CN117298263A - 一种重组狂犬病疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组狂犬病疫苗及其制备方法和应用,属于病毒疫苗制剂技术领域。其中,所述重组狂犬病疫苗包括:重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料和疫苗佐剂;其中,所述重组狂犬病病毒g蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;本发明采用序列为SEQ ID NO.1的重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料及疫苗佐剂,通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究,证明了自制重组狂犬病疫苗具有良好的免疫原性。
Description
技术领域
本发明属于病毒疫苗制剂技术领域,尤其涉及一种重组狂犬病疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)属于弹状病毒狂犬病病毒属,由遗传学相关的有外壳的病毒组成,含有单股非节段性负链RNA。目前尚无有效的治疗方法,人类暴露前预防(Pre-exposure prophylaxis,PrEP)和狂犬病暴露后预防(Post-exposureprophylaxis,PEP)是预治狂犬病的主要措施。
狂犬病疫苗,可用于暴露前和暴露后预防狂犬病,是预防和控制狂犬病的有效手段,在过去几十年中大大降低了狂犬病的发生。然而目前已上市人用狂犬病疫苗均为灭活疫苗,需要高浓度的抗原才能达到免疫效果,导致狂犬病疫苗成本昂贵;且用于暴露后预防处置时需接种4-5针,3个月以上再次暴露时需加强2针,依从性差、易导致免疫缺失;另若暴露后预防延迟或不完全,仍会导致死亡。因此,迫切需要开发一种安全高、成本低、疗程较短、长效的疫苗,以增强依从性并有效预防狂犬病。
狂犬病病毒G蛋白是一种三聚体,是诱导生产病毒中和抗体的主要抗原,可以针对狂犬病病毒致命感染产生免疫力,是疫苗发挥作用的主要成分。佐剂能够增强机体对疫苗的免疫应答,以低剂量抗原诱导细胞免疫或体液免疫达到保护要求。因此,相对于灭活疫苗,含有佐剂的重组狂犬病疫苗,可增强RABV中糖蛋白对机体的刺激,提高疫苗的免疫原性,加快免疫应答,减少所需剂量与接种剂次,降低疫苗成本。
在重组疫苗制剂佐剂的应用中,常规采用的是铝佐剂。但含有铝佐剂的狂犬病疫苗存在会延缓抗原的释放,进而使免疫前期抗体水平较低的缺陷,不利于狂犬病暴露后早期的防治,所以逐渐被当前的冻干灭活疫苗替代。
总之,现有的狂犬病疫苗虽然可以在一定程度上预防狂犬病,但存在如下缺陷:首先,灭活疫苗的高浓度抗原导致疫苗成本昂贵;其次,疫苗的接种剂量和次数较多,依从性差且容易导致免疫缺失;另外,传统的铝佐剂会延缓抗原的释放,影响疫苗在早期防治中的效果。因此,需要开发一种新型的包含有能快速产生抗体且产生的抗体水平高的新型佐剂的狂犬病疫苗,以克服现有疫苗的缺陷。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供一种重组狂犬病疫苗,包括:
重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料和疫苗佐剂;
其中,所述重组狂犬病病毒g蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述重组狂犬病病毒g蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地,每毫升的所述重组狂犬病疫苗中包含有50μg-300μg的重组狂犬病病毒g蛋白。
优选地,所述药用辅料在每毫升的所述重组狂犬病疫苗中包括如下含量的组分:
聚山梨酯80,100μg-500μg;
蔗糖,20mg-100mg;
氯化钠,1mg-9mg。
优选地,所述疫苗佐剂为第一佐剂组合物或第二佐剂组合物;
所述第一佐剂组合物和所述第二佐剂组合物中均包括:DOPC、胆固醇和QS-21。
优选地,以每毫升的所述重组狂犬病疫苗计,所述第一佐剂组合物包含如下含量的组分:
DOPC,700μg-3000μg;
胆固醇,175μg-750μg;
QS-21,35μg-120μg。
优选地,所述第二佐剂组合物中除了DOPC、胆固醇和QS-21之外,还包括DOTAP和Poly I:C。
优选地,以每毫升的所述重组狂犬病疫苗计,所述第二佐剂组合物包含如下含量的组分:
DOPC,500μg-2000μg;
胆固醇,175μg-600μg;
QS-21,50μg-120μg;
DOTAP,70μg-240μg;
Poly I:C,400μg-900μg。
此外,为解决上述问题,本发明还提供一种重组狂犬病疫苗的制备方法,包括:
将重组表达质粒依次经表达处理和纯化处理,得到重组狂犬病病毒g蛋白;
取疫苗佐剂,加入所述重组狂犬病病毒g蛋白的原液,调节pH值值6.0-7.0,使用注射用水定容后分装,即得到所述重组狂犬病疫苗。
优选地,所述表达处理,包括:
取所述重组表达质粒转化进DH5α化学感受态细胞中,并挑单克隆进行测序,获得基因工程转化的单克隆菌株;
将所述单克隆菌株扩增培养后,进行质粒纯化,得到转染级质粒;
利用PEI包裹,将所述转染级质粒转染进入CHO细胞,进行重组蛋白表达,收集得到表达上清液;
所述纯化处理,包括:将表达上清液进行超滤浓缩,得到浓缩后的表达上清液;对所述浓缩后的表达上清液进行亲和层析,收集洗脱液,得到所述重组狂犬病病毒g蛋白的原液。
优选地,所述重组狂犬病疫苗的制备方法还包括:制备得到所述疫苗佐剂;所述疫苗佐剂为第一佐剂组合物和第二佐剂组合物中的任意一种;其中,在所述疫苗佐剂为所述第一佐剂组合物时,所述制备得到所述疫苗佐剂,包括:利用DOPC和胆固醇制备得到中性脂质体;将磷酸盐缓冲液和中性脂质体混合后,再加入QS-21和药用辅料混合,得到所述第一佐剂组合物;在所述疫苗佐剂为所述第二佐剂组合物时,所述制备得到所述疫苗佐剂,包括:利用DOPC和胆固醇制备得到中性脂质体;以及,利用DOTAP、DOPC和胆固醇制备得到阳离子脂质体;将QS-21、Poly I:C、阳离子脂质体、中性脂质体及药用辅料混合后,得到所述第二佐剂组合物。
此外,为解决上述问题,本发明还提供一种如上述所述的重组狂犬病疫苗在制备用于治疗和/或预防狂犬病毒引起疾病的产品的应用,所述产品包括疫苗产品、药物、诊断试剂和检测试剂盒。
本发明提供一种重组狂犬病疫苗及其制备方法和应用,其中,所述重组狂犬病疫苗,包括:重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料和疫苗佐剂;其中,所述重组狂犬病病毒g蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用序列为SEQ ID NO.1的重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料及疫苗佐剂,通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究,证明了自制重组狂犬病疫苗具有良好的免疫原性。
附图说明
图1为本发明实施例2中洗脱蛋白层析图;
图2为本发明实施例2中纯化后SDS-PAGE凝胶电泳图;
图3为本发明实施例4中不同样品的溶血活性实验结果图;
图4为本发明实施例4中2℃-8℃与37℃放置1周DOPC与胆固醇含量结果图;
图5为本发明实施例4中2℃-8℃放置与37℃放置1周QS-21含量结果图;
图6为本发明实施例5中各组血清IgG抗体滴度折线图;
图7为本发明实施例6中各组血清IgG抗体滴度折线图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种重组狂犬病疫苗,包括:
重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料和疫苗佐剂;所述疫苗佐剂中包括QS-21;
其中,所述重组狂犬病病毒g蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;
进一步的,所述重组狂犬病病毒g蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明采用碱基序列为SEQ ID NO.1(且氨基酸序列为SEQ ID NO.2)的重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料及疫苗佐剂,通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究,证明了自制重组狂犬病疫苗具有良好的免疫原性。
进一步的,每毫升的所述重组狂犬病疫苗中包含有50μg-300μg的重组狂犬病病毒g蛋白。例如,可以为50μg、80μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg等等。
进一步的,所述药用辅料在每毫升的所述重组狂犬病疫苗中包括如下含量的组分:
(1)聚山梨酯80,100μg-500μg;例如,可以为100μg、200μg、300μg、400μg、500μg等等。
(2)蔗糖,20mg-100mg;例如,可以为20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、800mg、100mg等等。
(3)氯化钠,1mg-9mg。例如,可以为1mg、3mg、5mg、7mg、8mg、9mg等等。
上述,聚山梨酯80(Polysorbate 80)是一种非离子表面活性剂,也被称为Tween80。它是由山梨醇与不同数量的酸化棕榈油脂肪酸酯化而成的混合物。聚山梨酯80具有良好的乳化、分散、稳定和表面活性性质,在制药领域,聚山梨酯80可以被用作辅助剂,以提高药物的溶解度和稳定性,并促进药物的吸收。它可作为药物输送***中的乳化剂和分散剂,帮助药物与体液混合,增加其生物利用度。
上述,蔗糖可以替换为等量的海藻糖,或者蔗糖与海藻糖的混合物。
进一步的,所述疫苗佐剂为第一佐剂组合物或第二佐剂组合物;
所述第一佐剂组合物和所述第二佐剂组合物中均包括:
DOPC、胆固醇和QS-21。
上述,DOPC是二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)的简称。它是一种磷脂类物质,应用于生物医学领域和药物研究中。DOPC是一种主要成分来自天然来源的磷脂,在细胞膜中具有重要的生理功能。它属于磷脂双分子层中的主要成分之一,可以调节细胞膜的稳定性、流动性和通透性。作为一种磷脂类物质,DOPC由两个油酸基和一个磷酸基与胆碱组成。胆碱部分具有亲水性,可以与水分子相互作用,而油酸基则是疏水性的。这使得DOPC分子在水环境中能够以双层磷脂结构的形式自组装,形成细胞膜的基本结构单元。
上述,QS-21,为一种皂苷类化合物,具有多种生物活性和药理作用。它主要用作免疫佐剂,能够增强疫苗的免疫原性并促进免疫响应。本发明中,将QS-21与抗原一起使用,可以提高抗原的免疫原性,激活免疫***,并增加体内对疫苗的免疫反应。
本发明采用序列为SEQ ID NO.1的重组狂犬病病毒g蛋白和疫苗佐剂。其中,在疫苗佐剂***中采用的QS-21相较于皂甙,其成分更单一,结构确定,作为佐剂能产生高水平特异性的抗体和细胞免疫;此外,佐剂中加入了中性脂质体(DOPC+胆固醇),QS-21与中性脂质体中的胆固醇结合后,阻止了其与细胞膜的结合,能进一步降低其溶血活性,提高疫苗的安全性。
进一步的,以每毫升的所述重组狂犬病疫苗计,所述第一佐剂组合物包含如下含量的组分:
(1)DOPC,700μg-3000μg;例如,可以为700μg、800μg、1000μg、1500μg、2000μg、2500μg、3000μg等等;
(2)胆固醇,175μg-750μg;例如,可以为175μg、200μg、250μg、300μg、350μg、450μg、550μg、650μg、750μg等等;
(3)QS-21,35μg-120μg。例如,可以为35μg、45μg、50μg、60μg、70μg、100μg、110μg、120μg等等。
进一步的,所述第二佐剂组合物中除了DOPC、胆固醇和QS-21之外,还包括DOTAP和Poly I:C。
进一步的,以每毫升的所述重组狂犬病疫苗计,所述第二佐剂组合物包含如下含量的组分:
(1)DOPC,500μg-2000μg;例如,可以为500μg、600μg、800μg、1000μg、1200μg、1500μg、1800μg、2000μg等等。
(2)胆固醇,175μg-600μg;例如,可以为175μg、200μg、250μg、300μg、350μg、450μg、550μg、600μg等等;
(3)QS-21,50μg-120μg;例如,可以为50μg、60μg、70μg、100μg、110μg、120μg等等。
(4)DOTAP,70μg-240μg;例如,可以为70μg、90μg、100μg、120μg、150μg、200μg、220μg、240μg等等;
(5)Poly I:C,400μg-900μg。例如,可以为400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg等等。
上述,DOTAP全称是1,2-二油酰基-3-三甲基氯化铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane)。这是一种合成的阳离子类表面活性剂。
上述,聚肌胞聚肌胞(PolyI:C)是一种人工合成的双链核糖核酸,是一种干扰素诱导剂,有抗病毒和免疫调节功能,用于慢性乙型肝炎、流行性出血热、流行性乙型脑炎、病毒性角膜炎、带状疱疹、各种疣类和呼吸道感染等。
此外,本发明还提供一种重组狂犬病疫苗的制备方法,包括:
S1,将重组表达质粒依次经表达处理和纯化处理,得到重组狂犬病病毒g蛋白;
S2,取疫苗佐剂,加入所述重组狂犬病病毒g蛋白的原液,调节pH值值6.0-7.0,使用注射用水定容后分装,即得到所述重组狂犬病疫苗。
进一步的,所述表达处理,包括:
S11,取所述重组表达质粒转化进DH5α化学感受态细胞中,并挑单克隆进行测序,获得基因工程转化的单克隆菌株;
S12,将所述单克隆菌株扩增培养后,进行质粒纯化,得到转染级质粒;
S13,利用PEI包裹,将所述转染级质粒转染进入CHO细胞,进行重组蛋白表达,收集得到表达上清液。
上述,步骤S11中,首先将含有重组DNA的表达质粒通过化学方法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,使细胞内发生重组。然后从单个克隆中提取总DNA并进行测序,保证成功***目的基因。
其中,DH5α是一种化学感受态细胞,其质粒可被外源DNA转化,用于基因工程和分子生物学实验中。
步骤S12中进行了将所得到的单克隆菌株进行培养并扩增。然后利用质粒提取试剂盒等方法对原菌株进行裂解,分离出质粒,去除杂质并从中纯化出目标转染级质粒。
步骤S13中,用聚乙烯亚胺(PEI)等化学试剂对纯化的目标转染级质粒进行包裹,然后将其与CHO细胞共同培养。由于PEI会协助质粒与细胞膜结合并被细胞摄取,从而实现转染目的。接着通过细胞培养和诱导等方法,表达出目标蛋白质并分泌至培养上清液中。最终收集上清液以获取表达的重组蛋白。
其中,CHO细胞是一种应用于重组蛋白表达的哺乳动物细胞,具有高效的翻译和糖基化***,能够保证产生类似于天然蛋白的修饰和活性。PEI是一种高分子阳离子聚合物,具有良好的DNA或RNA包裹能力,可用于细胞内质粒的转染。
所述纯化处理,包括:
S14,将表达上清液进行超滤浓缩,得到浓缩后的表达上清液;
S15,对所述浓缩后的表达上清液进行亲和层析,收集洗脱液,得到所述重组狂犬病病毒g蛋白的原液。
上述,超滤浓缩是分离和浓缩溶液中大分子物质的方法。在步骤S14中,利用超滤膜技术将表达上清液通过筛选孔径较小的膜,使其中的水分和小分子物质透过膜而流失,而较大分子的重组蛋白则被滞留在膜上,并得到浓缩后的上清液。这样可以去除多余的水分和杂质,提高目标蛋白的浓度。
上述,亲和层析是基于亲和性相互作用的分离纯化技术。在步骤S15中,利用具有特异亲和性的配体(如亲和树脂)来结合目标蛋白,然后将非特异性结合的杂质物质洗脱掉,最终得到目标蛋白。这样可以实现对重组狂犬病病毒g蛋白的纯化。
超滤浓缩和亲和层析是蛋白表达和纯化技术中的处理步骤。超滤浓缩可提高目标蛋白的浓度,亲和层析则可实现目标蛋白的高效纯化。这些步骤和处理方式选择的原因包括提高目标蛋白的纯度,去除其他杂质,以及获取所需蛋白的足够量用于后续实验或应用。
进一步的,所述重组狂犬病疫苗的制备方法还包括:
制备得到所述疫苗佐剂;所述疫苗佐剂为第一佐剂组合物和第二佐剂组合物中的任意一种;
其中,在所述疫苗佐剂为所述第一佐剂组合物时,所述制备得到所述疫苗佐剂,包括:
(1)利用DOPC和胆固醇,制备得到中性脂质体;
(2)将磷酸盐缓冲液和中性脂质体混合后,再加入QS-21和药用辅料混合,得到所述第一佐剂组合物;
在所述疫苗佐剂为所述第二佐剂组合物时,所述制备得到所述疫苗佐剂,包括:
(1)利用DOPC和胆固醇制备得到中性脂质体;以及,利用DOTAP、DOPC和胆固醇制备得到阳离子脂质体;
(2)将QS-21、Poly I:C、阳离子脂质体、中性脂质体及药用辅料混合后,得到所述第二佐剂组合物。
上述,所述中性脂质体的制备方法可以包括:由二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇按照质量比为4:1进行配制,脂质成分分散均匀后,使用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法制备脂质体;
优选的,使用乙醇注入法进行制备,制备方法为:按照生产初乳、依次使用孔径为200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型,随后进行超滤、过滤除菌即得。
更优选的,所述中性脂质体的制备步骤如下:
(1)将第一佐剂组合物中的两种脂质成分(DOPC和胆固醇)溶于乙醇中,与水相在线剪切1次-3次;
(2)200nm脂质体挤出,使用孔径为200nm的滤膜进行过滤,进行多次循环挤出,控制粒径均匀性;
(3)100nm脂质体挤出,使用孔径为100nm的滤膜进行过滤,进行多次循环挤出,控制粒径均匀性;
(4)使用磷酸盐缓冲液超滤置换,浓缩倍数2倍-6倍,洗滤倍数6倍-8倍;
(5)使用无菌过滤器过滤除菌。
制备得到的中性脂质体的理化参数为:
(1)平均粒径(D50):80nm-140nm;例如可以为80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm等等;
(2)溶液pH值:5.5-7.0;例如,可以为5.5、6.0、6.5、7.0等等;优选为6.4-6.6;例如,可以为6.4、6.5、6.6等等。
上述,所述的阳离子脂质体的制备方法为:
由1,2二油酰基3三甲基氯化铵丙烷(DOTAP)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇按照质量比为2:2:1进行配制;三种脂质成分分散均匀后,使用乙醇注入法、薄膜分散法、超声波分散法、逆向蒸发法制备脂质体。
优选的,使用乙醇注入法进行制备,制备方法为:在超滤后依次使用孔径为200nm和100nm的挤出膜进行挤出成型,最后通过无菌过滤器过滤除菌即得。
更优选的,所述阳离子脂质体的制备步骤如下:
(1)将第二佐剂组合物中的三种脂质成分(DOTAP、DOPC和胆固醇)溶于乙醇中,与水相在线剪切1次-3次;
(2)使用蔗糖醋酸缓冲液超滤置换,浓缩倍数2倍-4倍,洗滤倍数6倍-8倍;
(3)200nm脂质体挤出,使用孔径为200nm的滤膜进行挤出,进行多次循环挤出,控制粒径均匀性;
(4)100nm脂质体挤出,使用孔径为100nm的滤膜进行挤出,进行多次循环挤出,控制粒径均匀性;
(5)使用无菌过滤器过滤除菌;
制备得到的阳离子脂质体的理化参数为:
(1)平均粒径(D50):40nm-100nm;例如,可以为40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm等等;
(2)溶液pH值:4.5-6.5;例如,可以为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5等等;
(3)Zeta电位:50mV-90mV(pH6.5)。例如,可以为50mV、60mV、70mV、80mV、90mV等等。
本发明将含SEQ ID NO.1序列的重组质粒转染CHO细胞表达后进行纯化,获得重组狂犬病病毒g蛋白原液,然后加入疫苗佐剂,制备获得重组狂犬病疫苗。通过肌肉注射给予BALB/c小鼠的免疫实验研究,证明了自制重组狂犬病疫苗具有良好的免疫原性。
此外,本发明还提供一种如上述所述的重组狂犬病疫苗在制备用于治疗和/或预防狂犬病毒引起疾病的产品的应用,所述产品包括疫苗产品、药物、诊断试剂和检测试剂盒。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1:重组狂犬病病毒g蛋白制备中的表达处理。
本实施例的重组狂犬病病毒g蛋白制备中进行了针对于重组表达质粒的表达处理。
(1)将测序正确的重组表达质粒转化进DH5α化学感受态细胞中。在预先制备好的含50μg/mL Kan的LB平板上,涂布棒均匀涂布基因工程菌株,倒置于37℃培养箱,过夜培养12小时-16小时后,挑取单个菌落,接种于含50μg/mL Kan的10mL LB培养液的三角瓶中,37℃220rpm振摇过夜;
(2)次日按0.1%接种于含50μg/mL Kan的1000mL LB培养液中,37℃220rpm振摇过夜。取出培养物,10000g℃离心15分钟,弃上清。按照Plasmid Giga Kit使用说明进行操作,纯化质粒,得到转染级质粒。
(3)转染前一天将,提前复苏并稳定传代的CHO细胞调整密度至3.5E6/mL,体积650mL/瓶37℃摇床培养过夜。
(4)转染时按每25mL转染体积使用55μg质粒250μg PEI,以Opti-MEM为稀释液将PEI溶液和DNA溶液配制成等体积稀释液进行混合制剂,转染试剂终体积占转染总体积的1%。应将等体积PEI溶液缓慢加入质粒DNA溶液,不可反向操作,不可剧烈震荡产生气泡,混合后孵育15分钟以充分反应。一边摇动一边将制备好的转染试剂逐滴加入细胞培养液,5%二氧化碳,34℃,80rpm/分钟培养。
(5)转染后第一天,第三天按培养体积的8%补液,培养5-6天可以收获,离心取上清。得到含有重组狂犬病病毒g蛋白的细胞发酵液。
实施例2:重组狂犬病病毒g蛋白制备的纯化处理。
本实施例的重组狂犬病病毒g蛋白制备中进行蛋白纯化处理处理。
(1)利用30kD 0.1m2超滤膜包,将重组狂犬病病毒g蛋白CHO细胞表达上清2200mL超滤浓缩至450mL。
(2)利用SCG蛋白纯化***,将70mL浓缩后重组狂犬病病毒g蛋白CHO细胞表达上清以1mL/分钟流速上样至已平衡后的亲和层析柱(Strep Trap XT);
(3)用平衡液(100mM Tris-Cl+150mM NaCl+1mM EDTA-Na2,pH8.0)以1mL/分钟流速冲洗层析柱至流出液OD280值达到基线。再将70mL浓缩后重组狂犬病病毒g蛋白CHO细胞表达上清以1mL/分钟流速上样至亲和层析柱。
(4)用平衡液以1mL/分钟流速冲洗层析柱至流出液OD280值达到基线。
(5)用洗脱液(100mM Tris-Cl+150mM NaCl+1mM EDTA-Na2+60mM Biotin,pH8.0)以1mL/分钟流速洗脱目的蛋白,收集流出液,进行4-20%SDS-PAGE分析。
参考图1和图2,经亲和层析柱(Strep Trap XT)纯化后,获得纯度较高的重组狂犬病病毒g蛋白。
实施例3:重组狂犬病疫苗的制备。
本实施例中,基于实施例1和实施例2,进行重组狂犬疫苗的制备。
(1)制备得到中性脂质体。
1)两种脂质成分(DOPC和胆固醇)溶于乙醇中,与水相在线剪切1次-3次;
2)200nm脂质体挤出,使用孔径为200nm的滤膜进行过滤,进行多次循环挤出,控制粒径均匀性;
3)100nm脂质体挤出,使用孔径为100nm的滤膜进行过滤,进行多次循环挤出,控制粒径均匀性;
4)使用磷酸盐缓冲液超滤置换,浓缩倍数2倍-6倍,洗滤倍数6倍-8倍;
5)使用无菌过滤器过滤除菌。
制备得到的中性脂质体的理化参数为:
1)平均粒径(D50):80nm-140nm;
2)溶液pH值:6.4-6.6。
(2)依次加入磷酸盐缓冲液(由一水磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配置得到),中性脂质体、QS-21溶液和重组狂犬病病毒g蛋白原液,调节pH为6.0-7.0,再使用注射用水定容,过滤除菌,然后分装,即得重组狂犬病疫苗。具体各组分含量如下表所示:
表1、实施例3中采用的重组狂犬病疫苗的各组分用量
实施例4:佐剂及辅料用量考察。
(1)QS-21加入前后理化性质的变化:按照第一佐剂组合物配制工艺,使用三批中性脂质体分别加入QS-21,检测QS-21加入前后粒径分布和Zeta电位的变化情况,结果如下表所示。
按照第一佐剂组合物配制工艺,使用三批中性脂质体分别加入QS-21,检测QS-21加入前后粒径分布和Zeta电位的变化情况,结果如下表所示。
表2、在第一佐剂组合物配制过程中加入QS-21前后粒径分布与Zeta电位表
由上表可以看出,加入QS-21后,第一佐剂组合物的平均粒径和Zeta电位无明显变化。说明QS-21的加入对体系的粒径分布和Zeta电位无明显影响。
(2)QS-21的溶血活性的变化考察:本实施例中,使用中性脂质体(胆固醇含量为250μg)分别吸附50μg、100μg、200μg、300μg和400μg的QS-21,同时以50μg的QS-21作为对照。将以上样品分别依次连续进行2倍稀释,并加入鸡血红细胞室温孵育30分钟,用紫外分光光度计在570nm处测定上清的OD值,OD值越高表明溶血性越强。
实验结果:如下表3数据中所示。
表3、不同样品的溶血活性实验表
实验结果分析:参考图3,当QS-21含量不高于200μg时,“QS-21+中性脂质体”组的OD值与空白对照无明显差异。说明含250μg胆固醇的中性脂质体,至少能吸附200μg的QS-21,使其不产生明显的溶血现象。
(3)佐剂***pH范围:不同pH值的样品在2℃-8℃与37℃放置1周,测定其佐剂各组分含量,结果如下表所示。
表4、不同pH条件下2℃-8℃与37℃放置1周佐剂部分各组分含量表
由上表及图4和图5可知,在pH6.0-7.5范围内,DOPC与胆固醇在2℃-8℃放置均无明显变化,在37℃放置1周,其含量有一定的降低,不同pH的样品降低幅度无明显差别;考虑到pH7.5的样品QS-21含量降低最明显,且QS-21在碱性环境下易于水解,因此制品的pH值应不高于7.0。
实施例5:重组狂犬病疫苗佐剂筛选实验。
(1)BALB/c小鼠的免疫:实验分组:将SPF级BALB/c小鼠随机分为11组,除冻干人用狂犬病疫苗组、抗原对照组和阴性对照为8只/组外,剩余8组均为12只/组,动物总数共120只,详细分组如下表所示。
表5、小鼠分组及免疫方案
免疫方式:供试品在使用前轻轻摇匀,使用300μL一次性无菌注射器和针头,各供试品抽取50μL的供试品溶液(冻干人用狂犬病疫苗组抽取100μL供试品溶液),在小鼠大腿外侧进行肌肉注射。
免疫时间:D0,D7给药,总计2次。
血清采集:各试验组实验动物在D1、D3、D6、D10采血,分离血清,-70℃冻存备用。
(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测:将抗原用包被液稀释成2μg/mL,100μL/孔包被ELISA板,4℃过夜。用洗涤液洗3次后,每孔加入200μL封闭液,25℃封闭1小时。封闭结束后倒掉封闭液,将鼠抗血清倍比稀释后和小鼠阴性血清加入ELISA板,100μL/孔,在25℃下孵育2小时。用洗涤液洗3次后,加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:10000),100μL/孔,在25℃下孵育1小时。用洗涤液洗5次后,加入TMB底物显色液,25℃避光反应15分钟,加100μL终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度,定为该样品的滴度。
(3)实验结果:通过ELISA检测结合IgG抗体滴度,检测结果抗体曲线见图6。
1)一免6天(D6)后,各组实验动物血清IgG抗体滴度均有增高。
“抗原+第一佐剂组合物”与“抗原+第二佐剂组合物”实验组诱导IgG抗体滴度相接近,均高于剩余实验组。
2)二免3天(D10)后,各组实验动物血清IgG抗体滴度均显著高于一免。
“抗原+第一佐剂组合物”与“抗原+第二佐剂组合物”实验组诱导IgG抗体滴度相接近,均高于剩余实验组。
综上可知,基于本发明中方法所制备得到的添加第一佐剂组合物和第二佐剂组合物佐剂的疫苗制剂,在BALB/c小鼠体内可迅速诱导产生良好的特异性免疫反应。
实施例6:重组狂犬病疫苗的免疫原性考察。
(1)BALB/c小鼠的免疫:实验分组:将SPF级BALB/c小鼠随机分为3组,分别为自制疫苗免疫组(采用实施例3所制备得到的疫苗制剂)、市售疫苗免疫组[市售冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)]、生理盐水免疫组。每组10只BALB/c小鼠,共30只,详细分组如下所示。其中,市售疫苗免疫组采用的为基于传统灭活技术的冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。
表6、小鼠分组及免疫方案
实验组 | 数量 | 注射方式 | 注射次数 | 注射剂量 |
自制疫苗 | 10 | 肌肉注射 | 2 | 0.1剂 |
市售疫苗 | 10 | 肌肉注射 | 2 | 0.1剂 |
生理盐水 | 10 | 肌肉注射 | 2 | 0.1剂 |
免疫方式:供试品在使用前轻轻摇匀,使用300μL一次性无菌注射器和针头除冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)(市售疫苗)抽取100μL,剩余供试品抽取50μL,对小鼠大腿外侧进行肌肉注射。
免疫时间:首免(D0)间隔7天加免,总计两次免疫。
血清采集:各试验组实验动物在免前(D-1)以免后D3、D6、D10、D15以及D20天采血,分离血清,-70℃冻存备用。
(2)抗血清中特异性抗体的ELISA检测:将抗原用包被液稀释成2μg/mL,100μL/孔包被ELISA板,4℃过夜。用洗涤液洗3次后,每孔加入200μL封闭液,25℃封闭1小时。封闭结束后倒掉封闭液,将鼠抗血清倍比稀释后和小鼠阴性血清加入ELISA板,100μL/孔,在25℃下孵育2小时。用洗涤液洗3次后,加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1:10000),100μL/孔,在25℃下孵育1小时。用洗涤液洗5次后,加入TMB底物显色液,25℃避光反应15分钟,加100μL终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度,定为该样品的滴度。
(3)结果:通过ELISA检测结合IgG抗体滴度,检测结果抗体曲线见图7。一免后,自制疫苗免疫组动物血清中IgG抗体滴度高于市售疫苗免疫组,且均高于阴性对照。二免后,各组实验动物血清中IgG抗体滴度均显著高于一免。在D15天时,各组实验动物血清中IgG抗体滴度达到峰值。在D20天,自制疫苗免疫组动物血清中诱导IgG抗体滴度保持稳定,其余组别动物血清中IgG抗体滴度均有降低。
综上,自制和市售疫苗在BALB/c小鼠体内能产生良好特异性免疫反应,且自制疫苗诱导的免疫原性优于市售疫苗。
以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提,还可以做出若干变形和改进,包括但不限于比例、流程、用量和反应容器的调整,例如采用连续流动反应器,这些都属于本发明的保护范围之内。以上所述的是本发明的优选实施方式和相应实施例,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提,还可以做出若干变形和改进,包括但不限于比例、流程、用量的调整,这些都属于本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种重组狂犬病疫苗,其特征在于,包括:
重组狂犬病病毒g蛋白、药用辅料和疫苗佐剂;
其中,所述重组狂犬病病毒g蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述重组狂犬病病毒g蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述重组狂犬病疫苗,其特征在于,每毫升的所述重组狂犬病疫苗中包含有50μg-300μg的重组狂犬病病毒g蛋白。
3.如权利要求1所述重组狂犬病疫苗,其特征在于,所述药用辅料在每毫升的所述重组狂犬病疫苗中包括如下含量的组分:
聚山梨酯80,100μg-500μg;
蔗糖,20mg-100mg;
氯化钠,1mg-9mg。
4.如权利要求1所述重组狂犬病疫苗,其特征在于,所述疫苗佐剂为第一佐剂组合物或第二佐剂组合物;
所述第一佐剂组合物和所述第二佐剂组合物中均包括:DOPC、胆固醇和QS-21。
5.如权利要求4所述重组狂犬病疫苗,其特征在于,以每毫升的所述重组狂犬病疫苗计,所述第一佐剂组合物包含如下含量的组分:
DOPC,700μg-3000μg;
胆固醇,175μg-750μg;
QS21,35μg-120μg。
6.如权利要求4所述重组狂犬病疫苗,其特征在于,所述第二佐剂组合物中除了DOPC、胆固醇和QS-21之外,还包括DOTAP和Poly I:C。
7.如权利要求6所述重组狂犬病疫苗,其特征在于,以每毫升的所述重组狂犬病疫苗计,所述第二佐剂组合物包含如下含量的组分:
DOPC,500μg-2000μg;
胆固醇,175μg-600μg;
QS21,50μg-120μg;
DOTAP,70μg-240μg;
Poly I:C,400μg-900μg。
8.一种重组狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于,包括:
将重组表达质粒依次经表达处理和纯化处理,得到重组狂犬病病毒g蛋白;
取疫苗佐剂,加入所述重组狂犬病病毒g蛋白的原液,调节pH值值6.0-7.0,使用注射用水定容后分装,即得到所述重组狂犬病疫苗。
9.如权利要求8所述重组狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于,所述表达处理,包括:
取所述重组表达质粒转化进DH5α化学感受态细胞中,并挑单克隆进行测序,获得基因工程转化的单克隆菌株;
将所述单克隆菌株扩增培养后,进行质粒纯化,得到转染级质粒;
利用PEI包裹,将所述转染级质粒转染进入CHO细胞,进行重组蛋白表达,收集得到表达上清液;
所述纯化处理,包括:
将表达上清液进行超滤浓缩,得到浓缩后的表达上清液;
对所述浓缩后的表达上清液进行亲和层析,收集洗脱液,得到所述重组狂犬病病毒g蛋白的原液。
10.如权利要求8所述重组狂犬病疫苗的制备方法,其特征在于,所述重组狂犬病疫苗的制备方法还包括:
制备得到所述疫苗佐剂;所述疫苗佐剂为第一佐剂组合物和第二佐剂组合物中的任意一种;
其中,在所述疫苗佐剂为所述第一佐剂组合物时,所述制备得到所述疫苗佐剂,包括:
利用DOPC和胆固醇制备得到中性脂质体;
将磷酸盐缓冲液和中性脂质体混合后,再加入QS-21和药用辅料混合,得到所述第一佐剂组合物;
在所述疫苗佐剂为所述第二佐剂组合物时,所述制备得到所述疫苗佐剂,包括:
利用DOPC和胆固醇制备得到中性脂质体;以及,利用DOTAP、DOPC和胆固醇制备得到阳离子脂质体;
将QS-21、Poly I:C、阳离子脂质体、中性脂质体及药用辅料混合后,得到所述第二佐剂组合物。
11.一种如权利要求1-7任一项所述的重组狂犬病疫苗在制备用于治疗和/或预防狂犬病毒引起疾病的产品的应用,其特征在于,所述产品包括疫苗产品、药物、诊断试剂和检测试剂盒。
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