CN113398251B - 一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及重组蛋白领域，一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂及其制备方法。一种人绒毛膜***冻干粉针剂，由包括人绒毛膜***、至少一种赋形剂和至少一种PH调节剂经冻干工艺制备得到。本发明人绒毛膜***冻干粉针剂，采用蔗糖作为冻干赋形剂，在适当的PH条件下进行冻干，得到的冻干产品外观饱满，支撑结构良好。

Description

一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂及其制备方法
技术领域
本申请涉及重组蛋白领域，尤其涉及一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂及其制备方法。
背景技术
hCG的研究和应用最早可追溯至二十世纪三十年代。一直以来以孕妇尿液为原料，通过沉淀、离子交换层析等方法制备。含较多杂质、来源不确定、有传染疾病风险以及批间差异、易发生过敏反应等，在临床使用中存在风险，之后研究者把研发重点放在了利用重组技术制备和生产，并在临床上逐渐取代尿源HCG。
虽然rhCG与u-HCG具有基本相同的分子结构和药理药代特点，但rhCG在纯度、效价和安全性等方面较u-HCG具有较大的优势。rhCG存在于CHO细胞的培养液中，培养液中存在多种杂质，须通过有效的分离纯化方法去除，才能获得纯度、比活和安全性达到药典要求的重组蛋白。目前常用的纯化方法也是多种层析和膜过滤方法的组合。应用研究***股份公司(ARS)采用C4硅胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM琼脂糖凝胶和C18反相层析，再利用超滤浓缩并去除小分子杂质，最后利用凝胶过滤层析去除及游离的α和β亚基，并获得了相关专利(EP2001/000665、ZL 01805363.7)。
根据文献报道信息：上市药品重组绒促性素
Figure BDA0003188708850000011
的粉针制剂处方组成为每支含有285微克重组绒促性素、30mg蔗糖、0.98mg磷酸和氢氧化钠(用于pH调节)。复溶的pH值为6.5至7.5。另外，上市重组绒促性素粉针制剂中用到的辅料是磷酸和氢氧化钠作为缓冲体系维持PH值范围。在注射剂中所用的辅料越少，溶液中的离子根的种类越少，制剂潜在的未知风险就越小。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种稳定性好、有关物质少的重组人绒毛膜***冻干粉针剂。
本发明的另一目的在于提供一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：一种人绒毛膜***冻干粉针剂，由包括人绒毛膜***、至少一种赋形剂和至少一种PH调节剂经冻干工艺制备得到。
进一步的，所述的赋形剂是蔗糖。进一步的，所述的PH调节剂是由一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。进一步的，所述的一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的重量百分比为1：1.6。进一步的，所述PH调节剂将复溶后的PH控制在6.5至7.5。进一步的，所述的人绒毛膜***是使用CHO细胞中发酵表达的重组蛋白rhCG并经纯化获得。进一步的，所述的使用CHO细胞中发酵表达的发酵混合培养基中加入氯化锰，在补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠。
一种人绒毛膜***冻干粉针剂的制备工艺，包括溶液配制、除菌过滤、灌装、冷冻干燥，除菌过滤采用0.22微米的聚醚砜材质的2.5英寸滤芯。进一步的，所述的人绒毛膜***冻干粉针剂的制备工艺，其特征在于溶液配制时，1000ml溶液中包括人绒毛膜***500毫克、一水磷酸二氢钠1.076mg、磷酸氢二钠1.732mg，加注射用水至1000ml。进一步的，一种人绒毛膜***冻干粉针剂的制备工艺，冷冻干燥的工艺参数为：预冻：板层温度-40～-50℃；全速降温；维持时间2-4小时；第一次升华：真空度小于20Pa，1小时内升温至-25～-32℃℃，保持30-40小时，真空度控制在10Pa±2Pa；第二次升华：1小时内升温至0℃，恒温保温5-10小时，真空度控制在20Pa±2Pa，1小时内升温至32℃，真空度控制在20Pa±2Pa，恒温保持5-10小时。
本发明人绒毛膜***冻干粉针剂，采用蔗糖作为冻干赋形剂，在适当的PH条件下进行冻干，得到的冻干产品外观饱满，支撑结构良好。而且采用一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠以重量百分比1∶1.6的缓冲体系，使复溶后的溶液中的离子比较单一可控，从而规避了磷酸中未知杂质对产品的潜在风险。
本发明中人绒毛膜***是用CHO细胞发酵获得，通过前期对发酵参数和细胞等因素的优化后，申请人尝试了对发酵混合培养基和补料培养基的改进，研究了多种特殊添加剂对CHO表达rhCG的影响，发现在培养基中加入锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠可以有效提高rhCG表达水平，并通过纯化工艺，使其纯度达99％以上，符合药典的要求。
附图说明
图1：使用CHO细胞中表达的重组蛋白rhCG的制备工艺图；
图2：为发酵培养第6日时hCG各亚基的相对丰度；
图3：对照品rhCG高效液相色谱图
图4：供试品rhCG高效液相色谱图；
图5：供试品和样品肽谱；
图6：rhCG冻干粉实物图。
具体实施方式
实施例1：使用CHO细胞发酵生产并纯化获得rhCG。
一、发酵所用的细胞、培养基及其他试剂：
发酵所用的CHO细胞为申请人自制，使用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂将携带rhCGα、β亚基的载体转染入CHO细胞K1株中制成，该细胞随后被无血清驯化并已经在申请人rhCG的试验性生产中运用超过18个月。
传代培养基：CD CHO AGT 24.3mg/ml、一水磷酸二氢2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L-精氨酸550mg/ml、L-天冬酰胺1300mg/ml、L-天冬氨酸400mg/ml；
发酵混合培养基：CD CHO AGT 24.3mg/ml、CD OPTICHO AGT 9.66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、生物素0.15mg/ml、叶酸11.5mg/ml、肌醇120mg/ml、氯化钾300mg/ml、葡萄糖5500mg/ml、氯化钠2100mg/ml、大豆水解蛋白30mg/ml；
补料培养基：BalanCD CHO Feee3 66mg/ml、一水磷酸二氢钠2.69mg/ml、磷酸氢二钠4.33mg/ml、L-精氨酸2000mg/L、L-天门冬氨酸4500mg/L、维生素C15mg/L、维生素H 5mg/L叶酸30mg/L、肌醇400mg/L、维生素B12 5mg/L、氯化钾0.0015mg/L、F-68 950mg/L、葡萄糖18000mg/L；
HCG ELISA试剂盒：日本东曹；MnCl2：济南凯创化工有限公司；CD CHO AGT：gibco；
CD OPTICHO AGT：gibco；BalanCD CHO Feee3：irvine scientific；焦磷酸钠：食品级，山东冠特生物工程有限公司；氢化可的松：上海麦克林生化科技有限公司；其他包括PCR试剂和仪器在内的试剂和仪器均为常规国产。
二、基本发酵生产过程：如图1中细胞发酵工艺所示
细胞复苏：
1)取细胞冻存管，置于37℃水浴锅内直至冻存的细胞悬液融化。
2)在吸取冻存细胞转至装有6～7ml CHO传代培养基的离心管内，离心1000rpm，5分钟，去除上清。
3)用分次吸取10mlCHO传代培养基轻轻吹打离心管内底部的成团细胞。
4)接种至装有10mlCHO传代培养基的125ml摇瓶内，使最终体积约为20ml，接种细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml。将摇瓶置于二氧化碳培养箱中36.5±1℃、5±3％CO2、125±10rpm进行培养。
传代：
1)摇瓶培养：将细胞摇瓶放置于二氧化碳培养箱中36.5±1℃、5±3％CO2、125±10rpm进行培养。每天进行细胞计数，当细胞密度达到1.5*106细胞/ml以上时，进行传代，加入CHO传代培养基，调整细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml。
2)wave培养：当细胞密度达1.5*106细胞/ml以上时，在把摇瓶内的细胞液收集到无菌瓶中，通过无菌接管机接种到细胞培养袋子中，调整细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml，将细胞培养袋置于36.5±1℃、20±5rpm摇摆式仪上进行培养。当细胞密度达到1.5*106细胞/ml以上时，进行传代，加入CHO传代培养基，调整细胞密度为0.4-1.0*106个细胞/ml。
发酵：(100L规模)：
当20L体积的细胞培养袋内细胞密度1.5*106细胞/ml以上时，接种20L到提前一夜已经预培养的50L发酵混合培养基里，接种完的当天，定为第一天，在培养第3、6、9天时分别加入10L补料培养基。培养至12天发酵结束(培养参数为：36.5±1℃、pH控制在6.8-7.2、溶氧控制在40-60％，转速控制在60±5转/分)。
发酵结束后和发酵过程中使用实施例1所述的试剂盒检测HCG水平，使用现有文献中的引物PCR检测α亚基、β亚基转录水平(α亚基：上游CTGGTCACATTGTGCTATCTTTC、下游TGAGGTGACGTTCTTTTGGAC；β亚基：上游ATGTTCCAGGGGCTGCTGCTGTT、下游CGCGGTAGTTATTGCACCACACCACCTGA)。
三、发酵过程的优化
经过前期对发酵参数和细胞等因素的优化，我们的方法在12天时间内实现了180mg/L左右的重组蛋白的表达水平。为了进一步提高产量/在类似产量下降低成本，我们自行对定制培养基进行了进一步改进。参考现有技术，尝试向培养基中加入MnCl2(发酵混合培养基中加入3mg/ml)，氢化可的松，焦磷酸钠，结果如下：
表1优化细胞株和发酵混合培养基中添加锰离子对表达水平的影响(三罐样本平均值)
Figure BDA0003188708850000041
进一步研究转录水平结果如图2所示：我们发现优化后的细胞株中β亚基与α亚基比率明显超过了初始细胞株，这意味着在优化后的细胞株中α亚基转录表达可能是限制产量的因素，而在发酵混合培养基中加入MnCl2可以有效提高α亚基转录水平进而提高产量；
表2补料培养基中加入氢化可的松和焦磷酸钠对表达水平的影响(优化后的细胞株，三罐样本平均值)
Figure BDA0003188708850000042
在补料培养基中单独加入氢化可的松或焦磷酸钠并无明显增产效果，而氢化可的松和焦磷酸钠的组合则可以实现明显提高重组蛋白表达量的效果(补料中两者配合可以抑制细胞生长，停滞细胞周期以累积产物)。
组合锰离子、氢化可的松和焦磷酸钠后，我们在12日培养时间中实现了280.22mg/L的高表达水平。
实施例2：rHCG蛋白纯化
如图1中蛋白纯化工艺流程，整个rhCG纯化过程一共包括细胞液下罐处理、亲和层析、第一步超滤、病毒灭活层析、疏水层析、第二步超滤、CHT层析、病毒过滤和无菌过滤。100kg细胞液(以实际下罐为准)纯化四步层析选用的柱子直径分别是350mm，72mm，72mm和40mm。CHT层析填料的高度为15-20cm。2次超滤用的膜均为10KD的聚醚砜超滤膜，具体膜面积按照实际情况选择。病毒预过滤器和病毒过滤器生产厂家均为Merck。具体膜面积按照实际情况选择。
1、发酵液处理
细胞液下罐后，加入一定量的氯化锌溶液，室温放置一段时间后用离心机离心或深层过滤，然后用一定体积的缓冲液顶洗，离心后的溶液放入有冷却水循环的缓冲罐中，再用聚醚砜滤芯前后串联过滤，收获后的溶液为亲和层析上样样品。
2、亲和层析
试剂准备：0.1M NaOH溶液、20％乙醇-0.1M KH2PO4溶液、亲和平衡液：pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+50mmol/L氯化钠、亲和漂洗液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+300mmol/L氯化钠+5mmol/LEDTA金属螯合剂、亲和洗脱液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1.5mol/L氯化钠+0.5mmol/L二硫苏糖醇+0.5mmol/Lβ-巯基乙醇+5％乙醇。
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)0.1M NaOH溶液冲洗：冲洗20～40min；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)亲和平衡液冲洗：用亲和平衡液冲洗柱子，待UV和电导曲线平稳后UV曲线调零，一般冲洗2～4个体积；
5)样品上柱：将样品溶液上柱；
6)亲和平衡溶液冲洗：样品上完后，用亲和平衡溶液冲洗，直到UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗2～4个柱体积；
7)亲和漂洗液冲洗：用亲和漂洗溶液冲洗，直到杂峰出现后UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗2～4个柱体积；
8)亲和洗脱液冲洗(样品洗脱)：用亲和洗脱溶液冲洗，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集洗脱产品，直到UV吸收值低于100mAU时结束收集；
9)0.1M NaOH溶液冲洗：用0.1M NaOH溶液冲洗30～40min；
10)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，直至pH和电导值下降，电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
11)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～10)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
在亲和层析的漂洗液中加入EDTA金属螯合剂，用来防止重金属对目标蛋白的破坏，在细胞发酵的培养基中含锰离子，EDTA金属螯合剂可以去除层析柱中的残留锰离子。
3、第一步超滤
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、离子交换平衡液20mmol/L Tris，pH7.5±0.2；
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，循环冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水将超滤膜冲洗至中性。
离子交换平衡液冲洗：用离子交换平衡液冲洗、湿润超滤膜。
样品超滤：对亲和层析洗脱的样品进行超滤，控制进口压力在1～3bar，出口压力小于1bar，亲和洗脱液先浓缩3倍左右体积，再置换到离子交换平衡液(通常5～8倍浓缩后体积)。作为下一步离子交换层析溶液。
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水冲洗超滤膜至流出的液体为中性。
4、病毒灭活、离子交换层析
病毒灭活：超滤后的样品，搅拌下缓慢加入一定量的TritonX-100，加完后，室温下搅拌，进行病毒灭活。
离子交换层析：
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、离子交换再生液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1mol/L氯化钠，、离子交换平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris、离子交换洗脱液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+0.5mol/L氯化钠；
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)0.5M NaOH溶液冲洗：冲洗20～40min；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)活化：用离子交换再生液活化填料，基本活化2～4个柱体积；
5)平衡：用离子交换平衡液来平衡柱子，平衡3～5个柱体积，直至电导率和pH基线平稳，纯化仪UV280手动归零；
6)上柱：将灭活好的样品溶液加载到柱子中，全部上完后用离子交换平衡液冲洗，直到UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗5～7个柱体积；
7)洗脱：用离子交换洗脱液洗脱样品，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集洗脱产品，直到UV吸收值100mAU时结束收集；
8)再生：用离子交换再生液来洗脱柱子，一般2～4个柱体积；
9)0.5M NaOH溶液冲洗：0.5M NaOH溶液冲洗柱子，冲洗30～40min；
10)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，直至pH和电导值下降，电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
11)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～10)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
5、疏水层析
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、疏水平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1.5mol/L硫酸铵、疏水漂洗液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+1mol/L硫酸铵、疏水洗脱液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+0.5mol/L硫酸铵，疏水缓冲液pH7.5±0.2，20mmol/L Tris+2mol/L硫酸铵。
样品处理：离子交换洗脱后的样品，用疏水缓冲液调节样品电导与疏水平衡液一致(相差2ms/cm之内)，测试调节后样品的pH值，与疏水平衡液pH差值在±0.2之内，如不在范围内，用0.1M盐酸或者0.1M氢氧化钠调节到范围内。
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)0.5M NaOH溶液冲洗：冲洗20～40min；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)平衡：用疏水平衡液来平衡柱子，平衡2～4个柱体积，直至UV、电导率基线平稳，纯化仪UV280手动归零；
5)样品上柱：将调节电导后的离子交换洗脱液加载到柱子中，用疏水平衡液溶液冲洗，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积；
6)漂洗：用疏水漂洗溶液冲洗，直到杂峰出现后UV平稳(UV吸收值低于100mAU)，UV下降速度较缓后换液，一般冲洗2～4个柱体积；
6)样品洗脱：用疏水洗脱液洗脱样品，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集洗脱产品，直到UV吸收值100mAU时结束收集；
7)再生：用注射用水冲洗柱子，一般冲洗2～4个体积；
8)0.5M NaOH溶液冲洗：0.5M NaOH溶液冲洗柱子，冲洗30～40min；
9)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，一般冲洗2～4个体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
10)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～9)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
6、第二步超滤
试剂准备：0.5M NaOH水溶液、0.1M NaOH水溶液、CHT平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L的PB。
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，循环冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水将超滤膜冲洗至中性。
CHT平衡液冲洗：用CHT平衡液冲洗、湿润超滤膜。
样品超滤：对疏水层析洗脱的样品进行超滤，进控制进口压力在1～3bar，出口压力小于1bar，控制样品重量不变，用CHT平衡液为超滤样品量的5-8倍。
超滤膜清洗：用0.5M NaOH冲洗超滤膜，冲洗30min左右。
注射用水冲洗：用注射用水冲洗超滤膜至流出的液体为中性。
7、羟基磷灰石层析(CHT层析)
试剂准备：1M NaOH水溶液、0.1M NaOH水溶液、CHT再生液pH7.5±0.2，1mol/L的PB、CHT平衡液pH7.5±0.2，20mmol/L的PB
纯化过程：
1)注射用水冲洗：冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
2)1M NaOH溶液冲洗：冲洗2～4个柱体积；
3)注射用水冲洗：用注射用水冲洗，直至pH值下降，UV和电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
4)用CHT再生液活化柱子，基本活化2～4个柱体积；
5)用CHT平衡液平衡柱子，平衡2～4个柱体积，直至UV、电导率和pH基线平稳，纯化仪UV280手动归零；
6)样品上柱(收集样品)：将样品全部上柱，样品上完后，用CHT平衡液溶液冲洗，当UV吸收值高于100mAU时，开始收集流穿产品，直到UV吸收值低于100mAU时结束收集；
7)再生：用CHT再生液洗脱柱子，基本冲洗2～4个柱体积；
8)NaOH溶液冲洗：用1M NaOH溶液冲洗柱子，冲洗2～4个柱体积；
9)注射用水冲洗：用注射用水冲洗柱子，直至pH和电导值下降，电导曲线平稳，一般冲洗2～4个柱体积(电导0.1ms/cm以下可提前结束冲洗)；
10)根据柱子载量和样品量，确定上样次数，当需要多次上样时，重复1)～9)操作。最后合并多次收集的洗脱液，用于下一步生产。
8、病毒过滤
用注射用水冲洗预过滤器和病毒过滤器，冲洗好后，进行病毒过滤，当样品溶液全部过滤完后，用20mM的磷酸盐缓冲液顶洗预过滤器和病毒过滤器，收集滤出的液体，用分光光度计测试蛋白浓度，当病毒过滤器出口样品基本无蛋白浓度后，停止收集。
对病毒过滤器进行完整性测试，确定是否合格，如不合格，应重新进行病毒过滤。
根据样品量选择合适的病毒预滤器和病毒过滤器。
9、无菌过滤
根据样品量来选择无菌过滤器。将无菌过滤器和无菌储液袋相连，将病毒过滤后的样品溶液过滤到无菌储液袋中，样品全部过滤完后，用20mM的磷酸盐缓冲液顶洗过滤器，用分光光度计测试蛋白浓度，基本无蛋白浓度后，停止过滤。
10、分装
根据样品量，分装至无菌储液袋中，-20℃以下保存。
实施例3：高效液相色谱法鉴别
简述：高效液相色谱法是一种专属性高的鉴别方法，根据供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间是否一致进行鉴别，由于本品的含量测定采用高效液相色谱法，因此本法可用于重组绒促性素的鉴别。
仪器与设备：高效液相色谱仪(配紫外检测器)、pH计、电子分析天平。
测定方法：对照溶液：用水制成每1ml中含250μg对照品的溶液(0.25mg/ml)，记录色谱图。
样品溶液：根据OD280测得的浓度，用水制成每1ml中含250μg样品的溶液(0.25mg/ml)，进样，记录色谱图。
结果判定：如图3和4所示，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000101
结论：经测定，3批中试样品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰的保留时间均一致。
实施例4：生物检定法
简述：生物检定法是一种专属性高的鉴别方法，由于本品的效价测定采用生物检定法，因此本法可用于重组绒促性素的鉴别。
动物及实验器具：
动物：取健康合格、出生15～23日、体重9～13g、同一来源雌性幼小鼠，一次实验所用幼小鼠的出生日数相差不得超过3日，体重相差不得超过3g；按体重随机分成6组，每组不少于10只。
器具：电子天平、手术剪、眼科剪、镊子、1ml针筒、扁形称量瓶、培养皿、磨口试剂瓶、50ml滴定管、1000ml或500ml烧杯等。
试剂：牛血清蛋白、氯化钠、纯化水、氢氧化钠。
试验操作：
溶剂配制：取牛血清蛋白2.00g，氯化钠18.00g，加水2000ml溶解，用1mol/L氢氧化钠调节pH值至7.2±0.2。
标准品配制：实验当日，取标准品，按标示效价加含0.1％牛血清白蛋白的0.9％氯化钠溶液溶解并定量稀释配成1ml含10单位的溶液，充分溶解后加0.1％牛血清白蛋白的0.9％氯化钠溶液配成高、中、低浓度的稀释液，相邻两剂量之比为1：0.6，置于2-10℃冰箱内保存，供3日内使用。
供试品配制：按标示效价或估计效价，照标准品溶液的配制法配制，相邻浓度之比值(r)应与标准品相等，标准品与供试品各剂量所致的反应均值应相近。
测定法：取上述动物，按体重均匀分成若干组，每组为10只，每日于大致相同的时间分别给每组动物大腿两侧及后背部皮下注射一种浓度的标准品或供试品溶液0.2ml，每日一次，连续3天。
于最后一次注射后约24小时后，将动物处死，分别称鼠重，然后用手术剪刀将小鼠下腹部剪开暴露二侧子宫，用眼科剪从卵巢与肾脏促剪断，捡起二侧子宫，再从***根部剪断取出子宫，剥离附着的组织，压干子宫内液，称重，记录。
结果判定：测定结果应能使未成年雌性小鼠子宫增重。
三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000111
结论：经测定，3批中试样品均能使未成年雌性小鼠子宫增重。
实施例5：肽谱检测方法
简述：肽谱是一种高特异的鉴定方法，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成图谱，记录样品和标准品的各峰的保留时间，计算其相似性，达到特性鉴别目的。
结果判定：如图5所示，供试品溶液的峰形与对照品溶液的峰形相似度应一致(相似度≥0.90)。三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000112
结论：经测定，3批中试样品溶液的峰形与对照品溶液的峰形一致。
实施例6：细菌内毒素
细菌内毒素检测方法
简述：参照细菌内毒素检查法(通则1143)第一法(凝胶法)建立本分析方法。
仪器与用具：试管恒温仪、旋涡混匀器、电热鼓风干燥箱、无热原试管。
试剂：0.25EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂、细菌内毒素检查用水、细菌内毒素标准品。
操作方法：本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。
供试品溶液：根据本品的蛋白含量将供试品浓溶液按照下式计算其最大有效稀释倍数，用细菌内毒素检查用水将供试品浓溶液逐步稀释至最大有效稀释倍数浓度，得到供试品溶液，稀释过程中每一步的稀释倍数不超过10倍。
Figure BDA0003188708850000121
式中MVD表示最大有效稀释倍数；L表示内毒素的限值，单位EU/U；C表示供试品浓溶液的浓度，单位U/ml；λ是鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。
采用凝胶限量法检测：将一定量的鲎试剂和等量的溶液(通常是0.1ml)分别按下表混合，根据鲎试剂供应商的建议将反应混合物恒温孵育一段时间(通常是37±1℃，60±2分钟)，避免振动。
各溶液制备如下：
Figure BDA0003188708850000122
结果判定：
孵育结束后将每支试管或安瓿轮流从恒温箱中直接取出并轻轻翻转180°观察结果，如果内容物形成结实凝胶并在试管翻转后不从管壁滑脱，则记为阳性；如果未形成完整的凝胶，则记为阴性。
当阳性对照溶液B和C中所有重复管均为阳性结果以及阴性对照溶液D所有重复管均为阴性结果时，试验方为有效。如果溶液A的两支重复管均为阳性时，供试品不符合规定。如果溶液A中一管为阳性结果另一管为阴性结果，则需重复此试验，重复试验中，如果溶液A的两管均为阴性结果，则该供试品符合规定。每1mg重组绒促性素中含内毒素的量应小于60EU。
三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000123
结论：经测定，3批中试样品溶液的细菌内毒素均符合标准要求。
实施例7：纯度(SEC-HPLC)
简述：采用HPLC法测定本品的纯度，计算方法采用面积归一化法。SEC-HPLC称为体积排阻色谱，又称凝胶色谱和分子筛色谱，其是以多孔凝胶为固定相，依据样品分子量大小达到分离的目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。根据样品性质可分为凝胶过滤和凝胶渗透，凝胶过滤主要用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、核苷酸、多糖等。凝胶渗透主要用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。纯度分析方法验证内容见含量项下，因纯度和含量检测方法相同。
测定法：用水制成每1ml中含约250μg样品的溶液(0.25mg/ml)，精密量取40μl注入液相色谱仪，记录色谱图。空白对照为水溶液，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图。
结果判定：按面积归一化法计算，除***峰外，主峰纯度大于95％。
三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000131
结论：经测定，3批中试样品溶液的纯度均符合标准要求。
实施例8:DNA残留
DNA残留检测方法
简述：本品是采用CHO细胞培养表达制得，需对CHO细胞产生的DNA残留进行检测。采用DNA提取试剂盒提取CHO DNA，然后用CHO DNA检测试剂盒对DNA进行测定，检测方法为荧光定量法，其特异性较好，且具有一定程度耐盐，检测灵敏度高。
计算结果：通过测出的SD值与DNA浓度的量得出线性公式，在将样品的SD值通过计算得出结果，回收率要在80％～120％之间，PCR扩增效率在90％～110％之间，线性R2≥0.98。
可接受标准：DNA残留不得过400pg/mg。
三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000132
结论：经测定，3批中试样品溶液的DNA残留均符合标准要求。
实施例9:HCP残留
HCP残留检测方法，简述：本品是采用CHO细胞培养制得，尽管采用多种纯化方式进行纯化，但可能在药物中还会有微量的宿主蛋白残留(HCP)，从而会对药品的安全性及药性产生影响，因此进行HCP检测。仪器与用具：酶标仪
操作方法：
将试剂及试剂盒取出平衡至室温。在预包被了抗体的酶标板上每孔加入100μlanti-CHO:HRP。将标准品(100ng/ml、40ng/ml、12ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0ng/ml)，质控品(由标准品稀释而来)和供试品各50μl加入到孔中。
产品稀释方法：估计供试品中HCP残留，用PBST20，(0.05％，v/v)稀释到合适浓度，标准品加样顺序从低浓度到高浓度，质控品加样顺序从高浓度到低浓度。
酶标板于室温(24±4℃)条件下180rpm孵育2h。每孔加入250μl稀释好的洗涤液洗涤4次。每孔加100μl TMB底物显色液，室温显色30min，注意不得震荡。每孔加入100μl终止液终止显色。置酶标仪上读OD450/650nm，进行编辑和数据处理分析。
可接受标准：线性R2≥0.99，质控回收率在80％～120％之间。结果不高100ppm。
三批中试结果：
Figure BDA0003188708850000141
结论：经测定，3批中试样品溶液的HCP残留均符合标准要求。
实施例10：人绒毛膜***冻干粉针剂
一、处方筛选优化
根据冻干粉针剂型的特点及生产工艺要求，包括处方的筛选和生产工艺开发，生产工艺的开发主要包括：溶液配制、除菌过滤、灌装、冷冻干燥。
对于冻干粉针制剂，甘露醇、右旋糖苷、蔗糖是用的良好赋形剂，通过试验发现，单个物料或组合物料与重组绒促性素混合后，在适当的pH条件下进行冻干，得到的冻干品外观饱满，支撑结构良好，说明这几种辅料都可作为该制剂的赋形剂。根据文献报道信息：上市药品重组绒促性素
Figure BDA0003188708850000142
的粉针制剂处方组成为每支含有285微克重组绒促性素、30mg蔗糖、0.98mg磷酸和氢氧化钠(用于pH调节)。复溶的pH值为6.5至7.5。因此我公司最终选择蔗糖作为所开发制剂的赋形剂，同时用量也与上市药品
Figure BDA0003188708850000143
粉针制剂中的保持一致。上市药品中用到的辅料还有和氢氧化钠，其中氢氧化钠是pH调节剂，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲体系代替磷酸，在保证溶液中磷酸根离子与上市药品相同的前提下，pH相同时，溶液中的钠离子强度也基本相同，且用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲体系基本能得到相应pH值范围的溶液，因此，最终选择用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的缓冲体系代替
Figure BDA0003188708850000144
粉针制剂中的磷酸和氢氧化钠，从而规避磷酸中未知杂质对产品的潜在风险。因此，最终使用的辅料是蔗糖、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、注射用水，且一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的重量百分比是1：1.6，经溶液稳定性、冻干产品稳定性的考察，说明此处方可行。
二、除菌工艺研究
1、不同pH的溶液稳定性
根据处方信息，室温下配制不同pH的重组绒促性素溶液，以蛋白含量的变化为指标，考察溶液稳定性，测定结果见下表。
不同pH值的重组绒促性素溶液稳定性(室温)
Figure BDA0003188708850000151
结果表明，室温条件下24h内，pH 6.0-8.0之间的重组绒促性素溶液较稳定，到48h后，pH6.0和pH 8.0的蛋白含量都开始降低，因此最终制定配液的条件为室温、pH7.0-7.6，且从配液开始至灌装结束时间应不超过24h。
2、过滤器吸附研究
生产过程中，需要进行2道无菌过滤，为了考察除菌过滤器过滤过程中使用的2个2.5英寸聚醚砜滤芯对蛋白的吸附，确保滤芯对蛋白的吸附量在合理的范围内，对三批样品进行吸附研究，每批都使用不同批号的除菌过滤滤芯(同一批使用2个同一批号的滤芯)，对过滤前后的样品取样检测，结果汇总如下。
表10-3滤芯信息
Figure BDA0003188708850000152
Figure BDA0003188708850000161
表10-4实验结果汇总表
Figure BDA0003188708850000162
结论：蛋白含量过滤前后在0.565-0.595mg/ml之间，且每批过滤后和过滤前的百分比值在97.65％～101.59％，前后变化不大，纯度均达到99％以上。符合要求。因此重组绒促性冻干粉针生产过程中，使用杭州科百特公司生产的0.22微米的聚醚砜材质的2.5英寸滤芯过滤对料液进行无菌过滤。
3、细菌截留研究
在生产过程中，使用的是0.22微米的聚醚砜材质的2.5英寸滤芯过滤对料液进行无菌过滤，因此需要对除菌级过滤器的微生物截留能力进行考察。
除菌级液体过滤器指在工艺条件下每平方厘米有效过滤面积可以截留107cfu缺陷假单胞菌的过滤器。GMP等相关规定提出在采用除菌过滤方法时，首先要确认采用的过滤器为“除菌级”。达到此要求后，除菌过滤法中的其他无菌保障措施才有意义。细菌截留验证的目的是证明在模拟工艺条件下，过滤过程可以持续除去悬浮于产品或替代流体中高浓度的标准细菌或相关微生物污染分离物。细菌挑战试验的条件应模拟实际生产工艺。试验规模按通量调整，即每单位面积的流速。
以Brevundimonas diminuta ATCC 19146作为挑战微生物来验证0.22μm的过滤器。试验结果显示：1、测试用重组绒促性素溶液无抑菌性，测试菌悬液直接加入药液中进行测试；2、阳性对照结果正常，本次细菌挑战结果有效；3、过滤器的下游滤液无菌生长，除菌即测试用过滤器能在测试条件下能有效截留挑战水平≥107cfu/cm2的B.diminuta(ATCC19146)的挑战菌悬液。在测试条件下，该除菌级过滤器的除菌性能符合要求。
三、冻干工艺研究
根据小试和中试的研究结果，最终确定的放大冻干工艺参数如下表。
冷冻干燥工艺参数
Figure BDA0003188708850000171
具体操作为：开启循环泵、压缩机及板冷阀，板层温度控制-40～-50℃；全速降温；维持时间2-4小时；第一次升华：真空度小于20Pa，1小时内升温至-25～-32℃，保持30-40小时，真空度控制在10Pa±2Pa；第二次升华：1小时内升温至0℃，恒温保温5-10小时，真空度控制在20Pa±2Pa，1小时内升温至32℃，真空度控制在20Pa±2Pa，恒温保持5-10小时。结束冻干。放气至干燥内剩有微量真空时，按下降按钮进行压塞，产品压塞完毕，放气待出箱。冻干完成后装入安瓿瓶保存，见图6rhCG冻干粉实物图。
实施例11：制剂的方法学研究
一、注射用重组人绒促性素质量标准
根据注射用绒促性素药典规定，以及本品的相关特性，对注射用重组人绒促性素进行了相应研究，其质量标准如下：
质量标准
Figure BDA0003188708850000172
Figure BDA0003188708850000181
1、性状：1.1.简述：性状是对药品外观的色泽和感观的规定。1.2.操作方法：取本品适量，在自然光下目视检查。1.3.结果判定：本品应为白色冻干块状物或粉末。1.4.三批中试结果
Figure BDA0003188708850000182
1.5.结论：经检查，3批中试样品的外观均为白色冻干块状物及粉末，与上述标准相符。
2、pH值
2.1.简述：pH值测定法是测定水溶液中氢离子活度的一种方法。本品以一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液作为pH调节剂。为控制产品质量，保证用药安全，故对本品的酸碱度进行检查。2.2.仪器与用具：pH计。2.3.试剂：水、pH 6.86磷酸盐标准缓冲溶液、pH 9.18四硼酸钠标准缓冲溶液。2.4.操作方法2.4.1仪器校正：用pH 9.18四硼酸钠标准缓冲溶液和pH 6.86磷酸盐标准缓冲溶液校正仪器；2.4.2pH值测定：取本品，每支加1ml注射用水溶解，直接测定pH值，平行测定3次，计算平均值。2.5.结果判定如pH值为6.5～7.5，即判为符合规定；否则，判为不符合规定。
2.6.三批中试结果
Figure BDA0003188708850000191
2.7.结论：经测定，3批中试样品溶液的pH值均在标准范围内。
3.溶液的澄清度与颜色
3.1.简述：本法是检查药品溶液的浑浊程度和颜色。澄清度可在一定程度上反映药品的质量和生产工艺水平，颜色可在一定程度上反映药品的杂质水平。3.2.仪器与用具：澄明度检测仪、纳氏比色管。3.3.试剂：水、标准比色液。3.4.供试品溶液的制备：取本品1支，加入1ml中注射用水溶解。3.5.结果判定：本品水溶液应澄清无色；如显浑浊，与2号浊度标准液比较，不得更深；如显色，与黄色4号标准比色液比较，不得更深。
3.6.三批中试结果
Figure BDA0003188708850000192
3.7.结论：经测定，3批中试样品的水溶液均为澄清无色，符合上述标准要求。
4.干燥失重：4.1.简述：样品中水分含量的多少及易挥发物质可能影响产品的质量和稳定性，因此需进行控制。4.2.仪器及器具：干燥器，真空泵。4.3.试剂：五氧化二磷。4.4.操作方法：取本品，置五氧化二磷干燥器中，室温减压干燥至恒重，减失重量不得超过5.0％4.5.结果判定：本品减失重量不得过5.0％。4.6.三批中试结果
Figure BDA0003188708850000193
Figure BDA0003188708850000201
4.7.结论：经测定，3批中试样品的干燥失重均符合标准要求。
5、聚合物
5.1.简述
采用HPLC法测定本品的有关物质，计算方法采用面积归一化法。SEC-HPLC称为体积排阻色谱，又称凝胶色谱和分子筛色谱，其是以多孔凝胶为固定相，依据样品分子量大小达到分离的目的。大分子不进入凝胶孔洞，沿多孔凝胶胶粒间隙流出，先被洗脱；小分子进入大部分凝胶孔洞，在柱中被强滞留，后被洗脱。根据样品性质可分为凝胶过滤和凝胶渗透，凝胶过滤主要用于分析水溶性样品，如多肽、蛋白、生物酶、核苷酸、多糖等。凝胶渗透主要用于分析脂溶性样品，如测定高聚物的分子量。5.2.仪器与设备：高效液相色谱仪、万分之一天平、色谱柱、进样瓶、容量瓶、移液管5.3.试剂与试液：水、硫酸钠、磷酸、氢氧化钠。5.4.试验操作：测定法，取本品，按照1000单位加入0.12ml水溶解配制，作为供试品溶液，精密量取40μl注入液相色谱仪，运行至主峰保留时间的两倍，记录色谱图。空白对照为水溶液，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图。5.5.结果判定：按面积归一化法计算，除***峰外，聚合物不得超5.0％。
5.6.三批中试结果
Figure BDA0003188708850000202
5.7.结论：经测定，3批中试样品的聚合物均符合标准要求。
6.不溶性微粒
6.1.简述：光阻法是当一定体积的供试液通过一窄小的检测区时，与液体流向垂直的入射光，由于被供试液中的微粒阻挡而减弱，因此由传感器输出的信号降低，这种信号变化与微粒的截面积大小相关，再根据通过检测区供试液的体积，计算出每1ml供试液中含10μm以上及含25μm以上不溶性微粒数。6.2.仪器与用具：不溶性微粒检测仪。6.3.试剂：不溶性微粒检查用水。6.4.操作方法：取供试品，小心开启瓶盖，分别精密加入适量微粒检查用水，缓缓振摇使内容物溶解，小心合并容器中的溶液，置于取样杯中，静置适当时间脱气，置于取样器上。开启搅拌，使溶液混匀(避免产生气泡)，依次测定至少4次，第一次数据不计，取后续测定结果的平均值，计算每瓶的微粒数。6.5.结果判定：每瓶中含10μm及10μm以上的微粒不得过6000粒，含25μm及25μm以上的微粒不得过600粒。6.6.三批中试结果
Figure BDA0003188708850000211
6.7.结论：经测定，3批中试样品的不溶性微粒均符合上述标准要求。
实施例12：制剂稳定性
Figure BDA0003188708850000212
注射用重组人绒促性素(批号190227)在25℃±2℃考察6个月的数据显示含量测定为108.80％，比活9035IU/支，氧化亚基、解离亚基等其他各项指标均在合格范围内。

Claims (7)

1.一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，由包括人绒毛膜***、至少一种赋形剂和至少一种PH调节剂经冻干工艺制备得到，其特征在于所述的人绒毛膜***是使用CHO细胞中发酵表达的重组蛋白rhCG并经纯化获得，使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵时，是将密度1.5*106cells/ml以上的细胞接种到发酵混合培养基里，接种完的当天，定为第一天，在培养第3、6、9天时分别加入补料培养基；补料培养基中包括浓度为0.05 mg/ml的氢化可的松和3mg/ml的焦磷酸钠；所述的冻干工艺包括溶液配制、除菌过滤、灌装、冷冻干燥，除菌过滤采用0.22微米的聚醚砜材质的2.5英寸滤芯；溶液配制时，1000ml溶液中包括人绒毛膜***500毫克、一水磷酸二氢钠 1.076 mg、磷酸氢二钠1.732mg，加注射用水至1000ml。
2.根据权利要求1所述的一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，其特征在于使用CHO细胞表达重组rhCG的补料培养发酵的发酵时间为12日。
3.根据权利要求2所述的一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，其特征在于发酵过程中的参数为：36.5±1℃、pH控制在6.8-7.2、溶氧控制在20-70%，转速控制在60±5转/分。
4.根据权利要求1所述的一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，其特征在于所述的PH调节剂是一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
5.根据权利要求4所述的一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，其特征在于所述的一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠的重量百分比为1：1.6。
6.根据权利要求4所述的一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，其特征在于所述PH调节剂将复溶后的pH 控制在6.5至7.5。
7.根据权利要求6所述的一种重组人绒毛膜***冻干粉针剂的制备方法，其特征在于冷冻干燥的工艺参数为：预冻：板层温度-40～-50℃；全速降温；维持时间2-4小时；第一次升华：真空度小于20Pa，1小时内升温至-25～-32℃℃，保持30-40小时，真空度控制在10Pa±2Pa；第二次升华：1小时内升温至0℃，恒温保温5-10小时，真空度控制在20Pa±2Pa，1小时内升温至32℃，真空度控制在20Pa±2Pa，恒温保持5-10小时。
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