RU2589680C1 - Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия - Google Patents
Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия Download PDFInfo
- Publication number
- RU2589680C1 RU2589680C1 RU2015119789/15A RU2015119789A RU2589680C1 RU 2589680 C1 RU2589680 C1 RU 2589680C1 RU 2015119789/15 A RU2015119789/15 A RU 2015119789/15A RU 2015119789 A RU2015119789 A RU 2015119789A RU 2589680 C1 RU2589680 C1 RU 2589680C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- staining
- platelets
- ultrasonic
- ultrasound
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных с помощью ультразвуковых волн. Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия включает обработку образцов крови ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0,4 Вт/см2, частотой 880 кГц, бегущей ультразвуковой волной, режим непрерывный, с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями. Изобретение обеспечивает возможность равномерной глубокой дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты. 2 ил.
Description
Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных, предварительно обработанной ультразвуком.
Тромбоциты - красные кровяные пластинки (бляшки Бицецеро); полиморфные бесцветные клетки, образующиеся из мегакариоцитов, диаметром 2-5 мкм, живут 8-11 дней. В норме (200-400)·109/л. У новорожденных концентрация тромбоцитов такая же, как у взрослых; к 7-9 дню снижается до (164-178)·109/л; к концу второй недели - как у взрослых. Увеличение количества - тромбоцитоз, уменьшение количества - тромбоцитопения.
Несмотря на распространение в последнее время в лабораториях счетчиков форменных элементов крови, наиболее часто подсчет тромбоцитов осуществляется в мазках крови, приготовленных с использованием трилона Б. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с пересчетом на 1 мкл крови исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.
Реактивы:
6%-ный раствор ЭДТА (этилендиаминтетраацетат Na);
раствор эозин-метиленового синего по Май-Грюнвальду;
раствор Романовского-Гимзы.
Окраска. Кровь смешивают с 6%-ным раствором ЭДТА. Для этого реактив, взятый капилляром Панченкова до метки «75», вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, т.е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться «метелочкой». Толстые, густо-розового цвета мазки не следует использовать, т.к. в них морфология клеток плохо различима.
Мазки фиксируют раствором Май-Грюнвальда 2-3 мин. Окрашивают раствором Романовского-Гимзы 30-45 мин (разведение из расчета примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды: должно устанавливаться опытным путем для каждой новой партии красителя).
Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 2-4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью - грануломером и более светлой периферической незернистой зоной - гиаломером. Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны не менее 1000 эритроцитов.
Известно приготовление мазков и подсчет количества тромбоцитов в периферической крови человека. Оснащение: смесь Никифорова, предметное и покровное стекла, марлевые салфетки, донорская кровь, капилляр, краска Романовского-Гимза, микроскоп, иммерсионное масло, счетчик 11-клавишный. Мазок готовится на обезжиренном стекле с помощью покровного или предметного стекла. Чистые стекла хранятся до употребления в смеси Никифорова (эфир со спиртом в отношении 1:1) в банке с притертой пробкой. Перед взятием крови стекла вынимают пинцетом и тщательно протирают салфеткой. На палец, обработанный спиртом, наносится капля 14% раствора MgSO4, через которую делается прокол скарификатором. Большим и средним пальцами левой руки берут предметное стекло за ребро и наносят каплю крови на край стекла. Правой рукой берут покровное стекло, ставят его узким краем рядом с каплей крови так, чтобы она растеклась в углу, образованном двумя стеклами. Покровным стеклом под углом 45° проводят по предметному стеклу, растягивая каплю тонким слоем (не толкать ее вперед, иначе кровь не ляжет ровным слоем). Хорошо сделанный мазок должен быть достаточно тонким, немного уже и короче предметного стекла, иметь желтоватый цвет и просвечивать. Высушивают мазок на воздухе, не подогревая. Затем фиксируют в смеси Никифорова 10 мин, после чего вынимают и сушат в вертикальном положении.
Высушенный мазок окрашивают краской Романовского, причем для подсчета тромбоцитов концентрация краски применяется вдвое больше, чем для окраски мазка для подсчета лейкоцитарной формулы. При этом морфологические особенности тромбоцитов изучать остается невозможно. Мазок покрывают тонким слоем краски и оставляют на 45 мин. Затем мазок промывают под проточной водой и сушат.
Смотрят под микроскопом при увеличении 90 с иммерсионным маслом, используя окошечко по Fonio. Подсчет количества тромбоцитов производится на 1000 эритроцитов.
В известных методах окраски тромбоциты отдельно окрашивают крайне редко, поскольку в таком случае остальные форменные элементы учитывать невозможно или крайне затруднительно. Одномоментной окраски форменных элементов, включая тромбоциты, без дополнительных затрат красителей в известных способах не происходит.
Наиболее близким аналогом изобретения является метод быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18) (Любин Н.А., Конова Л.Б. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. - Ульяновск, ГСХА, 2005, 113 с.).
Однако данный способ не обеспечивает глубокую и равномерную окраску тромбоцитов всех размеров, независимо от их видовой принадлежности какому-либо животному, возможность подсчета и выявления морфологических особенностей кровяных пластинок. В результате данного этапа работы была отработана методика одновременной глубокой окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно всегда равномерно окрасить тромбоциты животного любого вида для изучения морфологии и диагностики изменений клеточных мембран. Найденный диапазон интенсивности ультразвука (УЗ) и времени озвучивания обеспечивает гарантированно качественную окраску тромбоцитов во всех случаях (независимо от особенностей конкретных клеток, условий взятия и хранения крови, состояния животного, наличия патологического процесса), не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов.
Окрашивание ДИФФ-КВИК с УЗ позволяет хорошо визуализировать тромбоциты и может быть использовано в качестве модификации для подсчета именно тромбоцитов любого размера и вида и для одновременного изучения морфологических и цитологических особенностей всех окрашенных клеток, показывает наличие клеточных деформаций, анизоцитоза, повреждений цитоплазматических мембран тромбоцитов. Дает возможность визуализировать границы тромбоцитов.
Целью изобретения является разработка способа дифференциальной окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей в одной и той же концентрации.
Техническим результатом изобретения является возможность дифференциальной окраски всех форменных элементов крови, включая тромбоциты, после УЗ воздействия на образцы крови непосредственно до приготовления мазков. Возможность одинаково равномерной и глубокой окраски всех клеток крови одним стандартным набором красителей без дополнительных средств (красителей, спиртов) и затрат времени.
Указанный технический результат достигается тем, что окраску тромбоцитов проводили после ультразвукового воздействия. Образцы крови in vitro обрабатывали ультразвуком от 30 с до 45 с, интенсивностью 0,4 Вт/см2, частотой 880 кГц, бегущей УЗ волной, режим воздействия непрерывный. После ультразвукового воздействия готовили мазки крови и окрашивали их дифференциальными красителями.
Заявленный способ осуществляется следующим образом.
Воздействовали ультразвуком in vitro на образцы крови. Экспозиция УЗ: время от 30 с до 45 с, ISATA - средняя по пространству и времени интенсивность - 0,4 Вт/см2, частота 880 кГц. Аппараты: УЗТ-1-01Ф; УЗТ-5 и УЗТ-1.02С. Бегущая УЗ волна, режим непрерывный. Кровь брали из подкожной вены предплечья у кошек, собак, кроликов, яремной вены лошадей натощак в утренние часы. Кровь забирали в ветеринарной клинике во время ежегодного контроля здоровья. Для каждого объема крови подбиралась экспозиции таким образом, чтобы получались сопоставимые результаты. Образцы крови от 0,5-1,5 мл озвучивались в абсолютно одинаковых условиях. УЗ воздействие на клетки крови осуществлялось с помощью терапевтического излучателя. Результат сразу же наблюдали в световой микроскоп. Число клеток в единице объема крови определяли с помощью камеры Горяева и светового микроскопа. Делали мазки и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 10071,25, окуляр 10x/18).
На рис. 1 изображен образец крови кошки, обработанный ультразвуком, интенсивностью 0,4 Вт/см2, время 30 с, воздействие непрерывное.
На рис. 2 образец крови собаки, обработанный ультразвуком, интенсивностью 0,4 Вт/см2, время 35 с, воздействие непрерывное.
В результате данного этапа работы была отработана методика окраски всех форменных элементов крови, в то время как в известных способах окраски при окраске лейкоцитов невозможно одновременно глубоко и эффективно прокрасить тромбоциты всех размеров. Найденный диапазон интенсивности и времени обеспечивает окраску тромбоцитов, не влияя отрицательно на окраску других форменных элементов. Используемый диапазон ультразвукового воздействия является терапевтическим и безопасным для экспериментатора.
Claims (1)
- Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия, включающий предварительную обработку образцов крови ультразвуком in vitro от 30 с до 45 с интенсивностью 0,4 Вт/см2, частотой 880 кГц, бегущей ультразвуковой волной, режим непрерывный, с последующим приготовлением мазков крови и их окраской дифференциальными красителями.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015119789/15A RU2589680C1 (ru) | 2015-05-26 | 2015-05-26 | Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015119789/15A RU2589680C1 (ru) | 2015-05-26 | 2015-05-26 | Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2589680C1 true RU2589680C1 (ru) | 2016-07-10 |
Family
ID=56371291
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015119789/15A RU2589680C1 (ru) | 2015-05-26 | 2015-05-26 | Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2589680C1 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106198154A (zh) * | 2016-08-11 | 2016-12-07 | 衢州职业技术学院 | 一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法 |
RU2699733C1 (ru) * | 2018-03-30 | 2019-09-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Способ лабораторной ультразвуковой диагностики ранних стадий жеребости |
RU2770557C1 (ru) * | 2020-12-25 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ выявления тромбоцитов на гистологических препаратах |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1499150A1 (ru) * | 1987-05-07 | 1989-08-07 | Институт Химической Физики Ан Ссср | Способ окрашивани клеток крови на мазках |
SU1532548A1 (ru) * | 1987-07-02 | 1989-12-30 | Научно-исследовательский кожно-венерологический институт | Способ окраски тромбоцитов на мазках |
-
2015
- 2015-05-26 RU RU2015119789/15A patent/RU2589680C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1499150A1 (ru) * | 1987-05-07 | 1989-08-07 | Институт Химической Физики Ан Ссср | Способ окрашивани клеток крови на мазках |
SU1532548A1 (ru) * | 1987-07-02 | 1989-12-30 | Научно-исследовательский кожно-венерологический институт | Способ окраски тромбоцитов на мазках |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Н.А.Любин и др. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животных // Ульяновск, 2005. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106198154A (zh) * | 2016-08-11 | 2016-12-07 | 衢州职业技术学院 | 一种血小板涂片免疫组织化学染色的观察方法 |
RU2699733C1 (ru) * | 2018-03-30 | 2019-09-09 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина" (ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина) | Способ лабораторной ультразвуковой диагностики ранних стадий жеребости |
RU2770557C1 (ru) * | 2020-12-25 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Способ выявления тромбоцитов на гистологических препаратах |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Brito et al. | Andrology laboratory review: Evaluation of sperm concentration | |
Zheng et al. | Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain | |
RU2589680C1 (ru) | Способ окраски тромбоцитов после ультразвукового воздействия | |
Walberg | White blood cell counting techniques in birds | |
JP2014209090A (ja) | 細胞分析方法及び装置 | |
RU2589679C1 (ru) | Способ окраски тромбоцитов после воздействия модулированным ультразвуком | |
Dazo et al. | Two new field techniques for detection and counting of Schistosoma haematobium eggs in urine samples, with an evaluation of both methods | |
Soares et al. | Light microscopy in aquatic ecology: methods for plankton communities studies | |
Watts | Development of a fluorescent computer‐assisted spermatozoal quantification method and a comparison of results for manual counting with a haemocytometer and computer‐assisted semen analysis in dogs | |
RU137188U1 (ru) | Биочип для диагностики в области медицины | |
JP3746867B2 (ja) | 血球の粘着凝集能の測定法および測定装置 | |
RU2683324C2 (ru) | Набор для комплексной диагностики эндопаразитов животных методом копроскопии | |
WO2005035736A1 (ja) | 粘液除去方法並びにこれに用いる細胞処理液及び保存液 | |
RU2490635C1 (ru) | Усовершенствованный способ приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации | |
Shukla et al. | Forensic Applications of Compound Microscope | |
RU2657609C1 (ru) | Способ определения индекса фрагментации днк сперматозоидов у животных-производителей | |
Perumal et al. | Counting sperm numbers | |
CA3107571A1 (en) | Biological sample holder and handler | |
Nivedhita et al. | Analysis of Papanicolaou stain on peripheral smear compared to Leishman's stain: A prospective study. | |
Melaku et al. | Testicular cytological profiles of apparently healthy male dromedary camels during rutting and non-rutting periods | |
BR112020001726A2 (pt) | método para imobilização de amostras biológicas para fins analíticos e de diagnóstico | |
Srivastava et al. | Evaluating sperm cell morphology | |
HAMMED et al. | New and ModifiedStaining TechniquesforRapid Diagnosis of Hemoparasites in Blood Smears of Cows | |
Samatha et al. | Epidemiological and diagnostic studies of microfilariasis in buffaloes | |
Audu et al. | Prevalence of Haemoparasites and Associated Haematological Changes in Dogs in Potiskum Local Government Area, Yobe State, Nigeria. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170527 |