NO328694B1 - Fremgangsmate for fremstilling av rekombinant hCG med spesifikk biologisk aktivitet fra en prove - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av korionisk gonadotropin med spesifikk biologisk aktivitet fra en prøve, og da spesielt fremstilling av rekombinant humant korionisk gonadotropin (hCG) fra en prøve av urent rekombinant hCG (r-hCG). Fremgangsmåten innbefatter bruk av ionebytterkromatografi og reversfase-HPLC.

Korionisk gonadotropin er et hormon som produseres av placenta og som tradisjonelt har vært fremstilt fra urinen fra svangre kvinner.

Hormonet er en heterodimer som består av ikke-kovalent bundne a og (3 underenheter. Dets effekt er i alt vesentlig det samme som for det gonadotropin luteiniserende hormonet. Korionisk gonadotropin blir gitt til kvinner for å indusere eggløsning etter at follikulær utvikling er blitt stimulert med follikkelstimulerende hormon eller humane menopausale gonadotropiner ved behandling av anovulatorisk infertilitet som skyldes fravær av eller lave konsentrasjoner av gonadotropiner. En enkelt dose på fra 5000-10000 enheter blir vanligvis gitt ved intramuskulær injeksjon for å etterligne midtsyklustoppen for luteiniserende hormon som normalt stimulerer eggløsning. Korionisk gonadotropin er også gitt sammen med menotrofin, og enkelte ganger også klomifensitrat som supplement i in vitro befruktningsmetoder og andre assisterte unnfangelsesteknikker som innbefatter superovulering og oocyttoppsamling. Hos menn blir det gitt ved behandlingen av prepubertal kryptorkidisme. Regimene varierer meget sterkt, men dosene ligger vanligvis i området fra 500-4000 enheter tre ganger i uken ved intramuskulær injeksjon.

Korionisk gonadotropin ble også gitt for mannlig infertilitet som er forbundet med hypogonadotrofisk hypogonadisme. Igjen er det en betydelig variasjon med hensyn til doseringsregimet, og dosene varierer fra 500-4000 enheter 2-3 ganger i uken. Et middel med follikkelstimulerende aktivitet så som menotrofin, ble ofte gitt for å etablere normal spermatogenese. For oligospermia blir det vanligvis gitt doser på opptil 3000 enheter av korionisk gonadotropin én gang i uken, sammen med menotrofin eller andre follikkelstimulerende preparater. Ved behandling av forsinket pubertet assosiert med hypogonadisme hos menn, blir det gitt en dose på fra 500-1500 enheter to ganger i uken, og denne dosen bør titreres mot konsentrasjonen av testosteron i plasma.

Det har vært brukt forskjellige fremgangsmåter for å isolere og rense hCG fra ubehandlede urinprøver (Birken et al., Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35(5): 1414-6, 1990: Donini et al., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). Det er nylig utviklet en annen fremgangsmåte for affinitetskromatografi, som betegnes membranfiltreringsaffinitetskromatografi, og denne fremgangsmåten er anvendt for å rense hCG fra urin (Xu et al., Protein expression and purification, 16: 221-3, 1999). Denne fremgangsmåten unngår bruken av BrCN-aktivert Sepharose som en fast fase i affinitetskromatografikolonnen, og representerer en variasjon av de vanlige fremgangsmåter for rensing av hCG ved affinitetskromatografi fra urinprøver. Immunaktiviteten for det rensede hCG ifølge denne fremgangsmåten, er 8554 IU/mg. Teknikkens stand er også beskrevet i J.R. Hueth et al., "Bacterial expression in vitro folding of the P-subunit of human chorionic gonadotropin (hCGP) and functional assembly of recombinant hCGp with hCGa", Endocrinology, Vol. 135, No.3, 1994, pp.911-918, WO 9009800 Al (Univ. Washington), 1990-09-07, J.Evangelista Dyr and J.Suttnar, "Separation and purification of recombinant proteins", J. Chromatography B, Vol.699, 1997, pp.383-401 og i K.A. Barnthouse et al., "Cation-exchange displacement chromatography for purification of recombinant protein therapeutics from variants", J. Biotechnol., Vol.66, 1998, pp.125-136.

Rekombinant hCG har den fordelen at det fullstendig mangler andre gonadotropinhormoner og forurensninger av human opprinnelse, og mer spesifikt, de som er til stede i human urin. Det urene preparatet av rekombinant hCG inneholder imidlertid en rekke andre proteiner og forurensninger fra den cellen som er brukt under dets rekombinante produksjon, og en fremgangsmåte for å oppnå absolutt renhet av rekombinant korionisk gonadotropin er følgelig meget ønskelig.

Vi har nå funnet at et urent preparat av hCG, avledet fra en konsentrert prøve av et kulturmedium oppnådd etter en rekombinant prosess, eller fra et urent konsentrat av urin fra svangre kvinner, kan renses slik at det resulterende hCG praktisk talt er fritt for proteiner og andre forurensninger som var tilstede i det urene hCG-preparatet.

Renseprosessen er basert på bruken av ionebytterkromatografi og reversfase-HPLC. En mulig ytterligere anvendelse av en størrelsesutelukkende kolonne gjør det mulig å fjerne eventuelle gjenværende spor av forurensninger. Det oppnås optimale resultater når det anvendes minst to trinn med ionebytterkromatografi.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan brukes for fremstillingen av rekombinant hCG fra et urent preparat fra et kulturmedium avledet eller fremstilt ved hjelp av en rekombinant prosess. r-hCG oppnås med en meget høy grad av renhet og høy spesifikk bioaktivitet (i området fra 23000-28000 IU/mg), og praktisk talt fritt for storfefosterserum (FBS) proteiner, hvis disse er til stede i dyrkningsmediet, og for nukleinsyrer eller andre forurensninger som var til stede i de vertsceller, som ble brukt i den rekombinante prosessen.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes så vel som for fremstilling av r-hCG fra hCG-holdig urin, ved å starte fra et urent konsentrat av urin fra svangre kvinner, eller for rensingen av CG fra andre pattedyrarter, f.eks. storfe, hest, svin, sau og aper.

Det er en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av hCG fra en prøve, som innbefatter bruk av ionebytterkromatografi og reversfase-HPLC. Fremgangsmåten innbefatter trinn hvor prøven underkastes ionebytterkromatografi og deretter underkastes eluatet en reversfase-HPLC. Et ytterligere trinn som eventuelt kan utføres, er å påsette eluatet en størrelseseksklusjonskolonne.

De to ionebytterkromatografitrinnene blir utført under forskjellige betingelser for å oppnå optimale resultater ved fremstillingsprosessen. En foretrukket utførelse av den foreliggende fremgangsmåten innbefatter følgende trinn: (a) eluere prøven gjennom en silikakromatografikolonne; (b) eluere gjennom en DEAE-Sepharoseionebytterkromatografikolonne; (c) eluere gjennom en CM-Sepharose ionebytterkromatografikolonne; (d) eluere gjennom en Silica-C18-reversfase-HPLC-kolonne; og (e) eluere gjennom en sefakryl størrelseseksklusjonskromatografikolonne.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen blir elueringen gjennom DEAE-sepharoseionebytterkolonnen utført i natriumfosfatbuffer ved ca. pH 7,5. Elueringen gjennom CM-sepharoseionebytterkolonnen blir fortrinnsvis utført i en natriumfosfatbuffer ved ca. pH 6.

Reversfase-HPLC-trinnet (d) blir fortrinnsvis utført med 2-propanol/tris-fosfatbuffer som den mobile fasen.

CG ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis humant CG, og mest foretrukket rekombinant hCG, avledet eller isolert fra dyrkningsmediet av CHO-celler som er brukt i den rekombinante prosessen.

En farmasøytisk sammensetning eller et preparat som innbefatter en terapeutisk

effektiv mengde av renset rekombinant hCG fremstilt ved fremgangsmåten, som er beskrevet ovenfor, sammen med egnede fortynningsmidler, kan dermed fremstilles. Et eksempel på et egnet fortynningsmiddel er sukrose, som letter stabiliseringen av det frysetørkede produktet. Den farmasøytiske sammensetningen som inneholder rekombinant hCG er spesielt godt egnet for subkutan administrering.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for rensingen av hCG, spesielt rensingen av rekombinant hCG fra et urent preparat fra et dyrkningsmedium i en rekombinant prosess. r-hCG blir oppnådd med meget høy renhetsgrad og høy spesifikk bioaktivitet (i området fra 23000-28000 IU/mg), og praktisk talt fritt for (FBS) føtale, bovine serumproteiner som er til stede i dyrkningsmediet, og for nukleinsyrer eller andre forurensninger som var til stede i de vertsceller, som ble brukt i den rekombinante prosessen. Oppfinnelsen kan anvendes på biologiske prøver og materialer, da spesielt urene blandinger som inneholder hCG og andre forurensende proteiner, i det etterfølgende betegnet som prøver på utgangsmaterialet. De eksempler som detaljert er beskrevet nedenfor bruker prøver av utgangsmaterialet som inneholder r-hCG oppnådd fra celledyrkningssupernatantmedium fra en bioreaktor. Alternativt er prøven uren konsentrert urin fra svangre kvinner.

Prøven består av nylig oppsamlet celledyrkningssupernatantmedium som har gått

gjennom en bioreaktor i løpet av to døgn. Supernatanten blir fortrinnsvis gjort klar ved hjelp av filtrering. Hvis det er nødvendig kan den urene løsningen konsentreres og underkastes C4 silikakromatografi for å fjerne forurensninger som er avledet fra cellekulturen.

Den halvrensede prøven etter ultrafiltrering, blir så underkastet ionebytterkromatografi, som fortrinnsvis ble utført to ganger, og fortrinnsvis under forskjellige betingelser, og reversfase-HPLC. Først kan det utføres et DEAE-Sepharoseionebyttertrinn, som i alt vesentlig virker som et hCG «gjennomstrømnings»trinn, hvor størstedelen av ikke-hCG-proteinene og DNA blir eliminert. Et nytt ionebyttertrinn, fortrinnsvis gjennom en CM-Sepharosekolonne, virker som et hCG-bindingstrinn, og fjerner gjenværende DNA og forurensende proteiner fra vertscellene eller mediet. I en foretrukket utførelse blir dette trinnet utført ved ca. 5 °C og med en eluering med natriumfosfatbuffer ved pH ca. 6. Reversfasekromatografi på en Silica-C18-kolonne vil effektivt fjerne spor av nukleinsyrer og forurensninger som kommer fra celledyrkningsmediet. Kolonnen blir fortrinnsvis eluert med 2-propanol/tris-fosfatbuffer som den mobile fasen. Retentatløsningen blir så fortrinnsvis underkastet en 10 kD elimineringsultrafiltrering, konsentrert og kan så innvinnes ved hjelp av ammonium hydrogenkarbonat ved pH 8. Det konsentrerte produktet kan så påsettes en størrelseseksklusjonskromatografisk kolonne på Sephakryl-S200-HR. I dette trinnet er separasjonen basert på molekylær størrelse, og oppnås ved eluering med ammoniumhydrogenkarbonat pH 8 for å fjerne mulige spormengder av cellekulturavledede forurensninger, potensielle aggregater og frie hCG underenheter. Eluatet kan så underkastes dialyse ved ultrafiltrering på membraner med 10 kD som grense, fortrinnsvis i natriumfosfatbuffer pH 7. Etter filtreringen blir det rensede hCG fortrinnsvis lagret i sterile kolber ved lav temperatur.

EKSEMPEL 1

Reagenser:

Ammoniakk, analytisk kvalitet

Ammoniumhydrogenkarbonat, analytisk kvalitet (B.P.)

Di-natriumhydrogenfosfat, analytisk kvalitet

Absolutt denaturert etanol

Fosforsyre, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)

2-propanol, analytisk kvalitet (Ph.Helv.)

Natriumklorid, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)

Natriumdihydrogenfosfat, analytisk kvalitet

Natriumhydroksidpellets, analytisk kvalitet (Ph.Eur.)

Trifluoreddiksyre (TFA), HPLC-kvalitet

Tris-(hydroksymetyl)aminometan, analytisk kvalitet.

Prosessdiagram for renseprosessen

Innhøstet materiale fra celledyrkningsprosessen ble renset og konsentrert ved hjelp av en serie på 5 kromatografiske trinn.

Det følgende prosessdiagram (tabell 1) gir en oversikt over en foretrukket utførelse av r-hCG-renseprosessen, og angir de harpikser som ble brukt i de kromatografiske kolonner, foruten driftsprinsippene for hvert av de mellomliggende trinn.

Et detaljert prosessdiagram og en beskrivelse av fremgangsmåten er gitt i det etterfølgende. De betingelser som er gitt for innfangingstrinnet (trinn I) er de som normalt anvendes når det urene materialet er av rekombinant opprinnelse.

Trinn I (innfangingstrinn)

I dette trinnet (trinn I) blir det oppnådd en første konsentrasjon, og bufferen blir forandret slik at den får en kontrollert sammensetning. Dette trinnet startes ved romtemperatur (silika C4 kromatografi) og blir så fortsatt ved ca. +5 °C. Et foretrukket temperaturområde er 5+3. Dette trinnet blir gjentatt individuelt for hver innhøsting under produksjonssyklusen for bioreaktoren.

(i) Klaring av den innhøstede prøven.

Ved nylig oppsamlede dyrkningsmedium fra bioreaktoren blir vanligvis først gjort klart ved hjelp av filtrering.

(ii) Silika C4 kromatografi.

Etter klaringen blir de innhøstede prøvene påsatt en C4 silikakromatografikolonne, som på forhånd er blitt ekvilibrert i natriumfosfat 25 mM, pH 7. Et foretrukket pH-område er fra 6,6 til 7,7. Kolonnen blir vasket med natriumfosfat 25 mM inntil UV-kontrollsignalet er tilbake på basislinjen. Produktet blir så eluert med 34,2 %

(vekt/vekt) 2-propanol i natriumfosfat 25 mM.

(iii) Ammoniakkbehandling.

Ammoniakk blir så tilsatt løsningen til en sluttkonsentrasjon på 1 M. Denne blandingen blir så inkubert i 6 timer. Løsningens volum blir så to ganger fortynnet med vann, og pH blir justert til 7,5 ved å bruke 85 % fosforsyre. Et foretrukket pH-område er 7,5+0,2.

(iv) Konsentrasjon og dialyse.

De 10 kD grensemembranene som er lagret i 0,05 M natriumhydroksid mellom de enkelte produksjoner, blir vasket med renset vann inntil pH har gått ned til ca. 8.

Produktet blir så konsentrert og dialysert (ved ultrafiltrering på en 10 kD membran) for å fjerne materialet med en molekylvekt som er lavere enn 10 kD og for å eliminere spor av 2-propanol, og å forandre ammoniakkløsningen til natriumfosfat 40 mM pH 7,5. Et foretrukket pH-område er 7,5+0,2.

Det endelige retentatet blir innvunnet fra membranene ved hjelp av natriumfosfat 40 mM for å oppnå en ønsket proteinkonsentrasjon fra 3-15 mg/ml.

Løsningen blir så filtrert, og det resulterende konsentratet blir så lagret frosset ved ca. -15 °C.

Trinn II (filtrering og ionebytting ved hjelp av DEAE Sepharose FF kromatografi)

Dette kromatografi trinnet er et r-hCG «gjennomstrømnings»trinn, hvor størstedelen av ikke r-hCG proteiner og nukleinsyrer blir eliminert. Mens filtreringen blir utført ved romtemperatur, så blir det kromatografi trinn hvor produktet føres gjennom kolonnen, utført i et kaldt rom.

(i) Opptjening og sammenslåing av de r-hCG konsentrerte urene prøvene

De frosne konsentratene ble tint og slått sammen. En porsjon av det rensede masse r-hCG ble bearbeidet fra en sammenslåing av en rekke r-hCG urene konsentrater fremstilt fra den samme cellebanken. Kriteriet for antall r-hCG urene konsentrater som ble slått sammen, er basert på den maksimale proteinbindingskapasiteten i det neste kromatografiske trinnet av renseprosessen (4 mg totalt protein/mg harpiks).

(ii) Klaring ved filtrering r-hCG løsningen blir fortrinnsvis ført gjennom et filtreringsapparat og filtrene vasket med 40 mM natriumfosfat pH 7,5.

Den filtrerte løsningen og vaskeløsningene blir slått sammen.

(iii) Ionebytterkromatografi på DEAE-Sepharose-FF

Kolonnen pakket med en svakt ladet anionbytterharpiks, dietylaminoetan (DEAE) Sepharose Fast Flow, ble ekvilibrert med 40 mM natriumfosfat (pH 7,5).

r-hCG løsningen ble så påsatt kolonnen.

Kolonnen ble tilført 40 mM natriumfosfat pH 7,5. Den kromatografiske prosessen ble kontrollert ved spektrofotometri ved 280 nm.

Den første løsningen ble kastet inntil toppen begynner å elueres. Den ubundne delen som inneholdt r-hCG ble så oppsamlet.

Trinn III (CM-Sepharose-FF-kromatografi)

I dette kromatografiske trinnet blir en større del av forurensningene fra vertscellene fjernet. Det kromatografiske trinnet blir utført ved ca. +5 °C. Et foretrukket temperaturområde er 5+3.

(i) Fortynning av DEAE-Sepharose-FF-eluatet

Vann for injeksjon ble tilsatt DEAE-Sepharose-FF-eluatet, og pH ble justert til 6 ved å bruke 85 % fosforsyre. Et foretrukket pH område er 6+0,1.

(ii) Ionebytterkromatografi på CM-Sepharose-FF

Kolonnen, pakket med en svakt ladet kationbytterharpiks, karboksymetyl (CM) Sepharose Fast Flow, ble ekvilibrert med 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 6). Et foretrukket pH område er 6+0,1.

r-hCG løsningen ble så påsatt kolonnen. Kolonnen ble vasket med 20 mM natriumfosfatbuffer pH 6. Den kromatografiske prosessen ble kontrollert ved spektrofotometri ved 280 nm.

Produktet ble eluert ved å bruke 130 mM natriumfosfatbuffer pH 6. Den første løsningen fra kolonnen ble kastet inntil toppen begynte å elueres.

Hele toppen som inneholdt r-hCG, ble oppsamlet. Produktet kan eventuelt filtreres på dette trinnet, for å fjerne virusforurensninger.

Trinn IV (RP-HPLC på Silica-C18)

Dette RP-HPLC-kromatografitrinnet vil effektivt fjerne spormengder av celledyrkningsforurensninger, rester av nukleinsyrer og endotoksiner. Det blir fulgt av en 10 kD grense ultrafiltrering og eventuelt filtrering.

(i) Fremstilling av porsjoner

pH på de enkelte porsjoner ble justert til 5 og 2-propanol blir tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 15 % (volum/volum).

(ii) RP-HPLC-kromatografi på Silica-C18.

Kolonnen, pakket med en Silica Cl8 harpiks, blir først ekvilibrert i 15 % (v/v) 2-propanol i tris-fosfat 0,5 M buffer.

Den første porsjonen blir påsatt kolonnen, og kromatografien ble kontrollert ved hjelp av UV-spektrofotometri.

Kolonnen blir så vasket med den samme ekvilibreringsbufferen.

Eluering av r-hCG blir deretter utført med en lineær gradient av 2-propanol/tris-fosfat 0,5 M buffer som mobil fase fra 15-25 % (v/v).

r-hCG blir fraksjonert når den tilsvarende toppen blir påvist ved hjelp av spektrofotometri (A28o)- De fraksjoner hvor absorpsjonen var større enn 65 % av den maksimale topphøyden på den stigende delen, og høyere enn 20 % av den maksimale topphøyden på den fallende delen, blir slått sammen.

Fire r-hCG løsninger blir så slått sammen og fortynnet med en ekvivalent mengde vann for injeksjon (WFI).

Produktet blir så konsentrert og dialysert (ved hjelp av ultrafiltrering på en 10 kD membran), mot nevnte injiserte vann, for å fjerne forbindelser og proteiner med en molekylvekt som er lavere enn 10 kD, og for å eliminere 2-propanol.

Produktet blir så dialysert ved ultrafiltrering mot en

ammoniumhydrogenkarbonatbuffer, 0,1 M, pH 8.

Det resulterende produktet ble lagret ved ca. +5 °C eller frosset hvis dette er nødvendig. Foretrukne lagringstemperaturer er 5+3 °C og lik eller under -15 °C henholdsvis.

Trinn V (størrelseseksklusjonskromatografi på Sephacryl S-200 HR)

Dette størrelseseksklusjonskromatografiske trinn er effektivt for å fjerne spormengder av forurensninger fra celledyrkningsmediet, mulige aggregater og/eller frie underenheter. Det blir fulgt av en 10 kD grenseultrafiltrering. Sephacryl S-200 HR og 10 kD grenseultrafiltreringstrinn blir utført ved ca. +5 °C. Et foretrukket temperaturområde er 5+3 °C.

(i) Størrelseseksklusjon på Sephacryl S-200 HR

Kolonnen blir pakket med Sephacryl S-200 HR harpiks som blir ekvilibrert med ammoniumhydrogenkarbonat 0,5 M (pH 8). Et foretrukket pH-område er 8+0,2.

r-hCG løsningen ble påsatt kolonnen, og elueringen blir startet ved å bruke ammoniumhydrogenkarbonat 0,5 M, pH 8. Et foretrukket pH-område er 8+0,2.

Oppsamling av r-hCG fraksjonen blir startet fra begynnelsen av toppen, og varer inntil 50 % merket for maksimal topphøyde på den fallende delen av toppen blir nådd.

(ii) 10 kD grenseultrafiltrering.

10 kD grensemembranene blir lagret i 0,05 M natriumhydroksid mellom porsjonene, blir vasket med WFI inntil pH-verdien var falt til ca. 8.

Produktet ble så konsentrert og dialysert (ved ultrafiltrering) mot WFI.

Produktet blir så dialysert (ved ultrafiltrering) mot natriumfosfatbuffer 0,01 M, pH 7, og den endelige proteinkonsentrasjonen ble justert til en ønsket sluttkonsentrasjon på 3,5 mg/ml.

Den resulterende endelige r-hCG masseløsningen blir fortrinnsvis lagret frosset ved -15 °C.

Kromatografiske harpikser

De følgende kromatografiske harpikser kan brukes i renseprosessen: Tilsvarende harpikser kan eventuelt også anvendes.

Disse harpiksene blir for tiden levert av følgende:

Amersham Pharmacia Biotech,

Bjorkgatan 30

S-751 84 Uppsala Sverige

Millipore Corporation

17 Cherry Hill Drive

Danvers, MA 01923 USA

Vydac, The Separations Group,

17434 Mojave St.

Hesperia, CA 92345 USA

RESULTATER

• Molekylvekt og størrelse

SDS-PAGE

Den relative molekylvekten på r-hCG, fremstilt ved å anvende rensemetoden ifølge foreliggende oppfinnelse, ble bestemt ved SDS-PAGE mot standard proteiner med kjente molekylvekter.

Komassi brilliant blåfarging etter ikke-reduserende SDS-PAGE, viste et enkelt bredt bånd for r-hCG heterodimeren, med en molekylvekt på ca. 70 kD (område 65-75 kD). Båndets identitet ble bekreftet ved Western blotting.

• Biologisk aktivitet

Den biologiske aktiviteten for forskjellige porsjoner av r-hCG etter rensing ved hjelp av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er angitt i tabell 2. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved spektrofotometri ved 276,5 nm, a = 0,616.

Den midlere spesifikke aktiviteten for r-hCG preparatet er spesielt høy, og er ca. 25000 IU/mg.

Fl<y>tende preparat

Det ble fremstilt to flytende preparater med en konsentrasjon på 10000 IU/ml i ampuller DIN 2R, ved å bruke mannitol eller sukrose som fortynningsmiddel, og preparatene ble underkastet stabilitetsprøver ved 50, 40, 25 og 4 °C.

Sammensetningen er angitt i tabellene 3 og 4.

Resultatene av stabilitetsprøvene som ble utført ved hjelp av en bioprøve, SE/HPLC og RP-HPLC, viste at mannitolpreparatet var mer stabilt enn sukrosepreparatet. Lagring under kjølige betingelser er foretrukket for å minimalisere proteinoksidasjon og dannelse av frie underenheter.

Frysetørket preparat

Det ble fremstilt et frysetørket preparat med en konsentrasjon på 5000 IU i ampuller DIN 2R for stabilitetsprøver ved 50, 40, 25 og 4 °C, ved å bruke sukrose som fortynningsmi ddel.

Sammensetningen er angitt i tabell 5.

Resultatene av disse stabilitetsprøvene, som ble utført ved hjelp av en bioprøve, SE/HPLC og RP-HPLC, viste at dette frysetørkede preparatet var stabilt ved 40 og 50 °C i minst 19 uker.

Stabilitetsprøvene ved 25 og 4 °C ble utført i opptil 6 måneder, og ga ingen indikasjon på en nedbrytning av den aktive bestanddelen.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant hCG som har en spesifikk biologisk aktivitet i området 23 000 - 28 000 IU/mg fra en prøve, karakterisert ved å omfatte følgende trinn: (a) eluere prøven gjennom en silikakromatografikolonne; (b) eluere prøven gjennom en ionebytterkromatografikolonne; (c) eluere gjennom en andre ionebytterkromatografikolonne; (d) eluere gjennom en reversfase-HPLC kolonne; og (e) påsette eluatet en størrelseseksklusjonskromatografikolonne.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant hCG fra en prøve ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter trinnene: (a) eluere prøven gjennom en silikakromatografikolonne; (b) eluere prøven gjennom en DEAE-Sepharose-ionebytterkromatografikolonne; (c) eluere gjennom en CM-Sepharose-ionebytterkromatografikolonne; (d) eluere gjennom en Silica-C18 reversfase-HPLC-kolonne; og (e) påsette eluatet en Sephacryl størrelseseksklusjonskromatografikolonne.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at eluering gjennom DEAE-Sepharose-ionebytterkromatografi blir utført i natriumfosfatbuffer ved pH 7,5.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at eluering gjennom CM-Sepharose-ionebytterkromatografi blir utført i natriumfosfatbuffer ved pH 6.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at reversfase-HPLC-trinnet (d) blir utført med to-propanol/tris-fosfatbuffer som mobil fase.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at størrelseseksklusjonskromatografitrinnet (e) blir utført med ammoniumhydrogenkarbonatbuffer som mobil fase.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at prøven er et kulturmedium fra CHO-celler.