JP6349304B2 - 上気道感染症の処置のためのポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（ｉ：ｃ））製剤 - Google Patents

Description

本発明は、感染症または風邪の処置および／または予防における使用のための、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））と、デンプン、アルギネート、ブラノース（ｂｌａｎｏｓｅ）またはＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）から選択されるキャリアポリマーとのミクロ粒子を含む組成物、ならびに感染症または風邪の予防および／または処置を必要とする患者による使用のための、前記組成物を含むデバイス、好ましくは経鼻送達系に関する。

風邪（鼻咽腔炎、急性ウイルス性鼻咽頭炎、急性コリーザ、または感冒としても知られる）は、主としてウイルスによって引き起こされる、上気道系のウイルス感染性疾患である。

ウイルス
風邪は、上気道のウイルス感染症である。最も一般的に関係するウイルスは、９９種類の血清型が知られているピコルナウイルス科のウイルスの１種である、ライノウイルス（３０〜５０％）である。他のものとしては、コロナウイルス（１０〜１５％）、インフルエンザ（５〜１５％）、ヒトパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、およびメタニューモウイルスが挙げられる。

全部で２００種類を超える血清学的に異なるウイルス型が感冒の原因となる。コロナウイルスが成人の感冒に特に関係している。３０種類を超えるコロナウイルスのうち３または４種類がヒトにおける感染症の原因となるが、それらを研究室で増殖させることは困難であり、そのため、それらの重要性はそれほど十分に理解されているわけではない。多くの異なるウイルス型がありかつそれらは連続的に変異する傾向があるため、風邪に対する完全な免疫を獲得することは不可能である。

臨床的徴候および症状
上気道ウイルスの初期兆候は、多くの場合、喉の痛みまたはチクチク感である。他の一般的な症状は、鼻水、充血、およびくしゃみである。これらは、場合によっては、結膜炎（ピンクアイ）、筋肉痛、疲労、倦怠感、頭痛、衰弱、または食欲減退を伴う。咳および熱は、一般に、上気道ウイルスというよりもインフルエンザの徴候であり、陽性的中率は約８０％である。症状は、乳幼児および低年齢小児においてより深刻であり得、これらの場合においては、症状には熱および蕁麻疹が含まれ得る。上気道ウイルスは、喫煙者においてもより深刻であり得る。

ウイルス複製は、最初の接触から２〜６時間後に始まる。症状は、通常最初の感染から２〜５日後に始まるが、時折１０時間という少ない時間で発生する。症状は、症状発症から２〜３日後にピークに達するが、インフルエンザの症状発症は、一定かつ迅速である。持続期間を短縮する既知の処置は現在のところ存在しない。しかしながら、症状は通常７〜１０日で自然治癒するが、一部の症状はことによると３週間までにわたって続く。小児においては、咳が、３５〜４０％の症例で１０日よりも長く続き、１０％の症例で２５日よりも長く継続する。風邪はヒトにおける最も頻度の高い感染性疾患であり、平均的な成人は年間２〜４回感染症に罹り、平均的な小児は６〜１２歳の間の小児で年間数回感染症に罹る。米国では、感冒の発生率は、落葉季（秋季）および冬季により高く、ほとんどの感染症が９月〜４月の間に起こる。こうした季節性は、学年度の開始のため、または人々がより多くの時間を室内で（互いにより近い距離に極めて接近して）過ごすためであり得、ウイルス伝播の機会が増大する。

感染性期間
風邪は、症状の最初の２〜３日の間が最も感染性であるが、風邪は、症状の発症までの数日間もまた感染性であり、症状が完全に治癒してしまうまで依然としていくらか感染性であり得る。

ヒトライノウイルス
ヒトライノウイルスは、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科に属するエンテロウイルス属のメンバーである。ＨＲＶ粒子は、４つのポリペプチド（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、およびＶＰ４）からなる２７〜３０ｎｍの無エンベロープカプシドで構成されている。ウイルスカプシドは、およそ７２００塩基の一本鎖ＲＮＡゲノムを含有する。ウイルスにコードされるタンパク質（ＶＰｇ）が、ＲＮＡゲノムの５’末端に共有結合で結合している。ヒトライノウイルス（ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ：ＨＲＶ）への感染の臨床的経過は十分に特徴付けられている。ＨＲＶは上気道および下気道、鼻粘膜、副鼻腔ならびに中耳に感染し得、感染症は「風邪」の症状を示す（上記参照）。感染症は自己限定性であり、典型的には上気道に限局される。末梢白血球数が、感染の最初の２〜３日の間に上昇し得る。ＨＲＶ感染はまた、下気道の感染、中耳炎（特に低年齢小児において）、および副鼻腔炎にも繋がり得る。ライノウイルス感染からの重篤な合併症（例えば、肺炎）は稀であるが、乳幼児および低年齢小児、特に、気管支肺異形成症、先天性心疾患、未熟、および神経学的状態などの基礎状態に罹っているもの、ならびに免疫抑制された（骨髄移植受容者）成人において生じることが報告されている。ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科の他のメンバーは中枢神経系に感染し得る（すなわち、ポリオウイルス、エンテロウイルス）が、ＨＲＶへのヒト中枢神経系の感染は報告されていない。

処置
ライノウイルス感染症の処置または風邪の予防のための市販の抗ウイルス剤は存在しない。ライノウイルスによって引き起こされる上気道感染の処置は、典型的には一般市販薬の抗ヒスタミン薬、アスピリン、鎮咳薬、および鼻充血除去薬を用いての、症状（くしゃみ、鼻充血、鼻漏、眼の刺激、咽喉痛、咳、頭痛、熱、悪寒）の管理に基づく。ＨＲＶ感染のより重篤な合併症（例えば、肺炎）は、医学的に適切な医療基準を用いて管理される。

費用および医学的必要性
世界保健機関のデータによれば、１０億件より多くの風邪の症例が、昨年米国で報告された。米国では、風邪は、１年に７５００万〜１億件の医師訪問に繋がり、その費用は控えめに見積もっても年間７７億ドルである。米国人は、症状緩和のために２９億ドルを一般用医薬品に費やし、さらに４億ドルを処方薬に費やす。１年に約２２００万〜１億８９００万日の授業日が、感冒のため欠席される。その結果、親らは、１億２６００万日の仕事日を欠勤して、自分の子供を看病するために家にいる。被雇用者が感冒を患って欠勤する１億５０００万日の仕事日に加えると、感冒関連の労働損失の経済的影響は、全部で年間２００億ドルを超える。これは、仕事から失われた時間の４０％を占める。

気道上皮細胞が、ライノウイルスおよびコロナウイルスのような上気道（ｕｐｐｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ：ＵＲＴ）感染性因子の主要な標的である。これらのウイルスへの感染は、感染した細胞の免疫系クリアランスを反映する症状発症の前に起こるので、直接的な抗ウイルス治療介入は、それほど有効にはなりそうにない。加えて、鼻粘膜中で直接的抗ウイルス化合物の活性レベルを実現および維持することは、鼻粘膜の高代謝回転のため非常に困難である。これに対し、身体自体の防御を利用し、鼻上皮細胞における抗ウイルス状態を誘導することによる予防は、その後のウイルス攻撃に対する著しい保護を結果としてもたらすこと、および疾患関連の症状を弱めることが、既に示されている。

感冒は１週間または２週間しか続かないことがあり得るが、重篤な感冒は１ヶ月までにわたって続き得る。感冒は、年齢および曝露に依存して、成人では平均して年間２〜３回、小児では６〜１０回である。何百種という異なる血清型の感冒ウイルスが存在しており、このことにより、それらの全てに対して有効であるであろう一般的なワクチン予防を開発することが不可能になっている。対症療法は、一般に、睡眠誘導性経口抗ヒスタミンおよび／または刺激性副作用を有する血管収縮性充血除去薬を用いることを含む。これは、ほんの僅かに有効であるにすぎず、こうした副作用は、多くの場合、感染自体と同じように消耗性である。予防は理想的な解決法であるであろうが、上で言及した理由から、全ての異なる血清型に対する広範に有効なワクチンの見込みは、近い将来においてはとてもありそうにない。したがって、隔離なしでは、人々は、定期的に、とりわけ「寒季（ｃｏｌｄ ｓｅａｓｏｎ）」の間に、こうした感染性因子に曝露されるので、広範に有効で、好都合な、副作用のない予防薬は、公衆衛生および職場における生産性に大きな影響力を有するであろう。

先天性（ｉｎｎａｎｔｅ）免疫応答、すなわち身体のための「早期警告系」を標的化すれば、上述の問題を解決するであろう。鼻上皮細胞に存在するこの系は、一旦適切に刺激されると、細胞にそれらがウイルスに攻撃されていると思わせ、抗ウイルス防御応答を誘発する。一旦これが生じると、細胞は、その後のウイルス攻撃に免疫性となる。いくらかの初期の研究は１９８０年代末期には行われていたのであるが、先天性免疫応答を誘発するための免疫刺激性分子（例えば、インターフェロン）の使用の場合を見てみると、製造は高価であり、それらの作用を制御することが困難であった。

現研究の目的は、測定可能かつ制御可能な様式で（例えば、数日おきにまたはさらには１週間に１度）使用されて、先天性免疫系に抗原刺激をし、ウイルス感染に対する保護を提供し得る、誘発性分子（ポリ（Ｉ：Ｃ））の製剤を開発することであった。以下に概説したアプローチは、有効性を示しはしたが実用的でない既存の薬剤ポリ（Ｉ：Ｃ）を使用し、製剤科学を用いてそれを好都合かつ有効にする。

Ｔｏｌｌ様受容体３（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３：ＴＬＲ３）は、ヒトにおいてＴＬＲ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＴＬＲ３は、先天性免疫系のパターン認識受容体のＴｏｌｌ様受容体ファミリーのメンバーであり、病原体認識および先天性免疫の活性化において重要な役割を果たす。ＴＬＲは、ショウジョウバエ属からヒトまで高度に保存されており、構造的および機能的類似性を共有している。ＴＬＲは、感染性因子上に発現される病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ：ＰＡＭＰ）を認識し、有効な免疫の発達のために必要なサイトカインの産生を媒介する。種々のＴＬＲは、異なる発現パターンを示す。このＴＬＲ３受容体は、気道上皮細胞によっても発現され、白血球の樹状亜集団に限局される。

ＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を認識する。二本鎖ＲＮＡは、ウイルス複製サイクルの間に形成され得る２本の相補的な鎖を有するＲＮＡである。認識すると、ＴＬＲ３は、ＮＦ−κＢおよびインターフェロン調節因子３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ ３：ＩＲＦ３）のような転写因子の活性化を誘導して、他の細胞にそれらの抗ウイルス防御を高めるように合図するＩ型インターフェロンの産生を増加させる。

ＴＬＲ３の構造は、隣接した馬蹄に接した大きな馬蹄形を形成し、２つの馬蹄の「ダイマー」を形成している。ＴＬＲ３タンパク質表面の大部分が糖分子で覆われており、これによりこれは糖タンパク質となっているのであるが、一方の面（２つの馬蹄の間の既述の界面を含む）に、大きな糖非含有表面が存在する。この表面はまた、正に荷電したアミノ酸が豊富な２つの別個のパッチを含有しており、それらは負に荷電した二本鎖ＲＮＡのための結合部位であり得る。

ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、１，０００，０００ダルトンまでのＭＷ分布を有する二本鎖ＲＮＡ分子である。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ウイルスＲＮＡを模倣するＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドであり、先天性免疫応答の公知の刺激薬である。経鼻的に投与されると、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、鼻上皮におけるインターフェロンαおよびβのような抗ウイルスタンパク質の発現を誘導する。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ライノウイルス感染症の回数および重症度を低減することが示されている。

ポリ（Ｉ：Ｃ）は、水溶液中の不安定な分子である。現在のところ、有効な治療効果または予防効果を達成するためには、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、使用直前に再溶解され、２時間おきに投与される必要がある。患者コンプライアンスを改善するためおよび投与頻度を低減するために、安定であり、かつ向上した有効性を示す、新規の製剤を開発した。

ポリ（Ｉ：Ｃ）を、鼻上皮上での滞留時間を延長し得、先天性免疫系のより有効かつ制御可能な刺激を提供し得る、数種の生体接着性ポリマーと共に製剤化した。

本発明は、室温でほぼ無期限に貯蔵され得るであろう、かつその先天性免疫系刺激活性を保持する、特異な製剤の特定を提供する。

さらに、製剤は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の有効性を向上させ、はるかに少ない頻度の投与を一層大きなＴＬＲ３刺激活性を伴って可能にする。

ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア混合物の生体（インターフェロン）刺激能。ＧＦＰ−レポーター構築物がインターフェロン−β−プロモーター下において発現されたポリ（Ｉ：Ｃ）応答性細胞を、２４時間にわたりポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア混合物と共に（１：５比で）インキュベートし、続いてＧＦＰ発現について分析した。Ｙ軸上の数字は、試料中の総生細胞に対するＧＦＰ＋細胞の百分率を示す。ｘ軸上の数字は、混合物中のポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を示す。２つの実験を代表する結果が示されている。 ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア混合物の生体（インターフェロン）刺激能。ＧＦＰ−レポーター構築物がインターフェロン−β−プロモーター下において発現されたポリ（Ｉ：Ｃ）応答性細胞を、２４時間にわたりポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア混合物と共に（１：５比で）インキュベートし、続いてＧＦＰ発現について分析した。Ｙ軸上の数字は、試料中の総生細胞に対するＧＦＰ＋細胞の百分率を示す。ｘ軸上の数字は、混合物中のポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を示す。２つの実験を代表する結果が示されている。 噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）ミクロ粒子の走査型電子顕微鏡写真。 室温での１ヶ月の貯蔵後のポリ（Ｉ：Ｃ）概念の安定性。ＧＦＰ−レポーター構築物を有するポリ（Ｉ：Ｃ）応答性細胞を、２４時間にわたりポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア混合物と共にインキュベートし、続いてＧＦＰ発現について分析した。Ｙ軸上の数字は、試料中の総生細胞に対するＧＦＰ＋細胞の百分率を示す。ｘ軸上の数字は、混合物中のポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を示す。２つの実験を代表する結果が示されている。

したがって、本発明は、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））と、デンプン、アルギネート、ブラノースまたはＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）から選択されるキャリアポリマーとのミクロ粒子を含む組成物に関する。ミクロ粒子は、０．１μｍ〜１００μｍの間の平均粒径を有する粒子である。好ましくは、キャリアポリマーは、トウモロコシ、ジャガイモまたはキャッサバから得られるデンプンである。

組成物に含まれるポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリアポリマー微小球（または所謂ミクロ粒子とも）は、噴霧乾燥処理などの粒子形成処理によって製造される。

本発明に従うポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプン比は、１／２００（ｗ／ｗ）〜１／０．１（ｗ／ｗ）の範囲であるが、好ましくは１／１００（ｗ／ｗ）〜１／１（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは１／１００（ｗ／ｗ）〜１／５（ｗ／ｗ）の範囲であり、さらに、１／１２〜１／９（ｗ／ｗ）の間のポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプン比が最も好ましい。

本発明に従う組成物中のミクロ粒子のＤ_Ｖ５０（＝粒子の体積に基づく５０％累積網下）は、０．１マイクロメートル〜２００マイクロメートル、好ましくは１マイクロメートル〜５０マイクロメートル、より好ましくは２マイクロメートル〜４０マイクロメートル、さらにより好ましくは２マイクロメートル〜２０マイクロメートル、最も好ましくは１０マイクロメートル〜２０マイクロメートルの範囲である。

本発明の組成物はまた、有機溶媒を含む液体組成物であり得、ここで、有機溶媒は、グリセロールまたはエタノールまたはそれらの組み合わせをベースとするものである。

本発明の組成物は、医療において、好ましくは上気道のウイルス感染症（例えば、「風邪」と呼ばれるもの）の予防および／または処置における使用のために使用され得る。

本発明の組成物は、喘息および／またはＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）を患っている患者によって、やがて起こる風邪の症状を潜在的に予防および／または処置するために使用され得る。

上気道感染症を予防および／または処置するための好ましい方法は、経鼻投与によって行われる。

ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））と、デンプン、アルギネート、ブラノースまたはＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）から選択されるキャリアポリマーとのミクロ粒子を含む本発明の組成物は、（ウイルス）感染症または風邪の処置および／または予防のために使用され得、ここで、組成物は、１日〜１ヶ月の範囲内、より好ましくは数日おきからの範囲内、またはさらには１週間に１度からの範囲内の時間間隔で、経鼻適用によって投与される。

０．１マイクロメートル〜２００マイクロメートル、好ましくは１マイクロメートル〜５０マイクロメートル、より好ましくは２マイクロメートル〜４０マイクロメートル、さらにより好ましくは２マイクロメートル〜２０マイクロメートル、最も好ましくは１０マイクロメートル〜２０マイクロメートルの範囲である組成物中のミクロ粒子径と組み合わせて、ポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプン比が１／２００（ｗ／ｗ）〜１／０．１（ｗ／ｗ）の範囲であるが、好ましくは１／１００（ｗ／ｗ）〜１／１（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは１／１００（ｗ／ｗ）〜１／５（ｗ／ｗ）の範囲であり、さらに、１／１２〜１／９（ｗ／ｗ）の間のポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプン比が最も好ましい上述の組成物が、（ウイルス）感染症または風邪の処置および／または予防のために使用され得、ここで、前記組成物は、１日〜１ヶ月の範囲内、より好ましくは数日おきからの範囲内、またはさらには１週間に１度からの範囲内の時間間隔で、経鼻適用によって投与される。

本発明に従う組成物を含むデバイス、特に経鼻送達系もまた、本発明の一部である。

本発明によれば、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、経鼻投与のための乾燥粉末として製剤化される。安定性を改善するために、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ドラム乾燥された蝋質トウモロコシデンプンとポリ（Ｉ：Ｃ）とを含有する水性混合物から噴霧乾燥される。

デンプンは、次の２つの機能を有すると考えられる。（１）鼻内で生体接着剤として機能すること。（２）蝋質トウモロコシデンプン中に高濃度で存在するアミロペクチンが、鼻内でアミラーゼにより分解されてポリ（Ｉ：Ｃ）を放出する。

経鼻投与は、好ましくは、単回用量経鼻粉末デバイス（Ａｐｔａｒ Ｐｈａｒｍａ Ｇｅｒｍａｎｙから供給される単位用量デバイス）を用いて達成される。単位用量デバイスは、能動的送達系であり、これは、患者が吸入する必要がなく、性能が患者によって左右されないということを意味する。投与は駆動によって行われ、この駆動は過圧によって制御される。一吹き当たりの用量は、噴霧乾燥粉末中のポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度および放出される粉末重量によって決まる。この粉末は、各外鼻孔内に一吹き毎に新しいデバイスを用いて投与されるであろう。

上述のように、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、イノシン酸およびシチジル酸のナトリウム塩の反平行ポリヌクレオチド鎖からなる合成二本鎖ＲＮＡである。これらの鎖は、イノシン塩基とシトシン塩基との間に形成される水素結合によって非共有結合で結合している。

ポリ（Ｉ：Ｃ）についての平均鎖長は、３００〜６，０００塩基対の間の範囲であり、これは、およそ１８０，０００〜３，６００，０００ダルトンに相当する。分子式は、（Ｃ_１０Ｈ_１０Ｎ_４ＮａＯ_７Ｐ）_ｘ・（Ｃ_９Ｈ_１１ＮａＮ_３Ｏ_７Ｐ）_ｘである。

上記のポリ（Ｉ：Ｃ）は購入できるが、任意選択で、社内で例えば以下の手順を用いて作製することもできる。

二重鎖生成物ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ポリイノシン（Ｉ）およびポリシチジン（Ｃ）の個々のホモポリマーから製造される。ポリＩおよびポリＣは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰアーゼ）の存在下においてヌクレオシドジホスフェートのイノシンおよびシチジンを個々に重合させることにより合成される。各ヌクレオシドジホスフェートは、結果として生じるリボ核酸ポリマーの長さを制御するために、個々に２０〜２４時間にわたり、ＰＮＰアーゼによって重合される。次いで、酵素プロテインキナーゼを、重合反応を停止させるために添加する。結果として生じるホモポリマー（すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子）は、各ポリマー生成物の分子量範囲を特定の範囲内に制御するために加水分解される。加水分解された生成物は、溶液から一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｓｓＲＮＡ）を沈殿させるために、エタノールで処理される。沈殿物は上清から分離され、水に溶解される。次いで、ｓｓＲＮＡの溶液は、微粒子を除去するために濾過され、低分子量汚染物質を除去するために限外濾過され、次いで凍結乾燥される。凍結乾燥されたｓｓＲＮＡ生成物は、確実に生成物が規格の範囲内にあるようにするために、個々に純度、分子量、および他の品質特性について試験される。

個々の一本鎖ホモポリマー（ポリＩおよびポリＣ）は、個々に０．０１５Ｍ塩化ナトリウムに溶解され、次いで、二本鎖の二重鎖生成物（ポリＩ：ポリＣ）を構成するそれらの鎖をアニーリングするために合わされる。混合後、結果として生じる溶液は濾過される。濾液が、低分子量汚染物質を除去するために限外濾過される。次いで、限外濾過された生成物は凍結乾燥される。結果として生じる二重鎖生成物は、−２０℃で貯蔵される。凍結乾燥されたｄｓＲＮＡ生成物は、確実に生成物が規格の範囲内にあるようにするために、純度、分子量、および他の品質特性について試験される。

材料および方法
ポリイノシン−ポリシチジル酸ナトリウム塩（ポリ（Ｉ：Ｃ），Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ（Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ），ロット０２０９０５、部分アルファ化トウモロコシデンプン，Ｓｔａｄａ ＡＧ（Ｂａｄ Ｖｉｌｂｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ロット９３３０１−９６２８、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｂｌａｎｏｓｅ ７ＭＦ），Ａｓｈｌａｎｄ Ａｑｕａｌｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）ロット３−３０１７２、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｌｉｐｏｉｄ ＰＣ １６：０／１６：０），Ｌｉｐｏｉｄ ＧｍｂＨ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ），ロット５６３０９８−０１／０４９、ラクトース一水和物（＃３１６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏ），Ｆｏｒｅｍｏｓｔ（Ｂａｎａｂｏｏ，ＷＩ，ＵＳＡ），ロット８５０９０５２２６１、アルギン酸ナトリウム（Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ１０／６０ＬＳ），ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ（Ｄｒａｍｍｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ），ロットＳ１９６１６、無水エタノール Ｃｈｅｍ−Ｌａｂ（Ｚｅｄｅｌｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ），ロット１７．２７１２９０４．４００。

ポリ（Ｉ：Ｃ）のインビトロ生物活性
グリーン蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ構築物（Ｂ１Ｌ−ＧＡＲ５構築物）に連結された長いＩＦＮ−β１プロモーター（位置２１０６９４６３〜２１０６７８６９の第９染色体）を含有するベクターに、ポリ（Ｉ：Ｃ）感受性Ａ５４９細胞（癌ヒト肺胞上皮細胞）を感染させた。ポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激すると、ＩＦＮ経路が活性化され、その結果、Ｂ１Ｌ−ＧＡＲ５レポーター構築物の活性化ならびにＧＦＰおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現がもたらされる。極めて応答性の高い細胞クローンを得るために、ポリ（Ｉ：Ｃ）刺激細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて高ＧＦＰ発現について選別し、＞２００クローンのうちから、ポリ（Ｉ：Ｃ）応答性細胞の％に基づきＨ１０クローンを選択した。Ａ５４９−Ｂ１Ｌ−ＧＡＲ５−Ｈ１０細胞を、組織培養フラスコが細胞で集密的となるまで増殖させ、その後、培地を新しくし、細胞をさらに４日間培養した。次いで、細胞を標準的なトリプシン処理を用いて採取し、計数し、９６ウェル平底プレートに１ウェル当たり５０，０００細胞で播種し、１００μｌずつのインターフェロンβ（７５Ｕ／ｍｌ）で一晩刺激した。翌日、１００μｌのポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリアポリマー混合物を、ポリ（Ｉ：Ｃ）：ポリマー＝１：５の比で細胞に添加して２００μｌの最終体積を結果としてもたらし、細胞をさらに２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を（トリプシンを介した分離によって）採取し、ＢＤ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析した。

ポリ（Ｉ：Ｃ）のキャリアポリマーとの噴霧乾燥
アルギネート、ＣＭＣ（Ｂｌａｎｏｓｅ）および部分アルファ化トウモロコシデンプンの噴霧乾燥処理を、Ｂ９０ナノ噴霧乾燥器およびＢｕｃｈｉ Ｂ２９０ミニ噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。概して、Ｂ９０ナノ噴霧乾燥器を用いた噴霧乾燥実験は、溶液の高い粘度のため乏しい収率を結果としてもたらした。脱塩水を、０．２ミクロン酢酸セルロースフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ ＦＰ３０／０．２ ＣＡ−Ｓ）を用いて濾過し、ガラスビーカーに加えた。磁気撹拌機を用いて撹拌しながら賦形剤を添加した。完全に溶解した時に、ポリ（Ｉ：Ｃ）を溶液に添加した。０．５％（ｗ／ｗ）の総固形分濃度およびポリ（Ｉ：Ｃ）／賦形剤の比１／９（ｗ／ｗ）を、全ての概念に適用した。供給材料溶液の組成を、表１Ａに列挙する。

ＤＰＰＣ−ポリ（Ｉ：Ｃ）概念については、異なるエタノール／水混合物へのＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）の溶解度を測定した。純粋なＤＰＰＣを噴霧乾燥した場合、得られた収率は約２５％で低かった。したがって、キャリア材料の添加を検討した。Ｎａ−ＣＭＣ、Ｎａ−アルギネート、蝋質トウモロコシデンプンおよびマルトデキストリンはエタノールを添加すると沈殿するため、ラクトースを、ポリ（Ｉ：Ｃ）のＤＰＰＣとの噴霧乾燥のためのキャリアとして選択した。脱塩水を、０．２ミクロン酢酸セルロースフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ ＦＰ３０／０．２ ＣＡ−Ｓ）を用いて濾過し、ガラスビーカーに加えた。磁気撹拌機を用いて撹拌しながらラクトースを添加した。溶解すると、両方の溶液を混合し、６０℃まで加熱した。完全に溶解した時に、溶液を室温まで冷却し、ポリＩ：Ｃを添加した。０．２８％（ｗ／ｗ）の総固形分濃度およびポリ（Ｉ：Ｃ）／ラクトース／ＤＰＰＣの比１／２．２５／６．７５（ｗ／ｗ／ｗ）を適用した。供給材料溶液の組成を、表１Ｂに示す。

これらの溶液の噴霧乾燥を、実験室規模の噴霧乾燥器Ｂ ２９０型不活性ループ（Ｂｕｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。溶液を、蠕動ポンプ５２０Ｕ型（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）によって、噴霧乾燥器の上部にある二流体ノズル（直径：０．７ｍｍ）に供給した。噴霧乾燥器は、補助流窒素フローモードで運転した。噴霧乾燥された粒子を、サイクロンに取り付けられたレザバ中に収集した。粒子の収集後、サイクロンを室温まで冷却した。収集された粉末を、バイオハザードキャビネット中の琥珀色のガラスバイアルに移した。このバイアルを窒素でフラッシュし、密閉し、５℃で貯蔵した。処理パラメータを、表２に列挙する。

さらなるポリ（Ｉ：Ｃ）−部分アルファ化トウモロコシデンプン概念の噴霧乾燥
噴霧乾燥処理を、Ｂｕｃｈｉ Ｂ２９０ミニ噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。ヌクレアーゼ非含有水をガラスビーカーに加え、部分アルファ化トウモロコシデンプンをＵｌｔｒａ Ｔｕｒａｘ Ｔ２５（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ）を用いてデンプンが完全に分散するまで混合しながら添加する。ポリ（Ｉ：Ｃ）を、ヌクレアーゼ非含有水に溶解させ、ポリ（Ｉ：Ｃ）が完全に溶解するまで磁気撹拌機を用いて撹拌した。溶解させたポリ（Ｉ：Ｃ）を、分散させたデンプンに添加して、室温で撹拌し、噴霧乾燥の直前にポリ（Ｉ：Ｃ）溶液を調製する。１０％（ｗ／ｗ）または０．４５％の総固形分濃度およびポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプンの比１／２００−１／１００−１／５０−１／２４−１／９（ｗ／ｗ）を適用した。これらの製剤の供給材料組成を、表３Ａに示す。

溶液を、蠕動ポンプによって、噴霧乾燥器の上部にある二流体ノズル（直径：０．７ｍｍ）に供給した。噴霧乾燥器は、補助流窒素フローモードで運転した。噴霧乾燥された粒子を、サイクロンに取り付けられたレザバ中に収集した。粒子の収集後、ガラスシリンダーおよびサイクロンを室温まで冷却した。収集された粉末を、琥珀色のガラス瓶に移した。この瓶を、アルミニウムのベーパーロックバッグに入れる。このバイアルを室温で貯蔵した。処理パラメータを、表３Ｂに列挙する。

走査型電子顕微鏡法
試料を、直径＋／−３０〜５０ｎｍを有する金粒子でスパッタした。画像を、Ｅｖｅｒｈａｒｔ Ｔｈｏｒｎｌｅｙ検出器を備えたＦＥＩ走査型電子顕微鏡−Ｑｕａｎｔａ ２００Ｆ型を用いて生成した。

含水量−カールフィッシャー滴定
概念の含水量を、直接容量カールフィッシャー滴定によって測定した。ＫＦ ＴＩＴＲＡＴＯＲ Ｖ３０を使用する（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ，ＵＳ）。粉末（５０〜１００ｍｇ）を、Ｈｙｄｒａｎａｌ（登録商標）メタノールドライ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する滴定容器に移し、３００秒間撹拌した。５ｍｌビュレットを用いて、２ｍｇ／ｍｌの濃度のＨｙｄｒａｎａｌ（登録商標）コンポジット２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で滴定を行った。終点については、１５μｇ／分のストップドリフトを適用した。三重反復試験で試料を分析した。

粒径の測定
単に目的の生成物の体積分布に基づいて、粒径分布データを評価する傾向が存在する。それについて、評価は、多くの場合、Ｄ_Ｖ１０、Ｄ_Ｖ５０およびＤ_Ｖ９０累積網下の比較に限られている。

しかしながら、ｄ_Ｖｘ累積網下を比較することは、異なる技術および計器が容易に異なる結果に繋がるという事実から、必ずしも簡単なことではあり得ない。

さらに、粒径（または形状）分布データから、それらのデータを異なる観点から見る（すなわち、他のパラメータを用いる）ことによってより多くの情報が得られ得る。

粒径分布の測定については、レーザー回析試験法を用いた。

Ｈｙｄｒｏ２０００Ｓ湿式分散モジュール（または同等の系）を備えたＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００レーザー回析計を用いて分析を行った。２０ｎｍ〜２ｍｍのサイズ範囲において、青色光ＯＮ検出モードでこの計器を使用する。

インフルエンザマウスモデルにおける製剤のインビボ試験
全ての動物研究が、倫理委員会によって承認され、国内および国際ガイドラインに従って行われた。８〜１２週齢の雌Ｓｗｉｓｓマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）を使用した。全ての鼻腔内処置を、イソフルラン麻酔下において行った。ある量の液体を投与するために、小滴を鼻孔の上に直接適用し、口を閉じることによって、その液滴が鼻孔を介して鼻腔内に入ることを可能にした。噴霧乾燥されたポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア粉末を、各実験の直前に新たに調製し、１５μｌの液体として投与した。製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１ｍｇ／ｍｌの濃度で投与した。典型的に、攻撃前の２または３日目に、前処置を行った。０日目に、２５μｌの１０×ＬＤ_９０マウス適合Ｈ１Ｎ１ ＰＲ（ＦＬＵ ＰＲ １６００５１７）（高容量攻撃）で、または１５μｌの１×ＬＤ_９０（低容量攻撃）で、マウスを攻撃した。攻撃に続き、体重および挙動を評価することにより、マウスを１４日間毎日モニタリングし、体重減少が攻撃の日と比べて＞２０％となった場合、またはマウスの挙動が疾病の重篤な徴候を示した場合は、マウスを安楽死させた。

結果
キャリアポリマーの選択
鼻風邪の予防のための成功する概念の必要条件は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の生物活性が、最終製剤において保持されていなければならないことである。したがって、噴霧乾燥処理のためのキャリアポリマーの選択における第１の工程は、ポリ（Ｉ：Ｃ）のインターフェロン刺激能を阻害しないポリマーを特定することであった。この点に関して、数多くのキャリアポリマーを、５：１比（ｗ：ｗ）でポリ（Ｉ：Ｃ）と混合し、滴定量で、ポリ（Ｉ：Ｃ）応答性のインターフェロンプロモーター−ＧＦＰ−レポーター（Ａ５４９−ＩＦＮ−ＧＡＲ５、クローンＨ１０）細胞株（詳細については材料および方法参照）に添加した。この細胞を２４時間にわたり３７℃および５％ＣＯ_２でインキュベートし、その後、フローサイトメーターを用いてＧＦＰ^＋細胞の百分率を測定した。ポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度を高めると、より高い百分率のＧＦＰ^＋細胞を結果としてもたらすので、我々は、このインビトロモデルをポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリア混合物の生物活性を評価するために用いることができる（図１）。試験した種々のキャリアのうち、Ｎａ−アルギネート、部分アルファ化トウモロコシデンプン、ＤＰＰＣおよびブラノースは、ポリ（Ｉ：Ｃ）のインターフェロン刺激能を阻害しなかった。それに対して、カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）、κ−カラゲナン、キトサン、およびポリエチルアミンは、ポリ（Ｉ：Ｃ）のインターフェロン刺激能を阻害または完全に抑制した。これらの結果に基づき、ポリ（Ｉ：Ｃ）に影響を及ぼさないキャリアであるＮａ−アルギネート（Ｐｒｏｔａｎａｌ ＬＦ１０／６０ＬＳ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）、ドラム乾燥蝋質トウモロコシデンプン（Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｓｔａｄａを介して）、ＤＰＰＣ（Ｌｉｐｏｉｄ ＰＣ １６：０／１６：０，Ｌｉｐｏｉｄ）、およびＮａ−ＣＭＣ（Ｂｌａｎｏｓｅ ７ＭＦ）を、次の製剤開発工程のために選択した。

Ｎａ−アルギネートは、マンヌロン酸（Ｍ）ブロックおよびグルロン（Ｇ）ブロックからなるゲル形成性多糖である。ゲルの強度および柔軟性は、Ｇ／Ｍ比によって規定される。Ｎａ−ＣＭＣは、カルボキシメチル基を有するセルロース誘導体である。これは、経鼻製剤において多く用いられている。部分アルファ化トウモロコシデンプンは、粘膜組織に対して非刺激性の、アミロペクチンベースのデンプンである。Ｎａ−アルギネート、Ｎａ−ＣＭＣおよび部分アルファ化トウモロコシデンプンの３つの賦形剤は、良好な生体接着剤特性を示す。ＤＰＰＣは、リン脂質であり、肺サーファクタントの主成分である。ＤＰＰＣは、経鼻吸収を向上させ得る。

噴霧乾燥処理ならびに概念の生物活性および安定性
噴霧乾燥処理を、Ｂ９０ナノ噴霧乾燥器およびＢｕｃｈｉ Ｂ２９０ミニ噴霧乾燥器（Ｂｕｃｈｉ，Ｆｌａｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。概して、Ｂ９０ナノ噴霧乾燥器を用いた噴霧乾燥実験は、溶液の高い粘度のため乏しい収率を結果としてもたらした。

各処理後に、収率を、レザバ中に収集された粉末の量を供給材料の調製のために計量した粉末の理論量で除した値として計算した。結果を表４に列挙する。概念４についてのより低い収率は、サイクロン内への粉末付着の観察によって説明され得、この粉末付着は恐らくは、噴霧乾燥の間のサイクロン内の局所温度におけるＤＰＰＣの粘着性によって引き起こされるものである。

走査型電子顕微鏡法
噴霧乾燥粉末のＳＥＭ画像を図２に示す。

概念３（部分アルファ化トウモロコシデンプン）の粉末は、凹んだ球体からなっていた。対応するプラセボ粉末に対するレーザー回析測定は、４．５マイクロメートルのＤ_Ｖ５０を有する粒径を結果としてもたらした。

含水量
噴霧乾燥粉末の含水量を測定した。残留水は、環境からの水吸収および噴霧乾燥処理のために用いられた水に由来する。

部分アルファ化トウモロコシデンプン、ＮａＣＭＣおよびＮａ−アルギネートは吸湿性の賦形剤であり、これは、膨張およびゲル形成を通しての生体接着性に必要とされる性質である。このことは、表５に列挙された結果に反映されている。概念４については、含水量は、概念１〜３の含水量よりも低いことが分かったが、これは、概念４からの粉末がエタノール／水混合物から噴霧乾燥されたからである可能性が最も高い。さらに、ラクトースは吸湿性ではなく、この概念におけるＤＰＰＣの親油性のために水の吸収が制限される。

室温におけるポリ（Ｉ：Ｃ）概念の安定性
抗風邪製剤についての１つの重要な性質は、その概念が、貯蔵を容易にするためおよび生成物の有効成分の活性を保証するために、室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：ＲＴ）において安定であるべきであることである。しかしながら、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、加水分解によって、またはＲＮアーゼ酵素によって分解されるので、水含有溶媒に溶解される場合、ポリ（Ｉ：Ｃ）は非常に不安定である。特にＲＮアーゼ酵素は遍在的に存在することが知られており、ＲＮアーゼ汚染はポリ（Ｉ：Ｃ）ＲＮＡ分子の急速な分解を結果としてもたらすであろう。

安定性を試験するために、４つの概念を室温で貯蔵した。ＲＴでまたは−２０℃で貯蔵されたＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）を、コントロールとして使用した。１ヶ月の貯蔵後に、これらの概念およびコントロールの生物活性を、ポリ（Ｉ：Ｃ）応答性細胞株についてそれらの概念のインターフェロン−レポーター応答を測定することによって評価した。全ての噴霧乾燥されたポリ（Ｉ：Ｃ）概念が、ポリ（Ｉ：Ｃ）感受性細胞株に対して、−２０℃貯蔵ポリ（Ｉ：Ｃ）と比べて変わらない活性を示した（図３）。それに対して、ＰＢＳ中のＲＴ貯蔵ポリ（Ｉ：Ｃ）は、そのインターフェロン刺激活性を完全に喪失した。これらの結果は、噴霧乾燥製剤が、水含有液体中のポリ（Ｉ：Ｃ）とは異なり、室温で貯蔵された場合に非常に安定であることを示している。

マウスインフルエンザ攻撃モデルを用いてのインビボ予防
ポリ（Ｉ：Ｃ）は、その抗ウイルス作用について文献で知られている。しかしながら、マウスインフルエンザモデルにおけるインビボ有効性を示すためには、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、毎日または水／リポソーム製剤中で与えられなければならなかった。去る１９７２年には、ポリ（Ｉ：Ｃ）がヒト試験において抗ウイルス予防処置剤として有効であることが示されており、この試験では、ボランティアがヒトライノウイルス（ＨＲＶ）またはインフルエンザウイルスで攻撃された。しかしながら、この研究においては、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、２時間おきに与えられなければならなかった。我々の噴霧乾燥概念がＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）と比べて同様のインビトロ生物活性および増大したＲＴ安定性を示したので、我々は、種々の概念の抗ウイルス活性を試験するために、インビボ試験に従事した。この目的のために、０日目の高容量（２５μｌ）インフルエンザ攻撃の数日前に、単回鼻腔内用量の（噴霧乾燥された）ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤でマウスを処理した。噴霧乾燥概念は、粒子の解離を防ぐために、小体積（１５μｌ）の有機キャリア溶媒（エタノールまたはエタノール／グリセロール １／１ ｗ／ｗ）を用いて適用した。体重減少（０日目を基準とする）、一般挙動および生存を、１４日間にわたってモニタリングした（さらなる詳細については材料および方法参照）。興味深いことに、我々は、ＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）およびＰＢＳ中の噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）による単回処置は、体重減少および生存に関して有意でないマウスの保護によって示されたように、インフルエンザ攻撃に対して非常に小さな予防効果しか有さなかったことを観察した（表６）。これについての１つの説明は、噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン（Ｉ：Ｃ）がＰＢＳに溶解し、したがって、ポリ（Ｉ：Ｃ）と同様の応答をもたらしたというものである。ＰＢＳ中のポリ（Ｉ：Ｃ）は、２日続けて与えられた場合の方が僅かにより有効であったが、プラセボコントロールマウスとの差は有意ではなかった。驚くべきことに、エタノール中の部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）概念は、インフルエンザ攻撃に対する有意な保護を与えて優れた生存を結果としてもたらすために、単回の処置しか必要としなかった。明らかに、部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）の微小球粒子形態が、インフルエンザに対する優れた保護を結果としてもたらす作用機序の重大な部分である。

次の実験において、我々は、キャリア溶媒としてのエタノールがインフルエンザ攻撃の重症度に対して何らかの影響を有していたか否か比較した。表７に、ＰＢＳプラセボ処置マウスと比べたエタノール処置マウスの結果を示す。この実験において、インフルエンザ攻撃は、インフルエンザ攻撃後の生存に対するエタノール前処置の正または負の影響を我々が観察することができた表６の実験において用いられた攻撃と比べると、少し攻撃力が小さかった。我々は、エタノール処置マウスがＰＢＳ前処置マウスと比べて、インフルエンザ攻撃に対して非常に類似した感受性を経験したことを観察した。したがって、我々は、エタノールが抗ウイルス作用に積極的には寄与しておらず、したがって、概念の微小球粒子形態を保持する鼻腔内投与用キャリア溶媒として使用され得ると結論付ける。注目すべきは、製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）は、ポリ（Ｉ：Ｃ）がエタノール中で沈殿し、したがってポリ（Ｉ：Ｃ）の制御された適用を妨げたので、エタノール中では適用され得なかった。

次の工程で、我々は、部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）の粒子を生成するための概念の噴霧乾燥または成分の単なる混合が、抗ウイルス作用を観察するために必要とされるか否か／十分であるか否かという疑問に取り組んだ。この点に関して、我々は、乾燥粉末ポリ（Ｉ：Ｃ）を乾燥粉末デンプンと混合し（混合ポリ（Ｉ：Ｃ）−デンプン）、これを、噴霧乾燥されたデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）およびプラセボと比較した。我々は、この場合もまたインフルエンザ攻撃に対する優れたかつ有意な保護を結果としてもたらした部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）の噴霧乾燥製剤とは異なり、混合された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）は、インフルエンザ攻撃に対して有意な保護効果を有していなかったことを観察した（表８）。

噴霧乾燥ミクロ粒子が他の有機溶媒中でも投与され得るか否かを試験するために、我々は、ポリ（Ｉ：Ｃ）ミクロ粒子のためのキャリア溶媒としてのグリセロールの使用を試験した。このキャリアの使用もまた可能であり、有意な保護を結果としてもたらしたが、グリセロールの高い粘度によって、点鼻薬を鼻腔内に適用することがやや困難になることが分かった。したがって、我々は、ミクロ粒子を適用するために、エタノール／グリセロールの１／１混合物を試験した。この実験の結果は表９に示されており、エタノール／グリセロール中のミクロ粒子の単回投与が、プラセボ（エタノール／グリセロールのみ）と比較して、インフルエンザ攻撃からの有意な改善された生存を結果としてもたらすということを明確に示している。

次の工程で、我々は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の噴霧乾燥製剤における異なるキャリアポリマーの使用を試験した。この点に関して、我々は、プラセボ処置マウスを、ポリ（Ｉ：Ｃ）処置マウスと、および噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）または噴霧乾燥されたＮａ−アルギネート−ポリ（Ｉ：Ｃ）のいずれかと比較した。我々は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の噴霧乾燥ミクロ粒子のみが、その後のインフルエンザによる攻撃が原因で起こる重篤な体重減少からマウスを保護したことを観察した（表１０参照）。ポリ（Ｉ：Ｃ）単独は、体重減少に対して保護しなかった。これらの結果は、噴霧乾燥ミクロ粒子中のポリ（Ｉ：Ｃ）とキャリアポリマーとの組み合わせが、ウイルス病原体に対する十分な保護を与えるために必要とされるということを示している。キャリアポリマーの性質は、ミクロ粒子構造が保持される限りにおいてそれほど重要ではない（表６参照、噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＰＢＳに溶解された場合は有効ではない）。

最後に、我々は、製剤中で必要とされるポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度、および製剤中で必要とされるミクロ粒子径を特定するために、異なる部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を互いに、およびＰＢＳ中の製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）と比較した。この点に関して、我々は、５０／１および１００／１および２００／１の比でさらなる噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン／ポリ（Ｉ：Ｃ）を、ならびにそれぞれ（Ｄ_Ｖ５０）９μｍ（１／９、０．４５％）および（Ｄ_Ｖ５０）１７μｍ（１／９、１０％）の粒径を有する部分アルファ化トウモロコシデンプン／ポリ（Ｉ：Ｃ）を製造した。これらの製剤と製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）との比較の結果を表１１に示す。我々は、１／１００〜１／９の間のポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度がインフルエンザに対する良好な保護を結果としてもたらすことを観察した。ポリ（Ｉ：Ｃ）をデンプンでさらに希釈することは、それほど効率的でない、有意でない保護を結果としてもたらした。さらに、我々は、異なる粒径の２つのバッチにおいて目立った相違を観察しなかったのであるが、このことは、９μｍ〜１８μｍの間の粒径（Ｄ_Ｖ５０）がポリ（Ｉ：Ｃ）ミクロ粒子によって有効な保護を与えるのに十分であるということを示している。

結論
ポリ（Ｉ：Ｃ）の経鼻送達のために、４つの粉末概念を、噴霧乾燥によって製造した。Ｎａ−アルギネート（概念１）、Ｎａ−ＣＭＣ（概念２）、部分アルファ化トウモロコシデンプン（概念３）およびＤＰＰＣ（概念４）を用いた概念を、生物活性スクリーンおよび加工性に基づいて選択した。４つの概念を全て、製剤中のポリ（Ｉ：Ｃ）の生物活性および安定性を測定するために、インビトロで試験した。我々の結果は、噴霧乾燥処理が、ポリ（Ｉ：Ｃ）の生物活性に対して負の影響を有さないということを示している。さらに、これらの製剤は、ＰＢＳに溶解されたポリ（Ｉ：Ｃ）とは異なり、室温において安定である。

次の工程で、我々は、マウスインフルエンザ攻撃モデルを用いてのインフルエンザの予防において、概念１および３を試験した。文献に基づき、実験を、概念１および３が製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＢＳ中）と同様の保護効果を有するはずであるという意図で開始した。驚くべきことに、概念１および３が、その後のインフルエンザによる攻撃に対してマウスを保護することにおいてポリ（Ｉ：Ｃ）よりも優れているということを見出した。単回用量の製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）はマウスを保護することにおいてあまり効率的でないようであったが、より有効であるためにはポリ（Ｉ：Ｃ）は数回投与される必要があるようであった。しかしながら、製剤化されたポリ（Ｉ：Ｃ）（概念１および３）の単回投与は、有意にマウスを保護した。さらに、（ＰＢＳ溶解ミクロ粒子はインビボでは活性を失った（表６）がインビトロでは失わなかった（図１および２）ので）ミクロ粒子構造が極めて重要であることが示された。粒径を保持するために、我々は、エタノールキャリア溶媒中、またはエタノール／グリセロールキャリア溶媒中でミクロ粒子を投与した。９マイクロメートル〜１７マイクロメートルの間の粒径（Ｄ_Ｖ５０）が有効であった。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、１００／１〜９／１（デンプン／ポリ（Ｉ：Ｃ））の希釈において有効であった。

結論として、我々は、単回用量鼻腔内ポリ（Ｉ：Ｃ）投与のインビボ有効性を改善してその後のインフルエンザの致死的攻撃に対する予防的保護を与える新規の概念を特定した。

噴霧乾燥ミクロ粒子が他の有機溶媒中でも投与され得るか否かを試験するために、我々は、ポリ（Ｉ：Ｃ）ミクロ粒子のためのキャリア溶媒としてのグリセロールの使用を試験した。このキャリアの使用もまた可能であり、有意な保護を結果としてもたらしたが、グリセロールの高い粘度によって、点鼻薬を鼻腔内に適用することがやや困難になることが分かった。したがって、我々は、ミクロ粒子を適用するために、エタノール／グリセロールの１／１混合物を試験した。この実験の結果は表９に示されており、エタノール／グリセロール中のミクロ粒子の単回投与が、プラセボ（エタノール／グリセロールのみ）と比較して、インフルエンザ攻撃からの有意な改善された生存を結果としてもたらすということを明確に示している。

次の工程で、我々は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の噴霧乾燥製剤における異なるキャリアポリマーの使用を試験した。この点に関して、我々は、プラセボ処置マウスを、ポリ（Ｉ：Ｃ）処置マウスと、および噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）または噴霧乾燥されたＮａ−アルギネート−ポリ（Ｉ：Ｃ）のいずれかと比較した。我々は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の噴霧乾燥ミクロ粒子のみが、その後のインフルエンザによる攻撃が原因で起こる重篤な体重減少からマウスを保護したことを観察した（表１０参照）。ポリ（Ｉ：Ｃ）単独は、体重減少に対して保護しなかった。これらの結果は、噴霧乾燥ミクロ粒子中のポリ（Ｉ：Ｃ）とキャリアポリマーとの組み合わせが、ウイルス病原体に対する十分な保護を与えるために必要とされるということを示している。キャリアポリマーの性質は、ミクロ粒子構造が保持される限りにおいてそれほど重要ではない（表６参照、噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＰＢＳに溶解された場合は有効ではない）。

最後に、我々は、製剤中で必要とされるポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度、および製剤中で必要とされるミクロ粒子径を特定するために、異なる部分アルファ化トウモロコシデンプン−ポリ（Ｉ：Ｃ）製剤を互いに、およびＰＢＳ中の製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）と比較した。この点に関して、我々は、５０／１および１００／１および２００／１の比でさらなる噴霧乾燥された部分アルファ化トウモロコシデンプン／ポリ（Ｉ：Ｃ）を、ならびにそれぞれ（Ｄ_Ｖ５０）９μｍ（１／９、０．４５％）および（Ｄ_Ｖ５０）１７μｍ（１／９、１０％）の粒径を有する部分アルファ化トウモロコシデンプン／ポリ（Ｉ：Ｃ）を製造した。これらの製剤と製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）との比較の結果を表１１に示す。我々は、１／１００〜１／９の間のポリ（Ｉ：Ｃ）の濃度がインフルエンザに対する良好な保護を結果としてもたらすことを観察した。ポリ（Ｉ：Ｃ）をデンプンでさらに希釈することは、それほど効率的でない、有意でない保護を結果としてもたらした。さらに、我々は、異なる粒径の２つのバッチにおいて目立った相違を観察しなかったのであるが、このことは、９μｍ〜１８μｍの間の粒径（Ｄ_Ｖ５０）がポリ（Ｉ：Ｃ）ミクロ粒子によって有効な保護を与えるのに十分であるということを示している。

結論
ポリ（Ｉ：Ｃ）の経鼻送達のために、４つの粉末概念を、噴霧乾燥によって製造した。Ｎａ−アルギネート（概念１）、Ｎａ−ＣＭＣ（概念２）、部分アルファ化トウモロコシデンプン（概念３）およびＤＰＰＣ（概念４）を用いた概念を、生物活性スクリーンおよび加工性に基づいて選択した。４つの概念を全て、製剤中のポリ（Ｉ：Ｃ）の生物活性および安定性を測定するために、インビトロで試験した。我々の結果は、噴霧乾燥処理が、ポリ（Ｉ：Ｃ）の生物活性に対して負の影響を有さないということを示している。さらに、これらの製剤は、ＰＢＳに溶解されたポリ（Ｉ：Ｃ）とは異なり、室温において安定である。

次の工程で、我々は、マウスインフルエンザ攻撃モデルを用いてのインフルエンザの予防において、概念１および３を試験した。文献に基づき、実験を、概念１および３が製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＢＳ中）と同様の保護効果を有するはずであるという意図で開始した。驚くべきことに、概念１および３が、その後のインフルエンザによる攻撃に対してマウスを保護することにおいてポリ（Ｉ：Ｃ）よりも優れているということを見出した。単回用量の製剤化されていないポリ（Ｉ：Ｃ）はマウスを保護することにおいてあまり効率的でないようであったが、より有効であるためにはポリ（Ｉ：Ｃ）は数回投与される必要があるようであった。しかしながら、製剤化されたポリ（Ｉ：Ｃ）（概念１および３）の単回投与は、有意にマウスを保護した。さらに、（ＰＢＳ溶解ミクロ粒子はインビボでは活性を失った（表６）がインビトロでは失わなかった（図１および２）ので）ミクロ粒子構造が極めて重要であることが示された。粒径を保持するために、我々は、エタノールキャリア溶媒中、またはエタノール／グリセロールキャリア溶媒中でミクロ粒子を投与した。９マイクロメートル〜１７マイクロメートルの間の粒径（Ｄ_Ｖ５０）が有効であった。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、１００／１〜９／１（デンプン／ポリ（Ｉ：Ｃ））の希釈において有効であった。

結論として、我々は、単回用量鼻腔内ポリ（Ｉ：Ｃ）投与のインビボ有効性を改善してその後のインフルエンザの致死的攻撃に対する予防的保護を与える新規の概念を特定した。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））と、デンプン、アルギネート、ブラノースまたはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から選択されるキャリアポリマーとのミクロ粒子を含む組成物。
［２］
前記キャリアポリマーが、デンプンである、上記［１］に記載の組成物。
［３］
ポリ（Ｉ：Ｃ）−キャリアポリマーミクロ粒子が、噴霧乾燥処理などの粒子形成処理によって製造される、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］
ポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプン比が、１／２００（ｗ／ｗ）〜１／０．１（ｗ／ｗ）の範囲である、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５］
前記ポリ（Ｉ：Ｃ）／デンプン比が、１／１２（ｗ／ｗ）〜１／９（ｗ／ｗ）の間である、上記［４］に記載の組成物。
［６］
前記ミクロ粒子のＤ _Ｖ ５０が、０．１マイクロメートル〜２００マイクロメートルの範囲である、上記［３］〜［５］のいずれか一項に記載の組成物。
［７］
前記組成物が、有機溶媒を含む液体組成物である、上記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の組成物。
［８］
前記有機溶媒が、グリセロールまたはエタノールまたはそれらの組み合わせをベースとするものである、上記［７］に記載の組成物。
［９］
医療における使用のための、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］
感染症または風邪の処置および／または予防における使用のための、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］
経鼻投与による上気道感染症の予防および／または処置のための医薬の製造のための、上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の組成物の使用。
［１２］
上記［１］〜［８］のいずれか一項に記載の組成物を含むデバイス、特に経鼻送達系。

Claims (40)

1. ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、水およびキャリアポリマーからなるミクロ粒子であって、前記キャリアポリマーが、デンプン、アルギネート、カルボキシメチルセルロースおよびジパルミトイルホスファチジルコリンから選択される、ミクロ粒子。
2. 前記ポリイノシン酸およびポリシチジル酸の平均鎖長が、およそ３００塩基〜６，０００塩基である、請求項１に記載のミクロ粒子。
3. 結合したポリイノシン酸およびポリシチジル酸の平均分子量が、およそ１８０ｋＤａ〜３，６００ｋＤａである、請求項１または２に記載のミクロ粒子。
4. 前記ポリイノシン酸およびポリシチジル酸が、ナトリウム塩として存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のミクロ粒子。
5. 前記キャリアポリマーが、デンプンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のミクロ粒子。
6. 前記デンプンキャリアポリマーが、部分アルファ化デンプンである、請求項５に記載のミクロ粒子。
7. 前記デンプンキャリアポリマーが、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはキャッサバデンプンである、請求項５に記載のミクロ粒子。
8. 前記デンプンが、部分アルファ化トウモロコシデンプンである、請求項５に記載のミクロ粒子。
9. 前記キャリアポリマーがアルギネートであり、かつ、前記アルギネートがアルギン酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のミクロ粒子。
10. 前記キャリアポリマーが、ジパルミトイルホスファチジルコリンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のミクロ粒子。
11. 前記ミクロ粒子中のキャリアポリマーに対するポリイノシン酸およびポリシチジル酸の組み合わせの比が、１／２００（ｗ／ｗ）〜１０／１（ｗ／ｗ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のミクロ粒子。
12. 前記ミクロ粒子中のキャリアポリマーに対するポリイノシン酸およびポリシチジル酸の組み合わせの比が、１／１００（ｗ／ｗ）〜１／１（ｗ／ｗ）である、請求項１１に記載のミクロ粒子。
13. 前記ミクロ粒子中のキャリアポリマーに対するポリイノシン酸およびポリシチジル酸の組み合わせの比が、１／１００（ｗ／ｗ）〜１／５（ｗ／ｗ）である、請求項１２に記載のミクロ粒子。
14. 前記ミクロ粒子中のキャリアポリマーに対するポリイノシン酸およびポリシチジル酸の組み合わせの比が、１／１２（ｗ／ｗ）〜１／９（ｗ／ｗ）である、請求項１３に記載のミクロ粒子。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複数のミクロ粒子を含む、組成物。
16. 前記組成物のミクロ粒子が、０．１μｍ〜１００μｍの間の平均粒径を有する、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記組成物のミクロ粒子が、０．１μｍ〜２００μｍのＤ_ｖ５０を有する、請求項１５または１６に記載の組成物。
18. 前記組成物のミクロ粒子が、１μｍ〜５０μｍのＤ_ｖ５０を有する、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記組成物のミクロ粒子が、２μｍ〜４０μｍのＤ_ｖ５０を有する、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記組成物のミクロ粒子が、２μｍ〜２０μｍのＤ_ｖ５０を有する、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記組成物のミクロ粒子が、１０μｍ〜２０μｍのＤ_ｖ５０を有する、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記組成物が、液体である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記組成物が、有機溶媒を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記有機溶媒が、グリセロール、エタノールまたはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記組成物が、リン酸緩衝食塩水を含む、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記組成物が、乾燥粉末である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
27. 前記ミクロ粒子が、１カ月の室温での貯蔵の間安定である、請求項２６に記載の組成物。
28. 上気道のウイルス感染症を予防する方法において使用するための請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法は、患者に前記組成物を投与する工程を含む、組成物。
29. 前記ウイルス感染症が、ヒトライノウイルス感染症またはインフルエンザウイルス感染症である、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記ウイルス感染が、ピコルナウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルスおよびメタニューモウイルスから選択される、請求項２９に記載の組成物。
31. 前記患者が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
32. 対象における上気道のウイルス感染症の予防において使用するための組成物であって、ここで、
    前記組成物は、ミクロ粒子を含み、前記ミクロ粒子は、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、水およびキャリアポリマーからなり、前記キャリアポリマーは、デンプン、アルギネート、カルボキシメチルセルロースおよびジパルミトイルホスファチジルコリンから選択される、組成物。
33. 対象が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する、請求項３２に記載の組成物。
34. 経鼻投与用の、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
35. 請求項１５〜３４のいずれか一項に記載の組成物を含む、経鼻送達系。
36. ミクロ粒子を含む組成物を含む、経鼻送達系であって、前記ミクロ粒子が、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、水およびキャリアポリマーからなり、前記キャリアポリマーは、デンプン、アルギネート、カルボキシメチルセルロースおよびジパルミトイルホスファチジルコリンから選択される、経鼻送達系。
37. 上気道感染症の予防および／または処置のための医薬の製造のための、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
38. 上気道感染症の予防および／または処置のための医薬の製造のための、ミクロ粒子を含む組成物の使用であって、前記ミクロ粒子は、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、水およびキャリアポリマーからなり、前記キャリアポリマーは、デンプン、アルギネート、カルボキシメチルセルロースおよびジパルミトイルホスファチジルコリンから選択される、使用。
39. 請求項１５〜３４のいずれか一項に記載の組成物を含む、デバイス。
40. ミクロ粒子を含む組成物を含む、デバイスであって、前記ミクロ粒子が、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、水およびキャリアポリマーからなり、前記キャリアポリマーは、デンプン、アルギネート、カルボキシメチルセルロースおよびジパルミトイルホスファチジルコリンから選択される、デバイス。