RU2545694C2 - Вектор парапоксвируса, содержащий антиген вируса бешенства - Google Patents
Вектор парапоксвируса, содержащий антиген вируса бешенства Download PDFInfo
- Publication number
- RU2545694C2 RU2545694C2 RU2012149036/10A RU2012149036A RU2545694C2 RU 2545694 C2 RU2545694 C2 RU 2545694C2 RU 2012149036/10 A RU2012149036/10 A RU 2012149036/10A RU 2012149036 A RU2012149036 A RU 2012149036A RU 2545694 C2 RU2545694 C2 RU 2545694C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- parapoxvirus
- recombinant
- virus
- heterologous dna
- ovis
- Prior art date
Links
- 241000700639 Parapoxvirus Species 0.000 title claims abstract description 157
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 title claims abstract description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title description 39
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title description 39
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 83
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 53
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 68
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 65
- 241000283898 Ovis Species 0.000 claims description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 31
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000623261 Trypanosoma brucei brucei Uncharacterized 25.6 kDa protein in aldolase locus Proteins 0.000 claims description 6
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 6
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 60
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 55
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 26
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 19
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 13
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 4
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 3
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 3
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 3
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 3
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 3
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 3
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 3
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 3
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 3
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 3
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 3
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 3
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 3
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 3
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 3
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 3
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 3
- 241001518154 Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 3
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 3
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 3
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 3
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 3
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 3
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 3
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 201000005332 contagious pustular dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 2
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 description 2
- 241001647374 Chlamydia felis Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008034 Contagious Ecthyma Diseases 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000701915 Feline panleukopenia virus Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 206010031071 Orf Diseases 0.000 description 2
- 241000700635 Orf virus Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 2
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 108010064866 biozym Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000008214 highly purified water Substances 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 238000004803 parallel plate viscometry Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920000553 poly(phenylenevinylene) Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZQAUUVBKYXMET-UHFFFAOYSA-N 2-bromoethanamine Chemical compound NCCBr IZQAUUVBKYXMET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001518086 Bartonella henselae Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282985 Cervus Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000605314 Ehrlichia Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000702680 Equine rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000266847 Mephitidae Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 241000283150 Phoca vitulina Species 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000555736 Sciurus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl] (4ar,5r,6as,6br,9s,10s,12ar)-10-[(2r,3r,4s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)CO[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](C)O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1OC(=O)[C@]12CCC(C)(C)CC1C1=CCC3[C@@]([C@@]1(C[C@H]2O)C)(C)CCC1[C@]3(C)CC[C@@H]([C@@]1(C)C=O)O[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO2)O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)C(=O)NCCCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@](O)(CO)[C@H]1O NKVLDFAVEWLOCX-GUSKIFEASA-N 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 229940092524 bartonella henselae Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012973 diazabicyclooctane Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007915 intraurethral administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000008014 pharmaceutical binder Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
- C12N2710/24241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Применение рекомбинантного парапоксвируса, несущего в своем геноме G белок, взятый из вируса бешенства, позволяет создать иммуногенные композиции и вакцины с высокой эффективностью. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается рекомбинантных парапоксвирусов, содержащих гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства (RV), и их применения в иммуногенных композициях и вакцинах. Оно также касается способов вакцинации, лечения или профилактики заболеваний, вызванных вирусом бешенства. Оно также касается применения рекомбинантных парапоксвирусов для диагностики.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирусы семейства Poxviridae представляют собой овальные, довольно крупные вирусы из двухцепочечных ДНК. Род Parapoxvirus (PPV) относится к этим вирусам. Они имеют длину около 220-300 нм и ширину 140-170 нм. Они имеют уникальную спиральную оболочку, отличающую их от других поксвирусов.
PPV разделяются на три разных вида. Однако до сих пор остается невыясненным, являются ли эти вирусы самостоятельными видами в пределах рода парапоксвирусов или же они принадлежат к одному виду. Первый вид, Parapoxvirus ovis, считается прототипом рода. Он также называется вирусом контагиозной эктимы или вирусом контагиозного пустулезного дерматита. Второй, Parapoxvirus bovis 1, также называется вирусом папулезного стоматита крупного рогатого скота. Третий, Parapoxvirus bovis 2, также называется udderpoxvirus, вирусом паравакцины, вирусом ложной коровьей оспы или вирусом узелков доильщиц.
Виды парапоксвируса являются эндемическими для жвачных. PPV были обнаружены у оленя благородного, северного оленя, красной белки и обыкновенного тюленя. Инфицирование PPV может вызывать местные заболевания как у животных, так и у человека. Природно-очаговыми хозяевами видов PPV являются овцы, козы и крупный рогатый скот. Они могут инфицировать человека через прямой контакт с инфицированными животными, реакцию с локализованными эпидермальными поражениями, которые заживают без рубцевания. Для борьбы с заболеваниями могут применяться профилактические меры, такие как вакцинация.
Векторы для экспрессии инородной генетической информации на основе вирусов птичьей оспы, оспы енотовых, оспы овец и коз, оспы свиней или коровьей оспы описывались ранее (см. документы US 5,942,235 и US 7,094,412). Парапоксвирусы представляют собой другие варианты, которые могут применяться в векторных вакцинах. Однако с учетом морфологических, структурных и генетических отличий между отдельными родами поксвирусов способы, применяемые для этих поксвирусов, не могут применяться для парапоксвируса. Примером таких отличий может быть то, что в ORFV отсутствует ген тимидинкиназы (ТК), применяемый для селекции рекомбинантов в различных ортопоксвирусах. Также некоторые поксвирусы способны агглютинировать эритроциты посредством поверхностного белка, гемагглютинина, а парапоксвирусы такой способностью не обладают.
PPV могут иметь иммуномоделирующее действие, поскольку они стимулируют генерализованные (неспецифические) иммунные реакции у позвоночных. Они успешно применяются в ветеринарной медицине для повышения общей устойчивости у животных. Они могут комбинироваться с гомологичным и/или гетерологичным антигеном для обеспечения вакцин, обладающих патоген-специфическим эффектом, который длится от нескольких месяцев до нескольких лет, а также быстрым не специфическим к патогену эффектом.
Parapoxvirus ovis ранее применялся в качестве вектора, как описывается в Патенте США 6,365,393 и публикации Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145. Он обеспечивает значительные преимущества при применении в качестве вектора, включая очень узкий тропизм, отсутствие системной инфекции, краткосрочный специфический к вектору иммунитет (допускающий повторную иммунизацию), раннюю вакцинацию (индукция иммунитета может начаться в присутствии материнских антител) и благоприятные иммуномодулирующие свойства. Настоящее изобретение касается применения парапоксвируса в качестве вектора для гетерологичной ДНК, взятой из вируса бешенства.
Штамм Parapoxvirus ovis D1701 является сильно аттенуированным штаммом, который может распространяться в культуре клеток с титрами, сравнимыми с титрами вируса дикого типа. Он обладает отличными иммуностимулирующими свойствами как в хозяевах, поддерживающих репликацию инфекционного векторного вируса (например, овцах и козах), так и в хозяевах, не поддерживающих такую репликацию (например, собаках, свиньях, лошадях, мышах и крысах). Zylexis®, ранее известный как Baypamune®, который представляет собой препарат химически инактивированного Parapoxvirus ovis, производного от штамма D1701, применяют для профилактики, метафилактики и терапевтического лечения инфекционных заболеваний и для предотвращения вызванных стрессом заболеваний животных.
Вирус бешенства (RV), Нейротрофический лиссавирус, относится к семейству Rhabdoviridae. Он представляет собой нейротрофический вирус, вызывающий летальные заболевания у людей и других млекопитающих. Бешенство чаще всего передается через укусы бешеных животных с заражением через слюну животных. Подавляющее большинство случаев бешенства, о которых ежегодно сообщается в Центр по профилактике и контролю заболеваемости США (CDC), отмечается у диких животных, таких как еноты, скунсы, летучие мыши и лисы. Бешенство до сих пор остается очень распространенным заболеванием, в особенности в развивающихся странах. От бешенства ежегодно умирает приблизительно 50000 человек. Наиболее высокий риск инфекции для человека представляют бешеные собаки.
Вирус бешенства представляет собой содержащий одноцепочечную отрицательно-полярную нить РНК вирус, кодирующий 5 белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (Р), матриксный белок (М), гликопротеин (G) и полимераза (L). Зрелый пулевидный вирус со средней длиной приблизительно 180 нм и средней шириной приблизительно 75 нм имеет рибонуклеопротеиновое ядро, белковую оболочку и липидный конверт. Гликопротеиновые выступы, имеющие приблизительно 5-10 нм в длину и приблизительно 3 нм в диаметре, покрывают внешнюю поверхность вируса. Они образуют приблизительно 400 гримерных плотно расположенных отростков.
RV обладает высокой аффинностью к нервной ткани. Причина этого неизвестна. Однако она может состоять в том, что G-белок вируса бешенства может связываться в ацетилхолиновый рецептор (рецептор нейротрансмиттера). После присоединения RV к клетке-хозяину через вирусный G-белок вирус поглощается клеткой путем заглатывания.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в целом касается рекомбинантных парапоксвирусов, в частности Parapoxvirus ovis (PPVO). Рекомбинантный парапоксвирус применяется для опосредования быстрого природного иммунного ответа, а также длительного специфического к инородному гену иммунитета против вируса бешенства. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V.
В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства или его фрагменты. В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В еще одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Настоящее изобретение охватывает способы получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего вставку гетерологичной ДНК в геном парапоксвируса. В одном варианте осуществления способ включает применение Parapoxvirus ovis. В одном варианте осуществления способ включает применение штамма Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления способ включает применение штамма Parapoxvirus ovis D1701-V. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК, применяемая согласно способу, включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК, применяемая согласно способу, включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В одном варианте осуществления способа гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В одном варианте осуществления способ включает получение Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Настоящее изобретение охватывает иммуногенную композицию, включающую рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способы получения иммуногенной композиции, включающие комбинирование рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение также охватывает вакцину, включающую рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способ получения вакцины, включающий комбинирование рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает Parapoxvirus ovis, в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701, а в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты, а в других вариантах осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701. В других из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Настоящее изобретение охватывает способ стимулирования у животного иммунного ответа против вируса бешенства, включающий введение вышеупомянутому животному иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает способ вакцинации животного от вируса бешенства, включающий введение вышеупомянутому животному терапевтически эффективного количества композиции вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, и носитель. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, при изготовлении медикамента для стимулирования иммунного ответа против вирус бешенства у животного. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, при изготовлении медикамента для вакцинации животного против вируса бешенства. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус включает Parapoxvirus ovis, в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701, а в других рекомбинантный парапоксвирус включает штамм Parapoxvirus ovis D1701-V. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты, а в других вариантах осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. В некоторых из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В других из этих вариантов осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В некоторых из этих вариантов осуществления рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG. В некоторых из этих вариантов осуществления стимулируется специфический защитный иммунный ответ против G-белка. В других подобных вариантах осуществления иммунный ответ состоит в вырабатывании сывороточных антител против G-белка. В других подобных вариантах осуществления такое вырабатывание в результате обеспечивает титры антител свыше 0,5 международных единиц на мл.
Настоящее изобретение обеспечивает способ определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного. Описанные авторами парапоксвирусы могут отличаться от штаммов дикого типа как по геномному составу, так и по экспрессируемым белкам. Такое отличие позволяет проводить различия между вакцинированными и инфицированными животными. Настоящее изобретение охватывает применение рекомбинантного парапоксвируса, как указывается авторами в анализе дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). В одном варианте осуществления в DIVA-анализе применяют рекомбинантный Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
Эти и другие варианты осуществления описываются и охватываются представленным ниже подробным описанием.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Для лучшего понимания настоящего изобретения представлены прилагаемые фигуры, среди которых:
Фигура 1: Построение плазмиды pdV-RabG. G-ген вируса бешенства вставляют как фрагмент ВатHI-EcoRI в сайт множественного клонирования (обведенные основания) pdV-Recl, в результате чего получают плазмиду pdV-RabG (размером 7,7 т.п.н.). Показываются позиции праймеров ORF32N (SEQ ID NO:1) и ORF31N (SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:3 показывается на Фигуре.
Сокращения: Sm=SmaI, H3=HindIII, EcoV=EcoRV, P=PstI, В=BamHI, К=KpnI, E=EcoRI, S=SalI. F9L и ORF3 указывают на присутствие генов PPVO F9L (ORF 131) и ORF3 (ORF 133). Pvegf указывает на присутствие промотора vegF-E, применяемого для контроля экспрессии вставленного G-гена. (P) и (H3) показывают разрушенные сайты рестрикции PstI и HindIII основной цепи вектора плазмиды pSPT-18, соответственно, показаны промоторы Т7 и SP6 pSPT-18. Фигура показана не в масштабе.
Фигура 2: Нейтрализующий вирус ответ на сывороточное антитело (SNT) после иммунизации различными дозами D1701-V-RabG. Группы мышей C57/BL6 (для каждого дня n=6 или 7) иммунизировали единичной дозой D1701-V-RabG с применением 107 FU (колониеобразующих единиц) (А), 106 PFU (В), 105 PFU (С) и 104 PFU (D). Отдельные образцы сыворотки брали ежедневно в течение 14 дней после иммунизации (с d1 no d14).
Фигура 3: Эксперимент с провокацией иммунизированных мышей. Мышам C57/BL6 вводили единичную дозу D1701-V-RabG, как указано (от 107 до 104 PFU), и внутричерепным путем вводили провоцирующую инфекцию через 2 недели с применением как минимум 3400 LD50 (4,8×105 PFU) RV вирулентного штамма С VS. (А) показывает кривые выживаемости отдельных животных в каждой группе, а (В) показывает те же результаты в процентах выживших особей.
Фигура 4. SEQ ID NO:4 - Последовательность кодирующей области полной длины G-гена вируса бешенства (1575 нуклеотидов) плюс 7 нуклеотидов на 5'-конце и 6 нуклеотидов на 3'-конце в качестве линкерных последовательностей для рестрикционного анализа (BamHI и EcoRI).
Фигура 5. Роль Т-клеток для защитного иммунитета. CD4-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD4 клеткам. CD8-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD8-T-клеткам. CD4/8-Imm является группой, иммунизированной антителами, специфическими к CD4/CD8-T-клеткам. Imm С является контрольной группой, вакцинированной D1701-V-RabG, которая не получала антисыворотки. Non-Imm С является контрольной группой, которая не была вакцинирована D1701-V-RabG и не получала антисыворотки. "Дни п. провок." означает количество дней после провокации штаммом бешенства CVS.
Фигура 6. Защита, наблюдаемая при последующей вакцинации. Non-Imm является контрольной группой, которая не была вакцинирована D1701-V-RabG. D1701-V-RabG является группой, которая была вакцинирована D1701-V-RabG. CVS является вирулентным штаммом вируса бешенства. "Дни п. провок." означает количество дней после провокации штаммом RV CVS.
Фигура 7. Защита, наблюдаемая в различных режимах последующей вакцинации. Серые квадраты означают дни, в которые мышей вакцинировали D1701-V-RabG.
Фигура 8. Ответ на сывороточное антитело (определяемый как нейтрализующие антитела сыворотки, SNT) через 6 дней и 13 дней после иммунизации. Мышей иммунизировали D1701-V-RabG интравагинально (i.vag.), путем скарификации, внутрибрюшинно (i.p.), внутрикожно (i.d.), интраназально (i.n.), подкожно (s.c.), внутримышечно (i.m.) или внутривенно (i.v.).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если нет иного определения, научные и технические термины, применяемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области. Кроме того, если контекстом не предусматривается иного, термины в единственном числе в равной мере предполагают множественное число и наоборот.
Представленные ниже определения могут применяться к терминам, употребляемым в описании вариантов осуществления изобретения. Они заменяют любые противоречивые определения, содержащиеся в каждом отдельном источнике, включенном авторами путем ссылки.
"Около" или "приблизительно", применяемый в связи с измеримой числовой переменной, относится к указанному значению переменной и всем значениям переменной, которые пребывают в пределах экспериментальной погрешности указанного значения (например, в пределах 95%-ного доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов от указанного значения в зависимости от большей величины, если "около" не употребляется применительно к интервалам времени в неделях, когда "около 3 недель" означает от 17 до 25 дней, а "от приблизительно 2 до приблизительно 4 недель" означает от 10 до 40 дней.
"Адъювант" в контексте данного описания означает любое вещество, которое служит в качестве неспецифического стимулятора иммунного ответа. Дальнейшее описание адъювантов представлено ниже.
Термин "животное" в контексте данного описания означает любое животное, восприимчивое к инфицированию бешенством, включая млекопитающих, как домашних, так и диких.
"Антитело" в контексте данного описания представляет собой любой полипептид, включающий антиген-связывающий сайт, независимо от источника, способа получения или других характеристик. Оно означает молекулу иммуноглобулина или ее фрагмент, которые специфично связываются с антигеном в результате иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины являются сывороточными белками, состоящими из "легких" и "тяжелых" полипептидных цепей, имеющих "постоянные" и "вариабельные" области, и разделяются на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) в зависимости от состава постоянных областей. Антитело, являющееся "специфическим" к данному антигену, означает, что вариабельные области антитела распознают и связываются исключительно со специфическим антигеном. Антитела могут быть поликлональной смесью или моноклональными. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, взятыми из природных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. "Антитело" может быть преобразовано в антиген-связывающий белок, включающий, помимо прочих, фрагменты антител.
Термин "антиген" или "иммуноген" в контексте данного описания означает молекулу, содержащую один или несколько эпитопов (линейных, конформационных или и тех, и других), которые после воздействия на субъект вызывают иммунный ответ, который является специфическим к антигену. Термин "антиген" может означать ослабленные, инактивированные или модифицированные живые бактерии, вирусы, грибки, паразиты или другие микробы. Термин "антиген" в контексте данного описания также может означать субъединичный антиген, отделенный и обособленный от целого организма, с которым антиген связан в природе. Термин "антиген" также означает антитела, такие как антиидиотипичные антитела или их фрагменты, и синтетические пептиды-мимотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин "антиген" также может означать олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, например, при ДНК-иммунизации.
"Буфер" означает химическую систему, препятствующую изменениям концентрации другого химического вещества, например, системы доноров и акцепторов протонов служат в качестве буферов, препятствующих заметным изменениям концентрации ионов водорода (рН). Другим примером буфера может быть раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (сопряженное основание) или слабого основания и его соли (сопряженная кислота).
Термин "линия клеток" или "клетка-хозяин" в контексте данного описания означает прокариотическую или эукариотическую клетку, в которой может реплицироваться или поддерживаться вирус.
"Клеточный иммунный ответ" или "клеточно-опосредованный иммунный ответ" представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами или другими лейкоцитами, или и теми, и другими, и включает выработку цитокинов, хемокинов и подобных молекул, вырабатываемых активированными Т-клетками, лейкоцитами или и теми, и другими.
"Консервативное замещение" имеет определение в данной области, известно специалистам в данной области и распознается для классификации остатков согласно их соответствующим физическим свойствам.
Термин "культура" в контексте данного описания означает популяцию клеток или микроорганизмов, выращиваемых в отсутствие других видов или типов.
Термин "DIVA" в контексте данного описания означает дифференциацию инфицированных и вакцинированных животных.
"Доза" означает вакцину или иммуногенную композицию, которая вводится субъекту. "Первая доза" или "первичная вакцина" означает дозу такой композиции, которую вводят в начале отсчета времени (День 0). "Вторая доза", или "третья доза", или "годовая доза" означает количество такой композиции, которое вводят после первой дозы, и эта композиция может быть той же вакциной или иммуногенной композицией, что и в первой дозе, или отличной от нее.
"Эпитоп" является специфическим сайтом антигена, который связывается с Т-клеточным рецептором или специфическим антителом и, как правило, включает от приблизительно 3 аминокислотных остатков до приблизительно 20 аминокислотных остатков.
"Формообразующее" означает любой компонент вакцины или иммуногенной композиции, который не является антигеном.
"Фрагмент" означает укороченную часть белка или гена. "Функциональный фрагмент" и "биологически активный фрагмент" означает фрагмент, сохраняющий биологические свойства белка или гена полной длины. "Иммуногенно активный фрагмент" означает фрагмент, вызывающий иммунный ответ.
Термин "G-белок" в контексте данного описания означает часть гликопротеиновых выступов, покрывающих внешнюю поверхность вируса бешенства.
Термин "гетерологичный" в контексте данного описания означает взятый из другого вида или штамма.
Термин "гомологичный" в контексте данного описания означает взятый из того же вида или штамма.
"Гомология" или "процент гомологии" означает процент нуклеотидных или аминокислотных остатков в приемлемой последовательности, которые идентичны остаткам в сравнительных последовательностях после выравнивания последовательностей и вставки пробелов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, а также с учетом любых консервативных замещений в рамках идентичности последовательностей.
"Гуморальный иммунный ответ" означает иммунный ответ, который как минимум частично опосредован антителами.
"Идентичность" или "процент идентичности" означает процент нуклеотидов или аминокислот в приемлемой последовательности, которые идентичны остаткам в сравнительной последовательности после выравнивания обеих последовательностей и вставки пробелов, в случае необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких бы то ни было консервативных замещений в рамках идентичности последовательностей.
"Иммунный ответ" у субъекта означает выработку гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Иммуногенный ответ может быть достаточным для диагностических целей или других испытаний или может быть достаточным для предотвращения признаков или симптомов болезни, включая ее опасное для здоровья воздействие или осложнения, вызываемые инфекцией болезнетворного агента. Иммунные ответы обычно определяют с применением стандартных иммуноанализов и анализов с подавлением активности, которые известны специалистам в данной области.
"Иммуногенный" или "иммуногенность" в контексте данного описания означает способность вызывать иммунный ответ, специфически направленный против антигена.
Термины "иммуногенная композиция", или "иммунологически эффективное количество", или "количество, эффективное для выработки иммунного ответа", в контексте данного описания означают композицию или антиген, которые могут быть распознаны иммунной системой, в результате чего вырабатывается специфический иммунный ответ (то есть обладающее иммуногенной активностью), при введении животному отдельно или с фармацевтически приемлемым носителем.
"Выделенный" в контексте данного описания означает удаление из природной среды, отдельно или в гетерологичной клетке-хозяине, хромосомы или вектора (например, плазмиды, фага и т.п.). "Выделенные бактерии", "выделенные анаэробные бактерии", "выделенный бактериальный штамм", "выделенный вирус", "выделенный вирусный штамм" и т.п. означают композицию, в которой бактерии или вирус являются по сути свободными от других микроорганизмов, например, в культуре, отдельно от природной среды. Термин "выделенный", применяемый для описания любого конкретно определенного вещества, такого как полинуклеотид или полипептид, касается вещества, отделенного от природной клеточной среды, в которой обычно пребывает вещество, такое как полипептид или нуклеиновая кислота. Таким образом, в контексте данного описания, лишь в качестве примера, в рекомбинантной линии клеток, построенной с применением полинуклеотида согласно изобретению, используется "выделенная" нуклеиновая кислота. В альтернативном варианте, если конкретный белок или специфический иммуногенный фрагмент заявляется или применяется в качестве вакцины или другой композиции, он считается выделенным, поскольку он был распознан, отделен и в определенной мере очищен по сравнению с состоянием, в котором он может существовать в природе. Если белок или его специфический иммуногенный фрагмент производится в рекомбинантной бактерии или эукариотическом векторе экспрессии, который вырабатывает антиген, он считается существующим как выделенный белок или нуклеиновая кислота. Например, в рекомбинантной линии клеток, построенной с применением полинуклеотида, используется "выделенная" нуклеиновая кислота.
"Лекарственное средство" означает любой агент, который может применяться для профилактики, лечения или ослабления болезни, или для профилактики какого-либо физиологического состояния или явления.
Термин "множественность заражения" (MOI) означает пропорцию количества организмов на клетку, которая точно указывает, сколько инокулята должно использоваться при данной инфекции.
Термины "парапоксвирус", "парапоксвирусные штаммы" в контексте данного описания означают вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae и роду Parapoxvirus.
Термины "'Parapoxvirus ovis" и "Parapoxvirus ORFV" в контексте данного описания означают вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae, роду Parapoxvirus и виду Parapoxvirus ovis. Эти вирусы также называются вирусом контагиозной эктимы или вирусом контагиозного пустулезного дерматита. Они имеют уникальную спиральную оболочку, отличающую их от других поксвирусов.
Термин "штамм D1701 Parapoxvirus ovis" означает вирус, описанный в Патенте США 6,365,393, включенном в данное описание путем ссылки. "Штамм D1701 Parapoxvirus ovis-V" означает штамм Parapoxvirus ovis D1701, адаптированный к линии клеток обезьян Vero.
"Парентеральное введение" означает введение вещества, такого как вакцина, в организм субъекта через путь или маршрут, не затрагивающий пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, чрескожное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутриглазное и внутривенное введение.
Термин "патоген" или "патогенный микроорганизм" в контексте данного описания означает микроорганизм, например вирус бешенства, который способен вызывать болезнь, заболевание или аномальное состояние животного-хозяина.
"Фармацевтически приемлемый" означает вещества, которые по результатам тщательной медицинской клинической оценки считаются приемлемыми для применения в контакте с тканями субъектов без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствующими разумному соотношению между выгодой и риском и эффективными при предполагаемом применении.
Термин "поксвирус" в контексте данного описания означает вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae. Эти вирусы представляют собой овальные, довольно крупные вирусы из двухцепочечных ДНК.
Термин "полинуклеотид" или "молекула полинуклеотида" в контексте данного описания означает молекулу органического полимера, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепочку. ДНК (дезоксирибоонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) являются примерами полинуклеотидов с четкой биологической функцией.
Термины "предотвращать", "предотвращение" или "профилактика" и т.п. в контексте данного описания означают ингибирование репликации микроорганизма, ингибирование передачи микроорганизма или ингибирование внедрения микроорганизма в организм-хозяин. Эти и другие подобные термины в контексте данного описания также могут означать ингибирование или блокирование одного или нескольких признаков или симптомов инфекции. Лечение считается терапевтическим, если обеспечивается снижение нагрузки со стороны микроорганизма.
"Защита" и подобные термины в контексте данного описания в отношении вакцины или другой композиции означают, что вакцина или композиция предотвращает или уменьшает симптомы болезни, вызываемые организмом, из которого взят антиген, применяемый в вакцине или композиции. Термин "защита" и подобные термины также означают, что вакцина или композиция могут применяться для терапевтического лечения болезни или одного или нескольких симптомов болезни, уже существующей у субъекта.
Термин "вирус бешенства" означает нейротрофический лиссавирус, относящийся к семейству Rhabdoviridae. Он представляет собой вирус, состоящий из одноцепочечной отрицательно-полярной нити РНК, имеющий гликопротеиновые выступы на его внешней поверхности.
"Рекомбинантный PPV" означает PPV, имеющий инсерции и/или делеции в геноме. Инсерции и делеции осуществляют, применяя способы молекулярной биологии.
К "видовым гомологам" относятся гены, присутствующие в двух или более видах, имеющих существенную гомологию полинуклеотидной последовательности, и обладают одинаковыми или подобными биологическими функциями и/или свойствами. Предпочтительно полинуклеотидные последовательности, представляющие видовые гомологи, гибридизируются в умеренно жестких условиях, как описывается авторами на примере, и обладают одинаковыми или подобными биологической активностью и/или свойствами. В другом аспекте полинуклеотиды, представляющие видовые гомологи, имеют более чем приблизительно 60% гомологии последовательности, более чем приблизительно 70% гомологии последовательности, более чем приблизительно 80% гомологии последовательности, более чем приблизительно 90% гомологии последовательности, более чем приблизительно 95% гомологии последовательности, более чем приблизительно 96% гомологии последовательности, более чем приблизительно 97% гомологии последовательности, более чем приблизительно 98% гомологии последовательности или более чем приблизительно 99% гомологии последовательности.
Термины "специфическое связывание", "специфически связывается" и т.п. определяются как две или более молекул, образующих комплекс, измеримый в физиологических или аналитических условиях и являющийся селективным. Антитело или другой ингибитор считается "специфически связывающимся" с белком, если в надлежащим образом выбранных условиях такое связывание существенно не ингибируется, в то время как неспецифическое связывание ингибируется. Специфическое связывание характеризуется высокой аффинностью и является селективным для соединения или белка. Неспецифическое связывание обычно обладает низкой аффинностью. Например, связывание в IgG антителах в целом характеризуется аффинностью как минимум приблизительно 10-7 М или выше, например как минимум приблизительно 10-8 М или выше, или как минимум приблизительно 10-9 М или выше, или как минимум приблизительно 10-10 или выше, или как минимум приблизительно 10-11 М или выше, или как минимум приблизительно 10-12 М или выше. Термин также применим, например, в случаях, когда антигенсвязывающий домен является специфическим для конкретного эпитопа, который не содержится многими антигенами, и в этом случае антитело, содержащее антигенсвязывающий домен, как правило, не связывается с другими антигенами.
"Специфический иммуногенный фрагмент" в контексте данного описания означает часть последовательности, которая распознается антителом или Т-клеткой, которые являются специфическими для этой последовательности.
"Субъект" означает любое животное, восприимчивое к инфицированию бешенством, включая млекопитающих, таких как домашние, так и дикие.
"По сути идентичный" в контексте данного описания означает степень идентичности последовательностей как минимум приблизительно 90%, как минимум приблизительно 95%, как минимум приблизительно 96%, как минимум приблизительно 97%, как минимум приблизительно 98% или как минимум приблизительно 99%.
"Терапевтически эффективное количество" в контексте данного описания означает количество антигена или вакцины или композиции, которая вызывает иммунный ответ у субъекта (например, собаки), получившего антиген или вакцину или композицию, достаточную для профилактики или ослабления признаков или симптомов болезни, включая ее опасное для здоровья воздействие или осложнения, вызванные инфекцией патогена, такого как вирус, бактерия, паразит или грибок. Может быть вызван гуморальный иммунитет или клеточно-опосредованный иммунитет или как гуморальный, так и клеточно-опосредованный иммунитет. Иммуногенный ответ животного на антиген, вакцину или композицию может определяться косвенным образом, через измерение титров антител, анализы пролиферации лимфоцитов или непосредственно путем наблюдения за признаками и симптомами после провокации штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной или композицией, может определяться путем измерения снижения количества провоцирующего организма и/или снижения клинических признаков, таких как смертность, болезненность, температура и общее физическое состояние, состояние здоровья и работоспособность субъекта. Терапевтически эффективное количество вакцины или композиции может быть разным в зависимости от конкретного применяемого иммуногена или состояния субъекта и может определяться специалистом в данной области.
Термины "лечить" или "лечение" и т.п. в контексте данного описания означают уменьшение или устранение инфицирования микроорганизмом. Эти и подобные термины также могут означать снижение репликации микроорганизма, снижение переноса микроорганизма или снижение способности микроорганизма к внедрению в организм-хозяин. Эти и подобные термины в контексте данного описания также могут означать снижение, ослабление или устранение одного или нескольких признаков или симптомов инфицирования микроорганизмом или ускорение выздоровления от инфицирования микроорганизмом.
Термины "вакцинировать", "вакцинация" и т.п. в контексте данного описания означают введение животному вакцины или иммуногенной композиции.
Термины "вакцина" и "вакцинная композиция" в контексте данного описания означают композицию, которая предотвращает или снижает инфекцию, или предотвращает или снижает один или несколько признаков или симптомов инфекции. Защитный эффект вакцинной композиции против патогена обычно достигается путем стимулирования у субъекта иммунного ответа. В общих чертах, устраненные или сниженные показатели инфекции, ослабление признаков или симптомов или ускоренное удаление микроорганизма из организма инфицированного субъекта свидетельствуют о защитном эффекте вакцинной композиции. Вакцинные композиции согласно настоящему изобретению обеспечивают защитный эффект против инфекций, вызванных вирусом бешенства.
Термин "вариант" в контексте данного описания означает разновидность данной последовательности белка и/или гена, причем эта разновидность последовательности по сути является такой же, как и данная последовательность, кроме мутационных отличий. Вышеупомянутые отличия могут быть природными или вызванными синтетическим или генетическим путем.
"Вектор" или "векторный вирус" означает PPV, подходящий для инсерции гетерологичной ДНК, которая может переносить вставленную ДНК в клетки или организмы, и которая в соответствующих случаях обеспечивает экспрессию гетерологичной ДНК.
Термин "приемлемый в ветеринарии носитель" в контексте данного описания означает вещества, которые по результатам тщательной медицинской клинической оценки считаются приемлемыми для применения в контакте с тканями животных без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соответствующими разумному соотношению между выгодой и риском и эффективными при предполагаемом применении.
Представленное ниже описание поможет специалистам в данной области в практическом осуществлении настоящего изобретения. Однако при этом данное описание не следует рассматривать как ограничивающее объем настоящего изобретения, поскольку специалистами в данной области могут осуществляться модификации и изменения в обсуждаемых вариантах осуществления без отклонения от сущности и объема представленного изобретения.
ВИРУСЫ, ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ
Настоящее изобретение охватывает применение парапоксвирусов для получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства.
В одном варианте осуществления применяется Parapoxvirus ovis (PPVO) для получения рекомбинантного парапоксвируса, включающего гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В другом варианте осуществления применяется штамм Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления применяется штамм Parapoxvirus ovis D1701-V.
Генетическая последовательность, вставленная в парапоксвирус, включает гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, или его фрагменты. В одном варианте осуществления гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO:4 или молекулу полинуклеотида, имеющую как минимум 98% идентичности с SEQ ID NO:4. Структура этого гена также описывается, например, в публикации Anilionis et al., Nature 294, 275-278 (1981). Вставка имеет размер 1588 нуклеотидов. Полная последовательность вставки (SEQ ID NO:4) показана на Фигуре 4. Она содержит полноразмерную кодирующую область G-гена вируса бешенства (1575 нуклеотидов) плюс 7 нуклеотидов на 5'-конце и 6 нуклеотидов на 3'-конце в качестве линкерных последовательностей для рестрикционного анализа (BamHI и EcoRI).
Сведения о последовательности полинуклеотида позволяют легко получить любой возможный фрагмент этого полинуклеотида. Таким образом, изобретение обеспечивает фрагменты G-белка. В одном варианте осуществления обеспечиваются функциональные фрагменты. В другом варианте осуществления обеспечиваются биологически активные фрагменты. Фрагменты могут быть очищены традиционными способами, например путем фильтрации или хроматографии. Фрагменты могут быть получены путем рекомбинации с применением способов, известных специалистам в данной области.
При получении рекомбинантного парапоксвируса гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. В другом варианте осуществления гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII H/H штамма Parapoxvirus ovis D1701. Способы, применяемые для вставки гетерологичной ДНК в парапоксвирус, являются стандартными и известными специалистам в данной области. Они описываются в Патенте США 6,365,393.
В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
В одном варианте осуществления рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, представляет собой D1701-VrV RabG (K-UC1002), хранящийся в Американской коллекции типовых культур (АТСС®), Manassas, VA, 20108, США, под патентным депозитным номером АТСС® РТА-11662, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Последовательностью плазмиды pdV-RabG (7692 нуклеотидов) является SEQ ID NO:5, которая представлена в списке последовательностей.
Изобретение также охватывает полинуклеотидные последовательности, имеющие как минимум приблизительно 99%, как минимум приблизительно 98%,как минимум приблизительно 97%, как минимум приблизительно 96%, как минимум приблизительно 95%, как минимум приблизительно 93%, как минимум приблизительно 90%, как минимум приблизительно 85%, как минимум приблизительно 80%, как минимум приблизительно 75%, как минимум приблизительно 70%, как минимум приблизительно 65%, как минимум приблизительно 60%, как минимум приблизительно 55% и как минимум приблизительно 50% идентичности и/или гомологии с описанными авторами последовательностями.
Изобретение также охватывает полинуклеотидные последовательности, гибридизирующиеся в условиях от умеренной до высокой жесткости с некодирующей цепью или комплементом любой из описанных авторами последовательностей SEQ ID NO, и их видовые гомологи. Примерами условий высокой жесткости являются окончательное промывание в буфере, включающем 0,2×SSC/0,1% SDS, при температуре от 65°С до 75°С, а к условиям умеренной жесткости относится окончательное промывание в буфере, включающем 2×SSC/0,1% SDS, при температуре от 35°С до 45°С. Специалистам в данной области известно, что условия равноценной жесткости могут быть достигнуты путем изменения температуры и концентрации буфера или соли, как описывается в публикации Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1994), pp.6.0.3 to 6.4.10.
Рекомбинантный PPV может распространяться в клетках, линиях клеток и клетках-хозяевах. Вышеупомянутые клетки, линии клеток или клетки-хозяева, помимо прочих, могут быть, например, клетки млекопитающих и отличных от млекопитающих животных. Клетки, линии клеток и клетки-хозяева, в которых может распространяться PPV, являются хорошо известными и легко доступными специалистам в данной области. В одном варианте осуществления применяют клетки Vero. В других вариантах осуществления применяют клетки почек крупного рогатого скота или семенников барана.
Рекомбинантный PPV также может быть ослаблен или инактивирован перед применением в иммуногенной композиции или вакцине. Способы ослабления и инактивации хорошо известны специалистам в данной области. К способам ослабления, помимо прочих, относятся серийный пассаж в клеточной культуре на соответствующей линии клеток, ультрафиолетовое облучение и химический мутагенез. К способам инактивации, помимо прочих, относятся обработка формалином, бета-пропиолактоном (BPL) или бинарным этиленимином (BEI) или другие способы, известные специалистам в данной области.
Инактивация формалином может осуществляться путем смешивания вирусной суспензии с 37% формальдегидом до конечной концентрации формальдегида 0,05%. Вирусно-формальдегидную смесь смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре. Смесь инактивированного вируса затем испытывают на наличие остаточного живого вируса путем анализа роста на соответствующей линии клеток.
Инактивация путем BEI может осуществляться путем смешивания вирусной суспензии согласно настоящему изобретению с 0,1 М BEI (2-бромо-этиламин в 0,175 N NaOH) до конечной концентрации BEI 1 мМ. Смесь вируса-BEI смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 48 часов при комнатной температуре с последующим добавлением 1,0 М тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Смешивание продолжают в течение дополнительных двух часов. Смесь инактивированного вируса испытывают на наличие остаточного живого вируса путем анализа роста на соответствующей линии клеток.
Рекомбинантный PPV может применяться в иммуногенных композициях и вакцинах.
Иммуногенные композиции и вакцины необязательно могут включать один или несколько приемлемых в ветеринарии носителей, включая жидкие, полутвердые или твердые растворители, которые служат в качестве фармацевтических связующих, формообразующих или сред. В контексте данного описания "приемлемый в ветеринарии носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизаторы, растворители, консерванты, бактерицидные и противогрибковые средства, изотонические агенты, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. К растворителям относятся вода, солевой раствор, декстроза, этанол, глицерин и т.п. К изотоническим агентам относятся хлорид натрия, декстроза, маннит, сорбит и лактоза, помимо прочих, известных специалистам в данной области. К стабилизаторам, помимо прочих, известных специалистам в данной области, относится альбумин. К консервантам, помимо прочих, известных специалистам в данной области, относится мертиолат.
К адъювантам, помимо прочих, относятся адъювантная система RIBI (Ribi Inc.), квасцы, гель гидроокиси алюминия, эмульсии "масло в воде", эмульсии "вода в масле", например полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимеры (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) или другие сапониновые фракции, монофосфорил-липид А, адъювант Avridine липидамин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или полученный иным образом), холерный токсин или мурамилдипептид, помимо многих других, известных специалистам в данной области. Количество и концентрация адъювантов и добавок, применяемых в контексте настоящего изобретения, может легко определяться специалистами в данной области. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает иммуногенные композиции и вакцины, включающие от приблизительно 50 мкг до приблизительно 2000 мкг адъюванта. В другом варианте осуществления адъювант включен в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 1500 мкг, или от приблизительно 250 мкг до приблизительно 1000 мкг, или от приблизительно 350 мкг до приблизительно 750 мкг. В другом варианте осуществления адъювант включен в количестве приблизительно 500 мкг/2 мл дозу иммуногенной композиции или вакцины.
Иммуногенные композиции и вакцины также могут включать антибиотики. К таким антибиотикам, помимо прочих, относятся антибиотики из классов аминогликозидов, карбапенемы, цефалоспорины, гликопептиды, макролиды, пенициллины, полипептиды, хинолоны, сульфонамиды и тетрациклины. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает иммуногенные композиции и вакцины, включающие от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл антибиотика. В другом варианте осуществления иммуногенные композиции и вакцины включают от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 55 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 15 мкг/мл до приблизительно 45 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 40 мкг/мл антибиотика, или от приблизительно 25 мкг/мл до приблизительно 35 мкг/мл антибиотика. В еще одном варианте осуществления иммуногенные композиции и вакцины включают менее чем приблизительно 30 мкг/мл антибиотика.
Помимо рекомбинантного PPV, иммуногенные композиции и вакцины могут включать другие антигены. Антигены могут быть в форме инактивированной полной или частичной композиции микроорганизма или в форме антигенных молекул, полученных при помощи технологий генной инженерии или химического синтеза. К другим антигенам, подходящим для применения в соответствии с настоящим изобретением, помимо прочих, относятся взятые из патогенных бактерий или патогенных вирусов.
В отношении собак рекомбинантные иммуногенные композиции и вакцины от бешенства также необязательно могут содержать смесь с одним или несколькими дополнительными собачьими антигенами, такими как, например, Ehrlichia cams, собачий парвовирус (CPV), собачья чума, вирус собачьего парагриппа (CPI), собачий аденовирус II типа (CAV-2), собачий аденовирус (CDV), собачий коронавирус (CCV), Leptospira icterohemorrhagiae (LI), Leptospira canicola (LC), Leptospira grippotyphosa (LG), Leptospira pomona (LP), Borrelia burgdorferi и т.п. Одна комбинация антигенов включает изоляты собачьего парвовируса, собачьей чумы, собачьего аденовируса и собачьего парагриппа, с коронавирусом и Leptospira (включая возникающие серовары Leptospira grippotyphosa и Leptospira pomona) или без них.
В отношении кошек рекомбинантные иммуногенные композиции и вакцины от бешенства также необязательно могут содержать смесь с одним или несколькими дополнительными кошачьими антигенами, такими как, например, кошачий калицивирус (FCV), Chlamydophila felis (С. felis, также известный как Chlamydia psittaci (FCP)), вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус панлейкопении кошачьих (FPV), вирус ринотрахеита кошачьих (FVR), вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус инфекционного перитонита кошачьих (FIPV), Bartonella henselae (например, лихорадка кошачьих царапин) и т.п.
В отношении лошадей рекомбинантные иммуногенные композиции и вакцины от бешенства также необязательно могут содержать смесь с одним или несколькими дополнительными конскими антигенами, такими как, например, вирус конского гриппа, вирус конского герпеса 1 и 4, конский артеривирус, вирус Западного Нила, конский ротавирус, Streptococcus equi, столбнячный токсоид и т.п.
Описанные авторами иммуногенные композиции и вакцины вводят животным для стимулирования эффективного иммунного ответа против RV. Соответственно, описываются способы стимулирования эффективного иммунного ответа против RV, включающие введение животному терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства. В результате способ обеспечивает выработку сывороточных антител против G-белка.
Описанные авторами иммуногенные композиции и вакцины вводят животным для вакцинации против бешенства. Иммуногенные композиции и вакцины вводят животным для профилактики или лечения бешенства. Соответственно, авторами описываются способы вакцинации животных против бешенства и профилактики или лечения бешенства, включающие введение животному терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины, включающей рекомбинантный парапоксвирус, включающий гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства.
ФОРМЫ, ДОЗЫ И ПУТИ ВВЕДЕНИЯ
Иммуногенные композиции и вакцины могут приготавливаться в различных формах в зависимости от пути введения. Например, иммуногенные композиции и вакцины могут приготавливаться в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для инъекций, или в лиофилизированных формах с применением способов сушки замораживанием. Лиофилизированные иммуногенные композиции и вакцины, как правило, хранят при температуре приблизительно 4°С и восстанавливают влагосодержание в стабилизирующем растворе, например солевом растворе или HEPES. В альтернативном варианте иммуногенные композиции и вакцины могут сохраняться путем сушки замораживанием. Иммуногенные композиции и вакцины также могут приготавливаться в форме суспензий или эмульсий.
Иммуногенные композиции и вакцины включают терапевтически эффективное количество вышеописанного рекомбинантного PPV. Очищенные вирусы могут применяться непосредственно в иммуногенной композиции или вакцине или могут быть дополнительно ослаблены или инактивированы. Как правило, иммуногенная композиция или вакцина содержит от приблизительно 1×102 до приблизительно 1×1012 PFU или от приблизительно 1×103 до приблизительно 1×1011 PFU, или от приблизительно 1×104 до приблизительно 1×1010 PFU, или от приблизительно 1×105 и приблизительно 1×109 PFU, или от приблизительно 1×106 до приблизительно 1×108 PFU. Точное количество вируса в иммуногенной композиции или вакцине, эффективное для обеспечения защитного эффекта, может определяться специалистами в данной области.
Иммуногенные композиции и вакцины в целом включают приемлемый в ветеринарии носитель в объеме от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 5 мл. В другом варианте осуществления объем носителя составляет от приблизительно 1 мл до приблизительно 4 мл или от приблизительно 2 мл до приблизительно 3 мл. В другом варианте осуществления объем носителя составляет приблизительно 1 мл, или приблизительно 2 мл, или приблизительно 3 мл, или приблизительно 5 мл. Приемлемыми в ветеринарии носителями, подходящими для применения в иммуногенных композициях и вакцинах, могут быть любые из описанных авторами.
Специалисты в данной области смогут легко определить, требует ли вирус ослабления или инактивации перед введением. В другом варианте осуществления рекомбинантный PPV может вводиться непосредственно животному без дополнительного ослабления. Количество вируса, которое является терапевтически эффективным, может быть разным в зависимости от разных факторов, включая состояние животного и степень инфицирования, и может определяться специалистами в данной области.
В соответствии со способами согласно настоящему изобретению животному может вводиться единичная доза или, в альтернативном варианте, могут осуществляться две или большее количество прививок с интервалами от приблизительно двух до приблизительно десяти недель. Могут требоваться режимы ревакцинации и режим дозирования может регулироваться для обеспечения оптимальной иммунизации. Специалисты в данной области смогут легко определить оптимальный режим введения.
Иммуногенные композиции и вакцины могут вводиться непосредственно в кровоток, в мышцы или во внутренний орган. К приемлемым способам парентерального введения относятся внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутриуретральное, интрастернальное, интракраниальное, внутримышечное и подкожное. Подходящими устройствами для парентерального введения являются иглы (включая микроиглы) инжекторы, безыгольные инжекторы и средства инфузии.
Парентеральные композиции, как правило, представляют собой водные растворы, содержащие формообразующие, такие как соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно с уровнем рН от приблизительно 3 до приблизительно 9, или от приблизительно 4 до приблизительно 8, или от приблизительно 5 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 6 до приблизительно 7,5, или от приблизительно 7 до приблизительно 7,5), однако для некоторых случаев применения более приемлемым является рецептирование в форме стерильного неводного раствора или в высушенной форме для применения в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода.
Приготовление парентеральных композиций в стерильных условиях, например, путем лиофилизации может легко выполняться с применением стандартных фармацевтических технологий, хорошо известных специалистам в данной области.
Описанные авторами рекомбинантные парапоксвирусы и иммуногенные композиции и вакцины могут применяться при изготовлении медикамента для вакцинации животного против бешенства.
Настоящее изобретение обеспечивает способы определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного.
Вакцинация, при которой применяют вакцину DIVA, которая позволяет дифференцировать инфицированных и вакцинированных животных, обеспечивает средство определения происхождения парапоксвируса, присутствующего у животного. Эта дифференциация может осуществляться любым из разных диагностических способов, включая, помимо прочих, ELISA, вестерн-блоттинг и ПЦР. Эти и другие способы легко определяются и известны специалистам в данной области.
Описанные авторами парапоксвирусы могут отличаться от штаммов дикого типа как по их геномному составу, так и по экспрессируемым белкам. Такое отличие позволяет различать вакцинированных и инфицированных животных. Например, можно выяснить, присутствует ли у животного, определенного как позитивное на парапоксвирус в лабораторных испытаниях, штамм парапоксвируса дикого типа или рекомбинантно образованный парапоксвирус, ранее полученный путем вакцинации.
Для определения могут применяться различные анализы. Например, вирус может быть выделен из организма животного, определенного как позитивное на парапоксвирус, и могут применяться анализы на основе нуклеиновых кислот для обнаружения присутствия генома парапоксвируса, что свидетельствует о предварительной вакцинации. Анализы на основе нуклеиновых кислот включают саузерн- или нозерн-блоттинг, ПЦР и секвенирование. В альтернативном варианте могут применяться анализы на белковой основе. В анализах на белковой основе клетки или ткани, в которых предполагается наличие инфекции, могут быть выделены из организма животного, позитивного на парапоксвирус согласно тесту. Из таких клеток или тканей могут быть приготовлены клеточные экстракты, которые могут подвергаться, например, вестерн-блоттингу с применением соответствующих антител против вирусных белков, способных четко определять присутствие рекомбинантно образованного парапоксвируса, предварительно инокулированного, или парапоксвируса дикого типа.
Степень и характер иммунного ответа, вызванного у животного, определяют различными способами. Например, могут быть взяты образцы сыворотки привитых животных и подвергнуты испытанию на присутствие или отсутствие антител, специфических к парапоксвирусу, например, в традиционном ELISA-анализе. Обнаружение отвечающих цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL) в лимфоидных тканях может быть достигнуто путем анализов, например, с пролиферацией Т-клеток в качестве свидетельства стимулирования клеточного иммунного ответа. Соответствующие способы надлежащим образом описываются в источниках существующего уровня техники, например в публикации Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
Рекомбинантный Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG может применяться в DIVA-анализе. В одном варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения N-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных. В другом варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения Р-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных. В еще одном варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения L-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных. В еще одном варианте осуществления он может применяться в анализах для обнаружения М-генов или белков бешенства для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных.
Настоящее изобретение дополнительно описывается на следующих иллюстративных неограничительных примерах.
ПРИМЕРЫ
Генерировали рекомбинантный Parapoxvirus ovis, включающий ген, кодирующий G-белок RV. Определяли экспрессию G-белка, указывающую на иммуностимулирующие и защитные свойства рекомбинантного вируса против RV.
Пример 1
Генерация G-белка бешенства, экспрессирующего рекомбинантный вирус D1701-V-RabG
Получали рекомбинантно генерированный Parapoxvirus ovis, содержащий ген, который кодирует G-белок RV. Определяли экспрессию G-белка, указывающую на иммуностимулирующие и защитные свойства рекомбинантного вируса против RV.
Построение трансферной плазмиды
Для генерации рекомбинантного Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG использовали векторную систему Parapoxvirus ovis (PPVO) (Патент США 6,365,393; Rziha et al., 2000, J. BiotechnoL, 83, 137-145; Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323; Henkel et al., 2005, J. Virol. 79, 314-325). Ген G-белка вируса бешенства химически синтезировали (Blue Heron Biotech; США) и обеспечивали в pUC плазмиде. Полный G-ген выделяли как фрагмент ДИК BamHI - EcoRI размером в 1582 п.н. при помощи электрофореза в агарозном геле (0,8% (масса/объем)) и очищали при помощи комплекта для гель-экстракции Qiaex II (Qiagen; Германия). Плазмиду pdV-Rec1 (Fischer et al., 2003) подвергали двойному дигерированию с применением BamHI и EcoRI и использовали для лигирования (комплект для быстрого лигирования, Promega; Германия). После трансформации Е. coli DH5αF' (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; Германия) отбирали инсерционно-положительные колонии путем рестрикционного дигерирования EcoRI - ВатHI плазмидной ДНК. В результате обеспечивалась трансферная плазмида pdV-RabG (Фиг.1), которую получали при помощи комплекта Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen; Германия) и использовали для секвенирования ДНК. Для этого использовали праймер ORF32N (SEQ ID NO:1; 5'-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3'), расположенный перед сайтом инсерции, и праймер ORF3 IN (SEQ ID NO:2; 5'-ССАТССССТТАССАССССАСАСССАСССТССС-3'), расположенный после сайта инсерции в pdV-Rec1, а также внутренние G-ген-специфические праймеры RabG-F (SEQ ID NO:6; 5'-GGAGTCTCTCGTTATCATATCTC-3') и RabG-R (SEQ ID NO:7; 5'-CTAAACAAGGTGCTCAATTTCGT-3') соответственно. Это позволило определить полную последовательность вставленного G-гена (SEQ ID NO:4).
Отбор рекомбинантов путем окрашивания Bluo-gal
Клетки Vero (106 клеток) инфицировали 0,1 MOI (множественность заражения) lacZ-экспрессирующего вируса D1701-VrV и через 2 часа трансфицировали с применением 2 мкг плазмидной ДНК pdV-RabG путем нуклеофекции в соответствии с рекомендациями производителя (Атаха Nucleofector, Lonza; Германия). Лизаты вируса собирали через 3-4 дня и использовали для титрования на клетках Vero в 6-луночных планшетах (Fisher Scientific; Германия). Когда колонии становились видимыми, наносили содержащий агарозу Bluo-Gal, как описано (Fischer et al., 2003). Вирусные колонии белого цвета собирали и элюаты отдельных бляшек (суточные при 4°С в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS)) использовали для одновременного инфицирования клеток Vero (1×105 клеток) в отдельных лунках 48-луночного планшета.
Отбор рекомбинантов при помощи ПЦР бляшек.
Выделение ДНК из каждого изолята вирусных бляшек выполняли согласно модификации способа из публикации Pasamontes et al. (J. Virol. Methods 35: 137-141; 1991). Лизат вируса (0,2 мл) трижды замораживали (-70°С) и размораживали (37°С) и трижды обрабатывали ультразвуком на льду 3 в течение 20-30 сек (звуковая баня). После экстракции фенолом и хлороформом добавляли 10 мкг тРНК дрожжей или 3 мкл GlycoBlue (Ambion; Германия) перед осаждением этанолом. Осадок ДНК дважды промывали 70% (объем/объем) этанолом и растворяли после высушивания в 14 мкл воды высокой степени очистки.
Для RabG-специфической ПЦР 4 мкл ДНК смешивали на льду с 1 мкл праймерной смеси, состоящей из праймеров 4,0 пмоль RabG-F (SEQ ID NO:6) и 4,0 пмоль RabG-R (SEQ ID NO:7) и 5 мкл ReddyMix 2X PCR (Abgene, Thermo Fisher Scientific; Германия). ПЦР выполняли в Trio Thermoblock (Biometra; Германия) путем инкубации в течение 2 мин при 98°С с последующими 40 циклами в течение 1 мин при 96°С, 30 сек при 60°С, 30 сек при 72°С и конечным продленным этапом в течение 2 мин при 72°С. Продукты ПЦР отделяли путем горизонтального гель-электрофореза в 1% ((масса/объем)) агароза-этидийбромидных (0,3 мкг на мл) гелях. Лизаты вируса из изолятов бляшек, обнаруживающие G-ген-специфический ПЦР-фрагмент размером в 433 п.н., растворяли и подвергали дальнейшей очистке в колониях как минимум трижды с нанесением Bluo-Gal-агарозы, как описано выше. И наконец, ДНК изолятов рекомбинантного вируса в колониях, положительных на G-ген, испытывали в LacZ ген-специфической ПЦР с применением 4 мкл ДНК, 3,95 пмоль праймера lacZ-F (SEQ ID NO:8; 5'-CGATACTGTCGTCGTCCCCTCAA-3') и 4,13 пмоль праймера lacZ-R (SEQ ID NO:9; 5'-CAACTCGCCGCACATCTGAACT-3'). После добавления 5 мкл AccuPrime SuperMix II (Invitrogen, Fisher Scientific; Германия) выполняли ПЦР путем нагревания в течение 2 мин при 98°С с последующими 40 циклами в течение 1 мин при 96°С, 30 сек при 62°С и 90 сек при 68°С с конечным продленным этапом в течение 2 мин при 68°С. Отделение продуктов ПЦР выполняли, как описано выше. Отсутствие LacZ ген-специфического фрагмента размером в 508 п.н. продемонстрировало, что соответствующие изоляты колоний рекомбинантного вируса не содержали экспрессирующего lacZ родительского вируса D1701-VrV после трех циклов очищения колоний. После приготовления высоких титров популяций вирусов D1701-V-RabG вирусную ДНК получали, как описано ниже, и применяли для испытания RabG-ПЦР и LacZ-ПЦР.
Иммуногистохимическое окрашивание колоний рекомбинантных вирусов (IPMA)
Успешную экспрессию вставленного инородного гена сначала анализировали при помощи IPMA, включая Иммуногистохимическое окрашивание колоний рекомбинантных вирусов, титрованных на клетках Vero в 24-луночных планшетах. После появления колоний вирусов среду отсасывали из каждой лунки и клетки высушивали, оставляя планшет открытым приблизительно на 10 мин в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. После этого клетки фиксировали ледяным абсолютным метанолом при -20°С в течение 15-20 мин. После двукратного промывания ледяной 1% (объем/объем) эмбриональной телячьей сывороткой (FCS) в PBS клетки блокировали при помощи PBS, содержащего 10% (объем/объем) FCS, в течение 90 мин при комнатной температуре (RT). После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре со специфическим к G-белку мышиным моноклональным антителом G559 разбавляли в пропорции 1:200 в 1% FCS в PBS (FLI-Tuebingen; Германия). После трехкратного промывания PBS-T (PBS, содержащим 0,05% (объем/объем) Tween-20) добавляли связанное с пероксидазой вторичное антитело против мыши (Jackson-ImmunoRes., DIANOVA; Германия), разбавленное в соотношении 1:2000, и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. После тщательного промывания PBS-T и PBS добавляли субстрат (вектор Nova Red, Axxora; Германия) согласно рекомендациям производителя, пока не становилось видимым красно-коричневое позитивное окрашивание. В качестве негативного контроля включали неинфицированные клетки и клетки, инфицированные D-1701-VrV или D-1701-V. Колонии вирусов и инфицированные клетки оказались высокопозитивными на G-белок вируса бешенства.
Пример 2
Характеризация D1701-V-RabG
Приготовление популяций вирусов
Для получения высокотитрованных популяций рекомбинантных вирусов 10-20 колб с культурой Т 15 0 (Greiner; Германия) одновременно инфицировали MOI 0,5. Через 3 дня наблюдался приблизительно 80% цитопатогенный эффект (СРЕ) и клетки и супернатант со всех колб собирали для центрифугирования (2 ч при 13000 об/мин, 4°С). Супернатант осторожно удаляли и колонию вирусов растворяли в течение суток при 4°С в 1-2 мл PBS. Суспензию вирусов полностью диспергировали путем обработки ультразвуком (ультразвуковым разрушителем клеток, Branson; Германия) на льду с применением 3 импульсов (100 Вт) по 10 сек (10 сек перерыв между импульсами) с последующим центрифугированием (500-700×g, 10 мин, 4°С) для удаления клеточного дебриса. Супернатант хранили на льду, а колонию клеток ресуспендировали в 1,0 мл PBS и обрабатывали ультразвуком на льду (2 раза по 20 сек с 10-секундным перерывом, затем один раз в течение 30 сек). После медленного центрифугирования Супернатант комбинировали с первым супернатантом, разделяли на аликвотные части, титровали и хранили при -70°С.
Характеризация вирусной ДНК
Клетки Vero инфицировали MOI 0,5 и собирали через 2-3 дня (приблизительно 80% СРЕ) путем трипсинизации и кратковременного медленного центрифугирования при 4°С. ДНК выделяли с применением комплекта для выделения ДНК Master Pure (Epicentre Biotechnology, Biozym Scientific; Германия) в соответствии с протоколом производителя.
Для проверки инсерции G-гена в надлежащем локусе 2 мкг ДНК обрабатывали рестрикционным ферментом, отделяли в 0,8% ((масса/объем)) агарозных гелях и переносили на нейлоновую мембрану (GE Healthcare; Германия) для гибридизации путем саузерн-блоттинга в соответствии со стандартными процедурами. Специфический к G-гену бешенства зонд (продукт Rabg-F/-R ПЦР) выделяли при помощи гель-электрофореза, радиоактивно метили (32P-dCTP, MP Biomedicals; Германия) с использованием RediPrime (GE Healthcare; Германия). Затем ее использовали для гибридизации путем саузерн-блоттинга, которую осуществляли в условиях 50°С в 4 Х SSPE (1X=0,18 М NaCl, 10 мМ РР, 1 мМ EDTA, рН 7,4) с содержанием 0,5% ((масса/объем)) обезжиренного сухого молока, 1,0% ((масса/объем)) додецилсульфата натрия (SDS) и 0,5 мг/мл денатурированной ДНК телячьей вилочковой железы (КТ-ДНК, Sigma; Германия). После рентгеновского облучения (Kodak X-Omat; Германия) пробу удаляли с фильтра путем инкубации в 0,4 N NaOH при 45°С в течение 30-60 мин с последующей кратковременной инкубацией при 100°С в 0,1×SSC, 0,5% SDS, 0,2 М Tris-HCl (pH 7,4). Для второй гибридизации фрагмент Н HindIII D1701-V, содержащий локус vegF-E, использовали, как описано (Cottone et al., 1998. Vims Res. 56, 53-67). Результаты саузерн-блоттинга подтверждали правильность инсерции G-гена в геном D1701-VrV.
Обнаружение G-ген-специфической РНК
Клетки Vero инфицировали MOI 3-5 и полную РНК выделяли в различные моменты времени после инфицирования (p.i.) с применением комплекта для извлечения полной РНК SurePrep (Fisher Scientific; Германия). Дополнительно РНК извлекали из клеток, инфицированных в присутствии цитозина арабинозида (AraC; 0,04 мг/мл, Sigma; Германия) или циклогексимида (СНХ, 0,1 мг/мл, Serva; Германия) для испытания на раннюю экспрессию вставленного G-гена. В качестве контроля выделяли РНК из неинфицированных клеток. РНК отделяли в денатурирующем 1% агарозном геле, содержащем формальдегид, и переносили на нейлоновую мембрану, как описано (Kroczek, R.A. & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990). Радиоактивно меченный фрагмент Rabies G PCR (RabG-F/-R) использовали в качестве гибридизационного зонда в растворе UltraHyb (Ambion; Германия) при 42°С. Результаты четко продемонстрировали немедленную раннюю экспрессию G-гена бешенства благодаря регуляции под контролем раннего промотора vegF-E ORFV (Rziha et al. 1999, J. Biotechnol, 73, 235-242).
Обнаружение G-белка путем иммунофлуоресценции
Для иммунофлуоресценции клетки Vero (1×105 клеток/мл) инфицировали на 4-камерных предметных стеклах (BD Falcon; Германия) MOI 0,1 или 3,0. В различные моменты времени после инфицирования клетки промывали средой и фиксировали 3,7% (объем/объем) не содержащим метанол формальдегидом (Pierce, Thermo Fisher Scientific; Германия) в течение 15 мин при 37°С. После трехкратного промывания PBS клетки пермеабилизировали путем обработки 0,2% (объем/объем) Triton X-100 в течение 5 мин при 37°С. После промывания PBS клетки блокировали 5% FCS в PBS в течение 30-40 мин при 37°С. Для обнаружения G-белка клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°С мышиным моноклональным антителом G559 (FLI; Tuebingen, Германия), разбавленным в соотношении 1:1000 в PBS, содержащем 1% FCS. После пятикратного промывания в PBS стекла инкубировали в темноте при 37°С в течение 30 мин с вторичным антителом против мыши Alexa-555, разбавленным в соотношении 1:1000 в PBS (Molecular Probes; Германия).
Обнаружение клеток в более позднее время после инфицирования ORFV осуществляли путем применения ORFV-специфической антисыворотки кролика PAS2274, предоставленной Dr. Rudiger Raue (Pfizer, Великобритания). Сыворотку разбавляли в соотношении 1:100 в PBS 1% FCS и вторичное антитело, Alexa-488 против кролика, использовали разведенным в соотношении 1:1000.
Окрашивание на актин выполняли с использованием Phalloidin-647 согласно инструкциям производителя (Biotium; Германия) с последующим окрашиванием ядра 0,04 мкг/мл DAPI (4',6-диамидин-2'-фенилиндолдигидрохлорид; Roche Molecular Biochemicals; Германия) в течение 20-30 мин при комнатной температуре в темноте. После тщательного промывания в PBS стекла помещали в Mowiol-DABCO и выполняли флуоресцентную визуализацию при помощи Zeiss ApoTome с использованием программы Axiovision.
Результаты четко продемонстрировали сильную экспрессию G-белка бешенства на раннем (4 ч после инфицирования), а также позднем (24 ч после инфицирования) этапе после инфицирования D1701-V-RabG. Клетки, инфицированные на позднем этапе, могут дополнительно распознаваться путем специфического окрашивания антисывороткой PAS2274. Кроме того, флуоресцентное окрашивание обеспечивало свидетельство поверхностной экспрессии G-белка. Специфичность окрашивания испытывали путем применения неинфицированных клеток.
Обнаружение G-белка при помощи вестерн-блоттинга
Клетки Vero (3×105 клеток) одновременно инфицировали MOI 1,0 и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. В различные моменты времени после инфицирования клетки плюс супернатант собирали, центрифугировали (8900×g, 10 мин, 4°С) и осадок клеток трижды промывали 1,0 мл PBS и ресуспендировали в 0,15 мл PBS, содержащем 1% (объем/объем) Triton X-100. После 30 мин на льду лизат центрифугировали в течение 15 мин при 15000×g, 4°С и супернатант сохраняли для SDS-PAGE (электрофореза в полиакриламидном геле). Для этого 3 части лизата смешивали с одной частью 4Х загрузочного белкового буфера DualColor (Fermentas; Германия), кипятили в течение 5 мин, обрабатывали ультразвуком и приблизительно 10 мкг белка выделяли при помощи SDS-PAGE с использованием 8% ((масса/объем)) геля ProSieve50 с подвижным буфером Tris-Tricine-SDS согласно рекомендациям (FMC Bioproducts, Biozym; Германия). Prestained Protein Ladder (Fermentas; Германия) использовали в качестве маркеров молекулярной массы. После электрофореза белки переносили на мембрану из PVDF согласно указаниям производителя (Pierce, Thermo Fisher Scientific; Германия). После блокирования мембраны в 3Х Rotiblock (Roth; Германия) в течение 3 часов при комнатной температуре использовали антипептидную антисыворотку кролика, специфическую к С-концу G-белка вируса бешенства (предоставленную Dr.K.-K.Conzelmann, Max-von-Pettenkofer Institute; Munich, Германия), в соотношении 1:10000, разбавленную в 1X RotiBlock. После суточной инкубации при 4°С мембрану тщательно промывали 5 раз в TBS-Т (Tris-буферный солевой раствор с 0,05% объем/объем Tween-20) и инкубировали со связанным с пероксидазой антителом против кролика (1:20000; Jackson-ImmunoRes., Dianova; Германия) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания TBS-T использовали ECL субстрат согласно рекомендациям (Immobilon Western, Millipore; Германия). Прореагировавшие белки обнаруживали путем применения рентгеновской пленки для обнаружения хемилюминесценции (CL-XPosure, Pierce, Thermo Fisher Scientific; Германия).
Экспрессию G-белка вируса бешенства ожидаемой молекулярной массы (58-60 кДа) подтверждали в разные моменты времени после инфицирования.
Пример 3
Стимулирование специфического иммунного ответа после иммунизации мышей D1701-V-RabG
Зависящая от дозы индукция сывороточных антител против G-белка
G-белок может рассматриваться как наиболее важный антиген для защитного иммунного ответа, и количество индуцированных нейтрализующих вирус сывороточных антител (SNT) может коррелировать с провоцирующей инфекцией для защиты от вируса бешенства. Согласно OIE (Всемирной ветеринарной организации) и WHO (Всемирной организации здравоохранения) присутствие титров антител от 0,5 до 1,0 МЕ/мл (международных единиц) SNT и выше считается обеспечивающим защиту. Таким образом, индукцию специфических к G-белку антител SNT определяли с 1-го по 14-й дни после первичной иммунизации мышей с использованием D 1701-V-RabG.
Мышей C57/BL6 в возрасте 6-8 недель (n=6 или 7 на группу), выведенных в FLI (Friedrich-Loeffler-Institute, Federal Research Institute of Animal Health, Institute of Immunology; Tuebingen, Германия), внутримышечно иммунизировали 0,1 мл указанных PFU (колониеобразующих единиц) D1701-V-RabG (0,05 мл на бедро каждой задней лапы). Отдельные образцы сыворотки брали ежедневно и использовали для определения SNT при анализе быстрого ингибирования фокусов флюоресценции (RFFIT) согласно описанию (см. Публикацию OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies, которую также можно найти на следующем веб-сайте: www.oie.mt/fr/normes/mmanual/A_00044.htm; Cox, J.H. и L.G.Schneider, 1976, J. Clin. Microbiol. 3, 96-101.) То есть приготавливали последовательные 5-кратные разведения сыворотки в среде RPMI и 0,05 мл каждого разбавленного образца смешивали (в двух экземплярах) в лунках 96-луночного планшета, вместе с 0,05 мл вируса бешенства, штамм CVS 11 (партия №47, 1,7×105 PFU/мл). После 90 мин инкубации при 37°С и 5% СО2 в каждую лунку добавляли 0,1 мл суспензии клеток ВНК21 (1×106 клеток/мл), смешивали и инкубировали в течение 24 часов при 37°С в 5% СО2. После промывания лунки планшетов с культурой PBS и предварительно охлажденным 80% (объем/объем) ацетоном клетки фиксировали в свежем 80% (объем/объем) ацетоне в течение дополнительных 30 мин при 4°С. После удаления ацетона и высушивания на воздухе добавляли 0,05 мл моноклонального глобулина против кролика FITC (Centocor; США) в течение 30 мин при 37°С для окрашивания инфицированных вирусом бешенства клеток. После двукратного промывания PBS и однократного промывания водой высокой степени очистки вирусную инфекцию наблюдали при помощи флуоресцентной микроскопии. Разбавления сыворотки, которые снижали количество инфицированных клеток до 50%, считывались как позитивные. Титры сывороток выражались в МЕ/мл и сравнивались с позитивной контрольной сывороткой согласно WHO.
Фигура 2 демонстрирует развитие SNT после однократной внутримышечной иммунизации мышей указанными PFU рекомбинантного вируса D1701-V-RabG. Сыворотки испытывали в указанные дни (d) после иммунизации FFIT. Как можно увидеть на Фиг.2(D), даже низкая доза (104 PFU) иммунизации к 8-му дню в результате приводила к среднему показателю SNT 5,5 МЕ/мл, который до 14-го дня после иммунизации повышался до приблизительно 13 МЕ/мл. При использовании 106 или 107 PFU для иммунизации (Фиг.2А и 2В) на одну неделю позже достигали среднего показателя SNT приблизительно 10-20 МЕ/мл соответственно, который возрастал до приблизительно 50 МЕ/мл через 14 дней после примирования. При использовании 107 PFU D1701-V-RabG на 4-й день после иммунизации обнаруживали титры антител иммунной сыворотки (0,6-3,0 МЕ/мл), чего не наблюдалось при использовании более низких испытываемых доз иммунизации (Фиг.2).
Еще один эксперимент на мышах (данные не показаны) продемонстрировал, что бустер-иммунизация с применением 106 или 107 PFU рекомбинантного вируса ведет лишь к незначительному увеличению SNT через 14 дней после первичной иммунизации (с применением 106 или 107 PFU).
В целом эти результаты демонстрируют успешную стимуляцию титров антител защитных SNT в течение первой недели после иммунизации мышей различными дозами D1701-V-RabG.
Пример 4
Защитный иммунный ответ у мышей, опосредованный D1701-V-RabG
Оценку защитной способности D1701-V-RabG выполняли путем провоцирующей инфекции разных иммунизированных мышей (C57/BL6) согласно рекомендациям OIE (см. публикацию Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies, которую также можно найти на веб-сайте www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm.). В возрасте 6-8 недель мышей (n=11 или 12 на группу) иммунизировали указанным PFU D1701-V-RabG, как описано выше. Неиммунизированные контрольные мыши (п=15) получали инъекцию PBS. Через три недели после иммунизации всем животным интракраниально вводили провоцирующую дозу вирулентного штамма вируса бешенства CVS (0,03 мл с содержанием 4,8×105 PFU). Животных наблюдали ежедневно до 21 дня после провоцирующей инфекции. Умирающих животных, страдающих от тяжелых нейрональных симптомов, подвергали эвтаназии.
Как показано на Фиг.3, одноразовая внутримышечная иммунизация с применением 107 PFU D1701-V-RabG полностью защищает мышей (11/11) от высокой дозы интракраниально введенного провоцирующего вируса. Одно иммунизированное животное из этой группы умерло на 12-й день, но не по причине провоцирующей инфекции вируса бешенства. Таким образом, это животное было исключено из анализа данных. Применение одной дозы, содержащей в 10 раз меньшее количество (106 PFU) D1701-V-RabG, все же позволяло достигать 73% защиты (8/11 выживших). Дальнейшее снижение иммунизирующей дозы снижало показатель защиты до 58% (105 PFU; 7/12) или до 27% (104 PFU; 3/11), в то время, как все контрольные иммунизированные мыши (n=15) погибли в течение 6-9 дней после провоцирующей инфекции (Фиг.3).
Пример 5
Роль Т-клеток в защитном иммунитете
В следующих экспериментах исследовали вклад Т-клеток (CD4-, CD8-или CD4/8-позитивные клетки) в стимулировании защитного иммунитета рекомбинантным D1701-V-RabG у мышей. Как показано на Фигуре 5А, непосредственно перед и после дня 0 иммунизации с применением 107 PFU D1701-V-RabG (то есть в дни -1, 0, +1 и +5) антисыворотки, специфические к CD4- или CD8-Т-клеткам, внутрибрюшинно вводили группам мышей (количество (n) животных показано на Фигуре) для удаления каждой популяции Т-клеток in vivo.
Затем на 15-й день все животные интрацеребрально получали провоцирующую дозу 500 LD5o вирулентного штамма RV CVS.
Как показано на Фигуре 5А, животные с удаленными CD4-позитивными Т-клетками, как правило, были не защищены, о чем можно судить по подобному ответу у неиммунизированных контрольных животных.
Как показано на Фигуре 5 В, группы животных иммунизировали в день 0 с применением D1701-V-RabG, а затем in vivo удаляли CD4- и/или CD8-T-клетки непосредственно перед и после 15-го дня подвергались провоцирующей инфекции вирулентным штаммом RV CVS, то есть на 13 (за 2 дня до провоцирующей инфекции), 15, 19 и 23-й дни. Результаты демонстрируют, что после успешного примирования иммунного ответа против вируса бешенства с применением D1701-V-RabG удаление Т-клеток через 14 дней не имело отрицательного влияния на защиту, поскольку 75-90 процентов животных, у которых in vivo были удалены популяции Т-клеток, выжили после провоцирующей прививки.
Таким образом, результаты показывают, что CD4-позитивные Т-клетки (наиболее вероятно, Т-хелперные клетки, необходимые для выработки антитела против G-белка) являются основным определителем защитного иммунитета, вызванного рекомбинантным D1701-V-RabG.
Пример 6
Постконтактная вакцинация
Эффективность рекомбинантного D1701-V-RabG для терапевтической вакцинации испытывали на мышах. Для этого группы животных внутримышечно (i.m.) вакцинировали с введением 107 PFU D1701-V-RabG в дни 0, 1 и 4. Мыши получали провоцирующую дозу 1×106 PFU вирулентного штамма RV CVS в день 0. Как показано на Фигуре 6, все мыши в иммунизированной группе, кроме одной, были защищены от бешенства.
Дополнительные эксперименты проводили на мышах для испытания различных режимов постконтактной иммунизации после вирулентного штамма RV CVS. На Фигуре 7 серые квадраты указывают дни, в которые мышей вакцинировали D1701-V-RabG. Результаты (выжившие) показаны на Фигуре.
Результаты демонстрируют эффективность D1701-V-RabG для терапевтической вакцинации мышей. Как показано на Фигуре 7, посредством двойной вакцинации, осуществленной в день провокации и на следующий день, обеспечивалась 80% защита, и как минимум 60% животных были защищены 4 ежедневными иммунизациями, начиная с 3-го дня после провоцирующей инфекции периферическим RV.
Пример 7
Иммунный ответ, вызываемый различными путями иммунизации
Мышей иммунизировали 1×106 PFU D1701-V-RabG следующими путями введения: интравагинально (i.vag.), путем скарификации, внутрибрюшинно (i.p.), внутрикожно (i.d.), интраназально (i.n.), подкожно (s.c.), внутримышечно (i.m.) и внутривенно (i.v.). Вызванный ответ на сывороточное антитело (определяемый как нейтрализующие антитела сыворотки или SNT) через 6 дней (серые полосы) и 13 дней (черные полосы) после иммунизации показывается на Фигуре 8. Через четырнадцать дней после иммунизации животные интрацеребрально получали инфекцию 100 LD5o вирулентного штамма RV CVS и рассчитывали процент выживших.
Результаты показывают, что самые высокие титры SNT (указываемые в ME на мл) были вызваны i.v., i.p. и i.m. вакцинацией, что также в результате обеспечивало наилучшие показатели защиты 86%, 100% и 78% соответственно.
Claims (21)
1. Рекомбинантный парапоксвирус, включающий парапоксвирус и гетерологичную ДНК, взятую из вируса бешенства, где гетерологичная ДНК вставлена в геном парапоксвируса и где гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства, в качестве компонента вакцины против бешенства.
2. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 1, отличающийся тем, что парапоксвирус является вирусом Parapoxvirus ovis (ORFV).
3. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 2, отличающийся тем, что парапоксвирус представляет собой штамм Parapoxvirus ovis D1701.
4. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 1, отличающийся тем, что гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO: 4 или последовательность, имеющую как минимум приблизительно 95% идентичности с SEQ ID NO: 4.
5. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 1, отличающийся тем, что гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO: 4, или последовательность, имеющую как минимум приблизительно 98% идентичности с SEQ ID NO: 4.
6. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 1, отличающийся тем, что гетерологичную ДНК вставляют в фрагмент HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701.
7. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 6, отличающийся тем, что гетерологичную ДНК вставляют в кодирующую последовательность VEGF или соседние некодирующие последовательности в пределах фрагмента HindIII Н/Н штамма Parapoxvirus ovis D1701.
8. Рекомбинантный парапоксвирус по п. 1, отличающийся тем, что парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG, имеющий АТСС номер доступа РТА-11662.
9. Способ получения рекомбинантного парапоксвируса по п. 1, включающий вставку гетерологичной ДНК в геном парапоксвируса.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что парапоксвирус представляет собой штамм Parapoxvirus ovis D 1701.
12. Способ по п. 9, отличающийся тем, что гетерологичная ДНК включает ген, кодирующий G-белок вируса бешенства.
13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что гетерологичная ДНК включает SEQ ID NO: 4, или последовательность, имеющую как минимум приблизительно 98% идентичности с SEQ ID NO: 4.
14. Способ по п. 9, отличающийся тем, что рекомбинантный парапоксвирус представляет собой Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.
15. Иммуногенная композиция против бешенства, включающая рекомбинантный парапоксвирус по любому из пп. с 1 по 8 и носитель.
16. Способ получения иммуногенной композиции по п. 15, включающий комбинирование рекомбинантного парапоксвируса с носителем.
17. Способ стимулирования иммунного ответа против вируса бешенства у животного, включающий введение вышеупомянутому животному иммунологически эффективного количества иммуногенной композиции по п. 15.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что иммунный ответ состоит в вырабатывании сывороточных антител против G-белка.
19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что стимулируется специфический защитный иммунный ответ против G-белка.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что такое вырабатывание в результате обеспечивает титры антител свыше 0,5 Международных Единиц на мл.
21. Применение рекомбинантного парапоксвируса по любому из пп. с 1 по 8 при изготовлении медикамента для стимулирования иммунного ответа против вируса бешенства у животного.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US34698810P | 2010-05-21 | 2010-05-21 | |
US61/346,988 | 2010-05-21 | ||
US41428710P | 2010-11-16 | 2010-11-16 | |
US61/414,287 | 2010-11-16 | ||
PCT/IB2011/051847 WO2011145013A1 (en) | 2010-05-21 | 2011-04-27 | Parapoxvirus vectors containing rabies virus antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012149036A RU2012149036A (ru) | 2014-06-27 |
RU2545694C2 true RU2545694C2 (ru) | 2015-04-10 |
Family
ID=44972661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012149036/10A RU2545694C2 (ru) | 2010-05-21 | 2011-04-27 | Вектор парапоксвируса, содержащий антиген вируса бешенства |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110287051A1 (ru) |
EP (1) | EP2571521A1 (ru) |
JP (1) | JP5890399B2 (ru) |
KR (2) | KR20150015551A (ru) |
CN (1) | CN103260644A (ru) |
AR (1) | AR081409A1 (ru) |
AU (1) | AU2011254315B2 (ru) |
BR (1) | BR112012029633A8 (ru) |
CA (1) | CA2798055C (ru) |
CL (1) | CL2012003219A1 (ru) |
CO (1) | CO6670515A2 (ru) |
MX (1) | MX338052B (ru) |
NZ (1) | NZ603431A (ru) |
RU (1) | RU2545694C2 (ru) |
UY (1) | UY33400A (ru) |
WO (1) | WO2011145013A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201208264B (ru) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102014116334A1 (de) * | 2014-11-10 | 2016-05-12 | Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät | Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren |
DE102015111756A1 (de) * | 2015-07-20 | 2017-01-26 | Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät | Rekombinanter Orf-Virus-Vektor |
EP3432922B1 (en) * | 2016-03-21 | 2020-02-19 | South Dakota Board of Regents | Orf virus-based platform for vaccine delivery |
CN111944769B (zh) * | 2020-08-10 | 2022-06-28 | 塔里木大学 | 一种狂犬病毒g蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法 |
US20230340424A1 (en) * | 2020-08-13 | 2023-10-26 | Suzhou Prajna Biotech Co., Ltd. | Mutant orf viruses and uses thereof |
CN117298263A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-29 | 成都迈科康生物科技有限公司 | 一种重组狂犬病疫苗及其制备方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6365393B1 (en) * | 1996-02-28 | 2002-04-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Parapoxviruses containing foreign DNA, their production and their use in vaccines |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
EP0237686A1 (en) * | 1986-03-18 | 1987-09-23 | Institut Pasteur | DNA sequences derived from the rabies virus genome |
WO2003050135A2 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-19 | Board Of Regents The University Of Texas System | Use a parapox b2l protein to modify immune responses to administered antigens |
ATE300954T1 (de) | 2001-12-10 | 2005-08-15 | Bavarian Nordic As | Poxvirus-enthaltende zusammensetzungen und verfahren zu ihrer herstellung |
WO2010050913A1 (en) * | 2008-10-31 | 2010-05-06 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Vaccination with poxvirus vectors via mechanical epidermal disruption |
-
2011
- 2011-04-27 RU RU2012149036/10A patent/RU2545694C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-04-27 MX MX2012013451A patent/MX338052B/es active IP Right Grant
- 2011-04-27 EP EP11722560A patent/EP2571521A1/en not_active Withdrawn
- 2011-04-27 KR KR1020157001619A patent/KR20150015551A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-04-27 BR BR112012029633A patent/BR112012029633A8/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-04-27 AU AU2011254315A patent/AU2011254315B2/en not_active Ceased
- 2011-04-27 KR KR1020127032744A patent/KR20130008645A/ko active Application Filing
- 2011-04-27 NZ NZ603431A patent/NZ603431A/en not_active IP Right Cessation
- 2011-04-27 CN CN2011800357117A patent/CN103260644A/zh active Pending
- 2011-04-27 CA CA2798055A patent/CA2798055C/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-27 WO PCT/IB2011/051847 patent/WO2011145013A1/en active Application Filing
- 2011-04-27 JP JP2013511758A patent/JP5890399B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-05-19 US US13/111,020 patent/US20110287051A1/en not_active Abandoned
- 2011-05-20 AR ARP110101750A patent/AR081409A1/es unknown
- 2011-05-23 UY UY0001033400A patent/UY33400A/es not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-11-02 ZA ZA2012/08264A patent/ZA201208264B/en unknown
- 2012-11-19 CL CL2012003219A patent/CL2012003219A1/es unknown
- 2012-11-21 CO CO12210839A patent/CO6670515A2/es not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6365393B1 (en) * | 1996-02-28 | 2002-04-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Parapoxviruses containing foreign DNA, their production and their use in vaccines |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BRUN A et al, Antigen delivery systems for veterinary vaccine development, Vaccine, Elsevier, vol. 26, no. 51, 02.12.2008, pages 6508-6528. CADOZ M et al, Immunisation with canarypox virus expressing rabies glycoprotein", the Lancet, Lancet Limited, vol. 339, no. 8807, 13.06.1992, pages 1429-1432. ESPOSITO J J et al, Successful oral rabies vaccination of raccoons. with raccoon poxvirus recombinants expressing rabies virus glycoprotein, Virology, Academic press, vol. 165, no. 1, 01.07.1988, pages 313-316. VAN ROOIJ E M A et al, Comparison of different prime-boost regimes with DNA and recombinant Orf virus based vaccines expressing glycoprotein D of pseudorabies virus in pigs, Vaccine, Elsevier, vol. 28, no. 7, 17.02.2010, pages 1808-1813. * |
the whole document * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20150015551A (ko) | 2015-02-10 |
KR20130008645A (ko) | 2013-01-22 |
US20110287051A1 (en) | 2011-11-24 |
RU2012149036A (ru) | 2014-06-27 |
AU2011254315A1 (en) | 2013-01-10 |
CN103260644A (zh) | 2013-08-21 |
JP5890399B2 (ja) | 2016-03-22 |
MX338052B (es) | 2016-03-31 |
CA2798055C (en) | 2015-11-24 |
CL2012003219A1 (es) | 2013-04-05 |
AU2011254315B2 (en) | 2015-05-14 |
CA2798055A1 (en) | 2011-11-24 |
BR112012029633A8 (pt) | 2017-12-05 |
WO2011145013A1 (en) | 2011-11-24 |
MX2012013451A (es) | 2013-01-22 |
EP2571521A1 (en) | 2013-03-27 |
JP2013535953A (ja) | 2013-09-19 |
ZA201208264B (en) | 2014-01-29 |
NZ603431A (en) | 2014-06-27 |
CO6670515A2 (es) | 2013-05-15 |
AR081409A1 (es) | 2012-08-29 |
UY33400A (es) | 2011-12-30 |
BR112012029633A2 (pt) | 2016-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2545694C2 (ru) | Вектор парапоксвируса, содержащий антиген вируса бешенства | |
JP4859316B2 (ja) | ブタサーコウイルス組換えポックスウイルスワクチン | |
RU2502801C2 (ru) | ВЫДЕЛЕННАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ МОЛЕКУЛА, КОДИРУЮЩАЯ ВИРУС Torque teno, МОЛЕКУЛА РНК И ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ | |
KR101721090B1 (ko) | 돼지 토크 테노 바이러스 백신 및 진단 | |
BRPI0614119A2 (pt) | métodos de administração de vacina, caliciviroses de felino, e tratamentos para imunizar animais contra paraovìrus felino e herpes vìrus de felino | |
EA031453B1 (ru) | Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva) и его применение | |
US20120020995A1 (en) | Parapoxvirus vectors | |
CN113943714A (zh) | 一种猫杯状病毒毒株及其应用 | |
Ronchi et al. | Preliminary results on innocuity and immunogenicity of an inactivated vaccine against Peste des petits ruminants. | |
US7807180B2 (en) | Poxvirus methods and compositions | |
EP3280438B1 (en) | Recombinant lumpy skin disease virus knock-out mutant and uses thereof | |
US9950059B2 (en) | Immunogenic composition | |
US10190099B2 (en) | IBV strains and uses thereof | |
WO2009143332A2 (en) | Poultry viral materials and methods related thereto | |
US20130177582A1 (en) | Parapoxvirus expressing the vp60 major capsid protein of the rabbit haemorrhagic disease virus | |
JP2016502845A (ja) | ブタパルボウイルス5a、使用方法およびワクチン | |
WO2017120168A1 (en) | Porcine parainfluenza virus compositions and related methods | |
Monir et al. | Evaluation of Locally Prepared Inactivated Newcastle Disease Virus Vaccine | |
KR20210120898A (ko) | 신규한 돼지 유행성 설사병 바이러스 및 이의 용도 | |
KR20240066519A (ko) | 신규한 메르스 코로나바이러스 백신 조성물 및 이의 용도 | |
TWI361695B (en) | Pcv-2 vaccine | |
Gebreeziabher | Development of Dual Vaccines for the Control of Peste des Petits Ruminants and Capripox Infections of Small Ruminants | |
OA19861A (en) | Recombinant lumpy skin disease virus knock-out mutant and uses thereof. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HE9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160428 |