SK279053B6 - Spôsob výroby s-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxam - Google Patents

Spôsob výroby s-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxam Download PDF

Info

Publication number
SK279053B6
SK279053B6 SK662-92A SK66292A SK279053B6 SK 279053 B6 SK279053 B6 SK 279053B6 SK 66292 A SK66292 A SK 66292A SK 279053 B6 SK279053 B6 SK 279053B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
dimethylcyclopropanecarboxamide
microorganisms
dsm
genus
racemic
Prior art date
Application number
SK662-92A
Other languages
English (en)
Inventor
Karen Robins
Thomas Gilligan
Original Assignee
Lonza A.G.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza A.G. filed Critical Lonza A.G.
Publication of SK279053B6 publication Critical patent/SK279053B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Opisuje sa nový mikrobiologický spôsob výroby S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidu z R,S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidu. Pre tento spôsob sa oddelia a izolujú nové mikroorganizmy rodu Comamonas, Pseudomonas a Bacterium, ktoré sú schopné v racemickom 2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformovať R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarxylovú. Spôsob je možné uskutočniť s mikroorganizmami alebo s bezbunkovými enzýmami z týchto mikroorganizmov.
Oblasť techniky
Vynález sa týka nového spôsobu výroby opticky aktívneho S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidu, pri ktorom sa v racemickom R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformuje pomocou mikroorganizmov R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid na R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú kyselinu a pritom sa získa požadovaný S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid.
V ďalšom texte sa 2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid skrátene označuje ako 2,2-DMCPCA a 2,2-dimetylcyklopropánkarboxylová kyselina ako 2,2-DMCPCS.
Doterajší stav techniky
Opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA slúži ako východisková látka na výrobu inhibítora dehydropeptidázy cilastatínu, ktorý sa pri terapii podáva spolu s penemovými prípadne karbapenemovými antibiotikami, aby sa zabránilo dezaktivácii antibiotík renálnou dehydropeptidázou v ľadvine (EP 048 301).
Doteraz boli známe len chemické spôsoby výroby S-(+)-2,2-DMCPCA. Ich nedostatok spočíva v tom, že sú nákladné a uskutočňujú sa cez niekoľko stupňov (EP 155 779).
Podstata vynálezu
Úlohou predloženého vynálezu je nájsť biotechnologický postup, ktorým sa v jednom stupni získa požadovaný izomér vysokej čistoty, pričom východiskovou látkou je ľahko dostupný racemický R,S-(±)-2,2-DMCPCA.
Táto úloha sa rieši podľa vynálezu novým spôsobom podľa patentového nároku 1 a s novými mikroorganizmami podľa patentového nároku 10.
Mikroorganizmy podľa vynálezu sú schopné biotransformovať R-(-)-2,2-DMCPCA v racemickom R,S-(±)-2,2-DMCPCA za vzniku R-(-)-2,2-DMCPCS, pričom sa získa opticky aktívny S-(+)-2,2-CMCPCA.
Tieto mikroorganizmy je možné izolovať napríklad z pôdnych vzoriek, kalov alebo odpadových vôd pomocou tradičných mikrobiologických techník.
Podľa vynálezu prichádzajú do úvahy na výrobu S-(+)-2,2-DMCPCA všetky mikroorganizmy, ktoré využívajú R-(-)-DMCPCA ako substrát.
Tieto mikroorganizmy je možné získať nasledujúcou selekčnou metódou:
a) mikroorganizmy, ktoré rastú s 2,2-DMCPCA vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov ako zdrojom dusíka a s vhodným zdrojom uhlíka, sa kultivujú zvyčajným spôsobom,
b) z narastenej kultúry sa potom oddelia také, ktoré sú stabilné a využívajú 2,2-DMCPCA vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov ako jediného zdroja dusíka.
Účelne sa oddelia tie mikroorganizmy, ktoré prijímajú R-(-)-2,2-DMCPCA ako zdroj dusíka.
Ako zdroj uhlíka môžu mikroorganizmy využiť napríklad cukry, alditoly, karboxylové kyseliny alebo alkoholy ako rastový substrát. Ako cukor sa napríklad používa fruktóza alebo glukóza. Ako alditoly je možné použiť napríklad erytrit, mannit alebo sorbit. Ako karboxylové kyseliny je možné použiť mono-, di- alebo trikarboxylové kyseliny, ako napríklad kyselina octová, kyselina malonová alebo kyselina citrónová. Ako alkoholy je možné použiť jedno-, dvoj- alebo trojsytný alkohol, ako napríklad etanol, glykol alebo glycerín. Výhodne sa ako zdroj uhlíka používa trojsytný alkohol, ako napríklad glycerín.
Účelne je pomer uhlíka a dusíka (C/N) v selekčnom médiu v rozmedzí medzi 5 : 1 a 10 : 1.
Ako selekčné médium je možné použiť v odbore bežne používané médiá, ako je napríklad médium obsahujúce minerálne soli, ktoré je opísané v Kulla a spol., Árch. Microbiol. 135, str. 1 - 7,1983.
Výhodné mikroorganizmy, ktoré rastú s 2,2-DMCPCA vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov ako zdrojom dusíka a rastú so zdrojom uhlíka, sú: Comamonas acidovarans A: 18 (DSM č. 6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552), Pseudomonas sp. NSAK: 42 (DSM č. 6433) a mikroorganizmus Bacterium sp. VII:II (DSM č. 6316) a ich descendenly a mutanty.
Kmene označené DSM č. 6315 a 6316 boli uložené 29. 01. 1991, kmene DSM č. 6433 boli uložené 25. 03. 1991 a kmene DSM č. 6552 boli uložené 06. 04. 1991 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH (DSM), Mascherodeweg IB, D-3300 Braunschweig·
Vedecký opis rans A: 18 (DSM č. mikroorganizmu Comamonas 6315): acidovo-
bunková forma tyčinky hydrotýza
šírka μτη 0,W>,7 škrobu
dĺžka μτη 1,5-3,0 želatíny
pohyblivosť + kazeínu
bičíkom poláme>1 DNA
Gran-reakde - TweerruflO
lýza 3 %-ným KOH + eskutínu
amínopeptidáza (Cemy) + odbúranie tyrozínu
sp&y - využitie substrátu
coodáza 4 acatát +
kalaláza + adipát +
rast kaprát 4
anaeróbny - citrát 4
37/41 *C +/- glykdát 4-
pH 5.6 + levulinát 4
Mac-Conkey-agar + malát 4
SS-agar makxiát -
Cetrimiď-agar ♦ fenylacetát +
pigmenty L-arabinóza -
nedŕtúndujúce - fruktóza 4
difundujúce - glukóza
fluoreskujúce - manóza
pyokyanln - maltóza
kyselina z (OF-tast} xyióza
glukózy aerobne - inezitol
gUtázy anaeróbne - marutol +
plyn z glukózy glukonát 4
kyselina z N-ecetylg!ukQzamin -
glukózy - L-sorín -
fruktózy + L-tryptafán 4
xytózy - acetamid 4
mamitu + mezakonát 4
glycerolu + citrakonát 4
ONPG - L-tartrát 4
ADH zdroj N
VP NH4* ++
indol R,S(±)-2,2-dBTietylcyklo-
NO2ZNO3 + propánkartoxamid +
dentrifkácia Myramid ♦+
fenylalanlndezamináza aceUmid 4
levan zo sacharózy propénamid +
tecitinéza fomarnid t
uraáza benzamid rítofinamid 4 4
APi 20NE -> Cs. aadovorars 99,0 %
SK 279053 Β6
Vedecký opis mikroorganizmu rans TG 308 (DSM č. 6552): bunková fotma Gram-reakda (KOH-test) Gram-farebné spóry pohyblivosť rast‘C 37’C 41 *C 45’C kataláza oxidáza kvasenie v glukóze (OF-test)
Comamonas acidovoredukcie nitrétu produkcia indolu kyselina z glukózy arginihdehydrolóza ureáza hydrolýza eskullnu hydrolýza želatíny fáalaktozidáza asimilácia glukózy asimilácia arabinózy asimilácia manózy asmimilácia mannrtolu asimilácia N-acetylglukózaminu asimilácia maltózy asimilácia glutónátu asimilácia kaprátu asimilácia adipátu asimilácia malátu asimilácia citrátu asimilácia fenylacatátu cytochromoxidáza NO2ZNO3 hytfrnlýza močoviny využitie fruktózy alkallzácia aoetamidu alkalizácia tartrátu alkalizácia Simmonovhodtrátu alkalizácia malonátu (+) (t) slabo pozitívny
Vedecký opis mikroorganizmu Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM č. 6433)
bunková forma tyčinky hydrolýza
Šírka μη 0,54),8 škrobu
dĺžka μη 1.5-3,0 želatíny
pohyblivosť 4 kazeínu
Granweakcie - DNA
lýza 3 %-ným KOH 4 Tweenu 80
aminopeptidáza (Cemy) 4 eskulínu
spóry - odbúranie tyrozínu
oxidáza 4 potreba rastovej látky
kataláza 4 využitie substrátu
rast acetát 4
anaeróbny - kaprát 4
37M1 *C +/- citrát f
pH 5,5 4 glykolát 4
Mac-Conkey-agar ♦ lakiát 4
SS-aoar lovuiinát 4
Cetrimid-agar - maiál 4
pigmenty žité malonát 4
lyčinky izotóty
TG308
kfseínaz(OF-tesfj fenylacetát
gkiázy aertfcne sutaát +
glukózy anaeróbne barabinóza -
ptynzgkttózy tuktóza +
kyselinaz glukóza
glukózy manóza
fruktózy maltóza
xylôzy xytóza
ONPG namtol
ODC glukonál
ADH 2-ketoglukonát +
VP N«etylglukôzamtn
indol L-serin +
NO2ZNO3 L-histidin t
detWáú hydroxybutyrál t
fenylalanirriezamináza zdroj dusíka
lemzosactarózy NH)+ H
teôtináza R,S{i42Z-dimetylqWo-
ureáza propánkart»xamd
Vedecký opis mikroorganizmu Bacterium sp. VIIĽII (DSM č. 6316)
Gram farebný +
Gram reakcie (KOU test) oxidáza kataláza redukcia dusičnanu byptoíán -> indol glukóza (anaerd&ne) arginin ureáza eskulin 4 želatína β-galaktazidáza+ glukóza4 arabinóza manóza(4) mannit4
N-acetylglukozamín maltóza♦ glukonát kaprát adipát malát citrát fenylacetát
Predkultúra
Po selekcii sa zvyčajne založí predkultúra týchto mikroorganizmov, ktorou je potom možné naočkovať tiež ďalšie kultúry. Táto predkultúra sa môže pestovať v rovnakých médiách, s rovnakým pomerom C/N a s rovnakým zdrojom uhlíka ako pri selekčnom postupe.
Výhodne má médium na predkultúru zloženie uvedené v tabuľke 2 alebo v tabuľke 3 spolu s univerzálnym peptónom alebo bez neho. Ako zdroj dusíka je možné na predkultúru použiť zlúčeniny bežné v odbore. Výhodne sa ako zdroj dusíka používa amónna soľ, ako napríklad síran amónny.
Hodnota pH v predkultúre je účelne medzi pH 4 a 10, teplota je účelne od 20 do 40 °C.
Po ukončení kultivácie spravidla 10 až 100 hodín sa môžu indukovať enzýmy mikroorganizmov a tak ich pripraviť na biotransformáciu.
SK 279053 Β6
Indukcia
Touto predkultúrou sa zvyčajným spôsobom naočkuje indukčné médium, ktoré má rovnaké zloženie ako médium na predkultúru, až na zdroj dusíka. Médium na indukciu účinných enzýmov mikroorganizmov účelne obsahuje 2,2-DMCPCA vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov, ktorý môže slúžiť ako zdroj dusíka a tiež ako induktor enzýmov. Ako induktory je možné použiť aj iné zlúčeniny, ako napríklad cyklopropánkarboxamid, kaprolaktám, benzamid, cyklohexánkarboxamid, amid kyseliny nikotínovej ako krotónamid. Indukcia prebieha účelne s 0,005 až 0,15 % hmotnostnými, výhodne s 0,1 až 0,15 % hmotnostnými 2,2-DMCPCA vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov. Po bežnom čase indukcie od 15 do 80 hodín sa môžu mikroorganizmy izolovať napríklad odstredením alebo ultrafiltráciou a potom sa resuspendujú v médiu.
Biotransformácia
Vlastný spôsob výroby S-(+)-2,2-DMCPCA sa podľa vynálezu uskutočňuje tak, že sa v racemickom R,S-(±)-2,2-DMCPCA biotransformuje R-(-)-2,2-DMCPCA na R-(-)-2,2-DMCPCS, pričom sa získa a izoluje opticky aktívny S-(+)-2,2-DMCPCA. Racemický R,S-(±)-2,2-DMCPCA je možné napríklad vyrobiť chemickou alebo enzymatickou cestou z nitrilu kyseliny R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarobxylovej. Biotransformácia sa účelne uskutočňuje pomocou mikroorganizmov alebo izolovaných enzýmov v bezbunkovom systéme. Enzýmy pre bezbunkový systém je možné získať v odbore bežným spôsobom, a to rozrušením buniek mikroorganizmov a ich následnou izoláciou. K tomuto cieľu je možné použiť napríklad metódu rozrušenia buniek s ultrazvukom, Frenchovým tlakovým zariadením alebo lyzozýmom. Tieto bezbunkové enzýmy je na uskutočnenie postupu možné napríklad imobilizovvať na vhodnom nosičovom materiáli.
Pre opísaný postup sú zvlášť vhodné mikroorganizmy druhu Comamonas acidovorans A: 18 (DSM č. 6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552), Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM č. 6433) a druhu Bacterium sp. VIII:II (DSM č. 6316), ich descendenty amutanty, rovnako ako iné mikroorganizmy, ktoré sa podrobia selekcii opísaným spôsobom. Rovnako vhodné sú bezbunkové enzýmy z týchto mikroorganizmov.
Výhodne sa postup uskutočňuje buď s bunkami mikroorganizmov v pokoji (nerastúce bunky), ktoré už nevyužívajú na svoj rast žiadny zdroj uhlíka a dusíka alebo s enzýmami v bezbunkovom systéme. Tieto enzýmy sa získajú uvedeným spôsobom, napríklad rozrušením buniek mikroorganizmov, v ktorých bola syntéza týchto enzýmov indukovaná.
Médium účelne obsahuje racemický 2,2-DMCPCA v množstve od 0,2 do 5 % hmotnostných, výhodne od 0,2 do 2 % hmotnostných.
Pre postup slúžia média bežné v odbore, ako napríklad nízkomolámy fosfátový tlmivý roztok, opísané médium s obsahom minerálnych solí alebo tiež HEPES-tlmivý roztok (N-2-hydroxyetylpiperazín-2'-etánsulfonová kyselina).
Výhodne sa postup uskutočňuje v nízkomolámom fosfátovom tlmivom roztoku.
Hodnota pH média môže byť v rozmedzí od 6 do 11, výhodne medzi 6,5 a 10.
Biotransformácia sa účelne uskutočňuje pri teplote od 15 do 55 °C, výhodne pri 20 až 40 °C.
Po bežnom reakčnom čase od 1 do 30 hodín, výhodne od 5 do 25 hodín, sa R-(-)-2,2-DMCPCA úplne premení na zodpovedajúcu kyselinu, pričom sa získa opticky čistý S
-(+)-2,2-DMCPCA. Takto získaný S-(+)-2,2-CMCPCA je možné potom získať napríklad extrakciou, elektrodialýzou alebo sušením.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Izolácia a selekcia mikroorganizmov obsahujúcich R-(-)-2,2-DMCPCA hydrolázu
K rozomletým vzorkám pôdy (1 g) sa pridá izotonický roztok chloridu sodného (9 ml) a celé sa nechá cca 5 min. stáť. Potom sa supematant (0,5 ml) preočkuje do média obsahujúceho minerálne soli (25 ml) (Kulla a spol., Árch. Microbiol. 135, str. 1 - 7, 1983) a ktoré obsahuje glycerín a R,S-(±)-DMCPCA v pomere C/N 5:1. Potom sa kultúra inkubuje za vzniku zmesnej kultúry, ktorá dokáže využívať R,S-(±)-2,2-DMCPCA ako zdroj dusíka.
Čisté kultúry týchto mikroorganizmov sa získajú pomocou tradičných mikrobiologických techník. Takto získané kmene mikroorganizmov sa potom testujú na rast na agarových platniach obsahujúcich R,S-(±)-2,2-DMCPCA, S-(+)-2,2-DMCPCA a R-(-)-2,2-DMCPCA. Takto sa zistia nevhodné kmene, ktoré rastú rovnako rýchlo na oboch izoméroch R-(-)-2,2-DMCPCA a S-(+)-2,2-DMCPCA.
Kmene, ktoré zostali, sa ďalej testujú. Týmito sa potom naočkuje médium na predkultúru. Mikroorganizmy získané v tejto predkultúre sa premiestnia do média obsahujúceho minerálne soli. Potom sa testuje ich schopnosť využiť selektívne R-(-)-2,2-DMCPCA ako jediný zdroj dusíka. Supematant sa testuje pomocou GC (plynovej chromatografie) na tvorbu R-(-)-2,2-DMCPCS a na dávkovanie S-(+)-2,2-DMCPCA.
Príklad 2
Stanovenie aktivity R-(-)-2,2-DMCPCAhydrolázy
Na stanovenie aktivity hydrolázy sa upraví suspenzia mikroorganizmov na hodnotu optickej hustoty 0,5 pri 650 nm. Ako médium sa použije fosfátový tlmivý’ roztok (10 molámy), pH 7,0 s 0,2 % hmotnostnými R,S-2,2-DMCPCA. Táto suspenzia sa za trepania inkubuje 3 hodiny pri 30 °C. Meria sa množstvo hydrolázou uvoľnených NH4+ alebo R-(-)-2,2-DMCPCS a aktivita sa vyjadrí ako g premeneného R-(-)-2,2-DMCPCApremeneného /1/h/optickú aktivitu pri 650 nm, za predpokladu, že 1 mmol vytvoreného NH4+ = 1 mmol premeneného R-(-)-2,2-DMCPCA.
Tabuľka 1
Určenie aktivity hydrolázy v závislosti od teploty (kmeň Comamonas acidovorans A: 18, DSM č. 6315)
Teplota Aktivita (q gWODeM
250,25
300,5
371,0
451,5
461,8
551,9
65O
Príklad 3
Výroba S-(+)-2,2-DMCPCA
Comamonas acidovorans A: 18 sa napestuje na agarových platniach médiom obsahujúcim minerálne soli, s glycerínom ako zdrojom uhlíka a síranom amonným ako zdrojom dusíka 2 dni pri 30 °C. Zloženie média obsahujú ceho minerálne soli je uvedené v tabuľke 2. Týmito mikroorganizmami narastenými na platniach sa naočkuje médium na predkultúru a rovnakom zložení a inkubuje sa 2 dni pri 30 °C.
Rovnaké médium obsahujúce minerálne soli, ktoré obsahuje Na2SO4 namiesto (NH4)2SO4 (100 ml), 0,2 % hmotnostných glycerínu a 0,15 % hmotnostných R,S-(±)-2,2-DMCPCA sa naočkuje 5 ml predkultúry k dosiahnutiu indukcie enzýmov a inkubuje sa pri 30 °C počas 45 hodín. Potom sa bunky oddelia odstredením a suspendujú v 0,9 %-nom roztoku NaCl.
Po resuspendovaní buniek v 10 molámom fosfátovom tlmivom roztoku (800 ml), pH 7,0 sa upraví optická hustota pri 650 nm na 1,3 a pridajú sa 2 % hmotnostné R,S-(±)-2,2-DMCPCA. Po približne 25 hodinovej inkubácii pri 37 “C sa R-(-)-2,2-DMCPCA úplne premení na R-(-)-2,2-DMCPCS, čo zodpovedá optickej čistote (ee) 100 % a analyticky meranému výťažku S-(+)-2,2-DMCPCA 46,7 %. Dokončenie reakcie sa sleduje pomocou uvoľnenia NH4+ a pomocou GC-analýzy supematantu. Po odstredení buniek sa upraví supematant na hodnotu pH 9,5 a produkt sa izoluje extrakciou etylacetátom.
Príklad 4
Podobným spôsobom ako v príklade 1 sa izoluje mikroorganizmus Bacterium sp. VIILII. Pri tomto mikroorganizmu je čas na predkultivovanie 4 dni a čas indukcie 3 dni za inak rovnakých podmienok ako v príklade 3. Na rozdiel od príkladu 3 sa biotransformácia uskutočňuje pri tomto mikroorganizme s 0,2 % hmotnostnými R,S-(±)-2,2-DMCPCA, pričom je stanovená hodnota hydrolázy na hodnotu 0,13 g/l/h/OD65l) nm.
Tabuľka 2
Zloženie média na predkultúry (Kulla a spol., Árch. Microbiol. 135, str. 1 - 7, 1983) g/1 destilovanej vody pH 7,0
2,0 (NH4J2SO4
2,5 Na2HPO4.2H2O
1,0 KH2PO4
3,0 NaCl
0,4 MgCI2.6H2O
0,015 CaCfc. 2 H2O
0,0006 FeCJ2.6H2O
0,0001 ZnSO^. 7 H2O
0,00008 MnCI2.4 H2O
0,0003 H3BO3
0,0002 CoCfc.CH^
0,00001 CuCfe.ZH^
0.00002 NiCI2.6 HzO
0,00003 Na2MoO4. 2 H2O
0,005 NajEDTA. 2 H2O
0,002 FeSO4.7H2O
Glycerín
Príklad 5
Podobným spôsobom ako v príklade 1 sa izoluje Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSM č. 6433). Čas predkultivácie je 2 dni a indukcie 18 hodín a za podmienok inak rovnakých s príkladom 3 s tou výnimkou, že indukčné médium obsahuje 1 % hmotnostné glycerínu (miesto 0,2 % hmotnostných) a dodatočne ešte 0,3 % hmotnostné univerzálneho peptónu (Merck). Biotransformácia sa uskutoční s 0,2 % hmotnostnými R,S-(±)-2,2-DMCPCA, pričom je aktivita hydrolázy 0,34 g/l/h/OD6S0 „ra.
Príklad 6
Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552) sa kultivuje 2 dni pri 30 °C v komplexnom médiu (4 ml) „Nutrient Broth“ alebo v živnom prostredí (Oxoid Ltd., BG). Týmito mikroorganizmami sa naočkuje médium obsahujúce minerálne soli (tabuľka 3) a inkubuje sa 2 dni pri 30 °C. Potom sa získajú bunky podľa príkladu 3.
Na rozdiel od príkladu 3 sa biotransformácia usktuočňuje v 10 mmolámom HEPES-tlmivom roztoku (pH 7,0) s 0,5 % hmotnostnými R,S-(±)-2,2-DMCPCA za inak rovnakých podmienok ako v príklade 3.
Po 4,5 hodinovej inkubácii pri 37 °C sa R-(-)-2,2-DMCPCA celkom premení na R-(-)-2,2-DMCPCS, čo zodpovedá analyticky meranému výťažku 45,5 % a optickej čistote (e) 99,0 %.
Tabuľka 3 g/1 destilovanej vody
2,0
2,0
2,0
0,5
2,0
2,0
0,01 pH 7,0
K2HPO4
KH2PO4
MflSO4.7H2O extrakt kvasníc univerzálny peptón (Merck) NaCl
FeCl2H2O glutamát sodný Krotónamid
Príklad 7
Výroba S-(+)-2,2-DMCPCA pomocou enzýmov v bezbunkovom systéme
Po indukcii sa bunky Comamonas acidovorans A: 18 koncentrujú na 95 ml na hodnotu optickej hustoty 210 pri 650 nm v HEPES-tlmivom roztoku (lOmM, pH 7,0). Potom sa bunky rozrušia dvakrát vo Frenchovom tlakovom zariadení pri tlaku 120 MPa. Suspenzia sa odstredí 20 min. pri 20 000 otáčkach za min., aby sa získal bezbunkový enzýmový extrakt. V tomto bezbunkovom enzýmovom extrakte sa potom stanoví obsah proteínov, 39,3 mg proteínu na 1 ml (merané podľa metódy Bradforda).
Na stanovenie aktivity týchto bezbunkových enzýmov sa k 20 μΐ (cca 0,8 mg proteínu) tohto bezbunkového enzýmového extraktu pridajú 4 ml fosfátového tlmivého roztoku (10 mM, pH 7,0), ktorý obsahuje 0,2 % hmotnostných R,S-(±)-DMCPCA a celé sa inkubuje pri 30 °C. Pritom sa v bezbunkovom extrakte premení 2,5 g R-(-)-2,2DMCP-CA/h/g proteínu (3,64 umol/min/g proteínu) na zodpovedajúcu kyselinu.
Príklad 8
Výroba S-(+)-2,2-DMCPCA pomocou imobilizovaných buniek
Po indukcii podľa príkladu 3 sa získajú bunky mikroorganizmu Comamonas acidovorans A:18. Tieto bunky sa imobilizujú postupom podľa patentu CS 251 111 s použitím polyetylénimínu a glutaraldehydu. Imobilizovaný biokatalyzátor má aktivitu 1,6 pmol/min.g sušiny. Hmotnosť sušiny biokatalyzátora zodpovedá 32 % hmotnosti vo vlhkom stave. Potom sa biokatalyzátor v množstve 55 g hmotnosti vo vlhkom stave suspenduje v 800 ml kyseliny boritej (10 mM, pH 9,0) so 16 g R,S-(±)-2,2-DMCPCA. Po inkubácii 68,8 hodín pri 37 °C a za miešania rýchlosťou 200 otáčok za min. R-(-)-2,2-DMCPCA celkom zreaguje na R5
SK 279053 Β6
-(-)-2,2-DMCPCS. To zodpovedá optickej čistote (ee) 98,2 % a analyticky meranému výťažku S-(+)-2,2-DMCPCA 40 %.

Claims (14)

1. Spôsob výroby S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidu, vyznačujúci sa tým, že sa v racemickom R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformuje R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú, buď s mikroorganizmami rodu Comamonas, Pseudomonas alebo Bacterium alebo s enzýmami z týchto mikroorganizmov v bezbunkovom systéme, pričom sa získa opticky aktívny S-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid a ten sa izoluje.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa biotransformácia uskutočňuje v médiu, ktoré obsahuje racemický 2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid v množstve od 0,2 do 5 % hmotnostných.
3. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 a 2, vyzná í u j ú c i sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje pri hodnote pH od 6 do 11 a pri teplote od 15 do 55 °C.
4. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, v y značujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje buď s mikroorganizmami druhu Comamonas acidovorans A:18 DSM č. 6315 alebo s ich spontánnymi mutantami, ktoré si zachovávajú funkčné schopnosti materského mikroorganizmu alebo s bezbunkovými enzýmami z týchto mikroorganizmov.
5. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, v y značujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje buď s mikroorganizmami druhu Comamonas acidovorans TG 308 DSM č. 6552 alebo s ich spontánnymi mutantami, ktoré si zachovajú funkčné schopnosti materského mikroorganizmu, alebo s bezbunkovými enzýmami z týchto mikroorganizmov.
6. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, v y značujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje buď s mikroorganizmami druhu Pseudomonas sp. NSAK:42 DSM č. 6433 alebo s ich spontánnymi mutantami, ktoré si zachovávajú funkčné schopnosti materského mikroorganizmu, alebo s bezbunkovými enzýmami z týchto mikroorganizmov.
7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, v y značujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje buď s mikro-organizmami druhu Bacterium sp. VIII.II DSM č. 6316 alebo s ich spontánnymi mutantami, ktoré si zachovávajú funkčné schopnosti materského mikroorganizmu, alebo s bezbunkovými enzýmami z týchto mikroorganizmov.
8. Mikroorganizmus Comamonas acidovorans A: 18 DSM č. 6315 schopný v racemickom R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformovať R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú.
9. Mikroorganizmus Comamonas acidovorans TG 308 DSM č. 6552 schopný v racemickom R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformovať R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú.
10. Mikroorganizmus Pseudomonas sp. NSAK:42 DSM č. 6433 schopný v racemickom R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformovať R-(-)-2,2-di metylcyklopropánkarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú.
11. Mikroorganizmus Bacterium sp. VIII:II DSM č. 6316 schopný v racemickom R,S-(±)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamide biotransformovať R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxylovú.
12. Spôsob prípravy mikroorganizmov rodu Comamonas, Pseudomonas alebo Bacterium selekčnou metódou, vyznačujúcou sa tým, že
a) sa pestujú mikroorganizmy, ktoré rastú s 2,2-dimetylcyklopropánkarboxamidom vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov ako zdrojom dusíka a so zdrojom uhlíka,
b) z kultúry získanej pestovaním sa potom podrobia selekcii tie mikroorganizmy, ktoré sú stabilné a využívajú 2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid vo forme racemátu alebo jeho optických izomérov ako jediný zdroj dusíka.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že mikroorganizmy ako rastový substrát ako zdroj uhlíka využívajú cukry, alditoly, karboxylové kyseliny, alkoholy alebo iné zdroje uhlíka.
14. Spôsob podľa jedného z nárokov 12 a 13, v y značujúci sa tým, že mikroorganizmy ako zdroj dusíka prijímajú R-(-)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxamid.
SK662-92A 1991-03-06 1992-03-05 Spôsob výroby s-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxam SK279053B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH67891 1991-03-06
CH185491 1991-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK279053B6 true SK279053B6 (sk) 1998-06-03

Family

ID=25685343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK662-92A SK279053B6 (sk) 1991-03-06 1992-03-05 Spôsob výroby s-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxam

Country Status (17)

Country Link
US (2) US5273903A (sk)
EP (1) EP0502525B1 (sk)
JP (1) JP3249566B2 (sk)
AT (1) ATE139800T1 (sk)
CA (1) CA2062281C (sk)
CZ (1) CZ279306B6 (sk)
DE (1) DE59206633D1 (sk)
DK (1) DK0502525T3 (sk)
ES (1) ES2088512T3 (sk)
HU (1) HU214125B (sk)
IE (1) IE74179B1 (sk)
IL (1) IL101129A (sk)
MX (1) MX9200910A (sk)
PL (1) PL168885B1 (sk)
RO (1) RO113663B1 (sk)
RU (1) RU2096460C1 (sk)
SK (1) SK279053B6 (sk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2124714T3 (es) * 1991-07-26 1999-02-16 Lonza Ag Procedimiento de ingenieria genetica para la preparacion de s-(+)-2,2-dimetilciclopropanocarboxamida mediante microorganismos.
KR100441137B1 (ko) * 2001-11-22 2004-07-21 동국제약 주식회사 키랄 2,2-디메틸시클로프로판카르복실의 유도체의 제조방법
KR100511534B1 (ko) * 2002-07-05 2005-08-31 임광민 아미드 화합물의 새로운 제조방법
DE10260456A1 (de) * 2002-12-18 2004-07-08 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Mutanten des Bakterienstammes Delftia acidovorans MC1 und deren Verwendung zur Produktion von hochreinen R-Enantiomeren von 2-Phenoxypropionsäure-Derivaten
CN100345974C (zh) * 2005-11-24 2007-10-31 浙江工业大学 S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法
KR100650797B1 (ko) 2005-12-12 2006-11-27 (주)케미코월드 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법
KR100654923B1 (ko) 2005-12-15 2006-12-06 (주)씨엘에스랩 고순도의 광학활성아미드를 연속적으로 제조하는 방법
CN100547067C (zh) * 2007-08-10 2009-10-07 浙江工业大学 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用
CN111621541A (zh) * 2019-02-27 2020-09-04 上海艾美晶生物科技有限公司 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2511867A (en) * 1949-12-19 1950-06-20 Method fob separating enantiomers
EP0048301A1 (en) * 1980-09-24 1982-03-31 Merck & Co. Inc. 2-(Cyclopropane-carboxamido)-2-alkenoic acids, their esters and salts, and antibacterial compositions comprising the same and a thienamycin-type compound
DE3569725D1 (en) * 1984-02-28 1989-06-01 Sumitomo Chemical Co A method for the optical purification of an optically active 2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid amide
WO1987006269A1 (en) * 1986-04-16 1987-10-22 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for preparing optically active cyclopropanecarboxylic acids

Also Published As

Publication number Publication date
DE59206633D1 (de) 1996-08-01
HUT64587A (en) 1994-01-28
PL293716A1 (en) 1992-12-28
EP0502525A1 (de) 1992-09-09
US5273903A (en) 1993-12-28
EP0502525B1 (de) 1996-06-26
RU2096460C1 (ru) 1997-11-20
IE74179B1 (en) 1997-07-16
RO113663B1 (ro) 1998-09-30
HU214125B (en) 1997-12-29
JP3249566B2 (ja) 2002-01-21
MX9200910A (es) 1994-03-31
IL101129A (en) 1996-05-14
ATE139800T1 (de) 1996-07-15
IL101129A0 (en) 1992-11-15
CA2062281C (en) 2000-07-11
CZ279306B6 (cs) 1995-04-12
HU9200744D0 (en) 1992-05-28
IE920669A1 (en) 1992-09-09
ES2088512T3 (es) 1996-08-16
US5360731A (en) 1994-11-01
JPH0576391A (ja) 1993-03-30
PL168885B1 (pl) 1996-04-30
DK0502525T3 (da) 1996-07-29
CA2062281A1 (en) 1992-09-07
CS66292A3 (en) 1992-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2053300C1 (ru) Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы
CS224624B2 (en) Method for producing 2,5-diketo-d-gluconic acid or its salts
SK279053B6 (sk) Spôsob výroby s-(+)-2,2-dimetylcyklopropánkarboxam
US5766893A (en) Biotechnological process for the preparation of cyclic s-alpha-imino carboxylic acids and r-alpha-imino carboxamides
Yoshida et al. Isolation and identification of a pyrogallol producing bacterium from soil
DE69738080T2 (de) Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität
JPH04304892A (ja) グリシンの生物学的製造法
JPH04365491A (ja) ４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造法
JPH0499496A (ja) Ｒ（‐）―マンデル酸誘導体の製造法
US6214604B1 (en) Biotechnical production process of piperazine R-α-carboxylic acids and piperazine S-α-carboxylic acid amide
US5258305A (en) Manufacture of optically active 2-phenylpropionic acid and 2-phenylpropionamide from the nitrile using Rhodococcus equi
US5496715A (en) Process for preparing indigo
JP2983695B2 (ja) ４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法
IL101256A (en) Microbiological process for the production of 6-hydroxycycolic acid from 2-cyanopyridine
JPH0574353B2 (sk)
Ajane et al. Studies on bacterial biodegradation of benzonitrile
JPH08173152A (ja) 細菌の培養法
JPS6243679B2 (sk)
JPH0937792A (ja) 光学活性３−フェニル乳酸生産菌の取得方法
CA2257542A1 (en) Process for preparation of d-proline derivatives by means of micro-organisms
JPH09131196A (ja) 新規微生物及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20100305