SK278640B6 - Method of the factor viii isolation - Google Patents
Method of the factor viii isolation Download PDFInfo
- Publication number
- SK278640B6 SK278640B6 SK5371-90A SK537190A SK278640B6 SK 278640 B6 SK278640 B6 SK 278640B6 SK 537190 A SK537190 A SK 537190A SK 278640 B6 SK278640 B6 SK 278640B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- factor viii
- plasma
- volume
- factor
- gel filtration
- Prior art date
Links
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract description 12
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 74
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 17
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 8
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 abstract 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 19
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 108010088880 plasmagel Proteins 0.000 description 5
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 4
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 4
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 4
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 4
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 4
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 4
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 4
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 4
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 4
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 4
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 4
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 3
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 3
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 3
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 1
- 108010035369 Cohn fraction I Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 229940124135 Factor VIII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- -1 IgM Proteins 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 241000209027 Ilex aquifolium Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 238000006887 Ullmann reaction Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000603 anti-haemophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000013327 media filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 102220125763 rs886044063 Human genes 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Networks Using Active Elements (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Separation By Low-Temperature Treatments (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu izolácie faktora VIII z telesných tekutín ako plazmy pri použití filtrácie na géli ako prvého izolačného stupňa. 5
Doterajší stav techniky
Faktor VIII, známy tiež ako antihemofilický faktor A 10 alebo AHF, je bielkovina plazmy, ktorá sa zúčastňuje vnútorného mechanizmu zrážania krvi.
Faktor VIII je prítomný v krvnej plazme vo veľmi nízkych koncentráciách vo forme nekovalentného komplexu dvoch bielkovín s koagulačnou účinnosťou faktora 15 VIII (Faktor VIII : C) a s účinnosťou ristocetínu ako pomocného faktora (z Willebrandovho faktora (vWF), komplex má molekulovú hmotnosť 1 až 20 x 10®.
Faktor VIII chýba alebo je ho veľmi málo u osôb, trpiacich na hemofíliu A, ide približne o 5 osôb zo 100000. 20
Faktor von Willenbradov sa viaže na aktivované krvné doštičky takým spôsobom, že podporuje zhlukovanie aktivovaných doštičiek. Tento účinok je možné preukázať in vitro zhlukovaním doštičiek indukovaným ristocetínom. Preto je možné pozorovať v prípade Willebrandovej 25 choroby predĺžený čas krvácania v dôsledku toho, že chýba alebo je znížené množstvo Willebrandovho faktora.
Chorí, trpiaci na hemofíliu A a s ťažkými príznakmi Willebrandovej choroby, sú dnes liečení koncentrátmi s 30 obsahom faktora Vili: C/vWF, táto liečba zvýši kvalitu ich života a ich práceschopnosť podstatným spôsobom a prispieva tiež k predĺženiu ich života.
Farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú faktor
VIII (faktor VIILC a/alebo vWF), jc možné získať z krvi 35 alebo z krvnej plazmy. Tieto prostriedky je možné vyrábať rôznym spôsobom, ale vždy je výroba spojená s nízkym výťažkom, hlavne v prípade faktora VIII: C. Takmer všetky postupy vyžadujú počiatočné čistenie vrátane kryoprecipitácie, pri tomto čistení sa plazma rozmrazí pri teplote 0 až 4 °C, čím dôjde k vzniku zrazeniny, ktorá obsahuje faktor VIII, ktorý je možné oddeliť napríklad odstredením. I keď ide o pomerne jednoduchý postup, má tento postup veľké nevýhody pri použití vo veľkom meradle, napríklad pri zmesiach plazmy s hmotnosťou viac ako 5 kg poskytuje tento postup nízke výťažky faktora VIILC (30 až 45 % obsahuje v plazme), čo znamená, že konečný výťažok je nízky bez ohľadu na to, aké čistiace postupy sa potom použijú.
Okrem toho sa pri výrobe faktora VIII zvy čajne zaraďuje stupeň, pri ktorom dochádza k inaktivácii vírusov. Tieto stupne zvyšujú bezpečnosť použitia týchto prostriedkov, ale vo väčšine prípadov tiež znižujú ešte viac výťažok faktora VIILC.
Celkovo veľmi nízke výťažky faktora VIII viedli k jeho nedostatku v rôznych miestach. Je zrejmé, že by boli potrebné nové postupy na čistenie faktora VIII pre jeho získanie vo väčších množstvách pre potreby hemofilikov.
Najvhodnejšie nové metódy na izoláciu faktora VIII by boli priamo z plazmy, vzhľadom na to, že až 70 % obsahu tohto faktora v plazme sa stráca v počiatočných stupňoch, t.j. pri kryoprecipitácii alebo ešte pred ňou.
V súčasnosti boli vykonávané pokusy izolovať faktor VIII z plazmy priamo pri použití afinitnej chromatografle podľa publikácie Thromb. Haemost. 61 (2), 234 až 237 (1989), bol však dosiahnutý výťažok menej ako 60 % a špecifická účinnosť 1 IU (medzinárodná jednotka) faktora VlII/mg bielkoviny vo frakcii s obsahom faktoru VIII.
Gélová filtrácia alebo chromatografla na géli, pri ktorej zvyčajne dochádza tiež k deleniu podľa veľkosti molekúl, je riadený postup, ktorý sa používa na delenie rozpustených látok podľa ich veľkosti. Rozpustené materiály sa nechajú prejsť poréznymi časticami gélu s veľkosťou pórov, vylučujúcou najväčšie molekuly, pričom menšie molekuly difundujú do stacionárnej fázy vnútri častíc gélu. To znamená, že najväčšie častice, celkom vylúčené z gélových častíc, sa vymývajú ako prvé spolu s prázdnym objemom, pričom malé molekuly sa vymývajú až po dlhšom čase podľa svojej zmenšujúcej sa veľkosti so zvyšujúcim sa eluačným objemom.
Filtráciu na géli je možné vykonávať dvoma rôznymi spôsobmi:
1. Delenie do skupín
Pri tomto postupe sa rozpustené látky delia do dvoch skupín s veľkým rozdielom v molekulových rozmeroch, jedna z týchto skupín sa vymýva už na začiatku s prázdnym objemom, pričom druhá oveľa neskôr v objeme, ktorý často zodpovedá celkovému objemu použitej vrstvy. Tento postup sa používa predovšetkým na delenie bielkovín od rozpustených solí alebo na výmenu pufra a niekedy sa označuje ako odsolenie. Na tento účel sa používajú pevné gély s malým rozmerom pórov a postup je možné vykonávať pri použití veľkého množstva materiálu (objem vzorky môže byť 20 až 30 % objemu vrstvy) a veľkých prietokových rýchlostí (približne objem vrstvy za hodinu), kapacita stĺpca je teda vysoká.
2. Frakcionácia
Pri tomto postupe sa delia rozpustené látky s podobnou veľkosťou molekúl. Ide často o delenie bielkovín. Na tento účel sa používajú častice gélu s veľkými pórmi a materiál na filtráciu gélom sa použije tak, aby bielkoviny boli vymývané medzi prázdnym objemom a objemom, ktorý je rovný celkovému objemu vrstvy. Jednotlivé látky sa vymývajú veľmi blízko seba a môžu sa 40 prekrývať. Vysoká rýchlosť prietoku je nežiaduca, pretože pri nej nedochádza k účinnému deleniu bielkovín a zaťaženie stĺpca má byť malé, aby bolo možné dosiahnuť dostatočné oddelenie jednotlivých bielkovín. Tento postup je preto odporúčaný pri delení bielkovín až ako 45 posledný čistiaci stupeň, v ktorom už objem, v ktorom sa frakcionácia vykonáva, je malý (Jagschies, Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry, zv. B3(10), 1988 a Bio/Technol., 4, 954 až 958 (1986)).
Boli vykonané pokusy izolovať faktor Vili z plazmy 50 pri použití filtrácie na géli podľa J. Lab. Clin. Med., 72 (6), 1968, 1007 - 1008 a J. Clin. Invest. 48, 1969, 957 962. Získal sa veľmi čistý produkt, ale výťažok bol iba 40 až 50 %. Zistilo sa, že čistota frakcií s obsahom faktora VIII závisí od východiskovej plazmy tak, že veľký 55 počet chylomikrónov a vysoký obsah lipidov dáva vznik zakaleným frakciám s obsahom faktora VIII s nízkou špecifickou účinnosťou. Tiež sa pozorovalo, že použitý postup gélovej filtrácie neumožňoval použitie väčších objemov plazmy, i keď predbežné pokusy ukazovali, že 60 by týmto spôsobom bolo možné získať oveľa koncentrovanejšiu Cohnovu frakciu I.
Okrem toho sa v publikácii Paulssen a ďalší, Thromb. Diathes. Haemorr. 22, 1969, 577 - 583 uvádza, že faktor VIII by bolo zrejme možné oddeliť od iných 65 plazmatických bielkovín pri použití gélu Sepharose 6B, ale že by zrejme chromatografiu na géli bolo možné použiť vo väčšom meradle len v tom prípade, ak by sa ako východiskový materiál použila zrazenina po kryoprecipitačnom stupni po svojom opätovnom rozpustení.
V US patentovom spise č. 3 637 489 sa opisuje postup na delenie krvných zložiek pri použití filtrácie na géli a poréznych sklenených guličiek. Postup je určený najmä na delenie imunologický aktívnych materiálov od iných zložiek krvnej plazmy alebo séra.
Vykonal sa ešte rad pokusov na použitie filtrácie na géli na čistenie faktora VIII, ale tieto pokusy sa sústredili na filtráciu čiastočne čistených frakcií plazmy (znova rozpustenej zrazeniny po kiyoprecipitácii a iných čistiacich frakcii). Všetky pokusy boli vykonávané pri použití malého objemu vzorky vzhľadom na objem stĺpca a/alebo malú rýchlosť prietoku alebo pri kombinácii obidvoch týchto opatrení.
Filtrácia na géli ako prostriedok na frakcionáciu bielkovín je známa od roku 1959 aje široko využívaná v biochemických výskumných laboratóriách ako postup na zisťovanie vlastností bielkovín a čistenie bielkovín zo vzoriek s malým objemom, napríklad menším ako 1 liter. Až doteraz nebol tento postup používaný vo veľkom meradle na frakcionáciu plazmy alebo delenia bielkovín, jediným použitím bolo odstránenie solí z etanolu a z albumínových roztokov. Uvádza sa napríklad: Hlavným dôvodom, prečo sa nestala filtrácia na géli hlavným postupom pri frakcionácii plazmy, je nízky prietok bielkoviny v pomere k objemu stĺpca - J. H. Berglôf: Fractionation by gel filtration, str. 163 až 173 v J. M. Curling: Methods in Plasma Protein Fractionation, Academic Press, Londýn 1980.
Inde sa uvádza:
Nanešťastie je množstvo bielkoviny, ktoré je možné spracovať pomocou stĺpcov s rozumným objemom, malé a nie je možné zanedbať zriedenie vzorky. Z týchto dôvodov nie je postup príliš využívaný pri frakcionácii plazmy - J. J. Morganthaler a ďalší: PTeservation of structure and fíinction during isolation of human plasma proteins, str. 127 - 138 v Smit Sibinga a ďalší: Plasma fractionation and Blood transíusion, Martinus Nijhoff Publishers, Boston 1985.
V US patentovom spise č. 4 675 385 sa opisuje spôsob izolácie faktora VIII (protokoagulačné bielkoviny) z plazmy s obsahom faktora VIII alebo z preparátu plazmy, spôsob izolácie vysokomolekulárnych zložiek a nízkomolekulárnych zložiek postupnou vysoko účinnou chromatografiou tak, že sa v prvom stupni pripraví vo vodnom pufri roztok frakcie plazmy a nízkomolekuláme zložky sa oddelia na chromatografickom stĺpci vysokotlakovou kvapalinou chromatografiou pri použití častíc materiálu s rozmerom 13 až 35 pm. ako eluačné činidlo sa použije vodný pufer. Aby sa zaistilo dobré oddelenie, odporúča sa použitie stĺpca s pomerom dĺžky k šírke 10 až 40, čo znižuje kapacitu, ale nezaručuje dobrú izoláciu faktoru VIII od nízkomolekulárnych zložiek plazmy. Táto prvá izolácia teda nezaistí dobré oddelenie bielkovín s účinnosťou faktoru VIII:C od iných bielkovinových zložiek plazmy, toto je možné dosiahnuť iba vykonaním ďalšej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie.
Je teda zrejmé, že až doteraz je všeobecne prijímaná skutočnosť, že filtrácia na géli nie je vhodným postupom na delenie bielkovín pri frakcionácii plazmy, hlavne v prípade použitia väčších objemov, napríklad nad 5 litrov.
V súčasnosti sa neočakávane zistilo, že v prípade, že sa volí materiál na filtráciu na géli z prostriedkov, určených na rýchle prietoky, je možné izolovať faktor VIII vo forme čistej frakcie a vo veľmi vysokom výťažku priamo z plazmy veľmi šetrným mechanickým delením bez toho, aby bola potrebná zvyčajná počiatočná kryoprecipitácia.
Podstata vynálezu
Vynález sa týka spôsobu izolácie faktora VIII vo forme komplexu faktora VIII:C a vWF od iných bielkovín krvnej plazmy pri použití filtrácie na géli.
Spôsob podľa vynálezu spočíva v tom, že sa izolovaná plazma a/alebo čerstvo rozmrazená plazma podrobí filtrácii na géli za podmienok, zvyčajných na delenie do skupín pri použití veľkého zaťaženia stĺpca a vysokej rýchlosti prietoku,t.j., že objem pridanej plazmy je rovný aspoň 5 % objemu vrstvy materiálu na filtráciu na géli pri rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu, pričom gélové filtračné prostredie sa volí z častíc, inertných k faktoru Vili s frakcionačným rozmedzím 1 x 103 až l x 10^, výhodne 1 x 104 až 8 x 1 θ'3. Frakcionačné rozmedzie môže byť napríklad 5 x 104 až 4 x 10?.
Objem pridanej plazmy je podľa vynálezu aspoň 5 % objemu vrstvy v stĺpci, vo výhodnom vyhotovení je objem plazmy 15 až 40 % tohto objemu.
Spôsob podľa vynálezu sa výhodne vykonáva pri použití rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy za hodinu, obzvlášť výhodne 0,5 až 2 objemy vrstvy za hodinu.
Na účely vynálezu má mať prostriedok na filtráciu na géli rigiditu, ktorá umožni rýchlu eluáciu. Okrem toho musí byť použitý gél chemicky a imunologický inertný vzhľadom na faktor VIII v priebehu filtrácie. Pokusy ukázali, že spôsob podľa vynálezu je možné vykonávať pri použití bežne dodávaných gélov ako sú Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B, Sepharose 4FF, Sepharose 6FF, Sephacryl S-400, Sephacryl S-500, Fractogel TSK HW-65 (F) a Matrex Cellufine CGL 2000. Všetky tieto prostriedky je možné použiť na účely vynálezu. Tieto typy gélov majú zvyčajne za vlhka veľkosť častíc v rozmedzí 32 až 200 pm.
Podľa jedného vyhotovenia spôsobu podľa vynálezu sa zmrazená plazma nechá rozmraziť a zaistí sa rozpustenie všetkého množstva faktora VIII, načo sa plazma výhodne nanesie na stĺpec bezprostredne po rozpustení všetkého množstva faktora VIII. Výhodne sa nenechá teplota vystúpiť príliš vysoko, aby nedošlo k príliš veľkej degradácii faktora VIII. Plazmu je možné predbežne spracovávať napríklad pridaním heparínu, citrátu, sacharózy, aminokyselín, soli alebo iných stabilizátorov a pripadne sfiltrovať, odstrediť, zahustiť ultrafiltráciou, vopred zrážať pri použití bežných zrážacích činidiel alebo vopred spracovávať iným spôsobom pred nanesením na stĺpec, pokiaľ toto spracovanie nemá podstatný vplyv na obsah faktora VIII v plazme.
Neočakávane sa zistilo, že spôsob podľa vynálezu poskytuje veľmi vysoké výťažky faktora VIII. Je možné získať viac ako 70 % pôvodného obsahu faktora VIII v plazme, okrem toho metóda poskytuje veľmi čisté produkty so špecifickou účinnosťou 1 až 4 IU faktora VIII: C/mg bielkoviny. Túto skutočnosť je možné Čiastočne vysvetliť tým, že spôsobom podľa vynálezu je faktor VIII izolovaný tiež od proteolytických enzýmov, ktoré za zvyčajných okolností spôsobujú pokles obsahu faktora VIII:C už v skorých štádiách izolácie.
Spôsob podľa vynálezu umožňuje spracovanie veľkých objemov plazmy tak, že je možné naniesť veľké množstvo naraz pri vysokej rýchlosti prietoku pri vysokom výťažku a tiež vysokej čistote. Ide teda o veľmi účinný postup, ktorý je možné priemyselne využiť. 5
Frakcie z filtrácie na géli, ktoré obsahujú faktor VIII alebo spojené frakcie z väčšieho množstva filtráciou je potom možné koncentrovať a ďalej čistiť pri použití známych postupov ako sú ultrafiltrácia, zrážanie, iónomeničové postupy, afinitná chromatografia a podobne. 10
Zvyšné plazmatické bielkoviny ako albumín, imunoglobulíny, komplex protrombínu, antitrombín III a ďalšie je možno rovnako izolovať z ďalších frakcií filtrácie na géli pri použití známych postupov ako sú zrážanie alkoholom, zrážanie polyetylénglykolom, chromatogra- 15 fiou a podobne.
Stanovenie účinnosti faktora VIII:C je možno vykonávať ako jednostupňové alebo dvojstupňové. Je známe, že každý z týchto postupov môže poskytovať trochu odlišné výsledky v tej istej vzorke. Okrem toho je známe, že 20 pri opakovanom stanovení rovnakým spôsobom môže rovnako dôjsť k určitému rozptylu nameraných hodnôt pre účinnosť faktora VIII:C.
Pod pojmom plazma sa v priebehu prihlášky rozumie krv, z ktorej boli odstránené všetky druhy krviniek a 25 krvné doštičky napríklad odstredením.
Pod pojmom faktor VIILAg sa chápe antigén, vzťahujúci sa k faktoru VIII a vWF-Ag je zodpovedajúci antigén pre Willebrandov faktor.
Pod pojmom objem vrstvy sa chápe objem vrstvy 30 použitého gélu v naplnenom stĺpci spolu s objemom kvapalného prostredia, ktoré táto vrstva obsahuje. Prázdny objem je definovaný ako objem pufra medzi časticami gélu, eluačný objem je objem pufra, použitého na eluáciu špecifického materiálu. Pod pojmom zaťaženie stĺp- 35 ca sa chápe objem materiálu, naneseného na stĺpec, prepočítaný na objem vrstvy a uvedený v percentách. Pod pojmom fŕakcionačné rozmedzie sa chápe rozmedzie molekulových hmotností (globulámych) bielkovín alebo väčších molekúl, pre ktoré je gél odporučený výrobcom. 40
Prehľad obrázkov na výkresoch
Spôsob podľa vynálezu bude ďalej vysvetlený s pri- 45 hliadnutím k priloženým výkresom, ktoré rovnako ako príklady slúžia na objasnenie spôsobu podľa vynálezu.
Na obr. 1 je znázornený graf ktorý ilustruje eluáciu faktora VIII pri filtrácii na géli spôsobom podľa vynálezu pri stanovení rôznym spôsobom. 50
Na obr. 2 je znázornené poradie eluácie rôznych bielkovín plazmy pri filtrácii na géli spôsobom podľa vynálezu.
Príklady vyhotovenia vynálezu
Príklad 1
Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktora VIII
Stĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený prostried- 60 kom Sepharose CL-4B do výšky 60 cm.
Zmrazená plazma z dánskej krvnej banky bola rozmrazená pri teplote 25 °C vo vodnom kúpeli. Potom sa pridalo 1 IU heparínu/ml, 50 ml (16 % objemu vrstvy) plazmy bolo nanesené na stĺpec, lýchlosť prietoku bola 65 100 ml za hodinu, a potom bol stĺpec vymývaný pod tlakom množstvom 200 ml pufra za hodinu, čo zodpovedá rýchlosti 0,63 objemu vrstvy za hodinu. Dosiahnutie rovnovážneho stavu a eluácia boli vykonávané pri použití pufra (0,02 M citrát, 0,15 M NaCl, pH 7,4). K pufru bolo ďalej pridaných 2,55 ml 1 M CaC12 na liter, to znamená, koncentráciu voľných vápenatých iónov približne 7 x 10'5 M. Koncentrácia voľných vápenatých iónov bola overená použitím elektródy, selektívne citlivej na vápnik (Ingold GmbH, Frankfurt nad Mohanom, SRN). Boli odoberané frakcie a na každú frakciu bolo stanovené ODgkO· množstvo faktora VIII:C (pri použití jednostupňovej koagulácie i dvojstupňového chromogénneho stanovenia), faktor VIlkAg albumín, IgG, fibrinogén, IgM, a-2-makroglobulín, faktor IX, faktor X, bielkovina C a antitrombín III. Bielkovina, meraná pri OD2go> bola vymývaná pri prázdnom objeme (frakcia 10 až 18), potom nasledoval veľký a široký vrchol (frakcia 19 až 50, obr. 1). Dvojstupňovou chromogénnou skúškou sa zistilo 82 % faktoru VIII:C, jednostupňovou koagulačnou skúškou 91 % faktoru VIII:C, a to v jedinom vrchole spoločne s malým vrcholom pre bielkoviny. Zvyšok faktora VII bol vymytý ako malý následný vrchol bezprostredne po hlavnej frakcii (frakcie 19 až 25). Faktory VIILAg a vWF:Ag boli vymyté spoločne s faktorom VIII'.C. ale mali širšie následné vrcholy. Všetky ostatné bielkoviny plazmy, ktoré boli stanovené, boli vymyté vo frakcii, nasledujúcej po frakcii s obsahom faktora VIII spolu s veľkým a širokým vrcholom na bielkoviny, ako je znázornené na obr. 2. Plazmatické bielkoviny, ktoré boli oddelené od faktora VIII:C, mali nasledujúce molekulové hmotnosti:
| Antitrombín III | 65 000 |
| Bielkovina C | 62 000 |
| Faktor X | 59 000 |
| Faktor IX | 57 000 |
| α-2-makroglobulín | 718 000 |
| IgM | 900 000 |
| Fibrinogén | 340 000 |
| IgG | 150 000 |
| Albumín | 67 000 |
Stanovenie účinnosti faktora VIII:C pri použití dvojstupňovej chromogénnej skúšky bolo vykonané pri použití chromogénneho substrátu (KABI Coatest Factor VIII), pôvodná metóda s použitím skúmaviek bola modifikovaná tak, aby bolo možné použiť mikrotitračné platne pri nižšom množstve reakčných zložiek. Skúška sa vykonáva pri 37 °C. Použije sa vzorka s objemom 50 μΐ alebo štandard s tým istým objemom, po premiešaní so 75 pl roztoku fosfolipidu, faktora IXa, faktora X a CaC12 sa zmes inkubuje pri 37 °C na 15 minút, potom sa pridá 50 μΐ substrátu. Po ďalších 20 minútach inkubácie pri 37 °C sa reakcia zastaví pridaním 50 μΐ IM kyseliny citrónovej. Vzniknuté zafarbenie sa odpočíta pri 405 nm, kontrola pri 492 nm.
Stanovenie účinnosti faktora VIII:C jednostupňovým spôsobom sa vykonáva pri použití metódy APTT (Activated Partial Thromboplastin Tíme). 100 μΐ vzorky alebo štandardu sa napipetuje do kyvety, potom sa pridá 100 μΐ deficientnej plazmy (chudobnej na faktor VIII, Generál Diagnostic) a roztok sa uloží do termostatu pri 37 °C na 5 minút. Potom sa pridá 100 μΐ 0,03 M chloridu vápenatého a stanoví sa čas do vzniku koagulácie.
Na kvantitatívne stanovenie boli pripravené kalibračné krivky na základe zrieďovacieho radu vnútorného štandardu proti štandardu WHO (3. medzinárodný štandard F VIII, ľudská plazma, 3,9 1U/M1). Dvojstupňová skúška má približne lOx nižšiu medzu detekcie ako skúška jednostupňová. V prípade pridania heparínu je vhodné použiť dvojstupňovú skúšku vzhľadom na to, že je možné ľahko riedením vylúčiť akýkoľvek prípadný vplyv heparínu.
Faktor VIILAg bol stanovený pri použití skúšky ELISA s použitím protilátok chorého s inhibítorom faktora VIII ako povlaku na mikrotitračných platniach (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskilde, Dánsko) a pri použití fragmentov FjABjj, značených peroxidázou z toho istého chorého na stanovenie viazaného faktora VIII (Thromb. Haemost., 53 (3), 1985, 346 - 350. Štandardné krivky boli pripravené s použitím zmesí normálnej plazmy, kalibrovanej proti štandardu WHO (1. IRP, 1982).
Faktor vWF:Ag bol rovnako stanovený pri použití skúšky ELISA, ale pri použití králičej protilátky proti ľudskému vWF (DÁKO, Dánsko) ako povlaku a peroxidázou značenej králičej protilátky proti ľudskému vWF (DÁKO, Dánsko) kvôli stanoveniu viazaného vWF. Štandardné krivky sa získali pri použití tej istej normálnej plazmy ako v prípade skúšky ELISA na faktor VIILAg.
Faktor IX bol stanovený pomocou jednostupňovej koagulačnej skúšky podobným spôsobom ako faktor V11I:C s tým rozdielom, že bola použitá plazma, deficientná na faktor IX. IgG bol stanovený pomocou radiálnej imunodifúzie (Immunochemistry, 2, 1965, 235 - 254) a albumín, fibrinogén, a-2-makroglobulin, faktor X, bielkovina C a antitrombín III boli stanovené pomocou špeciálnej imunoelektroforézy (Anál. Biochem. 15, 1966, 45 - 52). Οϋ28θ bola stanovená pri použití spektrofotometra (Spectronic 601, Milron Roy Company) a bielkoviny pomocou Kjeldahlovej skúšky boli stanovené podľa Ph. Eur., 2. vydanie, I, zv. 3.5.2 bez zrážania TCA. Špecifické účinnosti čistených frakcií sa vypočítali ako pomer koncentrácie faktora VIII: C buď k C^go alebo ku koncentrácii bielkoviny Kjeldahlovou metódou. Pri použití OD28O na vypočítanie špecifickej účinnosti nie sú výsledky rôznych pokusov priamo porovnateľné vzhľadom na to, že frakcie, obsahujúce faktor VIII, sú často zakalené, ako je uvedené tiež v publikácii Ratnoff a ďalší,
J. Clin. Invest. 48, 1969, 957 - 962.
Rôzne prostriedky na filtráciu na géli sa získali od nasledujúcich firiem: Sepharose CL-6B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-2B, Sepharose 6FF, Sepharose 4FF, Sephacryl S-400 a Sephacryl S-500 boli získané od Pharmacia (Hillerod, Dánsko), Biogél, A-5m, Fine bol získaný od BioRad (Bie a Bemtsen, Rodovre, Dánsko), Fractogel TSK HW-65 (F) bol získaný od Merck (Struers, Rodovre, Dánsko) a Matrex Cellufine GCL 2000 bol získaný od Amicon (Helsingborg, Švédsko).
Príklad 2
Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktoru VIII pri použití rôznych prostriedkov na filtráciu na géli
Stĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený rôznymi prostriedkami na filtráciu na géli s rôznym rozmedzím frakcionácie a rôznou štruktúrou. Vo všetkých prípadoch bola konečná výška náplne 60 cm. Plazma bola rozmrazená rovnakým spôsobom ako v príklade 1 a bola pridaná 1 IU heparínu na ml. Pri použití každého prostriedku na filtráciu bolo na stĺpec nanesené 50 ml plazmy, t.j. 16 % vrstva. Zaťaženie stĺpca a eluácia pufrom boli vykonávané podľa príkladu 1. Prietoky boli vo všetkých prípadoch rovnaké ako v príklade 1 s výnimkou použitia prostriedku Biogel A-5m, kde bola rýchlosť prietoku znížená na 50 ml za hodinu vzhľadom na zvýšený spätný tlak. Frakcie sa zhromažďovali a na každú frakciu bola stanovená hodnota OD2gp a faktor VIII:C pri použití prostriedku Coatest. Špecifická účinnosť hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII bola vypočítaná ako pomer množstva faktora VIII:C/ml k OD23Q. Pokusy sa opakovali n-krát pri použití rôznych druhov plazmy v každom jednotlivom prípade a boli vypočítané priemerné hodnoty pre výťažky a pre špecifickú účinnosť. Hlavná frakcia s obsahom faktora VIII bola oddelená rovnakým spôsobom ako v príklade 1 a výťažok bol stanovený ako obsah faktora VIII :C v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII v percentách obsahu faktora VIII:C v spracovávanej plazme.
Frakcionačné rozmedzie a rozmery častíc na rôzne prostredie a na filtráciu na géli spolu s priemernými hodnotami pre výťažok a špecifickú účinnosť sú uvedené v tabuľke 1.
Pre jednotlivé materiály sú v tabuľke 1 použité nasledujúce skratky:
A: Sepharose C1-6B
B: Sepharose CL-4B,
C. Sepharose C1-2B D: Sepharose 6FF E: Sepharose 4FF F: Sephacryl S-500 G: Biogel A-5m Fine H: Fractogel TSK HW-65 (F) I: Matrex Cellufine GCL 2000 J: Sephacryl S-400
Tabufka I
| Prostriedok Frakcionačné | Priemer Výťažok Specif. častíc za | ||||
| pre filtráciu rozmedzie | Počet pokusov | ||||
| na géli | mol hmotnosti | % | účinnosť vlhka pm | ||
| A | 1x10*. 4x106 | 3 | 95 | 0.16 | 40-165 |
| B | 6x104-2x1Q7 | 4 | 82 | 0.88 | 40-165 |
| C | 7x10s-4x107 | 3 | 68 | 0.24 | 60-200 |
| D | 1x104-4x106 | 3 | 96 | 0.71 | 40-165 |
| E | 6x104.2x1 Q7 | 3 | 86 | 1 35 | 40-165 |
| F | 6x104-8x10? | 3 | 91 | 0.28 | 40-105 |
| G | 1x104-5x10® | 1 | 71 | 0.12 | 40- BO |
| H | 5x104.5x1ο6 | 2 | 84 | 0.18 | 32-63 |
| 1 | 1x104.3x1ο6 | 2 | 92 | 0.18 | 45-105 |
| J | 1x104-8x10® | 3 | 101 | 0.75 | 40-105 |
Príklad 3
Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktora VIII pri použití rôzneho zaťaženia stĺpca
Stĺpec s priemerom 2,6 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4FF do konečnej výšky vrstvy 60 cm. Plazma bola rozmrazená spôsobom podľa príkladu 1. Po rozmrazení bolo pH plazmy upravené na 7,0 pridaním 0,5 M HC1, bola pridaná 1 IU heparínu na ml a plazma bola sfiltrovaná cez filter s priemerom otvorov 10 p m z nylonu. Na stĺpec bolo nanesených 30, 40, 50, 60 a 70 ml plazmy. Použili sa podmienky z príkladu 1 s tým rozdielom, že pH pufra bolo upravené na 7,0. Odoberali sa frakcie a na každú frakciu bolo stanovené OIUgQ a množstvo faktora VIII:C (Coatest). Špecifická účinnosť faktora VIII v hlavnej frakcii bola stanovená ako pomer faktora VIII:C/ml k hodnote OD^gp. Pokusy boli trikrát zopakované pri použití troch rôznych vzoriek plazmy.
pre každé zaťaženie a vypočítali sa priemerné hodnoty (x). Objem hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII v ml je ten objem uvedenej frakcie, ktorý je možné odobrať pred 5 vymytím širokého hlavného vrcholu na bielkoviny (Οϋ28θ), táto frakcia sa odoberá rovnakým spôsobom ako v príklade 1. Výťažok sa stanoví ako obsah faktora VIILC v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII a uvádza sa v percentách obsahu faktora VIILC v spracovávanej 10 plazme.
Takto získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke II
Tabuľka II
| Množstvo plazmy | i. pokusu a priemer | Hl. frakcia | |||
| v ml | v% vrstvy | faktoru Vlll-ml | Výťažok % | Špecifická účinnosť | |
| 30 | 9.4 | 1 | 70 | 88 | 0,81 |
| 2 | 70 | 95 | 0.18 | ||
| 3 | 70 | 90 | 0.63 | ||
| x | 70 | 91 | 0.54 | ||
| 40 | 12.6 | 1 | 70 | 76 | 0.68 |
| 2 | 70 | 85 | 0.17 | ||
| 3 | 70 | 93 | 0.61 | ||
| x | 70 | 85 | C.49 | ||
| 50 | 15.7 | 1 | 80 | 91 | 0.57 |
| 2 | 80 | 90 | 0.20 | ||
| 3 | 80 | 85 | 0.53 | ||
| x | 80 | 89 | 0.43 | ||
| 60 | 18.8 | 1 | 80 | 79 | 0.81 |
| 2 | 80 | 85 | 0.16 | ||
| 3 | 90 | 95 | 0.61 | ||
| x | 83 | 86 | 0.53 | ||
| 70 | 22.0 | 1 | 80 | 85 | 082 |
| 2 | 100 | 90 | 0.21 | ||
| 3 | 100 | 93 | 0.53 | ||
| « | 93 | 89 | 0.52 |
Príklad 4
Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktoru VII pri použití rôznej rýchlosti eluácie
Na ten istý stĺpec ako v príklade 3, bolo nanesených 50 ml plazmy, rozmrazenej rovnakým spôsobom. Po rozmrazení bolo pH plazmy upravené na 7,0 pri použití 0,5 M HC1, bola pridaná 1 IU heparínu/ml a plazma bola sfiltrovaná cez nylonový filter s priemerom otvorov 10 gm. Pri použití troch rôznych vzoriek plazmy sa použila rýchlosť prietokov 100, 200 a 300 ml/h. Tá istá rýchlosť bola použitá tak v priebehu pridávania plazmy, ako pri následnej eluácii. Eluácia bola vykonáva pri použití toho istého pufra ako v príklade 3. Odoberali sa frakcie a na každú frakciu bola stanovená hodnota OĽ^gQ a množstvo faktora VIII (Coatest). Špecifická účinnosť a výťažok hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII boli vypočítané rovnakým spôsobom ako v príklade 3. Boli vypočítané tiež priemerné hodnoty (x) pre objem hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII, výťažok a špecifickú účinnosť. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke III.
Tabuľka III
| rýchlosť prietoku | Vzorka | ||||
| v ml/h | vpodieíi vrstvy/h | plazmy č. | Hl. frakcia f. Vlll-ml | Výťažok % | Špecifická účinnosť |
| 100 | 0.31 | 1 | 80 | 89 | 0.75 |
| 2 | 80 | 88 | 0.17 | ||
| 3 | 80 | 80 | 0.65 | ||
| x | 80 | 86 | 0.52 | ||
| 200 | 0.63 | 1 | 80 | 84 | 0.99 |
| 2 | 80 | 88 | 0.18 | ||
| 3 | BO | B9 | 0.79 | ||
| x | 80 | 87 | 0.65 | ||
| 300 | 0.94 | 1 | 70 | 65 | 0.72 |
| 2 | 80 | 96 | 0.18 | ||
| 3 | 80 | 83 | 0.44 | ||
| X | 77 | 88 | 0.45 |
Príklad 5
Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktoru VIII pri použití rôzneho zaťaženia stĺpca
Stĺpec s priemerom 10 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4FF do konečnej výšky náplne 60 cm. Zmrazená plazma z dánskej krvnej banky bola rozmrazená pri teplote 30 °C na vodnom kúpeli. Na stĺpec bolo nanesených 925, 1 497 a 2 000 g plazmy. Prietok bol udržiavaný na hodnote 4 200 ml/h v priebehu pridávania plazmy i eluácie pri použití čerpadla Masterflex (Buch & Holm, Herlev. Dánsko), rýchlosť prietoku bola 0,89 objemu vrstvy za hodinu. Na eluáciu bol použitý ten istý pufer ako v príklade 1. 0D2g(j bola kontinuálne zaznamenávaná pri použití Pharmacia Monitor UV-1. Len čo došlo k stúpaniu hodnoty OD2gQ, začala sa odoberať hlavná frakcia s obsahom faktora VIII. Odoberanie tejto frakcie bolo skončené v okamihu, kedy z hodnoty OD28Q bolo zrejmé, že začína dochádzať k eluácii hlavného širokého vrcholu pre bielkoviny. V hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII bol stanovený obsah faktora VIII:C pri použití jednostupňového koagulačného postupu, obsah bielkovín bol stanovený podľa Kjeldahla. Špecifická účinnosť bola vypočítaná ako pomer celkového počtu jednotiek faktora VIILC v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII k celkovému počtu mg bielkoviny v hlavnej frakcii s obsahom VIII. Výťažok faktora VIII:C bol vypočítaný ako obsah faktora VIILC v hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII v percentách obsahu faktora VIII:C v spracovávanej plazme.
Výsledky týchto pokusov sú uvedené v nasledujúcej tabuľke IV.
Tabuľka IV
| Množstvo nanesenej plazmy v g v % objemu vrstvy | Hl. frakcia f. VIII v g | Výťažok % | Špecifická účinnosť IU/mg |
| 925 19.6 | 1 192 | 74 | 2.50 |
| 1 497 31.8 | 1 850 | 73 | 2.24 |
| 2 000 42.2 | 2 220 | 81 | 1.08 |
Príklad 6
Filtrácia plazmy na géli pre izoláciu faktoru VIII pri použití stĺpca priemyselných rozmerov
Stĺpec s priemerom 29 cm bol naplnený prostriedkom Sepharose 4FF. Po dosiahnutí rovnovážneho stavu pri použití toho istého pufra ako v príklade 1, bola výška vrstvy gélu 53 cm. 10 kg zmrazenej plazmy z dánskej krvnej banky bolo rozmrazené a zahriate na 30 °C a potom nanesené na stĺpec. Nanesené množstvo predstavovalo 28,8 % objemu vrstvy. Pri použití čerpadla Masterflcx bol udržiavaný prietok 30 litrov/h, čo zodpovedá 0,86 objemu vrstvy za hodinu, a to v priebehu pridávania plazmy i v priebehu eluácie, ktorá bola vykonávaná pufrom, použitým na dosiahnutie rovnovážneho stavu. Hodnota OD28q bola kontinuálne sledovaná pri použití prístroja Pharmacia Monitor UV-1 kontinuálnym spôsobom, a len čo došlo k prvým známkam stúpania Οθ280’ začala sa odoberať hlavná frakcia s obsahom faktora VIII. Získalo sa celkom 11,73 kg hlavnej frakcie s obsahom faktora VIII. Obsah faktora VIII:C bol stanovený pomocou jednostupňového koagulačného postupu, bielkovina bola stanovená podľa Kjeldahla. V hlavnej frakcii s obsahom faktora VIII sa zistilo celkom 8 798 IU faktora VIII:C a menej ako 2 346 mg bielkoviny, výťažok faktora VIII:C je teda 880 HJ/kg plazmy, čo zodpovedá výťažku 88 % vo forme produktu so špecifickou účinnosťou vyššou ako 3,75 IU/mg bielkoviny.
Takto získaný faktor VIII v hlavnej frakcii je možné ďalej čistiť spôsobom, analogickým zvyčajnému čisteniu znova rozpusteného kryoprecipitátu, napríklad ďalším chromatografickým čistením a lyofilizáciou pri použití bežných prostriedkov za získania stáleho prostriedku. Tento prostriedok sa pred použitím rekonštituuje vo vhodnom bežnom nosiči.
Claims (5)
1. Spôsob izolácie faktora VIII od iných bielkovín krvnej plazmy s použitím filtrácie na géli, vyznačujúci sa tým, že objem pridanej plazmy je rovný aspoň 5 % objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli pri rýchlosti prietoku aspoň 0,3 objemu vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu, pričom sa ako prostriedok pre filtráciu použije materiál s časticami, inertnými proti faktoru VIII s frakcionačným rozmedzím 1 x 1(P až 1 x 10^.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že prostriedkom pre filtráciu na géli je materiál s frakcionačným rozmedzím od 1 x 10^ do 8 x 10^.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že prostriedkom pre filtráciu na géli je materiál s frakcionačným rozmedzím od 5 x 10^ do 4 x 1θ7
4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že objem plazmy, nanesenej na stĺpec, sa rovná 15 až 40 % obj. vrstvy materiálu pre filtráciu na géli.
5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že rýchlosť prietoku sa pohybuje v rozmedzí 0,5 až 2 objemy vrstvy materiálu pre filtráciu na géli za hodinu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK562189A DK162233C (da) | 1989-11-09 | 1989-11-09 | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK537190A3 SK537190A3 (en) | 1997-12-10 |
| SK278640B6 true SK278640B6 (en) | 1997-12-10 |
Family
ID=8144000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK5371-90A SK278640B6 (en) | 1989-11-09 | 1990-11-01 | Method of the factor viii isolation |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245014A (sk) |
| EP (1) | EP0524172B1 (sk) |
| JP (1) | JP2509407B2 (sk) |
| CN (1) | CN1044121C (sk) |
| AT (1) | ATE118508T1 (sk) |
| AU (1) | AU631471B2 (sk) |
| BG (1) | BG61231B1 (sk) |
| CA (1) | CA2073012C (sk) |
| CZ (1) | CZ537190A3 (sk) |
| DE (1) | DE69017050T2 (sk) |
| DK (1) | DK162233C (sk) |
| ES (1) | ES2068404T3 (sk) |
| FI (1) | FI103510B (sk) |
| HU (1) | HU214905B (sk) |
| IE (1) | IE66836B1 (sk) |
| IL (1) | IL96277A (sk) |
| NO (1) | NO180741C (sk) |
| NZ (1) | NZ236004A (sk) |
| PL (1) | PL164894B1 (sk) |
| PT (1) | PT95830B (sk) |
| RU (1) | RU2055593C1 (sk) |
| SK (1) | SK278640B6 (sk) |
| UA (1) | UA29421C2 (sk) |
| WO (1) | WO1991007438A1 (sk) |
| YU (1) | YU47524B (sk) |
| ZA (1) | ZA908599B (sk) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
| US5888974A (en) * | 1992-04-07 | 1999-03-30 | Emory University | Hybrid human/animal factor VIII |
| US5859204A (en) * | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6180371B1 (en) | 1996-06-26 | 2001-01-30 | Emory University | Modified factor VIII |
| US5659017A (en) * | 1995-11-07 | 1997-08-19 | Alpha Therapeutic Corporation | Anion exchange process for the purification of Factor VIII |
| US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
| US6531577B1 (en) * | 1997-12-15 | 2003-03-11 | Hemasure Denmark A/S | von Willebrand factor (vWF)-containing preparation, process for preparing vWF-containing preparations, and use of such preparations |
| US6290527B1 (en) * | 1998-07-03 | 2001-09-18 | Nippon Telegraph And Telephone Corp. | Nippon telegraph and telephone corporation |
| CZ300547B6 (cs) | 1999-02-22 | 2009-06-10 | University Of Connecticut | Nové formulace faktoru VIII prosté albuminu |
| JP2002348300A (ja) * | 1999-04-12 | 2002-12-04 | Fujimori Kogyo Co Ltd | 血液凝固第ｖｉｉｉ因子および血液凝固第ｖｉｉｉ因子／フォン・ビルブラント因子複合体の精製方法 |
| AUPR638801A0 (en) * | 2001-07-13 | 2001-08-09 | Life Therapeutics Limited | Factor viii separation |
| EP1750733B1 (en) | 2004-05-03 | 2013-12-11 | Emory University | METHOD OF ADMINISTERING PORCINE B-DOMAINLESS fVIII |
| WO2006021584A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Novo Nordisk Health Care Ag | Purification of factor xiii polypeptides from biological materials |
| US20060226086A1 (en) * | 2005-04-08 | 2006-10-12 | Robinson Thomas C | Centrifuge for blood processing systems |
| WO2010054238A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-05-14 | Baxter International Inc. | Factor viii formulations |
| DK3133157T3 (da) * | 2010-03-30 | 2019-08-12 | Octapharma Ag | Fremgangsmåde til oprensning af vitamin k-afhængige proteiner |
| RU2445974C2 (ru) * | 2010-04-26 | 2012-03-27 | Учреждение Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр ГНЦ РАМН | Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека |
| AU2011323236B2 (en) | 2010-11-05 | 2017-03-30 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | A new variant of antihemophilic factor VIII having increased specific activity |
| US9488625B2 (en) | 2010-12-15 | 2016-11-08 | Baxalta GmbH | Purification of factor VIII using a conductivity gradient |
| CN103506080A (zh) * | 2012-06-19 | 2014-01-15 | 汪志友 | 一种用于分离纯化凝血因子viii的介质及其制备方法 |
| JP6284481B2 (ja) | 2012-09-28 | 2018-02-28 | 中外製薬株式会社 | 血液凝固反応の評価方法 |
| US9663553B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-05-30 | Hemarus Therapeutics Limited | Integrated process for the production of therapeutics (human albumin, immunoglobulins, clotting factor VIII and clotting factor IX) from human plasma |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4495175A (en) * | 1982-08-05 | 1985-01-22 | University Of Rochester | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
| US4543210A (en) * | 1984-10-04 | 1985-09-24 | Miles Laboratories, Inc. | Process for producing a high purity antihemophilic factor concentrate |
| DK525384D0 (da) * | 1984-11-05 | 1984-11-05 | Nordisk Insulinlab | Praeparat paa basis af faktor viii til behandling af haemofili a inhibitorpatienter samt fremgangsmaade til fremstilling af et saadan praeparat |
| US4847362A (en) * | 1985-02-01 | 1989-07-11 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4675385A (en) * | 1985-03-27 | 1987-06-23 | Alpha Therapeutic Corporation | Isolation of human plasma procoagulant protein factor VIII from biological factors |
| US4758657A (en) * | 1985-07-11 | 1988-07-19 | Armour Pharmaceutical Company | Method of purifying Factor VIII:C |
| AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
| EP0321835B1 (en) * | 1987-12-21 | 1994-09-28 | Miles Inc. | Gel filteration of factor VIII |
| WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
| ES2042138T3 (es) * | 1989-05-24 | 1993-12-01 | Miles Inc. | Filtracion en gel del factor viii tratado termicamente. |
-
1989
- 1989-11-09 DK DK562189A patent/DK162233C/da not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-10-26 ZA ZA908599A patent/ZA908599B/xx unknown
- 1990-11-01 SK SK5371-90A patent/SK278640B6/sk unknown
- 1990-11-01 CZ CS905371A patent/CZ537190A3/cs unknown
- 1990-11-05 ES ES90917201T patent/ES2068404T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 JP JP3500067A patent/JP2509407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 AT AT90917201T patent/ATE118508T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-05 RU SU905052211A patent/RU2055593C1/ru active
- 1990-11-05 UA UA94020494A patent/UA29421C2/uk unknown
- 1990-11-05 DE DE69017050T patent/DE69017050T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-05 AU AU67470/90A patent/AU631471B2/en not_active Ceased
- 1990-11-05 EP EP90917201A patent/EP0524172B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 WO PCT/DK1990/000279 patent/WO1991007438A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-05 CA CA002073012A patent/CA2073012C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-05 HU HU9201551A patent/HU214905B/hu unknown
- 1990-11-07 NZ NZ236004A patent/NZ236004A/xx unknown
- 1990-11-07 YU YU210590A patent/YU47524B/sh unknown
- 1990-11-07 US US07/610,480 patent/US5245014A/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-08 IL IL9627790A patent/IL96277A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 PT PT95830A patent/PT95830B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-11-08 IE IE402290A patent/IE66836B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-11-09 CN CN90109030A patent/CN1044121C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-09 PL PL90287703A patent/PL164894B1/pl unknown
-
1992
- 1992-05-08 FI FI922105A patent/FI103510B/fi active
- 1992-05-08 NO NO921839A patent/NO180741C/no not_active IP Right Cessation
- 1992-05-08 BG BG96316A patent/BG61231B1/bg unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK278640B6 (en) | Method of the factor viii isolation | |
| US7498146B2 (en) | Stable factor VIII/von willebrand factor complex | |
| US5288853A (en) | Factor viii purification process | |
| EP0411810B1 (en) | Factor VIII complex purification using heparin affinity chromatography | |
| JP3110292B2 (ja) | フォンウィルブランド因子の高分子および低分子フラクション | |
| US6465624B1 (en) | Purification of von-Willebrand factor by cation exchanger chromatography | |
| SK279533B6 (sk) | Spôsob prípravy štandardizovaného vysoko čistého k | |
| US7888476B2 (en) | Process for the preparation of a von Willebrand (FvW) factor concentrate by chromatography and a FvW concentrate thus obtainable | |
| JP4250769B2 (ja) | 高度に精製されたｖＷＦまたは因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を得る方法 | |
| JPS6160614A (ja) | 第８因子製剤およびその製造方法 | |
| CN116322920A (zh) | 使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii | |
| US20020019036A1 (en) | Von willebrand factor derivatives and methods of isolating proteins that bind to von willebrand factor | |
| Brodniewicz-Proba et al. | Modified glycine precipitation technique for the preparation of factor VIII concentrate of high purity and high stability | |
| HRP930277A2 (en) | A method for isolating biologically active compounds | |
| Welbergen et al. | Purified Factor VIII: A high yield production method for routine Blood Banks |