CZ279306B6 - Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropan-karboxamidu pomocí mikroorganismů Comamonas, Pseudomon as nebo Bacterium a způsob přípravy těchto mikroorganismů - Google Patents
Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropan-karboxamidu pomocí mikroorganismů Comamonas, Pseudomon as nebo Bacterium a způsob přípravy těchto mikroorganismů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ279306B6 CZ279306B6 CS92662A CS66292A CZ279306B6 CZ 279306 B6 CZ279306 B6 CZ 279306B6 CS 92662 A CS92662 A CS 92662A CS 66292 A CS66292 A CS 66292A CZ 279306 B6 CZ279306 B6 CZ 279306B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- microorganisms
- dimethylcyclopropanecarboxamide
- dsm
- dmcpca
- bacterium
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Je popsán nový mikrobiologický způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu z R.S-(.sup.+.n.)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu. Pro tento způsob se oddělí a isolují nové mikroorganismy, které jsou schopné v racemickém 2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformovat R-(-)-2,2-dimethylcyklopropan karboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou. Tento způsob lze provést buď s těmito mikroorganismy nebo s bezbuněčnými enzymy z těchto mikroorganismů.ŕ
Description
Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropan-karboxamidu mikroorganismy Comamonas, Pseudomonas nebo Bacterium a způsob přípravy těchto mikroorganismů (57) Anotace:
Způsob výroby S-(+)-2,2-dlmethylcyklopropankarboxamidu z R,S-(± )-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu. Pro tento způsob se oddělí a isolují nové mikroorganismy rodu Comamonas, Pseudomonas nebo Bacterium, které jsou schopné v racemickém 2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformovat R-(-)-2,2-dimethylcyklopropan karboxamid na kyselinu R(-) - 2,2 - dimeťhyl cykl opropankarboxylovou, Re akce se provádí s mikroorganismy rodu Comamonas, Pseudomonas nebo Bacterium nebo s enzymy těchto mikroorganismů v bezbuněčném systému. Je popsán též způsob přípravy mikroorganismů, že se pěstují se sloučeninami, které slouží jako zdroj uhlíku vybranými ze skupiny cukrů, alditolů, karboxylových kyselin, alkoholů nebo jiných zdrojů uhlíku a poté se podrobí selekci ty mikroorganismy, které jsou stabilní.
Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu, mikroorganismy rodu Comamonas, Pseudomonas nebo Bacterium a způsob přípravy těchto mikroorganismů
Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu výroby opticky aktivního S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu, při kterém se v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformuje R—(—)—2,2-dimethylcyklopropankarboxamid na R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou kyselinu a přitom se získá požadovaný S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid.
V dalším textu se 2,2-dimethylcyklopropankarboxamid zkráceně označuje jako 2,2-DMCPCA a 2,2-dimethylcyklopropankarboxylová kyselina jako 2,2-DMCPCS.
Dosavadní stav techniky
Opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA slouží jako výchozí látka pro výrobu inhibitoru dehydropeptidasy cilastatinu, který se při terapii podává spolu s penemovými, popřípadě karbapenémovými antibiotiky, aby se zabránilo desaktivaci antibiotik renální dehydropeptidasou v ledvině (EP 048 301).
Dosud byly známé jen chemické způsoby výroby S-(+)-2,2DMCPCA. Jejich nedostatek spočívá v tom, že jsou nákladné a uskutečňují se přes několik stupňů (EP 155 779).
Podstata vynálezu
Úlohou předloženého vynálezu je nalézt biotechnologický postup, kterým se v jednom stupni získá požadovaný isomer ve vysoké čistotě, přičemž výchozí látkou je lehce dostupný racemický R,S-(±)-2,2-DMCPCA.
Tato úloha je řešena podle vynálezu novým způsobem podle patentového nároku 1 a novými mikroorganismy podle patentového nároku 12.
Mikroorganismy podle vynálezu jsou schopné biotransformovat R-(-)-2,2-DMCPCA v racemickém R,S-(±)-2,2-DMCPCA za vzniku R-(-)2,2-DMCPCS, přičemž se získá opticky aktivní S-(+)-2,2-DMCPCA.
Tyto mikroorganismy lze izolovat například z půdních vzorků, kalů nebo odpadních vod pomocí tradičních mikrobiologických technik.
Podle vynálezu přicházejí v úvahu pro výrobu S-(+)-2,2DMCPCA všechny mikroorganismy, které využívají R-(-)-DMCPCA jako substrát.
Tyto mikroorganismy lze získat následující selekční metodou:
a) mikroorganismy, které rostou s 2,2-DMCPCA ve formě racemátu nebo jeho optických isomerů jako zdrojem dusíku a se zdrojem uhlíku, se pěstují obvyklým způsobem;
b) z kultury, získané pěstováním, se pak oddělí takové, které jsou stabilní a využívají 2,2-DMCPCA ve formě racemátu nebo jeho optických isomerů jako jediného zdroje dusíku.
Účelně se oddělí ty mikroorganismy,. které přijímají
R-(-)-2,2-DMCPCA jako zdroj dusíku.
Jako zdroj uhlíku mohou mikroorganismy využít například cukry, alditoly, karboxylové kyseliny nebo alkoholy jako růstový substrát. Jako cukr se například používá fruktosa nebo glukosa. Jako alditoly lze například použít erythrit, mannit nebo sorbit. Jako karboxylové kyseliny lze použit mono-, di- nebo trikarboxylové kyseliny, jako například kyselina octová, kyselina malonová nebo kyselina citrónová. Jako alkoholy lze použít jedno-, dvojného troj sytný alkohol, jako například ethanol, glykol nebo glycerin. Výhodně se jako zdroj uhlíku používá trojsytný alkohol, jako například glycerin.
Účelně je poměr uhlíku a dusíku (C/N) v selekčním médiu v rozmezí mezi 5:1 až 10:1.
Jako selekční médium lze použít v oboru běžně užívaná média, jako je například médium, obsahující minerální soli, které je popsáno V Kulla a spol., Arch. Microbiol. 135, str. 1-7, 1983.
Výhodné mikroorganismy, které rostou s 2,2-DMCPCA ve formě racemátu nebo jeho optických isomerů jako zdrojem dusíku a rostou se zdrojem uhlíku, jsou:
Comamonas acidovorans A:18 (DSM č.6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552), Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM č.6433) a mikroorganismus Bacterium sp. VIII:II (DSM č. 6316) a jejich descendenty a mutanty.
Kmeny označené DSM č. 6315 a 6316 byly uloženy 29.1.1991, kmeny DSM č. 6433 byly uloženy 25.3.1991 a kmeny DSM č. 6552 byly uloženy 6.4.1991 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH (DSM), Mascherodeweg IB, D-3300 Braunschweig.
Vědecký popis mikroorganismu Comamonas acidovorans A:18 (DSM č. 6315):
| buněčná forma | tyčinky | hydrolýza | |
| šířka μιη | 0,5-0,7 | škrobu | - |
| délka μιη | 1,5-3,0 | želatiny | - |
| pohyblivost | + | kaseinu | - |
| mrskání | polární>l | DNA . | - |
| Gram-reakce | Tweenu 80 | - | |
| lyže 3 %ním KOH | + | eskulinu | - |
| aminopeptidasa (Cerny) | + | odbourání tyrosinu | - |
| spory | - | využití substrátu | |
| oxidasa | + | ačetát | + |
| katalasa | + | adipát | + |
| růst | kaprát | + | |
| anaerobní | - | citrát | + |
| 37/41 °C | +/- | glykolát | '+ |
| pH 5,6 | + | levulinát | + |
+ +
+
Mac-Conkey-agar SS-agar
Cetrimid-agar pigmenty nedifundující difunduj ící fluoreskující pyokyanin kyselina z (of-test) glukosy aerobně glukosy anaerobně plyn z glukosy kyselina z glukosy fruktosy xylosy mannitu glycerolu
ONPG
ADH
VP indol
N02 z N03 denitrifikace fenylalanindesaminasa levan ze sacharosy lecitinasa ureasa malát+ malonát fenylacetát+
L-arabinosa fruktosa+ glukosa mannosa maltosa xylosa inositol mannitol + glukonát+
N-acetylglukosamin L-serin
L-tryptofan+ acetamid+ mesakonát Ιοί trakonát+
L-tartát+ zdroj N nh4+++
R,S(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid+ butyramid++ acetamid+ /
propionamid+ formamid+ benzamid+ nikotinamid+
API 20NE —> Cs.acidovorans 99,0 %
Vědecký popis mikroorganismu Comamonas acidovorans (DSM č. 6552) :
TG 308 buněčná forma
Gram-reakce (KOH-test)
Gram-barvení spory pohyblivost růst °C °C °C °C katalasa oxidasa kvašení v glukose (OF-test) redukce nitrátu produkce indolu kyselina z glukosy arginindehydrolasa ureasa hydrolýza eskulinu tyčinky +
4isoláty
TG3 08 +
-3CZ 279306 B6 hydrolýza želatiny B-galaktosidasa asimilace glukosy asimilace arabinosy asimilace mannosy asimilace mannitolu + asimilace N-acetylglukosaminu asimilace maltosy asimilace glukonátu+ asimilace kaprátu+ asimilace adipátu+ asimilace malátu+ asimilace citrátu asimilace fenylacetátu+ cytochromoxidasa+
N02 z NO3+ hydrolýza močoviny využití fruktosy+ alkalisace acetamidu+ alkalisace tartrátu+ alkalisace Simmonova citrátu + alkalisace malonátu( + ) (+) slabě positivní
Vědecký popis mikroorganismu (DSM č. 6433)
Pseudomonas sp NSAK:42 buněčná forma šířka μιη délka μιη pohyblivost Gram-reakce lyse 3 %ním KOH aminopeptidasa (Cerny) spory oxidasa katalasa růst anaerobní
37/41 ’C '
PH 5,6
Mac-Conkey-agar
SS-agar Cetrimid-agar pigmenty kyselina z (OF-test) glukosy aerobně glukosy anaerobně plyn z glukosy kyselina z glukosy fruktosy xylosy ONPG
ODC
| tyčinky | hydrolýza | |
| 0,6-0,8 | škrobu | - |
| 1,5-3,0 | želatiny | - |
| + | kaseinu | - |
| - | DNA | - |
| Tweenu 80 | - | |
| -r ' | eskulinu | - |
| - | odbourání tyrosinu | - |
| -j. | potřeba růst.látky | - |
| + | využití substrátu | |
| acetát | + | |
| - | kaprát | + |
| + /- | citrát | + |
| + | glykolát | + |
| + | laktát | + |
| - | levulinát | + |
| - | malát | + |
| žluté | malonát | + |
| fenylacetát | + | |
| - | suberát | • + |
| - | L-arabinosa | - |
| - | fruktosa | + |
| glukosa | - | |
| - | mannosa | - |
| - | maltosa | - |
| - | xylosa | - |
| - | mannitol | |
| - | glukonát | + |
ADH
VP indol no2 z no3 denitrifikace fenylalanindesaminasa levan ze sacharosy lecitinasa ureasa
Λ
2-ketoglukonát+
N-acetylglukosamin
L-serin+
L-histidin+ hydroxybutyrát+ zdroj dusíku nh4+++
R,S(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid +
Vědecký popis mikroorganismu (DSM č 6316)
Bacterium sp. VIII:II
| Gram barvení | + |
| Gram reakce (KOH test) | - |
| oxidasa | - |
| katalasa | - |
| redukce dusičnanu | - |
| tryptofan -> indol | - |
| glukosa (anaerobně) | - |
| arginin | - |
| ureasa | - |
| eskulin | + |
| želatina | - |
| B-galaktosidasa | + |
| glukosa | |
| arabinosa | - |
| mannosa | (+) |
| mannit | + |
| N-acetylglukosamin | - |
| maltosa | + |
| glukonát | - |
| kaprát | - |
| adipát | - |
| malát | - |
| citrát | |
| fenylacetát | - |
Předkultura
Po selekci se obvykle založí předkultura těchto mikroorganismů, kterou je potom možné naočkovat také další kultury. Tato předkultura se může pěstovat ve stejných médiích, ve stejném poměru C/N a se stejnými sloučeninami jako zdrojem uhlíku jako při selekčním postupu.
Výhodně má médium pro předkulturu složení, uvedené buď v tabulce 2 nebo v tabulce 3 spolu s universálním peptonem nebo bez něho. Jako zdroj dusíku lze pro předkulturu použít sloučeniny běžné v oboru. Výhodně se jako zdroj dusíku používá amonná sůl, jako například síran amonný.
Hodnota pH v předkultuře je účelně mezi pH 4a 10, teplota je účelně od 20 do 40 °C.
-5CZ 279306 B6
Po kultivační době zpravidla 10 až 100 hodin se mohou mikroorganismy indukovat a' připravit pro biotransf ormaci.
Indukce
Touto předkulturou se obvyklým způsobem naočkuje indukční médium, které má stejné složení jako médium pro předkulturu, až na zdroj dusíku. Médium pro indukci účinných enzymů mikroorganismů účelně obsahuje 2,2-DMCPCA ve formě racemátu nebo jeho optických isomerů, který může sloužit jednak jako zdroj dusíku a jednak jako induktor enzymů. Jsou možné také jiné sloučeniny jako induktory, jako například cyklopropankarboxamid, kaprolaktám, benzamid, cyklohexankarboxamid, amid kyseliny nikotinové nebo krotonamiď. Indukce probíhá účelně s 0,005 až 0,15 % hmotnostními, výhodně s 0,1 až 0,15 % hmotnostními 2,2-DMCPCA ve formě racemátu nebo jeho optických isomerů. Po běžné době indukce od 15 do 80 hodin se mohou mikroorganismy získat například odstředěním nebo ultrafiltrací a pak se resuspendují v médiu.
Biotransformace
Vlastní způsob výroby S-(+)-2,2-DMCPCA . se podle vynálezu provádí tak, že se v racemickém R,S-(±)-2,2-DMCPCA biotransformuje R-(-)-2,2-DMCPCA na R-(-)-2,2-DMCPCS, přičemž se získá a izoluje opticky aktivní S-(+)-2,2-DMCPCA. Racemický R,S-(±)-2,2DMCPCA lze například vyrobit chemickou nebo enzymatickou cestou z nitrilu kyseliny R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylové. Biotransformace se účelně provádí buď s mikroorganismy nebo s enzymy v bezbuněčném systému. Enzymy pro bezbuněčný systém lže získat v oboru běžným způsobem rozrušením buněk mikroorganismů. K tomuto účelu lze použít například metody s ultrazvukem, Frenchovým tlakovým zařízením nebo lysozymem. Tyto bezbuněčné enzymy lze pak například pro provedení postupu imobilizovat na vhodném nosičovém materiálu.
Pro postup jsou zvláště vhodné mikroorganismy druhu Comamonas acidovorans A:18 (DSM č. 6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552), Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM č 6433) a druhu Bacterium sp. VIII:II (DSM č 6316), jejich descendenty a mutanty, stejně jako jiné mikroorganismy, které se podrobí selekci zde popsaným způsobem. Stejně vhodné jsou bezbuněčné enzymy z těchto mikroorganismů.
Výhodně se postup uskutečňuje buď s buňkami mikroorganismů v klidu (nerostoucí buňky), které již nepoužívají žádný zdroj uhlíku a dusíku, nebo s enzymy v bezbuněčném systému. Tyto enzymy se získají výše uvedeným způsobem, například rozrušením indukovaných mikroorganismů.
Médium účelně obsahuje racemický 2,2-DMCPCA v množství od 0,2 do 5 % hmotnostních, výhodně od 0,2 do 2 % hmotnostních.
Pro postup slouží média obvyklá v oboru, jako například nízkomolární fosfátový pufr, výše popsané médium s obsahem minerálních solí nebo také HEPES-pufr (N-2-hydroxyethylpiperazin21-ethansulfoňová kyselina).
-6CZ 279306 B6
Výhodně se postup provádí v nízkomolárním fosfátovém pufru.
Hodnota pH média může být v rozmezí od 6 do 11, výhodné mezi 6,5 a 10.
Biotransformace se účelně provádí při teplotě od 15 do 55 ’C, výhodně při 20 až 40 °C.
Po běžné reakční době od 1 do 30 hodin, výhodně od 5 do 25 hodin, se R-(-)-2,2-DMCPCA úplně přemění na odpovídající kyselinu, přičemž se získá opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA. Takto získaný S-(+)-2,2-DMCPCA lze pak získat například extrakcí, elektrodialysou nebo sušením.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace a selekce mikroorganismů R-(-)-2,2-DMCPCAhydrolasou
K rozmělněným vzorkům půdy (lg) se přidá isotonický roztok chloridu sodného (9 ml) a celé se nechá cca 5 min. stát. Potom se supernatant (0,5 ml) přeočkuje do média, obsahujícího minerální soli (25 ml) (Kulla a spol., Arch. Microbiol.. 135, str. 1-7, 1983) a které obsahuje glycerin a R,S-(±)-DMCPCA v poměru C/N 5:1. Pak se kultura inkubuje, až vznikne směsná kultura, která může využívat R,S-(±)-2,2-DMCPCA jako zdroj dusíku.
Čisté kultury těchto mikroorganismů se získají pomocí tradičních mikrobiologických technik. Takto získané kmeny mikroorganismů se pak testují na agarových deskách ke zjištěni jejich růstu na R,S-(±)-2,2-DMCPCA, S-(+)-2,2-DMCPCA a R-(-)-2,2-DMCPCA. Tak se zjistí nežádoucí kmeny, které rostou stejně rychle na obou isomerech R-(-)-2,2-DMCPCA a S-(+)-2,2-DMCPCA.
Zbylé kmeny se dále testují. Těmito se pak naočkuje médium pro předkulturu. Mikroorganismy, získané v této předkultuře, se převedou do média, obsahujícího minerální soli. Pak se testuje jejich schopnost využít selektivně R-(-)-2,2-DMCPCA jako jediný zdroj dusíku. Supernatant se testuje pomocí GC na tvorbu R-(-)-2,2-DMCPCS a na dávkováni S-(+)-2,2-DMCPCA.
Přiklad 2
Stanovení aktivity R- (- )-2., 2-DMCPCAhydrolasy
Pró stanovení aktivity hydrolasy se upraví suspense mikroorganismů na hodnotu optické hustoty 0,5 při 650 nm. Jako médium se použije fosfátový pufr (10 mmolární), pH 7,0, s 0,2 % hmotnostními R,S-2,2-DMCPCA. Tato suspense se za třepáni inkubuje 3 hodiny při 30 °C. Hydrolasou uvolněné NH4+ nebo R-(-)-2,2-DMCPCS se měří a aktivita se vyjádří jako g R-(-)-2,2-DMCPCA přeměněného /1/h/optickou aktivitou při 650 nm, za předpokladu, že 1 mmol vytvořeného NH4+ = 1 mmol přeměněného R-(-)-2,2-DMCPCA.
-7CZ 279306 B6
Tabulka 1
Určení aktivity hydrolasy v závislosti na teplotě (kmen Comamonas acidovorans A:18, DSM č. 6315)
| Teplota [°C] | Aktivita g/l/h/OD6 |
| 25 | 0,25 |
| 30 | 0,5 |
| 37 | 1,0 |
| 45 | 1,5 |
| 48 | 1,8 |
| 55 | 1,9 |
| 65 | 0 |
Příklad 3
Výroba S-(+)-2,2-DMCPCA
Comamonas acidovorans A:18 se napěstuje na agarových deskách s médiem, obsahujícím minerální soli, s glycerinem jako zdrojem uhlíku a síranem amonným jako zdrojem dusíku, 2 dny při 30 °C. Složení média, obsahujícího minerální soli, je uvedeno v tabulce
2. Těmito mikroorganismy, umístěnými na deskách, se naočkuje médium pro předkulturu o stejném složení a inkubuje se 2 dny při 30 °C.
Stejné médium, obsahující minerální soli, které obsahuje Na2SO4 místo (NH4)2SO4 (100 ml), 0,2 % hmotnostní glycerinu a 0,15 % hmotnostních R,S-(±)-2,2-DMCPCA se naočkuje 5 ml předkultury k dosažení indukce a inkubuje se při 30 °C po dobu 45 hodin. Pak se buňky získají odstředěním a suspendují v 0,9 %ním roztoku NaCl.
Po resuspendování buněk v 10 mmolárním fosfátovém pufru (800 ml), pH 7,0 se upraví optická hustota pří 650 nm na 1,3 a přidá se 2 % hmotnostní R,S-(±)-2,2-DMCPCA. Po inkubaci přibližně 25 hodin při 37 °C se R-(-)-2,2-DMCPCA úplně přemění na R-(-)-2,2-DMCPCS, což odpovídá optické čistotě (ee) 100 % a analyticky měřenému výtěžku S-(+)-2,2-DMCPCA 46,7 %. Dokončení reakce se sleduje pomocí uvolnění NH4+ a pomocí GC-analysy supernatantu. Po odstředěni buněk se upraví supernatant na hodnotu pH 9,5 a produkt se izoluje extrakcí ethylacetátem.
Příklad 4
Obdobným způsobem, jako v příkladu 1, se izoluje mikroorganismus Bacterium sp. VIII:II. U tohoto mikroorganismu je doba pro předkultivování 4 dny a doba indukce 3 dny za jinak shodných podmínek jako v příkladě 3. Na rozdíl od. příkladu 3 se biotransformace provádí u tohoto ' mikroorganismu s 0,2% hmotnostními R, S-(±)-2,2-DMCPCA, přičemž jé stanovena aktivita hydrolasy na hodnotu 0,13 g/l/h/OD650mn.
-8CZ 279306 B6
Tabulka 2
Složení média předkultury (Kulla a spol., Arch. Microbiol. 135, str. 1-7, 1983) q/1 destilované vody pH 7,0
| 2,0 | (NH4)2so4 |
| 2,5 | Na2HPO4.2H2O |
| 1,0 | kh2po4 |
| 3,0 | NaCl |
| 0,4 | -MgCl2.6H2O |
| 0,015 | CaCl2.2H2O |
| 0,0008 | FeCl2.6H2O |
| 0,0001 | ZnSO4.7H2O |
| 0,00009 | MnCl2.4H2O |
| 0,0003 | H3BO3 |
| 0,0002 | CoC12.6H20 |
| 0,00001 | CuC12.2H2O |
| 0,00002 | NÍC12.6H2O |
| 0,00003 | Na2Mo04.2H20 |
| 0,005 | Na2EDTA.2H2O |
| 0,002 | FeSO4.7H2O |
| 2 | Glycerin |
Příklad 5
Obdobným způsobem, jako v příkladu 1, se izoluje Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM č. 6433). Doba předkultivace jsou 2 dny a indukce 18 hodin za podmínek jinak shodných s příkladem 3 s tou výjimkou, že indukční médium obsahuje 1 % hmotnostní glycerinu (místo 0,2 % hmotnostních) a dodatečně ještě 0,3 % hmotnostní univerzálního peptonu (Měrek). Biotransformace se uskuteční s 0,2 % hmotnostními R,S-(±)-2,2-DMCPCA, přičemž je aktivita hydrolasy 0,34 g/l/h/OD650nm.
Příklad 6
Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552) se kultivuje 2 dny při 30 °C v komplexním médiu (4 ml) Nutrient Broth, neboli v živném prostředí (Oxoid Ltd., GB). Těmito mikroorganismy se naočkuje médium, obsahující minerální soli (tabulka 3) a inkubuje se 2 dny při 30 °C. Pak se získají buňky podle příkladu 3.
Na rozdíl od příkladu 3 se biotransformace provádí v 10 mmolárním HEPES-pufru (pH 7,0) s 0,5 % hmotnostními R,S-(±)-2,2DMCPCA za jinak shodných podmínek jako v příkladě 3.
-9CZ 279306 B6
Po 4,5 hodinové inkubaci při 37 °C se R-(-)-2,2-DMCPCA zcela přemění na R-(-)-2,2-ĎMCPCS, což odpovídá analyticky měřenému výtěžku 45,5 % a optické čistotě (ee) 99,0 %.
Tabulka 3 cf/1 destilované vody pH 7,0
| 2,0 | K2HPO4 |
| 2,0 | kh2po4 |
| 2,0 | MgSO4.7H2O |
| 0,5 2,0 2,0 0,01 | extrakt kvasnic univerzální pepton (Měrek) NaCl FeCl2.H2O |
| 10 5 | glutamát sodný Krotonamid |
Příklad 7
Výroba S-(+)-2,2-DMCPCA pomocí enzymů v bezbuněčném systému
Po indukci se buňky Comamonas acidovorans A:18 koncentrují na 95 ml na hodnotu optické hustoty 210 při 650 nm v HEPES-pufru (10 mM, pH 0,7). Pak se buňky rozruší dvakrát ve Frenchově tlakovém zařízení při tlaku 120 MPa. Suspense se odstředí 20 min při 20 000 otáčkách za min, aby se získal bezbuněčný enzymový extrakt. V tomto bezbuněčném enzymovém extraktu se pak stanoví obsah proteinů, .39,3 mg proteinu na 1 ml (měřeno podle.metody Bradforda).
Pro stanovení aktivity těchto bezbuněčných enzymů se k 20 μΐ (cca 0,8 mg. proteinu) tohoto bezbuněčného enzymového extraktu přidají 4 ml fosfátového pufru (10 mM, pH 7,0), který obsahuje 0,2 % hmotnostních R, S-(±)-DMCPCA a celé se inkubuje při 30 °C. Přitom se v bezbuněčném extraktu přemění 2,5 g R-(-)-2,2DMCPCA/h/g proteinu (3,64 μιηοΐ/ιηΐη/^ proteinu) na odpovídající kyselinu.
Příklad 8
Výroba S-(+)-2,2-DMCPCA pomocí zmobilizovaných buněk
Po indukci podle příkladu 3 se získají buňky mikroorganismu Comamonas acidovorans A:18. Tyto buňky se imobilizují postupem podle patentu CS 251 111 za použiti polyethyleniminu a glutaraldehydu. Imobilizovaný biokatalyzátor má aktivitu 1,6 μιποΐ/min.g sušiny. Hmotnost sušiny biokatalyzátoru odpovídá 32 % hmotnosti ve vlhkém stavu. Pak se biokatalyzátor v množství 55 g hmotnosti ve vlhkém stavu suspenduje v 800 ml kyseliny borité (10 mM, pH 9,0) s 16 g R,S-(±)-2,'2-DMCPCA. Po inkubaci 68,8 hodin při 37 °C a za míchání rychlosti 200 otáček za min R-(-)-2,2-DMCPCA
-10CZ 279306 B6 zcela zreaguje na R-(-)-2,2-DMCPCS. To odpovídá optické čistotě (ee) 98,2 % a analyticky měřenému výtěžku S-(+)-2,2-DMCPCA 40 %.
Průmyslová využitelnost
Opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPA slouží jako výchozí látka pro výrobu inhibitoru dehydropeptidasy cilastatinu, který se při terapii podává spolu s penemovými, popřípadě karbapenemovými antibiotiky, aby se zabránilo desaktivaci antibiotik renální dehydropeptidasou v ledvině.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (12)
1. Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu, vyznačující se tím, že se v racemickém R,S-(±)2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformuje R-(-)-2, 2dimethylcyklopropankarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou bud' s mikroorganismy rodu Comamonas, Pseudomonas nebo Bacterium, nebo s enzymy z těchto mikroorganismů v bezbuněčném systému, přičemž se získá opticky aktivní S-( +)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid a ten se izoluje.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí v médiu, které obsahuje racemický 2,2-dimethylcyklopropankarboxamid v množství od 0,2 do 5 % hmotnostních.
3. Způsob podle jednoho z nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí při hodnotě pH od 6 do. 11 a při teplotě od 15 do 55 °C.
4. Způsob' podle jednoho z nároků 1 až 3,vyznačuj ící se t i m, že se biotransf ormace provádí buď s mikroorganismy druhu Comamonas acidovorans A: 18 DSM č. 6315 nebo s jejich spontánními mutanty, nebo s bezbuněčnými enzymy z těchto mikroorganismů.
5. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se biotransf ormace provádí buď s mikroorganismy druhu Comamonas acidovorans TG 308 DSM č. 6552 nebo s jejich spontánními mutanty, nebo s bezbuněčnými enzymy z těchto mikroorganismů.
6. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí buď s mikroorganismy druhu Pseudomonas sp NSAK:42 DSM č. 6433 nebo s jejich spontánními mutanty, nebo s bezbuněčnými enzymy z těchto mikroorganismů.
7. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačující s .e tím, že se biotransf ormace provádí buď s mikroorganismy druhu Bacterium sp. VIII:II DSM č. 6316 nebo s jejich
-11CZ 279306 B6 spontánními mutanty, nebo s bezbuněčnými enzymy z těchto mikroorganismů.
8. Mikroorganismus Comamonas acidovorans A:18 DSM č. 6315, schop- ný v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankaboxamidu biotransformovat R-(-)-2,2-dimethylcyklopropanlarboxamid na kyselinu R- (-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou.
9. Mikroorganismus Comamonas acidovorans TG 308 DSM č. 6552, schopný v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformovat R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou.
10. Mikroorganismus Pseudomonas sp NSAK:42 DSM č. 6433, schopný v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransf ormovat R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou.
11. Mikroorganismus Bacterium sp. VIII:II DSM č. 6316, schopný v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformovat R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou.
12.Způsob přípravy mikroorganismů rodu Comamonas, Pseudomonas nebo Bacterium selekční metodou, vyznačující se t i m, že
a) se pěstují mikroorganismy, které rostou s 2,2-dimethylcyklopropankarboxamidem ve formě racemátu nebo jeho optických isomerů jako zdrojem dusíku a se zdrojem uhlíku,
b) z kultury získané pěstováním mikroorganismy, které jsou dimethylcyklopropankarboxamid optických isomerů jako se stabilní ve formě jediný zdroj dusíku.
pak podrobí selekci ty a využívají racemátu nebo
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH67891 | 1991-03-06 | ||
| CH185491 | 1991-06-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS66292A3 CS66292A3 (en) | 1992-09-16 |
| CZ279306B6 true CZ279306B6 (cs) | 1995-04-12 |
Family
ID=25685343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS92662A CZ279306B6 (cs) | 1991-03-06 | 1992-03-05 | Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropan-karboxamidu pomocí mikroorganismů Comamonas, Pseudomon as nebo Bacterium a způsob přípravy těchto mikroorganismů |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5273903A (cs) |
| EP (1) | EP0502525B1 (cs) |
| JP (1) | JP3249566B2 (cs) |
| AT (1) | ATE139800T1 (cs) |
| CA (1) | CA2062281C (cs) |
| CZ (1) | CZ279306B6 (cs) |
| DE (1) | DE59206633D1 (cs) |
| DK (1) | DK0502525T3 (cs) |
| ES (1) | ES2088512T3 (cs) |
| HU (1) | HU214125B (cs) |
| IE (1) | IE74179B1 (cs) |
| IL (1) | IL101129A (cs) |
| MX (1) | MX9200910A (cs) |
| PL (1) | PL168885B1 (cs) |
| RO (1) | RO113663B1 (cs) |
| RU (1) | RU2096460C1 (cs) |
| SK (1) | SK279053B6 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2124714T3 (es) * | 1991-07-26 | 1999-02-16 | Lonza Ag | Procedimiento de ingenieria genetica para la preparacion de s-(+)-2,2-dimetilciclopropanocarboxamida mediante microorganismos. |
| KR100441137B1 (ko) * | 2001-11-22 | 2004-07-21 | 동국제약 주식회사 | 키랄 2,2-디메틸시클로프로판카르복실의 유도체의 제조방법 |
| KR100511534B1 (ko) * | 2002-07-05 | 2005-08-31 | 임광민 | 아미드 화합물의 새로운 제조방법 |
| DE10260456A1 (de) * | 2002-12-18 | 2004-07-08 | Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh | Mutanten des Bakterienstammes Delftia acidovorans MC1 und deren Verwendung zur Produktion von hochreinen R-Enantiomeren von 2-Phenoxypropionsäure-Derivaten |
| CN100345974C (zh) * | 2005-11-24 | 2007-10-31 | 浙江工业大学 | S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法 |
| KR100650797B1 (ko) | 2005-12-12 | 2006-11-27 | (주)케미코월드 | 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법 |
| KR100654923B1 (ko) | 2005-12-15 | 2006-12-06 | (주)씨엘에스랩 | 고순도의 광학활성아미드를 연속적으로 제조하는 방법 |
| CN100547067C (zh) * | 2007-08-10 | 2009-10-07 | 浙江工业大学 | 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用 |
| CN111621541A (zh) * | 2019-02-27 | 2020-09-04 | 上海艾美晶生物科技有限公司 | 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2511867A (en) * | 1949-12-19 | 1950-06-20 | Method fob separating enantiomers | |
| EP0048301A1 (en) * | 1980-09-24 | 1982-03-31 | Merck & Co. Inc. | 2-(Cyclopropane-carboxamido)-2-alkenoic acids, their esters and salts, and antibacterial compositions comprising the same and a thienamycin-type compound |
| DE3569725D1 (en) * | 1984-02-28 | 1989-06-01 | Sumitomo Chemical Co | A method for the optical purification of an optically active 2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid amide |
| WO1987006269A1 (en) * | 1986-04-16 | 1987-10-22 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Process for preparing optically active cyclopropanecarboxylic acids |
-
1992
- 1992-01-30 RU SU925010867A patent/RU2096460C1/ru active
- 1992-03-02 IE IE920669A patent/IE74179B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-03 IL IL10112992A patent/IL101129A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-03 US US07/845,034 patent/US5273903A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-03 MX MX9200910A patent/MX9200910A/es unknown
- 1992-03-04 CA CA002062281A patent/CA2062281C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-05 CZ CS92662A patent/CZ279306B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 PL PL92293716A patent/PL168885B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 ES ES92103780T patent/ES2088512T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-05 AT AT92103780T patent/ATE139800T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 HU HU9200744A patent/HU214125B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 DK DK92103780.0T patent/DK0502525T3/da active
- 1992-03-05 DE DE59206633T patent/DE59206633D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-05 RO RO92-200261A patent/RO113663B1/ro unknown
- 1992-03-05 SK SK662-92A patent/SK279053B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-03-05 EP EP92103780A patent/EP0502525B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-06 JP JP04999792A patent/JP3249566B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-10-28 US US07/969,713 patent/US5360731A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59206633D1 (de) | 1996-08-01 |
| HUT64587A (en) | 1994-01-28 |
| PL293716A1 (en) | 1992-12-28 |
| EP0502525A1 (de) | 1992-09-09 |
| US5273903A (en) | 1993-12-28 |
| EP0502525B1 (de) | 1996-06-26 |
| RU2096460C1 (ru) | 1997-11-20 |
| IE74179B1 (en) | 1997-07-16 |
| RO113663B1 (ro) | 1998-09-30 |
| HU214125B (en) | 1997-12-29 |
| SK279053B6 (sk) | 1998-06-03 |
| JP3249566B2 (ja) | 2002-01-21 |
| MX9200910A (es) | 1994-03-31 |
| IL101129A (en) | 1996-05-14 |
| ATE139800T1 (de) | 1996-07-15 |
| IL101129A0 (en) | 1992-11-15 |
| CA2062281C (en) | 2000-07-11 |
| HU9200744D0 (en) | 1992-05-28 |
| IE920669A1 (en) | 1992-09-09 |
| ES2088512T3 (es) | 1996-08-16 |
| US5360731A (en) | 1994-11-01 |
| JPH0576391A (ja) | 1993-03-30 |
| PL168885B1 (pl) | 1996-04-30 |
| DK0502525T3 (da) | 1996-07-29 |
| CA2062281A1 (en) | 1992-09-07 |
| CS66292A3 (en) | 1992-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5356812A (en) | Processes for production of optically active 3-phenyl-1,3-propanediol by asymmetric assimilation | |
| EP0089370B1 (en) | Production of gamma-decalactone | |
| RU2053300C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы | |
| JP2793812B2 (ja) | イブプロフェンの製造方法 | |
| CS224624B2 (en) | Method for producing 2,5-diketo-d-gluconic acid or its salts | |
| EP0264457A1 (en) | Process for preparing optically active cyclopropanecarboxylic acids | |
| CZ279306B6 (cs) | Způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropan-karboxamidu pomocí mikroorganismů Comamonas, Pseudomon as nebo Bacterium a způsob přípravy těchto mikroorganismů | |
| Nishida et al. | Enzymatic production of L-tryptophan from DL-5-indolylmethylhydantoin by Flavobacterium sp. | |
| AU708588B2 (en) | Process for producing aspartase and process for producing L-aspartic acid | |
| JP3694065B2 (ja) | 環状Ｓ−α−アミノカルボン酸およびＲ−α−アミノカルボキサミドの生物工学的製造方法 | |
| DE69738080T2 (de) | Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität | |
| Yoshida et al. | Isolation and identification of a pyrogallol producing bacterium from soil | |
| EP0356912A2 (en) | A method for the preparation of an optically active 2-substituted carboxylic acid | |
| JPS6257316B2 (cs) | ||
| CZ281198A3 (cs) | Způsob výroby N-chráněných derivátů D-prolinu | |
| US6214604B1 (en) | Biotechnical production process of piperazine R-α-carboxylic acids and piperazine S-α-carboxylic acid amide | |
| US5258305A (en) | Manufacture of optically active 2-phenylpropionic acid and 2-phenylpropionamide from the nitrile using Rhodococcus equi | |
| US5238828A (en) | Method for the preparation of an optically active 2-substituted carboxylic acid | |
| JP2011182778A (ja) | Ｌ−ホモセリン及びｌ−ホモセリンラクトンの製造法 | |
| JPH08507683A (ja) | エステラーゼおよびバイオトランスフォーメーションにこれを使用する方法 | |
| JP2983695B2 (ja) | ４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法 | |
| CA2303697A1 (en) | An optical resolution of 4-halogeno-3-alkanoyloxybutyronitrile | |
| JP2001120259A (ja) | 微生物によるカルボン酸アミド類の製法 | |
| CZ3599A3 (cs) | Mikroorganismy a způsob výroby derivátů D-prolinu | |
| JP2000350594A (ja) | ４−ハロゲノ−３−アルカノイルオキシブチロニトリルの光学分割方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100305 |