SE453799C - Vävnadsbindemedel innefattande fibrinogen och faktor XIII samt förfarande för dess framställning - Google Patents

Description

453 229 10 15 20 25 30 En ytterligare studie har beskrivits av Spängler et al i "Wiener Klinischen Wochenschrift" 1973, sidorna 1 till 7. Även här dokumenteras medelst djurförsök möjligheten att med hjälp av fibrinogen såsom kryoprecipitat och trombin åstadkomma en vävnadshopklistring.

Kända preparat har dock icke visat sig vara tillfredsstäl- lande, eftersom de ännu icke i tillräcklig omfattning upp- fyller de fordringar, som man ställer på ett sådant vävnads- bindmedel nämligen: a) hög belastbarhet av klistringarna respektive sårför- seglingar samt en säker och kvarvarande blodstill- ning, dvs. god vidhäftningsförmåga av klistret på sår- resp. vävnadsytorna, samt en hög inre hållfast- het av klistret, b) reglerbar hållbarhet av klistringarna i kroppen, c) fullständig resorberbarhet av bindmedlet under sårläk- ningsprocessen, d) sàrläkningsbefrämjande egenskaper, Att tidigare preparaticke uppfyller ovannämnda fordringar 1 tillräcklig utsträckning kan delvis bero pà att de för blodstillning nödvändiga koaguleringsfaktorerna icke före- finnes i ett optimalt förhållande hos dessa kända preparat och kan också bero därpå, att den fibrinolytiska aktiviteten icke har kunnat tillräckligt behärskas inom klistringsomràdet.

Man erhöll ofta genom enzymatisk inverkan en för tidig upplös- ning av dessa vävnädshopklistringar.

Uppfinningen avser att undvika dessa nackdelar och svårig- heter och ändamålet med uppfinningen är att åstadkomma ett lyofiliserat vävnadsbindmedel av humant eller animaliskt ur- sprung, vilket uppfyller ovannämnda förutsättningar och före- ligger i lyofiliserad form, vilket erfodras med hänsyn till den längre h: 3 453 799 hållbarheten och den förbättrade transport resp. lagrings- förmågan.

I enlighet härmed består uppfinningen i en kombination av följande kännetecken: a) att bindemedlet innehåller åtminstone 33 viktprocent fibrinogen, b) att förhållandet av faktorn XIII till fibrinogenet ~ uttryckt i enheter av faktorn XIII per gram fibrino- gen, uppgår till åtminstone 80, c) att i totalproteinet fibrinogen och albumin förefin- nes i ett förhållande av 33 till 90 : 5 till 40, d) att bindemedlet innehåller en halt av plæamnomarakti- vator-inhibitor eller plasmin-inhibitor, företrädesvis aprotinin, i en mängd av 250 till 25000 kallikrein- -inaktivator-enheter (KIE) per gram fibrinogen, e) att preparatet lyofiliserat.

Enligt en föredragen utföringsform innehåller vävnadsbinde- medlet dessutom glycin, varigenom återupplösbarheten av den lyofiliserade produkten förbättras.

Dessutom kan vävnadsbindmedlet härutöver innehålla glukos eller sackaros, vilka komponenter likaledes befrämjar upp- lösbarheten.

Vävnadsbindmedlet kan dessutom innehålla 0,2 till 200 IE heparin per gram fibrinogen, varigenom en stabiliserande effekt uppnås.

Vävnadsbindmedlet enligt uppfinningen uppvisar karaktäristiska förnätningsegenskaper efter upplösning, vilka kunna bestämmas enligt natriumlaurylsulfat (SDS)-polyakrylamid-gelelektrofores- 453 799 10 15 20 25 30 35 -metoden. Denna test utföres pà sådant sätt, att blandningen H efter hopblandning av vävnadsbindmedlet med samma volym av en lösning innehållande 40 pMol CaCl2och 15 enheter NIH-en- heter(US National Institutes of Health-Enheter) trombin per ml, inkuberas vid 37°C. Förnätningsgraden bestämmes efter att reaktionen stoppas och efter en reduktiv spaltning av de i proteinerna förefintliga disulfitbroarna genom tillsats _ av en blandning av urinämne, natriumdodecylsulfat och ß-merkapto- etanol genom gelelektrofores. Karaktäristiskt för det enligt uppfinningen föreslagna bindmedlet är en fullständig förnätning av fibrin-Ü -kedjor efter 3 till 5 minuter och en åtminstone 35 procentig förnätning av fíbrin-G<-kedjorna efter två timmar.

Fibrinogen, albumin och i kyla olösligt globulin i total- proteinet skall i det enligt uppfinningen föreslagna bind- medlet stå i ett bestämt förhållande till varandra; detta förhållande uppgår till 33 till 90 : 5 till 40 : 0,2 till 15.

Uppfinningen omfattar dessutom ett förfarande för framställ- ning av det ovan beskrivna vävnadsbindmedlet, utgående från plasmakryoprecipitat, vilket kännetecknas av att i kyla lös- ligt 'plasmaprotein avlägsnas ur kryoprecipitatet genom en eller flera behandlingar med en buffertlösning med ett pH- värde på omkring 6,5, innehållande ungefär 6,6 g Na3-citrat~ 2H2O, ungefär 3,4 g NaCl, ungefär 10 g glycin, ungefär 13,0 g glykos-1H20, ungefär 50 000 KIE aprotinin och ungefär 200 IE heparin per liter, varefter den renade fällningen upp- löses, förses med humanalbumin och lösningen lyofiliseras.

Med fördel framställes kryoprecipitatet ur humant eller ani- malt fihsk plasma, vilken var djupfryst vid -20°C. Vid en ök- ning av temperaturen till mellan 0 - 2°C utvinnes kryopreci- pitatet och avskiljes genom centrifugering. Fällningen elueras genom en eller upprepade elusioner med buffertlösningen, som uppvisar ett pH-värde av mellan 6 till 8,0 och centrifugeras vid mellan 0 - 4°C för att avlägsna det i kyla lösliga plasma- proteinet. Behandlingen med buffertlösningen genomföres tills det önskade faktor XIII-fibrinogen-förhållandet har uppnåtts . 5 453 799 Den renade fällningen löses medelst en ytterligare buffert- lösning, som innehåller humanalbumin, glycin och eventuellt glykos eller sackaros, en plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin-inhibitor samt heparin och uppvisar ett pH- värde av mellan 6,5 till 9,0 och utspädes till en protein- koncentration av mellan 4,0 till 9,0 %. Lösningen filtreras över membranfilter med en porstorlek av upp till 0,2 Pm, fylles till slutbehâllarna och lyofiliseras.

Det så erhållna lyofiliserade bindmedlet kan lagras vid rumstemperatur eller företrädesvis vid +4°C och är bruks- färdig efter rekonstitution med Aqua ad iniectabilia,vilket allt efter önskan kan försättas med en plasminogen-aktivator- -inhibitor eller plasmin-inhibitor, företrädesvis aprotinin.

Vid upplösningen av det lyofiliserade preparatet måste beak- tas, att den bruksfärdiga lösningen innehåller åtminstone 70 mg fibrinogen per ml.

Vävnadsbindmedlet enligt uppfinningen visar en universell användbarhet. Bindmedlet kan användas för en sömlös hopbind- ning av humana eller animaliska vävnads- eller organdelar, för sårförsegling och blodstillning samt för att befrämja sârläkningar.

Föredragna användningsområden, där det enligt uppfinningen föreslagna vävnadsbindmedlet kan användas med god effekt äro: Indikationer inom omrâdet av hals-, näs-, öron- och käk- kirurgin, inom tandvården, inom neurokirurgin, inom den plastiska kirurgin, allmän kirurgi, abdominalkirurgi, torax- och kärlkirurgi, Ortopedi, olyckskirurgi, urologi, ophtalmologi och gynekologi.

Med fördel försättes bindemedlet före applikationen av detsamma på den för hopbindning avsedda vävnaden med en blandning av trombin och kalciumklorid eller också kan denna blandning appliceras på vävnaden. 453 799 e Det enligt uppfinningen föreslagna förfarandet kommer nedan att beskrivas närmare under hänvisning till ett följande exempel: 21 l humant vid -20°C djupfryst färskplasma uppvärmdes till +2°C. Det erhållnakryoprecipitatet (435 9) avskildes vid +2°C genom centrifugering och behandlades vid +2°C med 4,3 l av en buffertlösning med pH-värde 6,5 och innehållande 6,6 g Na3-citrat-2H2O, 3,4 g NaCl, 10,0 g glycin, 13,0 g glukos-lH2O, 50000 KIE aprotinin och 200 IE heparin per liter och centrifugerades en gång till vid +2°C. Den avskilda fäll- ningen upplöstes i en ytterligare buffertlösning med ett pH-värde 7,9 och innehållande 35,0 g humanalbumin, 20,0 g glycin, 50000 KIE aprotinin och 200 IE heparin per liter och underkastades en utspädning till en koncentration av 70 mg protein per ml.

Därefter sterilfiltrerades lösningen över membranfilter med en porstorlek av upp till 0,2 Pm och avfylldes i slutbehålla- re vardera innehållande 2,2 ml, djupfrystes och lyofilisera- des. Efter en rekonstitution av den lyofiliserade produkten till en fibrinogen konstruktion av 90 mg/ml uppvisade det bruksfärdiga vävnadsklisterpreparatet i en förnätningstest en fullständig fibrin-X-förnätning efter 5 minuter och en 66 %-ig fibrin-04-förnätning efter två timmar vid 37°C.

Förhållandet av i bindemedlet förefintliga proteiner fibrino- gen till albumin till i kyla olösligt globulin kunde fast- ställas till 64,0 : 22,3 : 7,7. Heparinhalten uppgick till 4,5 IE per g fibrinogen. Aprotinin förefanns i en koncentra- tion av ll33 KIE per g fibrinogen. Halten av fakto31XIII upp- gick till 161 enheter per g fibrinogen. Halten av totalprotei- net i det lyofiliserade preparatet uppgick till 72,2 %, halten av fibrinogen i det lyofiliserade preparatet till 46,2%.

Bestämningarna gjordes på följande sätt: bestämningen av faktor XIII-enheterna genomfördes medelst en förnätningstest, W v 453 799 vid vilken faktor XIII-fritt fibrinogen användes som substrat och den genom tillsatsen av den okända förtunnade åstadkomna fibrinförnätningen tjänade såsom mått för den däri förefint- liga mängden av faktorn XIII. En motsvarande kalibrerings- kurva erhölls med polad humant citratplasma, varvid 1 ml plasma innehåller l enhet faktor XIII. Den kvantitativa proteinbestämningen erhölls medelst Kjeldahl-metoden.

Bestämningen av proteinerna relativt till varandra genom- fördes likaledes enligt SDS-polyakrylamid-gelelektrofores- metoden, nämligen a) med ett icke reducerat och b) med ett med P-merkaptoetanol reducerat prov av vävnadsbindmedlet.

Claims (6)

l0 15 20 ¿5 30 35 \J ih U1 01 \J QD HD PATENTKRAV

1. Preparat framställt av human eller animal plasma med en halt av fibrinogen och faktor XIII, vilket efter att ha upplösts i vatten till en halt av minst 70 mg fibrin- ogen/ml och därpå satts i kontakt med trombin åstadkommer vävnadsbindning, k ä n n e t e c k n a t av a) att preparatet innehåller åtminstone 33 viktprocent fibrinogen, b) att förhållandet av faktorn XIII till fibrinogen - uttryckt i enheter av faktorn XIII per gram fibrino- gen - uppgår till minst 80, c) att albumin tillförts till ett förhållande mellan fibrinogen och albumin av 33 till 90:5 till 40, d) att plasminogen-aktivator-inhibitor eller plasmin- inhibitor, företrädesvis aprotinin, tillförts till en mängd av 250 till 25 000 KIE per gram fibrinogen, och e) att preparatet är lyofiliserat.

2. Preparat enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det dessutom tillförts glycin.

3. Preparat enligt kraven 1 eller 2, k ä n n e- t e c k n a t a v att det härutöver tillförts glukos eller sackaros.

4. Preparat enligt kraven 1 - 3, k ä n n e - t e c k n a t av att det tillförts heparin till en halt av 0,2 till 200 IE heparin per gram fibrinogen. 10 15 fl 455 799 e

5. Preparat enligt kraven 1 - 4, k ä n n e t e c k- n a t genom en fullständig förnätbarhet av fibrin-y- kedjorna genom inkubation efter 3 till 5 minuter och en åtminstone 35 %-ig förnätbarhet av fibrin-a-kedjorna efter en inkubation i två timmar, bestämd enligt SDS-polyakrylamid- gelelektrofores-metoden, efter upplösning av det lyofili- serade preparatet.

6. Preparat enligt kraven 1 - 5, k ä n n e t e c k- n a t av att förhållandet av fibrinogen till albumin till i kyla olösligt globulin i totalproteinet uppgår till 33 till 9025 till 40:02 till 15.