SI20026A

SI20026A - Heptapeptidni analogi - antagonisti oksitocina

Info

Publication number: SI20026A
Application number: SI9720076A
Authority: SI
Inventors: Per Melin; Anders Nilsson; Jerzy Trojnar; Carl-Johan Aurell; Pierre Riviere; Robert Haigh
Original assignee: Ferring B.V.
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2000-02-29
Also published as: NO992532D0; LT4650B; NO321380B1; ZA9710518B; CZ183299A3; RO120772B1; ATE242264T1; CZ299532B6; PT938496E; AU5142998A; HU228568B1; HUP0000577A3; SK283800B6; BR9713366B1; CN1129606C; HK1022481A1; CN1238781A; IL129519A0; RU2180668C2; JP2000507617A

Abstract

Heptapeptidni analogi ali njihove farmacevtsko sprejemljive soli, ki obstajajo iz heksapeptidnega dela S in C-terminalnega beta-aminoalkoholnega ostanka Z, vezanega na del S z amidno vezjo, pri čemer beta-aminoalkohol Z je -NR-CH(Q)-CH2OH, Q je (CH2)n-NH-A, n je 1-6 in A je H ali -C(=NH)NH2 ter R je CH3 ali C2H5, in je del S, kjer je X D-aromatska-a-aminokislina ter je Y alifatska a-aminokislina, in imajo oksitocin-antagonistično učinkovitost. Opisan je tudi postopek za njihovo sintezo, farmacevtski sestavki, ki vsebujejo te analoge, sinteza takih sestavkov ter metoda za kontrolo kontrakcij uterusa.ŕ

Description

Heptapeptidni analogi - antagonisti oksitocina

Področje izuma

Predmetni izum se nanaša na nove heptapeptidne analoge (to je heptapeptide, v katerih je N-terminalni ostanek deaminiran in C-terminus reduciran v alkohol), ki kažejo oksitocinantagonistično učinkovitost, ter so med drugim koristni za zmanjšanje ali blokiranje kontrakcije mišic uterusa, ki je v zvezi s prezgodnjimi porodnimi popadki in menstruacijskimi bolečinami. Izum se nanaša tudi na farmacevtske sestavke, ki vsebujejo te peptidne analoge, in na njihovo uporabo.

Ozadje izuma

Oksitocin je peptidni hormon. Stimulira kontrakcijo mišic uterusa. Zato menijo, da je povezan z etiologijo prezgodnjih porodnih popadkov in menstruacijske bolečine. Nadalje menijo, da bi oksitocin antagonisti mogli biti koristni pri kontroli teh stanj. Znani so peptidi, ki so oksitocin-antagonisti z zadostno jakostjo in selektivnostjo za terapevtske namene. Pogosto so namenjeni za dajanje v vodni raztopini. Proizvodnja takih doz tovrstnih antagonistov, ki so pripravljeni za uporabo, terja stabilnost raztopin v daljših obdobjih, kar pa ni vedno res. Za take primere je potrebno pripraviti zdravilo neposredno pred uporabo, npr. iz liofiliziranega peptida ali njegove farmacevtsko sprejemljive soli. Tovrstno rokovanje je neprikladno in pogojuje tveganje kontaminacije.

Nameni izuma

Namen predmetnega izuma je, da nudi nove oksitocin-antagoniste, ki so heptapeptidni analogi z izboljšano stabilnostjo v vodnih medijih, pri čemer ohranijo zadostno jakost in selektivnost za terapevtsko učinkovitost.

Nadaljnji namen izuma je, da nudi farmacevtske sestavke, ki vsebujejo navedene nove heptapeptidne analoge, ki so oksitocin-antagonisti z izboljšano stabilnostjo in zato daljšim skladiščnim časom.

Nadaljnji namen izuma je, da nudi metodo za zdravljenje zdravstvenega stanja, ki je v zvezi s prekomerno ali neprimerno kontrakcijo uterusa, pri čemer je ta metoda dajanje farmacevtskega sestavka, ki vsebuje navedeni heptapeptidni analog.

Povzetek izuma

Predmetni izum obsega razred spojin, ki so heptapeptidni analogi, farmacevtske sestavke, ki vsebujejo take analoge, in metodo za uporabo teh sestavkov, katera je zdravljenje kontrakcij uterusa, zlasti v zvezi s prezgodnjimi porodnimi popadki in menstruacijsko bolečino.

Heptapeptidni analogi po predmetnem izumu imajo N-terminalni heksapeptidni del S ter C-terminalni β-aminoalkohol Z, ki ga v nadaljevanju smatramo kot formalni ekvivalent sedme aminokisline heptapeptida. Del S ima strukturo:

Mpa-X-Ile-Y-Asn-Abu- S v kateri imajo Mpa, Ile, Asn in Abu naslednje pomene:

Mpa ostanek 3-merkaptopropionske kisline (sicer imenovan dezaminocistein) lle ostanek izolevcina

Asn ostanek asparagina

Abu ostanek α-amino maslene kisline;

in kjer je X aromatska D-a-amino kislina ter je Y alifatska α-amino kislina.

Aminoalkohol Z ima strukturo:

Q

I

-n-ch-ch₂-oh z

I

R v kateri

R je metil ali etil in

Q je -(CH₂)n-NH-A, kjer je n število 1-6 in A stoji za H ali -C(=NH)NH2.

Spojine po predmetnem izumu lahko tvorijo kislinske adicijske soli in v kolikor so te soli farmacevtsko sprejemljive, so vključene v obseg predmetnega izuma.

Spojine lahko vdelamo bodisi v trdne ali tekoče formulacije. Primeri za take formulacije vključujejo tablete, kapsule, raztopine in suspenzije. Druge komponente takih formulacij lahko vključujejo na primer razredčila, dispergatorje, konzervanse, pufrska sredstva, arome ter sredstva za regulacijo osmotskega tlaka. Trdne formulacije so posebno prikladne za oralno dajanje, medtem ko so raztopine najbolj koristne za injiciranje (i.v., i.m. ali 5. c.) ali za intranazalno dajanje. Posebna zasluga spojin po predmetnem izumu je v tem, da so njihove raztopine stabilnejše pri dolgotrajnem skladiščenju od tistih, narejenih iz že znanih spojin s primerljivo močjo.

Formulirani farmacevtik je koristen za kontrolo kontrakcij uterusa. Dve indikaciji, pri katerih bo verjetno potrebna taka kontrola, sta predčasni porodni popadki in menstruacijska bolečina. Kadar jih uporabimo pri kontroli predčasnih porodnih popadkov, lahko uporabimo farmacevtike kot akutna tokolitična sredstva po pričetku porodnih popadkov in kot vzdrževalno terapijo za preprečitev ponovnega pojava takih epizod.

Podroben opis izuma

V skladu s predmetnim izumom opisujemo heptapeptidne analoge, ki kažejo terapevtsko koristno oksitocin-antagonistično aktivnost ter imajo izboljšano stabilnost v vodnih medijih.

Heptapeptidni analogi po predmetnem izumu so značilni po strukturi, ki obsega S del N-terminalnega heksapeptidnega analoga ter Z del C-terminalnega β-aminoalkohola. Struktura β-aminoalkohola Z je :

-nr-ch-ch₂oh (Z) v kateri Q stoji za -(CH₂)_n-NH-A, n je 1-6 in A je H ali -C(=NH)NH2, in kjer R stoji za CH₃ ali C2H5; in del S je:

Mpa-X-Ile-Y-Asn-Abu- (S) kjer imajo Mpa, Ile, Asn in Abu naslednje pomene:

Mpa ostanek 3-merkaptopropionske kisline (sicer imenovan dezaminocistein)

Mpa

Ile ostanek izolevcina

Asn

Abu ostanek asparagina ostanek α-aminomaslene kisline;

in kjer je D-aromatska α-aminokislina; in je alifatska a-aminokislina.

X

Z aromatsko α-aminokislino mislimo α-aminokislino, v kateri stranska veriga vključuje aromatski obročni sistem. Tak sistem je lahko karbocikličen ali heterocikličen, monocikličen ali kondenziran. Primeri za aromatske α-aminokisline vključujejo (niso pa omejene na) fenilalanin, tirozin, (<?-etil)tirozin, triptofan, P-(2-naftil)alanin in fenilglicin. Upoštevati je treba, da je ostanek X v spojinah predmetnega izuma v nenaravni Dkonfiguraciji.

Z alifatsko α-aminokislino mislimo α-aminokislino, kjer ima stranska veriga samo atome ogljika in vodika. Take stranske verige bodo vključevale alkilne in cikloalkilne skupine. Lahko so nenasičene, vendar pa naj ne vključujejo aromatskih ostankov. Vključene so stranske verige z 1 do 12 atomi ogljika, čeprav je prednostno območje s 3 do 7 atomi ogljika. Primeri za alifatske α-aminokisline vključujejo (vendar niso omejene na) alanin, valin, levcin, cikloheksilglicin in adamantil alanin.

Ostanek Y ima naravno L-konfiguracijo.

V strukturi dela S heksapeptidnega analoga ima črta, ki združuje ostanka Mpa in Abu, svoj običajni pomen. To pomeni, da gre za kovalentno vez, ki veže konca stranskih verig obeh ostankov. V tem primeru je atom žvepla v Mpa ostanku vezan s kovalentno vezjo na γ- (ali 4-) atom ogljika v ostanku Abu.

Del Z aminoalkohola vključuje stereogen center in tako lahko obstaja v dveh epimemih oblikah, to je R in S, kar ustreza D in L izomeroma sorodnih aminokislin. Heptapeptidni analogi vsakega izmed teh izomerov so vključeni v obseg izuma, prav tako tudi zmesi epimerov. Prednostno je aminoalkoholni del prisoten kot en sam epimer in ima prednostno S konfiguracijo.

V kontekstu predmetnega izuma smatramo Mpa ostanek in aminoalkohol Z kot formalna ekvivalenta α-aminokislin ter ustrezno poimenujemo spojine predmetnega izuma kot heptapeptidni analogi.

Pri prednostni izvedbi predmetnega izuma je X bodisi D-triptofanski ostanek ali β-(2naftil)-D-alaninski ostanek.

Pri nadaljnji prednostni izvedbi izuma je Y ostanek valina, levcina, izolevcina, aloizolevcina, cikloheksilalanina in (p,p-dietil)alanina.

Pri nadaljnji prednostni izvedbi izuma je n v območju 2-4.

Pri bolj prednostni izvedbi izuma je X bodisi D-triptofanski ostanek ali P-(2-naftil)-Dalaninski ostanek in Y je ostanek valina, levcina, izolevcina, aloizolevcina, cikloheksilalanina in (p,P-dietil)alanina.

Posebno prednostna izvedba izuma je peptidni analog, izbran izmed:

Mjo a - D- T rp-11 e - a 1 o 11 e-Asn-Abu-N-CH- CH₂OH

CH₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mya-D-Trp-Ile-al.oIle-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

CH₃ ch₂ch₂ch₂ch₂nh₂

Mjoa-D-Trp-Ile-al oIle-Asn-Abu-N-CH- CH₂OH ch₃ ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-aloIle-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ¹--¹ I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh-c=nh

Ί nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Ala(3, 3- dietil ) -Asn-Abu-N——CH-CH₂OH ¹-·-¹ I ' I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

M^a-D-Nal-Ile~alolle -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Na 1 -11 e-Ala (3, 3- dietil .) -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ¹-¹ I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Ile-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

I___I

CH₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Leu-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

I-1 | |

CHi CHaCHjC^NHz

Mpa-D-Trp-Ile-Val-Asn-Abu-N——CH-CH₂OH ¹--J I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Cha-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ¹-' I I

CH₃ CH₂CH₂CH₂NH₂ kjer smo uporabili še

D-Trp

Alolle

Ala(3,3-dietil)

D-Nal

Leu

Val

Cha naslednje okrajšave: ostanek D-triptofana ostanek aloizolevcina ostanek (p,p-dietil)alanina ostanek p-(2-naftil)-D-alanina ostanek levcina ostanek valina ostanek β-cikloheksilalanina.

Najbolj prednostna izvedba izuma je peptidni analog:

-CH-CH₂OH

CH₂CH₂CH₂NH₂.

Spojine predmetnega izuma vsebujejo bazičen položaj oz. mesto (aminsko ali gvanidinsko) in tako lahko tvorijo soli s kislinami, pri čemer te soli ohranijo farmakološke lastnosti prostih baz. Zato so take soli vključene v obseg predmetnega izuma. Primeri za take soli vključujejo, vendar niso omejeni na hidroklorid, hidrobromid, sulfat, acetat, citrat, benzoat, trifluoroacetat in metansulfanat.

V predmetnem izumu so opisani in vključeni tudi farmacevtski sestavki, ki obsegajo farmakološko učinkovito množino najmanj enega izmed zgoraj opisanih heptapeptidnih analogov, ki so antagonisti oksitocina. Sestavek lahko vključuje tudi farmacevtsko sprejemljive dodatke, kot so konzervansi, razredčila, dispergima sredstva, sredstva za pospešitev absorpcije v mukozi (sluznici) (primeri za le-te so opisani v Merkus, F. W. H. M. et al., J. Controlled Release 24, 201-208, 1993, in ki vključujejo površinsko aktivna sredstva, žolčne kisline, fuzidate, fosfolipide in ciklodekstrine), pufrska sredstva in arome. Tovrstne sestavke lahko formuliramo kot trdne snovi (npr. kot tablete, kapsule ali praške), ali kot tekočine (npr. kot raztopine ali suspenzije), ki naj vključujejo kreme in mazila, namenjene za oralno ali parenteralno dajanje. Primerni načini doziranja so lahko oralno (vključno sublingualno in bukalno), intranazalno, pulmonamo, transdermalno, rektalno, vaginalno, subkutano, intramuskulamo in intravenozno.

Prednosten sestavek po predmetnem izumu je sterilna vodna raztopina heptapeptidnega analoga kot je opisano, zlasti pa izotonična solna raztopina, primerna za intranazalno dajanje ali intravenozno injiciranje. Raztopina lahko vsebuje puffsko sredstvo za vzdrževanje pH raztopine v območju 3.0-7.0, prednostno v območju 3.5-5.5. Pufer je npr. fosfatno/citratni pufer.

Nadaljnji prednostni sestavek po predmetnem izumu je tableta za oralno dajanje. Posebno prednostna je tableta, ki je preslojena s snovjo, katera je pretežno netopna pri nizkem pH, ki je prisoten v želodcu, pač pa se raztaplja v bolj nevtralnem pH tankega črevesa, da sprošča peptidni analog za absorpcijo. Primeri za take prevleke so opisani v PCT/SE94/00244 in v PCT/SE95/00249, ki jih vključujemo kot referenco v predmetni opis.

Predmetni izum nadalje prikazuje metodo za zmanjšanje ali ustavitev nezaželenih kontrakcij mišic uterusa. Ta metoda je dajanje pacientu učinkovite množine enega izmed heptapeptidnih analogov po predmetnem izumu, ki je oksitocin-antagonist, prednostno formuliranega kot zgoraj opisani sestavek. Iz opisa predmetnega izuma bo razvidno, da izum opisuje tudi uporabo spojin in formulacij po predmetnem izumu.

Posebno prednostna izvedba izuma je postopek za ustavitev kontrakcij uterusa pri prezgodnjih porodnih popadkih. Po začetni intervenciji, ki bo terjala eno- do tri-dnevno obdobje, lahko nadaljujemo z zdravljenjem, da preprečimo ponoven pojav porodnih popadkov, dokler se lečečemu zdravniku to ne zdi primemo. Torej obstajata dva vidika izvedbe in sicer akutna tokolitična uporaba in vzdrževalna terapevtska uporaba.

Nadaljnja prednostna izvedba izuma je postopek za zmanjšanje bolečih kontrakcij uterusa povezanih z menstruacijo.

Množina heptapeptidnega analoga, ki tvori terapevtsko učinkovito dozo, bo odvisna od številnih faktorjev. Način dajanja bo pomemben pri presoji. Intravenozna injekcija bo verjetno naj učinkovitejši način dajanja, medtem ko bo intranazalno dajanje po pričakovanju verjetno učinkovitejše od oralnega doziranja. Torej bo za eno samo intravenozno dozo potrebno manj spojine, kot za eno samo intranazalno dozo, več spojine pa bo potrebno za eno samo oralno dozo. Lečeči zdravnik bo moral upoštevati tudi faktoije, kot so, starost, teža in zdravstveno stanje pacienta. Kontrola oz. ublažitev menstruacijske bolečine bo veijetno terjala manj spojine od prezgodnjih porodnih popadkov.

Množina spojine, ki tvori eno samo učinkovito dozo za intravenozno zdravljenje povprečne ženske pri prezgodnjih porodnih popadkih, je od okoli 0.1 mg do okoli 500 mg, prednostno od okoli 1 mg do okoli 200 mg, v obdobju 24 ur.

Heptapeptidni analogi po predmetnem izumu selektivno inhibirajo kontrakcije mišic uterusa, pri tem pa nimajo nezaželenih lastnosti oksitocin-agonistov. Imajo tudi malo ali sploh nič antidiuretičnih, hipotenzivnih ali hipertenzivnih učinkov, ki bi bili lahko stranski učinki analogov oksitocina in sorodnega hormona vazopresina. Po jakosti so primerljivi s tistimi spojinami, znanimi v stroki, katerim so strukturno najbolj podobne. Od teh spojin, ki so prikazane v W095/02609, se razlikujejo po naravi C-terminalnega ostanka. Znane spojine imajo karboksamidno funkcijo (-CONH2), medtem ko imajo spojine po predmetnem izumu primarni alkohol (-ΟΗ₂ΟΗ). Spojine po predmetnem izumu prekašajo tiste iz W095/02609 z ozirom na njihovo stabilnost, zlasti v vodnih medijih. To je jasna prednost, kadar je treba spojino formulirati kot vodno raztopino, ki bo imela posledično daljšo skladiščno dobo in manj stroge zahteve glede hlajenja, poleg tega pa bo imela prednost pri postopkih proizvodnje in formuliranja, ki vključujeta časovna obdobja, v katerih je spojina v raztopini, celo takrat, kadar je končni sestavek trdna snov.

Čeprav smo zgoraj poudarili, da so spojine po predmetnem izumu posebno koristne pri kontroli kontrakcij mišic uterusa, pa bodo strokovnjaki zlahka upoštevali, da so možne za antagoniste oksitocina tudi druge terapevtske uporabe. Tako npr. je nadaljnja tarčna uporaba oksitocinskega delovanja mlečna žleza, ki pospešuje izločanje mleka. Spojine po predmetnem izumu bi se dale zato uporabiti za kontrolo neustrezne laktacije. Nadalje bi bile lahko koristne pri kontroli nekaterih tumorjev, zlasti tumorjev na dojki in sekundarnih metastaz, ki izvirajo iz primarnega tumorja na dojki. Nadaljnja tarčna terapija bi bila lahko tudi hiperplazija prostate. Predpostavljali so že tudi, da je oksitocin udeležen pri razvoju luteusa in pri olajšanju post-koitalnega transporta sperme. Iz tega se da sklepati, da bi bile spojine po predmetnem izumu lahko koristne kot kontracepcijska sredstva ali kot sredstva za regulacijo plodnosti. Nadaljnja periferna tarča oksitocina je imunski sistem. Antagonisti oksitocina so zato potencialno koristni kot imunomodulacijska in anti-inflamatoma sredstva.

Oksitocin je prisoten tudi v možganih, kjer naj bi po dosedanjih predlogih sodeloval pri etiologiji tako različnih stanj, kot je psihogena erektilna disfunkcija, shizofrenija in z alkoholom izzvane nevropsihološke hibe. Pri nekaterih vrstah se je tudi pokazalo, da učinkuje na kompleksno socialno obnašanje. Zato bi se dalo spojine po predmetnem izumu uporabiti npr. kot antipsihotiČna sredstva ali sredstva za izboljšanje kognitivnosti. Uporaba spojin po izumu v katerikoli izmed teh terapevtskih situacij naj bo vsebovana v okviru predmetnega opisa.

V nadaljevanju bomo opisali izum na splošno in s specifičnimi Primeri. Razumeti pa je treba, da predloženi opis ni namenjen za omejevanje obsega izuma in da v njegov obseg vključuje tudi take variacije, ki so v stroki znane in ki bi jih strokovnjak smatral za ekvivalentne.

Splošne metode sinteze

Kemične pretvorbe, ki so potrebne za izvedbo sinteze spojin po predmetnem izumu, so v stroki dobro znane. Tehnike peptidne kemije, tako v raztopini kot tudi na trdnih nosilcih, so posebno relevantne. Metode v fazi topil so opisane v naslednjih referencah:

Law, H.B. in Du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. 82,4579 - 4581, 1960;

ZhuZe, A. L. et al., Coli. Czech. Chem. Comm. 29,2648-2662,1964; in

Larsson, L.-E. et al., J. Med. Chem. 21, 352-356,1978.

Metode s trdno fazo so obravnavane v:

Merrifield, R. B.., J. Am. Chem. Soc. 85,2149,1963;

Merrifield, R. B., Biochemistry 3,1385, 1964; in

Konig, W. in Geiger, R. Chem. Ber. 103, 788, 1970.

Pot, ki so jo uporabili izumitelji, je v obrisih obravnavana spodaj in nato podrobno prikazana s Primeri. Strokovnjaku s področja peptidne kemije bo očitno, da je možno spreminjati zaporedje izvajanja nekaterih izmed pretvorb. Ni namen izumiteljev, da bi bile take očitne variacije izključene iz obsega izuma.

Najpogosteje bo izhodni material zaščitena N-alkilamino kislina s splošno formulo 1

P² p’-N

-ch-co₂h v kateri sta R in n izbrana izmed zgoraj nakazanih možnosti. P¹ je zaščitna skupina za dušik. Eden izmed najugodnejših izborov za P¹ je 9-fluorenilmetil-oksikarbonil (Fmoc).

Ce naj bo A v tarčni spojini H, tedaj je bodisi P skupina, ki ščiti dušik in se razlikuje od P (npr. benziloksikarbonil) ter P stoji za H ali za enak pomen kot P , ali pa sta P in P skupaj dvovalentni zaščitni skupini za dušik (npr. ftaloil).

3

Kadar naj A pomeni -C(=NH)NH₂ je P bodisi H ali zaščitna skupina kot zgoraj ter P stoji za -C(=NP⁴)NH₂, kjer je P⁴ zaščitna skupina ter je prednostno isto kot P². Strokovnjaku iz prakse bo očitno, da ti zaščiteni gvanidini lahko obstajajo kot tavtomeri in položajni izomeri. Čeprav je bil -(CH2)_n-N(P²)P³ definiran kot 2^A, lahko smatramo B C D izomere 2 , 2 in 2 kot ekvivalente tej strukturi za namene predmetnega opisa.

N-P N-H N-P ^ρ II p I h ||

- (CH_;)„-N-C-NHj - (CH₂)„-N-C-NH-P - (CH₂) „-N-C-NH-P ,B

NH-P

I

- (CH₂) _n-N=C-NH-P

Kadar zaščitene N-alkilamino kisline s splošno formulo 1 niso komercialno dostopne, se jih da pripraviti po metodah opisanih v literaturi, ali po metodah, ki so jim analogne.

Če predpostavimo, da naj uporabimo metode v trdni fazi, je aminokislina 1 vezana na primemo smolo, da daje spojino 3 kot prvi intermediat

P²

I , ch₂ „-n-p³ , I

P^-N-CH-COi-Res 3

I

R kjer Res predstavlja polimerno smolo.

P¹ cepimo in pripajamo FmocAbu(SCH2CH2CO2t-Bu)OH, da dobimo spojino 4.

P²

I , t-BuOzC (CH₂) 2-S- (CH₂) ₂ (CH₂) n-N-P³

Fmoc-NH-CH-CO-N-CH-C0₂-Res 4

I

R

Peptid razširimo s sekvenčnim pripajanjem s FmocAsn, FmocY, Fmoclle in nato BocX. Kadar X stoji za D-Trp, je prikladno, da zaščitimo indolni dušik kot njegov formilni derivat. Uporaba Boc-zaščite za to aminokislino dopušča istočasno cepitev t-butil estra in N-terminaine zaščitne skupine. Pri tej stopnji je prisoten intermediat 5.

P² t-BuO₂C (CH₂) 2-S- (CH₂) ₂ (CH₂)_n-N-P³

Boc-X-Ile-Y-Asn-NH-CH-C0-N-CH-CO₂-Res 5

R

Peptid cepimo od smole z uporabo primernih standardnih pogojev in nato zaestrimo, npr. z obdelavo z benzilbromidom, da dobimo benzil ester 6.

P² t-BuO₂C (CH₂) 2-S- (CH₂) ₂ (CH₂) _n-N-P³

I I 6

Boc-X-1 le-Y-Asn-NH-CH-C0-N-CH-CO₂-CH₂Ph

R (Le-tega lahko pišemo kot

P²

I ₃ (CH₂) _n-N-P³ i-:-1 I

Mpa-Ot-Bu Boc-X-Ile-Y-Asn-Abu-N-CH-CO₂-CH₂Ph 6}

I

R

Boc skupino in t-butil ester cepimo s kislinsko obdelavo ter nastale aminske in kislinske skupine kondenziramo, da tvorimo makrocikel. Benzil ester nato reduciramo, da dobimo primarni alkohol tarčne spojine, npr. z reakcijo z natrijevim borohidridom v vodnem izopropanolu. Prikladno lahko dosežemo med to pretvorbo tudi odstranitev preostalih zaščitnih skupin. Če pa se to ne zgodi, je potrebna končna stopnja odstranitve zaščitne skupine. Produkt izoliramo in očistimo z uporabo standardnih tehnik.

Naslednje specifične Primere pripravimo po teh splošnih navodilih. So predstavniki spojin predmetnega izuma. Uporabljamo naslednje okrajšave:

TBTU 2-( 1 -H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametil-uronij ev tetrafluoroborat

Boc /erc-butiloksikarbonil

Fmoc 9-fluorenilmetiloksikarbonil

TFA trifluorocetna kislina

DMF dimetilformamid

DBU 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en

Bn

Om

Pht benzil omitin ftaloil.

Zaščitene aminokisline smo dobili kot sledi:

FmocAbu(SCH₂CH₂CO₂t-Bu) pripravljen po Prochazka, E. et al., Coli. Czech. Chem. Comm. 57, 1335, 1992;

FmocN^aMeOm(Pht) pripravljen analogno načinu, uporabljenem za lizinski derivat v Freidinger, R. M. et al., J. Org. Chem. 48, 77, 1983;

Fmoc-alolle pripravljen po Ten Kortenaar, P. B. W. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 27, 398,1986;

FmocAla(3,3-dietil) pripravljen po Eisler, K. et al., Coli. Czech. Chem. Comm. 31,

4563,1966;

Boc-D-Trp(CHO); Boc-D-Nal; FmocAsn; Fmoclle; FmocVal; FmocLeu;

FmocCha vsi iz Bachem (CH in USA).

Primer 1

Mpa-D-Trp-Ile- alolle —Asn-Abu-N

CH-CHaOH

CH₃ CH₂CH₂CH₂NH₂ la: Boc-D-Trp (CHO) -Ile- alolle -Asn-Abu-N°MeOrn (Pht) OBn

I

SCH₂CH₂CO₂t-Bu

Peptid la smo sintetizirali z uporabo metodologije v trdni fazi na o-klorotritilni smoli in s

Fmoc strategijo.

Prva aminokislina, FmocN^aMeOm(Pht)OH, je bila vezana na smolo. Cepitev Fmoc skupine smo dosegli z 2% DBU v DMF. Druge ostanke smo sekvenčno pripajali in zaključili z Boc-D-Trp(CHO)OH. Na smolo vezani peptid smo obdelali z zmesjo ocetne kisline/trifluoroetanola/diklorometana(l :2:7), nato smo zmes filtrirali, filtrat uparili in liofilizirali. Nastalo peptidno kislino smo zaestrili z reakcijo z benzilbromidom (2 ekvivalenta) ter diizopropiletilaminom (2.5 ekvivalentov) v DMF v teku 27 ur. Topilo smo uparili in ostanek liofilizirali iz ocetne kisline.

Ib: Mpa-D-Trp (CHO)-Ile- alolle -Asn-Abu-N“MeOrn (Pht) OBn 1_I

N-terminalno Boc skupino in t-butil ester spojine la smo cepili z obdelavo s 95 % TFA/

2.5 % anizoIa/2.5 % vode v teku 1.5 ur pri sobni temperaturi. TFA smo uparili in produkt oborili z dodatkom dietiletra. Peptid smo ciklizirali z obdelavo s TBTU (1 ekvivalent) in N-metilmorfolinom (17 ekvivalentov) v DMF pri sobni temperaturi. Topilo smo uparili in peptid Ib očistili z reverzno-fazno kromatografijo.

Ic: Mpa-D-Trp-Ile- alolle -Asn-Abu-N-CH-CHjOH ^p—r-1 i i

CH, CH₂CH_zCH₂NH₂

Očiščeni benzil ester Ib smo obdelali z NaBH₄ (7 ekvivalentov) v raztopini v zmesi izopropanol/voda (6:1) pri sobni temperaturi v teku 22 ur v atmosferi inertnega plina. Dodali smo ocetno kislino (18 ekvivalentov) ter zmes segrevali 6 ur pri 80 °C. Topilo smo uparili in produkt peptid Ic (= »peptid I«) smo očistili z reverzno-fazno tekočinsko kromatografijo: stacionarna faza; Kromasil® 13 pm ali 5 pm, lOOm ’¹⁰, Cis ali Cs (EKA Nobel, Švedska) : mobilna faza; acetonitril/0.1 % TFA v vodi. Dobitek 14 mg. Masna spektrometrija (elektrospray ionizacija, analiza z ionsko pastjo (»ion trap«), pozitivni modul) je pokazala molekulsko maso v skladu s predlagano strukturo (ugotovljeno m/z =

830.5 [MH⁺j; izračunano za [^oH^NgOsS+H+j m/z = 830.5 ).

Ob uporabi enake metode kot pri Primeru I in z zamenjavo primernih zaščitenih aminokislin za Boc-D-Trp(CHO)OH in Fmoc-alolleOH, smo pripravili peptide, naštete v

Tabeli 1.

Tabela 1. Podatki za masno spektroskopijo

Mpa-X-Ile-Y-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ¹-¹ I I

CHj CH₂CH₂CH₂NH₂

Primeri II - VII

Peptid	X	Y	Masni spekter
Izrač. MIT	Ugotovljeno
II	D-Trp	Leu	830.5	830.4
III	D-Trp	Val	816.4	816.4
IV	D-Trp	Cha	870.5	870.5
v	D-Trp	lle	830.5	830.5
VI	D-Nal	alolle	841.5	841.5
VII	D-Trp	Ala (3,3.dietil) 844.5	844.5

Pripravili smo številne referenčne peptid amide po metodah, prikazanih v W095/02609, da smo primerjali lastnosti predmetnega izuma s tistimi, ki so znane v stroki. Ti referenčni peptidi so zbrani v Tabeli 2.

Tabela 2. Referenčni peptidi

Mpa-X-I1e-Y-Asn-Abu-N— L___1 1	-CH-CONH₂ 1 ch₂ch₂ch₂nh₂ Y
Peptid	1 CHj X
r-IX	D-Trp	alolle
r-X	D-Trp	Val
r-XI	D-Nal	alolle

Primer VIII

Ob uporabi metode iz primera I, le z zamenjavo -etil-omitina za hT-metilamino kislino, smo pripravili naslednji peptid (VHI) (ugotovljeno m/z = 855.1 [MH⁺] ; Izračunano za [C^H^NgOsS+Hf] m/x = 855.5 ).

Mpa-D-Nal-Ile-alolle —Asn-Abu-N - CH-CH₂0H ¹-¹ I I ch₃-ch₂ ch₂ch₂ch₂nh₂ peptid VIII

Primer IX

Biološko ovrednotenje spojin

Spojine po predmetnem izumu lahko preizkusimo v številnih in vitro ter in vivo bioloških sistemih. Te testne sisteme smo izbrali kolikor mogoče relevantne za ciljnega humanega pacienta.

i) Poskus vezave oksitocin receptorja

Rekombinantne humane oksitocin receptorje smo izrazili bodisi v CHO ali HEK293 celicah ob uporabi standardnih tehnik molekularne biologije. Pripravili smo membransko frakcijo in inkubirali v prisotnosti [ I]-oksitocina in s spremenljivimi koncentracijami heptapeptidnega analoga. Membrane smo nato izolirali s filtracijo in prešteli glede radioaktivnosti, da smo ugotovili oksitocinsko vezavo. Za analog smo določili inhibicijsko konstanto Ki.

Dobljene rezultate smo predstavili v Tabeli 3.

Tabela 3. Preizkus oksitocin receptorja; inhibicijske konstante Ki

Peptid	Ki (nM); srednji+SEM
I	0.25+0.16
II	3.2+0.75
III	0.80+0.30
IV	7.1+1.85
V	1.4+0.15
VI	0.1±0.0
VII	2.4+0.85

ii) Antagonistični učinek in vitro na modelu humanega uterusa

Tkivo mišic uterusa žensk v pozni nosečnosti s carskim rezom smo narezali na pramene, ki smo jih namestili v kopel za tkivo, polnjeno s Krebs-Ringeijevim pufrom in oksigenirali s karbogenskim plinom (95 % O₂ + 5 % CO₂). Spremembe napetosti izometrične mišice, ugotovljene s pretvornikom napetosti, smo zapisali na Grassovem poligrafu.

Zapisali smo krivuljo koncentracija - učinek za oksitocin. Učinek, izmeijen v tem primeru, ustreza neto vrednosti integrirane kontrakcijske krivulje med 10-minutnim obdobjem, ki sledi dajanju agonista (t.j. oksitocina). Izbrali smo koncentracijo oksitocina, ki daje najmanj polovico maksimalnega odziva. To koncentracijo agonista smo dajali v tkivo v prisotnosti različnih koncentracij antagonista heptapeptidnega analoga, ter zapisali odziv. Koncentracija antagonista, ki je bila potrebna za zmanjšanje odziva na 50 % njegove kontrolne vrednosti, je bila gotovljena z analizo regresije in tukaj podana kot IC50 vrednost. [IC50 vrednost = koncentracija antagonista, potrebna za zmanjšanje učinka dane doze agonista za 50 %]. Rezultati so podani v Tabeli 4.

Tabela 4. Inhibicija učinka agonista (model uterusa).

Peptid	IC50, model humanega uterusa (nM)
I	5±1
r-VIII	18+3

iii) in vivo model na podgani

Podgane Sprague Dawley (približno 250 g) v naravnem estrusu smo anestetizirali z Inactinom (0.5mg/100 g telesne teže, i.p.). Aktivnost miometrija smo izmerili s pomočjo katetra, fiksiranega v votlini uterusa ter napolnili z modificirano Lockesovo raztopino. Kateter smo povezali s Statham P23d pretvornikom moči ter izmerili kontrakcije na Grassovem poligrafu (model 7D).

-4 -3

Zapisali smo krivuljo doza - odziv za oksitocin (2 x 10 - 5 x 10 pmol/kg). V tem primeru je bil odziv kvantificiran z integracijo krivulje med 15 minutami, ki slede injekciji agonista. Izbrali smo dozo oksitocina, ki je dala učinek, ki ustreza intralumenamemu kontrakcijskemu tlaku 1332 - 3996 Pa (10 - 30 mm Hg), ter v okviru linearnega odseka krivulje. To dozo oksitocina smo dajali živali skupaj z najmanj dvema različnima dozama antagonista in zapisali učunek. Dozo antagonista, ki zmanjša učinek agonista na 50 % njegove kontrolne vrednosti, smo določili z interpolacijo in je tukaj navedena kot ID50 vrednost. [ ID50 vrednost = doza antagonista, potrebnega za zmanjšanje učinka dane doze agonista za 50%]. Rezultati so podani v Tabeli 5.

Trajanje učinka antagonistov smo tudi določili na tem modelu. Izbrali smo dozo oksitocina (2 χ 10'⁴ - 5 x ΙΟ’³ pmol/kg), ki daje učinek ustrezen polovici maksimalnega učinka (ta doza je ED50). Ugotovljeni učinek je bil enak, kot pri zgoraj definirani določitvi ID50). -4 -3

Izbrali smo dozo antagonista (8x10 -4x10 pmol/kg), tako, da smo dobili vsaj 50 % inhibicije odziva na agonist. Na pričetku poizkusa smo skupaj dajali posamične doze agonista in antagonista. V 20-minutnih intervalih zatem smo dajali doze samega agonista in izmerili odziv. Čas, ki je potreben za inhibicijo učinka agonista, da se zmanjša na 25 % svoje izhodne vrednosti, smo določili z interpolacijo in ga tukaj navedli kot t₇5 vrednost. [t₇5 vrednost = časovno obdobje, ki je potrebno za zmanjšanje učinkovitosti posamične doze za 75 % ]. Rezultati so predstavljeni v Tabeli 5.

Tabela 5. Inhibicija učinka agonista (in vivo model na podgani)

Peptid ID50, Model na podgani (nmol/kg) t₇5, Model na podgani (min)

I 2.9+0.3 169+2 r-IX 2.9+0.3 180+9

Iz rezultatov, predstavljenih v Tabelah 3 - 5, je razvidno, da so spojine po predmetnem izumu vsaj tako dobre kot doslej znane spojine na modelu podgane, tako glede jakosti in trajanja učinka, in prekašajo doslej znane spojine pri bolj relevantnem humanem modelu.

Primer X

Farmacevtske formulacije

Raztopina v izotonični zapufrani slanici za i.v. injiciranje.

Pripravili smo naslednje raztopine:

Raztopina A (0.02 M citronska kislina)

Monohidrat citronske kisline 0.42 g

Destilirana voda do 100 ml

Raztopina B (0.04 M dinatrijev hidrogen fosfat) Na₂HPO₄.2H₂O 0.712 g

Destilirana voda do 100 ml

K 27 ml raztopine A dodamo 23 ml raztopine B, 0.81 g NaCI ter 0.322 g peptid I acetata. Nato nastavimo pH na 4.5 z raztopino A ter dodamo destilirano vodo, da dobimo celotni volumen 100 ml. Končno filtriramo zmes skozi Sterivex-GV 0.22 pm. To da izotonično raztopino, ki vsebuje 0.3 mg/ml peptida I (izračunano kot prosto bazo) primemo za intravenozno injekcijo.

Tablete za oralno dajanje

Kombinirali smo naslednje komponente:

Peptid 1 acetata 108 mg

Manitola 7.7 g

Laktoze 6.0 g

Mikrokristalne celuloze 6.0 g

Premrežene karboksimetil celuloze 200 mg

Smukca 800 mg

Magnezijevega stearata 200 mg

Polivinilpirolidona/etanola za vezavo

Homogeno zmes smo oblikovali v tablete z uporabo standardnih metod. Zmes je zadoščala za pripravo 100 tablet, ki so vsebovale vsaka 1 mg peptida I (računano kot prosto bazo).

Enterična tableta za oralno dajanje zgoraj navedenih tablet smo z zračnim razprševanjem prevlekli s 100 mg celuloznega acetat ftalata (4 mg na tableto).

Za izum je bil tudi koristen sestavek, opisan v WO 95/25534, v katerem je učinkovina (npr. desmopresin) lahko nadomeščena s spojinami po predmetnem izumu. Prilagoditev sestavka, da prenese višje množine učinkovin, ki so potrebne za vdelavo v tableto, je za strokovnjaka zelo enostavna.

Primer XI

Ovrednotenje stabilnosti

Pripravili smo raztopine analogov heptapeptida predmetnega izuma s sestavki, ki so predstavniki vodnih formulacij. Raztopine smo skladiščili več tednov pri 50 °C ter periodično jemali alikvotne deleže za HPLC analizo. Vzporedno smo proučevali referenčne peptide. Razgradnjo smo ugotavljali kot izgubo peptida ( v % mase na teden), neodvisno od narave produktov razgradnje. Rezultati so prikazani v Tabeli 6.

Tabela 6. Test stabilnosti

Peptid Sestava testne raztopine Razgradnja pri 50 °C (mas. %/ teden)

I	Izotonični citratno/fosfatni pufer, pH 4.5	0.4
r-IX	kot zgoraj	2.9
III	kot zgoraj	0.7
r-X	kot zgoraj	4.3
VI	kot zgoraj	1.2
r-XI	kot zgoraj	4.0

Rezultati, predstavljeni zgoraj, jasno označujejo, da so spojine po predmetnem izumu stabilnejše v raztopini od predhodno opisanih spojin. V praksi pomeni ta povečana stabilnost, da bodo imele vodne formulacije daljšo skladiščno dobo in da bodo manj zahtevne glede skladiščenja v hladilnikih. Poleg posledičnih finančnih prihrankov bodo koristi tako glede prikladnosti kot tudi varnosti, saj bo zmanjšana potreba po pripravi posameznih doz tik pred aplikacijo. Koristi pa bodo tudi pri proizvodnem procesu, saj bodo spojine odpornejše na razgradnjo med in po čiščenju.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Heptapeptidni analog ali njegova farmacevtsko sprejemljiva sol, ki ima oksitocin antagonistično učinkovitost ter obstaja iz heksapeptidnega dela S in C-terminalnega βaminoalkoholnega ostanka Z, vezanega na del S z amidno vezjo, pri čemer je βaminoalkohol Z:

-NR-CH-CH₂OH (25)

I

Q v kateri Q stoji za -(CH₂)_n-NH-A, nje 1-6 in A je H ali -C(=NH)NH₂, in kjer R stoji za CH₃ ali C₂Hs; in del S je:

Mp a-X-Ile-Y-Asn-Abu-1 (S) kjer imajo Mpa, Ile, Asn in Abu naslednje pomene: Mpa ostanek 3-merkaptopropionske kisline

Ile ostanek izolevcina

Asn ostanek asparagina

Abu ostanek α-aminomaslene kisline;

in kjer

X je D-aromatska α-aminokislina; in

Y je alifatska a-aminokislina.
2. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, daje X amino acilni ostanek Dtriptofana ali P-(2-naftil)-D-alanina.
3. Heptapeptidni analog po zahtevku 2, značilen po tem, da je Y amino acilni ostanek levcina, valina, izolevcina, aloizolevcina, β,β-dietilalanina, cikloheksilalanina ali cikloheksilglicina.
4. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, da je Y amino acilni ostanek levcina, valina, izolevcina, aloizolevcina, β,β-dietilalanina, cikloheksilalanina ali cikloheksilglicina.
5. Heptapeptidni analog po zahtevku 4, značilen po tem, daje n enak 2, 3 ali 4.
6. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, daje n enak 2, 3 ali 4.
7. Heptapeptidni analog po zahtevku 6, značilen po tem, daje X amino acilni ostanek Dtriptofana ali β-(2-ηΒ&Π)-Ο-Βΐ3ηίη3.
8. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, daje X amino acilni ostanek Dtriptofana ali p-(2-naftil)-D-alanina, Y je amino acilni ostanek levcina, valina, izolevcina, aloizolevcina, β,β-dietilalanina, cikloheksilalanina ali cikloheksilglicina, in n stoji za 2, 3 ali 4.
9. Heptapeptidni analog po zahtevku 8, značilen po tem, daje izbran izmed: M^a-D-Trp-Ile-aloIle-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

CH₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-aloIle-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

CHj CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂

Mpa-D-Trp-He-al-oHe-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

CHj CH₂CH₂NH₂

M{j)a-D-Trp-Ile- alolle -Asn-Abu-N——CH-CH₂OH

CH₃ ch₂ch₂ch₂nh-c=nh nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Ala (3, 3-dietil ) -Asn-Abu-N—-CH-CH₂OH ΐ--1 , | ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Nal-Ile- alolle -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ^J I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Nal-Ile-Ala(3, 3- dietil ) -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

CH₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

M^a-D-Trp-Ile-Ile-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Leu-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

1-1 I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

M^a-D-Trp-Ile-Val-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂

Mpa-D-Trp-Ile-Cha-Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ¹-¹ I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂.
10. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, da ima strukturo:

Mpa-D-Trp-Ile- alolle -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ΐ-_-1 | |

CH, CHjCHiCH₂NH₂

ZJ
11. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, da ima strukturo:

Mjoa-D-Trp-Ile-L alolle -Asn-Abu-N —CH-CH₂OH

CH₃ CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂
12. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, da ima strukturo:

Mpa-D-Trp-Ile- alolle -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH

CH₃ ch₂ch₂ch₂nh-c=nh I nh₂
13. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, da ima strukturo:

Mpa-D-Nal-Ile-Ala (3, 3- dietil ) -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ¹-' I I ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂
14. Heptapeptidni analog po zahtevku 1, značilen po tem, da ima strukturo:

Mpa-D-Nal-Ile- alolle -Asn-Abu-N-CH-CH₂OH ch₃ ch₂ch₂ch₂nh₂
15. Farmacevtski sestavek, značilen po tem, da obsega farmakološko učinkovito množino heptapeptidnega analoga po zahtevku 1, in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
16. Sestavek po zahtevku 15, značilen po tem, daje vodna raztopina za nazalno, subkutano ali intravenozno dajanje.
17. Sestavek po zahtevku 15, značilen po tem, da nosilec vključuje pufrsko sredstvo.
18. Sestavek po zahtevku 15, značilen po tem, da je v obliki tablete, kapsule, granul in podobnega, za oralno dajanje.

1% Postopek za pripravo heptapeptidnega analoga ali njegove farmacevtsko sprejemljive soli, ki imajo oksitocin-antagonistično učinkovitost in obstajajo iz heksapeptidnega dela S in C-terminalnega β-aminoalkoholnega ostanka Z, vezanega na del S z amidno vezjo, pri čemer je β-aminoalkohol Z:

-NR-CH-CH₂OH

I

Q (Z) v kateri Q stoji za -(CH₂)_n-NH-A, nje 1-6 in A je H ali -C(=NH)NH₂, in.kjer R stoji za CH₃ ali C₂H₃; in del S je:

Mpa-X-Ile-Y-Asn-Abu- (S)

I_I kjer imajo Mpa, Ile, Asn in Abu naslednje pomene: Mpa ostanek 3-merkaptopropionske kisline lle ostanek izolevcina

Asn ostanek asparagina

Abu ostanek α-aminomaslene kisline;

in kjer

X je D-aromatska α-aminokislina; in

Y je alifatska a-aminokislina.

z redukcijo ustrezne spojine, v kateri Z stoji za Y:

-NlU-CH-CO-OBn (Y) v kateri M stoji za (CH₂)_n-N(Pht) ali -(CH₂)_n-N(P)-C(=NP)NP₂, v kateri je ena ali dve izmed skupin P zaščitna skupina za dušik, ostale pa so vodik, nje 1-6, R¹ pa stoji za CH₃ ali C₂H₅, z uporabo borohidridne soli ali substituiranega borohidrida ali borana.
20. Postopek po zahtevku 49. značilen po tem, daje borohidrid NaBH₄.

24· Postopek za pripravo farmacevtskega sestavka, značilen po tem, daje dobljeni sestavek namenjen za oskrbo oz. zdravljenje predčasnih porodnih popadkov in menstruacijske bolečine, neoplazij in hiperplazij, shizofrenije, vedenjskih motenj, erektilne disfunkcije, vnetja in neustrezne laktacije, ali kot sredstvo za izboljšanje kognitivnosti, za modulacijo imunosti ali za regulacijo fertilnosti, pri čemer postopek obsega združitev heptapeptidnega analoga ali njegove farmacevtsko sprejemljive soli, ki imajo oksitocin-antagonistično aktivnost ter obstajajo iz heksapeptidnega dela S in C-terminalnega β-aminoalkoholnega ostanka Z, vezanega na del S z amidno vezjo, pri čemer je β-aminoalkohol Z:

-NR-CH-CHjOH (Z)

I

Q v kateri Q stoji za -(CH₂)_n-NH-A, nje 1-6 in A je H ali -C(⁼NH)NH₂, in kjer R stoji za CH₃ ali C₂Hs; in del S je:

Mpa-X-Ile-Y-Asn-Abu- (S) i - _I kjer imajo Mpa, Ile, Asn in Abu naslednje pomene:

Mpa ostanek 3-merkaptopropionske kisline

Ile ostanek izolevcina

Asn ostanek asparagina

Abu ostanek α-aminomaslene kisline;

in kjer

X je D-aromatska α-aminokislina; in

Y je alifatska a-aminokislina s farmacevtsko sprejemljivim nosilcem.
22. -Postopek po zahtevku 21, značilen po tem, da je sestavek homogena zmes heptapeptidnega analoga ali njegove soli ter nosilca.
23. Postopek po zahtevku 22, značilen po tem, da obsega preslojenje navedene zmesi z enterično prevleko, zlasti tako enterično prevleko, ki ni zlahka topna pri pH 5.0 ali manj.
24. Postopek po zahtevku 22 ali 23, značilen po tem, da obsega tabletiranje ali granuliranje zmesi in/ali polnitev v kapsulo.