CN100547067C - 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用 - Google Patents
表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株新的菌种——表皮短杆菌ZJB-07021(Brevibacterium epidermidis ZJB-07021)，及其在微生物制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有立体选择性、可制备光学纯(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的新菌种，通过该菌种可制备高光学纯度的(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺；本发明通过筛选得到不同于以往研究的新菌种，从而为考察在手性拆分方面的微生物菌种的多样性、进而比较不同菌种在转化途径及反应机理上的差异提供了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株新的菌种——表皮短杆菌ZJB-07021(Brevibacteriumepidermidis ZJB-07021)，及其在微生物制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用。
(二)背景技术
2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的化学结构为：
外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺由(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和(R)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺两个对映体构成。
(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺是西司他丁合成的关键手性中间体。西司他丁，化学名为(Z)-7-[(2R)-(2氨基-2-羧基乙基)硫]-[(1S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺基]-2-庚烯酸，是第一个应用临床的肾脱氢肽酶抑制剂。西司他丁与亚胺培南(imipenem)的复方制剂泰能(Tienam)是美国默克(Merck)公司在1979年研制开发的一种广谱β-内酰胺抗生素，于1985年在德国首次上市。西司他丁本身无抗菌作用，对β-内酰胺酶也无抑制作用，作为肾脱氢二肽酶的特异性抑制剂，它能阻断亚胺培南在肾脏内(被肾脱氢二肽酶)的代谢，减轻药物的肾毒性，从而增加泌尿道内未经改变的亚胺培南的浓度，增加疗效。
利用传统的化学法制备光学纯(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺，需在反应中添加大量溶剂和昂贵并具有毒性的手性催化剂，会对环境造成极大危害。而用生物催化法制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺具有反应条件温和、产物单一、立体选择性强、环境友好等优点。目前，文献报道的生物法制备光学纯(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺主要有以下几种：
瑞士Lonza公司Robins等(US Patent 5273903、5427934)曾报道，从外消旋的2，2-二甲基环丙甲酰胺出发，通过含光学选择性酰胺酶的微生物Comamonas acidovorans A：18(DSM No.6315)、Comamonas acidovoransTG 308(DSM No.6552)、Pseudomonas sp.NSAK：42(DSM No.6433)、Bacterium sp.VIII：II(DSM No.6316)的动力学拆分，将其中的(R)-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺转化为相应的酸来制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。浙江工业大学郑裕国等(Research in Microbiology，2007，158：258-264)筛选到的Delftia tsuruhatensis ZJB-05174(CCTCC M 205114)也能选择性地降解外消旋体中R-异构体而制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺。韩国Lim等报道先将外消旋的2，2-二甲基环丙甲酸衍生化为对应的乙酯，通过光学选择性脂酶选择性水解其中的(S)-2，2-二甲基环丙甲酸乙酯为对应的酸和乙醇，再通过(S)-2，2-二甲基环丙甲酸的加氨来制备S-酰胺(WO2004/005241A1)。
中国科学院化学研究所***等(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2002，18：267-272)曾报道以外消旋的2，2-二甲基环丙甲腈为底物，以Rhodococcus sp.AJ270为催化剂来制备R-(-)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。
(三)发明内容
本发明是为了提供一株可用于制备光学纯(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的新菌种——表皮短杆菌ZJB-07021(Brevibacterium epidermidisZJB-07021)，及其在微生物制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用。
本发明采用的技术方案是：
表皮短杆菌ZJB-07021(Brevibacterium epidermidis ZJB-07021)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2007年6月8日，保藏编号CCTCC NO：M 207076。
该新菌株的特征如下：
菌落形态：30℃培养40h，在牛肉膏蛋白胨平板培养上的菌落呈圆形，直径1毫米，***形状为凸镜状，淡黄色，边缘整齐，光滑。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达5mm以上。
细胞形态：20h培养物的细胞呈杆状，0.6～1.2μm×1.5～3.0μm。无芽孢形成，不运动。培养时间延长，菌体逐步变短，老培养物变成球状。
生理生化特征：革兰氏阳性，接触酶阳性，硝酸盐还原弱阳性，其他阳性项目是：吐温40、吐温80、L-树胶醛糖、D-***糖、D-果糖、七叶苷，甘露醇、甘露糖、D-洛酮糖、松二糖、D-木糖、羟基丁酸、琥珀酸甲酯、丙酮酸甲酯、丙三醇利用；全部阴性的项目是：菊糖、β-葡糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、N-乙酰基-D-葡萄糖、海藻糖、山梨醇、木糖醇、松三糖、甘露醇、水杨苷、脲酶、葡萄糖、核糖、乳糖、蔗糖、肝糖原产酸、明胶液化、水苏糖、麦芽糖、丙二酸盐利用。
综合上述结果，该菌株被鉴定为表皮短杆菌Brevibacteriumepidermidis。
通过Plackett-Burman考察了碳源、氮源、诱导剂与金属离子等培养基组分对表皮短杆菌CCTCC M.207076菌株酶活的影响；同时采用旋转中心组合设计法对葡萄糖、酵母粉和乙酰胺等3个因素进行优化，得到表皮短杆菌CCTCC M.207076的培养基组成为(终浓度)：葡萄糖10.0～20.0g/L，酵母粉13.0～18.0g/L，KH2PO40.5～2.0g/L，K2HPO40.5～2.0g/L，NaCl1～3g/L，乙酰胺5～11.0g/L。
表皮短杆菌CCTCC M.207076的培养条件为：起始pH 6.0～8.5，装液量5～30％，培养温度20～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间48～72小时。
本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：
1)将由全国各地采回的土样和污水样接种到富集培养基中，在30℃，150rpm的摇床上培养4天，待培养基变混浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养4天。如此重复4～5个循环。富集培养基的配方如下(终浓度)：2，2-二甲基环丙烷甲酰胺：1～2.5g/L，K2HPO4·12H2O：1.0～2.5g/L，KH2PO4：1.0～2.0g/L，MgSO4·7H2O：0.2～0.5g/L，FeSO4·7H2O：0.01～0.05g/L，CaCl2：0.01～0.06g/L，以自来水配制，用1.0mol/L的盐酸或NaOH溶液调节pH值6.0～8.0。
2)最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基为富集培养基中加入1.5％～2.0％的琼脂。
3)挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下(终浓度)：葡萄糖10.0～20.0g/L，酵母膏5.0～10.0g/L，蛋白胨2.0～5.0g/L，NaCl 1.0～3.0g/L，K2HPO41.0～2.0g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO40.2～0.5g/L，FeSO40.01～0.05g/L，CaCl20.05～0.1g/L，乙酰胺2.0～5.0g/L，pH自然(121℃下，灭菌20min)；25～45℃下，摇瓶转速100～300rpm，培养48h～72h；离心后悬浮于磷酸缓冲体系中。然后根据浙江工业大学郑裕国等(Applied Microbiology and Biotechnology.2007，74：256-262)所述的立体选择性酰胺酶的筛选方法进行产R-酰胺酶菌株的筛选。
4)对通过上述方法筛选到的产R-酰胺酶菌株，通过水解转化反应进行复筛。按照上述方法培养得到的菌体，离心后悬浮于磷酸缓冲体系中，加入2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物，进行转化；用手性气相色谱法分析产物和底物的含量及光学纯度。
手性色谱法的具体操作条件为：日本岛津GC-14C气相色谱仪，GCSolution色谱工作站；瑞士BGB-175手性毛细管气相色谱柱；载气为高纯氦气，流量为1.5mL/min；进样量0.8μL，分流比为40∶1；检测器及进样口温度均为220℃。分离底物2，2-二甲基环丙烷甲酰胺及产物2，2-二甲基环丙烷甲酸时，柱温分别为170℃和130℃。
本发明还涉及所述的表皮短杆菌ZJB-07021在微生物发酵制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用。
具体的，所述的应用为：以外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺为底物，加入表皮短杆菌ZJB-07021湿菌体细胞，25～45℃下、于pH 6.5～9.0的缓冲液中反应1～4小时，反应液经分离纯化得到(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺。
优选的，所述反应在pH 6.5～7.8的磷酸盐缓冲液中进行。或者，所述反应在pH 7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液中进行。
优选的，所述反应体系中还可添加有体积为缓冲液体积3～10％的共溶剂，可以显著提高反应的活力和光学选择性。所述共溶剂包括但不限于下列之一：①甲醇、②乙醇、③乙酸乙酯、④丙酮、⑤正丙醇、⑥异丙醇、⑦乙腈等。
所述反应体系中，表皮短杆菌ZJB-07021湿菌体细胞的初始浓度为80～300g/L，底物外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的初始浓度为5～15g/L。
所述表皮短杆菌ZJB-07021湿菌体细胞可由如下方法制备得到：培养基终浓度组成：葡萄糖10.0～20.0g/L，酵母粉13.0～18.0g/L，KH2PO40.5～2.0g/L，K2HPO40.5～2.0g/L，NaCl 1～3g/L，乙酰胺5～11.0g/L，pH 6.0～8.5；接种表皮短杆菌ZJB-07021，20～35℃、100～300rpm振荡培养48～72小时，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞。
具体的，所述应用如下：
(1)培养基终浓度组成：葡萄糖15g/L，酵母粉14.5g/L，KH2PO41.0g/L，K2HPO41.0g/L，NaCl 1.0g/L，乙酰胺5.6g/L，pH 6.0～8.5；摇瓶装液量30％，接种表皮短杆菌ZJB-07021，于20℃、100～300rpm振荡培养72h，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞；
(2)取50mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞至细胞浓度为200g/L，并加入底物外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺至底物浓度为10g/L，35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，得S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一种具有立体选择性、可制备光学纯(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的新菌种，通过该菌种可制备高光学纯度的(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺；本发明通过筛选得到不同于以往研究的新菌种，从而为考察在手性拆分方面的微生物菌种的多样性、进而比较不同菌种在转化途径及反应机理上的差异提供了基础。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株的分离
产R-酰胺酶产生菌的分离：在9mL 0.85％的生理盐水中加入1g土样、适量玻璃珠，摇匀，使成均匀的土壤悬液；吸取0.5mL的土壤悬液接种到装有30mL富集培养基的250mL的三角瓶中，置于30℃，150rpm的摇床培养4天，等富集液出现浑浊后，再吸取0.5mL转接到新鲜的培养基中，继续培养4天；如此重复4～5个循环后，将富集液稀释多个梯度，涂布到分离平板上，获得单菌落；
富集培养基以2，2-二甲基环丙甲酰胺为唯一氮源，组成如下(终浓度)：K2HPO4·12H2O：2.5g/L，KH2PO4：2g/L，MgSO4·7H2O：0.5g/L，FeSO4·7H2O：0.01g/L，CaCl2：0.06g/L，2，2-二甲基环丙烷甲酰胺：1.5g/L，用自来水配制，pH调为7.0；
挑取的单菌落接种到富集培养基中，培养48h、72h后取样，用手性气相色谱法检测产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的对应体过量值(e.e.值)，e.e.值超过98％的，即为所述的微生物表皮短杆菌ZJB-07021。
实施例2：菌株的培养
斜面培养基组成(终浓度)：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，用自来水配制；
于平板上挑取CCTCC M.207076的单菌落，接种至斜面，于30℃恒温培养箱内培养48h后，放入4℃冰箱内保藏备用。
实施例3：湿菌体细胞的获得
培养基配制：葡萄糖10.0g，酵母粉13.0g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，NaCl1g，乙酰胺5g，自来水补足至1L，pH 6.5；
250ml摇瓶装液量30％，接种一环表皮短杆菌CCTCC M.207076，于20℃、300rpm振荡培养72h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，悬浮于50mM、pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液中，得湿菌体细胞含量为0.5g/mL的菌悬液，备用。
实施例4：湿菌体细胞的获得
培养基配制：葡萄糖20.0g，酵母粉18.0g，KH2PO42.0g，K2HPO42.0g，NaCl 3g，乙酰胺11.0g，自来水补足至1L，pH 8.0；
250ml摇瓶装液量30％，接种一环表皮短杆菌CCTCC M.207076，于35℃、100rpm振荡培养48h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，悬浮于50mM、pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液中，得湿菌体细胞含量为0.5g/mL的菌悬液，备用。
实施例5：
在10mL、50mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度98.5％e.e.，转化率52％。
实施例6：
在10ml、50mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.8)，加入1.6mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应3小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度95.6％e.e.，转化率41％。
实施例7：
在10ml、50mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.8)，加入6mL实施例4所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应1小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度99％e.e.，转化率54％。
实施例8：
在10ml、50mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入50mg(0.5％)外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度98.3％e.e.，转化率52％。
实施例9：
在10ml、50mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例4所得菌悬液；加入150mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应4小时。反应液离心，取上清液萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度97.9％e.e.，转化率48％。
实施例10：
在10ml、50mM的磷酸盐缓冲溶液中(pH 6.5)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于25℃恒温水浴摇床振荡反应4.5小时。反应液离心，取上清液萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度98.9％e.e.，转化率52％。
实施例11：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 9.0)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg(1.0％)外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物。于45℃恒温水浴摇床振荡反应3小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度99％e.e.，转化率55％。
实施例12：
在10ml、50mM的磷酸缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例4所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物和0.3mL甲醇。于35℃恒温水浴摇床振荡反应1.5小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度99.3％e.e.，转化率51％。
实施例13：
在10ml、50mM的磷酸缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例4所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺作为底物和1mL甲醇。于35℃恒温水浴摇床振荡反应1.8小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度99.5％e.e.，转化率53％。
实施例14：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.4)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和0.6mL乙酸乙酯。于40℃恒温水浴摇床振荡反应2.5小时。反应液离心，取上清液，经等体积的乙酸乙酯萃取，产物S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的光学纯度99.2％e.e.，转化率52％。
Claims (9)
1.表皮短杆菌ZJB-07021(Brevibacterium epidermidis ZJB-07021)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年6月8日，保藏编号CCTCC NO：M 207076。
2.如权利要求1所述的表皮短杆菌ZJB-07021在微生物制备(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺为底物，加入表皮短杆菌ZJB-07021湿菌体细胞，25～45℃下、于pH 6.5～9.0的缓冲液中反应1～4小时，反应液经分离纯化得到(S)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在pH 6.5～7.8的磷酸盐缓冲液中进行。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应在pH 7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液中进行。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述反应体系中还添加有体积为缓冲液体积3～10％的共溶剂，所述共溶剂为下列之一：①甲醇、②乙醇、③乙酸乙酯、④丙酮、⑤正丙醇、⑥异丙醇、⑦乙腈。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述反应体系中，表皮短杆菌ZJB-07021湿菌体细胞的初始浓度为80～300g/L，底物外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的初始浓度为5～15g/L。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述表皮短杆菌ZJB-07021湿菌体细胞由如下方法制备得到：培养基终浓度组成：葡萄糖10.0～20.0g/L，酵母粉13.0～18.0g/L，KH2PO4 0.5～2.0g/L，K2HPO40.5～2.0g/L，NaCl 1～3g/L，乙酰胺5～11.0g/L，pH 6.0～8.5；接种表皮短杆菌ZJB-07021，20～35℃、100～300rpm振荡培养48～72小时，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞。
9.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用如下：
(1)培养基终浓度组成：葡萄糖15g/L，酵母粉14.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，NaCl 1.0g/L，乙酰胺5.6g/L，pH 6.0～8.5；摇瓶装液量30％，接种表皮短杆菌ZJB-07021，于20℃、100～300rpm振荡培养72h，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞；
(2)取50mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞至细胞浓度为200g/L，并加入底物外消旋2，2-二甲基环丙烷甲酰胺至底物浓度为10g/L，35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯萃取，得S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
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