RO113663B1 - Procedeu de obtinere a s-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei - Google Patents

Procedeu de obtinere a s-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei Download PDF

Info

Publication number
RO113663B1
RO113663B1 RO92-200261A RO92200261A RO113663B1 RO 113663 B1 RO113663 B1 RO 113663B1 RO 92200261 A RO92200261 A RO 92200261A RO 113663 B1 RO113663 B1 RO 113663B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
microorganisms
dmcpca
biotransformation
dimethylcyclopropanecarboxamide
dsm
Prior art date
Application number
RO92-200261A
Other languages
English (en)
Inventor
Karen Robins
Thomas Gilligan
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of RO113663B1 publication Critical patent/RO113663B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/874—Pseudomonas

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a S-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei, destinată uzului farmaceutic.
In cele ce urmează, s-a prescurtat 2,2-dimetilciclopropancarboxamida cu 2,2-DMCPCA și acidul 2,2-dimetilciclopropancarboxilic cu 2,2-DMCPCS.
S-(+)-DMCPCA optic activ folosește ca material inițial pentru obținerea inhibitorului dehidropeptidazei Cilastatin, care se administrează în terapie împreună cu antibioticele Penem respectiv Carbapenem, pentru a împiedica dezactivarea antibioticelor în rinichi printr-o dehidropeptidază renală (EP 048 301],
Până acum, se cunosc numai procedee chimice pentru obținerea de S-(+J2,2-DMCPCA. Aceste procedee au dezavantajul că sunt scumpe și decurg în mai multe trepte (EP 155 779).
Procedeul, conform invenției, constă în aceea că, din amestecul racemic R, S-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidă se realizează biotransformarea R-(-)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei în acid R-(-)-2,2-dimetilciclopropancarboxilic, cu microorganisme, într-un mediu conținând de la 0,2 până la 5% în greutate amestec racemic de 2,2-dimetilciclopropancarboxamidă, la un pH cuprins între 6,0 și 11 ,□ și la o temperatură de 15 până la 55°C, în urma biotransformării, separându-se S-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamida optic activă, care apoi se izolează.
Prin aplicarea invenției, se obține avantajul unui procedeu mai eficient, mai rapid și cu mai puține etape.
Microorganismele conform invenției au capacitatea de a biotransforma R(-)-2,2-DMCPCA din R,S-(+)-DMCPCA racemic, în R-(-)-2,2-DMCPCS, rezultând S(+)-2,2-DMCPCA optic activ.
Aceste microorganisme se pot izola, de exemplu din probe de sol, nămol sau ape uzate, cu ajutorul tehnicilor microbiologice tradiționale.
Conform invenției, pentru obținerea de S-(+)-2,2-DMCPCA se pot folosi toate microorganismele care folosesc ca substrat R-(-)-2,2.DMCPCA.
Aceste microorganisme se pot obține conform următoarei metode de selecție:
a) Se cultivă microorganisme, care cresc cu 2,2-DMCPCA, sub forma racematului sau ai acestuia ca sursă de N și o sursă de C, în modul obișnuit.
b) Din cultura' obținută prin cultivare, se selecționează apoi acele microorganisme, care sunt stabile și care folosesc 2,2-DMCPCA sub forma racematului sau a izomerilor optici ai acestuia, ca singură sursă de N.
In mod corespunzător scopului, se selecționează microorganismele care acceptă R-(-)-2,2-DMCPCA ca sursă de N.
Ca sursă de C, microorganismele pot folosi de exemplu zaharuri, alcoolii din zaharuri, acizii carboxilici sau alcooli în substratul de creștere. Ca zaharuri, se pot folosi de exemplu fructoza sau glucoza.
Ca alcooli din zaharuri, se pot folosi de exemplu eritrolul, manitolul sau sorbitolul. Ca acizi carboxilici se pot folosi acizii mono-, di- sau tricarboxilici, ca de exemplu acidul acetic, acidul malonic sau acidul citric. Ca alcooli, se pot folosi alcooli mono-, bi- sau trihidroxilici, ca de exemplu etanolul, glicolul sau glicerina.
De preferință, se folosește drept sursă de C un alcool trivalent, ca de exemplu glicerina.
In mod corespunzător scopului, raportul C/N din mediul de selecție este într-un interval cuprins între 5:1 și 10:1.
Ca mediu de selecție, se pot folosi cele obișnuite în domeniu, ca de exemplu un mediu de săruri minerale, descris în Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, pag.
1...7, 1983.
Microorganismele preferate, care cresc cu 2,2-DMCPCA, sub forma racematului sau a izomerilor săi optici, ca sursă de N și o sursă de C, sunt: Comamonas acidovorans A: 18 (DSMnr.6315),Comamonas acidovorans TG 308 (DSM-nr.6552), Pseudomonas sp.NSAK:42 (DSM-nr.6433) și
Bacterium sp.VIII:ll (DSM-nr.631 6), precum și descendenții sau mutanții acesRO 113663 Bl cu nr. DSM 6552 la 06.04.1991 la
Colecția Germană de Microorganisme și
Culturi Celulare GmbH, Mascherodeweg
1B, D-3300 Braunschweig.
tora.
Tulpinile cu nr. DSM 6315 și
6316 au fost înregistrate la
29.01.1991, cele cu nr. DSM 6433 au fost înregistrate la 25.03.1991 și cele
Descrierea științifică a lui Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-nr.G315)
Forma celulelor Baghete Hidroliza
Lățimea pm 0,5...0,7 Amidonului
Lungimea pm 1,5...3,0 Gelatinei
Mobilitatea + Caseinei
Ciluri polar >1 DNA
Reacție Gram- - Tween 80
Liză cu KOH 3% + Aesculină
Aminopeptidază (Cerny) + Descompunerea tirozinei
Spori - Valorificarea substratului
□xidaza + Acetat +
Catalaza + Adipat +
Creșterea + Caprat +
anarerobă - Citrat +
37/41 °C +/- Glicolat +
pH=5,6 + Levulinat +
Agar-Mac-Conkey + Malat +
Agar-SS + Malonat -
Agar-Cetrimidă + Fenilacetat +
Pigmenți L-arabinoză -
nedifuzant - Fructoză +
difuzant - Glucoză
fluorescent - Manoză
Piocianină Maltoză
Acid din (testul OF ) Xiloză
Glucoză aerob - Inositol
Glucoză anaerob - Manitol +
Gaz din glucoză - Gluconat +
Acid din N-acetilglucozamină -
Glucoză - L-serină -
Fructoză + L-triptofan +
Xiloză - Acetamidă +
Manit + Mesaconat +
Glicerol + Citraconat +
ONPG - L-tartrat +
ADH - Sursă de N
VP - nh4+ ++
îndoi - R, S-[+J-2,2-d i m eti I-
N02 din N03 + ciclopropancarboxamidă +
Denitrificație - Butiramidă ++
Fenilalanindesaminază - Acetamidă +
Levan din zaharoză - Propionamidă +
Lecitinază - Formamidă +
Urează - Benzamidă Nicotinamidă + +
API 20NE —>Cs. acidovorans 99,0%
RO 113663 Bl
Descrierea științifică a lui Comamanas acidovoransTG 308 (DSM-nr.6552):
Forma celulelor Baghete
Reacția Gram- (test KOH )
Colorare GramSpori
Mobilitate
Creștere °C
37°C °C
45°C
Catalază + □xidază +
Fermentare în
Glucoză (test OF )
Izolate TG 308
Reducere cu nitrat Producere de indol Acid din glucoză Arginindehidrolază Urează
Hidroliză aesculinei
Hidroliză gelatinei β-galactozidază Asimilarea glucozei Asimilarea arabinozei Asimilarea manozei Asimilarea manitolului +
Asimilarea N-acetil-glucozaminei -
Asimilarea maltozei -
Asimilarea gluconatului +
Asimilarea capratului +
Asimilarea adipatului +
Asimilarea maleatului +
Asimilarea citratului -
Asimilarea fenilacetatului +
Citocrom-oxidaza +
N02 din N03 +
Hidroliză ureei -
Valorificarea fructozei +
Alcalinizarea acetamidei +
Alcalinizarea tartratului +
Alcalinizarea citratului Simon +
Alcalinizarea malonatului (+
(+] slab pozitiv
Descrierea științifică a lui Pseudomonas sp.l\JSAK:42 (DSM-nr.6433)
Forma celulelor Baghete Hidroliză
Lățimea pm 0,6...0,8 Amidonului
Lungimea pm 1,5...3,0 Gelatinei
Mobilitatea + Caseinei
RO 113663 Bl
Reacția Gram- DNA -
Liză cu KOH 3% + Tween 8D -
Aminopeptidază + Aesculină -
Spori - Descompunerea tirozinei -
Oxidază + Necesar de substanțe de creștere
Catalază + Valorificarea substratului
Creșterea Acetat +
anaerob - Caprat +
37/41 °C +/- Citrat +
pH=5,6 + Glicolat +
Agar-Mac-Conkei + Lactat +.
Agar-SS - Levulinat +
Agar-Cetrimidă - Malat +
Pigmenți Galben Malonat +
Acid din (test OF ] Fenilacetat +
Glucoză aerob - Suberat +
Glucoză anaerob - L-arabinoză -
Gaz din glucoză - Fructoză +
Acid din Glucoză -
Glucoză Manoză -
Fructoză Maltoză -
Xiloză Xiloză -
□NPG Manitol -
ODC Gluconat +
ADH 2-chetogluconat +
VP N-acetilglucozamină -
Indol L-serină +
N02 din N03 L-histidină -L
Denitrificare Hidroxibutirat +
Fenilalanindesaminază Sursă de N
Levan din zaharoză - NH/ + +
Lecitinază - R ,S-(±]-2,2-di metil-
ciclopropan + carboxamidă
Descrierea științifică a lui Bacterium sp.VIII:ll (DSM-nr.6316)
Colorare Gram +
Reacție Gram (test KOH ) -
Oxidază -
Catalază -
Reducere cu nitrat -
Triptofan—>lndol -
Glucoză [ anaerob ] -
Arginină -
Urează -
Esculină +
Gelatină -
β-galactozidază +
Glucoză +
Arabinoză -
Manoză (+
RO 113663 Bl
Manit
N-acetilglucozamină
Maltoză
Gluconat
Caprat
Adipat
Malat
Citrat
Fenilacetat
In mod obișnuit, se formează, conform procedeului de selecție, o precultură a acestor microorganisme, cu care se pot apoi inocula și alte culturi.
Această precultură poate fi cultivată în aceleași medii, cu același raport C/N și cu aceeași compuși drept sursă de C, în mod analog cu procedeul de selecție.
De preferință, mediul pentru precultură conține fie compoziția care este indicată în tabelul 2 sau cea care este indicată în tabelul 3, cu sau fără peptona universală.
Ca surse de N, se pot utiliza, pentru precultură, cele obișnuite în domeniu, de preferință utilizându-se ca sursă de N o sare de amoniu, ca de exemplu sulfatul de amoniu.
Valoarea pH-ului în precultură este de preferință între 4,0 și 10,0 la o temperatură adecvată de de 20 până la 40°C.
După o durată de cultivare de 1 □ până la 100 h, de regulă, microorganismele pot fi induse și pregătite pentru biotransformare.
In mod obișnuit, se inoculează cu această precultură mediul de inducție, care posedă, cu excepția sursei de N, aceeași compoziție ca și mediul de precultură.
In mod adecvat, acest mediu conține pentru inducția enzimelor active ale microorganusmelor 2,2-DMCPCA sub forma racematului sau a izomerilor optici ai acestuia, care pot folosi atât ca sursă de N cât și ca inductor de enzimă.
Se pot folosi însă și alți compuși ca inductori, ca de exemplu ciclopropancarboxamida, caprolactama, benzamida, ciclohexaricarboxamida, amida acidului +
+ nicotinic sau crotonamida. Inducția are loc în mod adecvat cu 0,05 până la 0,15% în greutate, de preferință cu 0,1 până la 0,15% în greutate, DMCPCA sub formă de racemat sau de izomeri optici ai acestuia.
După o durată obișnuită a inducției de 15 până la 80 h, microorganismele pot fi recoltate de exemplu prin centrifugare sau ultrafiltrare și apoi sunt din nou suspendate într-un mediu pentru procedeu.
Procedeul propriu-zis de obținere a S-(+]-2,2-DMCPCA se realizează conform invenției, prin aceea că se biotransformă R-(-)-2,2-DMCPCA din R,S(+)-2,2-DMCPCA racemic în R-[-)-2,2 DMCPCS, formându-se S-(+)-2,2DMCPCA optic activ, care se izolează.
Corespunzător scopului, biotransformarea se realizează fie cu microorganisme, fie cu enzime, într-un sistem fără celule.
Enzimele pentru sistemul lipsit de celule se pot obține prin descompunerea obișnuită a celulelor de microorganisme.Pentru aceasta, se poate folosi de exemplu metoda cu ultrasunete, Frenchpress sau Lysozym.
Aceste enzime lipsite de celule pot fi imobilizate apoi de exemplu, pentru realizarea procedeului, pe un material purtător adecvat.
Pentru procedeu, sunt adecvate în mod special microorganismele din specia Comamonas acidovorans A: 1 8 (DSM-nr.6315), Comamonas acidovorans TG 308 (DSM-nr.6552),
Pseudomonas sp. NSAK:42 (DSMnr.6433) specia Bacterium sp. VIII:II [DSM-nr.6316], descendenții sau mutanții acestora care se pot selecta după
RO 113663 Bl procedeul descris aici. La fel de adecvate, sunt și enzimele fără celule din aceste microorganisme.
De preferință, procedeul este realizat fie cu celule de microorganisme în stare de repaus (celule care nu cresc) care nu mai necesită sursă de C și N, sau cu enzime într-un sistem lipsit de celule, aceste enzime obținându-se așa cum s-a descris mai înainte, de exemplu prin descompunerea microorganismelor induse.
In mod adecvat, mediul conține
2,2-DMCPCA într-o cantitate de 0,2 până la 5% în greutate, de preferință de la 0,2 până la 2% în greutate.
Ca medii pentru procedeu, se pot folosi cele obișnuite în domeniu, ca de exemplu tampon de fosfat cu masă moleculară mică, mediul de sare minerală descris mai înainte sau tamponul HEPES (acid N-2-hidroxi-etil-piperazin-2'etansulfonic).
De preferință, procedeul se realizează într-un tampon de fosfat cu masă moleculară mică.
Valoarea pH-ului mediului se poate găsi într-un interval de 6,0 până la 11,0, de preferință între 6,5 și 10,0.
In mod adecvat, biotransformarea se realizează la o temperatură de 15 până la 55°C, de preferință de la 20 până la 40°C.
După o durată obișnuită a reacției de 1 până la 30 h, de preferință de la 5 până la 25 h, R-(-)-2,2-DMCPCA este transformat complet în acidul corespunzător, formându-se S-(+)-2,2-DMCPCA optic pur. S-(+)-2,2-DMCPCA astfel obținut se poate apoi recupera prin extracție, electrodializă sau prin uscare, de exemplu.
Se dau, în continuare, șase exemple de realizare a invenției.
Exemplul 1. Izolarea și selecția de microorganisme cu o hidrolază de R(-)-2,2-DMCPCA. La probe mărunțite de sol (1 g), s-a adăugat o soluție izotonică de sare de bucătărie (9 ml) și totul s-a lăsat să stea circa 5 min. Apoi partea de deasupra (0,5 ml] se suprainoculează într-un mediu de sare minerală (25 ml, Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, pag.
1...7, 1983] care conține glicerină și R,S-(+) DMCPCA într-un raport C/N de 5:1. Apoi această cultură s-a incubat, până ce s-a format o cultură de amestec, care poate folosi R,S-(+]-DMCPCA ca sursă de N.
S-au obținut culturi pure din aceste microorganisme cu ajutorul tehnologiilor microbiologice tradiționale.
Tulpinile de microorganisme, obținute în acest fel, apoi au fost testate pe plăci de agar pentru creșterea lor pe R,S-(±)-2,2-DMCPCA, S-(+)-2,2-DMCPCA și R-(-) -2,2-DMCPCA, pentru a găsi tulpinile nedorite, care cresc la fel de repede pe ambii izomeri (R-(-)-2,2-DMCPCA și S-(+)-2,2-DMCPCA).
Celelalte tulpini s-au testat mai departe. Cu acestea, s-a inoculat apoi un mediu de precultură. Microorganismele obținute în această precultură au fost trecute în mediul de sare minerală și apoi s-a verificat selectiv capacitatea lor de a folosi R-(-)-2,2-DMCPCA ca singură sursă de N, stratul de deasupra fiind verificat cu ajutorul GC pentru formarea de R-(-]-2,2-DMCPCS și pentru îmbogățirea de S-(+]-2,2-DMCPCA.
Stabilirea activității hidrolazei de R-(-)-2,2-DMCPCA
Pentru stabilirea activității hidrolazei, s-a reglat suspensia de microorganisme la o densitate optică de 0,5 la 650 nm. Ca mediu, s-a folosit un tampon de fosfat ( lOmmolar ), pH=7,0 cu 0,2% în grutate R,S-2,2-DMCPCA. Această suspensie s-a incubat 3 h, la 30°C sub agitare. NH/ sau R-(-)-2,2DMCPCS pus în libertate s-a măsurat și activitatea s-a exprimat în g de R-(-]-2,2DMCPCA reacționat/l/h/densitate optică la 650 nm, cu premiza că 1 mmol de NH/=1 mmol de R-(-]-2,2-DMCPCA, adică 1 mmol NH/ corespunde la 1 mmol de R-(-]-2,2-DMCPCA reacționat.
RO 113663 Bl
Tabelul 1
Determinarea activității hidrolazei În funcție de temperatură (tulpina Comamonas acidovorans A: 18 DSM-nr.6315
Temperatură ( DC ) 25 30 37 45 48 55 65 Reactivitate ( g/l/h/0D65O 0,25 0,5 1,0 ' 1,5 1,8 1,9 □
Obținerea de S-(+)-2,2-DMCPCA io
Comamonas acidovorans A: 18 a fost incubat pe plăci de agar cu mediu de sare minerală cu glicerină ca sursă de C și sulfat de amoniu ca sursă de N, timp de 2 zile, la 3O°C. Compoziția aces- 15 tui mediu de sare minerală este indicată în tabelul 2. Cu aceste microorganisme din plăci, s-a inoculat un mediu de precultură cu aceeași compoziție și s-a incubat timp de 2 zile, la 3O°C. 2o
Același mediu de sare minerală cu Na2S04în loc de (NH4)2S04 (1OOml) conținând 0,2% glicerină și 0,15% în greutate R,S-(+)-2,2-DMCPCA s-a inoculat cu 5 ml din această precultură pen- 2 5 tru inducție și s-a incubat la 30°C, timp de 45 h. Apoi celulele au fost recoltate prin centrifugare și preluate într-o soluție de NaCI 0,9%.
După resuspendarea celulelor în 3 o tampon de fosfat 10 mmolar (800ml) pH=7,0, s-a reglat o densitate optică de
1,3 la 650 nm și s-au adăugat 2% în greutate R,S-(-)-2,2-DMCPCA.
După o incubare de circa 25 h, la 3 5 37°C, s-a transformat complet R-(-)-2,2
DMCPCA în R-(-)-2,2-DMCPCS, ceea ce a corespuns la o puritate optică (ee) de 100% și la un randament măsurat în mod analitic în S-(+)-2,2-DMCPCA de 46,7%.
Desfășurarea reacției s-a urmărit cu ajutorul punerii în libertate de NH4 + și cu ajutorul analizei GC a suprastratului.
După separarea prin centrifugare a celulelor, suprastratul s-a reglat la o valoare a pH-ului de 9,5 și produsul s-a izolat prin extracție cu acetat de etil.
Exemplul 2. In mod analog ca în exemplul 1, s-a izolat microorganismul Bacterium sp. VIII:II. Durata de precultivare a fost la acest microorganism de 4 zile și durata de inducție de 3 zile, condițiile celelalte fiind aceleași ca în exemplul 1.
Spre deosebire de exemplul 1, biotransformarea s-a realizat cu acest microorganism cu 0,2% în greutate R,S(+)-2,2-DMCPCA, activitatea hidrolazei fiind stabilit că este de 0,13g/ I/ h/
Tabelul 2
Compoziția mediului preculturii (Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, pag. 1...7, 1983) g/l apă distilată
oH=7.O
2,0 (NH4]2S04
2,5 NaaHP04.2H20
1.0 KH2P04
3,0 NaCI
□,4 MgCI2.6Ha0
0,015 CaCI2.2H20
0,0008 FeCI2.6H20
□ ,0001 ZnS04.7Ha0
0,00009 MnCI2.4H20
RO 113663 Bl
0,0003
0,0002
0,00001
0,00002
0,00003
0,005
0,002
Tabelul 2 [continuare)
H3B03
CoCI2.6H2O
CuCI2.2H20
NiCI2.H2O
Na2Mo04.2H2C
Na2EDTA.2H20
FeS04.7H20
Glicerina
Exemplul 3. In mod analog cu io exemplul' 1, s-a izolat Pseudomonas sp. NSAK:42(DSM-nr.6433). Durata preculturii a fost de 2 zile și durata inducției de 18h, celelalte condiții fiind aceleași cu cele din exemplul 1, cu excepția faptului 15 că mediul de inducție a conținut 1%în greutate glicerină (în loc de 0,2% în greutate) și în plus și 0,3% în greutate peptonă universală (Merck). Biotransformarea a fost realizată cu 0,2% în 20 greutate de R,S-(+)-2,2-DMCPCA, activitatea hidrolazei fiind stabilită a fi de 0,34g/l/h/ODB50nm.
Exemplul 4. S-a cultivat Comamonas acidovorans TG 308 ( DSM- 25 nr.6552 ) timp de 2 zile, la 30°C în mediul complex (4ml) - “Nutrient Broth” (Oxoid Ltd, GB). Cu aceste microorganisme, s-a inoculat un mediu de sare minerală (tabelul 3) și s-a incubat timp de 2 zile, la 30°C. Apoi celulele s-au recoltat conform exemplului 1.
Spre deosebire de exemplul 1, biotransformarea s-a realizat în tamponul HEPES 10 mmolar (pH=7,0) cu 0,5% în greutate R,S-(+)-2,2-DMCPCA, restul condițiilor fiind aceleași ca în exemplul 1.
După o incubare de 4,5 h, la 37°C, s-a transformat R-(-)-2,2-DMCPCA complet în R-(-)-2,2-DMCPCA, ceea ce a corespuns la un randament măsurat analitic în S-(+)-DMCPCA de 45,5% și la o puritate optică (ee) de 99,0%.
Tabelul 3 g/l apă distilată pH=7,0
2,0 K2P04
2,0 KH2PG4
2,0 MgS04.7H20
0,5 extract de drojdie
2,0 peptonă universală ( Merck )
2,0 NaCI
0,01 FeCI2.H2O glutamat de sodiu amidă crotonică
Exemplul 5. Obținerea de S-[+)- 40
2,2-DMCPCA cu enzime într-un sistem lipsit de celule. După inducție, celulele de Comamonas acidovorans A: 18 s-au concentrat la o densitate optică la 650 nm de 210 la 95ml în tamponul HEPES 45 (10mM, pH=7,0). Apoi celulele s-au descompus de 2 ori în French-Press la o presiune de 1200 bar. Pentru a obține un extract de enzimă lipsit de celule, totul a fost centrifugat la 20 000 rpm, 50 timp de 20 min.
In acest extract de enzimă lipsit de celule, s-a determinat apoi cantitatea de proteină (măsurată după metoda Bradford) la 39,3 mg proteină/ml.
Pentru stabilirea activității acestei enzime lipsite de celule, s-au preluat pl (circa 0,8mg proteină] din acest extract de enzimă lipsit de celule în 4 ml de tampon de fosfat (10 mM, pH=7,0] conținând 0,2% în greutate R,S-(+)-2,2RO 113663 Bl
DMCPCA și s-a incubat la 3O°C. In acest caz, s-a transformat în extractul lipsit de celule 2,5g R-(-)-2,2-DMCPCA/h/g proteină (3,64 pmoli/min/g proteină) în acidul corespunzător. 5
Exemplul 6. Obținerea de S-[+]-
2,2-DMCPCA cu celule imobilizate. După inducție (corespunzător exemplului 1], sau recoltat celulele de Comamonas acidovorans A: 18. Aceste celule s-au io imobilizat printr-un tratament cu polietilenimină/aldehidă glutarică (corespunzător lui CS-PS 251 111). Biocatalizatorul imobilizat a avut o activitate de 1,6 pmol/min/g greutate uscată. 15 Greutatea uscată a biocatalizatorului a corespuns la 32% din greutatea umedă.
Apoi biocatalizatorul (cu o greutate umedă de 55 g) a fost suspendat în 800 ml acid boric (10mM, pH=9,0) cu 2o 16g R,S-(+)-2,2-DMCPCA.
După un timp de incubare de
68,8 h, 37°C și la o viteză de agitare de 200 rpm, s-a transformat complet R-(-J-
2.2- DMCPCA în R-(-)-2,2-DMCPCA în R-(- 2 5 )-2,2-DMCPCS, ceea ce a corespuns la o puritate optică (ee) de 98,2% și la un randament măsurat analitic în S-(+)-2,2DMCPCA de 40%.

Claims (6)

  1. Revendicări 3 o
    1. Procedeu de obținere a S-(+)-
  2. 2.2- dimetilciclopropancarboxamidei, caracterizat prin aceea că, din amestecul racemic R,S-(+)-2,2-dimetilciclopro- 3 5 pancarboxamidă, se realizează biotransformarea R-(-)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei în acid R-(-)-2,2-dimetilciclopropancarboxilic, cu microorganisme, într-un mediu conținând de la 0,2 până 4 o la 5% în greutate amestec racemic de
    2,2-dimetilciciopropancarboxamidă, la un pH cuprins între 6,0 și 11,0 și la o temperatură de 15 până la 55°C, în urma biotransformării, separându-se S(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamida optic activă, care apoi se izolează.
    2. Procedeu, conform revendicării
    1, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu enzimele din aceste microorganisme, într-un sistem lipsit de celule.
  3. 3. Procedeu, conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu microorganisme din specia Comamonas acidovorans A: 18 ( DSMnr.6315 ] sau cu descendenții sau mutanții acestora.
  4. 4. Procedeu, conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu microorganisme din specia Comamonas acidovorans TG 308 ( DSMnr.6552) sau cu descendenții sau mutanții acestora.
  5. 5. Procedeu, conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu microorganisme din specia Pseudomonas sp. NSAK:42( DSM-nr.6433 ) sau cu descendenții sau mutanții acestora.
  6. 6. Procedeu, conform revendicărilor 1 sau 2, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu microorganisme din specia Bacterium sp.VIII:ll (DSM-nr.6316) sau cu descendenții sau mutanții acestora.
RO92-200261A 1991-03-06 1992-03-05 Procedeu de obtinere a s-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei RO113663B1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH67891 1991-03-06
CH185491 1991-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO113663B1 true RO113663B1 (ro) 1998-09-30

Family

ID=25685343

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO92-200261A RO113663B1 (ro) 1991-03-06 1992-03-05 Procedeu de obtinere a s-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei

Country Status (17)

Country Link
US (2) US5273903A (ro)
EP (1) EP0502525B1 (ro)
JP (1) JP3249566B2 (ro)
AT (1) ATE139800T1 (ro)
CA (1) CA2062281C (ro)
CZ (1) CZ279306B6 (ro)
DE (1) DE59206633D1 (ro)
DK (1) DK0502525T3 (ro)
ES (1) ES2088512T3 (ro)
HU (1) HU214125B (ro)
IE (1) IE74179B1 (ro)
IL (1) IL101129A (ro)
MX (1) MX9200910A (ro)
PL (1) PL168885B1 (ro)
RO (1) RO113663B1 (ro)
RU (1) RU2096460C1 (ro)
SK (1) SK279053B6 (ro)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2124714T3 (es) * 1991-07-26 1999-02-16 Lonza Ag Procedimiento de ingenieria genetica para la preparacion de s-(+)-2,2-dimetilciclopropanocarboxamida mediante microorganismos.
KR100441137B1 (ko) * 2001-11-22 2004-07-21 동국제약 주식회사 키랄 2,2-디메틸시클로프로판카르복실의 유도체의 제조방법
KR100511534B1 (ko) * 2002-07-05 2005-08-31 임광민 아미드 화합물의 새로운 제조방법
DE10260456A1 (de) * 2002-12-18 2004-07-08 Ufz-Umweltforschungszentrum Leipzig-Halle Gmbh Mutanten des Bakterienstammes Delftia acidovorans MC1 und deren Verwendung zur Produktion von hochreinen R-Enantiomeren von 2-Phenoxypropionsäure-Derivaten
CN100345974C (zh) * 2005-11-24 2007-10-31 浙江工业大学 S－(+)－2,2－二甲基环丙甲酰胺的微生物制备方法
KR100650797B1 (ko) 2005-12-12 2006-11-27 (주)케미코월드 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법
KR100654923B1 (ko) 2005-12-15 2006-12-06 (주)씨엘에스랩 고순도의 광학활성아미드를 연속적으로 제조하는 방법
CN100547067C (zh) * 2007-08-10 2009-10-07 浙江工业大学 表皮短杆菌zjb-07021及其在制备(s)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺中的应用
CN111621541A (zh) * 2019-02-27 2020-09-04 上海艾美晶生物科技有限公司 使用电渗析技术拆分光学异构体的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2511867A (en) * 1949-12-19 1950-06-20 Method fob separating enantiomers
EP0048301A1 (en) * 1980-09-24 1982-03-31 Merck & Co. Inc. 2-(Cyclopropane-carboxamido)-2-alkenoic acids, their esters and salts, and antibacterial compositions comprising the same and a thienamycin-type compound
DE3569725D1 (en) * 1984-02-28 1989-06-01 Sumitomo Chemical Co A method for the optical purification of an optically active 2,2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid amide
WO1987006269A1 (en) * 1986-04-16 1987-10-22 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for preparing optically active cyclopropanecarboxylic acids

Also Published As

Publication number Publication date
DE59206633D1 (de) 1996-08-01
HUT64587A (en) 1994-01-28
PL293716A1 (en) 1992-12-28
EP0502525A1 (de) 1992-09-09
US5273903A (en) 1993-12-28
EP0502525B1 (de) 1996-06-26
RU2096460C1 (ru) 1997-11-20
IE74179B1 (en) 1997-07-16
HU214125B (en) 1997-12-29
SK279053B6 (sk) 1998-06-03
JP3249566B2 (ja) 2002-01-21
MX9200910A (es) 1994-03-31
IL101129A (en) 1996-05-14
ATE139800T1 (de) 1996-07-15
IL101129A0 (en) 1992-11-15
CA2062281C (en) 2000-07-11
CZ279306B6 (cs) 1995-04-12
HU9200744D0 (en) 1992-05-28
IE920669A1 (en) 1992-09-09
ES2088512T3 (es) 1996-08-16
US5360731A (en) 1994-11-01
JPH0576391A (ja) 1993-03-30
PL168885B1 (pl) 1996-04-30
DK0502525T3 (da) 1996-07-29
CA2062281A1 (en) 1992-09-07
CS66292A3 (en) 1992-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2053300C1 (ru) Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы
EP0610048B1 (en) Process for producing optically active alpha-hydrocarboxylic acid having phenyl group
RU2520870C1 (ru) Штамм бактерий rhodococcus aetherivorans bkm ac-2610d - продуцент нитрилгидратазы, способ его культивирования и способ получения акриламида
US5714357A (en) Process for producing optically active α-hydroxycarboxylic acid having phenyl group
US5134077A (en) Microorganisms of the genus Erwinia useful for preparing 2,5-diketo-D-gluconic acid
RO113663B1 (ro) Procedeu de obtinere a s-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxamidei
US5200331A (en) Method of producing an amide utilizing a microorganism
JP3694065B2 (ja) 環状Ｓ−α−アミノカルボン酸およびＲ−α−アミノカルボキサミドの生物工学的製造方法
Sztajer et al. The effect of culture conditions on lipolytic productivity of microorganisms
US5238827A (en) Process for preparing glycine from glycinonitrile
JPH0253029B2 (ro)
JP3154646B2 (ja) グリコール酸の微生物学的製造法
DE69738080T2 (de) Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität
JPH0440898A (ja) α―ヒドロキシ―４―メチルチオ酪酸の生物学的製造法
Li et al. Factors regulating production of α‐galactosidase from Bacillus sp. JF 2
US4017362A (en) Microbiological process for preparing L-tartaric acid in presence of surfactants
JP3810860B2 (ja) アルカリゲネス属の微生物を利用してヘテロ芳香族カルボン酸を製造する微生物学的方法
US5258305A (en) Manufacture of optically active 2-phenylpropionic acid and 2-phenylpropionamide from the nitrile using Rhodococcus equi
Plachý et al. Production of L-aspartic acid from fumaric acid by Alcaligenes metalcaligenes CCEB 312
JP2507406B2 (ja) Ｄ−（−）−酒石酸の製造法
JP3055711B2 (ja) 光学活性（ｓ）−３−フェニル−１，３−プロパンジオールの製造法
JPS5820596B2 (ja) コプロボルフイリン ３ ノ セイホウ
CZ279298B6 (cs) Mikroorganismy Alcaligenes faecalis DSM 6335 a způsob mikrobiologické výroby kyseliny 6-hydroxypikolinové
CA2303697A1 (en) An optical resolution of 4-halogeno-3-alkanoyloxybutyronitrile
JPH05219969A (ja) α−ヒドロキシイソ酪酸の生物学的製造法