JP4859316B2 - ブタサーコウイルス組換えポックスウイルスワクチン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の分野】
関連出願
本出願は1999年6月10日出願の米国特許出願第60/138,478号および2000年5月31日出願の米国特許出願の優先権を主張する。
1998年1月22日および1998年3月20日のWO-A-99 18214（1998）、1997年10月3日のフランス特許出願、1997年10月3日出願第97/12382号およびW099/29717を参照する。上記の各米国特許出願、国際特許出願およびフランス出願（出願文献）に記載の内容は本願明細書の一部をなす。
【０００２】
また、上記の各米国特許出願、国際特許出願およびフランス特許出願に記載の技術的事項は本発明の実施にあたって使用することができる。
本明細書では多数の刊行物を参照する。これらの文献の完全なリストは明細書の末尾にまとめて記載してある。これらの文献は本発明に関連し、本明細書で引用する（引用文献）。これら引用文献の内容は本願明細書の一部をなす。
【０００３】
【発明の分野】
発明の技術分野
本発明は、組換えベクターのようなベクター、組換え体ウィルス、例えば変更したポックスウイルスと、その製造方法とに関するものである。
具体例としては、本発明は組換え鶏痘ウィルス、例えばカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣに関するものである。
【０００４】
本発明はさらに、上記のベクター、例えば遺伝子産物、例えば抗原、ORFおよび／またはブタサーコウイルス2 (PCV2) の主要エピトープを発現するポックスウイルスと、疫組成物またはワクチンにも関するものである。
【０００５】
本発明はさらに、上記のベクター、例えば、PCV2遺伝子産物および／またはPCV2に対する免疫反応を誘発するポックスウイルスにも関し、好ましくはそれに対する免疫、免疫原、ワクチン組成物および／またはPCV2の汚染に対する感染防御免疫組成物に関するものである。
【０００６】
本発明はさらに、上記ベクター、組成物、その中間生成物の使用と、その中間生成物と、その製造方法および使用方法とに関するものである。本発明はさらに、上記産物、すなわち、本発明の組換え体、ポックスウイルス、その発現抗体とにも関するものである。
【０００７】
【従来の技術】
ＰＭＷＳ症候群（ブタ多臓器消耗症候群、porcine multisystemicwasting syndromまたは離乳後多臓器消耗症候群）は若いブタに最近認識されはじめた疾患である。このＰＭＷＳ症候群は体重の漸進的減少と、頻呼吸、呼吸困難および黄疽のような臨床的症状の現れによって特徴付けられる。病理学的にはリンパ球または肉芽腫性の溶浸、リンパ節症、肝炎、簡単にはリンパ球または肉芽腫性の腎炎から明らかになる（Clark, 1997; Harding, 1997）。
【０００８】
この症候群は北アメリカおよびヨーロッパの各国で報告されているが、その治療および予防方法は現在のところない。
このPMWSの原因微生物としてはブタサーコウイルスであることは多くの証拠がある（Ellis et al. 1998）。このサーコウイルスはPMWSに感染したブタから回種され、この疾患のブタにおいてブタサーコウイルスへの抗体が存在することが報告されている（Ellis et al. 1998）。
【０００９】
サーコウイルスは一本の線状DNAウイルスであり、動物および植物種で見られる。PCVは最初にブタ腎臓細胞株PK/15の非細胞変性汚染物として検出された。細胞培養分離菌はPK-15 (Meehan et al., 1997)とよばれる。近年、ＰＭＷＳを有するブタから得られたブタ・サーコウイルスをPK-15と比較した結果、上記のウィルスはヌクレオチドおよび蛋白質配列レベルでPK15とは実質的に異なっていることが分かり、PCV2 とよばれている(Meehan et al., 1998; Hamel et al., 1998）。
【００１０】
このPCV2ゲノムでは13の転写解読枠（ORF）が同定されている（COL1〜COL13、フランス特許出願98/03707）。これらのORFの4つはPK-15のゲノムとかなりの相同性を有している。ORF1（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL4に対応）は398〜1342（GenBank、受入れ番号AF055392）からなり、37.7 kDの予測分子量有する蛋白質をコードする。ORF2（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL13に対応）は1〜314に結合した1381〜1768から成り（GenBank受入れ番号AF055392）、27.8kDの予測分子量を有する蛋白質をコードする。ORF3（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL7に対応）は1018-704（GenBank受入れ番号AF055392）から成り、11.9kDの予測分子量を有する蛋白質をコードすることができる。
【００１１】
ORF4（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL10に対応）は912〜733（GenBank受入れ番号AF055392）から成り、6.5kDの予測分子量を有する蛋白質をコードする。PCV2のORF1はPK15分離菌、(Meehan et al、1998)のORF1に極めて相同している（86％に対等）。ORF1のPK-15蛋白の一部の特徴は分かっている（Meehan et al （1997）、Mankertz et al. 1998a）。これがウイルス複製にとって重要であることは知られており、多分ウイルスのDNA複製に関係している。
各ORF2間の蛋白質配列の差異はORF1sのそれより低かった（66％一致）各々のORF2sが、非常に節約された基礎的なＮ末端領域（鳥類のサーコウイルス・ニワトリ貧血ウイルスの主要な構造蛋白質のＮ末端領域において、観測されるそれと同様の）を共有した(CAV) (Meehan et al., 1998)。最近PK-15分離菌のORF2がORF 1のカプシドたんぱく質をコードすることを示唆した(Mankertz et al. (1998b)（Mankertzet al., 1998b）。
【００１２】
より大きい差は、それぞれのORF3sおよびPK-15分離菌のORF4sおよびPCV2との間に観測された。各場合において、PCV2 ORF4のC-末端部位および比較されるORF3の削除が、PK-15分離菌のゲノムに存在する対応するORFsに対してあった。最も高いproteinsequence相同性は、ORF3およびORF4、Meehanほか、1998のＮ末端領域で観測された。
PCV2のゲノムの転写解析はまだ発表されていない。
PK-15分離菌については得られた最近のデータはORF2がスプライスすることを示している（1998b、Mankertz et al）。
【００１３】
ワクシニアウィルスは、1980年に世界から根絶した天然痘に対する免疫源として用いられた。天然痘根絶後のポックスウイルス、異種遺伝子発現のための遺伝子設計したベクターの役割が重要になった(Panicali and Paoletti, 1982;Paoletti et al., 1984)。異種抗原をコードする遺伝子がワクチンで発現されて対応病原体の抗原投与に対して感染防御免疫を示すことがあった（Tartaglia et al., 1990）。MVAとよばれる非常に弱毒化した菌株をベクターとして使ったポックスウイルスベースのワクチンも作られた。このMVAの使用は米国特許番号第5,185,146に記載されている。
２つの追加のワクチン・ベクター系では自然宿主限定（hostrestricted）のポックスウイルス、鶏痘ウィルスを使用する。家禽ポックスウィルス（FPV、Taylor et al1988a,b）およびカナリア・ポックスウィルス（CPV、Taylor et al、1991、1992）の２つが異種遺伝子産物を発現するために設計された。
【００１４】
鶏痘ウイルス（FPV）は、ポックスウイルス族の鶏痘全体に効くプロトタイプのウィルスである。このウィルスは経済的に重要で、1920年代から家禽の疾患に対して生きた弱毒化ワクチンとして投与されている。鶏痘ウィルスの複製は鳥種に限られ（Matthews, 1982）、ヒトを含む全ての非鳥類生物種の増殖性感染の原因となる鶏痘ウィルスに関するレポートや文献はない。この宿主限定性は他の生物種へのウィルス伝達への安全バリヤーを提供し、鶏痘ウィルスをベースにしたワクチンベクターを用いた獣医学およびヒトへ応用に魅惑的である。
【００１５】
FPVは抗原を家禽からの病原体を発現するベクターとして有利に使われてきた。ビルレントなトリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン蛋白はFPV組換え型において発現された（Taylor et al., 1988c）。組換え体をニワトリおよびシチメンチョウへ接種した後に免疫反応が誘導され、同種または異種のビルレントなインフルエンザウイルスの抗原投与に対する保護を発揮した（Tayor et al. 1988c）。ニューカッスル病ウィルスの表面糖蛋白質を発現しているFPV組換え体も開発された(Teller et al 1990、Edbauer et al.1990)。
【００１６】
他の弱毒化したポックスウイルス・ベクターはウィルス野生株の遺伝子修飾によって調製されている。コペンハーゲン株ワクチンからの特異的毒性は宿主-領域遺伝子を削除して得たNYVACベクターは、発現された異種抗原に対する防御免疫応答を引き出す組換え体ベクターとして有用であることが分かっている (Tartaglia et al. 1992)。
【００１７】
遺伝子操作された他のポックスウイルス・ベクターはカナリア痘ウイルスに由来するALVACである。このALVACは鳥類以外の宿主では生産的なコピーを作らず、この特性は安全プロファイルを改善すると考えられる（Teller et al、1991、1992）。ALVACおよびNYVAC はBSL-1ベクターである。
サブユニットPCV2ワクチンの開発への一つのアプローチは関連するPCV2 ORFを発現する生ウイルスベクターを使用することである。組換え体ポックスウイルスは公知の２ステップで作ることができる。すなわち、米国特許第4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,174,993、5,494,807、5,505,941号（これらの内容は本願明細書の一部をなす）に記載に記載のポックスウイルス、例えばワクシニアウィルスおよび鶏痘ウィルスの合成組換え体の製造方法に類似した方法で作ることができる。
【００１８】
従って、PCV2組換え体ポックスウイルスと、その組成物および産物、特にPCV2組換え体、組成物および産物をベ―スにしたALVAC、特に、PCV2のORF 1および／またはORF 2を含む組換え体、組成物および産物は現在の技術を大きく向上させる上で大変望ましいものである。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の対象は、PCV2による感染の治療、予防のための組成物および方法にある。
本発明の他の対象は、PMWSを治療、予防する組成物および方法にある。
【００２０】
本発明の一つの観点から、本発明は組成物を接種される宿主動物に抗原性、免疫原性または免疫学的な応答を誘発するための、抗原性、免疫学的または免疫原性ワクチン組成物または治療組成物に関するものである。この組成物はキャリアまたは賦形剤、組換え体ウィルス、例えば組換え体ポックスウイルスを含むのが好ましい。組換え体ウィルスまたはポックスウイルスはORF、抗原、イムノゲンまたはPCV2からの所望エピトープ、PCV2またはPCV2に起因する症状、例えばPMWSに対する免疫学的応答を誘導する蛋白をコード化し、発現する外因の核酸分子を含む。この組換え体ウィルスは修正された組換え体ウィルスまたはポックスウイルス、例えばウィルスコード遺伝子機能、本質的でないウィルス-コード化遺伝子機能を不活性化したウイルスまたはポックスウイルスであり、従って、この組換え体ウィルスが毒性を弱めて、安全を改良したウィルスである。本発明は更に、上記組成物の製造方法、ウィルスの使用および組成物で使われるウィルスを提供する。
【００２１】
本発明組成物で使われるウィルスはポックスウイルス、特にワクシニアウィルスまたは鶏痘ウィルス、特に鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルスが好ましく、好ましくはALVACである。ウィルスは修正された組換え体、例えば、ウイルスゲノムの必須でない領域内に抗原蛋白、例えばPCV2 ORF、例えば、PCV2 ORF 1および／またはORF 2からの抗原蛋白をコードする異種DNAの塩基配列を含むことができる。
【００２２】
本発明の他の観点から、本発明は不活性化した必須でないウイマス−コード遺伝子機能を有する修正された組換え体ウィルスを含むビルレンスを弱くし、安全性を改良した免疫組成物に関するものである。
この修正された組換え体ウィルスはウイルスゲノムの必須でない領域中に抗原蛋白（例えば、PCV2 ORF、特にORFS 1および／またはORFS 2からの抗原蛋白）をコードする異種DNAの塩基配列を含み、免疫組成物を宿主に投与したときに抗原に対して免疫応答特性を誘発する。
【００２３】
本発明の更に他の観点から、本発明は必須でないウィルス-コード化遺伝子機能を内部に有し、従って、ウィルスが弱毒化され、例えばウイルスゲノムの必須でない部位に異種のＤＮＡを含む修正された組換え体ウィルスに関するものである。このＤＮＡはPCV2遺伝子、例えばPCV2 ORF1、ORF2、ORF3またはORF4（Meehan et al. 1998)またはその重要なエピトープをコードすることができる。遺伝子機能は毒性ファクタをコードする転写解読枠を削除するか、自然で宿主-制限されたウィルスを利用することで機能させなくすることができる。本発明で使用されるウィルスはポックスウィルス、例えばワクシニアウィルスまたは鶏痘ウィルスが好ましく、例えば鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルスである。
【００２４】
ポックスウイルスまたはウイルスゲノムから削除される転写解読枠はJ2R、B 13R＋B14R、A26L,A56R、C7L-K1LおよびI4L（Goebel et al., 1990に記載の用語）およびこれらの組み合わせから成る群の中から選択するのが好ましい。この転写解読枠はチミジンキナーゼ遺伝子、出血部位、Aタイプ封入小体部位、ヘマグルチニン遺伝子、宿主域遺伝子部位または大サブユニット（リボ・ヌクレオチド・レダクターゼ）またはこれらの組み合わせから成る。
【００２５】
ワクシニアウィルスの適切な修正されたコペンハーゲン菌株として同定されているのはNYVAC(Tartaglia et al、1992)またはJ2R,B 13R+B 14R、A26L、A56R、C7L-K11およびI4L、チミジンキナーゼ遺伝子、出血部位、Aタイプ封入小体部位、ヘマグルチニン遺伝子、宿主域部位、大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼが削除されたワクシニアウィルスである（NYVACおよび本発明で有用なNYVACから追加の削除または不活化をしたベクターに関しては米国特許番号第5,364,773号、第5,494,807号および第5,762,938号も参照)
【００２６】
好ましいポックスウイルスベクターはALVACまたは弱毒化したカナリア痘ウイルスである。この弱毒化は例えばニワトリ胚繊維芽細胞（Rentschlerワクチン株）を200以上の連続的に継代し、マスターシードを寒天で４回連続してプラーク精製し、それからさらに5回の連続したプラーク精製を行う（ALVACおよびTROVAC（本発明で有用な弱毒化した鶏痘ウイルス）に関しては米国特許第5,756,103号および第5,766,599号を参照）。本発明で利用可能なウイルスに関してはさらに米国特許第6,004,777号、第5,990,091号、第5,770,212号、第6,033,904号、第5,869,312号、第5,382,425号および国際特許第WO 95/30018号も参照）。
【００２７】
本発明で使用可能なベクターとしては例えば発現が増強されたベクター、機能が削除されたベクター、ブタ宿主に対して有用なベクター（ブタ宿主に対して有用なベクターの例としてはワクシニアウィルス、鶏痘ウィルス、カナリア痘ウイルス、スインポックスウイルスを含むポックスウイルスを含む）がある。また、各種の用語例えば「免疫原性組成物」「免疫学的組成物」、「ワクチン」、「重要なエピトープ」や供与量、投与経路、調合方法、アジュバントおよび組換え型ウィルスおよび発現産物の利用に関しても上記文献が参照できる。
【００２８】
本発明の更に他の観点から、本発明は本発明の組換え体ポックスウイルスの発現産物と、治療用、予防用、診断用製剤、免疫組成物またはワクチン組成物またはテストでのその使用と、組換え体ポックスウイルスからのＤＮＡプローブおよびPCRプライマーを作るのに有用なＤＮＡとに関するものである。
【００２９】
本発明は以下の記載、実施例の記載、添付図面を参照することでより明瞭に理解できよう。
【００３０】
本発明の一実施例では、本発明はPCV2からのDNAの塩基配列、例えばポックスウイルスゲノムの必須でない部位を含む組換え体、組換え体ウィルスに関する。ポックスウイルスは鶏痘ウイルス、特に弱毒化された鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルス、特に弱毒化されたカナリア痘ウイルス、例えばALVACであるのが好ましい。
本発明の組換え体ポックスウイルスは異種のPCV2遺伝子の遺伝子産物を発現する。PCV2の特異的なORFをポックスウイルスベクター中に挿入し、得られた組換え体ポックスウイルスを動物の感染に用いる。
【００３１】
PCV2遺伝子産物の動物での発現でPCV2に対する動物での免疫反応が得られる。従って、本発明の組換え体ポックスウイルスは免疫学的組成物またはワクチンとして使用され、保護免疫反応誘発手段を提供する(保護は必須ではない)。
本発明の組換え体ポックスウイルス-PCV2またはその発現産物、免疫学的組成物、抗原性組成物またはワクチン組成物または治療組成物は例えば腸管外のルート（皮内、筋肉内または皮下）の投与方法で投与できる。この種の投与によって全身免疫反応または液性応答または細胞応答が得られる。
【００３２】
一般に、本発明のポックスウイルス-PCV2組換え体、抗原性または免疫学的またはワクチン用ポックスウイルス-PCV2組成物または治療用組成物は製薬または獣医の技術に熟練した当業者に公知の標準的方法によって製造できる。この種の組成物は年齢、性、重量、生物種および投与ルート、患者のコンディション等のファクタを考慮に入れて製薬または獣医の技術に熟練した当業者が適用量を周知の手技で投与することができる。本発明組成物は単独で投与でき、また、他の免疫組成物を多価または「カクテル」または複合組成物として投与することもできる。投与法（順次投与か同時投与か）、投与成分および投与量は年齢、性、重量、生物種および投与ルート、患者のコンディション等のファクタを考慮に入れて製薬または獣医の技術に熟練した当業者が決定できる。
ィション）を持っていく、そして、投与のルート。この点に関しては狂犬病用の組成物および組合せ組成物およびその使用に関する米国特許第5,843,456号を参照されたい(この内容は本願明細書の一部を成す)。
【００３３】
本発明組成物の実施例は鼻、肛門、皮膚、経口投与用(例えば胃経由)の液体製剤、懸濁液、シロップまたはエリキシルョンのような投与、腸管外、皮下、皮内、筋肉内、静脈内の投与(例えば注射投与)、例えば無菌せ懸濁液またはエマルジョン用調合品を含む。この種の組成物では組換え体ポックスウイルスまたは抗原は適切なキャリヤ、賦形剤または付形剤、例えば滅菌水、生食水、グルコースまたはその他と混合物することができる。組成物を凍結乾燥することもできる。組成物は所望の投与ルートおよび調製法に応じた湿潤剤、乳化剤のような助剤物質、pH緩衝試剤、佐剤、ゲル化または添加剤、防腐剤、着色剤、香料、粘度改良剤等を含むことができる。
標準テキスト（例えば"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE"、第17の版、1985）(本願明細書で引用したものとする)を参照することで、過度の実験なしに適切な調合品を調製することができる。適切な適用量は下記の実施例に基づいて決めることができる。
本発明組成物はアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から選ばれる少なくとも一つの佐剤化合物を含むことができる。
【００３４】
好適な佐剤化合物はアクリル酸またはメタクリル酸の架橋した、特に砂糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋したポリマーである。これらの化合物はカルボマー（Phameuropa、第8巻（No.2）1996年6月）として公知である。当業者は米国特許第2909462号明細書（本願明細書に引用したものとする）を参照できる。この特許には少なくとも３つの水酸基、好ましくは８以下の水酸基を有するポリヒドロキシル化された化合物（少なくとも３つのヒドロキシル基の水素原子は２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されている）で架橋されたアクリルポリマーが記載されている。好ましい基は2〜4の炭素原子を有する基、例えばビニール、アリル、その他のエチレン性不飽和基である。不飽和基自身が他の置換基（例えばメチル）を含むこともできる。カルボポル（Carbopol、登録商標、BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で市販の化合物が特に適切である。これはアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。特に、カルボポル（Carbopolo）974P、934Pおよび971Pを挙げることができる。無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中では無水マレイン酸とエチレンの線形または架橋、例えばジビニルエーテルで架橋したコポリマーであるコポリマーのエマ（EMA、登録商標、Monsanto）が好ましい。これに関してはJ. Fields et al., Nature, 186:778-780,4 June 1960（本願明細書に引用したものとする）が参照できる。
【００３５】
アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびコポリマーのエマ（EMA、登録商標)は下記式の基本構造単位を有する：
【００３６】
【式１】
【００３７】
（ここで、R1とR2はHまたはCH3−を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、x ＝ 0または1、好ましくはx ＝1であり、y ＝ 1または2で、x＋y ＝ 2)
エマ（EMA、登録商標)ではx＝ 0、y = 2であり、カルボマーではx = y = 1である。
【００３８】
水にこのポリマ−を溶解すると酸性溶液になるので、好ましくは、実際のワクチンが取り入れられるアジュバント溶液を与えるために、生理学的なpHに中和する。ポリマ−のカルボキシル基は部分的にCOO−形になっている。本発明のアジュバント溶液、特にカルボマ−の溶液では、好ましくは塩化ナトリウム存在下で蒸留水に溶かす。得られる溶液は酸性pHである。
この原液に必要な量の水を加えて所望の最終濃度まで薄めてアジュバントの溶液を調製するのが好ましい。または、好ましくは生理的食塩水、好ましくはNaCl を添加(9g NaC1 9g/1)した生理的食塩水とNaOHで中和（pH 7.3〜7.4）する。生理学的なpHのこの溶液は凍結乾燥するか、液状で凍った状態で保存され、ワクチンと混合するためにそのままに扱われる。最終的なワクチン組成物のポリマ−濃度は0.01％〜2％ w/v、特に0.06〜1％ w/v、好ましくは0.1〜0.6％ w/vである。
【００３９】
本発明の免疫学的組成物は少なくとも一つのイムノゲンを発現する他のブタ病原体からの少なく一種の弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットまたは組換え体ワクチン（ベクターまたはＤＮＡプラスミドとしての例えばポックスウイルス）と組み合わせることができる。
【００４０】
本発明は均等なヌクレオチド配列、すなわち、考慮すべき遺伝子の官能性または株特異性（タイプ1の菌株およびタイプ2の菌株）を変えない配列またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの配列をコードし、発現するベクターが含まれる。コードの縮重が違う配列も当然含まれる。
【００４１】
以下の実施例で使用するPCV-2配列はMeehan et alから提供された（菌株Imp. 1010、ORF1ヌクレオチド398-1342、ORF2ヌクレオチド1381-314、各々1998年9月25日の米国出願第09/161092号のORF4およびORF13、WO-A-9918214のCOL4およびCOL134に対応）。
【００４２】
他のPCV-2菌株およびそれらの配列はWO-A-9918214で公開され、ImplO08、Imp999、ImplO11-48285およびImplO11-48121と呼ばれ、さらにA. L. Hamel et al. J. Virol. June 1998, vol 72,6: 5262-5267（GenBank AF027217）およびI. Morozov et al. J. Clinical Microb. Sept. 1998 vol.36,9: 2535-2541、および GenBank AF086834、AF086835およびAF086836にあり、均等なORF配列にアクセス可能。本発明ではこれらの配列またはそこからのORFまた抗原または重要なエピトープをコードする部位を使用できる。
【００４３】
本発明はさらに、厳密な条件で考えた時に上記遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド化が可能な均等な配列をも含むものである(Sambrook et al. 1989)。こうした均等な配列としては完全配列の免疫原性を保持した遺伝子断片が挙げられる。
タイプ1および2の全ゲノムの相同性は約75％である。ORF1では約66％、ORF2では約86％である。これに対してタイプ2のゲノム間およびORF間の相同性は一般に95％以上である。
【００４４】
さらに、本発明の均等配列としては、ORF1の場合、菌株ImplOl0の88％以上、特に90％以上、好ましくは92％または95％以上の相同性を有するか、ORF2の場合には菌株ImplO10の80％以上、特に85％以上、好ましくは90％または95％以上の相同性を有する配列が挙げられる。Meehan 1998に従うORF1およびORF2は、それぞれ37.7kDおよび27.8kDの予測された分子量を有する蛋白質をコードする可能性がある。ORF3およびORF4（Meehan et al. 1998、それぞれWO-A-9918214ではORF7およびORF10に対応）はそれぞれ11.9および6.5kDの予測された分子量を有する蛋白質をコードする可能性がある。これらのORFの配列はGenbank AF 055392でも利用できる。これらはプラスミド中に取り入れて、本発明で単独または例えばORF1および／またはORF2と組合せて使うことができる。
【００４５】
1998年9月25日米国特許第09/161,092号（WO−A−9918214のCOLs 1−3および5,6,8−9,11−12）に開示されている抗原またはエピトープをコードする他のORF 1−3および5,6,8−9,11−12も本明細書に記載の条件下で単独または互いに組み合わせてまたは上記定義のORF 1および2またはエピトープをコードする領域と組み合せて使うことができる。
【００４６】
本発明には均等配列、例えば上記の各種PCV-2菌株のORFからの均等配列の使用も含まれる。相同性に関しては、菌株lO10のORFに関して説明した上記の相同性を有するORF1および／またはORF2を有するPCV株から配列の均等性を決定することができる。
Meehan に従うORF3での相同性は例えば菌株ImplO10のORF3の80％以上、例えば85％以上、好ましくは90％または95％以上である。Meehan 1998に従うORF4での相同性は例えば菌株ImplO10のORF4の86％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上である。
例えばWO−A−99 18214に開示のゲノムのヌクレオチド配列から標準のソフトウェア（例えばMacVectort）を用いてORFを決定することはル−チンの技術である。また、菌株1010のゲノムと並べ、菌株1010のORFと比較して他の菌株（例えばWO−A−99 18214に開示のもの）のゲノムのORFを決定することは当業者が容易にできることである。ソフトウェアを使用し、整合することで過度の実験なしに均等なORFまたは核酸分子に直接アクセスできる。
【００４７】
ヌクレオチド配列の相同性はMyers and Millerの「Align」プログラムを用いて決定できる（"Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS4,11-17,1988、NCBIから入手可能。この内容は本願明細書に引用したものとする）。また、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列順序での「相同性」または「同一性」という用語で２つの配列間の相同性を量的に示すことができる。配列相同性パーセントは（Nref-Ndif）*100/Nrefとして計算できる、ここで、Ndifは並べた時に２つの配列中で同一でない残基の全数であり、Nrefは一つの配列中の残基の数である。例えば、DNAの塩基配列AGTCAGTCは配列AATCAATCに対して75％の配列類似性を有する（Nref ＝8、Ndif＝2）。
さらに、配列に関する「相同性」または「同一性」は同じヌクレオチドまたはアミノ酸の数を２つの配列で不足するヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割った数で表すこともできる。２つの配列はウィルバーおよびリップマン・アルゴリズム（Wilbur and Lipman、1983、PNAS USA80：726、本願明細書で引用したものとする）に従って並べることができる。
【００４８】
このWilbur and Lipman、1983、PNAS USA80：726では、例えば、20ヌクレオチドのウィンドウ・サイズを使用し、語長を４ヌクレオチドにし、ギャップ・ペナルティを4にして市販のプログラム（例えばIntelligenetics 登録商標 Suite, Intelligenetics Inc. CA）を使用してコンピュータで配列の並べ変えを含むめたデータの解釈を便利に実行することができる。RNA配列が類似しているか、DNAの塩基配列と同じまたは対等な配列を有する場合には、DNAの塩基配列のチミジン（T）をRNA配列ではウラシル（U）に等しいとみなす。DNAの塩基配列のチミジン（T）をRNA配列のウラシル（U）に等しいとみなしたDNAの塩基配列から誘導されるRNA配列は本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
さらに、アミノ酸配列の類似度、対等度または相同性をBlastPプログラム（Altschul et al., Nucl. AcidsRes. 25,3389-3402、本願明細書で引用したものとする、NCBIから入手可能）を使用して決定することもできる。以下の文献（本願明細書で引用したものとする）は２つの蛋白質のアミノ酸残基に関する対等度または相同性を比較するためのアルゴリズムを提供する。さらに、これら文献を用いて上記パーセント相同性を決定することもできる。
【００５０】
Needleman SB、and Wunsch CD,("A generalmethod applicable to the search for similarities in theamino acid sequences of two proteins) "J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970); Smith TF and Waterman MS、Bio-sequencesの対比、"Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981）、Smith TF, Waterman MS and Sadler JR、"Statisticalcharacterization of nucleic acid sequence functional domains、"Nucleic Acids Res.,1: 2205-2220 (1983）、Feng DF and Dolittle RF、"Progressive sequence alignment as aprerequisite to correct phylogenetic trees、"J. of Molec. Evol., 25: 351-360 (1987）、Higgins DG and Sharp PM,"Fast and sensitive multiple sequence alignment on amicrocomputer,"CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ, "Cluster W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix chaicec、Nucleic Acid Res., 22: 4673-480 (1994）, Devereux J, Haeberlie Pand Smithies O、"A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX, "Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984)。
【００５１】
本発明組成物は成人ブタだけでなく、若いブタおよび妊娠したブタへも投与できる。後者の場合には新生ブタへ受動免疫（母性抗体）を授けることができる。雌のブタは繁殖の前および／または妊娠前および／または妊娠中に接種するのが好ましい。好ましくは受精前に少なくとも一回接種し、その後、妊娠中、例えば妊娠中（妊娠の6-8週頃）および／または妊娠後期（妊娠の11-13週頃）にさらに接種を実行するのが好ましい。好ましくは交配前および／または妊娠前に接種し、妊娠中にブースタ接種することである。その後は各受精前におよび／または妊娠中、妊娠中期におよび／または妊娠後期に再接種することができる。再接種が妊娠中に行うのが好ましい。雄ブタにも予防接種することができる（例えば交配前)。
【００５２】
子豚、例えば予防注射した雌（例えば上記の接種をした）からの子豚は生まれてから最初の1週間いないに予防接種する。例えば生まれてから1週目および／または2週目および／または3週目および／または4週目および／または5週目に接種する。好ましくは子豚には生まれてから1週間以内または第3週目（例えば離乳時）に最初の接種する。この子豚にはそれから2〜4週間後にブースター注射をするのが好ましい。
【００５３】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００５４】
【実施例】
本発明の好ましい実施例の組換え体ポックスウイルスはポックスウイルスゲノムの必須でない部位にPCV2からのDNAの塩基配列を含む。この組換え体ポックスウイルスは異種PCV2遺伝子の遺伝子産物を発現する。特に、ORF2およびPCV2蛋白質をコードするORF1遺伝子を単離し、特徴付け、ALVAC（カナリア痘ベクター）組換え体中に挿入した。使用した分子生物学的方法はSambrook et al. (1989）に記載のものである。
【００５５】
細胞株およびウィルス菌株
Imp1010-Stoonと称されるPCV2の菌株については既に説明した（Meehan et al., 1998）。これはカナダで病気のブタの腸間膜リンパ節組織から単離した。PCV2ゲノムのクローニングはMeehan et al. (1998)に記載されている。PCV2ゲノムをEcoRI断片として含むプラスミドpGem7Z-Impl010-Stoon-EcoRI No.14をプラスミドpGem-7ZのEcoRIに挿入した (Promega, Madison, WI)。Imp1010-Stoon PCV2strainの完全なヌクレオチド配列はMeehan et al. (1998)により決定されている。これはGenBankから寄託番号AF055392で入手できる。
【００５６】
親のカナリア痘ウイルス（Rentschler菌株）はカナリアワクチン菌株である。このワクチン株は天然の分離菌をニワトリ胚繊維芽細胞上で200回以上の連続継代して弱毒化して得た。マスターウイルスシードを寒天で４回連続してプラーク精製し、一つのプラークのクローンを追加の５回連続した継代で増幅し、そのストック・ウィルスを試験管内組換えテストの親ウィルスとして使用した。プラーク精製したカナリア痘分離菌はALVACと称される。このALVACは1996年11月14日にAmerican Type Culture Collection, ATCCにブダペスト条約番号VR-2547で寄託されている。
【００５７】
ポックスウイルス組換え体の調製は下記の複数のステップで行った：（1）ポックスウイルスゲノム中の挿入位置の側面に位置する配列（"arms"）と2つのフランキングアームの間にクローニングサイト（MCS）を含む挿入プラスミドの構築（例えば実施例1を参照）、（2）異種遺伝子発現カセットが挿入されたMCS中への挿入プラスミドから成るドナープラスミドの構築（例えば実施例2〜5を参照）、（3）ドナープラスミドのアームと親ポックスウイルスのゲノムと間の細胞培養でのインビトロ組換えによって異種遺伝子発現カセットをポックスウイルスゲノムの該当位置へ挿入し、組換え体ウィルスのプラーク精製（例えば実施例6を参照）。
PMWSに対する動物の免疫化のためにPCV2組換え型免疫原をPCV1免疫原と一緒に使うことができる。最も単純なアプローチではPCV2免疫原なしにPCV1免疫原を使うことができる。
【００５８】
実施例1
C6位置のカナリア痘挿入プラスミドの構築
図1（配列番号：1）はカナリア痘ＤＮＡの3.7kbセグメントの配列である。配列解析の結果、C6Lと称されるORFは位置377で始まり、位置2254で終る。以下ではC6挿入プラスミドをC6 ORFを削除し、側面を転写および翻訳終結信号でフランクリングした多系交雑クローニングサイト(MCS)に代えて構築した。
【００５９】
380bp PCR断片はオリゴヌクレオチドプライマC6A1（配列番号：2）およびC6B1（配列番号：3）を用いてゲノムのカナリア痘ＤＮＡから増幅された。1155bp PCR断片はオリゴヌクレオチドプライマC6C1（配列番号：4）、C6D1（配列番号：5）を用いてゲノムのカナリア痘ＤＮＡから増幅した。380bpおよび1155bp断片をテンプレートとして加え、オリゴヌクレオチドプライマC6A1（配列番号：2）およびC6D1（配列番号：5）を用いて1613bp PCR断片を増幅した。この断片をSacIおよびKpnIで消化し、SacI/KpnIで消化したpBluescript SK + Strata遺伝子にリゲートした(La Jolla, CA, USA)。DNAの塩基配列の解析からプラスミドpC6Lが得られたことを確認した。
【００６０】
これはC6上流（「C6左腕」）の370bpのカナリア痘ＤＮＡ、種痘早期終結信号、6つの読み枠の翻訳ストップコードン、SmaI、PstI, XhoI、EcoRIを含むMCS、種痘早期終結信号、6つの読み枠の翻訳ストップコードンおよび下流（「C6右腕」）の1156bpのカナリア痘配列から成る。
【００６１】
プラスミドpJP099はpC6LのSmaI/EcoRI部位に異種遺伝子を組み込んだ種痘疹H6プロモータ（Taylor et al. (1988c), Guo et al. (1989) Perkus et al. 1989）に記載)を含むカセットをリゲートしてpC6Lから得た。
【００６２】
このプラスミドpJP099はユニークなEcoRV部位と、異種遺伝子のSTOPコードンとH6プロモータの3'端との間に位置したユニークなSalI部位と、異種遺伝子のSTOPコードンとC6左腕との間に位置したユニークなNruIサイトとを含んでいる。従って、このpJP099からの〜4.5kbのEcoRVlSaIIまたはNruI/SalI断片はプラスミド配列（pBluescript SK+、Stratagene, La Jolla, CA, USA）、2つのC6アーム、EcoRVまたはNruIサイトまでのH6プロモータの5'端を含む。
【００６３】
プライマの配列：
プライマC6A1（配列番号：2）
atcatcgagctcgcggccgcctatcaaaagtcttaatgagtt
プライマ C6B1 （配列番号：3）
gaattcctcgagctgcagcccgggtttttatagctaattagtcattttttcgtaagtaagtatttttatttaa
プライマ C6C1 （配列番号：4）
cccgggctgcagctcgaggaattctttttattgattaactagtcaaatgagtatatataattgaaaaagtaa
プライマ C6D1（配列番号：5）
gatgatggtaccttcataaatacaagtttgattaaacttaagttg
【００６４】
実施例2
PCV2 ORF2用のALVACDONORプラスミドの構築
プラスミドpGem-7Z中にEcoRI断片としてPCV2ゲノムを含むプラスミドpGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14をEcoRIで消化して、a1768bp断片を単離し、リゲートした。PCV2 ORF 2を適当なALVAC挿入ベクター中に挿入するためにプライマJP760（配列番号：6）およびJP773（配列番号：7）を用い、リゲートされた1768bp EcoRI断片（上記参照）からPCV2 ORF 2を増幅し、PCR J1304にした。プライマJP760（配列番号：6）はEcoRVからのH6プロモータの3'端とPCV2 ORF 2の5'端とを含む。プライマJP773（配列番号：7）はSalIサイトが続くPCV2 ORF 2の3'端を含む。次に、PCRJ1304の産物をEcoRVlSalIで消化し、pJP099から〜750 bp断片として〜4.5 kbのEcoRVlSalI断片にクローニングする（実施例1参照）。
【００６５】
得られたプラスミドは配列解析で確認し、pJP 102と名付けた（pJP 102、図2の地図および図3の配列（配列番号：8）を参照）。ORF 2の配列はGenBankから入手可能な配列（受入れ番号AF055392）とマッチした。ドナープラスミドpJP 102（NotIて線形化した）を試験管内組換え（IVR）テストで用い、ALVAC組換え体vCP 1614（実施例6を参照）を作った。
【００６６】
プライマの配列：
JP760（配列番号：6）
cat-cat-cat-gat-atc-cgt-taa-gtt-tgt-atc-gta-atg-acg-tat-cca-agg-agg-cg
JP773（配列番号：7)
tac-tac-tac-gtc-gac-tta-ggg-ttt-aag-tgg-ggg-gtc
【００６７】
実施例３
PCV2 ORF2およびORF1用のANALVACドナーPLASMIDFORの構築
PCV2 ORF 1は、プラスミドpGem7Z-ImplO10-Stoon-EcoRI No.14でプライマJP774（配列番号：9）およびJP775（配列番号：10）を用いてPCRで増幅してPCR J1311として得た。プライマーJP774（配列番号：9）はNruIからのH6プロモータを3'端に含み、5'端はPCV2 ORF1で終わる。プライマJP775（配列番号：10）はPCV2 ORF1を3'端に含み、それにSalIサイトが続く。PCR J1311（〜1 Kb）の産物をpCR2.1(Invitrogen、Carlsbad, CA)でクローニングする。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP104と名付ける。ORF1の配列はGenBankで入手可能な配列（Accession No. AF055392）とマッチした。pJP104から〜970bpのNruIlSalI断片を単離し、pJP099からの〜4.5 kb NruIlSalI断片でクローニングする（実施例1を参照）。得られたプラスミドを制限解析し、pJP105（図４参照）と名付けた。
【００６８】
このドナープラスミドpJP105は試験管内組換えテスト（実施例６に記載）でPCV2 ORF1を発現するALVAC組換え体を作るのに用いることができる。
pJP102（実施例2を参照）からの〜838bp BamHI/SalIをDNAポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いてブラントし、クレノーブラントしたpJP105のEcoRIサイトにクローニングする。クローンの挿入の向きを配列解析でチェックし、頭−頭の向きを選択した。このプラスミドを配列解析で確認し、pJP 107と名付けた（図5のpJP 107および図6の配列（配列番号：11）の地図を参照）。ドナープラスミドpJP107（NotIで線形化）を用いて試験管内組換えテスト（IVR）でALVAC組換え体vCP 1615（実施例6を参照）を得た。
【００６９】
プライマの配列：
JP774（配列番号：9）
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGG
JP775 （配列番号：10）
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG
【００７０】
実施例4
PCV1 ORF2のためのALVACドナープラスミドの構築
プラスミドpGem-7ZにPstI断片としてPCV1ゲノムを含む、プラスミドpPCV1（B. Meehan et al., J.Gen.Virol,1997.78.221-227）をテンプレートとして用いてPCV1 ORF2を増幅した。適当なALVAC挿入ベクターにPCV2 ORF 2を挿入するために、プライマJP787（配列番号：12）およびJP788（配列番号：13）を用いてプラスミドpPCV1（上記参照）からPCV1 ORF 2を増幅してPCR J1315を得た。プライマJP787(配列番号：12)は3'端にEcoRVからのH6プロモータとそれに続くSalIサイトORF 2を含む。PCR J1315の産物をEcoRVlSalIで消化し、〜750 bp断片としてpJP099（実施例1の上記参照）から〜4.5 kb EcoRVlSall断片にクローニングした。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP 13と名付けた。ORF 2の配列はGenBankで入手可能な配列（寄託No. U49186）とマッチした。ドナープラスミドpJP113（NotIで線形化)を用いて試験管内組換え（IVR）テストでALVAC組換え体vCP1621（実施例7参照）を得た。
【００７１】
プライマの配列：
JP787（配列番号：12）
CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CG
JP788 （配列番号：13）
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G
【００７２】
実施例５
PCV1 ORF2およびORF1のためのANALVACドナープラスミドの構築
プラスミドpGem-7Z中にPstI断片としてPCV1ゲノムを含むプラスミドpPCV 1（上記実施例４参照）をPstIで消化し、1759bp断片を単離し、リゲートした。
【００７３】
プライマJP789（配列番号：14）およびJP790（配列番号：15）を用いて、リゲートされた1759bp PstI断片からのPCV1 ORF1（上記参照）を増幅してinPCR J1316を得た。プライマJP789（配列番号：14）は3'端にNruIからのH6プロモータを含み、5'端にPCV1 ORF1を含む。プライマJP790（配列番号：15）は3'端にPCV1 ORF1端を含み、SalIsiteが続く。PCRJ1316の産物（〜1 Kb）をpCR2.1（Invitrogen、Carlsbad、CA）にクローニングする。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP 114と名付けた。ORF1の配列はGenBankで入手可能な配列（Accession No. U49186）とマッチした。〜970bpのNruI/SalI断片をpJPl 14から単離し、pJP099（実施例1参照）からの〜4.5kb NruIlSalI断片にクローニングした。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP 115と名付けた。ドナープラスミドpJP 115を用いて試験管内組換えテスト（実施例7参照）でPCV1 ORF1を発現するALVAC組換え体を得た。
【００７４】
pJP113（実施例４を参照）からの〜838bp BamHllSallをDNAポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いてブラントにし、pJP115のクレノー−ブラントしたEcoRIサイトにクローニングする。クローンの挿入の向きを配列解析でチェックし、頭−頭−の向きを選択した。このプラスミドを配列解析で確認し、pJP117と名付けた。このドナープラスミドpJPl17（NotIで線形化）を用いて試験管内組換え（IVR）テストでALVAC組換え体vCP1622を作った（実施例7を参照）。
【００７５】
プライマの配列：
JP789（配列番号：14）
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCCAAG-CAA-GAA-AAG-CGG
JP790（配列番号：15）
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG
【００７６】
実施例６
ALVAC-PCV2組換え体の作成
プラスミドpJP102（実施例２および図2を参照）およびpJP107（実施例３および図5を参照）をNotIを用いて線形にし、上記燐酸カルシウム沈降法（Panicali and Paoletti, 1982、Oiccini, et al., 1987）を用いてALVAC感染一次CEF細胞に形質移入した。PCV2特異的放射性プローブに対するハイブリッドをベースにしてポジティブプラークを選択し、純粋な母集団が得られるまでシーケンシャルなプラークの精製を４回行った。各IVRからの一つの代表プラークを増幅し、得られたALVAC組換え体をvCP1614およびvCP1615と名付けた。vCP1614ウィルスはALVACとドナープラスミドpJP102との間の組換の結果得られたもので、ALVAC C6位置に挿入されたPCV2 ORF2を含む。vCP1615ウィルスはALVACとドナープラスミドpJP107との間の組換の結果得られたもので、ALVAC C6位置に頭−頭の向きで挿入されたPCV2ORF2とORF1とを含む。
【００７７】
同様にして、実施例３に記載のドナープラスミドpJP105を使用してPCV2 ORF1のみを発現する組換え体ALVACを作ることもできる。
【００７８】
免疫蛍光法
免疫蛍光分析法（IF)で、ALVAC組換え体感染Vero細胞でPCV2蛋白が発現されるか否かを調べた。感染Vero細胞は汚染後のPBSで24時間洗浄し（m. o. i.＝約10）、室温で3分間の冷えた95％アセトンで固定した。最初の抗体としPCV2 ORF1（PCV2 199 1D3GA及びPCV2 210 7G5GD）またはORF2（PCV2190 4C7CF、PCV2 190 2B1BC及びPCV2 190 3A8BC）に特異的な５つのモノクローナル抗体（MAb）調合品（ハイブリドーマ上清）を使用した。
【００７９】
これらの特異的なモノクローナル抗体はMerial（Lyon）から得た。これらのモノクローナル抗体は下記の引用文献からも入手可能である：WO-A-99 18214 （1998）、フランス特許出願番号97/12382、98/00873、98/03707（それぞれ1997年10月3日、1998年1月22日、1998年3月20日出願)、W099/29717(
これらは本願明細書で引用したものとする）。IF反応はTaylor et al. (1990)に記載の方法で実行される。
【００８０】
３つのORF2-特異抗体とのPCV2特異免疫蛍光でvCP1614に感染した細胞およびvCP1615に感染した細胞を検出できる。２つのORF1-特異抗体とのPCV2特異免疫蛍光でvCP1615だけに感染した細胞を検出できる。これらの結果は、予想通り、vCP1614がORF2のみを発現し、vCP1615はORF1とORF2とを発現した。親のALVAC感染Vero細胞や未感染Vero細胞では蛍光は検出されなかった。
【００８１】
実施例７
ALVAC-PCV1組換え体の作成
プラスミドpJP 113（実施例４を参照）およびpJP117（実施例５を参照）をNotIで線形にし、上記燐酸カルシウム沈降法（Panicali and Paoletti, 1982、Oiccini, et al., 1987）を用いてALVAC感染一次CEF細胞に形質移入した。PCV1特異的放射性プローブに対するハイブリッドをベースにしてポジティブプラークを選択し、純粋な母集団が得られるまでシーケンシャルなプラークの精製を４回行った。各IVRから一つの代表プラークを増幅し、得られたALVAC組換え体をvCP1621およびvCP1622と名付けた。vCP1621ウィルスはALVACとドナープラスミドpJPl13との間の組換の結果であり、ALVAC C6位置に挿入されるPCV1 ORF2を含む。vCP1622ウィルスはALVACとドナープラスミドpJP17との間の組換の結果であり、ALVAC C6位置にヘッド−ヘッドの向きで挿入されたORF1PCV1およびORF2を含む。
同様にして、実施例５に記載のドナープラスミドpJP115を使用してPCV1 ORF1のみを発現する組換え体ALVACを作ることもできる。
【００８２】
免疫蛍光法
免疫蛍光分析法（IF)で、ALVAC組換え体感染Vero細胞でPCV1蛋白が発現されるか否かを調べた。感染Vero細胞は汚染後のPBSで24時間洗浄し（m. o. i.＝約10）、室温で3分間の冷えた95％アセトンで固定した。最初の抗体とし特異的抗-PCV1ブタ・ポリクローンの血清（Allan G. et. al. Vet. Microbiol. 1999.66：115-123）を使用した。IF反応はTaylor et al. (1990)に記載の方法で実行する。
【００８３】
PCV1特異的な免疫性蛍光はvCP1621に感染した細胞およびvCP1622に感染した細胞で検出できる。この結果は、予想通り、vCP1621およびvCP1622がPCV1-特異的な産物を発現することを示している。vCP1621に感染した細胞およびvCP1622に感染した細胞中のPCV2-特異的ブタポリクローン血清では蛍光は検出されなかった。親のALVAC感染Vero細胞および未感染のVero細胞でも蛍光は検出されなかった。
【００８４】
実施例８
ワクチンを製造するために、組換え体カナリア痘ウイルスCARBOPOLTM 974PおよびvCP1615（実施例６）をカルボマー溶液と混合する。同様に、組換え体カナリア痘ウイルスvCP1621およびvCP1622（実施例７）をカルボマー溶液と混合する。
【００８５】
本発明のブタのワクチン接種で使用するカルボマー成分はBFグッドリッチ社から市販のCarbopol（登録商標）974P（分子量3,000,000）である。Carbopol（登録商標）974P 1.5％保存溶液は先ず最初に１g/リットルの塩化ナトリウムを含む蒸留水に調製される。この保存溶液を用いて生理水中にCarbopol（登録商標）974Pを4mg/ml含む溶液を作る。保存溶液を必要な容積の生理水に一段階または複数のステップで混合して各ステップで１Ｎ（またはそれ以上の濃度）の水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ値を最終ｐＨ値の7.3〜7.4に調製する。この最終Carbopol（登録商標）974P溶液は凍結乾燥組換え体ウィルスの再構成や、濃縮組換え体ウィルスストックの希釈に直ちに使用できる溶液である。例えば、2mlの投与量当たり１０8 pfuを含む最終ウイルス懸濁液を得るには1.9mlの109fu/mlの保存溶液の0.1mlを上記の直ちに使用できる４mg/mlのCarbopol（登録商標）974P溶液に希釈する。同様に、直ちに使用できる２mg/mlのCarbopol（登録商標）974P溶液を用意することもできる。
【００８６】
実施例９
ブタの免疫化と抗原投与
9.1 1日齢の子豚の免疫化
帝王切開後１日目の子豚のグルプを集め隔離区画に入れ、２日目に子豚に各種ワクチン溶液を筋注で予防注射した。各ワクチンは組換え体ウィルスストックを無菌生理水（NaCl 0.9％）に希釈してウイルス懸濁液にした。ウイルス懸濁液の適切な濃度範囲は経験的に決定されるが、一般には106〜1010、好ましくは約1010（pfu/投与量）である。実施例８に記載のように、組換え体ウィルス懸濁液とCarbopol（登録商標）974P溶液とを混合してワクチン溶液を調製することもできる。
【００８７】
子豚は下記のいずれかで予防注射した：
組換え体ウィルスvCP1614（実施例2）
組換え体ウィルスvCP1615（実施例3）
組換え体ウィルスvCP1614とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
組換え体ウィルスvCP1615とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
ウイルス懸濁液は単位投与量当たり108プラーク形成単位（pfu）含む。各ウイルス懸濁液の1ml容積を筋肉経由で注射した。筋肉注射は首の筋に投与した。
【００８８】
実験の第２日と第４日の２回、ウイルス懸濁液を注射投与した。抗原投与は２１目にPCV-2毒性株の培養で得たウイルス懸濁液を経鼻投与して行った。抗原投与後、離乳後の全身的症候群の臨床徴候を見るために３週間、子豚をモニターした。下記の兆候を記録した：
【００８９】
直腸温： 抗原投与後、直腸温を２週間毎日モニターし、第３週目は２回測定した。
重量： 抗原投与直前に子豚を秤量し、その後最初の３週間、体重を測定した。
血液サンプルは実験後の第２日目、第14日目、第21日目、第28日目、第35日目および第42日目に採取してウイルス血症レベルおよび抗-PCV-2特異抗体滴定濃度をモニターした。
【００９０】
剖検： 生き残った全ての子豚を第42日目に人道的に安楽死させ、検死して特異的PWMS病変を肉眼で捜した。特異的組織の病変を捜すための組織サンプルは肝臓、リンパ節、脾臓、腎臓および胸腺から調製した。
【００９１】
9.2. 5〜7週齢の子豚の免疫化
母性の抗PCV-2特異抗体が無くなった5〜7週齢の成長した子豚に筋注で各種ワクチン溶液を予防注射した。ワクチン用ウイルス懸濁液は組換え体ウィルス・ストックを無菌の生理水（NaCI 0.9％）に希釈して作った。ワクチン溶液を実施例８に記載のように組換え体ウィルス懸濁液とCarbopol（登録商標）974P溶液とを混合して調製することもできる。
【００９２】
子豚には下記のいずれかを予防注射した：
組換え体ウィルスvCP1614（実施例2）
組換え体ウィルスvCP1615（実施例3）
組換え体ウィルスvCP1614とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
組換え体ウィルスvCP1615とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
ウイルス懸濁液は単位投与量当たり108のプラーク形成単位（pfu）を含む。各ウイルスの懸濁液の2ml容積を筋肉に注射した。筋肉注射は首の筋に投与した。
【００９３】
実験の第0日目および第21日目にウイルス懸濁液を２回注射投与した。抗原投与は第３５日目にPCV-2毒性株の培養で得たウイルス懸濁液を経鼻投与して行った。抗原投与後、離乳後の全身的症候群の臨床徴候を見るために８週間、子豚をモニターした。実施例9.1に記載のものと同じ兆候を記録したが、モニタリング期間を３週間でなくて８週間にした。
【００９４】
実験中に抗原投与で死んだ子豚を剖検し、実験の最後（第97日目）には生き残った全ての子豚も剖検した。組織サンプルは実施例9.1に記載のものと同じである。
【００９５】
9.3.
新生児子豚の免疫化
帝王切開後０日目の３匹または４匹の子豚のグルプを集め隔離区画に入れ、２日目に子豚の首の横側に1mlのPBS中のvCP1614、vCP1615または親ALVACベクターを108 pfuの量で筋肉注射した。第14日目に第2回目のワクチン投与または偽薬投与をした。ALVAC組換え体のワクチン接種は子豚にじ宇分に寛容で、ワクチン接種の副作用の証拠は見られなかった。第21日目に子豚にPCV-2ウイルス性懸濁液を経鼻投与で各外鼻孔に1mlの抗原投与した。第45日目に剖検し、組織サンプルを集めてウィルスを単離した。
【００９６】
剖検の結果：
一般に、ＰＭＷＳはリンパ節症、特に、肝炎または腎炎によって特徴付けられる。従って、各子豚のリンパ節の腫れを以下の方法で分類した：
【００９７】
0 ＝大きなリンパ節は見えない
1 ＝気管支リンパに限定される普通のリンパ節拡大
2 ＝気管支リンパに限定される中程度のリンパ節拡大
3 ＝気管支、下顎骨下、肩甲線、鼠径部リンパ節まで拡大した激しいリンパ節拡大
【００９８】
【表1】
【００９９】
PCV-2の場合、気管支リンパ節症が目立った所見である。vCP 1614およびvCP 1615（p < 0.05）で免疫化した場合、対照群に関してリンパ節病変の有意な減少が観測される。
【０１００】
以上、本発明の好ましい実施例を細部に説明したが、本発明は特許請求の範囲で定義されるもので、上記の特定な細部に限定されるものではなく、本発明の精神または範囲から逸脱せずに種々の変更を行うことができるということは理解できよう。
【０１０１】
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 （配列番号1）はC6転写解読枠を含むALVACのＤＮＡの3.7キロ塩基対断片のヌクレオチド配列を示す図。
【図２】 pJP102ドナープラスミドの地図。
【図３】 （配列番号8）はpJP102ドナープラスミドからのKpnI（位置653）からSacI(位置3166）までの制限サイトの2.5キロ塩基対断片のヌクレオチド配列を示す図。
【図４】 pJP105のドナープラスミドの地図。
【図５】 pJP107ドナープラスミドの地図。
【図６】 （配列番号11）はpJP107ドナープラスミドからのKpnI（位置653）からSacI（位置4255）までの制限サイトの3.6キロ塩基対断片のヌクレオチド配列を示す図。
【配列表】
【発明の分野】
関連出願
本出願は1999年6月10日出願の米国特許出願第60/138,478号および2000年5月31日出願の米国特許出願の優先権を主張する。
1998年1月22日および1998年3月20日のWO-A-99 18214（1998）、1997年10月3日のフランス特許出願、1997年10月3日出願第97/12382号およびW099/29717を参照する。上記の各米国特許出願、国際特許出願およびフランス出願（出願文献）に記載の内容は本願明細書の一部をなす。
【０００２】
また、上記の各米国特許出願、国際特許出願およびフランス特許出願に記載の技術的事項は本発明の実施にあたって使用することができる。
本明細書では多数の刊行物を参照する。これらの文献の完全なリストは明細書の末尾にまとめて記載してある。これらの文献は本発明に関連し、本明細書で引用する（引用文献）。これら引用文献の内容は本願明細書の一部をなす。
【０００３】
【発明の分野】
発明の技術分野
本発明は、組換えベクターのようなベクター、組換え体ウィルス、例えば変更したポックスウイルスと、その製造方法とに関するものである。
具体例としては、本発明は組換え鶏痘ウィルス、例えばカナリア痘ウイルスＡＬＶＡＣに関するものである。
【０００４】
本発明はさらに、上記のベクター、例えば遺伝子産物、例えば抗原、ORFおよび／またはブタサーコウイルス2 (PCV2) の主要エピトープを発現するポックスウイルスと、疫組成物またはワクチンにも関するものである。
【０００５】
本発明はさらに、上記のベクター、例えば、PCV2遺伝子産物および／またはPCV2に対する免疫反応を誘発するポックスウイルスにも関し、好ましくはそれに対する免疫、免疫原、ワクチン組成物および／またはPCV2の汚染に対する感染防御免疫組成物に関するものである。
【０００６】
本発明はさらに、上記ベクター、組成物、その中間生成物の使用と、その中間生成物と、その製造方法および使用方法とに関するものである。本発明はさらに、上記産物、すなわち、本発明の組換え体、ポックスウイルス、その発現抗体とにも関するものである。
【０００７】
【従来の技術】
ＰＭＷＳ症候群（ブタ多臓器消耗症候群、porcine multisystemicwasting syndromまたは離乳後多臓器消耗症候群）は若いブタに最近認識されはじめた疾患である。このＰＭＷＳ症候群は体重の漸進的減少と、頻呼吸、呼吸困難および黄疽のような臨床的症状の現れによって特徴付けられる。病理学的にはリンパ球または肉芽腫性の溶浸、リンパ節症、肝炎、簡単にはリンパ球または肉芽腫性の腎炎から明らかになる（Clark, 1997; Harding, 1997）。
【０００８】
この症候群は北アメリカおよびヨーロッパの各国で報告されているが、その治療および予防方法は現在のところない。
このPMWSの原因微生物としてはブタサーコウイルスであることは多くの証拠がある（Ellis et al. 1998）。このサーコウイルスはPMWSに感染したブタから回種され、この疾患のブタにおいてブタサーコウイルスへの抗体が存在することが報告されている（Ellis et al. 1998）。
【０００９】
サーコウイルスは一本の線状DNAウイルスであり、動物および植物種で見られる。PCVは最初にブタ腎臓細胞株PK/15の非細胞変性汚染物として検出された。細胞培養分離菌はPK-15 (Meehan et al., 1997)とよばれる。近年、ＰＭＷＳを有するブタから得られたブタ・サーコウイルスをPK-15と比較した結果、上記のウィルスはヌクレオチドおよび蛋白質配列レベルでPK15とは実質的に異なっていることが分かり、PCV2 とよばれている(Meehan et al., 1998; Hamel et al., 1998）。
【００１０】
このPCV2ゲノムでは13の転写解読枠（ORF）が同定されている（COL1〜COL13、フランス特許出願98/03707）。これらのORFの4つはPK-15のゲノムとかなりの相同性を有している。ORF1（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL4に対応）は398〜1342（GenBank、受入れ番号AF055392）からなり、37.7 kDの予測分子量有する蛋白質をコードする。ORF2（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL13に対応）は1〜314に結合した1381〜1768から成り（GenBank受入れ番号AF055392）、27.8kDの予測分子量を有する蛋白質をコードする。ORF3（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL7に対応）は1018-704（GenBank受入れ番号AF055392）から成り、11.9kDの予測分子量を有する蛋白質をコードすることができる。
【００１１】
ORF4（Meehan et al., 1998、フランス特許出願98/03707のCOL10に対応）は912〜733（GenBank受入れ番号AF055392）から成り、6.5kDの予測分子量を有する蛋白質をコードする。PCV2のORF1はPK15分離菌、(Meehan et al、1998)のORF1に極めて相同している（86％に対等）。ORF1のPK-15蛋白の一部の特徴は分かっている（Meehan et al （1997）、Mankertz et al. 1998a）。これがウイルス複製にとって重要であることは知られており、多分ウイルスのDNA複製に関係している。
各ORF2間の蛋白質配列の差異はORF1sのそれより低かった（66％一致）各々のORF2sが、非常に節約された基礎的なＮ末端領域（鳥類のサーコウイルス・ニワトリ貧血ウイルスの主要な構造蛋白質のＮ末端領域において、観測されるそれと同様の）を共有した(CAV) (Meehan et al., 1998)。最近PK-15分離菌のORF2がORF 1のカプシドたんぱく質をコードすることを示唆した(Mankertz et al. (1998b)（Mankertzet al., 1998b）。
【００１２】
より大きい差は、それぞれのORF3sおよびPK-15分離菌のORF4sおよびPCV2との間に観測された。各場合において、PCV2 ORF4のC-末端部位および比較されるORF3の削除が、PK-15分離菌のゲノムに存在する対応するORFsに対してあった。最も高いproteinsequence相同性は、ORF3およびORF4、Meehanほか、1998のＮ末端領域で観測された。
PCV2のゲノムの転写解析はまだ発表されていない。
PK-15分離菌については得られた最近のデータはORF2がスプライスすることを示している（1998b、Mankertz et al）。
【００１３】
ワクシニアウィルスは、1980年に世界から根絶した天然痘に対する免疫源として用いられた。天然痘根絶後のポックスウイルス、異種遺伝子発現のための遺伝子設計したベクターの役割が重要になった(Panicali and Paoletti, 1982;Paoletti et al., 1984)。異種抗原をコードする遺伝子がワクチンで発現されて対応病原体の抗原投与に対して感染防御免疫を示すことがあった（Tartaglia et al., 1990）。MVAとよばれる非常に弱毒化した菌株をベクターとして使ったポックスウイルスベースのワクチンも作られた。このMVAの使用は米国特許番号第5,185,146に記載されている。
２つの追加のワクチン・ベクター系では自然宿主限定（hostrestricted）のポックスウイルス、鶏痘ウィルスを使用する。家禽ポックスウィルス（FPV、Taylor et al1988a,b）およびカナリア・ポックスウィルス（CPV、Taylor et al、1991、1992）の２つが異種遺伝子産物を発現するために設計された。
【００１４】
鶏痘ウイルス（FPV）は、ポックスウイルス族の鶏痘全体に効くプロトタイプのウィルスである。このウィルスは経済的に重要で、1920年代から家禽の疾患に対して生きた弱毒化ワクチンとして投与されている。鶏痘ウィルスの複製は鳥種に限られ（Matthews, 1982）、ヒトを含む全ての非鳥類生物種の増殖性感染の原因となる鶏痘ウィルスに関するレポートや文献はない。この宿主限定性は他の生物種へのウィルス伝達への安全バリヤーを提供し、鶏痘ウィルスをベースにしたワクチンベクターを用いた獣医学およびヒトへ応用に魅惑的である。
【００１５】
FPVは抗原を家禽からの病原体を発現するベクターとして有利に使われてきた。ビルレントなトリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン蛋白はFPV組換え型において発現された（Taylor et al., 1988c）。組換え体をニワトリおよびシチメンチョウへ接種した後に免疫反応が誘導され、同種または異種のビルレントなインフルエンザウイルスの抗原投与に対する保護を発揮した（Tayor et al. 1988c）。ニューカッスル病ウィルスの表面糖蛋白質を発現しているFPV組換え体も開発された(Teller et al 1990、Edbauer et al.1990)。
【００１６】
他の弱毒化したポックスウイルス・ベクターはウィルス野生株の遺伝子修飾によって調製されている。コペンハーゲン株ワクチンからの特異的毒性は宿主-領域遺伝子を削除して得たNYVACベクターは、発現された異種抗原に対する防御免疫応答を引き出す組換え体ベクターとして有用であることが分かっている (Tartaglia et al. 1992)。
【００１７】
遺伝子操作された他のポックスウイルス・ベクターはカナリア痘ウイルスに由来するALVACである。このALVACは鳥類以外の宿主では生産的なコピーを作らず、この特性は安全プロファイルを改善すると考えられる（Teller et al、1991、1992）。ALVACおよびNYVAC はBSL-1ベクターである。
サブユニットPCV2ワクチンの開発への一つのアプローチは関連するPCV2 ORFを発現する生ウイルスベクターを使用することである。組換え体ポックスウイルスは公知の２ステップで作ることができる。すなわち、米国特許第4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,174,993、5,494,807、5,505,941号（これらの内容は本願明細書の一部をなす）に記載に記載のポックスウイルス、例えばワクシニアウィルスおよび鶏痘ウィルスの合成組換え体の製造方法に類似した方法で作ることができる。
【００１８】
従って、PCV2組換え体ポックスウイルスと、その組成物および産物、特にPCV2組換え体、組成物および産物をベ―スにしたALVAC、特に、PCV2のORF 1および／またはORF 2を含む組換え体、組成物および産物は現在の技術を大きく向上させる上で大変望ましいものである。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の対象は、PCV2による感染の治療、予防のための組成物および方法にある。
本発明の他の対象は、PMWSを治療、予防する組成物および方法にある。
【００２０】
本発明の一つの観点から、本発明は組成物を接種される宿主動物に抗原性、免疫原性または免疫学的な応答を誘発するための、抗原性、免疫学的または免疫原性ワクチン組成物または治療組成物に関するものである。この組成物はキャリアまたは賦形剤、組換え体ウィルス、例えば組換え体ポックスウイルスを含むのが好ましい。組換え体ウィルスまたはポックスウイルスはORF、抗原、イムノゲンまたはPCV2からの所望エピトープ、PCV2またはPCV2に起因する症状、例えばPMWSに対する免疫学的応答を誘導する蛋白をコード化し、発現する外因の核酸分子を含む。この組換え体ウィルスは修正された組換え体ウィルスまたはポックスウイルス、例えばウィルスコード遺伝子機能、本質的でないウィルス-コード化遺伝子機能を不活性化したウイルスまたはポックスウイルスであり、従って、この組換え体ウィルスが毒性を弱めて、安全を改良したウィルスである。本発明は更に、上記組成物の製造方法、ウィルスの使用および組成物で使われるウィルスを提供する。
【００２１】
本発明組成物で使われるウィルスはポックスウイルス、特にワクシニアウィルスまたは鶏痘ウィルス、特に鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルスが好ましく、好ましくはALVACである。ウィルスは修正された組換え体、例えば、ウイルスゲノムの必須でない領域内に抗原蛋白、例えばPCV2 ORF、例えば、PCV2 ORF 1および／またはORF 2からの抗原蛋白をコードする異種DNAの塩基配列を含むことができる。
【００２２】
本発明の他の観点から、本発明は不活性化した必須でないウイマス−コード遺伝子機能を有する修正された組換え体ウィルスを含むビルレンスを弱くし、安全性を改良した免疫組成物に関するものである。
この修正された組換え体ウィルスはウイルスゲノムの必須でない領域中に抗原蛋白（例えば、PCV2 ORF、特にORFS 1および／またはORFS 2からの抗原蛋白）をコードする異種DNAの塩基配列を含み、免疫組成物を宿主に投与したときに抗原に対して免疫応答特性を誘発する。
【００２３】
本発明の更に他の観点から、本発明は必須でないウィルス-コード化遺伝子機能を内部に有し、従って、ウィルスが弱毒化され、例えばウイルスゲノムの必須でない部位に異種のＤＮＡを含む修正された組換え体ウィルスに関するものである。このＤＮＡはPCV2遺伝子、例えばPCV2 ORF1、ORF2、ORF3またはORF4（Meehan et al. 1998)またはその重要なエピトープをコードすることができる。遺伝子機能は毒性ファクタをコードする転写解読枠を削除するか、自然で宿主-制限されたウィルスを利用することで機能させなくすることができる。本発明で使用されるウィルスはポックスウィルス、例えばワクシニアウィルスまたは鶏痘ウィルスが好ましく、例えば鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルスである。
【００２４】
ポックスウイルスまたはウイルスゲノムから削除される転写解読枠はJ2R、B 13R＋B14R、A26L,A56R、C7L-K1LおよびI4L（Goebel et al., 1990に記載の用語）およびこれらの組み合わせから成る群の中から選択するのが好ましい。この転写解読枠はチミジンキナーゼ遺伝子、出血部位、Aタイプ封入小体部位、ヘマグルチニン遺伝子、宿主域遺伝子部位または大サブユニット（リボ・ヌクレオチド・レダクターゼ）またはこれらの組み合わせから成る。
【００２５】
ワクシニアウィルスの適切な修正されたコペンハーゲン菌株として同定されているのはNYVAC(Tartaglia et al、1992)またはJ2R,B 13R+B 14R、A26L、A56R、C7L-K11およびI4L、チミジンキナーゼ遺伝子、出血部位、Aタイプ封入小体部位、ヘマグルチニン遺伝子、宿主域部位、大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼが削除されたワクシニアウィルスである（NYVACおよび本発明で有用なNYVACから追加の削除または不活化をしたベクターに関しては米国特許番号第5,364,773号、第5,494,807号および第5,762,938号も参照)
【００２６】
好ましいポックスウイルスベクターはALVACまたは弱毒化したカナリア痘ウイルスである。この弱毒化は例えばニワトリ胚繊維芽細胞（Rentschlerワクチン株）を200以上の連続的に継代し、マスターシードを寒天で４回連続してプラーク精製し、それからさらに5回の連続したプラーク精製を行う（ALVACおよびTROVAC（本発明で有用な弱毒化した鶏痘ウイルス）に関しては米国特許第5,756,103号および第5,766,599号を参照）。本発明で利用可能なウイルスに関してはさらに米国特許第6,004,777号、第5,990,091号、第5,770,212号、第6,033,904号、第5,869,312号、第5,382,425号および国際特許第WO 95/30018号も参照）。
【００２７】
本発明で使用可能なベクターとしては例えば発現が増強されたベクター、機能が削除されたベクター、ブタ宿主に対して有用なベクター（ブタ宿主に対して有用なベクターの例としてはワクシニアウィルス、鶏痘ウィルス、カナリア痘ウイルス、スインポックスウイルスを含むポックスウイルスを含む）がある。また、各種の用語例えば「免疫原性組成物」「免疫学的組成物」、「ワクチン」、「重要なエピトープ」や供与量、投与経路、調合方法、アジュバントおよび組換え型ウィルスおよび発現産物の利用に関しても上記文献が参照できる。
【００２８】
本発明の更に他の観点から、本発明は本発明の組換え体ポックスウイルスの発現産物と、治療用、予防用、診断用製剤、免疫組成物またはワクチン組成物またはテストでのその使用と、組換え体ポックスウイルスからのＤＮＡプローブおよびPCRプライマーを作るのに有用なＤＮＡとに関するものである。
【００２９】
本発明は以下の記載、実施例の記載、添付図面を参照することでより明瞭に理解できよう。
【００３０】
本発明の一実施例では、本発明はPCV2からのDNAの塩基配列、例えばポックスウイルスゲノムの必須でない部位を含む組換え体、組換え体ウィルスに関する。ポックスウイルスは鶏痘ウイルス、特に弱毒化された鶏痘ウイルスまたはカナリア痘ウイルス、特に弱毒化されたカナリア痘ウイルス、例えばALVACであるのが好ましい。
本発明の組換え体ポックスウイルスは異種のPCV2遺伝子の遺伝子産物を発現する。PCV2の特異的なORFをポックスウイルスベクター中に挿入し、得られた組換え体ポックスウイルスを動物の感染に用いる。
【００３１】
PCV2遺伝子産物の動物での発現でPCV2に対する動物での免疫反応が得られる。従って、本発明の組換え体ポックスウイルスは免疫学的組成物またはワクチンとして使用され、保護免疫反応誘発手段を提供する(保護は必須ではない)。
本発明の組換え体ポックスウイルス-PCV2またはその発現産物、免疫学的組成物、抗原性組成物またはワクチン組成物または治療組成物は例えば腸管外のルート（皮内、筋肉内または皮下）の投与方法で投与できる。この種の投与によって全身免疫反応または液性応答または細胞応答が得られる。
【００３２】
一般に、本発明のポックスウイルス-PCV2組換え体、抗原性または免疫学的またはワクチン用ポックスウイルス-PCV2組成物または治療用組成物は製薬または獣医の技術に熟練した当業者に公知の標準的方法によって製造できる。この種の組成物は年齢、性、重量、生物種および投与ルート、患者のコンディション等のファクタを考慮に入れて製薬または獣医の技術に熟練した当業者が適用量を周知の手技で投与することができる。本発明組成物は単独で投与でき、また、他の免疫組成物を多価または「カクテル」または複合組成物として投与することもできる。投与法（順次投与か同時投与か）、投与成分および投与量は年齢、性、重量、生物種および投与ルート、患者のコンディション等のファクタを考慮に入れて製薬または獣医の技術に熟練した当業者が決定できる。
ィション）を持っていく、そして、投与のルート。この点に関しては狂犬病用の組成物および組合せ組成物およびその使用に関する米国特許第5,843,456号を参照されたい(この内容は本願明細書の一部を成す)。
【００３３】
本発明組成物の実施例は鼻、肛門、皮膚、経口投与用(例えば胃経由)の液体製剤、懸濁液、シロップまたはエリキシルョンのような投与、腸管外、皮下、皮内、筋肉内、静脈内の投与(例えば注射投与)、例えば無菌せ懸濁液またはエマルジョン用調合品を含む。この種の組成物では組換え体ポックスウイルスまたは抗原は適切なキャリヤ、賦形剤または付形剤、例えば滅菌水、生食水、グルコースまたはその他と混合物することができる。組成物を凍結乾燥することもできる。組成物は所望の投与ルートおよび調製法に応じた湿潤剤、乳化剤のような助剤物質、pH緩衝試剤、佐剤、ゲル化または添加剤、防腐剤、着色剤、香料、粘度改良剤等を含むことができる。
標準テキスト（例えば"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE"、第17の版、1985）(本願明細書で引用したものとする)を参照することで、過度の実験なしに適切な調合品を調製することができる。適切な適用量は下記の実施例に基づいて決めることができる。
本発明組成物はアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中から選ばれる少なくとも一つの佐剤化合物を含むことができる。
【００３４】
好適な佐剤化合物はアクリル酸またはメタクリル酸の架橋した、特に砂糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋したポリマーである。これらの化合物はカルボマー（Phameuropa、第8巻（No.2）1996年6月）として公知である。当業者は米国特許第2909462号明細書（本願明細書に引用したものとする）を参照できる。この特許には少なくとも３つの水酸基、好ましくは８以下の水酸基を有するポリヒドロキシル化された化合物（少なくとも３つのヒドロキシル基の水素原子は２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されている）で架橋されたアクリルポリマーが記載されている。好ましい基は2〜4の炭素原子を有する基、例えばビニール、アリル、その他のエチレン性不飽和基である。不飽和基自身が他の置換基（例えばメチル）を含むこともできる。カルボポル（Carbopol、登録商標、BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で市販の化合物が特に適切である。これはアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋されている。特に、カルボポル（Carbopolo）974P、934Pおよび971Pを挙げることができる。無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中では無水マレイン酸とエチレンの線形または架橋、例えばジビニルエーテルで架橋したコポリマーであるコポリマーのエマ（EMA、登録商標、Monsanto）が好ましい。これに関してはJ. Fields et al., Nature, 186:778-780,4 June 1960（本願明細書に引用したものとする）が参照できる。
【００３５】
アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびコポリマーのエマ（EMA、登録商標)は下記式の基本構造単位を有する：
【００３６】
【式１】
（ここで、R1とR2はHまたはCH3−を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、x ＝ 0または1、好ましくはx ＝1であり、y ＝ 1または2で、x＋y ＝ 2)
エマ（EMA、登録商標)ではx＝ 0、y = 2であり、カルボマーではx = y = 1である。
【００３８】
水にこのポリマ−を溶解すると酸性溶液になるので、好ましくは、実際のワクチンが取り入れられるアジュバント溶液を与えるために、生理学的なpHに中和する。ポリマ−のカルボキシル基は部分的にCOO−形になっている。本発明のアジュバント溶液、特にカルボマ−の溶液では、好ましくは塩化ナトリウム存在下で蒸留水に溶かす。得られる溶液は酸性pHである。
この原液に必要な量の水を加えて所望の最終濃度まで薄めてアジュバントの溶液を調製するのが好ましい。または、好ましくは生理的食塩水、好ましくはNaCl を添加(9g NaC1 9g/1)した生理的食塩水とNaOHで中和（pH 7.3〜7.4）する。生理学的なpHのこの溶液は凍結乾燥するか、液状で凍った状態で保存され、ワクチンと混合するためにそのままに扱われる。最終的なワクチン組成物のポリマ−濃度は0.01％〜2％ w/v、特に0.06〜1％ w/v、好ましくは0.1〜0.6％ w/vである。
【００３９】
本発明の免疫学的組成物は少なくとも一つのイムノゲンを発現する他のブタ病原体からの少なく一種の弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットまたは組換え体ワクチン（ベクターまたはＤＮＡプラスミドとしての例えばポックスウイルス）と組み合わせることができる。
【００４０】
本発明は均等なヌクレオチド配列、すなわち、考慮すべき遺伝子の官能性または株特異性（タイプ1の菌株およびタイプ2の菌株）を変えない配列またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの配列をコードし、発現するベクターが含まれる。コードの縮重が違う配列も当然含まれる。
【００４１】
以下の実施例で使用するPCV-2配列はMeehan et alから提供された（菌株Imp. 1010、ORF1ヌクレオチド398-1342、ORF2ヌクレオチド1381-314、各々1998年9月25日の米国出願第09/161092号のORF4およびORF13、WO-A-9918214のCOL4およびCOL134に対応）。
【００４２】
他のPCV-2菌株およびそれらの配列はWO-A-9918214で公開され、ImplO08、Imp999、ImplO11-48285およびImplO11-48121と呼ばれ、さらにA. L. Hamel et al. J. Virol. June 1998, vol 72,6: 5262-5267（GenBank AF027217）およびI. Morozov et al. J. Clinical Microb. Sept. 1998 vol.36,9: 2535-2541、および GenBank AF086834、AF086835およびAF086836にあり、均等なORF配列にアクセス可能。本発明ではこれらの配列またはそこからのORFまた抗原または重要なエピトープをコードする部位を使用できる。
【００４３】
本発明はさらに、厳密な条件で考えた時に上記遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド化が可能な均等な配列をも含むものである(Sambrook et al. 1989)。こうした均等な配列としては完全配列の免疫原性を保持した遺伝子断片が挙げられる。
タイプ1および2の全ゲノムの相同性は約75％である。ORF1では約66％、ORF2では約86％である。これに対してタイプ2のゲノム間およびORF間の相同性は一般に95％以上である。
【００４４】
さらに、本発明の均等配列としては、ORF1の場合、菌株ImplOl0の88％以上、特に90％以上、好ましくは92％または95％以上の相同性を有するか、ORF2の場合には菌株ImplO10の80％以上、特に85％以上、好ましくは90％または95％以上の相同性を有する配列が挙げられる。Meehan 1998に従うORF1およびORF2は、それぞれ37.7kDおよび27.8kDの予測された分子量を有する蛋白質をコードする可能性がある。ORF3およびORF4（Meehan et al. 1998、それぞれWO-A-9918214ではORF7およびORF10に対応）はそれぞれ11.9および6.5kDの予測された分子量を有する蛋白質をコードする可能性がある。これらのORFの配列はGenbank AF 055392でも利用できる。これらはプラスミド中に取り入れて、本発明で単独または例えばORF1および／またはORF2と組合せて使うことができる。
【００４５】
1998年9月25日米国特許第09/161,092号（WO−A−9918214のCOLs 1−3および5,6,8−9,11−12）に開示されている抗原またはエピトープをコードする他のORF 1−3および5,6,8−9,11−12も本明細書に記載の条件下で単独または互いに組み合わせてまたは上記定義のORF 1および2またはエピトープをコードする領域と組み合せて使うことができる。
【００４６】
本発明には均等配列、例えば上記の各種PCV-2菌株のORFからの均等配列の使用も含まれる。相同性に関しては、菌株lO10のORFに関して説明した上記の相同性を有するORF1および／またはORF2を有するPCV株から配列の均等性を決定することができる。
Meehan に従うORF3での相同性は例えば菌株ImplO10のORF3の80％以上、例えば85％以上、好ましくは90％または95％以上である。Meehan 1998に従うORF4での相同性は例えば菌株ImplO10のORF4の86％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上である。
例えばWO−A−99 18214に開示のゲノムのヌクレオチド配列から標準のソフトウェア（例えばMacVectort）を用いてORFを決定することはル−チンの技術である。また、菌株1010のゲノムと並べ、菌株1010のORFと比較して他の菌株（例えばWO−A−99 18214に開示のもの）のゲノムのORFを決定することは当業者が容易にできることである。ソフトウェアを使用し、整合することで過度の実験なしに均等なORFまたは核酸分子に直接アクセスできる。
【００４７】
ヌクレオチド配列の相同性はMyers and Millerの「Align」プログラムを用いて決定できる（"Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS4,11-17,1988、NCBIから入手可能。この内容は本願明細書に引用したものとする）。また、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列順序での「相同性」または「同一性」という用語で２つの配列間の相同性を量的に示すことができる。配列相同性パーセントは（Nref-Ndif）*100/Nrefとして計算できる、ここで、Ndifは並べた時に２つの配列中で同一でない残基の全数であり、Nrefは一つの配列中の残基の数である。例えば、DNAの塩基配列AGTCAGTCは配列AATCAATCに対して75％の配列類似性を有する（Nref ＝8、Ndif＝2）。
さらに、配列に関する「相同性」または「同一性」は同じヌクレオチドまたはアミノ酸の数を２つの配列で不足するヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割った数で表すこともできる。２つの配列はウィルバーおよびリップマン・アルゴリズム（Wilbur and Lipman、1983、PNAS USA80：726、本願明細書で引用したものとする）に従って並べることができる。
【００４８】
このWilbur and Lipman、1983、PNAS USA80：726では、例えば、20ヌクレオチドのウィンドウ・サイズを使用し、語長を４ヌクレオチドにし、ギャップ・ペナルティを4にして市販のプログラム（例えばIntelligenetics 登録商標 Suite, Intelligenetics Inc. CA）を使用してコンピュータで配列の並べ変えを含むめたデータの解釈を便利に実行することができる。RNA配列が類似しているか、DNAの塩基配列と同じまたは対等な配列を有する場合には、DNAの塩基配列のチミジン（T）をRNA配列ではウラシル（U）に等しいとみなす。DNAの塩基配列のチミジン（T）をRNA配列のウラシル（U）に等しいとみなしたDNAの塩基配列から誘導されるRNA配列は本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
さらに、アミノ酸配列の類似度、対等度または相同性をBlastPプログラム（Altschul et al., Nucl. AcidsRes. 25,3389-3402、本願明細書で引用したものとする、NCBIから入手可能）を使用して決定することもできる。以下の文献（本願明細書で引用したものとする）は２つの蛋白質のアミノ酸残基に関する対等度または相同性を比較するためのアルゴリズムを提供する。さらに、これら文献を用いて上記パーセント相同性を決定することもできる。
【００５０】
Needleman SB、and Wunsch CD,("A generalmethod applicable to the search for similarities in theamino acid sequences of two proteins) "J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970); Smith TF and Waterman MS、Bio-sequencesの対比、"Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981）、Smith TF, Waterman MS and Sadler JR、"Statisticalcharacterization of nucleic acid sequence functional domains、"Nucleic Acids Res.,1: 2205-2220 (1983）、Feng DF and Dolittle RF、"Progressive sequence alignment as aprerequisite to correct phylogenetic trees、"J. of Molec. Evol., 25: 351-360 (1987）、Higgins DG and Sharp PM,"Fast and sensitive multiple sequence alignment on amicrocomputer,"CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ, "Cluster W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix chaicec、Nucleic Acid Res., 22: 4673-480 (1994）, Devereux J, Haeberlie Pand Smithies O、"A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX, "Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984)。
【００５１】
本発明組成物は成人ブタだけでなく、若いブタおよび妊娠したブタへも投与できる。後者の場合には新生ブタへ受動免疫（母性抗体）を授けることができる。雌のブタは繁殖の前および／または妊娠前および／または妊娠中に接種するのが好ましい。好ましくは受精前に少なくとも一回接種し、その後、妊娠中、例えば妊娠中（妊娠の6-8週頃）および／または妊娠後期（妊娠の11-13週頃）にさらに接種を実行するのが好ましい。好ましくは交配前および／または妊娠前に接種し、妊娠中にブースタ接種することである。その後は各受精前におよび／または妊娠中、妊娠中期におよび／または妊娠後期に再接種することができる。再接種が妊娠中に行うのが好ましい。雄ブタにも予防接種することができる（例えば交配前)。
【００５２】
子豚、例えば予防注射した雌（例えば上記の接種をした）からの子豚は生まれてから最初の1週間いないに予防接種する。例えば生まれてから1週目および／または2週目および／または3週目および／または4週目および／または5週目に接種する。好ましくは子豚には生まれてから1週間以内または第3週目（例えば離乳時）に最初の接種する。この子豚にはそれから2〜4週間後にブースター注射をするのが好ましい。
【００５３】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００５４】
【実施例】
本発明の好ましい実施例の組換え体ポックスウイルスはポックスウイルスゲノムの必須でない部位にPCV2からのDNAの塩基配列を含む。この組換え体ポックスウイルスは異種PCV2遺伝子の遺伝子産物を発現する。特に、ORF2およびPCV2蛋白質をコードするORF1遺伝子を単離し、特徴付け、ALVAC（カナリア痘ベクター）組換え体中に挿入した。使用した分子生物学的方法はSambrook et al. (1989）に記載のものである。
【００５５】
細胞株およびウィルス菌株
Imp1010-Stoonと称されるPCV2の菌株については既に説明した（Meehan et al., 1998）。これはカナダで病気のブタの腸間膜リンパ節組織から単離した。PCV2ゲノムのクローニングはMeehan et al. (1998)に記載されている。PCV2ゲノムをEcoRI断片として含むプラスミドpGem7Z-Impl010-Stoon-EcoRI No.14をプラスミドpGem-7ZのEcoRIに挿入した (Promega, Madison, WI)。Imp1010-Stoon PCV2strainの完全なヌクレオチド配列はMeehan et al. (1998)により決定されている。これはGenBankから寄託番号AF055392で入手できる。
【００５６】
親のカナリア痘ウイルス（Rentschler菌株）はカナリアワクチン菌株である。このワクチン株は天然の分離菌をニワトリ胚繊維芽細胞上で200回以上の連続継代して弱毒化して得た。マスターウイルスシードを寒天で４回連続してプラーク精製し、一つのプラークのクローンを追加の５回連続した継代で増幅し、そのストック・ウィルスを試験管内組換えテストの親ウィルスとして使用した。プラーク精製したカナリア痘分離菌はALVACと称される。このALVACは1996年11月14日にAmerican Type Culture Collection, ATCCにブダペスト条約番号VR-2547で寄託されている。
【００５７】
ポックスウイルス組換え体の調製は下記の複数のステップで行った：（1）ポックスウイルスゲノム中の挿入位置の側面に位置する配列（"arms"）と2つのフランキングアームの間にクローニングサイト（MCS）を含む挿入プラスミドの構築（例えば実施例1を参照）、（2）異種遺伝子発現カセットが挿入されたMCS中への挿入プラスミドから成るドナープラスミドの構築（例えば実施例2〜5を参照）、（3）ドナープラスミドのアームと親ポックスウイルスのゲノムと間の細胞培養でのインビトロ組換えによって異種遺伝子発現カセットをポックスウイルスゲノムの該当位置へ挿入し、組換え体ウィルスのプラーク精製（例えば実施例6を参照）。
PMWSに対する動物の免疫化のためにPCV2組換え型免疫原をPCV1免疫原と一緒に使うことができる。最も単純なアプローチではPCV2免疫原なしにPCV1免疫原を使うことができる。
【００５８】
実施例1
C6位置のカナリア痘挿入プラスミドの構築
図1（配列番号：1）はカナリア痘ＤＮＡの3.7kbセグメントの配列である。配列解析の結果、C6Lと称されるORFは位置377で始まり、位置2254で終る。以下ではC6挿入プラスミドをC6 ORFを削除し、側面を転写および翻訳終結信号でフランクリングした多系交雑クローニングサイト(MCS)に代えて構築した。
【００５９】
380bp PCR断片はオリゴヌクレオチドプライマC6A1（配列番号：2）およびC6B1（配列番号：3）を用いてゲノムのカナリア痘ＤＮＡから増幅された。1155bp PCR断片はオリゴヌクレオチドプライマC6C1（配列番号：4）、C6D1（配列番号：5）を用いてゲノムのカナリア痘ＤＮＡから増幅した。380bpおよび1155bp断片をテンプレートとして加え、オリゴヌクレオチドプライマC6A1（配列番号：2）およびC6D1（配列番号：5）を用いて1613bp PCR断片を増幅した。この断片をSacIおよびKpnIで消化し、SacI/KpnIで消化したpBluescript SK + Strata遺伝子にリゲートした(La Jolla, CA, USA)。DNAの塩基配列の解析からプラスミドpC6Lが得られたことを確認した。
【００６０】
これはC6上流（「C6左腕」）の370bpのカナリア痘ＤＮＡ、種痘早期終結信号、6つの読み枠の翻訳ストップコードン、SmaI、PstI, XhoI、EcoRIを含むMCS、種痘早期終結信号、6つの読み枠の翻訳ストップコードンおよび下流（「C6右腕」）の1156bpのカナリア痘配列から成る。
【００６１】
プラスミドpJP099はpC6LのSmaI/EcoRI部位に異種遺伝子を組み込んだ種痘疹H6プロモータ（Taylor et al. (1988c), Guo et al. (1989) Perkus et al. 1989）に記載)を含むカセットをリゲートしてpC6Lから得た。
【００６２】
このプラスミドpJP099はユニークなEcoRV部位と、異種遺伝子のSTOPコードンとH6プロモータの3'端との間に位置したユニークなSalI部位と、異種遺伝子のSTOPコードンとC6左腕との間に位置したユニークなNruIサイトとを含んでいる。従って、このpJP099からの〜4.5kbのEcoRVlSaIIまたはNruI/SalI断片はプラスミド配列（pBluescript SK+、Stratagene, La Jolla, CA, USA）、2つのC6アーム、EcoRVまたはNruIサイトまでのH6プロモータの5'端を含む。
【００６３】
プライマの配列：
プライマC6A1（配列番号：2）
atcatcgagctcgcggccgcctatcaaaagtcttaatgagtt
プライマ C6B1 （配列番号：3）
gaattcctcgagctgcagcccgggtttttatagctaattagtcattttttcgtaagtaagtatttttatttaa
プライマ C6C1 （配列番号：4）
cccgggctgcagctcgaggaattctttttattgattaactagtcaaatgagtatatataattgaaaaagtaa
プライマ C6D1（配列番号：5）
gatgatggtaccttcataaatacaagtttgattaaacttaagttg
【００６４】
実施例2
PCV2 ORF2用のALVACDONORプラスミドの構築
プラスミドpGem-7Z中にEcoRI断片としてPCV2ゲノムを含むプラスミドpGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No.14をEcoRIで消化して、a1768bp断片を単離し、リゲートした。PCV2 ORF 2を適当なALVAC挿入ベクター中に挿入するためにプライマJP760（配列番号：6）およびJP773（配列番号：7）を用い、リゲートされた1768bp EcoRI断片（上記参照）からPCV2 ORF 2を増幅し、PCR J1304にした。プライマJP760（配列番号：6）はEcoRVからのH6プロモータの3'端とPCV2 ORF 2の5'端とを含む。プライマJP773（配列番号：7）はSalIサイトが続くPCV2 ORF 2の3'端を含む。次に、PCRJ1304の産物をEcoRVlSalIで消化し、pJP099から〜750 bp断片として〜4.5 kbのEcoRVlSalI断片にクローニングする（実施例1参照）。
【００６５】
得られたプラスミドは配列解析で確認し、pJP 102と名付けた（pJP 102、図2の地図および図3の配列（配列番号：8）を参照）。ORF 2の配列はGenBankから入手可能な配列（受入れ番号AF055392）とマッチした。ドナープラスミドpJP 102（NotIて線形化した）を試験管内組換え（IVR）テストで用い、ALVAC組換え体vCP 1614（実施例6を参照）を作った。
【００６６】
プライマの配列：
JP760（配列番号：6）
cat-cat-cat-gat-atc-cgt-taa-gtt-tgt-atc-gta-atg-acg-tat-cca-agg-agg-cg
JP773（配列番号：7)
tac-tac-tac-gtc-gac-tta-ggg-ttt-aag-tgg-ggg-gtc
【００６７】
実施例３
PCV2 ORF2およびORF1用のANALVACドナーPLASMIDFORの構築
PCV2 ORF 1は、プラスミドpGem7Z-ImplO10-Stoon-EcoRI No.14でプライマJP774（配列番号：9）およびJP775（配列番号：10）を用いてPCRで増幅してPCR J1311として得た。プライマーJP774（配列番号：9）はNruIからのH6プロモータを3'端に含み、5'端はPCV2 ORF1で終わる。プライマJP775（配列番号：10）はPCV2 ORF1を3'端に含み、それにSalIサイトが続く。PCR J1311（〜1 Kb）の産物をpCR2.1(Invitrogen、Carlsbad, CA)でクローニングする。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP104と名付ける。ORF1の配列はGenBankで入手可能な配列（Accession No. AF055392）とマッチした。pJP104から〜970bpのNruIlSalI断片を単離し、pJP099からの〜4.5 kb NruIlSalI断片でクローニングする（実施例1を参照）。得られたプラスミドを制限解析し、pJP105（図４参照）と名付けた。
【００６８】
このドナープラスミドpJP105は試験管内組換えテスト（実施例６に記載）でPCV2 ORF1を発現するALVAC組換え体を作るのに用いることができる。
pJP102（実施例2を参照）からの〜838bp BamHI/SalIをDNAポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いてブラントし、クレノーブラントしたpJP105のEcoRIサイトにクローニングする。クローンの挿入の向きを配列解析でチェックし、頭−頭の向きを選択した。このプラスミドを配列解析で確認し、pJP 107と名付けた（図5のpJP 107および図6の配列（配列番号：11）の地図を参照）。ドナープラスミドpJP107（NotIで線形化）を用いて試験管内組換えテスト（IVR）でALVAC組換え体vCP 1615（実施例6を参照）を得た。
【００６９】
プライマの配列：
JP774（配列番号：9）
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGG
JP775 （配列番号：10）
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG
【００７０】
実施例4
PCV1 ORF2のためのALVACドナープラスミドの構築
プラスミドpGem-7ZにPstI断片としてPCV1ゲノムを含む、プラスミドpPCV1（B. Meehan et al., J.Gen.Virol,1997.78.221-227）をテンプレートとして用いてPCV1 ORF2を増幅した。適当なALVAC挿入ベクターにPCV2 ORF 2を挿入するために、プライマJP787（配列番号：12）およびJP788（配列番号：13）を用いてプラスミドpPCV1（上記参照）からPCV1 ORF 2を増幅してPCR J1315を得た。プライマJP787(配列番号：12)は3'端にEcoRVからのH6プロモータとそれに続くSalIサイトORF 2を含む。PCR J1315の産物をEcoRVlSalIで消化し、〜750 bp断片としてpJP099（実施例1の上記参照）から〜4.5 kb EcoRVlSall断片にクローニングした。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP 13と名付けた。ORF 2の配列はGenBankで入手可能な配列（寄託No. U49186）とマッチした。ドナープラスミドpJP113（NotIで線形化)を用いて試験管内組換え（IVR）テストでALVAC組換え体vCP1621（実施例7参照）を得た。
【００７１】
プライマの配列：
JP787（配列番号：12）
CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CG
JP788 （配列番号：13）
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G
【００７２】
実施例５
PCV1 ORF2およびORF1のためのANALVACドナープラスミドの構築
プラスミドpGem-7Z中にPstI断片としてPCV1ゲノムを含むプラスミドpPCV 1（上記実施例４参照）をPstIで消化し、1759bp断片を単離し、リゲートした。
【００７３】
プライマJP789（配列番号：14）およびJP790（配列番号：15）を用いて、リゲートされた1759bp PstI断片からのPCV1 ORF1（上記参照）を増幅してinPCR J1316を得た。プライマJP789（配列番号：14）は3'端にNruIからのH6プロモータを含み、5'端にPCV1 ORF1を含む。プライマJP790（配列番号：15）は3'端にPCV1 ORF1端を含み、SalIsiteが続く。PCRJ1316の産物（〜1 Kb）をpCR2.1（Invitrogen、Carlsbad、CA）にクローニングする。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP 114と名付けた。ORF1の配列はGenBankで入手可能な配列（Accession No. U49186）とマッチした。〜970bpのNruI/SalI断片をpJPl 14から単離し、pJP099（実施例1参照）からの〜4.5kb NruIlSalI断片にクローニングした。得られたプラスミドを配列解析で確認し、pJP 115と名付けた。ドナープラスミドpJP 115を用いて試験管内組換えテスト（実施例7参照）でPCV1 ORF1を発現するALVAC組換え体を得た。
【００７４】
pJP113（実施例４を参照）からの〜838bp BamHllSallをDNAポリメラーゼのクレノーフラグメントを用いてブラントにし、pJP115のクレノー−ブラントしたEcoRIサイトにクローニングする。クローンの挿入の向きを配列解析でチェックし、頭−頭−の向きを選択した。このプラスミドを配列解析で確認し、pJP117と名付けた。このドナープラスミドpJPl17（NotIで線形化）を用いて試験管内組換え（IVR）テストでALVAC組換え体vCP1622を作った（実施例7を参照）。
【００７５】
プライマの配列：
JP789（配列番号：14）
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCCAAG-CAA-GAA-AAG-CGG
JP790（配列番号：15）
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG
【００７６】
実施例６
ALVAC-PCV2組換え体の作成
プラスミドpJP102（実施例２および図2を参照）およびpJP107（実施例３および図5を参照）をNotIを用いて線形にし、上記燐酸カルシウム沈降法（Panicali and Paoletti, 1982、Oiccini, et al., 1987）を用いてALVAC感染一次CEF細胞に形質移入した。PCV2特異的放射性プローブに対するハイブリッドをベースにしてポジティブプラークを選択し、純粋な母集団が得られるまでシーケンシャルなプラークの精製を４回行った。各IVRからの一つの代表プラークを増幅し、得られたALVAC組換え体をvCP1614およびvCP1615と名付けた。vCP1614ウィルスはALVACとドナープラスミドpJP102との間の組換の結果得られたもので、ALVAC C6位置に挿入されたPCV2 ORF2を含む。vCP1615ウィルスはALVACとドナープラスミドpJP107との間の組換の結果得られたもので、ALVAC C6位置に頭−頭の向きで挿入されたPCV2ORF2とORF1とを含む。
【００７７】
同様にして、実施例３に記載のドナープラスミドpJP105を使用してPCV2 ORF1のみを発現する組換え体ALVACを作ることもできる。
【００７８】
免疫蛍光法
免疫蛍光分析法（IF)で、ALVAC組換え体感染Vero細胞でPCV2蛋白が発現されるか否かを調べた。感染Vero細胞は汚染後のPBSで24時間洗浄し（m. o. i.＝約10）、室温で3分間の冷えた95％アセトンで固定した。最初の抗体としPCV2 ORF1（PCV2 199 1D3GA及びPCV2 210 7G5GD）またはORF2（PCV2190 4C7CF、PCV2 190 2B1BC及びPCV2 190 3A8BC）に特異的な５つのモノクローナル抗体（MAb）調合品（ハイブリドーマ上清）を使用した。
【００７９】
これらの特異的なモノクローナル抗体はMerial（Lyon）から得た。これらのモノクローナル抗体は下記の引用文献からも入手可能である：WO-A-99 18214 （1998）、フランス特許出願番号97/12382、98/00873、98/03707（それぞれ1997年10月3日、1998年1月22日、1998年3月20日出願)、W099/29717(
これらは本願明細書で引用したものとする）。IF反応はTaylor et al. (1990)に記載の方法で実行される。
【００８０】
３つのORF2-特異抗体とのPCV2特異免疫蛍光でvCP1614に感染した細胞およびvCP1615に感染した細胞を検出できる。２つのORF1-特異抗体とのPCV2特異免疫蛍光でvCP1615だけに感染した細胞を検出できる。これらの結果は、予想通り、vCP1614がORF2のみを発現し、vCP1615はORF1とORF2とを発現した。親のALVAC感染Vero細胞や未感染Vero細胞では蛍光は検出されなかった。
【００８１】
実施例７
ALVAC-PCV1組換え体の作成
プラスミドpJP 113（実施例４を参照）およびpJP117（実施例５を参照）をNotIで線形にし、上記燐酸カルシウム沈降法（Panicali and Paoletti, 1982、Oiccini, et al., 1987）を用いてALVAC感染一次CEF細胞に形質移入した。PCV1特異的放射性プローブに対するハイブリッドをベースにしてポジティブプラークを選択し、純粋な母集団が得られるまでシーケンシャルなプラークの精製を４回行った。各IVRから一つの代表プラークを増幅し、得られたALVAC組換え体をvCP1621およびvCP1622と名付けた。vCP1621ウィルスはALVACとドナープラスミドpJPl13との間の組換の結果であり、ALVAC C6位置に挿入されるPCV1 ORF2を含む。vCP1622ウィルスはALVACとドナープラスミドpJP17との間の組換の結果であり、ALVAC C6位置にヘッド−ヘッドの向きで挿入されたORF1PCV1およびORF2を含む。
同様にして、実施例５に記載のドナープラスミドpJP115を使用してPCV1 ORF1のみを発現する組換え体ALVACを作ることもできる。
【００８２】
免疫蛍光法
免疫蛍光分析法（IF)で、ALVAC組換え体感染Vero細胞でPCV1蛋白が発現されるか否かを調べた。感染Vero細胞は汚染後のPBSで24時間洗浄し（m. o. i.＝約10）、室温で3分間の冷えた95％アセトンで固定した。最初の抗体とし特異的抗-PCV1ブタ・ポリクローンの血清（Allan G. et. al. Vet. Microbiol. 1999.66：115-123）を使用した。IF反応はTaylor et al. (1990)に記載の方法で実行する。
【００８３】
PCV1特異的な免疫性蛍光はvCP1621に感染した細胞およびvCP1622に感染した細胞で検出できる。この結果は、予想通り、vCP1621およびvCP1622がPCV1-特異的な産物を発現することを示している。vCP1621に感染した細胞およびvCP1622に感染した細胞中のPCV2-特異的ブタポリクローン血清では蛍光は検出されなかった。親のALVAC感染Vero細胞および未感染のVero細胞でも蛍光は検出されなかった。
【００８４】
実施例８
ワクチンを製造するために、組換え体カナリア痘ウイルスCARBOPOLTM 974PおよびvCP1615（実施例６）をカルボマー溶液と混合する。同様に、組換え体カナリア痘ウイルスvCP1621およびvCP1622（実施例７）をカルボマー溶液と混合する。
【００８５】
本発明のブタのワクチン接種で使用するカルボマー成分はBFグッドリッチ社から市販のCarbopol（登録商標）974P（分子量3,000,000）である。Carbopol（登録商標）974P 1.5％保存溶液は先ず最初に１g/リットルの塩化ナトリウムを含む蒸留水に調製される。この保存溶液を用いて生理水中にCarbopol（登録商標）974Pを4mg/ml含む溶液を作る。保存溶液を必要な容積の生理水に一段階または複数のステップで混合して各ステップで１Ｎ（またはそれ以上の濃度）の水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ値を最終ｐＨ値の7.3〜7.4に調製する。この最終Carbopol（登録商標）974P溶液は凍結乾燥組換え体ウィルスの再構成や、濃縮組換え体ウィルスストックの希釈に直ちに使用できる溶液である。例えば、2mlの投与量当たり１０8 pfuを含む最終ウイルス懸濁液を得るには1.9mlの109fu/mlの保存溶液の0.1mlを上記の直ちに使用できる４mg/mlのCarbopol（登録商標）974P溶液に希釈する。同様に、直ちに使用できる２mg/mlのCarbopol（登録商標）974P溶液を用意することもできる。
【００８６】
実施例９
ブタの免疫化と抗原投与
9.1 1日齢の子豚の免疫化
帝王切開後１日目の子豚のグルプを集め隔離区画に入れ、２日目に子豚に各種ワクチン溶液を筋注で予防注射した。各ワクチンは組換え体ウィルスストックを無菌生理水（NaCl 0.9％）に希釈してウイルス懸濁液にした。ウイルス懸濁液の適切な濃度範囲は経験的に決定されるが、一般には106〜1010、好ましくは約1010（pfu/投与量）である。実施例８に記載のように、組換え体ウィルス懸濁液とCarbopol（登録商標）974P溶液とを混合してワクチン溶液を調製することもできる。
【００８７】
子豚は下記のいずれかで予防注射した：
組換え体ウィルスvCP1614（実施例2）
組換え体ウィルスvCP1615（実施例3）
組換え体ウィルスvCP1614とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
組換え体ウィルスvCP1615とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
ウイルス懸濁液は単位投与量当たり108プラーク形成単位（pfu）含む。各ウイルス懸濁液の1ml容積を筋肉経由で注射した。筋肉注射は首の筋に投与した。
【００８８】
実験の第２日と第４日の２回、ウイルス懸濁液を注射投与した。抗原投与は２１目にPCV-2毒性株の培養で得たウイルス懸濁液を経鼻投与して行った。抗原投与後、離乳後の全身的症候群の臨床徴候を見るために３週間、子豚をモニターした。下記の兆候を記録した：
【００８９】
直腸温： 抗原投与後、直腸温を２週間毎日モニターし、第３週目は２回測定した。
重量： 抗原投与直前に子豚を秤量し、その後最初の３週間、体重を測定した。
血液サンプルは実験後の第２日目、第14日目、第21日目、第28日目、第35日目および第42日目に採取してウイルス血症レベルおよび抗-PCV-2特異抗体滴定濃度をモニターした。
【００９０】
剖検： 生き残った全ての子豚を第42日目に人道的に安楽死させ、検死して特異的PWMS病変を肉眼で捜した。特異的組織の病変を捜すための組織サンプルは肝臓、リンパ節、脾臓、腎臓および胸腺から調製した。
【００９１】
9.2. 5〜7週齢の子豚の免疫化
母性の抗PCV-2特異抗体が無くなった5〜7週齢の成長した子豚に筋注で各種ワクチン溶液を予防注射した。ワクチン用ウイルス懸濁液は組換え体ウィルス・ストックを無菌の生理水（NaCI 0.9％）に希釈して作った。ワクチン溶液を実施例８に記載のように組換え体ウィルス懸濁液とCarbopol（登録商標）974P溶液とを混合して調製することもできる。
【００９２】
子豚には下記のいずれかを予防注射した：
組換え体ウィルスvCP1614（実施例2）
組換え体ウィルスvCP1615（実施例3）
組換え体ウィルスvCP1614とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
組換え体ウィルスvCP1615とCarbopol（4mg/ml溶液）との混合物
ウイルス懸濁液は単位投与量当たり108のプラーク形成単位（pfu）を含む。各ウイルスの懸濁液の2ml容積を筋肉に注射した。筋肉注射は首の筋に投与した。
【００９３】
実験の第0日目および第21日目にウイルス懸濁液を２回注射投与した。抗原投与は第３５日目にPCV-2毒性株の培養で得たウイルス懸濁液を経鼻投与して行った。抗原投与後、離乳後の全身的症候群の臨床徴候を見るために８週間、子豚をモニターした。実施例9.1に記載のものと同じ兆候を記録したが、モニタリング期間を３週間でなくて８週間にした。
【００９４】
実験中に抗原投与で死んだ子豚を剖検し、実験の最後（第97日目）には生き残った全ての子豚も剖検した。組織サンプルは実施例9.1に記載のものと同じである。
【００９５】
9.3.
新生児子豚の免疫化
帝王切開後０日目の３匹または４匹の子豚のグルプを集め隔離区画に入れ、２日目に子豚の首の横側に1mlのPBS中のvCP1614、vCP1615または親ALVACベクターを108 pfuの量で筋肉注射した。第14日目に第2回目のワクチン投与または偽薬投与をした。ALVAC組換え体のワクチン接種は子豚にじ宇分に寛容で、ワクチン接種の副作用の証拠は見られなかった。第21日目に子豚にPCV-2ウイルス性懸濁液を経鼻投与で各外鼻孔に1mlの抗原投与した。第45日目に剖検し、組織サンプルを集めてウィルスを単離した。
【００９６】
剖検の結果：
一般に、ＰＭＷＳはリンパ節症、特に、肝炎または腎炎によって特徴付けられる。従って、各子豚のリンパ節の腫れを以下の方法で分類した：
【００９７】
0 ＝大きなリンパ節は見えない
1 ＝気管支リンパに限定される普通のリンパ節拡大
2 ＝気管支リンパに限定される中程度のリンパ節拡大
3 ＝気管支、下顎骨下、肩甲線、鼠径部リンパ節まで拡大した激しいリンパ節拡大
【００９８】
【表1】
PCV-2の場合、気管支リンパ節症が目立った所見である。vCP 1614およびvCP 1615（p < 0.05）で免疫化した場合、対照群に関してリンパ節病変の有意な減少が観測される。
【０１００】
以上、本発明の好ましい実施例を細部に説明したが、本発明は特許請求の範囲で定義されるもので、上記の特定な細部に限定されるものではなく、本発明の精神または範囲から逸脱せずに種々の変更を行うことができるということは理解できよう。
【０１０１】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】 （配列番号1）はC6転写解読枠を含むALVACのＤＮＡの3.7キロ塩基対断片のヌクレオチド配列を示す図。
【図２】 pJP102ドナープラスミドの地図。
【図３】 （配列番号8）はpJP102ドナープラスミドからのKpnI（位置653）からSacI(位置3166）までの制限サイトの2.5キロ塩基対断片のヌクレオチド配列を示す図。
【図４】 pJP105のドナープラスミドの地図。
【図５】 pJP107ドナープラスミドの地図。
【図６】 （配列番号11）はpJP107ドナープラスミドからのKpnI（位置653）からSacI（位置4255）までの制限サイトの3.6キロ塩基対断片のヌクレオチド配列を示す図。
【配列表】
Claims (20)
- 組換えポックスウイルスと担体とを含む免疫組成物であって、上記組換えポックスウイルスは配列番号１に示す配列を有するＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスであり且つブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦをコードする単離されたＤＮＡ分子を含み、この単離されたＤＮＡ分子はＰＣＶ２のＯＲＦ２またはＰＣＶ２のＯＲＦ２とＰＣＶ２のＯＲＦ１を含み且つＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスのＣ６位置にあり、このＣ６位置は上記配列番号１の３７７〜２２５４位にあり、
ここで、ＰＣＶ２のＯＲＦ１は配列番号１１の２２４８〜３１９２位の配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９８〜１３４２）と８８％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされ、ＰＣＶ２のＯＲＦ２は配列番号１１の１１９７〜１８９８位の配列に相補な配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド１３８１〜１７６８及び１〜３１４）と８０％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする免疫組成物。 - 上記の単離されたＤＮＡ分子がＰＣＶ２のＯＲＦ２を含む請求項１に記載の免疫組成物。
- アジュバントをさらに含む請求項１又は２に記載の免疫組成物。
- アジュバントがカルボマー（Carbomer）である請求項３に記載の免疫組成物。
- ブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦをコードする単離されたＤＮＡ分子を含む組換えポックスウイルスの、ＰＣＶ２に対する免疫応答を成人ブタ、若いブタおよび妊娠したブタにおいて誘導するための免疫組成物製造での使用であって、
上記組換えポックスウイルスが配列番号１に示す配列を有するＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスであり、上記の単離されたＤＮＡ分子がＰＣＶ２のＯＲＦ２またはＰＣＶ２のＯＲＦ２とＰＣＶ２のＯＲＦ１を含み、この単離されたＤＮＡ分子は上記ＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスのＣ６位置にあり、このＣ６位置は上記配列番号１の３７７〜２２５４位にあり、
ここで、ＰＣＶ２のＯＲＦ１は配列番号１１の２２４８〜３１９２位の配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９８〜１３４２）と８８％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされ、ＰＣＶ２のＯＲＦ２は配列番号１１の１１９７〜１８９８位の配列に相補な配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド１３８１〜１７６８及び１〜３１４）と８０％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする使用。 - 交配前と妊娠中に雌ブタに接種する免疫組成物の製造での請求項５に記載の使用。
- 妊娠の６〜８週および／または妊娠の１１〜１３週の期間中に投与する免疫組成物の製造での請求項６に記載の使用。
- 新生児に受動免疫を授けるための免疫組成物の製造での請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
- 妊娠した雌ブタに接種し、次いで、生まれた子豚にも接種する免疫組成物の製造での請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
- 子豚に誕生から離乳までの間に投与する免疫組成物の製造での請求項５〜９のいずれか一項に記載の使用。
- 子豚に誕生から最初の週内または３週目以内に投与する免疫組成物の製造での請求項１０に記載の使用。
- 子豚に誕生から最初の週内または３週目以内に投与し、それから２〜４週間後に再度投与する免疫組成物の製造での請求項１１に記載の使用。
- 免疫組成物がアジュバントをさらに含む請求項５〜１２のいずれか一項に記載の使用。
- アジュバントがカルボマー（Carbomer）である請求項１２または１３に記載の使用。
- (i)組換えポックスウイルスと、(ii)担体とから成るワクチンであって、
上記組換えポックスウイルスが配列番号１に示す配列を有するＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスであり且つブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦをコードする単離されたＤＮＡ分子を含み、この単離されたＤＮＡ分子はＰＣＶ２のＯＲＦ２またはＰＣＶ２のＯＲＦ２とＰＣＶ２のＯＲＦ１を含み且つ上記ＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスのＣ６位置にあり、このＣ６位置は上記配列番号１の３７７〜２２５４位にあり、
ここで、ＰＣＶ２のＯＲＦ１は配列番号１１の２２４８〜３１９２位の配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９８〜１３４２）と８８％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされ、ＰＣＶ２のＯＲＦ２は配列番号１１の１１９７〜１８９８位の配列に相補な配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド１３８１〜１７６８及び１〜３１４）と８０％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とするワクチン。 - 上記の単離されたＤＮＡ分子がＰＣＶ２のＯＲＦ２を含む請求項１５に記載のワクチン。
- アジュバントをさらに含む請求項１５又は１６に記載のワクチン。
- アジュバントがカルボマー（Carbomer）である請求項１７に記載のワクチン。
- 免疫組成物を用いて成人ブタ、若いブタおよび妊娠したブタにＰＣＶ２に対する免疫応答を誘導する方法であって、
上記免疫組成物が(i)組換えポックスウイルスと、(ii)担体とから成り、上記組換えポックスウイルスは配列番号１に示す配列を有するＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスであり且つブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦをコードする単離されたＤＮＡ分子を含み、この単離されたＤＮＡ分子はＰＣＶ２のＯＲＦ２またはＰＣＶ２のＯＲＦ２とＰＣＶ２のＯＲＦ１を含み且つ上記ＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスのＣ６位置にあり、このＣ６位置が配列番号１の３７７〜２２５４位にあり、
ここで、ＰＣＶ２のＯＲＦ１は配列番号１１の２２４８〜３１９２位の配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９８〜１３４２）と８８％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされ、ＰＣＶ２のＯＲＦ２は配列番号１１の１１９７〜１８９８位の配列に相補な配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド１３８１〜１７６８及び１〜３１４）と８０％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする方法。 - ワクチンを用いて成人ブタ、若いブタおよび妊娠したブタにＰＣＶ２に対する免疫応答を誘導する方法であって、
上記ワクチンが(i)組換えポックスウイルスと、(ii)担体とから成り、上記組換えポックスウイルスが配列番号１に示す配列を有するＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスであり且つブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）のＯＲＦをコードする単離されたＤＮＡ分子を含み、この単離されたＤＮＡ分子はＰＣＶ２のＯＲＦ２またはＰＣＶ２のＯＲＦ２とＰＣＶ２のＯＲＦ１を含み且つ上記ＡＬＶＡＣカナリア・ポックスウィルスのＣ６位置にあり、このＣ６位置が配列番号１の３７７〜２２５４位にあり、
ここで、ＰＣＶ２のＯＲＦ１は配列番号１１の２２４８〜３１９２位の配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド３９８〜１３４２）と８８％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされ、ＰＣＶ２のＯＲＦ２は配列番号１１の１１９７〜１８９８位の配列に相補な配列（Ｇｅｎｂａｎｋの番号ＡＦ５５３９２のヌクレオチド配列のヌクレオチド１３８１〜１７６８及び１〜３１４）と８０％以上のホモロジーを有するヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする方法。
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