KR20130008645A - 광견병 바이러스 항원을 함유하는 파라폭스바이러스 벡터 - Google Patents

광견병 바이러스 항원을 함유하는 파라폭스바이러스 벡터 Download PDF

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KR20130008645A
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에이에이치 유에스에이 42 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 게놈을 보유하는 재조합 파라폭스바이러스, 이러한 구축물의 제조, 면역원성 조성물 및 백신에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 진단을 위한 재조합 파라폭스바이러스의 용도에 관한 것이다.

Description

광견병 바이러스 항원을 함유하는 파라폭스바이러스 벡터{PARAPOXVIRUS VECTORS CONTAINING RABIES VIRUS ANTIGEN}
본 발명은 광견병 바이러스(RV)로부터 유래된 이종 DNA를 함유하는 재조합 파라폭스바이러스, 및 면역원성 조성물 및 백신에 있어서 이의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 광견병 바이러스에 의해 야기된 질환에 대해 백신접종하거나, 상기 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 진단을 위한 재조합 파라폭스바이러스의 용도에 관한 것이다.
폭스비리대(Poxviridae) 과(family)의 바이러스는 타원형의 꽤 큰 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 파라폭스바이러스(PPV) 속은 이들 바이러스들에 포함된다. 이들은 약 220 nm 내지 300 nm의 길이 및 140 nm 내지 170 nm의 폭을 갖는 것으로 측정된다. 이들은 이들을 다른 폭스바이러스로부터 구별시켜주는 독특한 나선 피막을 보유한다.
PPV는 3개의 상이한 종으로 나누어진다. 그러나, 이들 바이러스들이 파라폭스바이러스 속 내의 독립적인 종인지 아니면 이들이 동일한 종인지가 아직 명확히 확인되지 않았다. 제1종인 파라폭스바이러스 오비스(Parapoxvirus ovis)는 상기 속의 원형으로서 간주된다. 또한, 상기 종은 전염성 농창(ecthyma contagiosum) 바이러스, 전염성 농포성 피부염 바이러스 또는 양아구창(orf) 바이러스로도 지칭된다. 제2종인 파라폭스바이러스 보비스(Parapoxvirus bovis) 1은 소 유행성 구내염 바이러스 또는 구진성 구내염 바이러스로도 지칭된다. 제3종인 파라폭스바이러스 보비스 2는 우더폭스바이러스(udderpoxvirus), 파라백시니아(paravaccinia) 바이러스, 슈도카우폭스(pseudocowpox) 바이러스 또는 착유부결절(milker's nodule) 바이러스로도 지칭된다.
파라폭스바이러스 종은 반추동물 고유의 종이다. PPV는 붉은 사슴, 순록, 붉은 다람쥐 및 점박이 바다표범에서 발견된다. PPV에 의한 감염은 동물 및 인간 둘다에서 국소성 질환을 야기할 수 있다. PPV 종의 동물원성 감염증 숙주는 양, 염소 및 소이다. 이들은 상처형성 없이 치유되는 국소화된 표피 병소와 반응하면서 감염된 동물과의 직접적인 접촉을 통해 인간에서 감염을 야기한다. 예방 조치, 예컨대, 백신을 사용하여 상기 질환을 제어할 수 있다.
조류폭스(avipox), 라쿤폭스(racoonpox), 카프리폭스(capripox), 돼지폭스(swinepox) 또는 백시니아 바이러스에 기초하여 외래 유전 정보를 발현시키기 위한 벡터가 이미 공지되어 있다(미국 특허 제5,942,235호 및 제7,094,412호 참조). 파라폭스바이러스는 벡터 백신에서 사용될 수 있는 다양한 후보들을 대표한다. 그러나, 폭스바이러스의 개별 속들 사이의 형태적 차이, 구조적 차이 및 유전적 차이 때문에, 이들 폭스 바이러스들에 대해 이용되는 방법은 파라폭스바이러스에 대해 이용될 수 없다. 이러한 차이의 한 예는 ORFV가 다양한 오르토폭스바이러스들에서 재조합체의 선택에 사용되는 티미딘 키나제(TK) 유전자를 결여하고 있다는 것이다. 또한, 몇몇 폭스바이러스는 표면 단백질인 해마글루티닌에 의해 매개되는, 적혈구를 응집시키는 능력을 갖지만, 파라폭스바이러스는 이 능력을 갖지 않는다.
PPV는 척추동물에서 일반화된(비-특이적) 면역 반응을 자극하기 때문에 면역조절 효과를 나타낼 수 있다. 이 바이러스는 동물에서 일반적인 저항성을 증가시키기 위해 수의학에서 성공적으로 사용되고 있다. 이 바이러스는 동종 항원 및/또는 이종 항원과 조합되어, 수개월 내지 수년 동안 지속되는 병원체 특이적 효과뿐만 아니라 신속한 비-병원체 특이적 효과를 나타내는 백신을 제공할 수 있다.
파라폭스바이러스 오비스는 미국 특허 제6,365,393호 및 문헌[Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145]에 기재된 바와 같이 벡터로서 이미 사용되고 있다. 이 바이러스는 벡터로서 사용되었을 때 매우 좁은 숙주 범위, 전신 감염의 결여, 단기간의 벡터 특이적 면역(반복된 면역화를 허용함), 조기 백신접종(면역의 유도가 모체 항체의 존재 하에 개시될 수 있음), 및 유리한 면역 조절 성질을 포함하는 현저한 장점을 제공한다. 본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 위한 벡터로서 파라폭스바이러스의 사용에 관한 것이다.
파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701은 야생형 바이러스의 역가에 필적할만한 역가로 세포 배양물에서 증식될 수 있는 고도로 약독화된 균주이다. 이 균주는 감염성 벡터 바이러스의 복제를 뒷받침하는 숙주(예를 들면, 양 및 염소), 및 상기 복제를 뒷받침하지 않는 숙주(예를 들면, 개, 돼지, 말, 마우스 및 래트) 둘다에서 현저한 면역 자극 성질을 나타낸다. 베이파뮨(Baypamune)(등록상표)으로서 이전에 공지된 자일렉시스(Zylexis)(등록상표)는 균주 D1701로부터 유래된 화학적으로 불활성화된 파라폭스바이러스 오비스의 제제이고 감염성 질환의 예방, 방제(metaphylaxis) 및 치유적 치료에 사용되고 동물에서 스트레스에 의해 유도된 질환의 예방에 사용된다.
신경친화성 리사바이러스(lyssavirus)인 광견병 바이러스(RV)는 라브도비리대(Rabdoviridae) 과의 한 구성원이다. 이 바이러스는 인간 및 다른 포유동물에서 치명적 질환을 야기하는 신경친화성 바이러스이다. 광견병은 대다수의 경우 광견병 동물에게 물림으로써 전염되고, 이 전염은 동물의 타액을 통해 일어난다. 매년 미국 질병통제예방센터(CDC)에 보고된 광견병 사례의 대다수가 야생 동물, 예컨대, 라쿤, 스컹크, 박쥐 및 여우에서 발생된다. 광견병은 특히 개발도상국에서 여전히 매우 유행하는 질환이다. 매년 약 50,000명의 사람들이 광견병으로 사망한다. 인간에 대한 가장 높은 감염 위험은 광견병 개이다.
광견병 바이러스는 하기 5종의 단백질을 코딩하는 단일 가닥 음성 센스 RNA 바이러스이다: 핵단백질(N), 인단백질(P), 매트릭스 단백질(M), 당단백질(G) 및 중합효소(L). 길이가 평균 약 180 nm이고 폭이 평균 75 nm인 성숙 총탄형 바이러스는 리보핵단백질 코어, 단백질 피막 및 지질 외피를 갖는다. 길이가 약 5 nm 내지 10 nm이고 직경이 약 3 nm인 당단백질 돌출부(projection)가 상기 바이러스의 외부 표면을 덮는다. 상기 돌출부는 약 400개의 조밀하게 정렬된 삼량체 스파이크(spike)를 형성한다.
RV는 신경 조직에 대한 높은 친화성을 나타낸다. 이것에 대한 이유는 공지되어 있지 않다. 그러나, 광견병 바이러스 G 단백질이 아세틸콜린 수용체(신경전달물질 수용체)에 결합할 수 있는 가능성이 있다. RV는 바이러스 G 단백질을 통해 숙주 세포에 부착된 후 탐식(engulfment)에 의해 상기 세포 내로 흡수된다.
본 발명은 일반적으로 재조합 파라폭스바이러스, 특히 파라폭스바이러스 오비스(PPVO)에 관한 것이다. 재조합 파라폭스바이러스는 광견병 바이러스에 대한 신속한 선천성 면역 반응뿐만 아니라 장기 지속 외래 유전자 특이적 면역을 매개하는 데에 사용된다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 광견병 바이러스의 G 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접 비-코딩 서열 내에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG이다.
본 발명은 이종 DNA를 파라폭스바이러스의 게놈 내로 삽입하는 단계를 포함하는, 재조합 파라폭스바이러스를 제조하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 파라폭스바이러스 오비스의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V의 사용을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 이종 DNA는 광견병 바이러스의 G 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법에서 사용된 이종 DNA는 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접 비-코딩 서열 내에 삽입된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG의 제조를 포함한다.
본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스와 담체를 조합하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 백신을 포함한다. 본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스와 담체를 조합하는 단계를 포함하는, 백신을 제조하는 방법을 포함한다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함하는 반면, 몇몇 실시양태에서 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함하고, 다른 실시양태에서 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 이종 DNA는 광견병 바이러스의 G 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 반면, 다른 실시양태에서 이종 DNA는 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 이들 실시양태들 중 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접 비-코딩 서열 내에 삽입된다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG이다.
본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 면역학적 효과량의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서 광견병 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 치료적 효과량의 백신 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 광견병 바이러스에 대해 상기 동물을 백신접종하는 방법을 포함한다. 본 발명은 동물에서 광견병 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다. 본 발명은 광견병 바이러스에 대해 동물을 백신접종하기 위한 약제의 제조에 있어서 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함하는 반면, 몇몇 실시양태에서 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함하고, 다른 실시양태에서 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 이종 DNA는 광견병 바이러스의 G 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자를 포함하는 반면, 다른 실시양태에서 이종 DNA는 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 이들 실시양태들 중 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접 비-코딩 서열 내에 삽입된다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG이다. 이들 실시양태들 중 몇몇 실시양태에서, 항-G 단백질 특이적 보호 면역 반응이 유도된다. 다른 이러한 실시양태에서, 면역 반응은 항-G 단백질 혈청 항체의 유도이다. 다른 이러한 실시양태에서, 상기 유도는 ㎖ 당 0.5 국제 단위(International Unit) 초과의 항체 역가를 발생시킨다.
본 발명은 동물에 존재하는 파라폭스바이러스의 기원을 확인하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 파라폭스바이러스는 그의 게놈 조성 및 발현된 단백질 둘다에서 야생형 균주로부터 구별될 수 있다. 이러한 차이는 백신접종된 동물과 감염된 동물 사이의 구별을 가능하게 한다. 본 발명은 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하는 분석(DIVA 분석)에 있어서 본원에 교시된 재조합 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG는 DIVA 분석에서 사용된다.
이들 실시양태들 및 다른 실시양태들은 하기 상세한 설명에 의해 개시되고 포함된다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 플라스미드 pdV-RabG의 구축을 보여준다. 광견병 바이러스의 G 단백질을 BamHI-EcoRI 단편으로서 pdV-Rec1의 다중 클로닝 부위(상자 내에 기재된 염기) 내로 삽입하여 플라스미드 pdV-RabG(7.7 kbp의 크기)를 발생시킨다. 프라이머 ORF32N(서열번호 1) 및 ORF31N(서열번호 2)의 위치가 표시되어 있다. 서열번호 3은 도면에 표시되어 있다.
약어: Sm = SmaI, H3 = HindIII, EcoV = EcoRV, P = PstI, B = BamHI, K = KpnI, E = EcoRI, S = SalI. F9L 및 ORF3은 PPVO 유전자 F9L(ORF 131) 및 ORF3(ORF 133)의 존재를 표시한다. Pvegf는 삽입된 G 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용된 vegF -E 프라이머의 존재를 표시한다. (P) 및 (H3)은 플라스미드 pSPT-18의 벡터 골격의 파괴된 PstI 및 HindIII 제한 부위를 보여주고, pSPT-18의 T7 프로모터 및 SP6 프로모터가 각각 표시되어 있다. 도면은 일정한 비율로 확대되거나 축소되어 있지 않다.
도 2는 상이한 투여량의 D1701-V-RabG를 사용한 면역화 후 바이러스 혈청 중화 항체(SNT) 반응을 보여준다. 107 PFU(플라크 형성 단위)(2a), 106 PFU(2b), 105 PFU(2c) 및 104 PFU(2d)를 이용하여 C57/BL6 마우스 군(1일 당 n = 6 또는 7)을 단회 투여량의 D1701-V-RabG로 면역화시켰다. 개별 혈청을 면역화 후 14일 동안(d1 내지 d14) 매일 채취하였다.
도 3은 면역화된 마우스의 챌린지(Challenge) 실험을 보여준다. C57/BL6 마우스에게 표시된 바와 같이(107 내지 104 PFU) 단회 투여량의 D1701-V-RabG를 제공하였고, 2주 후 3,400 LD50(4.8 X 105 PFU) 이상의 RV 병독성 균주 CVS를 사용하여 두개내로 챌린지 감염시켰다. (3a)는 각각의 군에서 개별 동물들의 생존 곡선을 보여주는 반면, (3b)에는 상기 생존 곡선의 결과가 생존자의 백분율로 작도되어 있다.
도 4는 서열번호 4(광견병 바이러스의 G 유전자의 전장 코딩 영역(1575개의 뉴클레오티드)의 서열 플러스 제한효소 분석(BamHI 및 EcoRI)을 위한 링커 서열로서 5' 말단 상의 7개의 뉴클레오티드 및 3' 말단 상의 6개의 뉴클레오티드)를 보여준다.
도 5는 보호 면역을 위한 T 세포의 역할을 보여준다. CD4-Imm은 CD4 세포에 대한 특이성을 나타내는 항혈청으로 면역화된 군이다. CD8-Imm은 CD8 T 세포에 대한 특이성을 나타내는 항혈청으로 면역화된 군이다. CD4/8-Imm은 CD4/CD8 T 세포에 대한 특이성을 나타내는 항혈청으로 면역화된 군이다. Imm C는 항혈청을 제공받지 않은, D1701-V-RabG로 백신접종된 대조군이다. 비-Imm C는 D1701-V-RabG로 백신접종되지 않았고 항혈청을 제공받지 않은 대조군이다. "챌린지 후 날짜"는 광견병 균주 CVS를 사용한 챌린지 후 날짜의 수이다.
도 6은 노출 후 백신접종을 이용하였을 때 관찰된 보호를 보여준다. 비-Imm은 D1701-V-RabG로 백신접종되지 않은 대조군이다. D1701-V-RabG는 D1701-V-RabG로 백신접종된 군이다. CVS는 병독성 광견병 바이러스 균주이다. "챌린지 후 날짜"는 RV 균주 CVS를 사용한 챌린지 후 날짜의 수이다.
도 7은 다양한 노출 후 백신접종 섭생법들을 이용하였을 때 관찰된 보호를 보여준다. 회색 정사각형은 마우스를 D1701-V-RabG로 백신접종한 날짜를 표시한다.
도 8은 면역화 후 6일째 날 및 13일째 날 혈청 항체 반응(혈청 중화 항체(SNT)로서 측정됨)을 보여준다. D1701-V-RabG를 사용하여 마우스를 질내(i.vag.), 난절법, 복강내(i.p.), 피내(i.d.), 비강내(i.n.), 피하(s.c.), 근육내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.)로 면역화시켰다.
본원에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥이 달리 요구하지 않은 한, 단수형은 복수형을 포함할 것이고 복수형은 단수형을 포함할 것이다.
하기 정의는 본 발명의 실시양태의 설명에서 사용된 용어들에 적용될 수 있다. 이 정의는 본원에 참고로 도입되는 각각의 개별 참고문헌에 함유된 임의의 모순되는 정의를 대체한다.
측정가능한 수치적 변수와 관련하여 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은, "약"이 주 단위의 시간 간격을 언급하기 위해(이때, "약 3주"는 17일 내지 25일이고, 약 2주 내지 약 4주는 10일 내지 40일임) 사용되지 않은 한, 변수의 표시된 값뿐만 아니라 표시된 값의 실험 오차(예를 들면, 평균에 대한 95% 신뢰 구간) 또는 표시된 값의 10%(이들 둘 중 보다 큰 값) 이내에 있는 변수의 모든 값들을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "항원보강제(adjuvant)"는 면역 반응의 비-특이적 자극제로서 작용하는 임의의 물질을 의미한다. 항원보강제의 추가 설명에 대해서는 하기를 참조한다.
본원에서 사용된 용어 "동물" 또는 "동물 대상체"는 가축 포유동물 및 야생 포유동물 둘다를 포함하는, 광견병 감염에 민감한 임의의 동물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 공급원, 제조 방법 또는 다른 특성과 관계없이 항원 결정 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드이다. 이 용어는 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 상기 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자 또는 이의 단편을 의미한다. 면역글로불린은 "불변" 영역 및 "가변" 영역을 갖는 "경쇄" 및 "중쇄" 폴리펩티드로 구성된 혈청 단백질이고 불변 영역의 조성에 기초하여 클래스(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)로 나누어진다. 주어진 항원에 대한 "특이성"을 나타내는 항체는 항체의 가변 영역이 특이적 항원만을 인식하여 결합한다는 것을 의미한다. 항체는 다클론 혼합물 또는 단일클론 항체일 수 있다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있거나 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. "항체"는 항체 단편을 포함하지만 이로 한정되지 않는 항원 결합 단백질로 전환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항원" 또는 "면역원"은 대상체에 노출되었을 때 항원에 대한 특이성을 나타내는 면역 반응을 유도할 하나 이상의 에피토프(선형 에피토프, 입체구조적 에피토프 또는 이들 둘다)를 함유하는 분자를 의미한다. 용어 "항원"은 약독화된, 불활성화된 또는 변형된 생 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 또는 다른 미생물을 의미할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "항원"은 천연 상태에서 항원과 회합되어 있는 전체 유기체로부터 분리되어 별개로 존재하는 하위유닛(subunit) 항원을 의미할 수도 있다. 또한, 용어 "항원"은 항체, 예컨대, 항-이디오타입(idiotype) 항체 또는 이의 단편, 및 항원 또는 항원성 결정인자(에피토프)를 모방할 수 있는 합성 펩티드 미모토프(mimotope)를 의미한다. 용어 "항원"은 예컨대, DNA 면역화 적용에서와 같이 생체내에서 항원 또는 항원성 결정인자를 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미할 수도 있다.
"완충제"는 또 다른 화학물질의 농도 변화를 방지하는 화학적 시스템, 예를 들면, 수소 이온 농도(pH)의 현저한 변화를 방지하는 완충제로서 작용하는 양성자 공여체 및 수용체 시스템을 의미한다. 완충제의 추가 예는 약산과 이의 염의 혼합물(접합체 염기), 또는 약염기와 이의 염의 혼합물(접합체 산)을 함유하는 용액이다.
본원에서 사용된 용어 "세포주" 또는 "숙주 세포"는 바이러스가 복제될 수 있고 유지될 수 있는 원핵세포 또는 진핵세포를 의미한다.
"세포 면역 반응" 또는 "세포 매개 면역 반응"은 T 림프구 또는 다른 백혈 세포 또는 이들 둘다에 의해 매개되는 면역 반응이고 활성화된 T 세포, 백혈 세포 또는 이들 둘다에 의해 생성된 사이토카인, 케모카인 및 유사한 분자의 생성을 포함한다.
"보존 치환"은 당업계에서 정의되어 있고 당업자에게 공지되어 있으며 잔기의 관련 물성에 따라 잔기를 분류하는 것으로 인식되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "배양"은 다른 종 또는 유형의 부재 하에서 성장하는 세포 또는 미생물의 집단을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "DIVA"는 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하는 것을 의미한다.
"투여량"은 대상체에게 제공된 백신 또는 면역원성 조성물을 의미한다. "제1 투여량" 또는 "프라이밍(priming) 백신"은 0일째 날에 제공된 상기 조성물의 투여량을 의미한다. "제2 투여량", "제3 투여량", "년간(annual) 투여량"은 제1 투여량 후 제공된 상기 조성물의 투여량을 의미하고, 이 투여량은 제1 투여량과 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있는 백신 또는 면역원성 조성물의 투여량이다.
"에피토프"는 T 세포 수용체 또는 특이적 항체에 결합하는 항원의 특이적 부위이고 전형적으로 약 3개의 아미노산 잔기 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 포함한다.
"부형제"는 항원이 아닌 백신 또는 면역원성 조성물의 임의의 성분을 의미한다.
"단편"은 단백질 또는 유전자의 절두된(truncated) 부분을 의미한다. "기능성 단편" 및 "생물학적 활성 단편"은 전장 단백질 또는 유전자의 생물학적 성질을 보유하는 단편을 의미한다. "면역학적 활성 단편"은 면역 반응을 이끌어내는 단편을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "G 단백질"은 광견병 바이러스의 외부 표면을 덮는 당단백질 돌출부의 단백질을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "이종"은 상이한 종 또는 균주로부터 유래되었음을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "동종"은 동일한 종 또는 균주로부터 유래되었음을 의미한다.
"상동성" 또는 "% 상동성"은 서열들을 정렬하고 필요하다면 최대 % 서열 동일성을 달성하기 위해 갭(gap)을 도입하고 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려한 후 비교대상 서열 내의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미한다.
"체액성 면역 반응"은 적어도 부분적으로 항체에 의해 매개되는 면역 반응을 의미한다.
"동일성" 또는 "% 동일성"은 두 서열들을 정렬하고 필요하다면 최대 % 서열 동일성을 달성하기 위해 갭(gap)을 도입하고 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후 비교대상 서열 내의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율을 의미한다.
대상체에서 "면역 반응"은 항원에 대한 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응, 또는 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응의 발생을 의미한다. 면역원성 반응은 진단 목적 또는 다른 시험에 충분할 수 있거나 질환 유발제에 의한 감염에 의해 야기되는 불리한 건강 효과 또는 이의 합병증을 포함하는 질환의 징후 또는 증상을 예방하는 데에 적합할 수 있다. 면역 반응은 통상적으로 당업계에서 공지되어 있는 표준 면역분석 및 중화분석을 이용함으로써 측정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "면역원적" 또는 "면역원성"은 항원에 대해 특이적으로 유도된 면역 반응을 이끌어내는 능력을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "면역원성 조성물", "면역학적 효과량" 또는 "면역 반응을 일으키기에 효과적인 양"은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 동물에게 투여되었을 때 특이적 면역 반응을 발생시키는(즉, 면역원적 활성을 나타내는), 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 조성물 또는 항원을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "단리된"은 단독으로 또는 이종 숙주 세포에서 그의 천연 환경, 또는 염색체 또는 벡터(예를 들면, 플라스미드, 파지 등)로부터 제거되어 있음을 의미한다. "단리된 박테리아", "단리된 혐기성 박테리아", "단리된 박테리아 균주", "단리된 바이러스", "단리된 바이러스 균주" 등은 박테리아 또는 바이러스가 다른 미생물, 예를 들면, 배양물 중의 다른 미생물을 실질적으로 갖지 않는, 예컨대, 그의 천연 환경으로부터 분리되어 있는 경우의 조성물을 의미한다. 임의의 구체적으로 정의된 물질, 예컨대, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 물질, 예컨대, 폴리펩티드 또는 핵산이 통상적으로 발견되는 원래의 세포 환경으로부터 분리되어 있는 물질을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 사용하여 구축한 재조합 세포주는 "단리된" 핵산을 사용한다. 대안적으로, 특정 단백질 또는 특이적 면역원성 단편이 백신 또는 다른 조성물로서 청구되거나 사용되는 경우, 상기 단백질 또는 면역원성 단편은 이것이 천연 상태에서 어떻게 존재할 수 있는지와 비교될 때 확인되었고 분리되었고 어느 정도까지 정제되었기 때문에 단리된 것으로 간주될 것이다. 상기 단백질 또는 이의 특이적 면역원성 단편은 항원을 생성하는 재조합 박테리아 또는 진핵 발현 벡터에서 생성되는 경우, 단리된 단백질 또는 핵산으로서 존재하는 것으로서 간주된다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 사용하여 구축한 재조합 세포주는 "단리된" 핵산을 사용한다.
"약제"는 질환의 예방, 치유 또는 개선, 또는 몇몇 생리학적 병태 또는 발병의 예방에 유용한 임의의 물질을 의미한다.
용어 "감염 다중도"(MOI)는 얼마나 많은 접종물이 주어진 감염에서 사용될 것인지를 상세히 표시하는 세포 당 유기체 수의 비를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "파라폭스바이러스" 및 "파라폭스바이러스 균주"는 폭스비리대 과 및 파라폭스바이러스 속에 속하는 바이러스를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "파라폭스바이러스 오비스" 및 "파라폭스바이러스 ORFV"는 폭스비리대 과, 파라폭스바이러스 속 및 파라폭스바이러스 오비스 종에 속하는 바이러스를 의미한다. 이들 바이러스들은 전염성 농창 바이러스, 전염성 농포성 피부염 바이러스 또는 양아구창 바이러스로도 지칭된다. 이들은 이들을 다른 폭스바이러스와 구별시켜주는 독특한 나선 피막을 보유한다.
용어 "파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701"은 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제6,365,393호에 기재된 바이러스를 의미한다. 용어 "파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V"는 원숭이 세포주 베로(Vero)에 적합하게 개조된 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 의미한다.
"비경구 투여"는 소화관을 포함하지 않는 경로를 통해 또는 이 경로에 의해 물질, 예컨대, 백신이 대상체의 신체 내로 도입되는 것을 의미한다. 비경구 투여는 피하, 근육내, 경피, 피내, 복강내, 안구내 및 정맥내 투여를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "병원체" 또는 "병원성 미생물"은 그의 숙주 동물 내에서 질환, 질병 또는 비정상적인 상태를 유도할 수 있거나 야기할 수 있는 미생물, 예를 들면, 광견병 바이러스를 의미한다.
"약학적으로 허용가능한"은 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 적당한 이익-대-위험 비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등을 야기하지 않으면서 대상체의 조직과 접촉되어 사용되기에 적합하고 그들의 의도된 용도에 효과적인 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리대 과에 속하는 바이러스를 의미한다. 이들 바이러스들은 타원형의 꽤 큰 이중 가닥 DNA 바이러스이다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드 분자"는 쇄 형태로 공유결합된 뉴클레오티드 단량체들로 구성된 유기 중합체 분자를 의미한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)은 상이한 생물학적 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드의 예이다.
본원에서 사용된 용어 "예방한다", "예방하는" 또는 "예방" 등은 미생물의 복제를 억제하거나, 미생물의 전염을 억제하거나, 미생물이 그의 숙주 내에서 스스로 확립하는 것을 억제하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 이들 용어들 등은 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상을 억제하거나 차단하는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 미생물 부하(load)의 감소가 있는 경우 치유적 치료로서 간주된다.
백신 또는 다른 조성물과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "보호", "보호하는" 등은 상기 백신 또는 조성물이 이 백신 또는 조성물에서 사용된 항원(들)의 기원이 되는 유기체에 의해 야기된 질환의 증상을 예방하거나 감소시킨다는 것을 의미한다. 또한, 용어 "보호" 및 "보호하는" 등은 상기 백신 또는 조성물이 대상체에 이미 존재하는 질환 또는 이 질환의 하나 이상의 증상을 치유적으로 치료하는 데에 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "광견병 바이러스"는 라브도비리대 과의 한 구성원인 신경친화성 리사바이러스를 의미한다. 이 바이러스는 그의 외부 표면 상에서 당단백질 돌출부를 갖는 단일 가닥 음성 센스 RNA 바이러스이다.
"재조합 PPV" 또는 "재조합체 PPV"는 그들의 게놈 내에 삽입 및/또는 결실을 갖는 PPV이다. 상기 삽입 및 결실은 분자생물학적 방법을 이용함으로써 제조된다.
"종 상동체(homolog)"는 상당한 폴리뉴클레오티드 서열 상동성을 보유하고 동일한 또는 유사한 생물학적 기능 및/또는 성질을 보유하는, 둘 이상의 상이한 종에서 발견된 유전자를 포함한다. 바람직하게는, 종 상동체를 대표하는 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 중간 엄격도 조건 하에서 혼성화될 것이고 동일한 또는 유사한 생물학적 활성 및/또는 성질을 보유할 것이다. 또 다른 양태에서, 종 상동체를 대표하는 폴리뉴클레오티드는 약 60% 초과의 서열 상동성, 약 70% 초과의 서열 상동성, 약 80% 초과의 서열 상동성, 약 90% 초과의 서열 상동성, 약 95% 초과의 서열 상동성, 약 96% 초과의 서열 상동성, 약 97% 초과의 서열 상동성, 약 98% 초과의 서열 상동성 또는 약 99% 초과의 서열 상동성을 공유할 것이다.
용어 "특이적 결합", "특이적으로 결합한다" 등은 생리학적 또는 분석 조건 하에서 측정될 수 있고 선택적인 복합체를 형성하는 둘 이상의 분자로서 정의된다. 항체 또는 다른 억제제는 이러한 결합이 적절하게 선택된 조건 하에서 실질적으로 억제되지 않는 반면, 동시에 비-특이적 결합이 억제되는 경우 단백질"에 특이적으로 결합한다"고 기재된다. 특이적 결합은 높은 친화성을 특징으로 하고 화합물 또는 단백질에 대해 선택적이다. 비-특이적 결합은 통상적으로 낮은 친화성을 나타낸다. 예를 들면, IgG 항체에서 결합은 일반적으로 약 10-7 M 이상, 예컨대, 약 10-8 M 이상, 약 10-9 M 이상, 약 10-10 M 이상, 약 10-11 M 이상 또는 약 10-12 M 이상의 친화성을 특징으로 한다. 상기 용어는 예를 들면, 항원 결합 도메인이 다수의 항원에 의해 보유되지 않은 특정 에피토프에 대한 특이성을 나타내는 경우에도 적용될 수 있고, 이 경우 상기 항원 결합 도메인을 보유하는 항체는 일반적으로 다른 항원에 결합하지 않을 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "특이적 면역원성 단편"은 항체 또는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 서열의 일부를 의미하고, 이때 상기 항체 또는 T 세포는 상기 서열에 대한 특이성을 나타낸다.
"대상체"는 가축 포유동물 및 야생 포유동물 둘다를 포함하는, 광견병 감염에 민감한 임의의 동물을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성의 정도를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "치료적 효과량"은 병원체, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균에 의한 감염에 의해 야기된 불리한 건강 효과 또는 이의 합병증을 포함하는 질환의 징후 또는 증상을 예방하거나 호전시키기에 적합한 항원, 백신 또는 조성물을 제공받은 대상체(예를 들면, 개)에서 면역 반응을 유도할 항원, 백신 또는 조성물의 양을 의미한다. 체액성 면역 또는 세포 매개 면역, 또는 체액성 면역 및 세포 매개 면역 둘다가 유도될 수 있다. 항원, 백신 또는 조성물에 대한 동물의 면역원성 반응은 항체 역가의 측정 또는 림프구 증식 분석을 통해 간접적으로 평가될 수 있거나 야생형 균주를 사용한 챌린지 후 징후 및 증상의 모니터링을 통해 직접적으로 평가될 수 있다. 백신 또는 조성물에 의해 부여되는 보호 면역은 쉐딩된(shed) 챌린지 유기체의 감소, 및/또는 임상적 징후, 예컨대, 치사율, 이환율, 온도, 및 대상체의 전체적인 물리적 상태, 건강 및 성능의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 치료적으로 효과적인 백신 또는 조성물의 양은 사용되는 구체적인 면역원 또는 대상체의 상태에 따라 달라질 수 있고 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료" 등은 미생물에 의한 감염을 감소시키거나 제거하는 것을 의미한다. 이들 용어들은 미생물의 복제를 감소시키거나, 미생물의 전염을 감소시키거나, 미생물이 그의 숙주 내에서 스스로 확립하는 능력을 감소시키는 것을 의미할 수도 있다. 또한, 본원에서 사용된 이들 용어들 등은 미생물에 의한 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상을 감소시키거나, 호전시키거나, 제거하는 것을 의미할 수 있거나, 미생물에 의한 감염으로부터의 회복을 가속화하는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "백신접종한다" 및 "백신접종하는"은 동물에게 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "백신" 및 "백신 조성물"은 감염을 예방하거나 감소시키는 조성물, 또는 감염의 하나 이상의 징후 또는 증상을 예방하거나 감소시키는 조성물을 의미한다. 병원체에 대한 백신 조성물의 보호 효과는 통상적으로 대상체에서 면역 반응을 유도함으로써 달성된다. 일반적으로 말하면, 감염의 소멸된 또는 감소된 발생률, 징후 또는 증상의 호전, 또는 감염된 대상체로부터의 미생물의 가속화된 제거는 백신 조성물의 보호 효과를 표시한다. 본 발명의 백신 조성물은 광견병 바이러스에 의해 야기된 감염으로부터의 보호 효과를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "변이체"는 주어진 단백질 및/또는 유전자 서열의 유도체화를 의미하고, 이때 유도된 서열은 돌연변이 차이를 제외하고 상기 주어진 서열과 본질적으로 동일하다. 상기 차이는 천연적으로, 합성적으로 또는 유전적으로 발생될 수 있다.
"벡터" 또는 "벡터 바이러스"는 이종 DNA의 삽입에 적합하고 삽입된 DNA를 세포 또는 유기체 내로 수송할 수 있고 적절한 경우 상기 이종 DNA가 발현되게 할 수 있는 PPV이다.
본원에서 사용된 용어 "수의학적으로 허용가능한 담체"는 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 적당한 이익-대-위험 비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등을 야기하지 않으면서 동물의 조직과 접촉되어 사용되기에 적합하고 그들의 의도된 용도에 효과적인 물질을 의미한다.
하기 설명은 본 발명을 실시함에 있어서 당업자를 돕기 위해 제공된다. 그럼에도 불구하고, 본원에서 논의된 실시양태에 대한 변형 및 변경이 본원의 발명적 발견의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 만들어질 수 있기 때문에 이 설명은 본 발명을 과도하게 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
바이러스, 면역원성 조성물 및 백신
본 발명은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 제조를 위한 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다.
한 실시양태에서, 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 제조를 위해 파라폭스바이러스 오비스(PPVO)가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701이 사용된다. 추가 실시양태에서, 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V가 사용된다.
파라폭스바이러스 내로 삽입된 유전 서열은 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 이종 DNA는 광견병 바이러스의 G 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 이 유전자의 구조는 예를 들면, 문헌[Anilionis et al., Nature 294, 275-278 (1981)]에 개시되어 있다. 삽입체의 크기는 1588개 뉴클레오티드이다. 삽입체의 완전한 서열(서열번호 4)은 도 4에 제시되어 있다. 상기 서열은 광견병 바이러스의 G 유전자의 전장 코딩 영역(1575개의 뉴클레오티드) 플러스 제한효소 분석(BamHI 및 EcoRI)을 위한 링커 서열로서 5' 말단 상의 7개의 뉴클레오티드 및 3' 말단 상의 6개의 뉴클레오티드를 함유한다.
폴리뉴클레오티드의 서열의 지식은 상기 폴리뉴클레오티드의 용이하게 입수가능한 모든 가능한 단편을 만든다. 따라서, 본 발명은 G 단백질의 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 기능성 단편이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 활성 단편이 제공된다. 단편은 통상적인 방법, 예를 들면, 여과 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 단편은 당업자에게 공지된 방법에 의한 재조합에 의해 생성될 수 있다.
재조합 파라폭스바이러스의 제조에 있어서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접 비-코딩 서열 내에 삽입된다. 이종 DNA를 파라폭스바이러스 내로 삽입하는 데에 이용되는 방법들은 표준 방법들이고 당업자에게 공지되어 있다. 이들 방법들은 미국 특허 제6,365,393호에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG이다.
한 실시양태에서, 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스는 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약에 따라 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC(등록상표))(미국 버지니아주 20108 마나사스 소재)에 ATCC(등록상표) 특허 기탁번호 PTA-11662로 기탁된 D1701-VrV RabG(K-UC1002)이다.
플라스미드 pdV-RabG(7.692개 뉴클레오티드)의 서열은 서열목록에 제시된 서열번호 5이다.
본 발명은 본원에 기재된 서열에 대해 약 99% 이상, 약 98% 이상, 약 97% 이상, 약 96% 이상, 약 95% 이상, 약 93% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 60% 이상, 약 55% 이상 또는 약 50% 이상의 동일성 및/또는 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열도 포함한다.
또한, 본 발명은 중간 엄격도 내지 고 엄격도 조건 하에서 본원에 기재된 서열번호들 중 어느 하나의 비-코딩 가닥 또는 상보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 종 상동체를 포함한다. 예시적인 고 엄격도 조건은 65℃ 내지 75℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS를 포함하는 완충제 중에서의 최종 세척을 포함하는 반면, 예시적인 중간 엄격도 조건은 35℃ 내지 45℃에서 2X SSC/0.1% SDS를 포함하는 완충제 중에서의 최종 세척을 포함한다. 동등한 엄격도의 조건은 문헌[Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10]에 기재된 바와 같이 온도 및 완충제 또는 염 농도의 변경을 통해 달성될 수 있다는 것이 당업계에서 이해된다.
재조합 PPV는 세포, 세포주 및 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 상기 세포, 세포주 또는 숙주 세포는 예를 들면, 포유동물 세포 및 비-포유동물 세포일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. PPV가 증식될 수 있는 세포, 세포주 및 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있고 용이하게 입수될 수 있다. 한 실시양태에서, 베로 세포가 사용된다. 다른 실시양태에서, 소 신장 또는 양 정소 세포가 사용된다.
재조합 PPV는 면역원성 조성물 또는 백신에서 사용되기 전에 추가로 약독화될 수 있거나 불활성화될 수 있다. 약독화 및 불활성화 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 약독화 방법은 적합한 세포주에 대한 세포 배양물에서의 연속 계대배양, 자외선 조사 및 화학적 돌연변이유발을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 불활성화 방법은 포르말린, 베타프로프리올락톤(BPL) 또는 이원성 에틸렌아민(BEI)을 사용한 처리, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
포르말린에 의한 불활성화는 0.05%의 최종 포름알데하이드 농도까지 바이러스 현탁액을 37%의 포름알데하이드와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 바이러스-포름알데하이드 혼합물은 실온에서 약 24시간 동안 일정하게 교반함으로써 혼합된다. 그 다음, 불활성화된 바이러스 혼합물은 적합한 세포주 상에서의 성장에 대해 분석됨으로써 잔류 생 바이러스에 대해 시험된다.
BEI에 의한 불활성화는 1 mM의 최종 BEI 농도까지 본 발명의 바이러스 현탁액을 0.1 M BEI(0.175 N NaOH 중의 2-브로모-에틸아민)와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 바이러스-BEI 혼합물은 실온에서 약 48시간 동안 일정하게 교반한 후 0.1 mM의 최종 농도까지 1.0 M의 나트륨 티오설페이트를 첨가함으로써 혼합된다. 혼합은 추가 2시간 동안 계속된다. 불활성화된 바이러스 혼합물은 적합한 세포주 상에서의 성장에 대해 분석됨으로써 잔류 생 바이러스에 대해 시험된다.
재조합 PPV는 면역원성 조성물 및 백신에서 사용될 수 있다.
면역원성 조성물 및 백신은 임의적으로 약학적 비히클, 부형제 또는 매질로서 작용하는, 액체, 반고체 또는 고체 희석제를 포함하는 하나 이상의 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "수의학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 희석제는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 당업자에게 공지된 것들 중에서 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정화제는 당업자에게 공지된 것들 중에서 알부민을 포함한다. 보존제는 당업자에게 공지된 것들 중에서 머티올레이트를 포함한다.
항원보강제는 당업자에게 공지된 것들 중에서 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)), 명반, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예컨대, 프로인트 완전 항원보강제 및 불완전 항원보강제, 블록 공중합체(CytRx, 미국 조지아주 아틀란타 소재), SAF-M(키론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재), 암피젠(AMPHIGEN)(등록상표) 항원보강제, 사포닌, 퀼(Quil) A, QS-21(캠브리지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재), GPI-0100(갈렌시아 파마슈티칼스 인코포레이티드(Galenica Pharmaceuticals, Inc.), 미국 알라바마주 버밍햄 소재) 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘(Avridine) 지질-아민 항원보강제, (재조합 또는 다른) 이. 콜라이(E. coli)로부터의 열 불안정성 장독소, 콜레라 독소 또는 뮤라밀 다이펩티드를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 내용에서 유용한 항원보강제 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 50 ㎍ 내지 약 2000 ㎍의 항원보강제를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신을 고려한다. 또 다른 실시양태에서, 항원보강제는 약 100 ㎍ 내지 약 1500 ㎍, 약 250 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 또는 약 350 ㎍ 내지 약 750 ㎍의 양으로 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 항원보강제는 면역원성 조성물 또는 백신의 2 ㎖ 투여량 당 약 500 ㎍의 양으로 포함된다.
면역원성 조성물 및 백신은 항생제도 포함할 수 있다. 이러한 항생제는 아미노글리코사이드, 카바페넴(carbapenem), 세팔로스포린, 글리코펩티드, 마크롤라이드(macrolide), 페니실린, 폴리펩티드, 퀴놀론, 설폰아미드 및 테트라사이클린 부류들로부터의 항생제들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 1 ㎍/㎖ 내지 약 60 ㎍/㎖의 항생제를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신을 고려한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물 및 백신은 약 5 ㎍/㎖ 내지 약 55 ㎍/㎖의 항생제, 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 50 ㎍/㎖의 항생제, 약 15 ㎍/㎖ 내지 약 45 ㎍/㎖의 항생제, 약 20 ㎍/㎖ 내지 약 40 ㎍/㎖의 항생제, 또는 약 25 ㎍/㎖ 내지 약 35 ㎍/㎖의 항생제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물 및 백신은 약 30 ㎍/㎖ 미만의 항생제를 포함한다.
재조합 PPV 이외에, 면역원성 조성물 및 백신은 다른 항원을 포함할 수 있다. 항원은 불활성화된 전체적 또는 부분적 미생물 제제의 형태, 또는 유전공학 기법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 항원성 분자의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되기에 적합한 다른 항원은 병원성 박테리아 또는 병원성 바이러스로부터 유래된 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
개의 경우, 재조합 광견병 면역원성 조성물 및 백신은 임의적으로 하나 이상의 추가 개 항원, 예컨대, 에를리키아 캐니스(Ehrlichia canis), 개 파보바이러스(CPV), 개 홍역, 개 파라인플루엔자 바이러스(CPI), 개 아데노바이러스 II형(CAV-2), 개 아데노바이러스(CDV), 개 코로나바이러스(CCV), 렙토스피라 익테로헤모르하기애(Leptospira icterohemorrhagiae)(LI), 렙토스피라 캐니콜라(Leptospira canicola)(LC)), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa)(LG), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona)(LP), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 등을 갖는 혼합물을 함유할 수도 있다. 항원들의 한 조합물은 코로나바이러스 및 렙토스피라(새로 출현한 혈청형 렙토스피라 그립포티포사 및 렙토스피라 포모나를 포함함)를 갖거나 갖지 않은, 개 파보바이러스, 개 홍역, 개 아데노바이러스 및 개 파라인플루엔자의 단리물을 포함한다.
고양이의 경우, 재조합 광견병 면역원성 조성물 및 백신은 임의적으로 하나 이상의 추가 고양이 항원, 예컨대, 고양이 칼리시바이러스(calicivirus)(FCV), 클라미도필라 펠리스(Chlamydophila felis)(씨. 펠리스, 이전에 통상적으로 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci)(FCP)로도 공지됨), 고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 고양이 범백혈구감소증 바이러스(FPV), 고양이 비강기관염 바이러스(FVR), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 고양이 감염성 복막염 바이러스(FIPV), 바르토넬라 헨셀래(Bartonella henselae)(예를 들면, 묘소병) 등을 갖는 혼합물을 함유할 수도 있다.
말의 경우, 재조합 광견병 면역원성 조성물 및 백신은 임의적으로 하나 이상의 추가 말 항원, 예컨대, 말 인플루엔자 바이러스, 말 헤르페스 바이러스 1 및 4, 말 아테리바이러스(arterivirus), 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 말 로타바이러스, 스트렙토코커스 이퀴(Streptococcus equi), 파상풍 변독소 등을 갖는 혼합물도 함유할 수 있다.
본원에 기재된 면역원성 조성물 및 백신은 RV에 대한 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스를 포함하는 치료적 효과량의 면역원성 조성물 또는 백신을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, RV에 대한 효과적인 면역 반응을 자극하는 방법이 본원에 기재된다. 상기 방법은 항-G 단백질 혈청 항체를 유도한다.
본원에 기재된 면역원성 조성물 및 백신은 광견병에 대해 동물을 백신접종하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 상기 면역원성 조성물 및 백신은 동물에서 광견병을 예방하거나 치료하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스를 포함하는 치료적 효과량의 면역원성 조성물 또는 백신을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 광견병에 대해 동물을 백신접종하는 방법 및 광견병을 예방하거나 치료하는 방법이 본원에 기재된다.
제형, 투여량 및 투여 경로
면역원성 조성물 및 백신은 투여 경로에 따라 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 면역원성 조성물 및 백신은 주사 사용에 적합한 멸균 수성 용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나 동결건조 기법의 이용을 통해 동결건조된 형태로 제조될 수 있다. 동결건조된 면역원성 조성물 및 백신은 전형적으로 약 4℃에서 유지되고 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 및/또는 HEPES에서 재구성될 수 있다. 대안적으로, 면역원성 조성물 및 백신은 동결건조에 의해 보존될 수 있다. 면역원성 조성물 및 백신은 현탁액 또는 에멀젼의 형태로 제조될 수도 있다.
면역원성 조성물 및 백신은 치료적 효과량의 전술된 재조합 PPV를 포함한다. 정제된 바이러스는 면역원성 조성물 또는 백신에서 직접적으로 사용될 수 있거나, 추가로 약독화될 수 있거나 불활성화될 수 있다. 전형적으로, 면역원성 조성물 또는 백신은 약 1 X 102 PFU 내지 약 1 X 1012 PFU, 약 1 X 103 PFU 내지 약 1 X 1011 PFU, 약 1 X 104 PFU 내지 약 1 X 1010 PFU, 약 1 X 105 PFU 내지 약 1 X 109 PFU, 또는 약 1 X 106 PFU 내지 약 1 X 108 PFU의 바이러스를 함유한다. 보호 효과를 제공하기에 효과적인 면역원성 조성물 또는 백신 중의 바이러스의 정확한 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
면역원성 조성물 및 백신은 일반적으로 약 0.5 ㎖ 내지 약 5 ㎖의 부피로 수의학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 담체의 부피는 약 1 ㎖ 내지 약 4 ㎖ 또는 약 2 ㎖ 내지 약 3 ㎖이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 담체의 부피는 약 1 ㎖, 약 2 ㎖, 약 3 ㎖ 또는 약 5 ㎖이다. 면역원성 조성물 및 백신에서 사용되기에 적합한 수의학적으로 허용가능한 담체는 본원에 기재된 담체들 중 임의의 담체일 수 있다.
당업자는 바이러스가 투여 전에 약독화되거나 불활성화될 필요가 있는지를 용이하게 결정할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 PPV는 추가 약독화 없이 동물에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료적으로 효과적인 바이러스의 양은 동물의 상태 및 감염 정도를 포함하는 여러 인자들 중 임의의 인자에 따라 달라질 수 있고 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 단회 투여량이 동물에게 투여될 수 있거나, 대안적으로 2회 이상의 접종이 약 2주 내지 약 10주의 간격으로 수행될 수 있다. 부스팅(boosting) 섭생법이 필요할 수 있고, 투여 섭생법은 최적 면역화를 제공하도록 조절될 수 있다. 당업자는 최적 투여 섭생법을 용이하게 결정할 수 있다.
면역원성 조성물 및 백신은 혈류, 근육 또는 내부 기관 내로 직접적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 수단은 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 심실내, 요도내, 복장내, 두개내, 근육내 및 피하를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 장치는 바늘(미세바늘을 포함함) 주사기, 바늘 부재 주사기 및 관주 기법을 포함한다.
비경구 제제는 전형적으로 부형제, 예컨대, 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 약 3 내지 약 9, 약 4 내지 약 8, 약 5 내지 약 7.5, 약 6 내지 약 7.5 또는 약 7 내지 약 7.5의 pH까지)를 함유할 수 있는 수성 용액이지만, 몇몇 적용의 경우 상기 비경구 제제는 멸균 비-수성 용액으로서, 또는 적합한 비히클, 예컨대, 멸균 발열원 무함유 물과 함께 사용될 건조된 제형으로서 보다 적합하게 제제화될 수 있다.
멸균 상태 하에 예를 들면, 동결건조에 의한 비경구 제제의 제조는 당업자에게 잘 공지되어 있는 표준 약학적 기법의 이용을 통해 용이하게 달성될 수 있다.
본원에 기재된 재조합 파라폭스바이러스, 면역원성 조성물 및 백신은 광견병에 대해 동물을 백신접종하기 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다.
본 발명은 동물에 존재하는 파라폭스바이러스의 기원을 확인하는 방법을 제공한다.
DIVA 백신(백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별할 수 있는 백신)을 사용하는 백신접종은 동물에 존재하는 파라폭스바이러스의 기원을 확인하는 수단을 제공한다. 이 감별은 ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 PCR을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 진단 방법들 중 임의의 방법을 통해 달성될 수 있다. 이들 방법들 및 다른 방법들은 당업자에게 용이하게 인식되고 공지되어 있다.
본원에 기재된 파라폭스바이러스는 그들의 게놈 조성 및 발현된 단백질 둘다에서 야생형 균주와 구별될 수 있다. 이러한 구별은 백신접종된 동물과 감염된 동물의 식별을 가능하게 한다. 예를 들면, 특정 실험실 시험에서 파라폭스바이러스에 대해 양성으로 시험된 동물이 야생형 파라폭스바이러스 균주를 보유하는지 아니면 백신접종을 통해 미리 수득된 재조합적으로 생성된 파라폭스바이러스를 보유하는지를 확인할 수 있다.
다양한 분석들이 이러한 확인을 수행하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들면, 파라폭스바이러스에 대해 양성으로 시험된 동물로부터 바이러스를 단리할 수 있고, 핵산 기초 분석을 이용하여 백신접종 전의 파라폭스바이러스임을 표시하는 파라폭스바이러스 게놈의 존재를 확인할 수 있다. 핵산 기초 분석은 서던 또는 노던 블롯 분석, PCR 및 서열분석을 포함한다. 대안적으로, 단백질 기초 분석이 이용될 수 있다. 단백질 기초 분석에서, 감염이 의심되는 세포 또는 조직을 파라폭스바이러스에 대해 양성으로 시험된 동물로부터 단리할 수 있다. 이러한 세포 또는 조직으로부터 세포 추출물을 제조할 수 있고, 미리 접종된 재조합적으로 생성된 파라폭스바이러스 또는 야생형 파라폭스바이러스의 존재를 구별가능하게 확인시켜줄 수 있는 바이러스 단백질에 대한 적절한 항체를 사용하여 상기 세포 추출물을 예를 들면, 웨스턴 블롯으로 분석할 수 있다.
동물에서 유도된 면역 반응의 정도 및 성질은 다양한 기법의 이용을 통해 평가될 수 있다. 예를 들면, 접종된 동물로부터 혈청을 수집하고 예를 들면, 통상적인 ELISA에서 파라폭스바이러스에 대한 특이성을 나타내는 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 림프 조직에서 반응하는 세포독성 T 림프구(CTL)의 검출은 세포성 면역 반응의 유도를 표시하는 T 세포 증식과 같은 분석에 의해 달성될 수 있다. 관련 기법은 당업계에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)]).
재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG가 DIVA 분석에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이 균주는 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하기 위한 광견병 N 유전자 또는 단백질의 검출 분석에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이 균주는 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하기 위한 광견병 P 유전자 또는 단백질의 검출 분석에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이 균주는 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하기 위한 광견병 L 유전자 또는 단백질의 검출 분석에서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이 균주는 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하기 위한 광견병 M 유전자 또는 단백질의 검출 분석에서 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 예시적인 비-제한적 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예
RV의 G 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 오비스를 발생시켰다. G 단백질의 발현이 RV에 대한 재조합 바이러스의 면역자극성 및 보호성을 암시하기 때문에 G 단백질의 발현을 평가하였다.
실시예 1
광견병 G 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 D1701-V-RabG의 발생
RV의 G 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합적으로 발생된 파라폭스바이러스 오비스를 발생시켰다. G 단백질의 발현이 RV에 대한 재조합 바이러스의 면역자극성 및 보호성을 암시하기 때문에 G 단백질의 발현을 평가하였다.
전달 플라스미드의 구축
재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG의 발생을 위해, 파라폭스바이러스 오비스(PPVO) 벡터 시스템(미국 특허 제6,365,393호; 문헌[Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145]; 문헌[Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323]; 문헌[Henkel et al., 2005, J. Virol. 79, 314-325])을 사용하였다. 광견병 바이러스 G 단백질 유전자는 화학적으로 합성되었고(블루 헤론 바이오텍(Blue Heron Biotech); 미국 소재) pUC 플라스미드 내에 포함되어 제공되었다. 완전한 G 유전자를 아가로스 겔(0.8%(중량/부피)) 전기영동으로 1,582 bp 크기의 BamHI - EcoRI DNA 단편으로서 단리하였고 퀴액스(Qiaex) 겔 추출 키트(퀴아젠; 독일 소재)로 정제하였다. 플라스미드 pdV-Rec1(문헌[Fischer et al., 2003])을 BamHI 및 EcoRI으로 이중 절단하였고 라이게이션(ligation)(패스트 라이게이션 키트(Fast ligation kit), 프로메가(Promega); 독일 소재)에 사용하였다. 이. 콜라이 DH5αF'(인비트로겐, 써모 피셔 사이언티픽(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific); 독일 소재)의 형질전환 후, 삽입체 양성 콜로니를 플라스미드 DNA의 EcoRI - BamHI 제한 절단으로 선택하였다. 이것은 전달 플라스미드 pdV-RabG(도 1)를 발생시켰고, 이 플라스미드를 퀴아젠 플라스미드 맥시 키트(퀴아젠; 독일 소재)로 추출정제하여 DNA 서열분석에 사용하였다. 이를 위해, pdV-Rec1 내의 삽입 부위의 상류에 위치한 프라이머 ORF32N(서열번호 1; 5'-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3') 및 pdV-Rec1 내의 삽입 부위의 하류에 위치한 프라이머 ORF31N(서열번호 2; 5'-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-3')뿐만 아니라 각각 내부 G 유전자 특이적 프라이머 RabG-F(서열번호 6; 5'-GGAGTCTCTCGTTATCATATCTC-3') 및 RabG-R(서열번호 7; 5'-CTAAACAAGGTGCTCAATTTCGT-3')도 사용하였다. 이것은 삽입된 G 유전자의 완전한 서열(서열번호 4)의 확인을 가능하게 하였다.
Bluo-Gal 염색에 의한 재조합체의 선택
베로 세포(106개 세포)를 제조자의 권고(아막사 뉴클레오펙토르(Amaxa Nucleofector), 론자(Lonza); 독일 소재)에 따라 0.1 MOI(감염 다중도)의 lacZ 발현 바이러스 D1701-VrV로 감염시켰고, 2시간 후 핵감염(nucleofection)을 통해 2 ㎍의 pdV-RabG 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 3일 내지 4일 후 바이러스 용해물을 수거하였고 6-웰 플레이트(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific); 독일 소재)에서 베로 세포에 대한 역가측정에 사용하였다. 플라크가 보이게 되었을 때, 아가로스 함유 Bluo-Gal을 문헌[Fischer et al., 2003]에 기재된 바와 같이 덧씌웠다. 백색 외관을 갖는 바이러스 플라크를 선발하였고, 단일 플라크 용출액(4℃에서 포스페이트 완충 식염수(PBS) 중에서 밤새 용출)을 48-웰 플레이트의 단일 웰 내의 베로 세포(1 X 105개 세포)의 동시적인 감염에 사용하였다.
플라크- PCR 에 의한 재조합체의 선택
각각의 바이러스 플라크 단리물로부터 DNA를 단리하는 것을 문헌[Pasamontes et al., J. Virol. Methods 35:137 - 141; 1991]의 변형된 방법으로 수행하였다. 바이러스 용해물(0.2 ㎖)을 3회 동결(-70℃)시키고 해동(37℃)시켰고, 얼음 상에서 20초 내지 30초 동안 초음파처리하였다(초음파 수조). 페놀 및 클로로포름 추출 후, 에탄올 침전 전에 10 ㎍ 효모 tRNA 또는 3 ㎕ 글리코블루(GlycoBlue)(암비온(Ambion); 독일 소재)를 첨가하였다. DNA 펠렛을 70%(부피/부피) 에탄올로 2회 세척하였고 14 ㎕ 정제수(aqua bidest)에서 건조한 후 용해시켰다.
RabG 특이적 PCR을 위해, 4 ㎕의 상기 DNA를 얼음 상에서 4.0 pmol RabG-F(서열번호 6) 프라이머 및 4.0 pmol RabG-R(서열번호 7) 프라이머로 구성된 1 ㎕ 프라이머 혼합물 및 5 ㎕ 레디믹스(ReddyMix) 2X PCR(애브진, 써모 피셔 사이언티픽(Abgene, Thermo Fisher Scientific); 독일 소재)과 혼합하였다. 98℃에서 2분 동안 항온처리한 후, 96℃에서 1분, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초 동안 항온처리 40주기, 및 72℃에서 2분 동안 최종 연장 단계를 실시함으로써 PCR을 트라이오 써모블록(Trio Thermoblock)(바이오메트라(Biometra); 독일 소재)에서 수행하였다. PCR 생성물을 수평 1%(중량/부피) 아가로스-에티듐브로마이드(㎖ 당 0.3 ㎍) 겔에서 분리하였다. 433 bp 크기의 G 유전자 특이적 PCR 단편을 보이는 플라크 단리물로부터 수득된 바이러스 용해물을, 전술된 바와 같은 Bluo-Gal 아가로스 덧씌우기를 이용하여 희석하였고 3회 이상 추가로 플라크 정제하였다. 마지막으로, G 유전자에 대해 양성을 나타내는 재조합 바이러스 플라크 단리물의 DNA를, 4 ㎕ DNA, 3.95 pmol의 프라이머 lacZ-F(서열번호 8; 5'-CGATACTGTCGTCGTCCCCTCAA-3') 및 4.13 pmol의 프라이머 lacZ-R(서열번호 9; 5'-CAACTCGCCGCACATCTGAACT-3')을 사용하여 LacZ 유전자 특이적 PCR에서 시험하였다. 5 ㎕의 아큐프라임 수퍼믹스 II(AccuPrime SuperMix II)(인비트로겐 피셔 사이언티픽; 독일 소재)를 첨가한 후, 98℃에서 2분 동안 가열한 후 96℃에서 1분, 62℃에서 30초 및 68℃에서 90초 동안 항온처리 40주기, 및 68℃에서 2분 동안 최종 연장 단계를 실시함으로써 PCR을 수행하였다. PCR 생성물의 분리를 전술된 바와 같이 수행하였다. 508 bp 크기의 LacZ 유전자 특이적 단편의 부재는 상응하는 재조합체 바이러스 플라크 단리물이 3회 플라크 정제 후 LacZ 발현 모 바이러스 D1701-VrV를 함유하지 않는다는 것을 입증하였다. D1701-V-RabG의 고 역가 바이러스 원액의 제조 후, 바이러스 DNA를 후술된 바와 같이 추출정제하여 RabG-PCR 및 LacZ-PCR에서 시험에 사용하였다.
재조합 바이러스 플라크의 면역조직화학적 염색(IPMA)
먼저, 24-웰 플레이트 내의 베로 세포에 대해 역가측정된 재조합 바이러스 플라크의 면역조직화학적 염색을 수반하는 IPMA를 이용하여 삽입된 외래 유전자의 성공적인 발현을 분석하였다. 바이러스 플라크의 출현 후, 배지를 각각의 웰로부터 흡입하고, 층류 후드 내에서 상기 플레이트를 약 10분 동안 개방된 상태로 남겨둠으로써 세포를 건조하였다. 그 후, 상기 세포를 -20℃에서 빙냉 무수 메탄올로 15분 내지 20분 동안 고정시켰다. PBS 중의 빙냉 1%(부피/부피) 태아 소 혈청(FCS)으로 2회 세척한 후, 상기 세포를 실온(RT)에서 10%(부피/부피) FCS를 함유하는 PBS로 90분 동안 차단하였다. 실온에서 PBS 중의 1% FCS 중에 1:200으로 희석된 G 단백질 특이적 마우스 단일클론 항체 G559(에프엘아이(FLI); 독일 투에빈겐 소재)와 함께 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. PBS-T(0.05%(부피/부피) 트윈(Tween)-20을 함유하는 PBS)로 3회 세척한 후, 1:2000으로 희석된 퍼록시다제 커플링된 항-마우스 이차 항체(잭슨-이뮤노리서치(Jackson-ImmunoRes.), 다이아노바(DIANOVA); 독일 소재)를 첨가하였고 실온에서 60분 동안 항온처리하였다. PBS-T 및 PBS로 철저히 세척한 후, 기질(벡터 노바 레드(Vector Nova Red), 액소라(Axxora); 독일 소재)을 제조자의 설명서에 의해 권장된 바와 같이 적갈색 양성 염색이 보이게 될 때까지 첨가하였다. 음성 대조군으로서 비-감염된 세포 및 D-1701-VrV 또는 D-1701-V에 감염된 세포를 포함시켰다. 바이러스 플라크 및 감염된 세포는 광견병 바이러스 G 단백질에 대해 강한 양성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
실시예 2
D1701-V-RabG의 특징규명
바이러스 원액의 제조
고 역가 재조합 바이러스 원액을 수득하기 위해, 10개 내지 20개의 T150 배양 플라스크(그레이너(Greiner); 독일 소재)를 0.5의 MOI로 동시적으로 감염시켰다. 3일 후, 약 80%의 세포병원성(cytopathogenic) 효과(CPE)를 관찰하였고, 모든 플라스크의 세포 및 상청액을 수거하였고 원심분리(13,000 rpm에서 2시간, 4℃)를 위해 회수하였다. 상청액을 조심스럽게 제거하였고, 바이러스 펠렛을 4℃에서 1 ㎖ 내지 2 ㎖의 PBS에 밤새 용해시켰다. 10초의 3회 펄스(100 W)(각각의 펄스 사이에 10초 중단)를 이용하여 얼음 상에서 초음파처리한(초음파 세포 파괴기, 브랜슨(Branson); 독일 소재) 후 원심분리하여(500 내지 700 x g, 10분, 4℃) 세포 파편(debris)을 제거함으로써 바이러스 현탁액을 완전히 분산시켰다. 상청액을 얼음 상에서 저장한 반면, 세포 펠렛을 1.0 ㎖ PBS에 재현탁시켰고 얼음 상에서 초음파처리하였다(20초 동안 2회, 이들 사이에 10초 중단, 및 이어서 30초 동안 1회). 저속 원심분리 후, 상청액을 제1 상청액과 조합하였고 분취액으로 나누었고 역가를 측정하였고 -70℃에서 저장하였다.
바이러스 DNA의 특징규명
베로 세포를 0.5의 MOI로 감염시켰고 2일 내지 3일(약 80% CPE) 후 트립신처리 및 4℃에서의 짧은 저속 원심분리로 수거하였다. 마스터 퓨어(Master Pure) DNA 단리 키트(에피센트레 바이오테크놀로지 바이오자임 사이언티픽(Epicentre Biotechnology, Biozym Scientific); 독일 소재)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 DNA를 단리하였다.
G 유전자가 정확한 좌위로 삽입되었음을 입증하기 위해, 2 ㎍의 DNA를 제한효소로 절단하였고 0.8%(중량/부피) 아가로스 겔에서 분리하였고 표준 절차에 따라 서던 블롯 혼성화를 위해 나일론 막(지이 헬쓰케어(GE Healthcare); 독일 소재)으로 옮겼다. 광견병 G 유전자 특이적 프로브(Rabg-F/-R PCR의 생성물)를 겔에서 단리하였고 레디프라임(지이 헬쓰케어; 독일 소재)을 사용하여 방사성표지(32P-dCTP, 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals); 독일 소재)로 표지하였다. 그 다음, 이것은 50℃의 조건 하에서 0.5%(중량/부피) 탈지 우유, 1.0%(중량/부피) 나트륨 도데실설페이트(SDS) 및 0.5 mg/㎖ 변성된 소 흉선 DNA(KT DNA, 시그마(Sigma); 독일 소재)를 함유하는 4X SSPE(1X = 0.18 M NaCl, 10 mM PP, 1 mM EDTA, pH 7.4)에서 수행된 서던 블롯 혼성화를 위해 사용되었다. X-선(코닥 엑스-오매트(Kodak X-Omat); 독일 소재) 노출 후, 상기 프로브를 45℃에서 0.4 N NaOH에서 30분 내지 60분 동안 항온처리한 후 100℃에서 0.1X SSC, 0.5% SDS 및 0.2 M 트리스 HCl(pH 7.4)에서 짧게 항온처리함으로써 필터로부터 제거하였다. 제2 혼성화를 위해, vegF-E 좌위를 함유하는 D1701-V의 HindIII 단편 H를 문헌[Cottone et al., 1998. Virus Res. 56, 53-67]에 기재된 바와 같이 사용하였다. 서던 블롯 결과는 D1701-VrV의 게놈 내로의 G 유전자의 정확한 삽입을 확인시켜주었다.
G 유전자 특이적 RNA의 검출
베로 세포를 3 내지 5의 MOI로 감염시켰고, 감염 후(p.i.) 슈어프렙(SurePrep) 총 RNA 추출 키트(피셔 사이언티픽; 독일 소재)를 사용하여 총 RNA를 상이한 시간에서 단리하였다. 추가로, 사이토신 아라비노사이드(AraC; 0.04 mg/㎖, 시그마; 독일 소재) 또는 사이클로헥스이미드(CHX, 0.1 mg/㎖, 서바(Serva); 독일 소재)의 존재 하에서 RNA를 감염된 세포로부터 추출하여 삽입된 G 유전자의 초기 발현을 시험하였다. 대조군으로서, 비-감염된 세포로부터 RNA를 단리하였다. 포름알데하이드를 함유하는 변성 1% 아가로스 겔에서 RNA를 분리하였고 문헌[Kroczek, R.A. & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990]에 기재된 바와 같이 나일론 막으로 옮겼다. 방사성표지로 표지된 광견병 G PCR(RabG-F/-R) 단편을 42℃에서 울트라하이브(UltraHyb) 용액(암비온; 독일 소재)에서 혼성화 프로브로서 사용하였다. 결과는 ORFV의 초기 vegF -E 프로모터의 조절 하에서의 그의 조절로 인한 광견병 G 유전자의 즉시 초기 발현을 명확히 입증하였다(Rziha et al. 1999, J. Biotechnol., 73, 235-242).
면역형광에 의한 G 단백질의 검출
면역형광을 위해, 베로 세포(1 X 105개 세포/㎖)를 0.1 또는 3.0의 MOI로 4-챔버 슬라이드(비디 팔콘(BD Falcon); 독일 소재)에서 감염시켰다. 감염 후 상이한 시간에서, 세포를 배지로 세척하였고 37℃에서 3.7%(부피/부피) 메탄올 무함유 포름알데하이드(피어스, 써모 피셔 사이언티픽(Pierce, Thermo Fisher Scientific); 독일 소재)로 15분 동안 고정시켰다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 37℃에서 0.2%(부피/부피) 트리톤 X-100으로 5분 동안 처리함으로써 투과가능한 상태로 만들었다. PBS 세척 후, 세포를 37℃에서 PBS 중의 5% FCS로 30분 내지 40분 동안 차단하였다. G 단백질 검출을 위해, 37℃에서 1% FCS를 함유하는 PBS 중에 1:1000으로 희석된 마우스 단일클론 항체 G559((에프엘아이; 독일 투에빈겐 소재)와 함께 세포를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS로 5회 세척한 후, 슬라이드를 37℃에서 PBS 중에 1:1000으로 희석된 이차 항-마우스 알렉사-555 항체(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes); 독일 소재)와 함께 30분 동안 암실 내에서 항온처리하였다.
ORFV를 사용한 감염 후 후기 시간에서 루디거 라우에(Rudiger Raue) 박사(화이자(Pfizer), 영국 소재)에 의해 제공된 ORFV 특이적 토끼 항혈청 PAS2274를 사용하여 세포의 검출을 수행하였다. 혈청을, 1% FCS를 함유하는 PBS 중에 1:100으로 희석하였고, 이차 항체인 항-토끼 알렉사-488을 1:1000 희석비로 사용하였다.
액틴 염색을 제조자(바이오튬(Biotium); 독일 소재)의 설명서에 따라 팔로이딘(Phalloidin)-647을 사용하여 수행한 후, 0.04 ㎍/㎖ DAPI(4',6-다이아미딘-2'-페닐인돌다이하이드로클로라이드; 로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals); 독일 소재)를 사용한 핵 염색을 실온에서 암실 내에서 20분 내지 30분 동안 수행하였다. PBS에서 철저히 세척한 후, 슬라이드를 모와이올(Mowiol)-DABCO로 포매하였고, 악시오비젼(Axiovision) 소프트웨어를 이용하는 제이스 아포톰(Zeiss ApoTome)을 이용하여 형광 영상화를 수행하였다.
결과는 D1701-V-RabG를 사용한 감염 후 초기(감염 후 4시간)에 및 후기(감염 후 24시간)에 광견병 G 단백질의 강한 발현을 명확히 입증하였다. 후기에, 감염된 세포를 항혈청 PAS2274를 사용한 특이적 염색으로 추가로 확인할 수 있었다. 나아가, 형광 염색은 G 단백질의 표면 발현의 증거를 나타내었다. 염색의 특이성을 비-감염된 세포의 사용을 통해 시험하였다.
웨스턴 블롯팅에 의한 G 단백질의 검출
베로 세포(3 X 105개의 세포)를 1.0의 MOI로 동시적으로 감염시켰고 5% CO2 대기 하에서 37℃에서 항온처리하였다. 감염 후 상이한 시간에서 세포 및 상청액을 수거하였고 원심분리하였고(8,900 X g, 10분, 4℃), 세포 침전물을 1.0 ㎖ PBS로 3회 세척하였고 1%(부피/부피) 트리톤 X-100을 함유하는 0.15 ㎖ PBS에 재현탁시켰다. 얼음 상에서 30분 동안 방치한 후, 용해물을 4℃에서 15,000 X g로 15분 동안 원심분리하였고, 상청액을 SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 위해 저장하였다. 이를 위해, 3부의 용해물을 1부의 4X 듀얼칼라(DualColor) 단백질 적재 완충제(퍼멘타스(Fermentas); 독일 소재)와 혼합하였고 5분 동안 끓였고 초음파처리하였고, 권장된 바와 같이(에프엠시 바이오프로덕츠, 바이오자임(FMC Bioproducts, Biozym); 독일 소재) 트라이스-트라이신-SDS 런닝 완충제와 함께 8%(중량/부피) 프로시이브(ProSieve)50 겔을 사용하는 SDS-PAGE로 약 10 ㎍의 단백질을 분리하였다. 예비염색된 단백질 래더(퍼멘타스; 독일 소재)를 분자량 마커로서 사용하였다. 전기영동 후, 단백질을 제조자(피어스, 써모 피셔 사이언티픽; 독일 소재)의 설명서에 따라 PVDF 막으로 옮겼다. 실온에서 3X 로티블록(Rotiblock)(로쓰(Roth); 독일 소재)에서 막을 3시간 동안 차단한 후, 광견병 바이러스 G 단백질의 C-말단에 대한 특이성을 나타내는 토끼 항-펩티드 항혈청(콘젤만(K.-K. Conzelmann) 박사(맥스-본-페텐코퍼 인스티튜트(Max-von-Pettenkofer Institute); 독일 소재)에 의해 친절하게 제공됨)을 1X 로티블록 중에 1:10,000으로 희석하여 사용하였다. 4℃에서 밤새 항온처리한 후, 막을 TBS-T(0.05%(부피/부피) 트윈-20을 함유하는 트라이스 완충 식염수)로 5회 철저히 세척하였고 실온에서 퍼록시다제 커플링된 항-토끼 항체(1:20,000; 잭슨-이뮤노리서치, 다이아노바; 독일 소재)와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. TBS-T 세척 후, ECL 기질을 권장된 바와 같이(이모빌론 웨스턴, 밀리포어(Immobilon Western, Millipore); 독일 소재) 사용하였다. 반응된 단백질을 화학발광 X-선 필름(씨엘-엑스프로슈어(CL-XPosure); 피어스, 써모 피셔 사이언티픽; 독일 소재)을 사용하여 검출하였다.
예측된 분자량(58 kDa 내지 60 kDa)의 광견병 바이러스 G 단백질의 발현을 감염 후 상이한 시간에서 확인하였다.
실시예 3
D1701-V-RabG를 사용한 마우스의 면역화 후 특이적 면역 반응의 유도
항-G 혈청 항체의 투여량 의존적 유도
G 단백질은 보호 면역 반응을 위한 가장 중요한 항원으로서 간주될 수 있고, 유도된 바이러스 혈청 중화 항체(SNT)의 정도는 광견병 바이러스 챌린지 감염에 대한 보호와 상관관계를 가질 수 있다. OIE(세계 동물 보건 기구) 및 WHO(세계 보건 기구)에 따르면, 0.5 IU(국제 단위)/㎖ 내지 1.0 IU/㎖의 SNT를 초과하는 항체 역가의 존재는 보호로서 간주된다. 따라서, D1701-V-RabG를 사용한 마우스의 프라임 면역화 후 1일 내지 14일 동안 G 단백질 특이적 SNT 항체의 유도를 측정하였다.
에프엘아이(FLI)(프리에드리흐-로에플러-인스티튜트(Friedrich-Loeffler-Institute), 연방 동물보건연구소, 면역학연구소; 독일 투에빈겐 소재)에서 사육된 6주령 내지 8주령의 C57/BL6 마우스(n = 군 당 6마리 또는 7마리)를 0.1 ㎖의 표시된 PFU(플라크 형성 단위)의 D1701-V-RabG(각각의 뒷다리의 넓적다리에 대해 0.05 ㎖)로 근육내로 면역화시켰다. 개별 혈청 샘플을 매일 채취하였고 기재된 바와 같이 신속 형광 초점 억제 시험(RFFIT)에서 SNT의 측정을 위해 사용하였다(인터넷 웹사이트(www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm)에서도 발견되는 문헌[OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies]; 문헌[Cox, J.H. and L.G. Schneider, 1976, J. Clin. Microbiol. 3, 96-101]). 요약하건대, RPMI 배지 중의 연속 5배 혈청 희석물을 제조하였고, 0.05 ㎖의 각각의 희석물을 96-웰 플레이트의 웰 내에서 (이중으로) 0.05 ㎖의 광견병 바이러스 균주 CVS 11(로트 번호 47, 1.7 X 105 PFU/㎖)과 혼합하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 90분 동안 항온처리한 후, 0.1 ㎖의 BHK21 세포 현탁액(1 X 106개의 세포/㎖)을 각각의 웰 내에 첨가하였고 혼합하였고 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 배양 플레이트의 웰을 PBS 및 예비냉각된 80%(부피/부피) 아세톤으로 세척한 후, 세포를 4℃에서 새로운 80%(부피/부피) 아세톤으로 추가 30분 동안 고정시켰다. 아세톤을 제거하고 공기 건조한 후, 0.05 ㎖의 FITC 항-광견병 단일클론 글로불린(센토코르(Centocor); 미국 소재)을 37℃에서 30분 동안 첨가하여 광견병 바이러스에 감염된 세포를 염색하였다. PBS로 2회 세척하고 정제수로 1회 세척한 후, 바이러스 감염을 형광 현미경관찰로 모니터링하였다. 감염된 세포의 수를 50%까지 감소시키는 혈청 희석물을 양성으로서 판독하였다. 혈청의 역가를 IU/㎖로서 표현하였고 양성 WHO 기준 혈청과 비교하였다.
도 2는 표시된 PFU의 D1701-V-RabG 재조합 바이러스를 사용한 마우스의 단회 근육내 면역화 후 SNT의 발생을 입증한다. 혈청을 FFIT에 의한 면역화 후 표시된 날짜(d)에 시험하였다. 도 2d에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 8일째 날까지 낮은 투여량(104 PFU)의 면역화조차도 평균 5.5 IU/㎖의 SNT를 발생시켰고, SNT는 면역화 후 14일째 날까지 약 13 IU/㎖까지 증가하였다. 면역화를 위해 106 PFU 또는 107 PFU를 사용한 경우(도 2a 및 2b), 1주 후까지 약 10 IU/㎖ 내지 20 IU/㎖의 평균 SNT가 유도되었고 상기 SNT는 프라이밍 후 14일째 날까지 최대 약 50 IU/㎖까지 증가하였다. 107 PFU의 D1701-V-RabG를 사용한 경우, 면역화 후 4일째 날까지 보호 혈청 항체 역가(0.6 IU/㎖ 내지 3.0 IU/㎖)가 검출되었는데, 이것은 시험된 보다 낮은 면역화 투여량을 사용한 경우에는 검출되지 않았다(도 2).
또 다른 마우스 실험(데이터는 제시되지 않음)은 106 PFU 또는 107 PFU의 재조합 바이러스를 사용한 부스터 면역화가 프라임 면역화(106 PFU 또는 107 PFU를 사용함) 후 14일째 날까지 SNT의 미미한 증가만을 일으켰다.
종합하건대, 이들 결과들은 다양한 투여량의 D1701-V-RabG를 사용한 마우스의 면역화 후 첫 주 동안 보호 SNT 항체 역가의 성공적인 유도를 입증한다.
실시예 4
D1701-V-RabG에 의해 매개된 마우스의 보호 면역 반응
OIE의 권장(인터넷 웹사이트(www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm)에서도 발견되는 문헌[Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2007. Part 2, Section 2.2, Chapter 2.2.5 Rabies])에 따라 상이한 면역화된 마우스들(C57/BL6)의 챌린지 감염으로 D1701-V-RabG의 보호 능력의 평가를 수행하였다. 6주령 내지 8주령의 마우스들(n = 군 당 11 또는 12)을 전술된 바와 같이 표시된 PFU의 D1701-V-RabG로 면역화시켰다. PBS를 비-면역화된 대조군 마우스들(n = 15)에게 주사하였다. 면역화 후 3주에서, 모든 동물들을 병독성 광견병 바이러스 균주 CVS(4.8 X 105 PFU를 함유하는 0.03 ㎖)로 두개내로 챌린지하였다. 챌린지 감염 후 21일째 날까지 동물들을 매일 관찰하였다. 중증 신경 증상을 앓는 죽어가는 동물들을 안락사시켰다.
도 3에 도시된 바와 같이, 107 PFU의 D1701-V-RabG를 사용한 단회 근육내 면역화는 높은 투여량의 두개내로 적용된 챌린지 바이러스로부터 마우스들(11/11)을 완전히 보호하였다. 상기 군으로부터 1마리의 면역화된 동물이 12일째 날에 사멸하였으나, 이것은 챌린지 광견병 바이러스 감염으로 인한 것이 아니었다. 따라서, 상기 동물은 데이터 분석으로부터 배제되었다. 10배 더 적은 양(106 PFU)의 D1701-V-RabG를 함유하는 1회 투여량의 적용은 여전히 73% 보호(8/11 생존자)를 달성하였다. 면역화 투여량의 추가 감소는 보호율을 58%(105 PFU; 7/12) 또는 27%(104 PFU; 3/11)까지 감소시킨 반면, 모든 대조군 면역화된 마우스들(n = 15)은 챌린지 감염 후 6일 내지 9일 동안 사멸하였다(도 3).
실시예 5
보호 면역에 대한 T 세포의 역할
하기 실험은 마우스에서 재조합 D1701-V-RabG에 의한 보호 면역의 유도에 대한 T 세포(CD4 양성, CD8 양성 또는 CD4/8 양성 세포)의 기여를 조사하였다. 도 5a에 표시된 바와 같이, 107 PFU의 D1701-V-RabG를 사용한 0일째 날 면역화 직전 및 후(즉, -1일째 날, 0일째 날, +1일째 날 및 +5일째 날)에 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포에 대한 특이성을 나타내는 항혈청을 마우스 군(도면에 나타낸 동물의 수(n))에게 복강내로 투여하여 생체내 각각의 T 세포 집단을 고갈시켰다.
그 후, 15일째 날에 모든 동물들을 500 LD50의 투여량의 병독성 RV 균주 CVS로 뇌내로 챌린지하였다.
도 5a에 도시된 바와 같이, CD4 양성 T 세포가 고갈된 동물들은 비-면역화된 대조군 동물과 유사한 반응에 의해 관찰된 바와 같이 일반적으로 보호되지 않았다.
도 5b에서 볼 수 있는 바와 같이, 동물 군을 0일째 날에 D1701-V-RabG로 면역화시킨 후, 병독성 RV 균주 CVS를 사용한 15일째 날 챌린지 감염 직전 및 후, 즉 13일째 날(챌린지 감염 2일 전), 15일째 날, 19일째 날 및 23일째 날에 생체내 CD4 T 세포 및/또는 CD8 T 세포를 고갈시켰다. 결과는 D1701-V-RabG에 의한 항-광견병 바이러스 면역 반응의 성공적인 프라이밍 후, 생체내 T 세포 집단이 고갈된 동물들의 75% 내지 90%가 챌린지로부터 생존하였다는 점에서 14일 후 T 세포의 고갈이 보호에 불리하게 영향을 미치지 않았다는 것을 입증한다.
종합하건대, 결과는 CD4 양성 T 세포(항-G 항체 생성에 필요할 가능성이 가장 높은 T 헬퍼 세포)가 재조합 D1701-V-RabG에 의해 유도된 보호 면역의 주 결정인자임을 보여준다.
실시예 6
노출 후 백신접종
치유적 백신을 위한 재조합 D1701-V-RabG의 효능을 마우스에서 시험하였다. 이를 위해, 동물 군을 0일째 날, 1일째 날 및 4일째 날에 107 PFU의 D1701-V-RabG로 근육내(i.m.)로 백신접종하였다. 마우스들을 0일째 날에 1 X 106 PFU의 병독성 RV 균주 CVS로 챌린지하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 1마리의 마우스를 제외한 면역화된 군 내의 모든 마우스들이 광견병으로부터 보호되었다.
병독성 RV 균주 CVS에의 다양한 노출 후 면역화 섭생법들을 시험하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 도 7에서, 회색 정사각형은 마우스들이 D1701-V-RabG로 백신접종된 날짜를 표시한다. 결과(생존자)는 도면에 요약되어 있다.
결과는 마우스의 치유적 백신접종을 위한 D1701-V-RabG의 능력을 입증한다. 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 챌린지 당일 및 이후 날짜에 제공된 이중 백신접종은 80% 보호를 매개하였고, 60% 이상의 동물들이 말초 RV 챌린지 감염 후 3일째 날에 개시되는 4일간의 매일 면역화에 의해 보호되었다.
실시예 7
상이한 경로의 면역화에 의해 유도된 면역 반응
마우스를 하기 적용 경로들을 이용하여 1 X 106 PFU의 D1701-V-RabG로 면역화시켰다: 질내(i.vag.), 난절법, 복강내(i.p.), 피내(i.d.), 비강내(i.n.), 피하(s.c.), 근육내(i.m.) 및 정맥내(i.v.). 면역화 후 6일째 날(회색 막대) 및 13일째 날(흑색 막대)에 유도된 혈청 항체 반응(혈청 중화 항체 또는 SNT로서 측정됨)이 도 8에 도시되어 있다. 면역화 후 14일째 날에 동물들을 100 LD50의 병독성 RV 균주 CVS로 뇌내로 감염시켰고, % 생존자를 계산하였다.
결과는 가장 높은 SNT 역가(㎖ 당 IU로서 제시됨)가 정맥내, 복강내 및 근육내 백신접종에 의해 유도되었고, 이것은 또한 각각 86%, 100% 및 78%의 가장 우수한 보호율을 발생시켰다.
ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션) PTA-11662 20110203
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Claims (22)

  1. 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 및 광견병 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 바이러스(ORFA)인, 재조합 파라폭스바이러스.
  3. 제2항에 있어서,
    파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701인, 재조합 파라폭스바이러스.
  4. 제1항에 있어서,
    이종 DNA가 광견병 바이러스의 G 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 단편을 포함하는, 재조합 파라폭스바이러스.
  5. 제1항에 있어서,
    이종 DNA가 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 재조합 파라폭스바이러스.
  6. 제1항에 있어서,
    이종 DNA가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입되어 있는, 재조합 파라폭스바이러스.
  7. 제6항에 있어서,
    이종 DNA가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접 비-코딩 서열 내에 삽입되어 있는, 재조합 파라폭스바이러스.
  8. 제1항에 있어서,
    파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG인, 재조합 파라폭스바이러스.
  9. 이종 DNA를 파라폭스바이러스의 게놈 내로 삽입하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 재조합 파라폭스바이러스의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스인, 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701인, 제조 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    이종 DNA가 광견병 바이러스의 G 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 단편을 포함하는, 제조 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    이종 DNA가 서열번호 4, 또는 서열번호 4에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 제조 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    재조합 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-RabG인, 제조 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  16. 재조합 파라폭스바이러스를 담체와 조합하는 단계를 포함하는, 제15항에 따른 면역원성 조성물의 제조 방법.
  17. 제15항에 따른 면역원성 조성물의 면역학적 효과량을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 동물에서 광견병 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    면역 반응이 항-G 단백질 혈청 항체의 유도인, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    항-G 단백질 특이적 보호 면역 반응이 유도되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    유도가 ㎖ 당 0.5 국제 단위(International Unit) 초과의 항체 역가를 발생시키는, 방법.
  21. 동물에서 광견병 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 파라폭스바이러스의 용도.
  22. 백신접종된 동물로부터 감염된 동물을 감별하기 위한 분석에 있어서 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 재조합 파라폭스바이러스의 용도.
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