KR20030051687A

KR20030051687A - 분자량이 감소된 정제 아밀로펙틴-기제 녹말을 갖는서방투여용 생분해성 미세입자

Info

Publication number: KR20030051687A
Application number: KR10-2003-7004508A
Authority: KR
Inventors: 잰슨모니카; 구스타프슨닐스오베; 라크소티모; 레스로우매츠
Original assignee: 자고텍 아게
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2003-06-25
Also published as: EP1322291A1; AU2001294458B2; HK1061981A1; CA2424892A1; AU2001292529A1; WO2002028371A1; CA2424936A1; HUP0302622A3; US20020098203A1; WO2002028370A1; HUP0302622A2; AU9445801A; CN100352427C; EP1322290A1; JP2004510724A; CN1468093A; JP2004510723A

Abstract

감소된 분자량을 갖는 정제된 아밀로펙틴-기제 녹말의 20중량% 이상의 수용액을 제조하고, 이 용액을 생물학적 활성물질과 혼합하며, 중합체 용액의 외부상에 녹말 방울의 유제를 형성하고, 이 녹말 방울을 겔화시키고, 겔화된 녹말 입자를 건조시키는 것을 포함하는 비경구적으로 투여가능한 미세입자의 제조방법에 관한 것이다. 방출 제어 외피도 경우에 따라 상기 입자에 적용될 수 있다. 본질적으로 상기 녹말로 구성된 미세입자는 50㎍ 미만의 아미노산 함량을 가지며 공유화학적 가교결합을 갖지 않는다.

Description

분자량이 감소된 정제 아밀로펙틴-기제 녹말을 갖는 서방투여용 생분해성 미세입자{Biodegradable microparticles for controlled release administration, with purified amylopectin-based starch of reduced molecular weight}

많은 약물들은 예컨대 경구적 또는 경비적 또는 직장 경로로 투여될 때 분해되기 쉽거나 불충분하게 흡수되기 때문에 주사로 투여되어야한다. 비경구적으로 사용하기 위한 약물 제제는 인간 적용에 대한 규제기관으로부터 승인을 받기 위해 수많은 요건을 만족시켜야한다. 따라서 그러한 제제는 생체적합성이어야하고 생분해성이어야하며 또 모든 사용된 물질 및 이들의 분해생성물은 독성이 없어야한다. 또한, 주사에 이용하기 위한 미립자 약물은 주사바늘을 통과할 만큼 충분히 작아야하며, 이는 이들이 바람직하게는 200㎛ 보다 작아야함을 의미한다. 약물은 그 제조 또는 저장중에 또는 투여된 후에 상당한 정도로 그 제제에서 분해되지 않아야 하며또 재현가능한 역학으로 생물학적 활성 형태로 방출되어야한다.

생체적합성 및 무해한 최종생성물로의 생분해성 요건을 만족하는 중합체의 한 종류는 젖산, 글리콜산 및 이들의 혼합물을 기본한 직선상 폴리에스테르이다. 이들 중합체를 이후 "PLGA"라 칭한다. 이 PLGA는 에스테르 가수분해에 의해 젖산과 글리콜산으로 분해되며 또한 탁월한 생체적합성을 갖는 것으로 밝혀졌다. PLGA의 무독성 성질은 이들 중합체를 기본한 몇 개의 비경구적 지연방출 제제에 대한 미국 식품의약청(US FDA)을 비롯한 규제기관의 승인에 의해 예시될 수 있다.

현재 시판되고 있고 PLGA를 기본한 비경구적으로 투여가능한 지연방출 제품은 Decapeptyl^TM(입센 바이오테크 제조), Prostap SR^TM(레데르레 제조), Decapeptyl^TMDepot (페링 제조) 및 Zoladex^R(제네카 제조)를 포함한다. 이들 제제속의 약물은 모두 펩티드이다. 다시 말해, 이들은 비교적 중합도가 낮은 중합체로 축합된 아미노산으로 구성되어 있으며 또 이들은 잘 정의된 3차원 구조를 갖지 않는다. 이는, 상기 제품들을 제조하는 동안 비교적 엄격한 조건의 이용을 가능하게한다. 예컨대, 압출 및 뒤이은 사이즈 리덕션(size reduction)을 이용할 수 있는데, 이들 수법은 단백질이 일반적으로 그러한 엄격한 조건을 견딜 수 없기 때문에 단백질과 관련해서는 이용될 수 없는 것이다.

따라서, 단백질에 대한 서방성 제제가 또한 요청된다. 단백질은 아미노산으로 구성된 점에서는 펩티드와 유사하지만, 그 분자는 더 크고 또 대부분의 단백질은 생물학적 활성 및 면역원성을 비롯한 이들의 많은 특성면에서 잘 규정된 3차원구조에 따라 다를 것이다. 이들의 3차원 구조는 예컨대 고온, 표면-유도 변성 및 많은 경우 유기용매에 대한 노출에 의해 비교적 용이하게 파괴될 수 있다. 단백질의 지연방출면에서 아주 우수한 물질인 PLGA의 사용과 결부된 아주 결정적인 결점은 상기 PLGA를 용해시키기 위하여 유기용매를 사용할 필요가 있다는 점인데, 이는 단백질의 안정성이 손상될 우려 및 단백질 형태변화가 환자에서 면역반응을 초래함으로써 억제성 항체 형성을 통한 치료효과의 손실과 독성 부작용을 가져오는 부수적인 위험을 갖고 있다. 복합 단백질이 그의 3차원 구조를 모든 면에서 그대로 유지하는지 확실히 결정하기는 극히 어렵기 때문에, 그러한 형태변화를 유발할 수 있는 조건에 단백질이 노출되지 않게 하는 것이 아주 중요하다.

PLGA의 제조 공정중 고유한 단백질 불안정성 문제를 피하기 위해 PLGA 기술을 변형하려는 많은 노력에도 불구하고, 이 분야에서의 진보는 아주 느렸는데, 그 주요 원인은 아마도 대부분 단백질의 3차원 구조가 너무 민감해서, 이용된 제조조건 및 PLGA 매트릭스 분해시 형성되는 화학적 산성 환경을 견딜 수 없기 때문일 것이다. 과학문헌에는 PLGA 마이크로스피어(microsphere) 제조시 유기용매 노출에 기인한 안정성 문제가 다수 기재되어 있다. PLGA 매트릭스 분해시 형성되는 산성 환경의 일례로서, 직경 약 40 ㎛의 PLGA 마이크로스피어에서 pH값은 1.5로 떨어진다는 것이 최근 밝혀졌는데, 이 값은 많은 치료학적으로 사용될 수 있는 단백질을 충분히 변성 또는 손상시킬 수 있는 것이다(Fu 등, Visual Evidence of Acidic Environment Within Degrading Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) Microspheres, Pharmaceutical Research, Vol. 17, No. 1, 2000, 100-106 ). 마이크로스피어가 더 큰 직경을 갖는다면, 산성 분해생성물이 확산되어 나가기가 더 어려워져 자동촉매반응이 강화될 것이므로 pH값은 더욱 떨어질 것으로 예상될 수 있다.

단백질 및 펩티드와 같은 수용성 물질을 캡슐화하기 위해 현재 가장 일반적으로 사용되는 수법은 다중 유제 시스템을 이용하는 것이다. 약물 물질을 수성 또는 완충액에 용해시킨 다음, 물과 섞이지 않고 용해된 중합체를 함유하는 유기용매와 혼합한다. 수성 상을 내부상으로 갖는 유제가 형성된다. 상이한 유형의 유화제 및 급격한 혼합을 이용하여 상기 제1 유제를 생성한다. 이 유제를, 교반하에서, 폴리비닐 알코올과 같은 다른 중합체를 함유하는 다른 액체, 흔히 물로 전달하여 물/오일/물 삼중 유제를 생성한다. 이어 마이크로스피어를 경화시킨다. 가장 일반적인 방법은 비점이 낮은 유기용매, 전형적으로 디클로로메탄을 이용하고 또 그 용매를 증류제거하는 것이다. 유기용매가 물과 충분히 섞이지 않으면, 더 많은 물을 부가함으로써 연속 추출과정이 삼중 유제에 이용될 수 있다. 상술한 일반적 과정에 대한 수많은 변형이 문헌에 기재되어 있다. 특정 경우, 일차 유제를 비 수성 상, 예컨대 실리콘 오일과 혼합하는 경우도 있다. 고형 약물 물질은 용해된 약물 물질 대신 사용될 수도 있다.

단백질을 함유하는 PLGA 마이크로스피어는 WO A1-9013780호에 기재되어 있으며, 그 주요 특징은 단백질내의 높은 생물학적 활성을 유지시키기 위하여 마이크로스피어 제조중에 아주 낮은 온도를 이용하는 것이다. 캡슐화된 슈퍼옥사이드 디스뮤테이션(dismutation) 활성은 입자로부터 방출된 부분에서만 측정된다. 이 방법은WO-A1-9412158호에 기재된 인간 성장 호르몬을 함유하는 PLGA 마이크로스피어를 생산하기 위해 이용되어 왔으며, 상기 인간 성장 호르몬은 PLGA를 함유하는 염화메틸렌에 분산되며, 수득한 분산액을 액체 질소층 아래의 냉동 에탄올 용기에 살포하여 미세 방울을 냉동시켜 이 방울들을 에탄올상의 질소에 고정시킨다. 이 에탄올을 이어 해동시키면 마이크로스피어는 에탄올에 가라앉기 시작하며, 염화메틸렌을 에탄올중에서 추출하여 마이크로스피어를 고화시킨다. 상기 방법을 이용하면, PLGA 마이크로스피어에 단백질을 집어넣기 위한 다른 대다수의 방법에서 보다 훨씬 더 양호하게 단백질 안정성이 유지될 수 있고, 또 어떤 제품은 미국에서 규제기관에 의해 최근 승인을 받았다. 그러나, 이 방법은 다른 단백질에 대해서는 아직 분명히 입증되어 있지 않고 또 상기 포함된 생물학적 활성물질은 PLGA 매트릭스의 분해 동안 매우 낮은 pH에 노출되는 문제가 존재한다.

PLGA를 사용한 캡슐화를 기본한 상술한 방법에서, 활성물질들은 여전히 유기용매에 노출되며 또 이것은 일반적으로 단백질의 안정성에 유해하다. 게다가, 상기 논의된 유제 방법들은 복잡해서 공업적 규모로 설계하기에는 문제가 있을 것이다. 또한, 이들 방법의 다수에서 이용된 다수의 유기용매는 환경문제와 관련이 있고 또 PLGA 중합체에 대한 이들의 높은 친화성으로 인하여 제거하기가 어렵다.

생물학적 활성물질이 마이크로스피어 매트릭스의 생분해중 화학적으로 산성인 환경에 노출되는 것과 제조공정중 유기용매에 노출되는 것에 의해 제기된 상술한 문제를 해결하기 위한 수많은 시도가 기재되어 있다. 생분해하는 동안 산성환경을 피하기 위하여, 마이크로스피어에 대한 매트릭스인 PLGA를 화학적으로 중성인분해생성물을 생성하는 중합체로 교체하려는 시도가 실시되었고 또 생물학적 활성물질이 유기용매에 노출되는 것을 피하기 위하여, 일단 제조 건조되면 생물학적 활성물질을 갖게되는 진보된 마이크로스피어를 제조하려는 시도, 또는 마이크로스피어를 제조하는 동안 유기용매를 배제시키거나 제한하려는 시도가 행해져 왔다.

일례로서, 고도로 분지된 비교적 저분자량의 녹말(말토덱스트린, 평균 분자량 약 5 000 Da)을 마이크로스피어로 고화될 수 있는 형태로 전환시키기 위해 아크릴기를 사용하여 공유적으로 변형시키고, 그로부터 얻은 폴리아크릴 녹말을 유제중에서 외부상인 톨루엔/클로로포름(4:1)과 라디칼 중합반응시킴으로써 미립자 형태로 전환시켰다(Characterization of Polyacryl Starch Microparticles as Carriers for Proteins and Drugs, Artursson et al, J Pharm Sci, 73, 1507-1513, 1984 ). 단백질은 상기 마이크로스피어에 포함되어 있을 수 있지만, 그 제조조건을 보면 유제 제조시 생물학적 활성물질이 유기용매와 높은 전단력 모두에 노출되게된다. 수득한 마이크로스피어는 효소적으로 용해되어 있고 그 pH는 중성으로 유지될 수 있을 것이다. 수득한 마이크로스피어는 많은 이유로 인하여 비경구적 투여, 특히 반복되는 비경구 투여용으로는 적합하지 않다. 무엇보다 가장 중요한 것은 녹말 매트릭스 및 이들 녹말 분자를 가교결합시키는 합성 중합체 쇄가 불완전하며 생분해성이 아주 느리다는 점이다(Biodegradable Microspheres IV. Factors Affecting the Distribution and Degradation of Polyacryl Starch Microparticels, Laakso et al, J Pharm Sci 75, 962-967, 1986). 더구나, 이들 마이크로스피어는 직경이 <2 ㎛ 정도로 너무 작아서 서방성이 필요한 조직에 주사되기에는 부적합한데, 이는조직 대식세포가 이들을 용이하게 식균작용할 수 있기 때문이다. 아크릴기를 고분지된 녹말에 결합시키기 위해 강력한 생분해성 에스테르기를 도입함으로써 분해율과 분해도를 증가시키려는 시도는 목적한 결과를 내지 못하였고 이들 폴리아크릴 녹말 마이크로스피어는 오히려 너무 느리게 생분해되었고 적합한 시간 동안 불완전하였다(BIODEGRADABLE MICROSPHERES: Some Properties of Polyacryl Starch Microparticles Prepared from Acrylic acid Esterified Starch, Laakso and Sjoholm, 1987 (76), pp. 935-939, J Pharm Sci.).

폴리아크릴 덱스트란의 마이크로스피어는 2상 수성계로 제조되어 왔다(Stenekes et al, The Preparation of Dextran Microspheres in an All-Aqueous System: Effect of the Formulation Parameters on Particle Characteristics, Pharmaceutical Research, Vol. 15, No. 4, 1998, 557-561, and Franssen and Hennink, A novel preparation method for polymeric microparticles without using organic solvents, Int J Pharm 168, I-7, 1998). 이러한 모드의 과정에 의해, 생물학적 활성물질은 유기용매에 노출되지 않게 되지만, 그밖의 것에 관해서는 마이크로스피어는 상술한 폴리아크릴 녹말 마이크로스피어에 대해 기술한 특성과 동일한 특성을 가지므로 반복되는 비경구적 투여용으로는 적합하지 않다. 인간은 특정 덱스트란-분해 효소를 갖지 않는다는 것을 고려할 때, 분해율은 폴리아크릴 녹말 마이크로스피어에 비해서 더 낮아야한다. 덱스트란의 사용은 또한 심각한 앨러지 반응의 특정 위험과 관련되어 있다.

오일을 외부상으로 하여 비-화학적으로 변형된 녹말을 사용하여 녹말 마이크로스피어를 제조하는 것은 공지되어 있다(미국특허 4,713,249호; Schroder, U., Crystallized carbohydrate spheres for slow release and targeting, Methods Enzymol, 1985 (112), 116-128; Schroder, U., Crystallized Carbohydrate spheres as a slow release matrix for biologically active substances, Bio-materials 5: 100-104, 1984). 이들 경우에서 마이크로스피어는 아세톤에 석출되는 것에 의해 고화되어, 생물학적 활성물질을 유기용매에 노출시키고 또 제조공정중에 녹말이 물리적 가교를 통하여 고화되는 자연적인 경향을 이용하지 못하게 만든다. 이것은 다시 말해 선천적 불안정성을 갖는 마이크로스피어를 초래하게되는데, 녹말은 물에 재현탁된 후 및 체액에 노출될 때 그러한 가교결합을 형성하려고 애쓰기 때문이다. 오일중물형 유제를 얻기 위해서는 고전단력이 요구되고 또 형성되는 마이크로스피어는 너무 작아서 비경구적 서방형에 적합하지 않다.

EP 213303 A2호는 2상 액체계의 화학적으로 변형되지 않은 녹말의 마이크로스피어를 제조하는 것을 개시하고 있으며, 이것은 물리적 가교결합의 형성을 통하여 녹말이 고화되는 천연 능력 및 생물학적 활성물질이 유기용매에 노출되는 것을 피하기 위해 마이크로스피어에 물질을 고정시키는 것을 이용하고 있다. 정의된 녹말 특성과 조합된 상기 방법은 충분히 생분해가능한 입자를 제공하지 않는다. 상기 얻은 입자는 주사용, 특히 장기간에 걸친 반복 주사용으로는 적합하지 않은데, 이는 상술한 녹말의 특성이 너무 많은 양의 외래 영양 단백질을 함유하고 있기 때문이다. 이 특허가 시사하는 점과는 대조적으로, 놀랍게도 2상 액체계를 형성하기 위해 필요한 양 보다 훨씬 고농도의 중합체를 사용하면 생물학적 활성분자의 수율을현저히 양호하게하고 생물학적 활성분자의 부하량을 더 높게할 수 있으며, 또 안정한 비-응집형 마이크로스피어를 얻기 위한 조건 및 이들의 크기 분포면에서 이점을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 상술한 온도처리는 민감한 마크로분자에 대해 이용될 수 없으며 에탄올 또는 아세톤을 사용하여 건조시키는 것을 포함하는 가공에 적용될 수 있다.

2상 액체계의 마이크로스피어를 제조하기 위한 다른 방법도 공지되어 있다. 미국특허 5 981 719호에서는, 생물학적 활성 마크로분자를, 마크로분자의 등전점과 가까운 pH에서, 중합체와 혼합함으로써 미세입자를 제조한 다음 에너지 공급, 바람직하게는 열 공급을 통하여 마이크로스피어를 안정화시킨다. 그 제조에서 마크로분자, 즉 생물학적 활성물질의 최저 함량은 40%이며, 이것은 대부분의 적용에서 너무 많은 양이어서 활성물질의 주사량의 불확실성을 초래하게되는데, 이것은 미세입자의 투여량이 너무 적게되기 때문이다. 상기 제조방법은 온화한 방법이고 또 포함된 생물학적 활성물질의 생물학적 활성을 유지할 수 있지만, 상기 미세입자는 가열에 의해 안정화되며, 예를들면, 가열은 적어도 58℃로 30분간 실시되며, 많은 경우 민감한 단백질이 견디지 못할 것으로 보이는 상당 기간 동안 70 내지 90℃로 가열되며, 그의 생물학적 활성은 3차원 구조에 따라 다르며, 상기 단백질이 상기 제조 방법을 분명히 견딘다하더라도, 적지만 결코 미미하지 않은 단백질 구조의 변형 우려가 여전히 존재한다. 외부상으로서, 2개 중합체, 일반적으로 폴리비닐 피롤리돈 및 PEG의 조합물이 언제나 사용되며, 이것은 이들 물질이 마이크로스피어로부터 재현가능하고 신뢰할만한 방식으로 세척 제거되어야하는 점에서 제조 공정을 복잡하게 만든다. 형성된 미세입자는 너무 작아서(실시예에서, 직경 0.1 ㎛ 미만의 값이 인용됨)비경구적 서방형, 예컨대 피하주사용으로는 적합하지 않는데, 이는 입자를 식균하며 조직에 존재하는 세포인 대식세포가 5-10, 가능하게는 20㎛까지의 마이크로스피어를 용이하게 식균작용을 할 수 있고, 식균작용된 입자는 리소좀 세포내에 배치되며, 그곳에서 입자와 생물학적 활성물질이 분해되어 치료효과가 상실되게된다. 아주 작은 입자 크기는 또한 마이크로스피어의 가공을 보다 복잡하게 만들기도 하는데, 여과와 같은 바람직한 방법이 이용될 수 없기 때문이다. 미국특허 5 849 884호에 대해서도 마찬가지이다.

미국특허 5 578 709호 및 EP 0 688 429 B1호는 마크로분자 미세입자 용액을 제조하기 위한 2상 수성 계의 사용과 미세입자를 형성하기 위한 탈수 마크로분자의 화학적 또는 열적 가교결합을 개시하고 있다. 생물학적 활성 마크로분자를 화학적으로 가교결합시키는 것은 전적으로 바람직하지 않은데, 이것은 이러한 종류의 화학적 변형은 민감한 단백질의 생활성을 감소시키고 단백질의 새로운 항원 결정기에 대한 면역반응 유도 위험과 같은 다수의 심각한 결점을 갖고 있기 때문이며, 그에 따라 생성물의 안전성을 조사하기 위해 광범위한 독물학적 연구가 필요하게된다. 글루타르알데히드와 화학적 가교결합을 통하여 제조된 미세입자는 전부터 공지되어 있으며 일반적으로 인간에게 비경구적으로 반복투여하기에 적합하지 않은 것으로 알려져있다. 미국특허 5 578 709호에 기재된 미세입자는, 화학적 변형 또는 유해 온도에 노출됨으로 인하여 민감한 단백질을 제조하기에 바람직하지 않은 조건을 갖고 또 미세입자 크기분포가 비경구적 서방형으로 사용하기에는 너무 작고 마이크로스피어의 후-제조공정을 복잡하게 하는 등의 일반적으로 미국특허 5 981 719호에 기재된 것과 동일한 결점을 갖는다.

WO 97/14408호는 생물학적 활성물질을 유기용매에 노출시킴없이 비경구적 투여 이후 서방형이 되도록 미세입자를 제조하는 공기-현탁 수법을 개시한다. 그러나, 상기 문헌은 본 발명에 따른 방법 또는 그에 의해 얻을 수 있는 신규 미세입자에 대한 어떠한 안내도 제공하지 않는다.

미국극허 5 470 582호에서, PLGA로 구성되고 마크로분자를 함유하는 마이크로스피어는 유기 용매를 사용하여 마이크로스피어를 먼저 제조한 다음 유기용매가 이미 제거된 나중 단계에서 마크로분자를 부하시키는 2단계 방법에 의해 마크로분자를 제조한다. 이 과정은 생물학적 활성물질의 함량을 극히 적게, 일반적으로 1 내지 2%로 만들며, 아주 큰 분획은 주사직후 방출되어서 흔히 전체적으로 적합하지 않다. 이러한 아주 신속한 초기 방출은 1%의 경우 매우 높고 마이크로스피어 내의 활성물질 함량이 더 높을 때 더욱 더 현저해진다. PLGA 매트릭스의 분해시, pH는 민감한 마크로분자에 일반적으로 허용되지 않는 수준까지 떨어진다.

이러한 녹말은 이론적으로 매우 적합하고, 아마도 이상적인 미세입자용 매트릭스 물질로서 오랫동안 공지되어 있는데, 이는 녹말이 유기용매에 용해될 필요가 없고 또 천연적으로 고화되는 경향을 갖고 있으며 또 녹말을 내생물질 및 중성물질, 궁극적으로 글루코오스로 분해시킬 수 있는 체내 효소가 존재하기 때문이며 또 녹말은 내생 글리코겐과 유사함으로 인하여 비-면역원으로 알려져있기 때문이다. 열성적인 노력에도 불구하고, 비경구적 용도에 적합한 미세입자를 제조할 수 있도록 하는 특성 및 단백질과 같은 민감한 생물학적 활성물질이 포함될 수 있도록 하는 온화한 조건하에서 충분히 생분해가능한 미세입자를 제조할 수 있는 조건을 갖는 녹말은 전에는 제시되지 않았다.

녹말 과립은 천연적으로 녹말 단백질과 같은 불순물을 함유하고 있는데, 이것은 녹말과립을 비경구적 주사에 적합하지 않게 만든다. 안정화된 녹말 과립이 부서져있는 많은 유형의 작업용 장갑이 사용되는 작업에서 생길 수 있는 것과 같이, 불충분하게 정제된 녹말이 예상치 않게 침적되는 경우, 매우 심각한 2차 효과가 생길 수 있다. 녹말 과립은 허용될 수 있는 시간 간격내에 충분히 생분해될 수 없기 때문에 반복되는 비경구적 투여용으로 본질적으로 적합하지 않다.

산-가수분해되고 정제된 녹말로 제조된 녹말 마이크로스피어는 인간에 대한 비경구적 투여용으로 사용되어 왔다. 이 마이크로스피어는 강한 알칼리성 조건하에서 에피클로로히드린과의 화학적 가교결합에 의해 제조된다. 녹말에 의해 습득된 화학적 변형은 생분해능을 감소시키게되어 이들 마이크로스피어는 α-아밀라제와 같은 내생 효소에 의해 충분히 분해될 수 있지만, 최종 생성물로서 완전히 글루코오스로 전환되지 않는다. 얻어진 마이크로스피어 뿐만 아니라 제조방법은 민감한 단백질의 고정화에 적합하지 않으며, 가수분해된 아밀로오스를 기본적으로 하는 그러한 산-가수분해된 녹말은 충분히 생분해가능한 녹말 마이크로스피어 또는 고부하량의 단백질과 같은 생물학적 활성물질을 함유하는 녹말 마이크로스피어를 생성하기에 적합하지 않다.

히드록시에틸 녹말(HES)은 인간에게 비경구적으로 플라즈마 치환체로서 다량투여된다. HES는 대략적으로 고분지된 아밀로펙틴, 소위 "왁스성 옥수수"로 배타적으로 구성된 녹말로부터 얻은 녹말 과립에 의해 생성되며, 이것은 산-가수분해되어 분자량 분포를 감소시키고 이어 알칼리성 조건하에서 히드록시에틸화되며 또 다시 한번 산-가수분해되어 약 200,000 Da의 평균분자량에 도달한다. 이후에, 여과, 아세톤을 사용한 추출 및 분무-건조를 실시한다. 히드록시에틸화의 목적은 상기 효과의 지속시간을 연장시키는 것인데, 이것은 변형되지 않은 아밀로펙틴은 α-아밀라아제에 의해 아주 신속하게 분해되어 순환에서 그 체류시간이 약 10분이기 때문이다. HES는 생물학적 활성물질을 함유하는 완전히 생분해가능한 마이크로스피어의 제조용으로 적합하지 않은데, 그 이유는 화학적 변형이 생분해 속도와 생분해의 완전성을 현저히 감소시켜서 녹말이 비-공유 가교결합의 형성을 통하여 고화되는 천연적 경향이 없어지기 때문이다. 또한, HES의 고농축 용액은 너무 점성이 강해서 미세입자 제조용으로 사용될 수 없다. 이처럼 고 투여량의 HES를 사용하는 것은 HES가 화학적 가교결합없이 마이크로스피어의 제조에 이용될 수 없거나 또는 유기용매에 의해 석출되더라도, 비경구적으로 사용될 수 있는 녹말이 제조될 수 있음을 나타낸다.

WO 99/00425호는 표면-결합된 단백질의 녹말 과립을 세정시키기 위해 넓은 pH-최적 조건을 갖는 내열성 단백질분해 효소의 사용을 개시하고 있다. 얻어진 과립은 비경구적 투여에 적합하지 않은데, 그 이유는 상기 과립이 과립내에 존재하는 녹말 단백질을 여전히 함유하고 있고 또 부가된 단백질분해 효소의 잔여물이 과립내에 남겨져 있을 우려가 있기 때문이다. 이 과립은 2상 수성 계의 비경구적으로투여가능한 녹말 마이크로스피어의 제조용으로 적합하지 않은데, 그 이유는 이들 과립은, 용해된 이후에도, 충분히 높은 농도로 사용될 수 없는 잘못된 분자량 분포를 갖고 있기 때문이며, 마이크로스피어를 얻을 수 있다해도, 이들은 충분히 생분해될 수 없다.

정제를 제조하기 위해 더욱 우수한 녹말을 제조하기 위해 녹말의 분자량 분포를 변경하기 위해 전단력의 이용은 미국특허 5,455,342호 및 WO 93/21008호에 기재되어 있다. 이렇게하여 얻은 녹말은, 전단을 받은 후 변형된 형태로 존재할 수 있는 녹말 단백질의 함량이 높기 때문에 비경구적 투여용으로 적합하지 않고 또 얻어진 녹말은 비경구적 투여용의 생분해성 녹말 마이크로스피어 제조 또는 그러한 녹말 마이크로스피어 제조를 위한 2상 수성 계에서의 용도에 적합하지 않다. 전단력은 WO 96/10042호에 기재된 바와 같이 히드록시에틸녹말을 제조하기 위해서도 이용되어 왔다. 그러나, 상기와 유사한 이유로 인하여 이러한 히드록시에틸녹말은 비경구적 투여에 적합하지 않거나 또는 상술한 마이크로스피어의 제조용으로 적합하지 않다.

따라서 이하와 같은 특징을 갖는 비경구적으로 투여가능한 녹말 제제를 제조하기 위한 방법이 극히 바람직할 것이다:

● 민감한 생물학적 활성물질을 그 생물학적 활성을 유지하면서 미세입자내에 포함시킬 수 있는 방법;

● 생물학적 활성물질을 유기용매, 고온 또는 높은 전단력에 노출시키지 않는 조건하에서 생물학적 활성물질이 포함될 수 있고 또 이들 생물학적 활성물질이그 생물학적 활성을 유지할 수 있도록 하는 방법;

● 아주 민감한 생물학적 활성물질을 갖는 비경구적으로 투여가능한 제제를 고부하시킬 수 있는 방법;

● 비경구적 주사에 적합한, 실질적으로 충분히 생분해될 수 있고 생체적합한 제제가 제조될 수 있으며 그 분해시 화학적으로 중성인 내생 물질이 형성되는 방법;

● 조직 대식세포의 식균작용을 피하기 위해 20 ㎛를 초과하는 크기, 바람직하게는 30 ㎛를 초과하는 크기를 갖는 비경구적으로 주사가능한 제제가 제조될 수 있으며 제조중에 동일한 가공을 단순화시키는 방법;

● 서방성, 지속방출성 또는 지연방출성 제제의 제조시 중간체 생성물로서 사용될 수 있고 포함된 생물학적 물질의 화학적 안정성 및 생물학적 활성의 정확한 특성 제어를 가능하게하는 생물학적 활성물질을 함유하는 미세입자의 제조방법;

● 실질적으로 충분히 생분해가능한 녹말 미세입자의 제조에 적합한 비경구적으로 허용되는 녹말을 이용하는 방법;

● 비경구적 주사에 적합하고 분해시 화학적으로 중성의 내생 물질이 형성되는 실질적으로 완전히 생분해가능하고 생체적합한 미세입자 제제;

● 생물학적 활성물질을 함유하고 공기-현탁 수법을 이용함으로써 코팅하기에 적합한 입자 크기 분포를 가지며 상기 목적을 위해 충분한 기계적 강도를 갖는 미세입자 제제.

상술한 목적 및 기타 다른 목적은 이하에 정의한 본 발명에 의해 달성될 수있다.

본 발명은 생물학적 활성물질을 투여하기 위한 본초약물 제제 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 생물학적 활성물질, 특히 약물을 비경구적으로 투여하기 위한 서방성 미세입자(microparticle)에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 생물학적 활성물질을 함유하는 그러한 입자의 신규 제조방법 및 그에 의해 얻을 수 있는 신규한 서방성 입자에 관한 것이다.

본 발명의 제1 요지에 따르면, 미세입자의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 생물학적 활성물질을 함유하고 상기 물질을 포유류, 특히 인간에게 비경구적으로 투여하기 위한 미세입자의 제조방법에 관한 것이다. 상기 비경구적 투여는 일차적으로 미세입자를 주사에 의해 투여하는 것을 의미한다.

상기 미세입자는 주사하기 위한 것이므로, 10-200 ㎛, 일반적으로 20-100 ㎛, 특히 20-80㎛ 범위의 평균 입경을 갖는 입자의 제조가 문제가 된다.

본 발명과 관련하여 "미세입자"라는 표현은 당해분야에서 공지된 특정 크기를 갖는 입자에 대한 일반적 표시로 사용된다. 일개 유형의 미세입자는 주로 구형의 미세입자이지만, 상기 용어 미세입자는 이상적인 구형으로부터 약간 벗어난 것도 일반적으로 포함한다. 당해 분야에서 공지된 용어 미세캡슐도 공지 기술에 따르면 상기 표현 "미세입자"에 포함된다.

보다 상세하게는 본 발명에 따른 방법은 다음을 포함한다:

a) 아밀로펙틴 함량이 85 중량% 이상이고, 상기 아밀로펙틴의 분자량은 아밀로펙틴의 80중량% 이상이 10-10 000 kDa 범위에 존재하도록 감소된 것이며, 또 녹말의 g 건조중량당 50 ㎍ 미만의 아미노산 질소 함량을 갖는 녹말을 함유하는 녹말 수용액을 제조하고, 이때 수용액의 녹말 농도는 20중량% 이상이며;

b) 생물학적 활성물질을 상기 녹말 용액과 혼합시켜 녹말 용액중에 활성물질의 용액, 유제 또는 현탁액 형태로 조성물을 형성시키고;

c) 상기 b) 단계에서 얻은 조성물을 2상 수성 계를 형성하는 능력을 갖는 중합체의 수용액과 혼합하여, 상기 중합체 용액의 외부상내에 생물학적 활성물질을 내부상으로 함유하는 녹말방울의 유제를 형성하며;

d) 상기 단계 c)에서 얻은 녹말 방울을 겔화시켜 녹말이 고화되는 천연 특성을 통하여 녹말 입자를 생성하고;

e) 상기 녹말 입자를 건조시키며; 또

f) 경우에 따라 생체적합한 생분해성 중합체의 방출-제어성 외피를, 바람직하게는 공기 현탁법에 의해, 상기 건조된 녹말 입자에 적용한다.

본 발명의 중요한 요지는 다시 말해서 미세입자 매트릭스와 같은 특정 유형의 녹말을 사용하는 것이다. 특히 적합한 1개 녹말 및 그의 제조방법은 스웨던 특허출원 0003616-0호에 기재되어 있다. 상기 경우, 전단에 의해 분자량 감소가 수반된다. 다른 유용한 녹말은 본 출원과 동시계류중인 PCT 출원인 발명의 명칭 "녹말"에 개시되어 있다.

마지막에 언급한 경우, 산 가수분해에 의해 분자량 감소가 수반된다.

녹말에 대한 자세한 사항은 상기 특허 출원으로부터 얻을 수 있으며, 따라서 상기 문헌에 포함된 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

이러한 녹말의 몇몇 더욱 중요한 특징은 이하에 기재한다. 높은 활성물질 수율을 갖는 완전히 생분해가능한 미세입자가 2상 수성 계로 형성되고 또 수득한 녹말 미세입자가 이하에 기재한 특성을 갖도록, 상기 녹말은 일반적으로 천연상태에서 녹말 과립으로서 아밀로펙틴이라 칭하는 주로 고분지된 녹말로 구성되어야한다.소망하는 농도 및 겔화 속도를 달성할 수 있도록 하는 분자량 분포를 가져야한다.

이와 관련하여, 용어 "생분해성"은 비경구적으로 투여된 이후 미세입자가 체내에서 용해되어 내생 물질, 궁극적으로 예컨대 글루코오스를 형성하는 것을 의미한다. 생분해능은 적합한 효소, 예컨대 α-아밀라아제와 함께 시험관에서 배양하는 것에 의해 결정 또는 측정할 수 있다. 상기 경우 배양기간 동안 상기 효소를 다수 첨가함으로써 배양 혼합물에 활성 효소가 영구적으로 존재하도록하는 것이 적합하다. 생분해능은 미세입자를 비경구적으로 주사, 예컨대 피하 주사 또는 근육내 주사하는 것에 의해 조사할 수 있으며 또 시간함수로 조직을 조직검사함으로써 조사할 수 있다.

생분해성 녹말 미세입자는 수주내, 일반적으로 1주내에 조직으로부터 보통 사라진다. 녹말 미세입자가 방출-제어성 외피로 피복된 경우, 생분해 속도를 결정하는 상기 외피는 다시 언제 알파-아밀라아제를 녹말 매트릭스에 적용할 수 있을 지를 결정한다.

생분해능은 미세입자를 비경구적으로 투여, 예컨대 피하 주사 또는 근육내 주사하는 것에 의해 조사할 수 있으며 또 시간함수로 조직의 조직검사를 통하여 조사할 수 있고, 흔히 단백질인 생물학적 활성물질은 그 자체내에 예컨대 다른 종에 투여되면 흔히 면역반응을 유도하는 능력을 갖고 있다. 예컨대 다수의 재조합적으로 생성된 인간 단백질은 시험 동물에서 면역반응을 유발할 수 있다.

녹말은 또한 비경구적으로 투여가능한 제제의 제조에 적합한 순도를 가져야한다. 안정하지만 그와 동시에 생분해성 미세입자를 얻기 위해, 제어되는 방식으로자연적으로 고화될 수 있어여하는 동시에, 물질의 생활성을 유지하는 조건하에서 생물학적 활성물질이 혼합될 수 있는 충분히 고농도의 충분히 안정한 용액을 형성할 수 있어야한다. 고 농도의 녹말은 생물학적 활성물질이 외부상으로 또는 내부와 외부상 사이의 계면으로 허용될 수 없을 정도로 분포되지 않도록 하는데 중요하다.

녹말의 특징과 관련한 다수의 바람직한 구체예는 다음과 같다.

녹말은 바람직하게는 녹말의 g 건조중량당 아미노산 질소가 20 ㎍ 이하, 보다 바람직하게는 10 ㎍ 이하, 가장 바람직하게는 5 ㎍ 이하인 순도를 갖는다.

상술한 아밀로펙틴의 분자량은 아밀로펙틴의 80중량% 이상이 100-4000 kDa, 보다 바람직하게는 200-1 000 kDa, 가장 바람직하게는 300-600 kDa 범위이도록 바람직하게 감소된다.

또한, 상기 녹말은 감소된 분자량을 갖는 아밀로펙틴 함량이 바람직하게는 95중량%를 넘는, 보다 바람직하게는 98중량%를 넘는다. 이것은 또한 100 중량%의 이러한 아밀로펙틴으로 구성될 수 있다.

다른 바람직한 구체예에 따르면, 녹말은 25중량%를 초과하는 농도로 물에 용해될 수 있는 유형이다. 이것은 일반적으로 원래 공지된 수법에 따라 물에 용해되는 능력, 즉 승온, 예컨대 약 80℃ 이하의 온도에서 용해되는 능력을 의미한다.

다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 녹말은 공유결합된 여분의 화학 기가 부족하며, 이러한 유형은 히드록시에틸 녹말에서 찾을 수 있다. 이것은 일반적으로 녹말이 천연 녹말에서 발견되는 유형의 기만을 함유하고 히드록시에틸 녹말과 같이 변형되지 않았음을 의미한다.

다른 바람직한 구체예는 내독소 함량이 25 EU/g 미만인 녹말을 포함한다.

더욱 바람직한 구체예는 그램당 100개 미만의 미생물, 흔히 10개 미만의 미생물을 함유하는 녹말을 포함한다.

녹말은 또한 수성 알칼리 용액으로 세척하는 것에 의해 표면-편재화된 단백질, 지질 및 내독소로부터 실질적으로 정제될 수 있고, 전단력에 의해 분자량을 감소시킬 수 있고 또 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 내부 단백질로부터 정제될 수 있다.

모든 상기 내용에서 순도가 관련되는 한, "필수적으로" 또는 "실질적으로" 유형의 표현은 일반적으로 최소 90%, 예컨대 95%, 99% 또는 99.9%를 의미한다.

사용된 녹말에서 아밀로펙틴이 주요 성분을 구성한다는 것은 일반적인 용어로 그의 점유가 녹말의 건조 중량을 기준하여 산출했을 때 60 내지 100 중량%이라는 것을 의미한다.

특정 경우, 단계 d)에서 겔화속도를 변형시키기 위하여 소량, 예컨대 2 내지 15중량%의 단쇄 아밀로오스를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 아밀로오스의 평균 분자량은 바람직하게는 2.5 내지 70 kDa, 특히 5 내지 45 kDa 범위이다. 단쇄 아밀로오스에 대한 다른 자세한 사항은 미국특허 명세서 3,881,991호로부터 얻을 수 있다.

단계 a)에서 녹말 용액을 형성할 때, 원래 공지된 수법에 따른 가열을 일반적으로 이용하여 녹말을 용해시킨다. 특히 바람직한 구체예는 오토클레이브 처리하에서 녹말을 용해시키는 것을 포함하며, 멸균되는 것이 특히 바람직하다. 상기 오토클레이브 처리는 수용액중, 예컨대 주사용 물 또는 적합한 완충액에서 실현될 수 있다.

생물학적 활성 물질이 민감한 단백질 또는 기타 온도 민감성 물질이면, 녹말 용액은 고려하고 있는 물질과 조합하기 전에 적합한 온도로 냉각시켜야 한다. 어떤 온도가 적합하지는 생물학적 활성물질의 열적 안정성에 의해 결정되지만, 순수하게 일반적 관점에서 약 60℃ 미만의 온도, 바람직하게는 55℃ 미만의 온도가 적합하다.

바람직한 구체예에 따르면, 활성물질은 많아야 60℃, 보다 바람직하게는 많아야 55℃, 가장 바람직하게는 20 내지 45℃ 범위, 특히 30 내지 37℃ 온도에서 녹말 용액과 조합된다.

단계 b)에서 혼합 작업의 경우, 녹말: 생물학적 활성 물질의 중량비는 3:1 내지 10 000:1, 바람직하게는 3:1 내지 100:1이 유리하게 이용된다.

상기 혼합 작업의 경우, 활성물질은, 2상 수성 계가 단계 c)에서 형성되기 전에, 녹말 용액과 혼합한다. 활성물질은 용해된 형태, 예컨대 완충액일 수 있거나, 또는 일반적으로 실온(20℃) 내지 45℃ 범위의 적합한 온도에서, 바람직하게는 많아야 37℃에서 고체, 무정형 또는 결정성 형태일 수 있다. 녹말 용액을 생물학적 활성물질에 부가하거나, 또는 그 반대로 할 수 있다. 상기 계에 사용하기 적합한 생물학적 활성물질, 예컨대 단백질이 거대분자이기 때문에, 용해된 거대분자의 용액을 녹말과 혼합하여 유제를 형성하는 경우, 상기 거대분자는 일반적으로 내부상 또는 석출물을 나타낸다. 이것은 생물학적 활성물질이 그의 생활성을 유지하거나또는 상당히 손실하지 않을 때 전체적으로 허용가능하다. 적합한 수법을 이용하여 교반하는 것에 의해 균질 용액, 유제 또는 현탁액을 생성할 수 있다. 이러한 수법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 그 예는 자기 교반, 프로펠러 교반 또는 하나 이상의 스테틱 믹서(static mixer)의 사용을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예는 프로펠러 교반을 이용한 경우로 표시된다.

본 발명에 따른 녹말 미세입자의 제조에서, 고체 형태로 전환되고 생물학적 활성물질이 혼입될 용액에서 녹말의 농도는 우수한 특성을 갖는 녹말 미세입자를 형성할 수 있도록 20중량% 이상이어야한다. 개별 경우에서 어떤 녹말 농도가 가장 잘 작용할 수 있을지는 미세입자내의 부하량이 개별 경우에서 필요한 부하량인지 각 개별 생물학적 활성물질에 대해 적정하는 간단한 방식으로 측정할 수 있다. 이와 관련하여, 미세입자에 혼입될 생물학적 활성물질은 2상 계 및 녹말의 겔화 특성에 영향을 줄 수 있다는 것을 주의해야하며, 이는 개별 경우에서 최적 조건을 결정하기 위해 통상적인 제조 시험을 실시한다는 것을 의미한다. 상기 시험은 일반적으로 녹말 농도는 유리하게는 30중량% 이상이어야하고 특정 경우 40중량% 이상이어야함을 나타낸다. 최고 한도로서, 50중량%가 보통 적용될 수 있고, 특히 많아야 45중량%가 이용될 수 있다. 분자량 감소된 고분지된 녹말을 사용함없이 이렇게 높은 녹말 농도를 얻는 것은 쉽지 않다.

2상 수성 계를 형성하기 위한 단계 c)에서 이용된 중합체의 관하여, 녹말을 내부상으로 하여 2상 계를 형성하는 능력을 갖는 다수의 중합체에 관한 정보가 이 기술분야에 정확하게 기재되어 있다. 이러한 모든 중합체는 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되어야한다. 그러나 이와 관련하여 특히 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 이 폴리에틸렌 글리콜은 바람직하게는 5 내지 35 kDa, 보다 바람직하게는 15 내지 25 kDa, 특히 약 20 kDa의 평균 분자량을 갖는다.

상기 중합체를 적합한 농도로 완충액을 포함하는 물 또는 수용액에 용해시키고 적합한 온도로 온도 조정한다. 이 온도는 바람직하게는 4 내지 50℃, 보다 바람직하게는 10 내지 40℃, 가장 바람직하게는 10 내지 37℃ 범위이다. 수용액중의 중합체의 농도는 20중량% 이상, 바람직하게는 30중량% 이상이고, 가장 유리하게는 많아야 45중량%이다. 특히 바람직한 범위는 30 내지 40 중량% 이다.

단계 c)에서 혼합작업은 많은 상이한 방법, 예컨대 프로펠러 교반 또는 하나 이상의 스테틱 믹서를 이용하는 것을 통하여 실시될 수 있다. 상기 혼합은 4-50℃ 범위, 바람직하게는 20-40℃, 흔히 약 37℃ 온도에서 실시된다. 뱃치 공정에서, 녹말 용액은 중합체 용액에 부가될 수 있거나 또는 그 역으로 할 수 있다. 스테틱 믹서 또는 블랜더를 사용한 경우, 상기 작업은 2개 용액을 2개의 별도의 파이프라인을 통하여 펌핑해서 블렌더를 갖고 있는 공통 파이프라인으로 보내는 것에 의해 실시할 수 있다.

유제는 낮은 전단력을 이용하여 형성될 수 있는데, 이는 오일/물 또는 물/오일 유제와 대조적으로 물/물 유제중의 상 사이에는 높은 표면장력이 존재하지 않기 때문이며, 이 경우 특정 크기 분포를 얻기 위해서는 방울이 극복해야하는 것은 녹말 용액의 점도이다. 대부분의 경우, 자기 교반 또는 프로펠러 교반이 충분하다. 대규모의 경우, 예컨대 생성할 미세입자의 양이 50 g을 초과하는 경우, 소위 이용된 용기에서 보다 더 효과적인 교반을 실시하도록 소위 방지재장치(baffle)를 사용하는 것이 유리하다. 물/물 유제를 형성하는 다른 방법은 하나 이상의 스테틱 믹서를 이용하는 것으로, 이 방법에서 녹말 용액은 스테틱 믹서가 위치하는 파이프로 일정 속도로 펌핑되는 것이 유리하다. 상기 조건하에서 균일한 유량을 제공하고, 혼합물을 불필요하게 높은 전단력에 노출시키지 않으며 또 바람직하지 않은 물질의 순도 및 비-누출 측면에서 비경구 제제를 제조하기에 적합한 것인 한, 어떤 형태의 것이든 적합한 펌프를 이용하여 상기 펌핑을 실시할 수 있다. 스테틱 믹서를 이용하여 유제를 생성하는 상기 경우에서는, 미세입자로의 고화과정을 적합한 교반이 가해지는 용기중에서 실시하는 것이 일반적으로 유리하다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 단계 c)에서 중합체 용액을 적어도 2단계로 조성물에 부가하는 것을 의미하며, 유제가 생성되거나 생성되기 시작한 후 혼합을 실시한다.

바람직한 내부상에서 녹말 농도를 향상시키기 위하여 많은 단계에서 중합체 용액을 부가하고 또 예컨대 사용된 중합체의 평균 분자량 및/또는 농도를 변화시키는 것도 물론 본 발명의 범위내에 포함된다.

단계 c)에서 혼합 과정은 형성될 녹말 방울이 미세입자에 필요한 크기를 갖는, 즉 바람직하게는 건조 상태에서 평균 직경이 10-200 ㎛, 바람직하게는 20-100㎛, 보다 바람직하게는 20-80㎛ 범위인 조건하에서 실시하는 것이 유리하다.

본 발명에 따른 미세입자의 제조에서, 고화과정은 녹말이 겔로되는 천연걱 경향 또는 능력을 통하여 실시되고 예컨대 아세톤과 같은 유기용매를 사용한 석출을 통하여 실시되지 않는 것이 중요하다. 후술한 과정은, 생물학적 활성물질을, 많은 경우에, 허용될 수 없는 유기용매에 노출시키게되어, 제어되는 방식으로 안정한 미세입자를 얻기 위해 필요한 물리적 가교결합의 자연적 형성이 존재하지 않게된다.

미세입자의 고화와 관련하여, 고화는 생물학적 활성물질을 혼입시키기 위하여 온화한 조건하에서 실시되는 것이 중요하다. 즉, 현존하는 물질에 유해하지 않은 온도를 이용하는 것이 핵심 문제이다. 이와 관련하여, 놀랍게도 상기를 위한 기준 및 적합한 크기분포를 가진 안정한 미세입자를 형성하기 위한 기준은, 고화하는 동안 1 이상의 온도 또는 온도 수준이 이용되면 용이하게 충족될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 2상 계에서 고화과정이 고화의 최종 상에서 이용된 온도 보다 더 낮은 온도에서 개시된다면 특히 유리하다. 바람직한 구체예는 고화가 1-20℃ 범위, 바람직하게는 1-10℃, 특히 약 4℃에서 개시되고 또 20-55℃ 범위, 바람직하게는 25-40℃, 특히 약 37℃에서 종결되는 것을 의미한다.

선택한 조건이 정확한지 또는 적합한지 여부의 확인은 녹말 미세입자가 소망하는 크기 분포를 갖고, 뒤이은 세척 및 건조 과정동안 안정하며 또 시험관내 존재하는 충분한 효소적 수단에 의해 실질적으로 용해되는 것 및/또는 혼입된 물질이 효과적으로 캡슐화되어 있고 생활성을 유지하고 있다는 것을 증명하는 것에 의해 달성할 수 있다. 마지막에 기술한 내용은 시험관내 또는 생체내에서, 미세입자가 온화한 조건하에서 효소적으로 용해된 후, 크로마토그래피 방법을 이용하거나 또는 당해분야에서 공지된 다른 방법을 이용하여 조사하며, 마지막에 언급한 내용은 민감한 생물학적 활성물질의 강인하고 신뢰할만한 제조방법을 보증하는 중요한 요소이다. 미세입자가 온화한 조건하에서 완전히 용해될 수 있는 것은 아주 유리한데, 이는 예컨대 PLGA 매트릭스로 구성되는 미세입자를 용해시키기 위해 유기용매가 필요한 경우에 흔히 발견되는 제제-유도된 인공물을 최소화하기 때문이다.

형성된 미세입자를 바람직하게는 적합한 방식으로 세척하여 외부상 및 임의의 과량의 활성물질을 제거한다. 이러한 세척은 여과에 의해 유리하게 실시될 수 있는데, 이는 미세입자의 양호한 기계적 안정성과 적합한 크기 분포에 의해 가능하게 된다. 원심분리에 의한 세척, 상청액 제거 및 세척 배지에서 재현탁도 또한 적합할 수 있다. 각 세척 공정에서, 1개 이상의 적합한 세척 배지가 사용될 수 있고, 일반적으로 완충액-함유 수용액이 사용된다. 상기와 관련하여, 미세입자의 크기 분포를 조정하기 위해, 예컨대 너무 작은 미세입자의 함량을 제거하고 또 특정 크기 이상의 미세입자가 최종 생성물에 존재하지 않게 하기 위해 필요한 경우 체질(sieving)도 이용할 수 있다.

미세입자는 임의 방법, 예컨대 분무-건조, 냉동-건조 또는 진공-건조에 의해 건조될 수 있다. 개별 경우에서 어떤 건조 방법을 선택할지는 함유될 생물학적 활성물질에 대한 생물학적 활성을 보유하는데 어떤 것이 가장 적합할지에 따라 결정한다. 공정에 관한 검토는 용량 및 순도 특성에도 중요하게된다. 냉동-건조는 흔히 바람직한 건조방법인데, 정확하게 설계되기만하면 포함된 생물학적 활성물질에 대해 온화하기 때문이다. 혼입된 생물학적 활성물질이 그의 생활성을 보유하는 것은 상기 물질이 온화한 조건하에서 효소적으로 용해된 후 미세입자에 대해 적합한분석을 실시함으로써 증명될 수 있다. 녹말과 관련하여 사용하기에 적합한 효소는 알파-아밀라제 및 아밀로글루코시다제 단독 또는 조합한 것이며, 경우에 따라서 이들은 단백질을 분해할 수 있는 프로테아제(protease)를 전혀 갖지 않게 하는 것이 중요할 수 있다. 프로테아제의 존재는 당해분야에 공지된 방법, 예컨대 대조 시험에서 생물학적 활성물질을 혼합하고 미세입자를 용해시키기 위해 사용될 수 있는 조건하에서 목적하는 효소 혼합물과 함께 배양한 후 통상의 방식으로 그의 통합도를 결정하는 것에 의해 검출할 수 있다.

사용될 효소는 예컨대 미세입자에 혼입된 재조합 단백질과 같은 민감한 물질의 인공적 분해를 피하기 위해 프로테아제 오염되지 않게 정제될 필요가 있다. 이것은 당해분야에 공지된 수법, 예컨대 적합한 크로마토그래피 물질에 결합된 α₂-마크로글로불린을 사용한 크로마토그래피에 의해 실시될 수 있다.

미세입자에 대한 방출 특성을 변형시키기 위하여, 생체적합성 및 생분해성 중합체로 제조된 방출 제어 외피 또는 코팅을 도포할 수 있다. 이와 관련하여 적합한 중합체의 예는 종래 기술, 예컨대 EP 535 937호에 기재되어 있으며, 젖산 및 글리콜산의 중합체(PLGA)가 특히 적합하다. 당해 외피는 바람직하게는 공기현탁 기술을 이용하여 도포된다. 특히 적합한 상기 종류의 수법은 WO 97/14408호에 기재되어 있고 이와 관련한 상세한 것은 상기 문헌으로부터 얻을 수 있을 것이며, 이 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 얻은 녹말 미세입자는 상기 공기 현탁기술에 의한 코팅에 아주 잘 적합하며, 얻어진 코팅된미세입자는 비경구적 투여용으로 특히 적합하다.

제조된 미세입자를 사용한 경우, 이들은 방출제어 외부 외피로 코팅되거나 또는 코팅되지 않으며, 건조 미세입자는 적합한 매질에 현탁되어 특히 주사제를 생성한다. 이러한 매질 및 이와 관련한 방법은 당해분야에 잘 공지되어 있으며, 여기서 더 자세히 기재할 필요는 없을 것이다. 실제 주사는 적합한 바늘 또는 바늘없는 주사기를 통해 실시될 수 있다. 주사 매질에 미리 재현탁시킴없이 건조 분말 주사기를 이용하여 미세입자를 주사할 수도 있다.

상기 논의된 이점 이외에, 본 발명에 따른 방법은 생물학적 활성물질의 수율이 일반적으로 높고, 생물학적 활성물질의 생활성을 유지하면서 미세입자내의 생물학적 활성물질의 함량을 아주 높게 수득할 수 있고, 수득한 미세입자는 대식세포에 의해 식균되지 않을 정도로 아주 크고 또 소형 바늘, 예컨대 23G-25G을 통하여 주사되기에 충분할 만큼 작기 때문에 비경구적, 서방성(예컨대 지연방출 또는 지속방출)용으로 사용하기 위한 정확한 크기 분포를 가지며, 또 미세입자의 분해시 내생 및 천연 분해 생성물이 형성되게되므로, 그에 의해 활성물질이 과도하게 낮은 pH값에 노출되지 않게 할 수 있는 이점을 갖는다. 또한, 상기 방법 자체는 엄격한 품질 관리에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 방법은 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다당류 또는 일반적으로 유기용매 등에서 민감하거나 불안정한 기타 약물 또는 생물학적 활성물질, 주로 수용성 물질과 관련하여 특히 중요하다. 재조합적으로 생성된 단백질은 생물학적 활성물질의 아주 중요한 그룹이다. 그러나 일반적으로, 본발명은 이러한 물질의 존재에 한정되는 것은 아닌데, 본 발명의 개념은 비경구적 투여에 이용될 수 있는 어떤 생물학적 활성물질이라도 적용될 수 있기 때문이다. 민감성 또는 불안정성 문제와 관련한 것 이외에, 본 발명은 용매를 제거하기 어려운 경우 또는 독소학적 또는 기타 환경적 문제가 생길 수 있는 경우에 특히 중요하다.

사용될 수 있는 생물학적 활성물질의 종류는 예컨대 재조합 단백질, 글리코실화 재조합 단백질, 페길화된 재조합 단백질, 성장인자, 사이토킨, 혈액응고인자, 모노클로날 항체, LHRH 유사체 및 백신이다.

상기 물질의 특수 예는 성장 호르몬, 에리트로포이에틴 및 그의 유사체, 인터페론(α,β,γ), 혈액응고 인자 V-XIII, 단백질 C, 인슐린 및 그의 유도체, 대식세포-콜로니-자극 인자, 과립구 콜로니 자극인자, 인터루킨, 글루카곤 유사 펩티드 1 또는 2, C-펩티드, 렙틴, 종양 괴저인자 및 표피 성장인자이다.

비-단백질 약물 유형의 사용가능한 생물학적 활성물질은 다음 군으로부터 선택될 수 있다:

항종양제, 항생물질, 항염증제, 항히스타민제, 진정제, 근육이완제, 항간질증제, 항우울제, 항앨러지제, 기관지확장제, 강심제, 항부정맥제, 혈관확장제, 항당뇨제, 항응고제, 지혈제, 마취제 및 스테로이드.

본 발명의 다른 요지에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 유형의 신규 미세입자에도 관한 것이다. 그러나 본 발명에 따른 신규 미세입자는 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 것에만 한정되는 것이 아니며, 제조방법과관계없이 당해 유형의 모든 미세입자를 포함한다.

보다 상세하게는, 본 발명은 비경구적 투여, 바람직하게는 주사에 의해 포유동물, 특히 인간에게 투여되기에 적합하고, 생물학적 활성 물질을 함유하는 미세입자에 관한 것이며, 이들 미세입자는 아밀로펙틴 함량이 85중량%를 초과하고, 상기 아밀로펙틴의 80중량% 이상은 10-10 000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖고, 녹말의 g 건조중량 당 50 ㎍ 미만의 아미노산 함량을 가지며 또 녹말 분자 사이에 공유 화학적 가교결합을 갖지 않는 녹말로 구성된다.

당해 미세입자가 기본으로하는 녹말은 상기 방법과 관련하여 상기 정의된 유형의 녹말중의 하나인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 미세입자의 바람직한 구체예에 따르면, 이들에서 생물학적 물질의 생활성은 이들 물질이 녹말에 혼입되기 전에 나타낸 생활성의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상이다. 상기 생활성은 미세입자내에 가장 바람직하게는 상당량 보유 또는 보존된다.

본 발명의 더욱 바람직한 구체예는 α-아밀라제 및/또는 아밀로글루코시다제 존재하의 시험관내에서 생분해될 수 있는 미세입자로 대표된다.

다른 구체예는 생분해될 수 있고 또 피하투여 또는 근육내 투여된 후 조직으로부터 제거될 수 있는 것이 바람직하다.

미세입자의 특히 바람직한 구체예는 하나 이상의 막 형성성, 생체적합성 및 생분해성 중합체의 방출 제어 외피를 갖는 입자로 대표된다.

상기 중합체는 바람직하게는 α-히드록시산으로 제조된 동종중합체 또는 공중합체이며, 상기 α-히드록시산은 바람직하게는 젖산 및/또는 글리콜산이다. 다른 변형은 글리콜리드 및 락티드로 구성된 군으로부터 선택된 α-히드록시산의 시클릭 이합체이다.

이러한 중합체 또는 이합체(예컨대 PLGA 유형)는 종래기술에 자세하게 기재되어 있으며, 이들에 대한 더욱 자세한 사항은 그로부터 얻을 수 있을 것이다.

다른 구체예는 상기 중합체 이외에, 외피가 하나 이상의 방출 조절 물질을 함유하는 미세입자로 대표된다. 이러한 물질은 바람직하게는 수용성 또는 물에 거의 용해되지 않는다. 젖산, 젖산을 함유하는 올리고머 및 글리콜산으로부터 선택된다.

폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PEG를 블록의 하나로 포함하는 블록 공중합체를 포함하는 물질로부터 선택하는 것이 유리하다.

다른 중요한 구체예는 미세입자의 응집을 방해하는 능력을 갖는 하나 이상의 수용성 물질의 외부 층을 갖는 미세입자로 대표된다.

더욱 바람직한 미세입자는 물론 상술한 방법에 의해 얻을 수 있거나 제조할 수 있으며 일반적 형태 또는 상술한 방법의 바람직한 구체예 형태의 미세입자로 대표될 수 있다.

활성물질을 함유하는 미세입자에 대한 생물학적 활성의 결정에 관해서는, 각 개별 생물학적 물질에 적합한 방식으로 실시되어야한다. 동물 시험 형태로 상기 결정을 실시하는 경우, 녹말 미세입자에 혼입된 특정 양의 생물학적 활성 물질을 주사하고, 이들 미세입자가 온화한 조건하에서 효소적으로 미리 용해된 후 생물학적반응을, 상응하는 양의 동일 생물학적 활성물질을 적합한 용액으로 주사한 후 얻은 반응과 비교하여 실시한다. 상기 평가를 체외, 예컨대 시험관 또는 세포 배양물에서 실시한 경우, 생물학적 활성물질은, 녹말 미세입자가 온화한 조건하에서 효소적으로 용해된 후 그 활성을 측정해서 동일 농도의 당해 생물학적 활성물질을 갖는 대조용 용액에 대한 활성과 비교하는 것에 의해 상기 평가 이전에 얻을 수 있다. 어떤 경우든, 평가는 녹말 미세입자의 생분해 생성물의 비특이적 효과를 포함할 것이다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 더욱 자세하게 설명한다. 이들 실시예에서, 나머지 명세서를 통하여, 특별히 언급하지 않는 한 %는 중량기준이다. 실시예 1 내지 7은 비교시험에 관한 것이고, 실시예 8 내지 13은 본 발명을 나타낸다.

실시예 1a-1e-b

대조시험: EP 213303 A2에 따른 녹말 마이크로스피어의 제조 과정. 이들 대조 시험의 목적은 종래기술의 상태를 보여주는 것이었다. 녹말 농도는 일반적으로 5% 이었고 PEG 농도는 6%이었다(평균 분자량 6 kDa). 녹말 용액(10g)을 PEG 용액(5g, 70℃로 온도 조정됨)에 붓고 실온에서 철야로 교반하면서 안정화시켰다. 이 물질을 95% 에탄올에 재현탁시키는데, 이는 이들을 여과시킬 수 없었기 때문이다. 다양한 단계 동안, 불연속 마이크로스피어의 발생을 관찰하였고 또 가능한 경우, 회수후에 α-아밀라제를 사용하여 시험관내에서 생분해능을 분석하였다. 초기시험은 여과에 의한 마이크로스피어의 회수를 위해 실시하였지만, 이것은 원심분리(Sorfvall, SS34, 5분, 10 000 rpm 20℃)를 실시할 수 없었기 때문이었고, 상청액을 제거하고 10 ml의 95% 에탄올을 부가하였다.

실시예 1a

감자 녹말로부터 녹말 마이크로스피어의 제조

감자녹말(Acros Organics, Lot No. A013642301)은 5%에서도 매우 높은 점도를 갖는 투명용액을 형성하였다. 철야로 안정화시킨 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 형성되지 않았고, 석출물 형태로 형성되었다. 95% 에탄올로 세척한 후, 뚜렷이 구별되는 녹말 마이크로스피어는 발견되지 않았고, 오히려 경질의 점성 덩어리가 발견되었다.

실시예 1a-b

BSA를 함유하는 녹말 마이크로스피어의 제조

단백질(소 혈청 알부민(BSA), 20%, 0.1 ml)을, 2상 계를 만들기 전에, 녹말 용액과 혼합하는 차이를 두어 실시예 1a에 따라 녹말 마이크로스피어를 제조하였다. 철야로 안정화시킨 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 형성되지 않았지만 석출물 유형이 형성되었고, 95% 에탄올로 세척한 후 점성 덩어리가 얻어졌지만 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 얻어지지 않았다.

실시예 1b

용해성 녹말로부터 녹말 마이크로스피어의 제조

용해성 녹말(Baker BV-Deventer Holland, Lot No. M27602)은 95℃로 가열될때 약간의 유백색 용액을 생성하였다. 철야로 교반한 후에도 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 형성되지 않았지만, 석출물 형태는 형성되었다. 95% 에탄올로 세척한 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 관찰될 수 없었지만, 녹말은 작은 자갈과 유사한 입자로 석출되었다. 건조 후, 제조 녹말 전체 500 mg으로부터 약 4 mg의 입자를 얻었다. 시험관내에서 α-아밀라제와 함께 배양하면, 약 65%의 녹말 매트릭스는 저항성이어서 용해되지 않았다.

실시예 1b-b

용해성 녹말로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에 BSA의 혼입

BSA(20%, 0.1 ml)를, 2상 계를 생성하기 전에, 녹말 용액과 혼합하는 이외에는 실시예 1b에 따른 방법을 반복하였다. 철야로 안정화시킨 후, 뚜렷이 구별되는 입자가 형성되었고, 이를 회수한 다음 α-아밀라제와 함께 배양하는 것을 통하여 시험관내에서 생분해성을 분석하여 약 57%의 매트릭스가 용해될 수 있다는 것을 알았다. 단백질 수율은 낮았고 정량될 수 없었는데, 이는 마이크로스피어의 부분적 분해 후에 얻어진 농도가 HPLC법의 표준 곡선에서 최저 표준 보다 더 낮았기 때문이다.

실시예 1c

산화된 용해성 녹말로부터 녹말 마이크로스피어의 제조

녹말(Perfectamyl A3108, Stadex)는 95℃로 가열된 후 투명 용액을 형성하였다. 철야로 안정화시킨 후에도 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 형성되지 않았고 고형 물질도 전혀 시편에서 발견되지 않았다.

실시예 1c-b

BSA(20%, 01% ml)를, 2상 계를 생성하기 전에, 녹말 용액과 혼합하는 이외에는 실시예 1c에 따른 방법을 반복하였다. 안정화시킨 후, 석출물이 관찰되었으며, 이는 녹말을 전혀 닮지 않은 것이며, 세척 및 건조시킨 후, 약 2 mg의 고형 물질을 얻었다.

실시예 1d

천연의 고분지된 녹말(아밀로펙틴)로부터 녹말 마이크로스피어의 제조

천연의 아밀로펙틴 녹말(Cerestar SF 04201)은 95℃로 가열될 때 투명한 점성 용액을 생성하였다. 철야로 교반한 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 관찰되지 않았지만, 시편은 약간의 석출물을 만들었다. 95% 에탄올로 세척한 후, 시편은 끈적한 덩어리로 되었으며 뚜렷이 구별되는 녹말 마이크로스피어를 함유하지 않았다.

실시예 1d-b

천연의 고분지된 녹말(아밀로펙틴)로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에 BSA의 혼입

BSA(20%, 0.1%)를, 2상 계를 생성하기 전에, 녹말 용액과 혼합하는 이외에는 실시예 1d에 따른 방법을 반복하였다. 안정화시킨 후, 녹말을 닮지 않은 석출물이 관찰되었으며, 세척 및 건조후 점성 덩어리를 얻었다.

실시예 1e

산-가수분해되고 전단된 아밀로펙틴으로부터 녹말 마이크로스피어의 제조

녹말은 산-가수분해된 왁스상 옥수수(Cerestar 06090)로 원래 구성되며 2상 수성 계에서 녹말 마이크로스피어의 제조에 더욱 적합한 분자량 분포를 갖도록 기계적으로 전단을 받았다. 약 95℃로 가열시킨 후, 투명 용액을 얻었다. 철야로 교반한 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 관찰되지 않았지만, 시편은 일종의 석출물로 구성되었다. 95% 에탄올로 세척한 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 관찰되지 않았지만, 녹말은 작은 입자를 형성하였다.

실시예 1e-b

산-가수분해되고 전단된 녹말(아밀로펙틴)로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에 BSA의 혼입

BSA(20%, 0.1ml)를, 2상 계를 생성하기 전에 녹말 용액과 혼합한 이외에는 실시예 1e에 따른 방법을 반복하였다. 철야로 교반한 후, 뚜렷이 구별되는 마이크로스피어는 관찰되지 않았다. 반면에, 극히 작은 석출물이 관찰될 수 있었다. 회수한 후, 수득한 양은 정밀한 측정이 실시될 수 없을 정도로 적었다.

실시예 2

아밀로오스로부터 녹말 마이크로스피어의 제조

시험관내 및 생체내에서 그의 생분해성을 분석하기 위하여 아밀로오스(Serva 제조)로부터 녹말 마이크로스피어를 제조하였다. 이 아밀로오스는 급격하게 겔화되어 수동생산이 불가능하기 때문에, 연속적인 제조가 가능하도록 기계를 사용하였다. 기계의 중심 유닛은, 단백질 용액 또는 완충액 용액과 혼합하기 전에, 녹말을급속하게 약 150℃로 가열시킨 다음 약 45℃로 냉각시키는 마이크로파 유닛이다. 녹말 용액은 증류수중에 제조하였는데, 그렇지 않으면 녹말이 마이크로파 유닛에서 가열될 때 갈색으로 변해버리기 때문이다. 녹말은 예비젤라틴화된 아밀로오스(4%)로 구성되며 반복적인 균질화에도 불구하고 다수의 덩어리가 잔존하였다. 유량을 다음과 같이 조정하였다: 녹말(5 ml/분), 트리스 완충액, pH 7.8 (1.2 ml/분) 및 6.9% 염화나트륨 및 14.3 % 만니톨을 또한 함유하는 PEG 용액(2.4중량% PEG, 평균 분자량 300,000 Da). 상기 미세입자를 실온에서 몇시간 방치하여 안정화시킨 다음 냉장고에서 철야로 방치하였다. 이들은 다음과 같이 원심분리에 의해 연속적으로 세척하여 회수하였다: 70% 에탄올을 사용하여 3회, 1mM 염화나트륨 및 0.02% 나트륨 아지드(pH 7.4)를 함유하는 5 mm 인산염-완충된 공통 염 용액으로 3회 및 마지막으로 99.5% 에탄올을 사용하여 3회. 상기 미세입자를 진공 건조시켰다. 석출물에는 아주 작은 입자가 일부 존재하기 때문에, 99.5% 에탄올을 사용하여 3배량 침강시키는 것에 의해 이들을 제거하려는 시도를 실시하였지만, 이들을 완전히 제거하지는 못하였다. 전체 9.5 g의 미세입자를 얻었으며, 침강후 8.5 g이 잔류하였다.

Malvern Mastersizer를 이용하여 입자 크기 분포를 결정하였고, 약 5 ㎛의 가장 작은 마이크로스피어와 160 ㎛를 초과하는 최대 마이크로스피어에 이르기 까지 광범위한 것으로 밝혀졌다. 부피로부터 산출한 평균 직경은 25 ㎛이었다. 이들 마이크로스피어를 시험관내 37℃에서 α-아밀라제와 2주간 배양할 때 녹말 매트릭스의 약 30 내지 40%가 용해되었다.

비교예는 아밀로오스로부터 마이크로스피어를 제조하는데 관련된 어려움을보여주며, 이는 용해시키기 위해 아주 고온을 필요로하고, 이들 고온에 노출되면 분해되기 쉬우며 또 아주 신속하게 겔화되기 때문에 균일한 용액을 구성하기 어렵기 때문이다. 이 실시예는 또한 생성한 마이크로스피어가 제조직후 및 크기 분포를 좁게하려고 시도한 후에도 극히 넓은 크기 분포를 나타내며 또한 피하주사 또는 근육내 주사한 후 지속 방출되기에 적합한 10㎛ 미만의 크기를 갖는 마이크로스피어의 함량이 아주 높다는 것을 나타낸다. 이 실시예는 또한 시험관에서 분석했을 때, 생분해능이 분석한 시간에 대해 불완전하다는 것을 나타낸다.

실시예 3

β-락토글로불린을 함유하는 녹말 마이크로스피어의 제조

모델 단백질인 β-락토글로불린을 고정화시키는 효과를 분석하기 위해 아밀로오스(Serva 제조)로부터 녹말 마이크로스피어를 제조하였다. 이 아밀로오스는 급격하게 겔화되어 수동생산이 전적으로 불가능하기 때문에 녹말을 약 150℃로 급격하게 가열한 다음 단백질 용액 또는 완충액과 혼합하기 전에 45℃ 근처로 냉각시키는 마이크로파 유닛을 갖는 기계를 사용하였다. 이 녹말 용액(10%)은 증류수내에 제조하며 그 유량은 5 g/분으로 설정하였다. 이 녹말 용액(2.5 ml)을 플라스틱 비이커에 수집하고 온도가 50-70℃로 떨어짐에 따라서 단백질 용액(0.6 ml, 8.3% 완충액중)을 자기 교반하에 부가하였다. 넓게 말해서, 그 즉시 제1 PEG 용액(10%, 평균 분자량 20,000 Da, 3.0 ml)을 교반하에 녹말 용액에 부가하였고, 교반하에 1분후, 제2 PEG 용액(40%, 평균 분자량 20,000 Da, 10 ml)을 유제에 부가하고 이것을 다음날까지 실온에서 방치하여 안정화시켰다. 형성된 마이크로스피어는 이들이 적합한 단백질 부하량을 갖고 있는 능력을 예시하도록 상이한 2개 방법으로 회수하였다. 제1 세척법은 완충액을 사용한 원심분리 세척법으로 구성되며 녹말 마이크로스피어로부터 대부분의 모든 단백질을 생성한다. 제2 회수방법은, 이소프로필 알코올을 사용하여 마이크로스피어내에서 락토글로불린 부하량을 증가시킨다. 이 방법에서, 세척은 70% 이소프로필 알코올을 사용하여 3회 실시한 다음, 1 mm 염화 칼슘 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 5 mM 인산염-완충액 공통염 용액을 사용하여 1회 실시하고, 이어 완충액중에서 교반하에 1시간 동안 방치되기 전에 동일 완충액을 사용하여 1회 실시한 후, 상기 완충액을 사용하여 5회 실시하고, 마지막으로 100% 이소프로필 알코올을 사용하여 3회 실시하였다. 이소프로필 알코올 세척을 이용한 단백질 부하량은 3.6% 이었고, 이것은 이론치의 18%에 상응하는 것이다.

이들 중에서, 상기 실시예는 아밀로오스로부터 단백질을 함유하는 마이크로스피어를 제조함에 있어서 상당한 실질적인 어려움이 있음을 지적하고 있는데, 그 이유는 녹말 용액은 완전히 용해되기 위해 아주 고온에 처리되어야하는데, 녹말은 이들 고온에서 급격하게 화학적 변화를 거치게되어 녹말 용액이 민감한 단백질과 혼합되기 위해 합리적으로 낮은 온도로 냉각된 후 급격하게 겔화되기 때문이다. 마이크로스피어의 형성과 그속에 단백질의 혼입을 가능하도록 하기 위해 2개의 상이한 용액을 사용할 필요가 있기 때문에 그 제법이 더욱 복잡하게된다. 더욱 심각한 결점은 허용될 수 있는 단백질 부하량을 얻기 위하여 마이크로스피어를 회수하는데 이소프로필 알코올을 사용할 필요가 있다는 점인데, 대부분의 민감한 단백질은 상기 또는 그와 유사한 유기 용매에 노출되는 것을 견딜 수 없기 때문이다. 상기 아밀로오스로부터 제조된 녹말 마이크로스피어는 시험관내 또는 생체내에서 α-아밀리라제에 의해 충분히 생분해되지 않는다.

실시예 4

완두콩으로부터 아밀로오스의 제조

녹말 과립으로부터 걸러내는 것에 의해 아밀로오스를 제조하였다. NUTRIO-P-star 33 (300 g, Nordfalk 제조)를 물(7200 g)에 현탁시키고 그 현탁액을 1시간 동안 75℃로 가열하였다. 팽윤된 과립을 원심분리에 의해 제거하고 수득한 용액을 먼저 목탄 여과기, 이어 예비여과기(Filtron, 1.5 ㎛) 그리고 마지막으로 멸균 여과기(Millipore, 0.2 ㎛)를 통하여 여과시켰다. 여과된 용액을 냉장고에 철야로 보관하여, 아밀로오스를 석출시키고 원심분리하여 회수하였다. 수득한 석출물을 에탄올(95%, 700 ml)로 2회 세척한 다음 진공 건조시켰다. 약 30 g의 아밀로오스를 수득하였다.

실시예 5

시험관내 및 생체내에서 이들의 생분해능을 분석하기 위하여 실시예 4에 따라 제조한 아밀로오스로부터 녹말 마이크로스피어를 제조하였다. 아밀로오스는 급속하게 겔화되어 수동제조를 할 수 없게되므로, 연속적인 제조를 가능하게하도록 기계를 이용하였다. 기계의 중심 유닛은, 단백질 용액 또는 완충액 용액과 혼합하기 전에, 녹말을 급속하게 약 150℃로 가열시킨 다음 약 45℃로 냉각시키는 마이크로파 유닛이다. 녹말 용액은 증류수중에 제조하였는데, 그렇지 않으면 녹말이 마이크로파 유닛에서 가열될 때 갈색으로 변해버리기 때문이다. 녹말은 예비젤라틴화된아밀로오스(4%)로 구성되며 반복적인 균질화에도 불구하고 다수의 덩어리가 잔존하였다. 유량을 다음과 같이 조정하였다: 녹말(5 ml/분), 트리스 완충액, pH 7.8 (1.2 ml/분) 및 6.9% 염화나트륨 및 14.3 % 만니톨을 또한 함유하는 PEG 용액(2.4중량% PEG, 평균 분자량 300,000 Da). 상기 미세입자를 실온에서 몇시간 방치하여 안정화시킨 다음 냉장고에서 철야로 방치하였다. 이들은 다음과 같이 원심분리에 의해 연속적으로 세척하여 회수하였다: 70% 에탄올을 사용하여 3회, 1mM 염화나트륨 및 0.02% 나트륨 아지드(pH 7.4)를 함유하는 5 mm 인산염-완충된 공통 염 용액으로 3회 및 마지막으로 99.5% 에탄올을 사용하여 3회. 상기 미세입자를 진공 건조시켰다. 석출물에는 아주 작은 입자가 일부 존재하기 때문에, 99.5% 에탄올을 사용하여 3배량 침강시키는 것에 의해 이들을 제거하려는 시도를 실시하였지만, 이들을 완전히 제거하지는 못하였다. 침강후 입자의 수율은 8.5 g의 미세입자를 얻었으며, 침강처리동안 1g의 마이크로스피어가 세정되어 제거되었다.

Malvern Mastersizer를 이용하여 입자 크기 분포를 결정하였고, 약 5 ㎛의 가장 작은 마이크로스피어와 160 ㎛를 초과하는 최대 마이크로스피어에 이르기 까지 광범위한 것으로 밝혀졌다. 부피로부터 산출한 평균 직경은 25 ㎛이었다.

녹말 마이크로스피어의 생분해능은 시험관내에서 α-아밀라제와 배양하는 것에 의해 분석하였다. 초기에 분해는 급속적이었고 1일 후 약 35 내지 45%가 용해성 형태로 전환되었다. 그후 분해속도가 감소되었고 6일 후에는 약 50%가 용해되었다. 그후 생분해능은 무시될 정도였고 25일 후에는 약 50%의 녹말 마이크로스피어는 용해되지 않은 형태로 잔존하였다.

이 비교예는 아밀로오스로부터 마이크로스피어를 제조하는데 관련된 어려움을 보여주며, 이는 용해시키기 위해 아주 고온을 필요로하고, 이들 고온에 노출되면 분해되기 쉬우며 또 아주 신속하게 겔화되기 때문에, 균일한 용액을 구성하기 어렵기 때문이다. 이 실시예는 또한 생성한 마이크로스피어가 제조직후 및 크기 분포를 좁게하려고 시도한 후에도 극히 넓은 크기 분포를 나타내며 또한 피하주사 또는 근육내 주사한 후 지속 방출되기에 적합한 10㎛ 미만의 크기를 갖는 마이크로스피어의 함량이 아주 높다는 것을 나타낸다. 이 실시예는 또한 시험관에서 분석했을 때, 생분해능이 불완전하다는 것을 나타낸다.

실시예 6

아밀로오스로부터 제조된 녹말 마이크로스피어의 생체내에서의 생분해능의 분석

실시예 4에서 아밀로오스로부터 제조된 녹말 마이크로스피어(3.01 mg)를 100 ㎕ 부피로 뇌하수체절제된 스프라크-다우리(Spraque-Dawley)주 레트 8마리의 목에 피하주사하였다. 주사한지 8 내지 9일 후 모든 레트의 피부아래 주사부위에서 작은 혹이 검출되었다. 주사한 지 9일 후 해부하여 현미경 관찰을 실시하면 작은 백색 결정이 모든 레트의 주사 부위에서 발견되었다. 현미경 변화는 4% 인산염-완충 포름알데히드에 고정시키고, 파라핀 왁스에 끼운 다음 5 ㎛ 두께로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색시킨 다음 광학 현미경으로 조사하였다. 녹말 마이크로스피어가 발견될 수 있었던 파라핀 왁스 부분에서, 이들은 거대 세포를 함유하는 조직을 과립화하는 대역으로 둘러쌓인 호산구 소구체로서 발견되며 상기 조직 반응은피하 조직에서 만성적인 "육아종성" 염증으로 특징화된다. 녹말 마이크로스피어는 대식세포 내부에서 관찰될 수 있었다.

상기 시험은 아밀로오스로부터 제조된 녹말 마이크로스피어는 주사한지 9일후에도 피하조직에서 발견될 수 있었고 따라서 그 기간 동안 용해될 만큼 충분히 생분해되지 않았음을 나타내며, 어떤 경우든 마이크로스피어의 일부는 대식세포에 의해 식균작용되기에 충분할 만큼 작았다.

실시예 7

실시예 4에 따라 아밀로오스로부터 제조되어 10 ml의 인산염-완충된 (5mM) 생리학적 공통염 용액(0.15M), pH 7.2에 현탁된 녹말 마이크로스피어를 어린 돼지의 다리에 근육내 주사하였다. 2마리 돼지에는 120 mg의 마이크로스피어를 주사하였고 2마리 돼지에는 600 mg의 마이크로스피어를 주사하였다. 이 동물들을 14일 후 치사시키고 그 조직을 현미경 변화 조사한 다음 통상의 끼우기 및 염색 과정 이후, 현미경 변화를 조사하였다. 14일에, 마이크로스피어는 투여량에 따라서 다른 정도로 조직에서 나타났다. 일부 미세입자는 대식세포 및 거대 세포에 의해 식균되었고 또 일부는 근육내에서 발견되었는데, 이는 이들 마이크로스피어의 분해가 아주 느리다는 것을 반영한다.

상기 시험은 아밀로오스로부터 제조된 녹말 마이크로스피어는 주사한지 2주후에도 근육내 조직에서 발견되며, 이는 이들 마이크로스피어의 생분해능이 아주느리다는 것을 나타낸다.

실시예 7b

감자로부터 산-가수분해된 아밀로오스(Reppal PSM60U)으로부터 녹말 마이크로스피어를 제조하고, 이를 한외여과처리시켜 저분자량 성분을 제거함으로써 이들을 유기용매에 노출시킴없이 단백질을 혼입하는 능력 및 이들의 생분해능을 분석하였다. β-락토글로불린을 모델 단백질로 사용하였다. 녹말 농도는 24%이었고 4 ml를 37℃에서 50 mg/ml 농도를 갖는 1.6 ml의 단백질 용액과 혼합하고 또 PEG(평균 분자량 100 kDa, 15%, 4ml)와 혼합하고 교반하여 유제를 형성하였다. 실온에서 철야로 교반하면서 상기 마이크로스피어를 고화시켰다.

완충액(5 mM 인산나트륨, pH 7.8)에서 원심분리 세척하는 것을 통하여 마이크로스피어로부터 모든 단백질을 걸러내었다. 이소프로필 알코올만을 사용하는 경우 또는 먼저 분자량 100,000의 15% PEG, 이어 분자량 10,000 Da의 40% PEG 그리고 마지막으로 이소프로필 알코올로 구성된 시리즈를 이용한 경우, 1.5 내지 3%에 상응하는 단백질은 마이크로스피어에서 발견될 수 있었다. 이들 마이크로스피어의 생분해능을 시험관에서 분석하였다. 이들 생분해능을 초기에는 급속하였고, 24시간 이후에는 매트릭스의 약 60%가 용해성 형태로 전환되었다. 그후 분해는 중지되었고, 7일 후 매트릭스의 약 70%는 상기 조건하에서 생분해되었다.

상기 마이크로스피어에 소정량의 단백질을 부하시키기 위하여, 단백질을 유기 용매로 석출시킬 필요가 있기 때문에, 이 방법은 민감한 단백질에는 적용할 수 없는 방법이다. 이들 마이크로스피어는 시험관내에서 충분한 생분해능을 나타내지않았다.

실시예 7c

감자로부터 산-가수분해된 아밀로오스(Reppal PSM625, Reppe, Glykos, vaxjo)으로부터 녹말 마이크로스피어를 제조하고, 이를 유기용매에 노출시킴없이 단백질을 혼입하는 능력 및 이들의 생분해능을 분석하였다. β-락토글로불린을 모델 단백질로 사용하였다. 녹말 농도는 24%이었고 그 4 ml를, 37℃에서 50 mg/ml의 농도를 갖는 1.6 ml의 단백질 용액과 혼합하고, 또 PEG(평균 분자량 100 kDa, 15%, 4ml)와 혼합하고 교반하여 유제를 형성하였다. 실온에서 철야로 교반하면서 상기 마이크로스피어를 고화시켰다.

완충액(5 mM 인산나트륨, pH 7.8)에서 원심분리 세척하는 것을 통하여 마이크로스피어로부터 모든 단백질을 걸러내었다. 이소프로필 알코올만을 사용하는 경우 또는 먼저 분자량 100,000의 15% PEG, 이어 분자량 10,000 Da의 40% PEG 그리고 마지막으로 이소프로필 알코올로 구성된 시리즈를 이용한 경우, 1.5 내지 2.5%에 상응하는 단백질은 마이크로스피어에서 발견될 수 있었다. 이들 마이크로스피어의 생분해능을 시험관에서 분석하였다. 이들 생분해능을 초기에는 급속하였고, 24시간 이후에는 매트릭스의 약 55%가 용해성 형태로 전환되었다. 그후 분해는 중지되었고, 7일 후 매트릭스의 약 70%는 상기 조건하에서 생분해되었다.

실시예 8

고분지된 전단된 녹말로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에서 부하량이 높은 BSA의 고정화

전단을 받고, 고분지된 평균 분자량 1600 kDa의 녹말의 녹말 용액(40%), 평균분자량 20 000 Da의 PEG 용액(38%) 및 BSA(14%) 용액을, 50 mM 인산나트륨, pH 8.3에서 제조하였다. 녹말 용액의 온도는 50-55℃로 조정하였고, PEG 및 BSA 용액은 약 33℃로 조정하였다. 녹말 용액(2g)을 BSA 용액(0.7 ml)과 혼합하였다. 수득한 용액을, 주사기 펌프를 구비한 주사기에 넣었다. PEG 용액(29g)을, 주사기 펌프를 구비한 다른 주사기에 넣었다. 녹말 마이크로스피어는 상기 녹말/BSA 및 PEG의 혼합물을 비이커 아래의 주사기 펌프에 의해 스테틱 믹서를 통하여 펌핑하고 유제를 프로펠러(100 rpm)로 교반하는 것에 의해 제조하였다. 상기 과정의 이 부분은 처음부터 모든 것이 혼합될 때 까지 2분이 소요되었다. 비이커에서 교반을 10분간 실시하고 시편을 4℃로 옮기고 그 온도에서 교반하에 약 4시간 방치하였다. 그후, 용액의 pH 값을 약 5.5로 감소시키고 제제를 37℃에서 철야로 교반없이 방치하였다. 아미콘(Amicon 한외여과 셀)에서 5 mM 인산나트륨, pH 4.5로 여과하는 것에 의해 녹말 마이크로스피어를 세척하고 또 냉동건조시켰다.

건조된 마이크로스피어를 α-아밀라제 및 아밀로 글루코시다제를 사용한 효소 작용에 의해 용해시켜 단백질 및 녹말 수율과 단백질 부하량을 측정하였다. Malvern Mastersizer를 사용한 평균 입자 크기는 90㎛이었고 이것은 그 분포의 10%미만이 35 ㎛ 미만이라는 것을 말해준다. α-아밀라아제 또는 α-아릴라제 및 아밀로글루코시다제를 사용한 배양에 의하여, 상기 마이크로스피어는 48시간 동안 충분히 용해되었다.

이 실시예는 단백질, BSA가 고수율로 고정화될 수 있고 또 수득한 마이크로스피어가 고부하량의 단백질을 갖고 있음을 나타낸다. 상기 마이크로스피어는 생분해성이며, 이들은 시험관내에서 α-아밀라제에 의해 완전히 분해되고 또 온화한 조건하에서 실시될 수 있기 때문에, 실제 추출 방법을 고려할 때 인공물의 도입없이 고정화된 단백질의 정확한 화학적 분석이 가능하다. 본 실시예는 모든 혼입된 단백질은 마이크로스피어를 용해시킨 후 회수할 수 있다.

실시예 9

고분지되고, 전단처리된 녹말로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에서 부하량이 높은 BSA의 고정화

BSA를 함유하는 녹말 마이크로스피어는 50 mM 인산염, pH 8.3에서 제조된, 평균 분자량 1600 kDa의 전단처리된 고분지된 녹말의 녹말 용액(40%), PEG 용액(38%, 평균 분자량 20 000 Da) 및 BSA 용액(16%)을 사용하여 제조하였다. 녹말 용액의 온도는 50-55℃로 조정하였고 PEG 및 BSA 용액은 약 30℃로 조정하였다. 녹말 마이크로스피어는 IKA 반응기(IKA 라보라토리 반응기 LR250)에서 제조하였다. 녹말 용액(20g)은 BSA 용액(6.7 ml)과 혼합하였다. PEG 용액(290g)을 교반하(100 rpm)에서 약 6분간 반응 용기로 펌핑하고 약 15분간 계속 교반하였다. 제제를 4℃로 옮기고 교반하에 철야 방치하였다. 상기 용액의 pH값을 약 5.5로 감소시키고 이것을 다시 37℃로 옮겨서 여기서 약 7시간 동안 교반없이 방치하였다. BSA를 함유하는 녹말 마이크로스피어를 5 mM 인산나트륨, pH 4.5로 세척하고 냉동 건조시켰다.

건조된 마이크로스피어를 α-아밀라제 및 아밀로 글루코시다제를 사용한 효소작용에 의해 용해시켜 단백질 및 녹말 수율 및 단백질 부하량을 결정하였다. 단백질 수율은 99%이었고, 녹말 수율은 91%이었으며 수득한 부하량은 11.5%이었다. Malvern Mastersizer로 측정한 평균 입자 크기는 48㎛이었고 그 분포의 10% 미만은 17 ㎛ 미만이었다. α-아밀라제 또는 α-아밀라제 및 아밀로글루코시다제와 함께 배양하는 것에 의해, 상기 마이크로스피어는 48시간 내에 완전히 용해되었다.

실시예 10

고분지, 전단처리된 녹말로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에서 부하량이 높은 BSA의 고정화

평균분자량 1930 kDa의 고분지되고 전단처리된 녹말의 녹말용액(20%), PEG 용액(38%, 평균 분자량 20 000 kDa) 및 BSA 용액(20%)을 50 mM 탄산나트륨, pH 9.8에서 제조하였다. 녹말 용액의 온도는 50-55℃로 조정하였고 나머지 용액은 약 37℃로 조정하였다. 녹말 용액(3g)을 BSA 용액(0.7 ml)과 혼합하였다. 그 혼합물을 주사기에 넣고 교반되는 비이커중의 PEG 용액(28g)에 부가하였다. 그 제제를 4℃로 옮기고, 그 온도에서 4시간 동안 방치한 다음 37℃로 옮겨서 그 온도에서 철야로 방치하였다. BSA를 함유하는 녹말 마이크로스피어를 5 mM 인산나트륨, pH 4.5로 세척한 다음 냉동 건조시켰다.

건조된 마이크로스피어를 α-아밀라제 및 아밀로 글루코시다제를 사용한 효소작용에 의해 용해시켜 단백질 및 녹말 수율 및 단백질 부하량을 결정하였다. 단백질 수율은 91%이었고, 녹말 수율은 90%이었으며 수득한 부하량은 10.6%이었다. Malvern Mastersizer로 측정한 평균 입자 크기는 44㎛이었고 그 분포의 10% 미만은 21 ㎛ 미만이었다. α-아밀라제 또는 α-아밀라제 및 아밀로글루코시다제와 함께 배양하는 것에 의해, 상기 마이크로스피어는 48시간 내에 완전히 용해되었다.

실시예 11

녹말 및 PEG 농도가 높은 고분지되고 전단처리된 녹말로부터 제조된 녹말 마이크로스피어에서 결정성 hGH의 고정화 및 온도 주기

아연 hGH의 결정은 EP 0 540 582 B1호에 따라 제조하였다. 상기 결정의 현탁액은 10 mM 아세트산나트륨, pH 6.4으로 제조하였고, 2 mM 아세트산아연을 함유하고 있었다.

녹말 용액(40%)은, 평균분자량 378 kDa인 고분지되고 전단처리된 녹말로부터 10 mM 인산나트륨, pH 6.4 및 평균 분자량 20,000인 30% 농도의 PEG 용액중에서 제조하였다. 상기 용액의 pH를 1M HCl을 사용하여 6.4로 조정하였다. 이 용액의 온도는 다음과 같이 조정하였다: 녹말 용액은 50-55℃로 조정하였고, PEG 용액은 37℃로 조정하였고, Zn-hGH 결정의 현탁액은 37℃로 조정하였다. 4.9 g의 녹말 용액을 7 ml의 Zn-hGH 결정의 현탁액에 부가하면서 교반하였다. 약 20 초후, 28g의 PEG 용액을 주사기 펌프에 의해 약 6분간 부가하고 그 동안 400 rpm(Eruostar digital 제조)에서 계속 교반하였다. 마이크로스피어가 즉시 형성되기 시작하였고 약 15분후37℃로부터 4℃로 바꾸고 그 온도에서 교반하면서 4시간 동안 유지시켰다. 4시간 동안 안정화시킨 후, 마이크로스피어는 아주 안정하여서 37℃로 옮길 수 있었고 그 온도에서 철야로 교반함없이 유지시켰다. 수득한 마이크로스피어를 2mM 아세트산아연을 함유하는 10 mM 아세트산 나트륨, pH 6.4로 3회 세척하였고, 그후 37℃에서 약 17 내지 20시간 동안 Amicon으로 여과하는 것에 의해 안정화시키고 또 냉동 건조시켰다.

건조된 마이크로스피어를 α-아밀라제 및 아밀로 글루코시다제를 사용한 효소작용에 의해 용해시켜 단백질 및 녹말 수율 및 단백질 부하량을 결정하였다. 단백질 수율은 95.2%이었고, 녹말 수율은 68%이었으며 마이크로스피어에서 단백질 부하량은 27.8%이었다. Malvern Mastersizer로 측정한 평균 입자 크기는 59 ㎛이었고 그 분포의 10% 미만은 29 ㎛ 미만이었다. α-아밀라제 또는 α-아밀라제 및 아밀로글루코시다제와 함께 배양하는 것에 의해, 상기 마이크로스피어는 48시간 내에 완전히 용해되었다. 단백질의 이합체 함량은 0.75%이었고 중합체 함량은 <0.1% 이었다.

상기 시험은 고체 형태로 전환된 단백질도 고수율로 고정화될 수 있고, 그 결과 본 발명에 따른 단백질의 부하량이 높은 녹말 마이크로스피어를 생성한다는 것을 나타낸다. 상기 시험은 또한 상기 수득한 녹말 마이크로스피어는 시험 제조로부터 유래하는 인공물의 도입없이 고정화된 단백질의 특징화를 엄격히 제어할 수 있는 온화한 조건하에서 용해될 수 있다는 것과 상기 단백질은 상기 공정중에 분해되지 않는다는 것을 보여준다. 상기 수득한 단백질 특성은 인간에 비경구적으로 투여되기에 적합한 것이다.

실시예 12

고분지되고 전단처리된 녹말의 녹말 마이크로스피어에서 BSA의 고정화 및 생체내에서 생분해능의 분석

BSA를 함유하는 녹말 마이크로스피어는 고분지되고 전단처리된 평균분자량 1930 kDa의 녹말로부터 하기 조건하에서 제조하였다: 녹말(30%, 100 ml)를 PEG(38%, 1466 ml, 평균 분자량 20 kDa)와 혼합한 다음 처음에는 20℃에서 6시간 동안 이어 37℃에서 철야로 교반하였다. 이들을, 0.6% 나트륨 히알우론산(분자량 2000 kDa, Kraeber GmbH, Hamburg)으로 구성된 주사 부형제중의 30 mg의 투여량으로 레트에 피하주사 및 근육내 주사하고 3일 후 및 7일후에 그 주사 부위에 대해 조직학적 분석을 실시하였다. 3일째에는, 주사부위에서 세포 침투가 관찰되었고, 이들 변화는 7일째 이미 사라졌다.

상기 시험은 고분지되고 전단처리된 녹말로부터 제조된 녹말 마이크로스피어는 생체내에서 1주내에 신속하게 생분해될 수 있고 또 그 조직은 신속하게 정상화된다는 것을 나타낸다.

실시예 13

돼지에서 녹말 마이크로스피어의 생분해능 측정

녹말 마이크로스피어는 평균 분자량 529 kDa의 전단처리된 녹말로부터 제조하였다. 상기 녹말을 측량해서 10 mM 인산나트륨, pH 6.4에 넣어 용해후 농도를 30%로 만들었고, 또 평균 분자량의 PEG 20을 동일 완충액에 넣어 용해후 최종 농도를 27%로 만들었다. 상기 용액은 오토클레이브 처리하여 제조하였다. 그 제조는 Eurostar digital stirring control (Labasco 제조)을 구비한 IKA 반응기에서 실시하였다. 14.35 g의 녹말 용액을 상기 제조에 사용하였고 이를 용해시킨 후 50℃에서 따뜻하게 유지시킨 후 200 g의 PEG 용액을 상기 반응기에 공급하였다. 프로펠러를 이용하여 160 rpm에서 교반하는 것에 의해 유제를 형성하고, 8분 후 교반속도를 140rpm으로 조정한 다음 5시간 후 110 rpm으로 조정하였고 또 온도는 7시간 동안 20℃로 설정한 다음 17시간 동안 38℃로 설정하였다. 수득한 녹말 마이크로스피어를 300 ml 물을 사용하여 4회 세척(Amicon 한외여과 유닛 8400)하고 냉동 건조시켰다. 건조 녹말 마이크로스피어를 38 및 100 ㎛ 스크린으로 체질하였다(Retsch sieving 기계). 체질하기 전에 수득한 녹말 마이크로스피어의 전체 양은 3.61 g 이었고, 이는 약 86% 수율에 상응하는 것이고, 체질한 후에는 2.54 g으로서, 이는 약 59% 수율에 상응한다.

녹말 마이크로스피어를 1 ml의 0.11% 나트륨 히알우론산, 4% 만니톨, 주사용 물 및 100 mg의 마이크로스피어에 현탁시켜 돼지에 피하 주사하였다. 주사 부위를 준비하여 조직학적 평가를 실시하였다. 주사한지 7일 후 녹말 마이크로스피어는 발견되지 않았다.

이 시험은 녹말 마이크로스피어는 1주내에 주사부위로부터 신속하게 생분해되어 사라진다는 것을 나타낸다.

Claims

a) 아밀로펙틴 함량이 85 중량% 이상이고, 상기 아밀로펙틴의 분자량은 아밀로펙틴의 80중량% 이상이 10-10 000 kDa 범위에 존재하도록 감소된 것이며, 또 녹말의 g 건조중량당 50 ㎍ 미만의 아미노산 질소 함량을 갖는 녹말을 함유하는 녹말 수용액을 제조하고, 이때 수용액의 녹말 농도는 20중량% 이상이며;

b) 생물학적 활성물질을 상기 녹말 용액과 혼합시켜 녹말 용액중에 활성물질의 용액, 유제 또는 현탁액 형태로 조성물을 형성시키고;

c) 상기 b) 단계에서 얻은 조성물을 2상 수성 계를 형성하는 능력을 갖는 중합체의 수용액과 혼합하여, 상기 중합체 용액의 외부상내에 생물학적 활성물질을 내부상으로 함유하는 녹말방울의 유제를 형성하며;

d) 상기 c) 단계에서 얻은 녹말 방울을 겔화시켜 녹말이 고화되는 천연 특성을 통하여 녹말 입자를 생성하고;

e) 상기 녹말 입자를 건조시키며; 또

f) 경우에 따라 생체적합한 생분해성 중합체의 방출-제어성 외피를, 바람직하게는 공기 현탁법에 의해, 상기 건조된 녹말 입자에 적용하는 것을 포함하는,

비경구적으로, 바람직하게는 주사에 의해 투여가능한, 생물학적 활성물질을 함유하는 미세입자의 제조방법.
제1항에 있어서, 녹말은 녹말의 g 건조중량당 아미노산 질소가 20 ㎍ 이하,바람직하게는 10 ㎍ 이하, 보다 바람직하게는 5 ㎍ 이하인 순도를 갖는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 녹말은 감소된 분자량이 95중량%를 넘는, 바람직하게는 98중량%를 넘는 아밀로펙틴 함량을 갖는 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 아밀로펙틴의 분자량은 상기 물질의 80중량% 이상이 100-4000 kDa, 바람직하게는 200-1000 kDa, 보다 바람직하게는 300-600 kDa 범위이도록 감소되는 방법.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹말은 25중량%를 초과하는 농도로 물에 용해될 수 있는 방법.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹말은 히드록시에틸 녹말에서 찾을 수 있는 유형의 공유결합된 여분의 화학 기를 갖지 않는 방법.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹말의 내독소 함량은 25 EU/g 미만이고 또 그램당 100개 미만의 미생물을 함유하는 방법.
제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹말은 수성 알칼리 용액으로 세척하는 것에 의해 표면-편재화된 단백질, 지질 및 내독소로부터 실질적으로정제될 수 있고, 전단력을 이용하여 분자량이 감소될 수 있으며, 또 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 내부 단백질로부터 정제될 수 있는 방법.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서는 2.5 내지 70 kDa 범위, 바람직하게는 5 내지 45 kDa의 평균분자량을 갖는 2 내지 15중량%의 아밀로오스가 녹말로 사용되며, 상기 중량% 점유는 녹말의 건조 중량을 기준하여 산출되는 방법.
제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 30중량% 이상의 녹말 농도를 갖는 용액이 제조되는 방법.
제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 50중량% 이하, 바람직하게는 45중량% 이하의 녹말 농도를 갖는 용액이 제조되는 방법.
제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서 녹말 수용액은 동일한 오토클레이브 처리를 실시하여 제조되는 방법.
제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 활성성분은, 60℃ 이하, 바람직하게는 20 내지 45℃, 특히 30 내지 37℃ 온도에서 녹말 용액과 조합되는 방법.
제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 녹말 대 생물학적 활성물질간의 중량비가 3:1 내지 10 000:1, 바람직하게는 3:1 내지 100:1 범위로 조성물이 형성되는 방법.
제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 중합체는 상기 수용액중에서 20중량% 이상, 바람직하게는 30중량% 이상의 농도로 사용되는 방법.
제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 중합체는 상기 수용액중에서 45중량% 이하, 바람직하게는 30 내지 40중량%의 농도로 사용되는 방법.
제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 혼합은 4 내지 50℃, 바람직하게는 10 내지 40℃, 특히 10 내지 37℃ 범위의 온도에서 실시되는 방법.
제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 혼합은 하나 이상의 스테틱 믹서를 이용하여 실시되는 방법.
제1항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 중합체 용액은, 유제가 생성되기 시작한 후 1회 이상 부가를 실시하는 2단계 이상으로 조성물에 부가되는 방법.
제1항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 폴리에틸렌 글리콜이 수성 중합체로서 사용되는 방법.
제20항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 5 내지 35 kDa, 바람직하게는 15 내지 25 kDa, 특히 약 20 kDa의 평균분자량을 갖는 방법.
제1항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 고화반응은 초기에는 종료때보다 낮은 온도에서 실시되는 것과 같이 2종 이상의 온도에서 실시되는 방법.
제22항에 있어서, 상기 고화반응은 1 내지 20℃ 범위, 바람직하게는 1 내지 10℃, 특히 약 4℃에서 개시되고, 또 20 내지 55℃ 범위, 바람직하게는 25 내지 40℃, 특히 약 37℃에서 종료되는 방법.
제1항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서, 단계 e)에서 건조는 분무-건조, 냉동-건조 또는 진공-건조, 바람직하게는 냉동-건조 형태로 실시되는 방법.
제1항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 물질로서는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 다당류, 특히 재조합적으로 생성된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 물질이 혼입되는 방법.
제1항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질은 성장인자, 인슐린, 에리트로포이에틴, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 혈액응고인자 V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII 및 XIII, 단백질 C, 글루카곤-유사 펩티드 1 또는 2, C-펩티드, 표피 성장인자, 성장 호르몬, LHRH-유사체, 시바미드(civamide), 대식세포 콜로니 성장인자, 과립구 콜로니 성장인자, 렙틴 및 인터루킨 또는 양친 물질과 동일한 약물학적 활성을 갖거나 또는 그와 비교하여 더 향상된 약물학적 활성을 갖는 이들의 유사체 또는 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제26항중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서, 녹말방울은 미세입자 형성에 필요한 크기, 바람직하게는 건조상태에서의 평균 입자 직경 10-200 ㎛, 바람직하게는 20-100 ㎛, 보다 바람직하게는 20-80㎛ 범위를 갖게 형성되는 방법.
제1항 내지 제27항중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 이후에, 미세입자는 소망하는 입자 크기 분포를 얻기 위하여 여과를 통하여 세척되고, 경우에 따라 체질되는 방법.
비경구적 투여, 바람직하게는 주사에 의해 포유동물, 특히 인간에게 투여되기에 적합하고, 생물학적 활성 물질을 함유하는 미세입자에 있어서,

상기 미세입자는 아밀로펙틴 함량이 85중량%를 초과하고, 상기 아밀로펙틴의 80중량% 이상은 10-10 000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖고, 녹말의 g 건조중량당 50 ㎍ 미만의 아미노산 질소 함량을 가지며 또 녹말 분자 사이에 공유 화학적 가교결합을 갖지 않는 녹말로 구성되는 것을 특징으로 하는 미세입자.
제29항에 있어서, 녹말은 제2항 내지 제9항중 어느 한 항에 정의된 종류인 미세입자.
제29항 또는 제30항에 있어서, 생물학적 활성물질의 생활성은, 녹말에 혼입되기 전에 생물학적 활성물질이 나타낸 생활성과 비교하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 그대로 유지되는 미세입자.
제29항 내지 제31항중 어느 한 항에 있어서, 알파-아밀라제 및/또는 아밀로글루코시다제 존재하의 시험관내에서 생분해성인 미세입자.
제29항 내지 제32항중 어느 한 항에 있어서, 생분해성이며 피하주사 또는 근육내 주사후 조직으로부터 제거되는 미세입자.
제29항 내지 제33항중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 막 형성성 생체적합성 및 생분해성 중합체의 방출제어 외피를 갖는 미세입자.
제34항에 있어서, 상기 중합체는 알파-히드록시산 단위를 함유하는 동종중합체 또는 공중합체인 미세입자.
제35항에 있어서, 알파-히드록시산이 젖산 및/또는 글리콜산인 미세입자.
제34항 내지 제36항중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피는 상기 중합체 이외에, 하나 이상의 방출 조절 물질을 함유하는 미세입자.
제37항에 있어서, 상기 물질은 수용성 또는 물에 거의 녹지않는 미세입자.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 물질은 젖산, 젖산을 함유하는 올리고머 및 글리콜산으로부터 선택되는 미세입자.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG를 블록의 하나로 포함하는 블록 공중합체를 포함하는 미세입자.
제29항 내지 제40항중 어느 한 항에 있어서, 미세입자의 응집을 방지할 수있는 하나 이상의 수용성 물질의 외층을 갖는 미세입자.
제29항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서, 23G 바늘을 이용하여 주사될 수 있는 미세입자.
제29항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서, 25G 바늘을 이용하여 주사될 수 있는 미세입자.
제29항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서, 건조 분말 주사를 이용하여 피부를 통하여 주사될 수 있는 미세입자.
제29항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서, 바늘을 사용하지 않는 주사기를 통하여 주사될 수 있는 미세입자.
제29항 내지 제45항중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제28항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 미세입자.