RU2589680C1

RU2589680C1 - Method for thrombocyte staining after ultrasonic exposure

Info

Publication number: RU2589680C1
Application number: RU2015119789/15A
Authority: RU
Inventors: Анна Анатольевна Олешкевич; Тимофей Николаевич Пашовкин; Элла Муссаевна Комарова
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2016-07-10

Abstract

FIELD: veterinary science.

SUBSTANCE: invention relates to veterinary science and medicine and can be used in non-invasive examination of animal blood using ultrasonic waves. Method for thrombocyte staining after ultrasonic exposure involves treatment of blood samples to ultrasound for 30 to 45 s with intensity 0.4 W/cm², frequency 880 kHz, ultrasonic travelling wave continuous mode, followed by blood smear preparation and colouring with differential dyes.

EFFECT: invention enables uniform deep differential colouring of all blood corpuscles, including platelets.

1 cl, 2 dwg

Description

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных, предварительно обработанной ультразвуком.The invention relates to veterinary medicine and medicine and can be used for non-invasive examination of animal blood, pre-treated with ultrasound.

Тромбоциты - красные кровяные пластинки (бляшки Бицецеро); полиморфные бесцветные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, диаметром 2-5 мкм, живут 8-11 дней. В норме (200-400)·10⁹/л. У новорожденных концентрация тромбоцитов такая же, как у взрослых; к 7-9 дню снижается до (164-178)·10⁹/л; к концу второй недели - как у взрослых. Увеличение количества - тромбоцитоз, уменьшение количества - тромбоцитопения.Platelets - red blood plates (Bicecero plaques); colorless polymorphic cells formed from megakaryocytes, 2-5 microns in diameter, live 8-11 days. Normal (200-400) · 10 ⁹ / l. In newborns, the platelet concentration is the same as in adults; by day 7-9 it decreases to (164-178) · 10 ⁹ / l; by the end of the second week - as in adults. An increase in the amount of thrombocytosis, a decrease in the amount of thrombocytopenia.

Несмотря на распространение в последнее время в лабораториях счетчиков форменных элементов крови, наиболее часто подсчет тромбоцитов осуществляется в мазках крови, приготовленных с использованием трилона Б. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с пересчетом на 1 мкл крови исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.Despite the recent distribution in the laboratories of blood counters, platelets are most often counted in blood smears prepared using Trilon B. The method is based on counting the number of platelets in stained blood smears per 1000 red blood cells based on 1 μl of blood based on the content in this volume of the number of red blood cells.

Реактивы:Reagents:

6%-ный раствор ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na);6% solution of EDTA (ethylene diamine tetraacetate Na);

раствор эозин-метиленового синего по Май-Грюнвальду;May-Grunwald eosin-methylene blue solution;

раствор Романовского-Гимзы.Romanovsky-Giemsa solution.

Окраска. Кровь смешивают с 6%-ным раствором ЭДТА. Для этого реактив, взятый капилляром Панченкова до метки «75», вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, т.е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться «метелочкой». Толстые, густо-розового цвета мазки не следует использовать, т.к. в них морфология клеток плохо различима.Coloring. Blood is mixed with a 6% solution of EDTA. For this, the reagent taken by the Panchenkov capillary to the mark “75” is added to the tube, then the blood taken by the same capillary is added to the mark “0”. The contents of the test tube are mixed and thin strokes are prepared. The dried smear should be uniformly thin, yellowish, of sufficient size, i.e. located 1-1.5 cm from the edges, occupy 2/3 of the length of the glass and end with a “panicle”. Thick, deep pink smears should not be used because in them the morphology of cells is poorly distinguishable.

Мазки фиксируют раствором Май-Грюнвальда 2-3 мин. Окрашивают раствором Романовского-Гимзы 30-45 мин (разведение из расчета примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды: должно устанавливаться опытным путем для каждой новой партии красителя).Smears are fixed with May-Grunwald solution for 2-3 minutes. Stained with Romanovsky-Giemsa solution for 30-45 min (dilution at the rate of about 1 drop per 1 ml of distilled water: it should be established empirically for each new batch of dye).

Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 2-4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью - грануломером и более светлой периферической незернистой зоной - гиаломером. Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны не менее 1000 эритроцитов.Dry smears are microscopic with an immersion lens, counting the platelet count in thin spots of the preparation (red blood cells should be located in isolation). Platelets in smears look in the form of rounded purple formations 2-4 microns in size with a clearly visible centrally located granular part - granulomer and a lighter peripheral non-granular zone - hyalomer. The calculation is carried out as follows: in each field of view of the microscope, the number of red blood cells and platelets is counted, moving the smear until at least 1000 red blood cells are counted.

Известно приготовление мазков и подсчет количества тромбоцитов в периферической крови человека. Оснащение: смесь Никифорова, предметное и покровное стекла, марлевые салфетки, донорская кровь, капилляр, краска Романовского-Гимза, микроскоп, иммерсионное масло, счетчик 11-клавишный. Мазок готовится на обезжиренном стекле с помощью покровного или предметного стекла. Чистые стекла хранятся до употребления в смеси Никифорова (эфир со спиртом в отношении 1:1) в банке с притертой пробкой. Перед взятием крови стекла вынимают пинцетом и тщательно протирают салфеткой. На палец, обработанный спиртом, наносится капля 14% раствора MgSO₄, через которую делается прокол скарификатором. Большим и средним пальцами левой руки берут предметное стекло за ребро и наносят каплю крови на край стекла. Правой рукой берут покровное стекло, ставят его узким краем рядом с каплей крови так, чтобы она растеклась в углу, образованном двумя стеклами. Покровным стеклом под углом 45° проводят по предметному стеклу, растягивая каплю тонким слоем (не толкать ее вперед, иначе кровь не ляжет ровным слоем). Хорошо сделанный мазок должен быть достаточно тонким, немного уже и короче предметного стекла, иметь желтоватый цвет и просвечивать. Высушивают мазок на воздухе, не подогревая. Затем фиксируют в смеси Никифорова 10 мин, после чего вынимают и сушат в вертикальном положении.It is known to prepare smears and count platelets in human peripheral blood. Equipment: a mixture of Nikiforov, slide and glass covers, gauze wipes, donated blood, capillary, Romanovsky-Giemsa paint, microscope, immersion oil, 11-key counter. A smear is prepared on defatted glass using a coverslip or slide. Clean glasses are stored until use in a mixture of Nikiforov (ether with alcohol in a ratio of 1: 1) in a jar with a ground stopper. Before blood collection, the glass is removed with tweezers and thoroughly wiped with a napkin. A drop of 14% MgSO ₄ solution is applied to a finger treated with alcohol, through which a scarifier is punctured. The thumb and middle fingers of the left hand take a glass slide by the rib and apply a drop of blood to the edge of the glass. Take the coverslip with your right hand, place it with a narrow edge next to a drop of blood so that it spreads in the corner formed by two glasses. A coverslip at an angle of 45 ° is carried out on a glass slide, stretching the drop with a thin layer (do not push it forward, otherwise the blood will not lie in an even layer). A well-made smear should be thin enough, slightly narrower and shorter than the glass slide, have a yellowish color and shine through. Dry the smear in air without heating. Then it is fixed in a Nikiforov mixture for 10 minutes, after which it is removed and dried in an upright position.

Высушенный мазок окрашивают краской Романовского, причем для подсчета тромбоцитов концентрация краски применяется вдвое больше, чем для окраски мазка для подсчета лейкоцитарной формулы. При этом морфологические особенности тромбоцитов изучать остается невозможно. Мазок покрывают тонким слоем краски и оставляют на 45 мин. Затем мазок промывают под проточной водой и сушат.The dried smear is stained with Romanowsky paint, and for the calculation of platelets the concentration of paint is used twice as much as for staining the smear for counting the leukocyte formula. At the same time, it remains impossible to study the morphological features of platelets. The smear is covered with a thin layer of paint and left for 45 minutes. Then the smear is washed under running water and dried.

Смотрят под микроскопом при увеличении 90 с иммерсионным маслом, используя окошечко по Fonio. Подсчет количества тромбоцитов производится на 1000 эритроцитов.Look under a microscope at a magnification of 90 with immersion oil using the Fonio window. Platelet counts are performed per 1000 red blood cells.

В известных методах окраски тромбоциты отдельно окрашивают крайне редко, поскольку в таком случае остальные форменные элементы учитывать невозможно или крайне затруднительно. Одномоментной окраски форменных элементов, включая тромбоциты, без дополнительных затрат красителей в известных способах не происходит.In known staining methods, platelets alone are extremely rarely stained, since in this case it is impossible or extremely difficult to take into account the remaining uniform elements. Simultaneous staining of shaped elements, including platelets, without additional cost dyes in the known methods does not occur.

Наиболее близким аналогом изобретения является метод быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18) (Любин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. - Ульяновск, ГСХА, 2005, 113 с.).The closest analogue of the invention is the method of rapid differential staining of DIFF-QUIK biological products: smears were fixed in absolute methanol for 15 s, kept in dye solutions for 10 s, washed in buffered water, dried and microscopied (Mikmed-5 microscope, lens 100x / 1.25, eyepiece 10x / 18) (Lyubin N.A., Konova L.B. Methodical recommendations for determining and removing hemograms in agricultural and laboratory animals with pathologies. - Ulyanovsk, State Agricultural Agricultural Academy, 2005, 113 pp.).

Однако данный способ не обеспечивает глубокую и равномерную окраску тромбоцитов всех размеров, независимо от их видовой принадлежности какому-либо животному, возможность подсчета и выявления морфологических особенностей кровяных пластинок. В результате данного этапа работы была отработана методика одновременной глубокой окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно всегда равномерно окрасить тромбоциты животного любого вида для изучения морфологии и диагностики изменений клеточных мембран. Найденный диапазон интенсивности ультразвука (УЗ) и времени озвучивания обеспечивает гарантированно качественную окраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретных клеток, условий взятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологического процесса), не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов.However, this method does not provide a deep and uniform coloration of platelets of all sizes, regardless of their species affiliation with any animal, the ability to count and identify morphological features of blood platelets. As a result of this stage of the work, a technique was developed for simultaneous deep staining of all blood cells, while in the known staining methods for staining leukocytes it is impossible to always uniformly stain platelets of an animal of any kind to study the morphology and diagnosis of changes in cell membranes. The found range of ultrasound (ultrasound) intensity and sonication time ensures guaranteed high-quality platelet staining in all cases (regardless of the characteristics of specific cells, conditions for blood collection and storage, the condition of the animal, the presence of a pathological process), without negatively affecting the color of other shaped elements.

Окрашивание ДИФФ-КВИК с УЗ позволяет хорошо визуализировать тромбоциты и может быть использовано в качестве модификации для подсчета именно тромбоцитов любого размера и вида и для одновременного изучения морфологических и цитологических особенностей всех окрашенных клеток, показывает наличие клеточных деформаций, анизоцитоза, повреждений цитоплазматических мембран тромбоцитов. Дает возможность визуализировать границы тромбоцитов.DIFF-QUIK staining with ultrasound allows you to visualize platelets well and can be used as a modification to count platelets of any size and type and to simultaneously study the morphological and cytological features of all stained cells, shows the presence of cell deformations, anisocytosis, and damage to the cytoplasmic platelet membranes. It makes it possible to visualize the boundaries of platelets.

Целью изобретения является разработка способа дифференциальной окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей в одной и той же концентрации.The aim of the invention is to develop a method for differential staining of all blood cells with one standard set of dyes in the same concentration.

Техническим результатом изобретения является возможность дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты, после УЗ воздействия на образцы крови непосредственно до приготовления мазков. Возможность одинаково равномерной и глубокой окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей без дополнительных средств (красителей, спиртов) и затрат времени.The technical result of the invention is the possibility of differential staining of all blood cells, including platelets, after ultrasonic treatment of blood samples immediately before preparation of smears. The ability to equally uniformly and deeply stain all blood cells with one standard set of dyes without additional funds (dyes, alcohols) and time-consuming.

Указанный технический результат достигается тем, что окраску тромбоцитов проводили после ультразвукового воздействия. Образцы крови in vitro обрабатывали ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0,4 Вт/см², частотой 880 кГц, бегущей УЗ волной, режим воздействия непрерывный. После ультразвукового воздействия готовили мазки крови и окрашивали их дифференциальными красителями.The specified technical result is achieved by the fact that the color of platelets was performed after ultrasonic treatment. Samples of blood in vitro sonicated for 30 seconds to 45 seconds, the intensity of 0.4 W / cm ^2, a frequency of 880 kHz, the ultrasonic wave traveling, continuous exposure mode. After ultrasonic treatment, blood smears were prepared and stained with differential dyes.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.The claimed method is as follows.

Воздействовали ультразвуком in vitro на образцы крови. Экспозиция УЗ: время от 30 с до 45 с, I_SATA - средняя по пространству и времени интенсивность - 0,4 Вт/см², частота 880 кГц. Аппараты: УЗТ-1-01Ф; УЗТ-5 и УЗТ-1.02С. Бегущая УЗ волна, режим непрерывный. Кровь брали из подкожной вены предплечья у кошек, собак, кроликов, яремной вены лошадей натощак в утренние часы. Кровь забирали в ветеринарной клинике во время ежегодного контроля здоровья. Для каждого объема крови подбиралась экспозиции таким образом, чтобы получались сопоставимые результаты. Образцы крови от 0,5-1,5 мл озвучивались в абсолютно одинаковых условиях. УЗ воздействие на клетки крови осуществлялось с помощью терапевтического излучателя. Результат сразу же наблюдали в световой микроскоп. Число клеток в единице объема крови определяли с помощью камеры Горяева и светового микроскопа. Делали мазки и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 10071,25, окуляр 10^x/18).In vitro ultrasound was applied to blood samples. Ultrasound exposure: time from 30 s to 45 s, I _SATA - average in space and time intensity - 0.4 W / cm ² , frequency 880 kHz. Devices: UZT-1-01F; UZT-5 and UZT-1.02C. Running ultrasonic wave, continuous mode. Blood was taken from the saphenous vein of the forearm from cats, dogs, rabbits, jugular veins of horses on an empty stomach in the morning. Blood was taken at a veterinary clinic during the annual health check. For each blood volume, exposure was selected so that comparable results were obtained. Blood samples from 0.5-1.5 ml were voiced under exactly the same conditions. Ultrasound exposure to blood cells was carried out using a therapeutic emitter. The result was immediately observed under a light microscope. The number of cells per unit volume of blood was determined using a Goryaev camera and a light microscope. Smears were made and stained according to the method of fast differential staining of DIFF-QUIK biological products: the smears were fixed in absolute methanol for 15 s, kept in dye solutions for 10 s, washed in buffered water, dried and microscopic (Mikmed-5 microscope, lens 10071, 25, eyepiece 10 ^x / 18).

На рис. 1 изображен образец крови кошки, обработанный ультразвуком, интенсивностью 0,4 Вт/см², время 30 с, воздействие непрерывное.In fig. 1 shows a cat blood sample treated with ultrasound, intensity 0.4 W / cm ² , time 30 s, continuous exposure.

На рис. 2 образец крови собаки, обработанный ультразвуком, интенсивностью 0,4 Вт/см², время 35 с, воздействие непрерывное.In fig. 2 a blood sample of a dog treated with ultrasound, intensity 0.4 W / cm ² , time 35 s, continuous exposure.

В результате данного этапа работы была отработана методика окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно одновременно глубоко и эффективно прокрасить тромбоциты всех размеров. Найденный диапазон интенсивности и времени обеспечивает окраску тромбоцитов, не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов. Используемый диапазон ультразвукового воздействия является терапевтическим и безопасным для экспериментатора.As a result of this stage of the work, a technique for staining all blood cells was developed, while in the known staining methods when staining white blood cells, it is impossible to deeply and efficiently stain platelets of all sizes. The found range of intensity and time provides the color of platelets, without negatively affecting the color of other shaped elements. The ultrasonic exposure range used is therapeutic and safe for the experimenter.

Claims

Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия, включающий предварительную обработку образцов крови ультразвуком in vitro от 30 с до 45 с интенсивностью 0,4 Вт/см², частотой 880 кГц, бегущей ультразвуковой волной, режим непрерывный, с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями. A method for staining platelets after ultrasonic treatment, including pretreatment of blood samples with ultrasound in vitro from 30 s to 45 with an intensity of 0.4 W / cm ² , a frequency of 880 kHz, a traveling ultrasonic wave, a continuous mode, followed by preparation of blood smears and their differential staining dyes.