小于80％，同时精品的效价在3000iu/mg左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜***的纯化方法。与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本方法收率可以达到90％以上，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

本发明提出的从孕妇尿液中提取的绒毛膜***的纯化方法，包括以下步骤：

(1)用溶液A对HCG粗品进行提取，提取液流经阴离子交换树脂进行吸附，再用溶液B洗脱，得到洗脱液即为中间体I。

(2)中间体I经阴离子交换凝胶层析，用溶液C洗脱，向洗脱液中加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体II。

(3)将中间体II用溶液D溶解，先后加入溶液E和溶液F除热原，再加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀，分装得成品。

其中所述溶液A为0.05-0.08mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液B为0.08-0.12mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液C含有0.05-0.15mol/L醋酸钠和0.05-0.15mol/L氯化钠，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液D为含有8-12重量％乙酸铵的20-60体积％乙醇溶液；溶液E为0.1-0.3mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.2-0.4mol/L醋酸钙溶液。

例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述溶液A为0.06mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至5.0；溶液B为0.1mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.8；溶液C含有0.1mol/L醋酸钠和0.1mol/L氯化钠，以冰醋酸调节pH至5；溶液D为含有10％乙酸铵的40％乙醇溶液；溶液E为0.2mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.3mol/L醋酸钙溶液。

下面对步骤(1)中的操作进行详细的说明：所述提取的方式优选采用搅拌提取；优选情况下，提取液在吸附前先用3-8mol/L氢氧化钠调pH至4.5-5.0；所述阴离子交换树脂优选为DE-23阴离子交换树脂和/或DEAE阴离子交换树脂。

下面对步骤(2)的操作进行详细的说明：所述阴离子交换凝胶优选为CM·sephadax c-50；优选情况下，所述中间体I在经阴离子交换凝胶层析前调节其电导值，使中间体I的电导值比溶液B的电导值略低，pH值与溶液B相同；沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在干燥前先用无水乙醇对沉淀进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。

下面对步骤(3)中的操作进行详细的说明：除热原操作可以为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用5-12mol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.5，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用5-12mol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.0，离心后上清液用冰醋酸调整pH至6.5-7.5；例如，在本发明的一种优选的实施方式中，除热原操作为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0，离心得到的上清液用冰醋酸调整pH至7.0；所述沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用为95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在干燥前先用无水乙醇对沉淀进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。优选地，所述除热原和分装均在十万级精烘包区域内进行。

本发明提供的纯化方法与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本方法收率可以达到90％以上，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1本发明提供的从孕妇尿液中提取的绒毛膜***的纯化工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例

工艺操作过程：

实施例使用的纯化工艺流程图如图1所示，具体的操作方法如下：

1混合、提取、吸附、洗脱：

1.1混合、提取：

精确称取绒毛膜***粗品加入不锈钢桶内，再加入20倍量体积的溶液A搅拌提取，搅拌速度200-400转/分，控制温度0-15℃，提取1-1.5小时。在4000转/分、机内温度2-6℃条件下离心30分钟，取上清液，渣子再用10倍量体积溶液A搅拌提取1小时，在离心4000转/分、机内温度2-6℃条件下离心30分钟，取上清液。合并两部分上清液，用5mol/L氢氧化钠调pH值至4.5-5.0。

1.2吸附洗脱：

将上述溶液放置高位，流经一根DEAE填料柱(10L)，流速为80-100ml/min。控制温度0-15℃，用溶液B洗脱，洗脱速率为80-100ml/min，OD280明显上升时开始收集，OD280明显下降时停止收集，收集洗脱液(即中间体I)。调节洗脱液电导值比溶液B的电导值略低，pH值与B溶液一致，待上样。

2层析、洗脱、沉淀、干燥

2.1层析：

将上样液放置高位，温度0-10℃，流入一根CM·sephadax c-50柱，流速50-100ml/分钟，柱体积10L，上样完毕用B溶液洗涤(流速50-100ml/分钟)至流出液OD值在280nm处小于0.1/ml，同步观察色带是否均衡、平整，洗涤体积约2-3柱体积。

2.2洗脱：

洗涤完毕即用溶液C进行洗脱，流速50-100ml/分，用相应容器收集活性部分(紫外分光度计测定OD值，当OD值升至0.3/ml时开始收集，当OD值明显下移即停止收集)，收集液合并，量取体积，测定计算并记录其总OD值，得洗脱液。

2.3沉淀：

将洗脱液放置于不锈钢桶内，在搅拌下缓慢地加入5倍体积的-10-0℃的95％药用级乙醇，继续搅拌至沉淀物出现，移入冷库0-10℃高位存放过夜。

2.4干燥：

次日在冷库内虹吸去除上清液，沉淀部分移入离心室，用广口离心杯在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)10分钟，将上清液倾入规定收集桶内(回收)，沉淀物加入4-8倍量的-10℃的无水乙醇，用油画笔充分搅碎、搅匀，洗涤、脱水后，再在天平上平衡离心(4-6℃、4000转/分钟)10分钟，反复三次，弃去上清液后，沉淀连离心杯用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压干燥(在不锈钢盘内放有五氧化二磷)，真空度控制在-0.1Mpa，干燥24小时，其间更换5次五氧化二磷，得中间体II。将其保存于洁净的玻璃药瓶内，4℃冰箱内保存，并取样20mg置于洁净西林瓶内，加盖后贴上标签、测定生物效价。

3混和、除热原、沉淀、干燥、分装

3.1混和：

精确称取14g中间体II(约2000万单位)放入相应不锈钢容器内，加入200ml的0-15℃的溶液D，以台式无级调速搅拌机，中速搅拌至完全溶解。将溶解液倒入洁净广口离心杯内，在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)30-45分钟，弃渣，上清液倒入相应不锈钢容器内，补加溶液D至400ml，环境温度4-10℃。

3.2除热原：

在机械搅拌器中速搅拌下，向上述上清液中缓慢加入40ml溶液E，搅拌1小时，再滴加40ml溶液F，用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0(用精密试纸测定)，搅拌30分钟，倒入洁净无热原带盖离心杯内，在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)1小时，弃渣，上清液中再缓慢加入40ml溶液E，搅拌1小时，再滴加40ml溶液F，搅拌30分钟，用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0(用精密试纸测定)，倒入洁净无热原带盖离心杯内，在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)1小时，弃渣，上清液用冰醋酸调整pH至7.0。

3.3沉淀：

根据上清液体积放入相应不锈钢桶内，加4倍量-10-0℃的95％药用乙醇沉淀过夜。

3.4干燥：

次日倾去上清液，沉淀部分连同不锈钢桶移入离心室，沉淀部分倾入带盖无热原离心杯中，经天平平衡后，离心(4-6℃，4000转/分钟)10分钟，上清液倾入规定收集桶内(回收)。向沉淀中加入4-8倍量-10℃无水乙醇，用不锈钢药勺搅匀、搅拌研碎。洗涤脱水后再在天平上平衡，离心(4-6℃，4000转/分钟)10分钟，反复三次，弃去上清液后，装有沉淀物的离心杯用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压干燥(在不锈钢盘内放有五氧化二磷的条件下)，真空度控制在-0.1Mpa，更换4-5次五氧化二磷，干燥时间约30小时后，得无热原干燥品，在精密天平上称量后，保存于玻璃药瓶内，4℃冰箱保存。

3.5分装

将无热原块状成品放入无热原60目不锈钢筛网中，用玻璃研头研碎，放入相应无热原玻璃药瓶中，用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内，室温减压干燥(在放有五氧化二磷的条件下)，真空度控制在-0.1Mpa，更换1-2次五氧化二磷，干燥时间约10小时，取样150mg，根据药典标准作全项测定。成品加盖、密闭封口后保存于4℃冰箱内，待化验合格，办理入库手续。

以上除热原，分装操作均在10万级精烘包区域内进行。

其中在不同的实施例中使用的溶液的配方如表1所示：

表1

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					溶液A	0.06mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.8	0.08mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.9	0.07mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5	0.05mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2
溶液B	0.1mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.8	0.09mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5	0.08mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.9	0.11mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2
					溶液C	含有0.1mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至4.8	含有0.08mol/L醋酸钠、0.11mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至5	含有0.12mol/L醋酸钠、0.07mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至4.9	含有0.09mol/L醋酸钠、0.13mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至5.2
溶液D	40体积％乙醇水溶液，含8重量％乙酸铵	30体积％乙醇水溶液，含10重量％乙酸铵	50体积％乙醇水溶液，含11重量％乙酸铵	45体积％乙醇水溶液，含9重量％乙酸铵
					溶液E	0.2mol/L磷酸钠	0.15mol/L磷酸钠	0.25mol/L磷酸钠	0.2mol/L磷酸钠
溶液F	0.3mol/L醋酸钙	0.25mol/L醋酸钙	0.35mol/L醋酸钙	0.3mol/L醋酸钙

二、质量标准与检验方法

1.质量标准：

尿促性素粗品：每mg HCG效价3.7-5.0单位，干燥失重≤10％；

成品：每mg HCG效价≥150单位；

粗品→成品收率：＞90％。

2.检验方法

a.用溶媒(pH7.0±0.2的每1ml含有1mg牛血清蛋白的生理盐水溶液)将标准品和待测品分别配制成含HCG高、中、低三种浓度的溶液，相邻两个剂量的比值(r)为0.5，所有标准品和待测品溶液的高剂量浓度相同。

b.每次实验(同时安排2个标准品和8个待测品进行实验)将41-60g雌性大鼠按体重随机分成31组，每组8只，第1-30组为给药组，按顺序在每日基本相同的时间内，每鼠背部皮下注射HCG溶液0.5ml，连续给药3日，低、中、高剂量组每鼠接受的HCG剂量分别为1.0、2.0、4.0IU，第31组为空白对照组，仅注射溶媒，注射体积与给药组相同。

c.第4日上午按上述给药顺序处死动物，称取每鼠体重，解剖，取出卵巢，小心剥离随着的脂肪等组织，用滤纸吸干卵巢周围的水分并立即称重(精确到0.1mg)，计算每只大鼠的卵巢重(mg)与体重(g)的比值。用bs2000生物统计软件中量反应平等线3.3法计算生物效价。

参考“尿促性素第三批国家标准品的标定”，中国药品标准，2007年第8卷第4期第50-52页；《中国药典》[S]二部，2005，附录XII N。

三、检验结果：

检验结果如表2所示。

表2

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					每mg粗品的HCG效价	4.1	4.5	4.8	4.9
每mg成品的HCG效价	159	174	168	182
					粗品→成品收率	90.5％	94％	92％	95％

通过表2中的数据可以看出，本发明提供的绒毛膜***的纯化方法收率可以达到90％以上，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

Claims

1.一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜***的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用溶液A对绒毛膜***粗品进行提取，提取液流经阴离子交换树脂柱进行吸附，再用溶液B洗脱，得到洗脱液即为中间体I；

(2)中间体I经阴离子交换凝胶层析，用溶液C洗脱，向洗脱液中加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体II；

(3)将中间体II用溶液D溶解，加入溶液E和溶液F除热原，再加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀，分装得成品；

其中，所述溶液A为0.05-0.08mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液B为0.08-0.12mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液C含有0.05-0.15mol/L醋酸钠和0.05-0.15mol/L氯化钠，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液D为含有8-10重量％乙酸铵的20-60体积％乙醇溶液；溶液E为0.1-0.3mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.2-0.4mol/L醋酸钙溶液；

其中，步骤(1)中所述阴离子交换树脂为DEAE阴离子交换树脂；步骤(2)中所述阴离子交换凝胶为CM·sephadax c-50。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述提取操作采用搅拌提取。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述提取液在吸附前用4-5mol/L氢氧化钠调pH至4.5-5.0。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(2)中，在经阴离子交换凝胶柱层析前调节所述中间体I的电导值，使中间体I的电导值比溶液B的电导值略低，pH值与溶液B相同。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，所述除热原操作为在搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用5-12mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5-8.5，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用5-12mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5-8.5，离心得到的上清液用冰醋酸调整pH至6.5-7.5。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，所述除热原和分装均在十万级精烘包区域内进行。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(2)和(3)中，所述沉淀用乙醇为95体积％的药用级乙醇。

8.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(2)和(3)中，所述干燥前以无水乙醇对沉淀进行脱水。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(2)和(3)中，所述干燥操作采用真空干燥。

10.根据权利要求9所述的纯化方法，其中，在步骤(2)和(3)中，所述干燥为在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。