RU2650636C2 - Составы на основе полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly(i:с)) для лечения инфекций верхних дыхательных путей - Google Patents

Составы на основе полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly(i:с)) для лечения инфекций верхних дыхательных путей Download PDF

Info

Publication number
RU2650636C2
RU2650636C2 RU2014148544A RU2014148544A RU2650636C2 RU 2650636 C2 RU2650636 C2 RU 2650636C2 RU 2014148544 A RU2014148544 A RU 2014148544A RU 2014148544 A RU2014148544 A RU 2014148544A RU 2650636 C2 RU2650636 C2 RU 2650636C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
poly
composition
starch
microparticle
microparticles
Prior art date
Application number
RU2014148544A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2014148544A (ru
Inventor
Брюс Альберт МАЛКОЛМ
Роджер Паулюс Мария ЗУТМУЛЛЕР
Ливен Элвир Колетт Барт
Original Assignee
Янссен Сайенсиз Айрлэнд Юси
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48430695&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2650636(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Янссен Сайенсиз Айрлэнд Юси filed Critical Янссен Сайенсиз Айрлэнд Юси
Publication of RU2014148544A publication Critical patent/RU2014148544A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2650636C2 publication Critical patent/RU2650636C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A61K47/38—Cellulose; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности к микрочастицам и композиции, содержащей микрочастицы, для профилактики вирусной инфекции, а также к применению композиции для получения лекарственного средства для профилактики вирусных инфекций верхних дыхательных путей. Микрочастицы состоят из полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты, смешанных с одним или более полимерами-носителями и водой, где полимер выбран из крахмала, альгината, карбоксиметилцеллюлозы и дипальмитоилфосфатидилхолина. Осуществление изобретения позволит получить лекарственное средство, обеспечивающее защиту врожденной иммунной системы от вирусных инфекций. 4 н. и 25 з.п. ф-лы, 11 табл., 3 ил.

Description

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей микрочастицы полиинозиновой-полицитидиловой кислот (Poly(I:C)) и полимера-носителя, выбранного из крахмала, альгината, бланозы или DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолина), для применения в лечении и/или предупреждении инфекций или простуды, и к устройству, предпочтительно к системе назальной доставки, содержащему указанную композицию для применения пациентом, нуждающегося в предупреждении и/или в лечении инфекций или насморка.
Простуда (также известная как назофарингит, острый вирусный ринофарингит, вирусная инфекция верхних дыхательных путей или простуда) является вирусным инфекционным заболеванием верхнего отдела дыхательной системы, вызываемым преимущественно вирусами.
ВИРУСЫ
Простуда является вирусной инфекцией верхних дыхательных путей. Чаще всего вовлеченный вирус представляет собой риновирус (30-50%), тип пикорнавируса с 99 известными серотипами. Другие включают коронавирус (10-15%), вирусы гриппа (5-15%), вирусы парагриппа человека, респираторный синцитиальный вирус человека, аденовирусы, энтеровирусы и метапневмовирус.
В целом более 200 серологически различных типов вирусов вызывают простуды. В простуды у взрослых в особенности вовлечены коронавирусы. Среди более 30 коронавирусов 3 или 4 вызывают инфекции у людей, но их трудно выращивать в лаборатории и их значение, таким образом, понимается хуже. В связи с существованием многих различных типов вирусов и их тенденции к непрерывным мутациям невозможно выработать абсолютный иммунитет к насморку.
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ И СИМПТОМЫ
Первым признаком вирусного заболевания верхних дыхательных путей часто является болезненное или саднящее горло. Другими распространенными симптомами являются насморк, заложенность носа и чихание. Они иногда дополняются конъюнктивитом ("розовым глазом"), болями в мышцах, усталостью, недомоганием, головной болью, слабостью или потерей аппетита. Кашель и лихорадка, как правило, указывают на грипп, а не на вирусное заболевание верхних дыхательных путей, при этом прогностическая ценность положительного результата составляет около 80%. Симптомы могут быть более тяжелыми у младенцев и маленьких детей, и в этих случаях они могут включать лихорадку и сыпь. Вирусные заболевания верхних дыхательных путей также могут быть более тяжелыми у курильщиков.
Репликация вируса начинается через 2-6 часов после первичного контакта. Симптомы обычно проявляются через 2-5 дней после первичного инфицирования, но изредка наблюдаются уже через 10 часов. Проявление симптомов достигает пика через 2-3 дня после появления симптомов, тогда как появление симптомов гриппа является постоянным и немедленным. В настоящее время не существует способа лечения, сокращающего продолжительность; однако симптомы обычно устраняются самопроизвольно в течение от 7 до 10 дней, при этом проявление некоторых симптомов может продолжаться до трех недель. У детей кашель продолжается более 10 дней в 35-40% и продолжается более 25 дней в 10% случаев. Простуда является наиболее частым инфекционным заболеванием у людей, при этом средний взрослый заражается инфекцией от двух до четырех раз в год, а средний ребенок в возрасте от 6 до 12 лет заражается инфекцией несколько раз в год. В США частота возникновения форм простуды является более высокой в осенний период (осенью) и зимой, при этом большинство инфекций наблюдаются в период с сентября по апрель. Сезонность может быть связана с началом учебного года или связана с тем, что люди проводят больше времени в помещении (в непосредственной близости друг к другу), что повышает вероятность передачи вируса.
ИНФЕКЦИОННЫЙ ПЕРИОД
Простуда является наиболее заразной в течение первых двух-трех дней проявления симптомов, однако он также является заразным в течение двух дней до появления симптомов и может все еще оставаться в некоторой степени заразной до полного устранения симптомов.
РИНОВИРУС ЧЕЛОВЕКА
Риновирус человека является представителем рода Enterovirus семейства Picornaviridae. Частица HRV состоит из безоболочечного капсида размером 27-30 нм, состоящего из 4 полипептидов (VP1, VP2, VP3 и VP4). Капсид вируса содержит геном в виде одноцепочечной РНК, состоящей из приблизительно 7200 оснований. Белок, кодируемый вирусом (VPg), ковалентно присоединен к 5'концу РНК генома. Клиническое течение инфекции, вызванной риновирусом человека (HRV), было хорошо охарактеризовано. HRV могут инфицировать верхние и нижние дыхательные пути, слизистую оболочку носа, носовые пазухи и среднее ухо, и инфекции вызывают симптомы “простуды” (см. выше). Инфекции являются локальными и, как правило, ограничиваются верхними дыхательными путями. Число периферических лейкоцитов может быть повышенным в течение первых 2-3 дней инфекции.
Инфицирование HRV может также приводить к инфекции нижних дыхательных путей, отиту среднего уха (особенно у маленьких детей) и синуситу. Серьезные осложнения риновирусной инфекции (такие как пневмония) являются редкими, и сообщалось, что они наблюдаются у младенцев и маленьких детей, особенно у таковых с первопричинными патологическими состояниями, такими как бронхолегочная дисплазия, врожденный порок сердца, недоношенность и неврологические состояния, и у взрослых с ослабленным иммунитетом (у реципиентов трансплантированного костного мозга). При том, что другие представители семейства Picornaviridae (т.е. вирус полиомиелита, энтеровирус) могут инфицировать центральную нервную систему, об инфекции центральной нервной системы человека, вызываемой HRV, не сообщалось.
ЛЕЧЕНИЕ
Не существует коммерческих противовирусных средств для лечения риновирусных инфекций или предупреждения форм насморка. Лечение инфекций верхних дыхательных путей, вызываемых риновирусами, основано на контроле симптомов (чихания, заложенности носа, ринореи, раздражения глаз, боли в горле, кашля, головных болей, лихорадки, озноба), как правило, при помощи безрецептурных антигистаминных средств, аспирина, средств от кашля и средств против заложенности носа. Контроль более серьезных осложнений инфекций, вызываемых HRV (например, пневмонии), осуществляют при помощи подходящих с медицинской точки зрения стандартов ухода.
СТОИМОСТЬ И МЕДИЦИНСКАЯ НЕОБХОДИМОСТЬ
Согласно данным Всемирной организации здравоохранения в прошлом году в США сообщалось о более чем 1 миллиарде случаев простуды. В США простуда приводит к 75-100 миллионам визитов к врачу ежегодно, при этом их стоимость по предварительным подсчетам составляет 7,7 миллиарда долларов в год. Американцы тратят 2,9 миллиарда долларов на безрецептурные лекарственные средства и еще 400 миллионов долларов на рецептурные лекарства для облегчения симптомов. По оценкам ежегодно пропускается 22-189 миллионов дней занятий в школе в связи с простудой. В результате родители пропускают 126 миллионов рабочих дней, оставаясь дома для ухода за своими детьми. Вдобавок к 150 миллионам рабочих дней, пропускаемых работниками, страдающими простудой, общее экономическое влияние нетрудоспособности, связанной с простудой, превышает 20 миллардов долларов в год. Это составляет 40% потерянного рабочего времени.
Эпителиальные клетки дыхательных путей являются основной мишенью для возбудителей инфекции верхних дыхательных путей (URT), таких как рино- и коронавирусы. Поскольку инфекция, вызываемая этими вирусами, наблюдается до появления симптомов, отражающих элиминацию инфицированных клеток иммунной системой, прямое противовирусное терапевтическое вмешательство вряд ли окажется очень эффективным. В дополнение, установление и поддержание активных уровней противовирусных соединений прямого действия в слизистой оболочке носа является очень сложным в связи с высокими темпами их метаболизма. С другой стороны, ранее было показано, что профилактика путем задействования собственных защитных сил организма и индукции противовирусного состояния в эпителиальных клетках носа приводит к значительной защите от последующего контрольного заражения вирусом, а также к снижению интенсивности симптомов, связанных с заболеванием.
Хотя простуды могут продолжаться в течение только одной или двух недель, тяжелые простуды могут продолжаться до месяца. Взрослые в среднем заболевают простудой два-три раза в год, а дети - от шести до десяти в зависимости от их возраста и продолжительности контакта. Существуют сотни различных серотипов вируса простуды, что делает невозможным разработку стандартной схемы вакцинопрофилактики, которая была бы эффективной против всех из них.
Симптоматическое лечение обычно включает применение снотворных антигистаминных средств для перорального применения и/или сосудосуживающих средств против заложенности носа, обладающих стимулирующими побочными эффектами. Это является эффективным лишь в незначительной степени, и эти побочные эффекты часто ослабляются по мере ослабления самой инфекции. Хотя предотвращение было бы оптимальным решением, по причинам, перечисленным выше, вероятность создания эффективной вакцины широкого спектра действия против всех различных серотипов в ближайшем будущем является весьма малой. Таким образом, люди, в отношении которых не применяется карантин, будут регулярно подвергаться воздействию этих возбудителей инфекции, особенно в течение “холодного времени года”, и, следовательно, подходящее эффективное профилактическое средство широкого спектра действия, не обладающее побочными эффектами, будет оказывать значительное влияние на состояние здоровья населения и производительность на рабочем месте.
Целенаправленное воздействие на врожденную иммунную реакцию, “систему раннего предупреждения” организма, будет решать вышеупомянутые проблемы. Соответствующая стимуляция этой системы, имеющейся в эпителиальных клетках носа, приводит к тому, что клетки думают, что они атакованы вирусом, и запускает противовирусную защитную реакцию. Как только это происходит, клетки становятся невосприимчивыми к последующей атаке вируса. Хотя в некоторых ранних работах, выполненных в конце 1980-х гг., рассматривалось применение иммуностимулирующих молекул, таких как интерферон, для запуска врожденной иммунной реакции, их производство было дорогостоящим, а эффекты сложно было контролировать.
Целью настоящего исследования была разработка состава на основе запускающей молекулы (Poly(I:C)), который можно применять измеримым и контролируемым способом, например, каждые два дня или даже раз в неделю, для приведения в готовность врожденной иммунной системы и обеспечения защиты от вирусной инфекции. В подходе, изложенном ниже, используют существующее средство, Poly(I:C), которое продемонстрировало эффективность, но которое является непрактичным, и делают его подходящим и эффективным, применяя знания о составах.
Toll-подобный рецептор 3 (TLR3) представляет собой белок, который у людей кодируется геном TLR3. TLR3 является представителем семейства Toll-подобных рецепторов в составе образраспознающих рецепторов врожденной иммунной системы, который играет фундаментальную роль в распознавании патогенов и активации врожденного иммунитета. В ряду от дрозофил до людей TLR являются высококонсервативными и обладают структурными и функциональными сходствами. Они распознают патоген-ассоциированные молекулярные образы (PAMP), экспрессируемые возбудителями инфекции, и опосредуют выработку цитокинов, необходимых для развития эффективного иммунитета. Различные TLR проявляют разные паттерны экспрессии. Этот рецептор TLR3 также экспрессируется эпителиальными клетками дыхательных путей и ограничен субпопуляцией дендритных клеток в составе лейкоцитов.
TLR3 распознает двухцепочечную РНК (dsRNA). Двухцепочечная РНК представляет собой РНК с двумя комплементарными цепями, которая может быть образована в ходе цикла репликации вируса. После распознавания TLR 3 индуцирует активацию факторов транскрипции, таких как NF-κB и регуляторный фактор интерферонов 3 (IRF3), для увеличения выработки интерферонов I типа, которые передают сигналы другим клеткам для усиления их противовирусных защитных реакций.
Структура TLR3 представлена в форме большой подковы, которая соединяется с соседней подковой, образуя "димер" из двух подков. Значительная часть поверхности белка TLR3 покрыта молекулами сахаров, что делает его гликопротеином, но на одной внешней стороне (в том числе на предполагаемой границе контакта между двумя подковами) имеется большая поверхность, на которой не содержатся сахара. Эта поверхность также содержит два различных участка, богатых положительно заряженными аминокислотами, которые могут быть местом связывания с отрицательно заряженной двухцепочечной РНК.
Полиинозиновая-полицитидиловая кислота (Poly(I:C)) является двухцепочечной молекулой РНК с распределением по MW до 1000000 дальтон. Poly(I:C) является лигандом Toll-подобного рецептора 3 (TLR3), который имитирует вирусную РНК и является известным стимулятором врожденной иммунной реакции. При назальном введении он индуцирует экспрессию противовирусных белков, таких как интерферон α и β, в назальном эпителии. Было продемонстрировано, что он уменьшает количество и тяжесть риновирусных инфекций.
Poly(I:C) является нестабильной молекулой в водных растворах. На данный момент, чтобы достичь эффективного терапевтического или профилактического эффекта, Poly(I:C) необходимо повторно растворить непосредственно перед применением и вводить каждые 2 часа. Для улучшения комплаентности пациентов и снижения частоты введения дозы был разработан новый состав, являющийся стабильным и демонстрирующий повышенную эффективность.
Poly(I:C) составлялась с несколькими биоадгезивными полимерами, могущими продлевать время пребывания в назальном эпителии и обеспечивать более эффективную и регулируемую стимуляцию врожденной иммунной системы.
Настоящее изобретение обеспечивает определение уникального состава, который можно хранить почти неограниченно при комнатной температуре и который сохраняет свою стимулирующую активность в отношении врожденной иммунной системы.
В дополнение, состав повышает эффективность Poly(I:C) и позволяет осуществлять гораздо менее частое введение дозы при даже большей стимулирующей активности в отношении TLR3.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к композиции, содержащей микрочастицы полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (Poly(I:C)) и полимера-носителя, выбранного из крахмала, альгината, бланозы или DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолина). Микрочастицы являются частицами со средним размером частицы от 0,1 мкм до 100 мкм. Предпочтительно, полимер-носитель представляет собой крахмал, полученный из кукурузы, картофеля или маниока.
Микросферы на основе поли(I:C) и полимера-носителя, или также так называемые микрочастицы, содержащиеся в композиции, получают посредством способа образования частиц, такого как способ распылительной сушки.
Соотношение Poly(I:C)/крахмал согласно настоящему изобретению варьируется в диапазоне от 1/200 (вес/вес) до 1/0,1 (вес/вес), но предпочтительно от 1/100 (вес/вес) до 1/1 (вес/вес) и даже более предпочтительно от 1/100 (вес/вес) до 1/5 (вес/вес), при этом соотношение Poly(I:C)/крахмал от 1/12 до 1/9 (вес/вес) является наиболее предпочтительным.
Dv50 (= суммарный показатель объемного распределения, соответствующий размеру, который не превышают 50% частиц) микрочастиц в композиции согласно настоящему изобретению варьируется в диапазоне от 0,1 микрометра до 200 микрометров, предпочтительно от 1 микрометра до 50 микрометров, более предпочтительно от 2 микрометров до 40 микрометров, еще более предпочтительно от 2 микрометров до 20 микрометров и наиболее предпочтительно от 10 микрометров до 20 микрометров.
Композиция по настоящему изобретению может также быть жидкой композицией, содержащей органический растворитель, где органический растворитель является таковым на основе глицерина, или этанола, или их комбинации.
Композицию по настоящему изобретению можно применять в медицине предпочтительно для применения в предотвращении и/или лечении вирусных инфекций верхних дыхательных путей, например, называемых “простудами”.
Композицию по настоящему изобретению могут применять пациенты, страдающие от астмы и/или COPD (хронического обструктивного заболевания легких), в целях возможного предотвращения и/или лечения наступающих симптомов простуды.
Предпочтительный способ предупреждения и/или лечения инфекций верхних дыхательных путей осуществляют путем назального введения.
Композицию по настоящему изобретению, содержащую микрочастицы полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (поли(I:C)) и полимера-носителя, выбранного из крахмала, альгината, бланозы или DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолина), можно применять для лечения и/или предотвращения (вирусных) инфекций или простуды, при этом композиция вводится посредством внесения в нос с промежутком времени, который находится в диапазоне от одного дня до одного месяца, более предпочтительно каждые два дня или даже раз в неделю.
Вышеупомянутую композицию, в которой соотношение Poly(I:C)/крахмал варьируется в диапазоне от 1/200 (вес/вес) до 1/0,1 (вес/вес), но предпочтительно от 1/100 (вес/вес) до 1/1 (вес/вес) и даже более предпочтительно от 1/100 (вес/вес) до 1/5 (вес/вес), при этом соотношение Poly(I:C)/крахмал от 1/12 до 1/9 (вес/вес) является наиболее предпочтительным, в сочетании с размером микрочастиц в композиции, варьирующимся в диапазоне от 0,1 микрометра до 200 микрометров, предпочтительно от 1 микрометра до 50 микрометров, более предпочтительно от 2 микрометров до 40 микрометров, еще более предпочтительно от 2 микрометров до 20 микрометров и наиболее предпочтительно от 10 микрометров до 20 микрометров, можно применять для лечения и/или предотвращения (вирусных) инфекций или простуды, при этом указанная композиция вводится посредством внесения в нос с промежутком времени, который находится в диапазоне от одного дня до одного месяца, более предпочтительно каждые два дня или даже раз в неделю.
Частью настоящего изобретения также является устройство, в частности, система назальной доставки, содержащее композицию согласно настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению Poly(I:C) составляют в виде сухого порошка для назального введения. Для улучшения стабильности Poly(I:C) подвергают распылительной сушке из водной смеси, содержащей высушенный в барабанной сушилке крахмал из восковой кукурузы и Poly(I:C).
Полагают, что крахмал имеет двойную функцию: (1) действует в качестве биоадгезивного средства в носу, (2) амилопектин, присутствующий в высокой концентрации в крахмале из восковой кукурузы, разрушается амилазами в носу с высвобождением Poly(I:C).
Назальное введение предпочтительно выполняют при помощи устройства для введения разовой дозы назального порошка (однодозовое устройство, поставляемое Aptar Pharma, Германия). Однодозовое устройство представляет собой систему активной доставки, что означает, что пациенту не нужно вдыхать, а действие не зависит от пациента. Введение дозы осуществляется путем приведения в действие, контролируемого избыточным давлением. Объем дозы в расчете на одно впрыскивание определяется по концентрации Poly(I:C) в подвергнутом распылительной сушке порошке и отгруженной массе порошка. Порошок будет вводиться в каждую ноздрю с применением нового устройства для каждого впрыскивания.
Как упоминалось ранее, Poly(I:C) представляет собой синтетическую двухцепочечную РНК, состоящую из антипараллельных полинуклеотидных цепей натриевых солей инозиновой кислоты и цитидиловой кислоты. Цепи нековалентно связаны водородными связями, образованными между инозиновыми и цитозиновыми основаниями.
Средняя длина цепи Poly(I:C) варьируется в диапазоне от 300 до 6000 пар оснований, что соответствует от приблизительно 180000 до 3600000 дальтон. Молекулярная формула представляет собой (C10H10N4NaO7P)x⋅(C9H11NaN3O7P)x.
Figure 00000001
Вышеупомянутый Poly(I:C) можно закупить, но также можно необязательно получить своими силами, применяя, например, следующую процедуру.
Двойной продукт Poly(I:C) изготавливают из отдельных гомополимеров полиинозина (I) и полицитидина (C). Поли I и поли C синтезируют путем полимеризации нуклеозиддифосфатов инозина и цитидина по отдельности в присутствии полинуклеотида фосфорилазы (PNPase). Каждый нуклеозиддифосфат по отдельности полимеризуется с помощью PNPase в течение 20–24 ч. для контроля длины получаемого в результате полимера рибонуклеиновой кислоты. Затем добавляют фермент, протеинкиназу, для завершения реакции полимеризации. Полученные в результате гомополимеры (т.е. одноцепочечные молекулы РНК) подвергают гидролизу для контроля того, чтобы диапазон молекулярных масс каждого полимерного продукта находился в установленных пределах. Гидролизованный продукт обрабатывают этанолом для осаждения одноцепочечных молекул РНК (ssRNA) из раствора. Осадок отделяют от надосадочной жидкости и растворяют в воде. Раствор ssRNA затем фильтруют с удалением макрочастиц, подвергают ультрафильтрации с удалением низкомолекулярных загрязняющих примесей и затем лиофилизируют. Лиофилизированные продукты в виде ssRNA по отдельности тестируют в отношении чистоты, молекулярной массы и других показателей качества для обеспечения соответствия продуктов установленным требованиям.
Отдельные одноцепочечные гомополимеры (поли I и поли C) по отдельности растворяют в 0,015 M хлориде натрия и затем в сочетании с отжигом цепей формируют двухцепочечный двойной продукт (поли I:поли C). После смешивания полученный в результате раствор фильтруют. Фильтрат подвергают ультрафильтрации с удалением низкомолекулярных загрязняющих примесей. Подвергнутый ультрафильтрации продукт затем лиофилизируют. Полученный в результате двойной продукт хранят при -20°C. Лиофилизированный продукт в виде dsRNA тестируют в отношении чистоты, молекулярной массы и других показателей качества для обеспечения соответствия продукта установленным требованиям.
Материалы и способы
Натриевые соли полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (Poly(I:C), Midland Certified Reagent Company Inc (Техас, США), № партии 020905, частично прежелатинизированный кукурузный крахмал, Stada AG (Бад-Фильбель, Германия), № партии 93301-9628, натрий-карбоксиметилцеллюлоза (бланоза 7MF), Ashland Aqualon (Уилмингтон, Делавэр, США) № партии 3-30172, дипальмитоилфосфатидилхолин (Lipoid PC 16:0/16:0), Lipoid GmbH (Людвигсхафен, Германия), № партии 563098-01/049, моногидрат лактозы (#316 Fast Flo), Foremost (Барабу, Висконсин, США), № партии 8509052261, альгинат натрия (Protanal LF10/60LS), FMC Biopolymer (Драммен, Норвегия), № партии S19616, абсолютный этанол Chem-Lab (Зедельгем, Бельгия), № партии 17.2712904.400.
Биологическая активность Poly(I:C) in vitro
Клетки A549, чувствительные к Poly(I:C) (эпителиальные клетки альвеолярной карциномы человека), инфицировали вектором, содержащим длинный промотор гена IFN-β1 (положения 21069463-21067869 в хромосоме 9), объединенный с конструктом на основе гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) и гена люциферазы Renilla (конструктом B1L-GAR5). После стимуляции с помощью Poly(I:C) активируется сигнальный путь IFN, что в результате приводит к активации конструкта с репортерами B1L-GAR5 и экспрессии генов-репортеров GFP и люциферазы. Для получения клона клеток с высокой реактивностью клетки, стимулированные с помощью Poly(I:C), сортировали по высокому уровню экспрессии GFP с помощью проточного цитометра FACS Aria (Becton Dickinson), и из >200 клонов выбрали клон H10 на основе % клеток, реактивных в отношении Poly(I:C). Клетки A549-B1L-GAR5-H10 выращивали до достижения клетками конфлюэнтности во флаконах для тканевых культур, после чего среду обновляли, а клетки культивировали в течение дополнительных четырех дней. Затем клетки собирали при помощи стандартной трипсинизации, подсчитывали и высевали на 96-луночные плоскодонные планшеты при 50000 клеток на лунку и стимулировали в течение ночи интерфероном β (75 ЕД/мл) в 100 мкл. На следующий день к клеткам добавляли 100 мкл смесей Poly(I:C) и полимера-носителя в соотношении Poly(I:C):полимер = 1:5, в результате чего получали конечный объем 200 мкл, и клетки инкубировали в течение дополнительных 24 ч. После инкубирования клетки собирали (при помощи разделения, опосредованного трипсином) и анализировали на проточном цитометре BD-Calibur.
Распылительная сушка Poly(I:C) с полимерами-носителями
Способ распылительной сушки альгината, CMC (бланозы) и частично прежелатинизированного кукурузного крахмала осуществляли в нанораспылительной сушилке B90 и в распылительной мини-сушилке Buchi B290 (Buchi, Флавиль, Швейцария). Как правило, эксперименты по распылительной сушке с помощью нанораспылительной сушилки B90 обуславливали низкие выходы по причине высокой вязкости растворов. Деминерализованную воду фильтровали при помощи фильтра из ацетата целлюлозы на 0,2 микрона (Whatman FP30/0,2 CA-S) и добавляли в аналитический стакан. Наполнители добавляли при перемешивании с помощью магнитной мешалки. После полного растворения в раствор добавляли Poly(I:C). Для всех вариантов применяли общую концентрацию твердых веществ 0,5% (вес/вес) и соотношение Poly(I:C)/наполнитель 1/9 (вес/вес). Составы исходных растворов приведены в таблице 1A.
Таблица 1A
Составы исходных смесей для вариантов с альгинатом, CMC и частично прежелатинизированным кукурузным крахмалом
материал Количество (г)
альгинат CMC частично прежелатинизированный кукурузный крахмал
альгинат Na (Protanal LF 10/60LS) 1,35
Na-CMC (бланоза 7 MF) 1,35
DDWM 1,35
Poly(I:C) 0,15 0,15 0,15
Деминерализованная вода 300 300 300
Для варианта DPPC-Poly(I:C) определяли растворимость DPPC (дипальмитоилфосфатидилхолин) в различных смесях этанол/вода. При распылительной сушке чистого DPPC получаемый выход был низким и составлял примерно 25%. Поэтому рассматривали возможность добавления материала-носителя. По причине осаждения Na-CMC, альгината Na, крахмала из восковой кукурузы и мальтодекстрина при добавлении этанола в качестве носителя для распылительной сушки Poly(I:C) с DPPC выбрали лактозу. Деминерализованную воду фильтровали при помощи фильтра из ацетата целлюлозы на 0,2 микрона (Whatman FP30/0,2 CA-S) и добавляли в аналитический стакан. Лактозу добавляли при перемешивании с помощью магнитной мешалки. После растворения оба раствора смешивали и нагревали до 60°C. После полного растворения раствор охлаждали до комнатной температуры и добавляли Poly I:C. Применяли общую концентрацию твердых веществ 0,28% (вес/вес) и соотношение Poly(I:C)/лактоза/DPPC 1/2,25/6,75 (вес/вес/вес). Состав исходного раствора показан в таблице 1B.
Таблица 1B
Составы исходных смесей для вариантов с DPPC
Материал Количество (г)
DPPC
DPPC (Lipoid PC 16:0/16:0) 1,35
Абсолютный этанол 430,80
Моногидрат лактозы (#316 Fast Flo) 0,45
Poly(I:C) 0,20
Деминерализованная вода 287,20
Распылительную сушку этих растворов осуществляли в лабораторной распылительной сушилке типа B 290 с петлей для инертного газа (Buchi, Флавиль, Швейцария). Растворы подавались в двухпоточную форсунку (диаметр: 0,7 мм) в верхней части распылительной сушилки посредством перистальтического насоса типа 520U (Watson Marlow, Корнуолл, Великобритания). Распылительная сушилка функционировала в режиме параллельного потока азота. Подвергнутые распылительной сушке частицы собирали в резервуаре, присоединенном к циклонному уловителю. После сбора частиц циклонный уловитель охлаждали до комнатной температуры. Собранный порошок переносили в пузырьки из янтарного стекла в боксе биологической безопасности. Пузырьки продували азотом, закрывали и хранили при 5°C. Параметры способа приведены в таблице 2.
Таблица 2
Условия способа
Параметр способа Целевое значение
альгинат CMC частично прежелатинизированный кукурузный крахмал DPPC
Температура сушильного азота на входе (°C) 150 150 150 100
Температура сушильного азота на выходе (°C) 70 70 70 50
Скорость подачи (г/мин.) 4,0 4,1 4,0 5,3
Температура конденсатора (°C) NA NA NA 10
Аспирация сушильного азота (%) 100 100 100 100
Падение давления азота для мелкодисперсного разбрызгивания (бар) 0,3 0,3 0,3 0,3
Концентрация кислорода (%) <6 <6 <6 <6
Распылительная сушка дополнительных вариантов Poly(I:C) - частично прежелатинизированный кукурузный крахмал
Способ распылительной сушки осуществляли в распылительной мини-сушилке Buchi B290 (Buchi, Флавиль, Швейцария). Воду, не содержащую нуклеаз, добавляли в аналитический стакан, и частично прежелатинизированный кукурузный крахмал добавляли при перемешивании при помощи Ultra Turax T25 (Janke & Kunkel), пока крахмал полностью не диспергировался. Poly(I:C) растворяли в воде, не содержащей нуклеаз, и перемешивали с помощью магнитной мешалки, пока Poly(I:C) полностью не растворился. Растворенный Poly(I:C) добавляли к диспергированному крахмалу и перемешивали при комнатной температуре, раствор Poly(I:C) получали непосредственно перед распылительной сушкой. Применяли общую концентрацию твердых веществ 10% (вес/вес) или 0,45% и соотношение Poly(I:C)/крахмал 1/200-1/100-1/50-1/24-1/9 (вес/вес). Составы исходных смесей для этих составов показаны в таблице 3A.
Таблица 3A
Составы исходных смесей для вариантов с частично прежелатинизированным кукурузным крахмалом
Материал Количество (г)
1/200 10% 1/100 10% 1/50 10% 1/24 10% 1/9 10% 1/9 0,45%
Частично прежелатинизированный кукурузный крахмал (г) 50,25 25,25 25,5 12,5 9 4,5
Poly(I:C) (г) 0,25 0,25 0,500 0,500 1 0,5
Вода, не содержащая нуклеаз (г) 454,5 229,5 234 117 90 1106
Растворы подавались в двухпоточную форсунку (диаметр: 0,7 мм) в верхней части распылительной сушилки посредством перистальтического насоса. Распылительная сушилка функционировала в режиме параллельного потока азота. Подвергнутые распылительной сушке частицы собирали в резервуаре, присоединенном к циклонному уловителю. После сбора частиц стеклянный цилиндр и циклонный уловитель охлаждали до комнатной температуры. Собранный порошок переносили в бутылку из янтарного стекла, и эту бутылку помещали в алюминиевый пароизолированный пакет. Флаконы хранили при комнатной температуре. Параметры способа приведены в таблице 3B.
Таблица 3В
Условия способа
Параметр способа 200/1–100/1–50/1–24/1–9/1 10% вес/вес 9/1 0,45% вес/вес
Температура сушильного азота на входе (°C) 180 150
Температура сушильного азота на выходе (°C) 95-112 75-95
Скорость подачи (г/мин) 6-9 5-6
Температура конденсатора (°C) 10 10
Аспирация сушильного азота (%) 100 100
Падение давления азота для мелкодисперсного разбрызгивания (бар) 0,3 0,4
Концентрация кислорода (%) <6 <6
Сканирующая электронная микроскопия
На образцы напыляли частицы золота диаметром +/-30-50 нм. Изображения создавали с помощью сканирующего электронного микроскопа FEI типа Quanta 200F с детектором Эверхарта-Торнли.
Содержание воды - титрование по Карлу Фишеру
Содержание воды в вариантах определяли посредством прямого волюметрического титрования по Карлу Фишеру. Применяли титратор KF V30 (Mettler Toledo, США). Порошок (50-100 мг) переносили в сосуд для титрования, содержащий сухой метанол Hydranal® (Sigma Aldrich), и перемешивали в течение 300 секунд. Титрование осуществляли с помощью Hydranal® композита-2 (Sigma Aldrich) в концентрации 2 мг/мл при помощи бюретки на 5 мл. Для прекращения применяли величину дрейфа, определяющую окончание титрования, составляющую 15 мкг/мин. Образцы анализировали в трех повторностях.
Определение размера частиц
Существует тенденция к оценке данных по распределению размера частиц всего лишь на основе объемного распределения продуктов, представляющих интерес. Таким образом, оценка часто ограничивается сравнением суммарных показателей, соответствующих размеру, который не превышает определенная доля частиц - Dv10, Dv50 и Dv90.
Однако сравнение суммарных показателей, соответствующих размеру, который не превышает определенная доля частиц - dvx, не всегда может быть эффективным в связи с тем фактом, что различные методики и приборы без труда приводят к различным результатам.
В дополнение, из данных по распределению размера (или формы) частиц можно получить больше информации, рассматривая данные в другом аспекте (т.е. применяя другие параметры).
Для определения распределения размера частиц применяли способ тестирования на основе лазерной дифракции.
Анализ выполняли на лазерном дифрактометре Mastersizer 2000 от Malvern, оснащенном модулем диспергирования в жидкой среде Hydro2000S (или эквивалентной системой). Прибор применяют в режиме детекции при включенном синем свете в диапазоне размеров от 20 нм до 2 мм.
Тестирование составов in vivo в мышиной модели гриппа
Все исследования на животных были одобрены комитетом по этике и выполнялись согласно национальным и международным методическим указаниям. Применяли самок швейцарских мышей в возрасте 8-12 недель (Janvier). Все интраназальные обработки проводили под анестезией изофлураном. Для введения определенного количества жидкости каплю наносили непосредственно на верхушку ноздри, и посредством закрывания рта капле позволяли проникнуть через ноздрю в полость носа. Подвергнутые распылительной сушке порошки на основе Poly(I:C) и носителя были свежеприготовленными непосредственно перед каждым экспериментом и вводились в 15 мкл жидкости. Несоставленную Poly(I:C) вводили в натрий-фосфатном буфере (PBS), в концентрации 1 мг/мл. Предварительную обработку, как правило, проводили в день 2 или 3 перед контрольным заражением. Мышей подвергали контрольному заражению в день 0 с помощью 10×LD90 адаптированного к мышам H1N1 PR (FLU PR 1600517) в 25 мкл (контрольное заражение при высоком объеме) или с помощью 1×LD90 в 15 мкл (контрольное заражение при низком объеме). После контрольного заражения мышей отслеживали ежедневно в течение 14 дней путем определения веса и поведения, мышей подвергали эвтаназии, если потеря веса составляла >20% по сравнению с днем контрольного заражения или если в их поведении проявлялись вызывающие опасения признаки болезни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выбор полимеров-носителей
Требование к успешному варианту для предотвращения простуд состоит в том, что биологическая активность Poly(I:C) должна сохраняться в конечном составе. Таким образом, первым этапом в выборе полимеров-носителей для способа распылительной сушки было выявление полимеров, не ингибирующих способность Poly(I:C) к стимуляции выработки интерферона. Для этой цели ряд полимеров-носителей смешивали c Poly(I:C) в соотношении 5:1 (вес:вес) и добавляли в титрованных количествах к линии реактивных в отношении Poly(I:C) клеток, содержащих промотор гена интерферона и ген-репортер GFP (A549-IFN-GAR5, клон H10) (в отношении подробностей см. материалы и способы). Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°C и 5% CO2, после чего измеряли процентную долю GFP+ клеток на проточном цитометре. Повышение концентраций Poly(I:C) обуславливает большую процентную долю GFP+ клеток, что, таким образом, позволяет применять эту in vitro модель в оценке биологической активности смесей Poly(I:C) и носителей (фигура 1). Среди различных протестированных носителей альгинат Na, частично прежелатинизированный кукурузный крахмал, DPPC и бланоза не ингибируют способность Poly(I:C) к стимуляции выработки интерферона. В отличие от этого, карбопол, κ-каррагинан, хитозан и полиэтиламин ингибировали или полностью блокировали способность Poly(I:C) к стимуляции выработки интерферона. Исходя из этих результатов, для следующего этапа разработки состава выбрали носители, не воздействующие на Poly(I:C): альгинат Na (Protanal LF10/60LS, FMC Biopolymer), высушенный в барабанной сушилке крахмал из восковой кукурузы (Cargill, через Stada), DPPC (Lipoid PC 16:0/16:0, Lipoid) и Na-CMC (бланозу 7MF).
Альгинат Na представляет собой гелеобразующий полисахарид, состоящий из блоков маннуроновой (M) и гулуроновой (G) кислот. Прочность и эластичность геля определяются соотношением G/M. Na-CMC представляет собой производное целлюлозы с карбоксиметильными группами. Его часто применяют в назальных составах. Частично прежелатинизированный кукурузный крахмал представляет собой амилопектиновый крахмал, не вызывающий раздражение слизистой ткани. Три наполнителя - альгинат Na, Na-CMC и частично прежелатинизированный кукурузный крахмал - проявляют хорошие биоадгезивные свойства. DPPC представляет собой фосфолипид и основную составляющую легочного сурфактанта. Он может повышать всасывание при назальном введении.
Фигура 1. Способность Poly(I:C) и смесей Poly(I:C) и носителей к биологической стимуляции (выработки интерферона). Реактивные в отношении Poly(I:C) клетки с конструктом на основе гена-репортера GFP, экспрессируемого под контролем промотора гена интерферона β, инкубировали со смесями Poly(I:C) и носителей (в соотношении 1:5) в течение 24 часов и затем анализировали в отношении экспрессии GFP. Цифры на оси Y указывают на процентную долю GFP+ клеток среди общего количества живых клеток в образце. Цифры на оси X указывают на концентрацию Poly(I:C) в смеси. Приведены показательные результаты двух экспериментов.
Способ распылительной сушки и биологическая активность и стабильность вариантов
Способ распылительной сушки осуществляли в нанораспылительной сушилке B90 и в распылительной мини-сушилке Buchi B290 (Buchi, Флавиль, Швейцария). Как правило, эксперименты по распылительной сушке с помощью нанораспылительной сушилки B90 обуславливали низкие выходы по причине высокой вязкости растворов.
После выполнения каждого способа выход подсчитывали как количество порошка, собранное в резервуаре, деленное на теоретическое количество порошка, взвешенного для получения исходной смеси. Результаты приведены в таблице 4. Более низкий выход для варианта 4 можно объяснить наблюдаемым явлением скопления порошка в циклонном уловителе, что, возможно, обуславливается липкостью DPPC при локальной температуре в циклонном уловителе во время распылительной сушки.
Таблица 4
Выход, масса собранного порошка в сравнении с
теоретической массой
Вариант
альгинат (1) CMC (2) частично прежелатинизированный кукурузный крахмал (3) DPPC (4)
Технологический выход (% вес/вес) 77,7 74,1 86,2 52,0
Сканирующая электронная микроскопия
SEM-изображения подвергнутого распылительной сушке порошка показаны на фигуре 2.
Порошок в варианте 3 (частично прежелатинизированный кукурузный крахмал) состоит из сжатых сфер. В результате измерений соответствующего плацебо-порошка по методу лазерной дифракции получили размер частиц, при котором Dv50 составлял 4,5 микрометра.
Фигура 2. Полученная с помощью сканирующей электронной микроскопии картина подвергнутых распылительной сушке микрочастиц частично прежелатинизированного кукурузного крахмала-Poly(I:C).
Содержание воды
Определяли содержание воды в подвергнутом распылительной сушке порошке. Остаточная вода происходит из воды, поглощаемой из окружающей среды, и воды, применяемой в способе распылительной сушки.
Таблица 5
Содержание воды в вариантах после распылительной сушки
Вариант
альгинат (1) CMC (2) частично прежелатинизированный кукурузный крахмал (3) DPPC (4)
Содержание воды (% вес/вес) 8,2 7,48 7,38 3,61
Частично прежелатинизированный кукурузный крахмал, Na-CMC и альгинат Na являются гигроскопичными наполнителями, что является характеристикой, необходимой для биоадгезии посредством набухания и гелеобразования. Это отражено в результатах, приведенных в таблице 5. Для варианта 4 содержание воды оказалось более низким, чем таковое для вариантов 1-3, по всей вероятности, в связи с тем, что порошок из варианта 4 был подвергнут распылительной сушке в смеси этанол/вода. В дополнение, лактоза не является гигроскопичной, и поглощение воды ограничено в связи с липофильной природой DPPC в этом варианте.
Стабильность вариантов Poly(I:C) при комнатной температуре
Одной важной характеристикой состава против насморка является то, что вариант должен быть стабильным при комнатной температуре (RT) в целях способствования хранению и обеспечения активности активного компонента продукта. Однако Poly(I:C) является очень нестабильным при растворении в воде, содержащей растворители, поскольку он расщепляется путем гидролиза или с помощью ферментов РНКаз. В частности, о ферментах РНКазах известно, что они присутствуют повсеместно, и загрязнение РНКазами может привести в результате к быстрому распаду молекул РНК типа Poly(I:C).
Для тестирования стабильности четыре варианта хранили при комнатной температуре. Poly(I:C) в PBS, которые хранили при RT или при -20°C, применяли в качестве представителей контрольной группы. Спустя месяц хранения биологическую активность вариантов и представителей контрольной группы оценивали посредством измерения реакции с участием интерферона и репортеров, вызываемой вариантами в линии клеток, реактивных в отношении Poly(I:C). Все подвергнутые распылительной сушке варианты Poly(I:C) продемонстрировали неизменную активность по сравнению c Poly(I:C), хранившимся при -20°C, в отношении линии клеток, чувствительных к Poly(I:C) (фигура 3). В отличие от этого, Poly(I:C) в PBS, хранившиеся при RT, полностью утратили свою стимулирующую активность в отношении интерферона. Эти результаты показывают, что подвергнутые распылительной сушке составы являются весьма стабильными при хранении при комнатной температуре в отличие от Poly(I:C) в водосодержащих жидкостях.
Фигура 3. Стабильность вариантов Poly(I:C) спустя месяц хранения при комнатной температуре. Реактивные в отношении Poly(I:C) клетки с конструктом на основе гена-репортера GFP инкубировали со смесями Poly(I:C) и носителей в течение 24 часов и затем анализировали в отношении экспрессии GFP. Цифры на оси Y указывают на процентную долю GFP+ клеток среди общего количества живых клеток в образце. Цифры на оси X указывают на концентрацию Poly(I:C) в смеси. Приведены показательные результаты двух экспериментов.
Профилактика in vivo с применением мышиной модели с контрольным заражением гриппом
Из литературы известно, что Poly(I:C) обладает противовирусными эффектами. Однако, в целях демонстрации эффективности in vivo в мышиной модели гриппа, его следовало давать в последовательные дни или в водных/липосомальных составах. Еще в 1972 г. было показано, что Poly(I:C) был эффективным в качестве противовирусного средства профилактического лечения в испытании с участием людей, в котором добровольцев подвергали контрольному заражению риновирусом человека (HRV) или вирусом гриппа. В этом исследовании, однако, Poly(I:C) следовало давать каждые два часа. Поскольку подвергнутые распылительной сушке варианты демонстрировали сходную биологическую активность in vitro и повышенную стабильность при RT по сравнению c Poly(I:C) в PBS, их включили в тестирование in vivo в целях тестирования противовирусной активности различных вариантов. С этой целью мышей обрабатывали одной интраназальной дозой состава на основе Poly(I:C) (подвергнутого распылительной сушке) за несколько дней до контрольного заражения гриппом при высоком объеме (25 мкл) в день 0. Подвергнутые распылительной сушке варианты вносили с помощью небольшого объема (15 мкл) органических растворителей-носителей (этанола или этанола/глицерина 1/1 вес/вес) в целях предупреждения диссоциации частиц. Потерю веса (по сравнению с днем 0), общее поведение и выживаемость отслеживали в течение 14 дней (более подробно см. материалы и способы). Что интересно, наблюдали, что однократная обработка с помощью Poly(I:C) в PBS, а также подвергнутого распылительной сушке частично прежелатинизированного кукурузного крахмала-Poly(I:C) в PBS оказывала лишь весьма несущественный профилактический эффект при контрольном заражении гриппом, на что указывает незначительная защита мышей с точки зрения потери веса и выживаемости (таблица 6). Одно объяснение этого состоит в том, что подвергнутый распылительной сушке, частично прежелатинизированный кукурузный крахмал (I:C) растворяется в PBS и, таким образом, дает реакцию, сходную с таковой для Poly(I:C). Poly(I:C) в PBS был немного более эффективным, когда его давали в два последовательных дня, хотя отличие от наблюдаемого у мышей из контрольной группы плацебо было незначительным. На удивление, вариант частично прежелатинизированного кукурузного крахмала с Poly(I: C) в этаноле требовал всего лишь одной обработки с целью придания значительной защиты от контрольного заражения гриппом, что обуславливало превосходящую выживаемость. По-видимому, форма частиц частично прежелатинизированного кукурузного крахмала-Poly(I:C), представляющая собой микросферы, играет ключевую роль в механизме действия, обуславливающем превосходящую защиту от гриппа.
Таблица 6
Выживаемость мышей, подвергнутых контрольному заражению гриппом, обработанных (составленным) Poly(I:C)
Группы обработки* Подробная информация
растворитель Общее количество Poly(I:C) на мышь (мкг) % выживших мышей P-значение в сравнении с плацебо
Плацебо PBS 0 0 -
Poly(I:C), день -2 PBS 40 0 N.S.
Poly(I:C), дни -2, -1 PBS 80 20 N.S.
частично прежелатинизированный кукурузный крахмал-Poly(I:C) PBS 40 0 N.S.
частично прежелатинизированный кукурузный крахмал-Poly(I:C) этанол 40 60 0,04
* = 5 мышей на группу приведены показательные результаты двух экспериментов, P-значение рассчитано при помощи
статистического метода Каплана-Мейера с применением логарифмического рангового критерия. N.S. = незначимо
В следующем эксперименте определяли, имел ли этанол в качестве растворителя-носителя какой-либо эффект в отношении тяжести контрольного заражения гриппом. В таблице 7 показаны результаты для мышей, обработанных плацебо в этаноле, в сравнении с таковыми в случае PBS. В этом эксперименте контрольное заражение гриппом было немного менее интенсивным по сравнению с контрольным заражением, применяемым в эксперименте, описанном в таблице 6, что позволяло наблюдать положительный или отрицательный эффект предварительной обработки этанолом в отношении выживаемости после контрольного заражения гриппом. Наблюдали, что мыши, обработанные этанолом, испытывали очень похожую чувствительность к контрольному заражению гриппом по сравнению с мышами, предварительно обработанными PBS. Таким образом, был сделан вывод, что этанол не вносит активный вклад в противовирусный эффект и может, следовательно, применяться в качестве растворителя-носителя для интраназального введения, который сохраняет варианты в форме частиц-микросфер. Следует отметить, что несоставленную Poly(I:C) нельзя вносить в этаноле, поскольку Poly(I:C) осаждается в этаноле, что, таким образом, препятствует контролируемому внесению Poly(I:C).
Таблица 7
Выживаемость мышей, обработанных плацебо в этаноле и PBS, после контрольного заражения гриппом
Группы обработки* Подробная информация
Растворитель Общее количество Poly(I:C) на мышь (мкг) % выживших мышей P-значение в сравнении с плацебо
Плацебо PBS 0 33 -
Плацебо в этаноле Этанол 0 33 N.S.
* = 6 мышей на группу, P-значение рассчитано при помощи статистического метода Каплана-Мейера с применением логарифмического рангового критерия. N.S. = незначимо
На следующем этапе занимались вопросом изучения того, что является необходимым/достаточным для наблюдения противовирусных эффектов - распылительная сушка варианта с образованием частиц частично прежелатинизированного кукурузного крахмала-Poly(I:C) или всего лишь смешивание ингредиентов. Для этой цели смешивали сухой порошок Poly(I:C) с сухим порошком крахмала (получали смесь Poly(I:C) и крахмала) и сравнивали полученное с подвергнутым распылительной сушке крахмалом-Poly(I:C) и плацебо. Наблюдали (таблица 8), что смесь частично прежелатинизированного кукурузного крахмала и Poly(I:C) не оказывала значительного защитного эффекта в отношении контрольного заражения гриппом в отличие от подвергнутого распылительной сушке состава на основе частично прежелатинизированного кукурузного крахмала и Poly(I:C), который и в этом случае обуславливал превосходящую и значительную защиту от контрольного заражения гриппом.
Таблица 8
Выживаемость мышей, обработанных смесью частично прежелатинизированного кукурузного крахмала и Poly(I:C), после контрольного заражения гриппом по сравнению с таковой в случае распылительной сушки данных ингредиентов
Группы обработки* Подробная информация
Раствори-тель Общее количество поли(I:C) на мышь (мкг) % выживших мышей P-значение в сравнении с плацебо
Плацебо PBS 0 0 -
Смесь частично прежелатинизированного кукурузного крахмала и Poly(I:C)** этанол 10 25 N.S.
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал-Poly(I:C) этанол 10 60 0,03
* = 6 мышей на группу, ** = 4 мыши, P-значение рассчитано при помощи статистического метода Каплана-Мейера с применением логарифмического рангового критерия. N.S. = незначимо
В целях тестирования того, можно ли микрочастицы, подвергнутые распылительной сушке, также вводить в другом органическом растворителе, тестировали применение глицерина в качестве растворителя-носителя для микрочастиц Poly(I:C). Применение данного носителя также было возможным и обуславливало значительную защиту, хотя оказалось, что высокая вязкость глицерина несколько осложняет интраназальное внесение капель в нос. Поэтому тестировали смесь этанол/глицерин 1/1 для внесения микрочастиц. В таблице 9 показаны результаты этого эксперимента, и они четко указывают на то, что однократное введение микрочастиц в этаноле/глицерине обуславливает значительно улучшенную выживаемость после контрольного заражения гриппом по сравнению с плацебо (этанол/глицерин в отдельности).
Таблица 9
Выживаемость мышей, обработанных подвергнутым распылительной сушке, частично прежелатинизированным кукурузным крахмалом-Poly(I:C) с применением этанола/глицерина в качестве растворителя-носителя
Группы обработки* Подробная информация
растворитель Общее количество Poly(I:C) на мышь (мкг) % выживших мышей P-значение в сравнении с плацебо
Плацебо этанол/глицерин 0 0 -
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал-Poly(I:C) этанол/глицерин 10 78 <0,01
* = 9 мышей на группу, P-значение рассчитано при помощи статистического метода Каплана-Мейера с применением логарифмического рангового критерия.
На следующем этапе тестировали применение другого полимера-носителя в подвергнутом распылительной сушке составе на основе Poly(I:C). Для этой цели сравнивали мышей, обработанных плацебо, с мышами, обработанными Poly(I:C), и с таковыми, обработанными подвергнутым распылительной сушке, частично прежелатинизированным кукурузным крахмалом-Poly(I:C) либо подвергнутым распылительной сушке альгинатом Na-Poly(I:C). Наблюдали, что только подвергнутые распылительной сушке микрочастицы Poly(I:C) защищали мышей от значительной потери веса, вызываемой последующим контрольным заражением гриппом (см. таблицу 10). Poly(I:C) в отдельности не защищал от потери веса. Эти результаты указывают, что для придания существенной защиты от патогенного вируса требуется комбинация Poly(I:C) с полимером-носителем в подвергнутых распылительной сушке микрочастицах. Природа полимера-носителя является менее важной, поскольку структура микрочастиц сохраняется (см. таблицу 6, подвергнутый распылительной сушке, частично прежелатинизированный кукурузный крахмал-Poly(I:C) не является эффективным при растворении в PBS).
Таблица 10
Потеря веса мышей, обработанных подвергнутым распылительной сушке, частично прежелатинизированным кукурузным крахмалом-Poly(I:C) и альгинатом Na-Poly(I:C)
Группы обработки* Подробная информация
растворитель Общее количество Poly(I:C) на мышь (мкг) % веса, сохраня-ющегося ко дню 4 P-значение в сравнении с плацебо
Плацебо этанол/ глицерин 0 85,99 -
Poly(I:C) PBS 10 87,04 N.S.
Подвергнутый распылительной сушке, частично прежелатинизированный кукурузный крахмал-Poly(I:C) этанол/ глицерин 10 92,82 0,006
Подвергнутый распылительной сушке альгинат Na-Poly(I:C) этанол/ глицерин 10 90,91 0,007
* = 12 мышей на группу, P-значение рассчитано при помощи статистического метода с применением двухвыборочного t-критерия для независимых выборок. N.S.= незначимо
Наконец, сравнивали различные составы на основе частично прежелатинизированного кукурузного крахмала-Poly(I:C) друг с другом и с несоставленной Poly(I:C) в PBS с целью определения требуемой концентрации Poly(I:C) в составе, а также требуемого размера микрочастиц в составе. Для этой цели получали дополнительный, подвергнутый распылительной сушке, частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) в соотношениях 50/1 и 100/1, и 200/1, а также частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) с размером частиц (Dv50) 9 мкм (1/9, 0,45%) и (Dv50) 17 мкм (1/9, 10%), соответственно. Результаты сравнения этих составов с несоставленной Poly(I:C) показаны в таблице 11. Наблюдали, что концентрация Poly(I:C) от 1/100 до 1/9 обуславливает хорошую защиту от гриппа. Большее разбавление Poly(I:C) в крахмале обуславливало менее эффективную и незначительную защиту. В дополнение, не наблюдали больших различий между двумя партиями с разным размером частиц, что указывает на то, что размер частиц (Dv50) от 9 мкм до 18 мкм является достаточным для придания эффективной защиты с помощью микрочастиц Poly(I:C).
Таблица 11
Потеря веса мышей, подвергнутых контрольному заражению гриппом, обработанных дополнительными вариантами подвергнутого распылительной сушке частично прежелатинизированного кукурузного крахмала-Poly(I:C)
Группы обработки* Подробная информация
растворитель Общее количество Poly(I:C) на мышь (мкг) % веса, сохраняющегося ко дню 4 P-значение в сравнении с Poly(I:C) (PBS)
Poly(I:C) PBS 10 82,9 -
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) (50/1) этанол/глицерин 10 103,5 <0,02
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) (100/1) этанол/глицерин 10 97,2 <0,02
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) (200/1) этанол/глицерин 10 90,71 NS
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) (9/1, 0,45%) этанол/глицерин 10 99,62 <0,02
Подвергнутый распылительной сушке частично прежелатинизированный кукурузный крахмал/Poly(I:C) (9/1, 10%) этанол/глицерин 10 99,56 <0,02
* = 8 мышей на группу, P-значение рассчитано при помощи статистического метода с применением двухвыборочного t-критерия для независимых выборок. N.S. = незначимо
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
4 порошковых варианта были получены посредством распылительной сушки для назальной доставки Poly(I:C). Варианты с альгинатом Na (вариант 1), Na-CMC (вариант 2), частично прежелатинизированным кукурузным крахмалом (вариант 3) и DPPC (вариант 4) выбирали на основе скрининга биологической активности и технологических свойств. Все четыре варианта тестировали in vitro для определения биологической активности и стабильности Poly(I:C) в составе. Результаты указывают на то, что способ распылительной сушки не оказывал отрицательного эффекта на биологическую активность Poly(I:C). В дополнение, составы являются стабильными при комнатной температуре, в отличие от Poly(I:C), растворенного в PBS.
На следующем этапе тестировали варианты 1 и 3 при профилактике гриппа с применением мышиной модели с контрольным заражением гриппом. На основании литературных данных эксперименты начинали с предположением, что варианты 1 и 3 должны оказывать такой же защитный эффект, что и несоставленная Poly(I:C) (в PBS). На удивление, было обнаружено, что варианты 1 и 3 превосходили Poly(I:C) в защите мышей от последующего контрольного заражения гриппом. Как оказалось, однократная доза несоставленной Poly(I:C) является не очень эффективной в защите мышей, но чтобы Poly(I:C) была более эффективной, ее необходимо вводить несколько раз. Однократное введение составленной Poly(I:C) (варианты 1 и 3), однако, защищало мышей в значительной степени. Дополнительно, было показано, что структура микрочастиц является критически важной (поскольку микрочастицы, растворенные в PBS, теряли активность in vivo (таблица 6), но не in vitro (фигуры 1 и 2)). Для сохранения размера частиц микрочастицы вводили в растворителях-носителях этаноле или этаноле/глицерине. Размер частиц (DV50) от 9 микрометров до 17 микрометров был эффективным. Poly(I:C) была эффективной в разведениях от 100/1 до 9/1 (крахмал/Poly(I:C)).
Напоследок, идентифицировали новые варианты, улучшающие in vivo эффективность интраназального введения Poly(I:C) в однократной дозе в целях придания профилактической защиты от последующего смертельного контрольного заражения гриппом.

Claims (32)

1. Микрочастица для профилактики вирусной инфекции, состоящая из полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты, смешанных с одним или более полимерами-носителями и водой; причем каждый полимер-носитель выбран из крахмала, альгината, карбоксиметилцеллюлозы и дипальмитоилфосфатидилхолина.
2. Микрочастица по п.1, причем микрочастица получена способом образования частиц, представляющим собой способ распылительной сушки.
3. Микрочастица по п.1, в которой средняя длина цепи каждой из полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты составляет приблизительно от 300 до 6000 оснований.
4. Микрочастица по п.1, в которой каждая из полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты присутствует в форме натриевой соли.
5. Микрочастица по п.1, причем микрочастица состоит из одного полимера-носителя, воды, полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты.
6. Микрочастица по п.1, в которой по меньшей мере один полимер-носитель представляет собой крахмал.
7. Микрочастица по п.6, в которой полимер-носитель, представляющий собой крахмал, представляет собой частично прежелатинизированный крахмал.
8. Микрочастица по п.6, в которой полимер-носитель, представляющий собой крахмал, представляет собой кукурузный крахмал, картофельный крахмал или крахмал маниоки.
9. Микрочастица по п.7, в которой крахмал представляет собой частично прежелатинизированный кукурузный крахмал.
10. Микрочастица по п.6, в которой отношение в комбинации полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты к крахмалу варьирует от 1/200 до 1/0,1 (вес/вес).
11. Микрочастица по п.10, в которой отношение в комбинации полиинозиновой кислоты и полицитидиловой кислоты к крахмалу составляет от 1/12 до 1/9 (вес/вес).
12. Микрочастица по п.1, в которой по меньшей мере один полимер-носитель представляет собой альгинат, и альгинат представляет собой альгинат натрия.
13. Микрочастица по п.1, в которой по меньшей мере один полимер-носитель представляет собой дипальмитоилфосфатидилхолин.
14. Микрочастица по п.1, причем DV50 микрочастицы варьирует от 0,1 до 200 мкм.
15. Микрочастица по п.14, причем DV50 микрочастицы варьирует от 0,1 до 100 мкм.
16. Микрочастица по п.15, причем DV50 микрочастицы варьирует от 1 до 50 мкм.
17. Микрочастица по п.16, причем DV50 микрочастицы варьирует от 2 до 40 мкм.
18. Микрочастица по п.17, причем DV50 микрочастицы варьирует от 2 до 20 мкм.
19. Микрочастица по п.18, причем DV50 микрочастицы варьирует от 10 до 20 мкм.
20. Композиция для профилактики вирусной инфекции, содержащая множество микрочастиц по любому из пп. 1-19.
21. Композиция по п.20, причем композиция является жидкой.
22. Композиция по п.20, причем композиция содержит органический растворитель.
23. Композиция по п.22, в которой органический растворитель представляет собой глицерин, этанол или их комбинацию.
24. Композиция по п.20, причем композиция представляет собой сухой порошок.
25. Композиция по п.20, причем композиция является пригодной для назального введения.
26. Применение композиции по п.20 для получения лекарственного средства для профилактики вирусной инфекции верхних дыхательных путей путем назального введения композиции.
27. Применение композиции по п.26, причем вирусная инфекция представляет собой риновирусную инфекцию человека или инфекцию вируса гриппа.
28. Применение композиции для получения лекарственного средства для профилактики вирусной инфекции верхних дыхательных путей путем назального введения композиции, причем
композиция содержит множество микрочастиц;
микрочастицы содержат полиинозиновую кислоту и полицитидиловую кислоту, смешанные с одним или более полимерами-носителями и водой; и
причем каждый полимер-носитель выбран из крахмала, альгината, карбоксиметилцеллюлозы и дипальмитоилфосфатидилхолина.
29. Применение композиции по п.28, причем композиция состоит из множества микрочастиц.
RU2014148544A 2012-05-03 2013-05-02 Составы на основе полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly(i:с)) для лечения инфекций верхних дыхательных путей RU2650636C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12166595.4 2012-05-03
EP12166595 2012-05-03
PCT/EP2013/059079 WO2013164380A1 (en) 2012-05-03 2013-05-02 Polyinosinic-polycytidylic acid (poly (i:c)) formulations for the treatment of upper respiratory tract infections

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2014148544A RU2014148544A (ru) 2016-06-27
RU2650636C2 true RU2650636C2 (ru) 2018-04-16

Family

ID=48430695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014148544A RU2650636C2 (ru) 2012-05-03 2013-05-02 Составы на основе полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly(i:с)) для лечения инфекций верхних дыхательных путей

Country Status (18)

Country Link
US (3) US9682096B2 (ru)
EP (1) EP2846767B1 (ru)
JP (1) JP6349304B2 (ru)
KR (1) KR102240042B1 (ru)
CN (1) CN104394846B (ru)
AU (1) AU2013255885C1 (ru)
BR (1) BR112014026957A8 (ru)
CA (1) CA2866230C (ru)
CL (1) CL2014002929A1 (ru)
CO (1) CO7101247A2 (ru)
ES (1) ES2911116T3 (ru)
HK (1) HK1203390A1 (ru)
IN (1) IN2014MN02359A (ru)
MX (1) MX2014013256A (ru)
NZ (1) NZ630040A (ru)
RU (1) RU2650636C2 (ru)
SG (2) SG10201607288VA (ru)
WO (1) WO2013164380A1 (ru)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014026957A8 (pt) 2012-05-03 2018-01-16 Janssen R&D Ireland micropartícula, composição compreendendo a mesma, seu uso e sistema de distribuição nasal relacionados ao tratamento de infecções do trato respiratório superior
AU2014345667A1 (en) * 2013-11-06 2016-05-19 Janssen Sciences Ireland Uc Polyinosinic-polycytidylic acid (poly (i:c)) formulations for the treatment of upper respiratory tract infections
GB201415381D0 (en) * 2014-08-29 2014-10-15 Algipharma As Inhalable powder formulations of alginate oligomers
KR20180004233A (ko) * 2015-05-11 2018-01-10 얀센 사이언시즈 아일랜드 유씨 상기도 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 폴리이노신-폴리사이티딜산 (Poly (I:C)) 완두 전분 제형
ES2755418T3 (es) 2015-11-17 2020-04-22 Bioncotech Therapeutics S L Novedosa composición farmacéutica que comprende partículas que comprenden un complejo de un polirribonucleótido de doble cadena y una polialquilenimina
MX2018006575A (es) * 2015-11-30 2018-12-06 Novus Therapeutics Inc Composiciones y metodos para profilaxis otologica y tratamiento.
US20200060972A1 (en) 2016-11-16 2020-02-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Formulations of polyinosinic acid and polycytidylic acid for the prevention of upper respiratory tract infections
DK3448363T3 (da) 2017-05-17 2022-08-08 Highlight Therapeutics S L Hidtil ukendt, farmaceutisk sammensætning, der omfatter partikler omfattende et kompleks af et dobbeltstrenget polyribonukleotid og en polyalkylenimin
CA3105283A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 Xinfu (Beijing) Medical Technology Co., Ltd. Method for preparing composite for enhancing immune response

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050244505A1 (en) * 2003-12-11 2005-11-03 Higbee Russell G Immunotherapy compositions, method of making and method of use thereof
WO2009116960A1 (ru) * 2008-03-19 2009-09-24 Noga David Anatol Evich Фармацевтическая композиция и способ её получения
CN101757018A (zh) * 2008-12-24 2010-06-30 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种用于畜禽的聚肌胞干粉及其制备方法

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8723846D0 (en) 1987-10-10 1987-11-11 Danbiosyst Ltd Bioadhesive microsphere drug delivery system
US5707644A (en) * 1989-11-04 1998-01-13 Danbiosyst Uk Limited Small particle compositions for intranasal drug delivery
ATE154241T1 (de) 1991-10-01 1997-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Mikropartikeln-zusammenfassung zur verlängerten freigabe und herstellung derselbe
GB9606188D0 (en) * 1996-03-23 1996-05-29 Danbiosyst Uk Pollysaccharide microspheres for the pulmonary delivery of drugs
AR012448A1 (es) 1997-04-18 2000-10-18 Ipsen Pharma Biotech Composicion en forma de microcapsulas o de implantes que comprende un excipiente biodegradable, polimero o co-polimero, o una mezcla de talesexcipientes, y una sustancia activa o una mezcla de sustancias activas, procedimiento para la preparacion de una sustancia soluble en agua de elevada
CA2203843C (en) 1997-04-28 2013-07-23 Her Majesty The Queen, In Right Of Canada, As Represented By The Ministe R Of National Defence Liposome-encapsulated poly iclc
MA25590A1 (fr) * 1998-09-14 2002-12-31 Inhale Therapeutic Syst Agent actif de delivraison de poudre seche
KR20030051687A (ko) * 2000-10-06 2003-06-25 자고텍 아게 분자량이 감소된 정제 아밀로펙틴-기제 녹말을 갖는서방투여용 생분해성 미세입자
AU2003287332A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
US7638138B2 (en) 2003-02-21 2009-12-29 Translational Research, Ltd. Compositions for nasal administration of pharmaceuticals
JP4817625B2 (ja) 2003-08-11 2011-11-16 一般財団法人阪大微生物病研究会 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン
CN101229378A (zh) 2005-05-05 2008-07-30 国家淀粉及化学投资控股公司 用于送递活性剂的组合物
PL1898948T3 (pl) 2005-06-08 2012-06-29 Yisheng Biopharma Singapore Pte Ltd Adiuwant na bazie kwasu poliinozynowego i policytydylowego
US20070166239A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-19 Haixiang Lin Mucosal immunogenic substances comprising a polyinosinic acid - polycytidilic acid based adjuvant
GB0607534D0 (en) 2006-04-13 2006-05-24 Univ London Pharmacy Colonic drug delivery formulation
PL2046740T3 (pl) 2006-07-22 2012-10-31 Oxagen Ltd Związki o aktywności antagonisty CRTH2
CL2007002218A1 (es) 2006-08-03 2008-03-14 Celgene Corp Soc Organizada Ba Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa.
AR067997A1 (es) * 2007-08-24 2009-10-28 Novartis Ag Compuestos organicos
JP2009209086A (ja) * 2008-03-04 2009-09-17 Masami Moriyama 粘膜投与型ワクチン
EP2116602A1 (en) 2008-05-07 2009-11-11 Institut Gustave Roussy Combination products for treating cancer
EP2379059A4 (en) * 2008-12-10 2012-10-31 Anhui Zhongren Technology Co Ltd COMPOSITION WITH CONTROLLED RELEASE
CN101491503A (zh) 2008-12-17 2009-07-29 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种用于宠物的聚肌胞滴丸及其制备方法
LT3098239T (lt) 2008-12-22 2020-02-10 Targimmune Therapeutics Ag Į egfr nukreipiamas dvigrandis rnr vektorius, skirtas sisteminiam vėžio gydymui
JP5762307B2 (ja) 2009-03-31 2015-08-12 国立感染症研究所長 経鼻投与用ワクチンを用いるインフルエンザの予防方法
JP2013535457A (ja) 2010-07-28 2013-09-12 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 呼吸器系及び炎症性疾患の治療用医薬組成物
US8431155B1 (en) 2012-04-30 2013-04-30 Veroscience Llc Bromocriptine formulations
BR112014026957A8 (pt) 2012-05-03 2018-01-16 Janssen R&D Ireland micropartícula, composição compreendendo a mesma, seu uso e sistema de distribuição nasal relacionados ao tratamento de infecções do trato respiratório superior
AU2014345667A1 (en) 2013-11-06 2016-05-19 Janssen Sciences Ireland Uc Polyinosinic-polycytidylic acid (poly (i:c)) formulations for the treatment of upper respiratory tract infections

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050244505A1 (en) * 2003-12-11 2005-11-03 Higbee Russell G Immunotherapy compositions, method of making and method of use thereof
WO2009116960A1 (ru) * 2008-03-19 2009-09-24 Noga David Anatol Evich Фармацевтическая композиция и способ её получения
CN101757018A (zh) * 2008-12-24 2010-06-30 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种用于畜禽的聚肌胞干粉及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Малая медицинская энциклопедия. Том 2 / гл. редактор В.И. Покровский // Издательство "Советская энциклопедия", 1991 г. С.319-336. *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2866230C (en) 2020-08-18
CN104394846A (zh) 2015-03-04
NZ630040A (en) 2016-10-28
HK1203390A1 (en) 2015-10-30
JP2015515968A (ja) 2015-06-04
IN2014MN02359A (ru) 2015-08-14
EP2846767B1 (en) 2022-01-26
AU2013255885A1 (en) 2014-09-25
US20180325939A1 (en) 2018-11-15
EP2846767A1 (en) 2015-03-18
US9987300B2 (en) 2018-06-05
US10485816B2 (en) 2019-11-26
BR112014026957A2 (pt) 2017-06-27
JP6349304B2 (ja) 2018-06-27
CA2866230A1 (en) 2013-11-07
AU2013255885B2 (en) 2017-10-05
CO7101247A2 (es) 2014-10-31
SG10201607288VA (en) 2016-10-28
WO2013164380A1 (en) 2013-11-07
ES2911116T3 (es) 2022-05-17
RU2014148544A (ru) 2016-06-27
MX2014013256A (es) 2015-01-16
KR102240042B1 (ko) 2021-04-14
BR112014026957A8 (pt) 2018-01-16
US9682096B2 (en) 2017-06-20
KR20150008855A (ko) 2015-01-23
SG11201406208QA (en) 2014-11-27
AU2013255885C1 (en) 2018-04-26
CL2014002929A1 (es) 2015-01-16
US20150140042A1 (en) 2015-05-21
CN104394846B (zh) 2018-10-19
US20160296551A1 (en) 2016-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2650636C2 (ru) Составы на основе полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly(i:с)) для лечения инфекций верхних дыхательных путей
JP6629216B2 (ja) 上気道感染症の治療のためのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（ｉ：ｃ））製剤
US20200060972A1 (en) Formulations of polyinosinic acid and polycytidylic acid for the prevention of upper respiratory tract infections
JP2018515530A (ja) 上気道感染症の予防および／または治療のためのポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（ｉ：ｃ））のエンドウマメデンプン製剤
US9822364B2 (en) Compositions and methods for controlled delivery of inhibitory ribonucleic acids
WO2021236626A1 (en) Mucoretentive antiviral technologies
Jha et al. Polymeric nanomaterials for infectious diseases
US20240238242A1 (en) EGCG buccal tablet and use thereof
CN115702935A (zh) 一种氯雷他定药物组合物及其制备方法