MX2012013451A

MX2012013451A - Vectores de parapoxvirus que contienen el antigeno del virus de la rabia.

Info

Publication number: MX2012013451A
Application number: MX2012013451A
Authority: MX
Inventors: Olivier Michel Martinon; Nanda Kumar Damavarapu Reddy
Original assignee: Ah Usa 42 Llc
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2013-01-22
Also published as: KR20150015551A; KR20130008645A; US20110287051A1; RU2012149036A; AU2011254315A1; CN103260644A; JP5890399B2; RU2545694C2; MX338052B; CA2798055C; CL2012003219A1; AU2011254315B2; CA2798055A1; BR112012029633A8; WO2011145013A1; EP2571521A1; JP2013535953A; ZA201208264B; NZ603431A; CO6670515A2

Abstract

La presente invención se refiere a parapoxvirus recombinantes portadores en sus genomas que comprenden ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia, a la preparación de dichos constructos y a su uso en composiciones inmunogénicas y vacunas; además se refiere al uso de parapoxvirus recombinantes para diagnóstico.

Description

VECTORES DE PARAPOXVIRUS QUE CONTIENEN EL ANTÍGENO DEL VIRUS DE LA RABIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a parapoxvirus recombinantes que contienen ADN heterologo derivado de un virus de la rabia (RV) y de su uso en composiciones ¡nmunógenas y vacunas. Esto se refiere también a procedimientos para vacunar contra, tratar, o evitar enfermedad causada por virus de la rabia. Se refiere adicionalmente al uso de parapoxvirus recombinantes para diagnósticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los virus de la familia Poxviridae son ovales, bastante largos, de doble cadena de ADN. El género Parapoxvirus (PPV) está incluido entre estos virus. Miden aproximadamente 220-300 nm de largo por 140-170 nm de ancho. Poseen un revestimiento espiral único que los distingue de otros poxvirus.

Los PPV se dividen en tres especies diferentes. Sin embargo, aún no se ha aclarado si estos virus son especies autónomas dentro del género Parapoxvirus o si son la misma especie. La primera especie, Parapoxvirus ovis, se considera como el prototipo del género. También se denomina virus del ectima contagioso, virus de la dermatitis pustular contagiosa o virus orf. El segundo, Parapoxvirus bovis 1 , se llama también virus de la estomatitis papular bovina o virus de la estomatitis papulosa. El tercero, Parapoxvirus bovis 2, se llama también udderpoxvirus, virus paravaccinia, virus pseudocowpox, o virus de los nodulos del ordeñador.

Las especies de Parapoxvirus son endémicas en rumiantes. Se han encontrado PPV en el ciervo rojo, el reno, las ardillas rojas y los lobos marinos. Las infecciones con PPV pueden causar enfermedades locales tanto en animales como en el hombre. Los huéspedes de la zoonosis de las especies de PPV son ovejas, cabras y ganado vacuno. Causan infecciones en seres humanos a través de contacto directo con animales infectados, que reaccionan con lesiones epidérmicas localizadas que sanan sin cicatrizar. Las medidas preventivas, tales como vacunas, se pueden usar para controlar las enfermedades.

Los vectores para expresar información genética extraña basada en virus avipox, racoonpox, capripox, swinepox, o vaccinia se han descrito anteriormente (véanse documentos US 5,942,235 y US 7,094,412). Parapoxvirus representan diferentes candidatos que se pueden usar en vacunas vectorizadas. Sin embargo, debido a las diferencias morfológicas, estructurales y genéticas entre los géneros individuales de los parapoxvirus, los procedimientos usados para estos poxvirus no se pueden usar para Parapoxvirus. Un ejemplo de tales diferencias es que ORFV está perdiendo un gen de timidina quinasa (TK), que se usa para selección de recombinantes en los diferentes ortopoxvirus. Además, algunos poxvirus tienen la capacidad de aglutinar eritrocitos, que está mediada por medio de una proteína de superficie, la hemaglutinina, mientras que los Parapoxvirus no.

PPV pueden tener un efecto inmunomodulador debido a que estimulan reacciones inmunes generalizadas (no específicas) en vertebrados. Se han usado exitosamente en medicina veterinaria para incrementar resistencia general en animales. Se pueden combinar con un antígeno homólogo y/o heterólogo para proporcionar vacunas que tengan un efecto específico de patógenos que dura de meses a años, así como un efecto no específico de patógeno rápido.

Parapoxvirus ovis se ha usado previamente como un vector como se describe en la Patente de los Estados Unidos 6,365,393 y en Rziha y col., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145. Ello ofrece ventajas notables cuando se usa como un vector, incluyendo un intervalo de huésped muy estrecho, carencia de infección sistémica, inmunidad específica de vector a corto plazo (permitiendo inmunizaciones repetidas), vacunación temprana (inducción de inmunidad puede iniciarse en presencia de anticuerpos maternales) y propiedades de modulación inmunes benéficas. La presente invención se refiere a usar Parapoxvirus como un vector para ADN heterólogo derivado del virus de la rabia.

La cepa D1701 de Parapoxvirus ovis es una cepa altamente atenuada que se puede propagar en cultivo celular con valoraciones comparables a aquellas del virus de tipo silvestre. Tiene propiedades estimulantes inmunitarias destacables tanto en huéspedes que dan soporte a replicación del virus de vector de la infección (por ejemplo, ovejas y cabras) y en huéspedes que no (por ejemplo, perros, puercos, caballo, ratón y rata). Zylexis®, anteriormente conocido como Baypamune®, que es una preparación de Parapoxvirus ovis químicamente inactivado, derivado de cepa D1701 , se usa para la profilaxis, metafilaxis y tratamiento terapéutico de enfermedades infecciosas y para evitar enfermedades inducidas por estrés en animales.

El virus de la rabia (RV), Neurotropic lyssavirus, es un miembro de la familia Rhabdoviridae. Es un virus neurotrófico que causa enfermedades fatales en seres humanos y otros mamíferos. La rabia se transmite lo más a menudo a través del mordisco de un animal rabioso, con la transmisión teniendo lugar a través de la saliva de los animales. La inmensa mayoría de los casos de rabia comunicado en los Centros de los Estados Unidos para Control y Prevención de Enfermedades (CDC) tienen lugar cada año en animales salvajes tales como visones, mofetas, murciélagos y zorros. La rabia es aún una enfermedad altamente prevalente, especialmente en países en desarrollo. Aproximadamente 50,000 personas mueren cada año de rabia. El riesgo más alto de infección para seres humanos es a partir de perros rabiosos.

El virus de la rabia es un virus de ARN de cadena simple, de sentido negativo que codifica 5 proteínas: nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), glicoproteína (G) y polimerasa (L). El virus en forma de bala maduro, que promedia aproximadamente 180 nm en longitud y 75 nm en anchura, tiene un núcleo de ribonucleoproteína, una cobertura proteica y una envoltura lipidica. Las proyecciones de glicoproteínas, que son de aproximadamente 5-10 nm de longitud y de aproximadamente 3 nm en diámetro, recubren la superficie externa de los virus. Forman aproximadamente 400 púas dispuestas estrictamente en trímeros.

RV tiene una afinidad alta por el tejido nervioso. La razón para ello no se conoce. Sin embargo, puede ser que la proteína G del virus de la rabia se pueda unir al receptor de acetilcolina (un receptor de neurotransmisor). Después de que RV se una a la célula huésped por medio de la proteína viral G, el virus se absorbe dentro de la célula por inmersión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente infección generalmente se refiere generalmente a Parapoxviruses recombinantes y en particular a Parapoxvirus ovis (PPVO). El parapoxvirus recombinante se usa para mediar una respuesta inmune innata rápida, así como una inmunidad específica de gen ajeno de larga duración contra virus de la rabia. En una modalidad, un parapoxvirus recombinante comprende ADN heterólogos derivados de un virus de la rabia. En una modalidad, el parapoxvirus recombinante comprende la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En una modalidad, el parapoxvirus recombinante comprende la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis.

En una modalidad, el parapoxvirus recombinante comprende el gen que codifica la proteína G del virus de la rabia, o fragmentos de la misma. En una modalidad, el parapoxvirus recombinante comprende SEQ ID NO: 4 o una molécula polinucleotídica que tiene al menos identidad del 98% con la SEQ ID NO: 4. En una modalidad, el ADN heterologo está insertado dentro del fragmento HindIII H/H de la cepa D1701 del Parapoxvirus ovis. En otra modalidad, el ADN heterologo está insertado dentro de la secuencia codificante de VEGF o de las secuencias no codificantes dentro del fragmento de HindIII H/H de la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En aún otra modalidad, el Parapoxvirus recombinante es Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

La presente invención abarca procedimientos de preparar un parapoxvirus recombinante que comprende insertar ADN heterologo dentro del genoma del parapoxvirus. En una modalidad, el procedimiento comprende el uso de Parapoxvirus ovis. En una modalidad, el procedimiento comprende el uso de la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En una modalidad, el procedimiento comprende el uso de la cepa D1701-V de Parapoxvirus ovis. En una modalidad, el ADN heterologo usado en el procedimiento comprende el gen codificado por la proteína G del virus de la rabia, o fragmentos del mismo. En una modalidad, el ADN heterologo usado en el procedimiento comprende SEQ ID NO: 4 o una molécula polinucleotídica que tiene al menos identidad del 98% con la SEQ ID NO: 4. En una modalidad del procedimiento, el AND heterologo está insertado dentro del fragmento HindIII H/H de la cepa D1701 del Parapoxvirus ovis. En otra modalidad, el ADN heterologo está insertado dentro de la secuencia codificante de VEGF o de las secuencias no codificantes adyacentes con el fragmento H/H de Hindlll de la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En una modalidad, el procedimiento comprende la preparación de Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

La presente invención abarca una composición inmunógena que comprende un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia y un vehículo. La presente invención abarca procedimientos de preparar una composición inmunógena que comprende combinar un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia y un vehículo. La presente invención también abarca una vacuna que comprende un parapoxvirus recombinante que comprende un ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia y un vehículo. La presente invención abarca un procedimiento de preparar una vacuna que comprende combinar un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia y un vehículo. En algunas de estas modalidades, los parapoxvirus recombinantes comprenden Parapoxvirus ovis, mientras que en algunos los parapoxvirus recombinantes comprenden cepa D1701 de Parapoxvirus ovis y en otros los parapoxvirus recombinantes comprenden cepa D1701-V de Parapoxvirus ovis. En algunas de estas modalidades, el ADN heterólogo comprende el gen que codifica la proteína G del virus de la rabia, o los fragmentos del mismo, mientras que en otras modalidades, el ADN heterólogo comprende SEQ ID NO: 4 o una molécula de polinucleótido que tiene al menos identidad del 98% con SEQ ID NO: 4. En algunas de estas modalidades, el ADN heterologo está insertado dentro del fragmento H/H de Hindlll de cepa 1701 de Parapoxvirus ovis. En otras de estas modalidades, el ADN heterologo está insertado dentro de la secuencia codificante de VEGF o dentro de las secuencias adyacentes no codificantes dentro del fragmento H/H de Hindlll de la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En algunas de estas modalidades, el parapoxvirus recombinante es Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

La presente invención abarca un procedimiento de inducir en un animal una respuesta inmune contra el virus de la rabia, que comprende administrar a un animal una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición inmunógena que comprende un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterologo derivado de un virus de la rabia y un vehículo. La presente invención abarca un procedimiento de vacunar un animal contra el virus de la rabia, que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de vacuna que comprende el parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterologo derivado de un virus de la rabia y un vehículo. La presente invención abarca un uso de un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterologo derivado de un virus de la rabia en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune contra el virus de la rabia en un animal. La presente invención abarca un uso de un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterologo derivado de un virus de la rabia en la preparación de un medicamento para vacunar un animal contra el virus de la rabia. En algunas de estas modalidades, el parapoxvirus recombinante comprende Parapoxvirus ovis, mientras que en algunas el parapoxvirus recombinante comprende cepa D 701 de Parapoxvirus ovis y en otras el parapoxvirus recombinante comprende cepa D1701-V de Parapoxvirus ovis. En algunas de estas modalidades, el ADN heterólogo comprende el gen que codifica la proteina G del virus de la rabia, o fragmentos del mismo, mientras que en otras modalidades el ADN heterólogo comprende SEQ ID NO: 4 o una molécula de polinucleótidos que tiene al menos identidad del 98% con la SEQ ID NO: 4. En algunas de estas modalidades, el ADN heterólogo está insertado dentro del fragmento H/H de Hindlll de cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En otra de estas modalidades, el ADN heterólogo está insertado dentro de la secuencia codificante de FEGF o de las secuencias no codificantes adyacentes dentro del fragmento H/H de Hindlll de cepa D1701 de Parapoxvirus ovis. En algunas de estas modalidades, el parapoxvirus recombinante es Parapoxvirus ovis D1701 -V-RabG. En algunas de estas modalidades, se induce una respuesta inmune protectora específica anti-proteína G. En otra de tales modalidades, la respuesta inmune es la inducción de anticuerpos séricos anti-proteínas G. En aún otras modalidades, la inducción da como resultado valoraciones de anticuerpos que exceden de 0.5 Unidades Internacionales por mi.

La presente invención proporciona procedimientos para determinar el origen de un Parapoxvirus presente en un animal. Los Parapoxvirus descritos en el presente documento pueden distinguirse de las cepas de tipo salvaje tanto en composición genómica como en proteínas expresadas. Tal distinción tiene en cuenta discriminación entre animales vacunados y animales infectados. La presente invención comprende un uso de un parapoxvirus recombinante como se enseña en el presente documento en un ensayo para la diferenciación de animales infectados de los vacunados (DIVA). En una modalidad, el Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG recombinante se usa en un ensayo de DIVA.

Estas y otras modalidades están descritas y comprendidas por la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Una mejor comprensión de la presente invención se obtendrá haciendo referencia a los dibujos acompañantes en los que: Figura 1 : Construcción de plásmido pdV-RabG. El gen G del virus de la rabia se inserta como un fragmento SamHI-EcoRI dentro del sitio de clonación múltiple (bases en las cajas) de pdV-Red , lo que dio como resultado plásmido pdV-RabG (7.7 kbp en tamaño). Se muestra la posición de los cebadores ORF32N (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). SEQ ID NO: 3 se muestra en la Figura.

Abreviaturas: Sm = Sma\, H3 = Hind U, EcoV = EcoRV, P = Pst\, B = eamHI, K = Kpn\, E = EcoRI, S = Sa/I. F9L y ORF3 indican la presencia de los genes de PPVO F9L (ORF 131 ) y ORF3 (ORF 133). Pvegf indica la presencia del promotor vegF-E usado para controlar expresión del gen G insertado. (P) y (H3) representan los sitios de restricción de Pst\ y de Hind\\\ destruidos de la estructura principal del vector del plásmido pSPT-18, se indican los promotores T7 y SP6 de pSP-18, respectivamente. La figura no está dibujada a escala.

Figuras 2A-2D: Respuesta de anticuerpo sérico neutralizante (SNT) de virus después de inmunización con diferentes dosis de D1701-V-RabG. Grupos de ratones C57/BL6 (por cada día n = 6 ó 7) se inmunizaron con una dosis individual de D1701-V-RabG usando 107 U.F.P. (unidades formadoras de placa) (Figura 2A), 106 UFP (Figura 2B), 105 UFP (Figura 2C) y 04 UFP (Figura 2D). Los sueros individuales se tomaron diariamente durante 14 días después de la inmunización (d1 a d14).

Figuras 3A y 3B: Experimento de puesta a prueba de ratones inmunizados. Los ratones C57/BL6 recibieron una dosis individual de D1701-V-RabG como se indica (107 a 104 UFC) y se infectaron poniéndose a prueba intracranealmente 2 semanas después con al menos DL50 3400 (4.8 X 105 UFP) de cepa CVS virulenta de RV. La Figura 3A muestra las curvas de supervivencia de los animales individuales en cada grupo, mientras que la Figura 3B los mismos resultados se trazan en porcentaje de supervivientes.

Figura 4. SEQ ID NO: 4 - Secuencia de la región codificante de longitud total del gen G del virus de la rabia (1575 nt) más 7 nt en el extremo 5' y 6 nt en el extremo 3 como secuencias de engarce para análisis de enzimas de restricción (BamHI y EcoRI).

Figuras 5A y 5B. Papel de las células T para inmunidad protectora. CD4-lmm es el grupo inmunizado con antisueros específicos para células CD4. CD8-lmm es el grupo inmunizado con antisueros específicos de células T CD8. CD4/8-lmm es el grupo inmunizado con antisueros específicos para células T CD4/CD8. C Inm es el grupo control vacunado con D1701-V-RabG, que no recibió antisueros. C no inmunizados es el grupo control que no se vacunó con D1701-V-RabG y no recibió antisueros. "Días tras la puesta a prueba" es el número de días tras la puesta a prueba con la cepa de rabia CVS.

Figura 6. Protección vista con vacunación tras exposición. No inmunizados es el grupo control que no se vacunó con D1701-V-RabG. D1701-V-RabG es el grupo que se vacunó con D1701-V-RabG. CVS es la cepa de virus de la rabia virulento. "Días tras la puesta a prueba" es el número de días tras la puesta a prueba con la cepa de RV CVS.

Figura 7. Protección vista con diversos regímenes de vacunación tras la exposición. Los cuadros grises indican los días en los que los ratones se vacunaron con D1701-V-RabG.

Figure 8. Respuesta de anticuerpos séricos (determinada como anticuerpos de neutralización sérica, SNT) 6 días y 13 días después de la inmunización. Los ratones se inmunizaron con D1701-V-RabG intravaginalmente (i.vag.), por escarificación, intraperitonealmente (i.p.), intradérmicamente (i.d.), ¡ntranasalmente (i.n.), subcutáneamente (s.c), intramuscularmente (i.m.), o intravenosamente (i.v.).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que se entienden comúnmente por cualquiera de habilidad ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera lo contrario por el contexto, los términos singulares incluyen pluralidades y los términos plurales incluyen el singular.

Las siguientes definiciones se pueden aplicar a términos empleados en la descripción de modalidades de la invención. Ellas reemplazan cualesquiera definiciones contradictorias contenidas en cada referencia individual incorporada en el presente documento por referencia.

"Cerca de" o "aproximadamente", cuando se usan en relación con una variable numérica medible, se refieren al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que estén dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95% para el promedio) o dentro del 10 por ciento del valor indicado, cualquiera de los cuales es grande, a menos que se use cerca de en referencia a los intervalos temporales en semanas donde "cerca de 3 semanas" es de 17 a 25 días y cerca de 2 a cerca de 4 semanas es 10 a 40 días.

"Coadyuvante", como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que sirve como un estimulador no específico de la respuesta inmune. Véase más adelante para una definición adicional de coadyuvantes.

El término "animal" o "sujeto animal", como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que es susceptible a infecciones de rabia, incluyendo mamíferos, tanto domesticados como salvajes.

"Anticuerpo", como se usa en el presente documento, es cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno sin tener en cuenta la fuente, procedimientos de producción, u otras características. Ello se refiere a una molécula de ¡nmunoglobulina o a un fragmento de la misma que se une específicamente a un antígeno como un resultado de una respuesta inmune a ese antígeno. Las inmunoglobulinas son proteínas séricas compuestas de cadenas polipeptídicas "ligera" y "pesada" que tienen regiones "constante" y "variable" y se dividen en clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM) en base a la composición de las regiones constantes. Un anticuerpo que es "específico" para un antígeno dado indica que las regiones variables del anticuerpo reconocen y unen un antígeno específico exclusivamente. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonales. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes, o pueden ser partes inmunorreactivas de ¡nmumnoglobulinas intactas. Un "anticuerpo" puede convertirse en una proteína de unión a antígeno, que incluye pero no se limita a fragmentos de anticuerpo.

El término "antígeno" o "¡nmunógeno", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos) que tras exposición a un sujeto inducirán una respuesta inmunitaria que es específica para cada antígeno. El término "antígeno" se puede referir a bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios vivos atenuados, inactivados o modificados. El término "antígeno" como se usa en el presente documento se puede referir también a una subunidad de antígeno, que está separado y diferenciado a partir de un organismo entero con el que el antígeno está asociado en la naturaleza. El término antígeno también se refiere a anticuerpos, tales como anticuerpos antiidiotípicos o fragmentos de los mismos, y a mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o un determinante antigénico (epítopo). El término "antígeno" se puede referir también a un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno o determinante antigénico in vivo, tales como en aplicaciones de inmunización de ADN.

"Tampón" significa un sistema químico que previene el cambio en la concentración de otra sustancia química, por ejemplo, sistemas de dadores y aceptores de protones sirven como tampones que previenen cambios marcados en la concentración iónica de hidrógeno (pH). Otro ejemplo de un tampón es una solución que contiene una mezcla de un ácido débil y su sal (base conjugada) o una base débil y su sal (ácido conjugado).

El término "línea celular" o "célula huésped", tal como se usa en el presente documento, significa una célula procariota o eucariota en la que un virus puede replicarse y/o mantenerse.

"Respuesta inmunitaria celular" o "respuesta inmunitaria mediada por células" es una mediada por linfocitos T u otros leucocitos o ambos, e incluye la producción de citocinas, quimiocinas y moléculas similares producidas por linfocitos T activados, leucocitos, o ambos.

"Sustitución conservadora" se define en la técnica y es conocida para un experto en la técnica, y se reconoce por clasificar residuos de acuerdo con sus propiedades físicas relacionadas.

El término "cultivo", tal como se usa en el presente documento, significa una población de células o microorganismos que crecen en ausencia de otras especies o tipos.

El término "DIVA", tal como se usa en el presente documento, significa diferenciar animales infectados de los vacunados.

"Dosis" se refiere a una vacuna o composición inmunogénica dada a un sujeto. Una "primera dosis" o "vacuna iniciadora" se refiere a la dosis de una composición tal dada el día 0. Una "segunda dosis" o una "tercera dosis" o una "dosis anual" se refiere a una cantidad de tal composición dada posteriormente a la primera dosis, que puede ser o no la misma vacuna o composición inmunogénica que la primera dosis.

Un "epítopo" es el sitio específico del antígeno que se une a un receptor de linfocitos T o anticuerpo específico, y comprende normalmente de desde aproximadamente 3 residuos de aminoácidos hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácidos.

"Excipiente" se refiere a cualquier componente de una vacuna o composición inmunogénica que no es un antígeno.

"Fragmento" se refiere a una parte truncada de una proteina o gen. "Fragmento funcional" y "fragmento biológicamente activo" se refiere a un fragmento que retiene las propiedades biológicas del gen o proteína de longitud completa. Un "fragmento ¡nmunogénicamente activo" se refiere a un fragmento que permite una respuesta ¡nmunitaria.

El término "proteína G", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína en las proyecciones de glucoproteína que cubren la superficie externa de un virus de la rabia.

El término "heterólogo", tal como se usa en el presente documento, significa derivado de una especie o cepa diferente.

El término "homólogo", tal como se usa en el presente documento, significa derivado de la misma especie o cepa.

"Homología" o "porcentaje de homología" se refiere al porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos en las secuencias comparadoras después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y considerando también cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia.

"Respuesta ¡nmunitaria humoral" se refiere a una que está al menos en parte mediada por anticuerpos.

"Identidad" o "porcentaje de identidad" se refiere al porcentaje de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos en la secuencia comparadora después de alinear ambas secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considera cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia.

"Respuesta inmunitaria" en un sujeto se refiere al desarrollo de una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria humoral y celular a un antígeno. La respuesta inmunogénica puede ser suficiente para los propósitos de diagnóstico o de prueba o puede ser adecuada para prevenir signos o síntomas de enfermedad, incluyendo efectos adversos para la salud o complicaciones de los mismos, provocados por infección con un agente de enfermedad. Las respuestas inmunitarias se pueden determinar normalmente usando inmunoensayos estándar y ensayos de neutralización que se conocen en la técnica.

"Inmunogénico" o "inmunogenicidad", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de permitir una respuesta inmunitaria dirigida específicamente contra un antígeno.

Los términos "composición inmunogénica," o "cantidad inmunológicamente efectiva," o "cantidad efectiva para producir una respuesta inmunitaria," tal como se usa en el presente documento, se refiere a una composición o antígeno que se puede reconocer por el sistema inmunitario, dando como resultado la generación de una respuesta inmunitaria especifica (es decir, tiene actividad inmunogénica) cuando se administra sola o con un vehículo farmacéuticamente aceptable, a un animal.

"Aislado", tal como se usa en el presente documento, significa retirado de su entorno natural, solo o bien en una célula huésped heteróloga, o cromosoma o vector (por ejemplo, plásmido, fago, etc.). "Bacterias aisladas", "bacterias anaerobias aisladas", "cepa bacteriana aislada", "virus aislado" "cepa vírica aislada" y similares se refieren a una composición en la que las bacterias o los virus están sustancialmente libres de otros microorganismos, por ejemplo, en un cultivo, tal como cuando se separan de su medio natural. "Aislado", cuando se usa para describir cualquier sustancia definida particularmente, tal como un polinucleótido o un polipéptido, se refiere a la sustancia que se separa del medio celular original en el que la sustancia (tal como un polipéptido o ácido nucleico) se halla normalmente. Por lo tanto, tal como se usa en el presente documento, sólo a modo de ejemplo, una línea celular recombinante construida con un polinucleótido de la invención hace uso del ácido nucleico aislado. De manera alternativa, si se reivindica o se usa una proteína particular o un fragmento inmunogénico específico como una vacuna u otra composición, se debe considerar que está aislado debido a que se ha identificado, separado y en cierta medida purificado en comparación con cómo puede existir en la naturaleza. Si la proteína o un fragmento inmunogénico específico de la misma se produce en una bacteria recombinante o vector de expresión eucariota que produce el antígeno se considera que existe como ácido nucleico o proteína aislada. Por ejemplo, una línea celular recombinante construida con un polinucleótido hace uso de un ácido nucleico "aislado".

"Agente medicinal" se refiere a cualquier agente que sea útil en la prevención, cura o mejora de la enfermedad, o la prevención de alguna afección fisiológica o aparición.

El término "multiplicidad de infección" (MOI) se refiere a una proporción del número de organismos por célula, que detalla cuánto inoculo se va a usar en una infección dada.

Los términos "parapoxvirus", "cepas de parapoxvirus", tal como se usan en el presente documento, se refieren a virus que pertenecen a la familia Poxviridae y al género Parapoxvirus.

Los términos "Parapoxvirus ovis" and "Parapoxvirus ORFV", tal como se usan en el presente documento, se refieren a virus que pertenecen a la familia Poxviridae, al género Parapoxvirus y la la especie Parapoxvirus ovis. Estos virus también se denominan virus del ectima contagioso, virus de dermatitis pustulosa contagiosa o virus orf. Poseen un revestimiento de espiral único que los distingue de otros poxvirus.

El término "Cepa de Parapoxvirus ovis D1701 " se refiere al virus tal como se describe en la patente de los Estados Unidos 6,365,393, que está incorporada en el presente documento por referencia. "La cepa de Parapoxvirus ovis D1701-V" se refiere a la cepa de Parapoxvirus ovis D1701 adaptada a la linea celular de simio Vero.

"Administración parenteral" se refiere a la introducción de una sustancia, tal como una vacuna, dentro del cuerpo de un sujeto a través de o por medio de una ruta que no incluye en tubo digestivo. La administración parenteral incluye administración subcutánea, intramuscular, transcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intraocular e intravenosa.

El término "patógeno" o "microorganismo patógeno", tal como se usa en el presente documento, significa un microorganismo (por ejemplo, un virus de la rabia) que es capaz de inducir o provocar una enfermedad, síndrome o estado anormal en su animal huésped.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a sustancias, que están dentro del alcance del juicio médico sólido, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de sujetos sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica indebidas, y similares, que se corresponden con una proporción beneficio frente a riesgo razonable, y efectivas para su uso deseado.

El término "poxvirus", tal como se usa en el presente documento, se refiere a virus que pertenecen a la familia Poxviridae. Estos virus son virus de ADN bicatenario, bastante grandes, ovales.

El término "polinucleótido" o "molécula polinucleotídica", como se usa en el presente documento, significa una molécula polimérica orgánica compuesta de monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos con distinta función biológica.

Los términos "prevenir", "previniendo" o "prevención", y similares, tal como se usan en el presente documento, significan inhibir la replicación de un microorganismo, inhibir la transmisión de un microorganismo, o inhibir a un microorganismo de establecerse por sí mismo en un huésped. Estos términos y similares, tal como se usan en el presente documento, también pueden significar inhibir o bloquear uno o más signos o síntomas de infección. El tratamiento se considera terapéutico si hay una reducción en la carga de microorganismos.

"Protección", "proteger", y similares, tal como se usa en el presente documento con respecto a una vacuna u otra composición, significa que la vacuna o composición previene o reduce los síntomas de la enfermedad provocada por el organismo del que el/los antígeno(s) usado(s) en la vacuna o composición se deriva. Los términos "protección" y "proteger" y similares, también significan que la vacuna o composición se puede usar para tratar terapéuticamente la enfermedad o uno de más síntomas de la enfermedad que ya existe en un sujeto.

El término "virus de la rabia" se refiere a Neurotropic lyssavirus, un miembro de la familia Rhabdoviridae. Es un virus de ARN de sentido negativo, bicatenario, que tiene proyecciones de glucoproteina sobre su superficie externa.

"PPV recombinante" o "PPV recombinante" son PPV que tienen inserciones y/o deleciones en su genoma. Las inserciones o deleciones están preparadas usando procedimientos de biología molecular.

"Homólogos de especies" incluyen genes hallados en dos o más especies diferentes que poseen homología de secuencia de polinucleótidos sustancial y poseen las mismas, o similares, funciones y/ propiedades biológicas. Preferentemente las secuencias de polinucleótidos que representan homólogos de especies hibridarán bajo condiciones moderadamente restrictivas, tal como se describe en el presente documento por ejemplo, y poseen las mismas o similares actividades y/o propiedades biológicas. En otro aspecto, los polinucleótidos que representan homólogos de especies compartirán más de aproximadamente el 60% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 70% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 80% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 90% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 95% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 96% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 97% de homología de secuencia, más de aproximadamente el 98% de homología de secuencia o más de aproximadamente el 99% de homología de secuencia.

Los términos "unión específica," "se une específicamente," y similares, se definen como dos o más moléculas que forman un complejo que se puede medir bajo condiciones de ensayo o fisiológicas y es selectivo. Se dice que un anticuerpo u otro inhibidor "se une específicamente" a una proteína si, bajo condiciones apropiadamente seleccionadas, tal unión no se inhibe sustancialmente, mientras que al mismo tiempo se inhibe la unión no específica. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y es selectiva para el compuesto o la proteína. La unión no específica normalmente tiene baja afinidad. La unión en anticuerpos IgG, por ejemplo, se caracteriza generalmente por una afinidad de al menos aproximadamente 10"7 M o mayor, tal como al menos aproximadamente 10"8 M o mayor, o al menos aproximadamente 10"9 M o mayor, o al menos aproximadamente 10"10 o mayor, o al menos aproximadamente 10" 1 M o mayor, o al menos aproximadamente 10~12 M o mayor. El término también es aplicable, por ejemplo, donde un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que no lo llevan numerosos antígenos, en este caso el anticuerpo que porta el dominio de unión a antígeno generalmente no se unirá a otros antígenos.

"Fragmento inmunogénico específico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una parte de una secuencia que se puede reconocer por un anticuerpo o linfocito T específico para esa secuencia.

"Sujeto" se refiere a cualquier animal que es susceptible a infecciones de rabia, incluyendo mamíferos, tanto domésticos como salvajes.

"Sustancialmente idénticas", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grado de identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99%.

"Cantidad terapéuticamente efectiva", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un antígeno o vacuna o composición que induciría una respuesta inmunitaria en un sujeto (por ejemplo, un perro) que recibe el antígeno o vacuna o composición que sea adecuada para prevenir o mejorar los signos o síntomas de enfermedad, incluyendo efectos adversos para la salud o complicaciones de los mismos, provocados por la infección con un patógeno, tal como un virus, una bacteria, un parásito o un hongo. Se puede inducir inmunidad humoral o inmunidad mediada por células, o tanto la inmunidad humoral como la inducida por células. Las respuesta inmunogénica de un animal a un antígeno, vacuna o composición se puede evaluar indirectamente a través de la medida de valoraciones de anticuerpos, ensayos de proliferación de linfocitos, o directamente a través de la monitorización de señales y síntomas después de la exposición con la cepa de tipo salvaje. La inmunidad protectora conferida por una vacuna o composición se puede evaluar midiendo la reducción de la propagación del organismo expuesto y/o la reducción en los signos clínicos, tales como mortalidad, morbilidad, temperatura y condición física general, salud y comportamiento del sujeto. La cantidad de una vacuna o composición que es terapéuticamente efectiva puede variar, dependiendo del inmunogeno particular usado, o la afección del sujeto, y puede ser determinada por un experto en el técnica.

Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento", y similares, tal como se usan en el presente documento, significan reducir o eliminar una infección por un microorganismo. Estos términos y similares pueden significar también reducir la replicación de un microorganismo, reducir la transmisión de un microorganismo, o reducir la capacidad de un microorganismo para establecerse por sí mismo en su huésped. Estos términos y similares como se usan en el presente documento pueden significar también reducir, mejorar o eliminar uno o más signos o síntomas de infección por un microorganismo, o acelerar la recuperación de la infección por un microorganismo.

Los términos "vacunar" y "vacunando" y similares, tal como se usan en el presente documento, significan administrar a un animal una vacuna o composición inmunogénica.

Los términos "vacuna" y "composición de vacuna", tal como se usan en el presente documento, significan una composición que previene o reduce una infección, o que previene o reduce uno o más signos o síntomas de infección. Los efectos protectores de una composición de vacuna contra un patógeno se logran normalmente induciendo en el sujeto una respuesta inmunitaria. Hablando de manera general, las incidencias de infección abolidas o reducidas, la mejora de los signos o síntomas, o la eliminación acelerada del microorganismo de los sujetos infectados son indicativas de los efectos protectores de una composición de vacuna. Las composiciones de vacuna de la presente invención proporcionan efectos protectores contra infecciones provocadas por virus de la rabia.

El término "variante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una derivación de una proteína dada y/o de una secuencia de genes, en la que la secuencia derivada es esencialmente la misma que la secuencia dada, excepto por diferencias mutacionales. Dichas diferencias puede ser naturales, o se pueden generar sintética o genéticamente.

Un "vector" o "virus de vector" es un PPV que es adecuado para la inserción de ADN heterólogo, que puede transportar el ADN insertado en células u organismos y que, si es apropiado, permite que se exprese el ADN heterólogo.

El término "vehículo veterinariamente aceptable", tal como se usa en el presente documento, se refiere a sustancias, que están dentro del alcance del juicio médico sólido, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica indebidas, y similares, que se corresponden con una proporción beneficio frente a riesgo razonable, y efectivas para su uso deseado.

La siguiente descripción se proporciona para ayudar a aquellos expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. Aún así, esta descripción no debería interpretarse para limitar indebidamente la presente invención ya que se pueden hacer modificaciones y variaciones en las modalidades discutidas en el presente documento por aquellos expertos en la técnica sin apartarse del espíritu o del alcance del presente descubrimiento de la invención.

Virus, composiciones inmunogénicas y vacunas La presente invención abarca el uso de parapoxvirus para la preparación de un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia.

En una modalidad, se usa Parapoxvirus ovis (PPVO) para la preparación de un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia. En otra modalidad, se usa la cepa de Parapoxvirus ovis D1701. En una modalidad adicional, se usa la cepa de Parapoxvirus ovis D1701.

La secuencia genética insertada en el parapoxvirus incluye ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia. En una modalidad, el ADN heterólogo comprende el gen que codifica la proteína G del virus de la rabia, o fragmentos del mismo. En una modalidad, el ADN heterólogo comprende la SEQ ID NO: 4 o una molécula de polinucleótidos que tiene al menos el 98% de identidad con respecto a la SEQ ID NO: 4. La estructura de este gen se da a conocer adicionalmente, por ejemplo, por Anilionis et al., Nature 294, 275-278 (1981 ). El inserto es de 1588 nt de tamaño. La secuencia completa del inserto (SEQ ID NO: 4) se muestra en la figura 4. Contiene la región de codificación de longitud completa del gen G del virus de la rabia (1575 nt) más 7 nt en el extremo 5' y 6 nt en el extremo 3' como secuencias de engarce para el análisis de enzimas de restricción (BamHl y EcoRI).

Conocer la secuencia de un polinucleótido hace que que cada posible fragmento de ese polinucleótido esté fácilmente disponible. Por lo tanto, la invención proporciona fragmentos de la protema G. En una modalidad, se proporcionan fragmentos funcionales. En otra modalidad, se proporcionan fragmentos biológicamente activos. Los fragmentos se pueden purificar mediante procedimientos convencionales, tales como por ejemplo por filtración o cromatografía. Los fragmentos se pueden producir por recombinación mediante procedimientos conocidos por un experto en las técnicas.

Al preparar el parapoxvirus recombinante, el ADN heterólogo se inserta dentro del fragmento H/H de HindIII de la cepa de Parapoxvirus ovis D1701. En otra modalidad, el ADN heterogéneo se inserta dentro de la secuencia de codificación VEGF o adyacente a secuencias no codificantes dentro del fragmento H/H HindIII de la cepa de Parapoxvirus ovis D1701. Los procedimientos usados para insertar el ADN heterólogo en el parapoxvirus son estándar y conocidos por un experto en la técnica. Se describen en la patente de los Estados Unidos 6,365,393.

En una modalidad, el parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia es Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

En una modalidad, el parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia es D1701-VrV RabG (K-UC1002), que está depositado en The American Type Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA, 20108 USA con la designación de depósito de patente de ATCC® PTA-11662, en conformidad con el tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los propósitos del procedimiento de patentes.

La secuencia del plásmido pdV-RabG (7,692 nt) es la SEQ ID NO: 5, que se muestra en el listado de secuencias.

La invención también abarca secuencias de polinucleótidos, que tienen al menos aproximadamente el 99%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 93%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 55% y al menos aproximadamente el 50% de identidad y/o homología con respecto a las secuencias descritas en el presente documento.

La invención también abarca secuencias de polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de moderada a altamente restrictivas a la cepa no codificante, o complemento de una cualquiera de las SEQ ID NO descritas en el presente documento, y homólogos de especies de las mismas. Condiciones restrictivas altas a modo de ejemplo incluyen un lavado final en tampón que contiene 0.2X SSC/0.1 % SDS, de 65°C a 75°C, mientras que las condiciones restrictivas moderadas incluyen un lavado final en tampón que comprende 2X SSC/0.1 % SDS, de 35°C a 45°C. Se entiende en la técnica que las condiciones de restricción equivalentes se pueden lograr con la variación de la temperatura y del tampón, o la concentración de sal como se describe en Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Bioloqy, John Wiley & Sons (1994), pp. de 6.0.3 a 6.4.10.

El PPV recombinante se puede propagar en células, líneas celulares y células huésped. Dichas células, líneas celulares o células huésped pueden ser por ejemplo, pero no se limitan a, células de mamífero y células no de mamífero. Se conocen fácilmente células, líneas celulares y células huésped en las que el PPV se puede propagar y son accesibles a los expertos en la técnica. En una modalidad, se usan células Vero. En otras modalidades, se usan células de riñon bobino o de testículo ovino.

El PPV recombinante se puede atenuar adicionalmente o inactivar antes de su uso en una composición o vacuna inmunogénica. Los procedimientos de atenuación e inactivación son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos para atenuación incluyen, pero no se limitan a, paso en serie en el cultivo celular sobre una línea celular adecuada, irradiación ultravioleta y mutagénesis química. Los procedimientos para inactivación incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con formalina, betapropiolactona (BPL) o etilenoimina binaria (BEI), u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

La inactivación por formalina se puede realizar mezclando la suspensión de virus con formaldehido al 37% hasta una concentración de formaldehido final del 0.05%. La mezcla de virus-formaldehído se mezcla por agitación constante durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de virus inactivada se pone a prueba después para determinar los virus vivos residuales realizando un ensayo por crecimiento en una línea celular adecuada.

La inactivación por BEI se puede realizar mezclando la suspensión de virus de la presente invención con BEI 0.1 M (2-bromo-etilamina en NaOH 0.175 N) hasta una concentración de BEI final de 1 mM. La mezcla de vírus-BEl se mezcla con agitación constante durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente, seguido de la adición de tiosulfato de sodio 1.0 M hasta una concentración final de 0.1 mM. Se continúa la mezcla durante dos horas adicionales. La mezcla de virus inactivada se pone a prueba después para determinar los virus vivos residuales realizando un ensayo por crecimiento en una línea celular adecuada.

El PPV recombinante se puede usar en composiciones inmunogénicas y vacunas.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden incluir opcionalmente uno o más vehículos veterinariamente aceptables, incluyendo diluyentes líquidos, semisólidos, o sólidos, que sirven como vehículos farmacéuticos, excipientes o medios. Tal como se usa en el presente documento, un "vehículo veterinariamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, coadyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros conocidos por los expertos en la técnica. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros conocidos por el experto en la técnica. Los conservantes incluyen mertiolato, entre otros conocidos por el experto en la técnica.

Los coadyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el sistema coadyuvante RIBI (Ribi Inc.), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, coadyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero Block (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), coadyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galénica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, monofosforil-lípido A, coadyuvante amina lipoidal Avridina, enterotoxina lábil de E. coli (recombinante o de otra forma), toxina colérica, o dipéptido de muramilo, entre otros muchos conocidos por los expertos en la técnica. Las cantidades y concentraciones de coadyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención se pueden determinar fácilmente por el experto en la técnica. En una modalidad, la presente invención contempla composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden de desde aproximadamente 50 pg hasta aproximadamente 2000 pg de coadyuvante. En otra modalidad, el coadyuvante está incluido en una cantidad de desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 1500 pg, o de desde aproximadamente 250 pg hasta aproximadamente 1000 pg, o de desde aproximadamente 350 pg hasta aproximadamente 750 pg. En otra modalidad, el coadyuvante está incluido en una cantidad de desde aproximadamente 500 pg/2 mi de dosis de la composición inmunogénica o vacuna.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas también pueden incluir antibióticos. Tales antibióticos incluyen, pero no se limitan a, los de las clases de aminoglicósidos, carbapenems, cefalosporinas, glicopéptidos, macrólidos, penicilinas, polipéptidos, quinolonas, sulfonamidas, y tetraciclinas. En una modalidad, la presente invención contempla composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden de desde aproximadamente 1 pg/ml hasta aproximadamente 60 pg/ml de antibiótico. En otra modalidad, las composiciones inmunogénicas y vacunas comprenden de desde aproximadamente 5 pg/ml hasta aproximadamente 55 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 10 pg/ml hasta aproximadamente 50 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 15 pg/ml hasta aproximadamente 45 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 20 pg/ml hasta aproximadamente 40 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 25 pg/ml hasta aproximadamente 35 pg/ml de antibiótico. Aún en otra modalidad, las composiciones inmunogénicas y vacunas comprenden menos de aproximadamente 30 pg/ml de antibiótico.

Además del PPV recombinante, las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden incluir otros antígenos. Los antígenos pueden estar en forma de una preparación total o parcial inactivada del microorganismo, o en la forma de moléculas antigénicas obtenidas por técnicas de ingeniería genética o de síntesis química. Otros antígenos apropiados para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los derivados de bacterias patógenas o virus patógenos.

En el caso de perros, las composiciones inmunogénicas de la rabia recombinantes y vacunas también pueden contener opcionalmente una mezcla con uno o más antígenos caninos adicionales tales como, por ejemplo, Ehrlichia canis, parvovirus canino (CPV), moquillo, virus de parainfluenza canina (CPI), adenovirus canino tipo II (CAV-2), adenovirus canino (CDV), coronavirus canino (CCV), Leptospira icterohemorrhagiae (Ll), Leptospira canicola (LC), Leptospira grippotyphosa (LG), Leptospira pomona (LP), Borrelia burgdorferi, y similares. Una combinación de antígenos abarca aislados de parvovirus canino, moquillo, adenovirus canino y parainfluenza canina, con o sin coronavirus y Leptospira (incluyendo los serotipos emergentes de Leptospira grippotyphosa y Leptospira pomona).

En el caso de gatos, las composiciones inmunogénicas de la rabia recombinantes y vacunas también pueden contener opcionalmente una mezcla con uno o más antígenos felinos adicionales tales como, por ejemplo, calicivirus felino (FCV), Chlamydophila felis (C. felis, también denominado previa y comúnmente como Chlamydia psittaci (FCP)), virus de la leucemia felina (FeLV), virus de panleucopenia felina (FPV), virus de la rinotraqueitis felina (FVR), virus de inmunodeficiencia felina (FIV), virus de peritonitis infecciosa felina (FIPV), Bartonella henselae (por ejemplo, enfermedad por arañazo de gato) y similares.

En el caso de caballos, las composiciones inmunogénicas de la rabia recombinantes y vacunas también pueden contener opcionalmente una mezcla de uno o más antígenos equino adicionales tales como, por ejemplo, virus de influenza equina, herpesvirus equino 1 y 4, arterivirus equino, virus del Nilo occidental, rotavirus equino, Streptococcus equi, toxoide de tétano y similares.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas descritas en el presente documento se pueden administrar a un animal para inducir una respuesta inmunitaria efectiva contra RV. Por consiguiente, en el presente documento se describen procedimientos de estimulación de una respuesta inmunitaria efectiva contra RV que comprende administrar a un animal una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición inmunogénica o vacuna que comprende un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia. El procedimiento da como resultado la inducción de anticuerpos en suero de proteína anti-G.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas descritas en el presente documento se pueden administrar a un animal vacunando al animal contra la enfermedad de la rabia. Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden administrar al animal para prevenir o tratar la enfermedad de la rabia en el animal. Por consiguiente, en el presente documento se describen procedimientos de vacunación de un animal contra la enfermedad de la rabia y de prevención o tratamiento de la enfermedad de la rabia, que comprende administrar al animal una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición inmunogénica o vacuna que comprende un parapoxvirus recombinante que comprende ADN heterólogo derivado de un virus de la rabia.

Formas, dosificaciones, vías de administración Las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden fabricarse en varias formas en función de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden fabricarse en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable, o pueden fabricarse en formas liofilizadas usando técnicas de secado por congelación. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4°C y pueden reconstituirse en una solución estabilizante, por ejemplo, solución salina o y HEPES. Como alternativa, las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden conservarse mediante secado por congelación. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas también se pueden fabricar también en forma de suspensiones o emulsiones.

Las composiciones inmunogénicas y las vacunas incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz del VPP recombinante descrito con anterioridad. Los virus purificados se pueden usar directamente en una composición inmunogénica o vacuna, o pueden atenuarse adicionalmente, o inactivarse. Normalmente, una composición inmunogénica o vacuna contiene entre aproximadamente 1 >< 102 y aproximadamente 1 ^1012 UFP, o entre aproximadamente 1 x 103 y aproximadamente 1 x 101 1 UFP, o entre aproximadamente 1 * 104 y aproximadamente 1 1010 UFP, o entre aproximadamente 1 ? 105 y aproximadamente 1 ? 109 UFP, o entre aproximadamente 1 106 y aproximadamente 1 x 108 UFP. Un trabajador experto puede determinar la cantidad precisa de un virus en una composición inmunogénica o vacuna efectiva para proporcionar un efecto protector.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas comprenden, generalmente, un vehículo veterinariamente aceptable en un volumen de entre aproximadamente 0.5 mi y aproximadamente 5 mi. En otra modalidad, el volumen del vehículo está entre aproximadamente 1 mi y aproximadamente 4 mi, o entre aproximadamente 2 mi y aproximadamente 3 mi. En otra modalidad, el volumen del vehículo es aproximadamente 1 mi, o es aproximadamente 2 mi o es aproximadamente 3 mi o es aproximadamente 5 mi. Los vehículos veterinariamente aceptables adecuados para usar en composiciones inmunogénicas y vacunas pueden ser cualquiera de los descritos en el presente documento.

Los expertos en la técnica determinan fácilmente si se tiene que atenuar o inactivar un virus antes de su administración. En otra modalidad, el PPV recombinante se puede administrar directamente al animal sin atenuación adicional. La cantidad de un virus que es terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de varios factores, incluidas la afección del animal y el grado de infección, y trabajador experto puede determinarla.

De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, se puede administrar a los animales una dosis individual, o, alternativamente, pueden tener lugar dos o más inoculaciones con intervalos desde aproximadamente dos hasta aproximadamente diez semanas. Pueden ser necesarios regímenes de refuerzo y se puede ajustar el régimen de dosificación para proporcionar una inmunización óptima. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el régimen de administración óptimo.

Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden administrar directamente dentro del torrente sanguíneo, dentro del músculo o dentro de un órgano interno. Los medios adecuados para administración parenteral incluyen intravenoso, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular y subcutáneo. Los dispositivos adecuados para administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluidos los de microaguja), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.

Las formulaciones parenterales son, típicamente, soluciones acuosas que pueden contener excipientes como sales, carbohidratos y agentes de tamponación (preferentemente a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 7.5, o aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma desecada para usarse junto con un vehículo adecuado, tal como agua sin pirógenos estéril.

La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, se pueden llevar a cabo fácilmente usando técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los parapoxvirus recombinantes y las composiciones inmunogénicas y vacunas descritas en el presente documento se pueden usar en la preparación de un medicamento para vacunar a un animal contra la enfermedad de la rabia.

La presente invención proporciona procedimientos para determinar el origen de un parapoxvirus presente en un animal.

La vacunación que emplea una vacuna de DIVA, una que es capaz de diferenciar los animales infectados de los vacunados, proporciona un medio para determinar el origen de un parapoxvirus presente en un sujeto animal. Esta diferenciación puede lograrse por medio de cualquiera de diversos procedimientos diagnósticos, incluidos, entre otros, ELISA, transferencia de tipo de Western y PCR. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente estos y otros procedimientos.

Los parapoxvirus descritos en el presente documento se pueden distinguir de las cepas silvestres tanto por su composición genómica como por las proteínas que expresan. Tal distinción permite distinguir animales vacunados y animales infectados. Por ejemplo, se puede hacer una determinación en cuanto a que si un animal da resultados positivos para parapoxvirus en ciertas pruebas de laboratorio es portador de una cepa de parapoxvirus de tipo silvestre o es portador de parapoxvirus producidos por técnicas recombinantes obtenidos previamente por vacunación.

Se puede emplear una diversidad de ensayos para hacer la determinación. Por ejemplo, los virus se pueden aislar del animal que da positivo para parapoxvirus y se pueden usar ensayos basados en ácidos nucleicos para determinar la presencia de genoma de un parapoxvirus, indicativo de vacunación previa. Los ensayos basados en ácidos nucleicos incluyen análisis de transferencia de tipo Southern o Northern, PCR y secuenciación. Alternativamente, se pueden emplear ensayos basados en proteínas. En los ensayos basados en proteínas, las células o tejidos sospechosos de una infección se pueden aislar del animal que da resultados positivos para BVDV. Se pueden preparar extractos celulares a partir de tales células o tejidos y pueden someterse a, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo Western, usando los anticuerpos apropiados contra proteínas virales que pueden identificar inequívocamente la presencia del parapoxvirus producido por técnicas recombinantes previamente inoculado o del parapoxvirus de tipo silvestre.

La extensión y naturaleza de las respuestas inmunológicas inducidas en el animal se puede valorar usando una diversidad de técnicas. Por ejemplo, se pueden recoger sueros de los animales inoculados y se pueden someter a ensayo para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos específicos de parapoxvirus, por ejemplo en un ELISA convencional. Se puede lograr la detección de linfocitos T-citotóxicos (CTL) respondedores en tejidos linfoides mediante ensayos tales como proliferación de células T, como indicativo de la inducción de una respuesta inmunológica celular. En la técnica se describe bien las técnicas relevantes se describen, por ejemplo, en Coligan y col. Current Protocols ¡n Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).

En un ensayo DIVA se puede usar el parapoxvirus recombinante ovis D1701-V-RabG. En una modalidad, se puede usar en ensayos para la detección de genes o de proteínas N de la rabia para distinguir entre animales infectados y vacunados. En otra modalidad, se puede usar en ensayos para la detección de genes o de proteínas P de la rabia para distinguir entre animales infectados y vacunados. En otra modalidad más, se puede usar en ensayos para la detección de genes o de proteínas L de la rabia para distinguir entre animales infectados y vacunados. En todavía otra modalidad, se puede usar en ensayos para la detección de genes o de proteínas M de la rabia para distinguir entre animales infectados y vacunados.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes.

EJEMPLOS Se generó un Parapoxvirus ovis recombinante, que comprende el gen que codifica la proteína G del VR. Se evaluó la expresión de la proteína G, así como las propiedades inmunoestimuladoras y protectoras del virus recombinante contra el VR.

EJEMPLO 1 Generación del virus recombinante D1701-V-RabG que expresa la proteína G de la rabia Se generó un Parapoxvirus ovis recombinante, que contiene el gen que codifica la proteína G del VR. Se evaluó la expresión de la proteína G, así como las propiedades inmunoestimuladoras y protectoras del virus recombinante contra el VR.

Construcción del plásmido de transferencia Para generar el parapoxvirus ovis D1701-V-RabG recombinante se usó el sistema vector Parapoxvirus ovis (PPVO) (patente de EE.UU. 6,365,393; Rziha y col., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145; Fischer y col., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323; Henkel y col., 2005, J. Virol. 79, 314-325). El gen de la proteína G del virus de la rabia se sintetizó químicamente (Blue Heron Biotech; EE.UU.) y se proporcionó en un plásmido pUC. El gen G completo se aisló como un fragmento de ADN digerido con BamH\ - EcoR\ de un tamaño de 1 ,582 pb mediante electroforesis en gel (0.8% p/v) y se purificó con el kit de extracción en gel Qiagex II (Qiagen; Alemania). El plásmido pdV-Red (Fischer y col., 2003) se sometió a digestión doble con fíamHI y EcoRI y se usó para unión (Fast ligation kit, Promega; Alemania). Tras la transformación de E. coli, las clonias positivas al inserto DH5aF' (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; Alemania) se seleccionaron mediante digestión del ADN plasmídico con las enzimas de restricción EcoRI - Bam \. Esto tuvo como resultado el plásmido de transferencia pdV-RabG (Figura 1), que se preparó con el kit Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen; Alemania) y se usó para secuenciar el ADN. Para este fin se usó el cebador ORF32N (SEQ ID NO: 1 ; 5'-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3') localizado en dirección 3' del sitio de la inserción y el cebador ORF31 SEQ ID NO: 2; S'-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-S') localizado en dirección 3' del sitio de inserción en pdV-Red , además de los cebadores internos específicos del gen G RabG-F SEQ ID NO: 6; 5'-GGAGTCTCTCGTTATCATATCTC-3') y RabG-R SEQ ID NO: 7; 5'-CTAAACAAGGTGCTCAATTTCGT-3'), respectivamente. Esto permitió la determinación de la secuencia completa del gen G insertado SEQ ID NO: 4).

Selección de recombinantes mediante tinción Bluo-Gal Se infectaron células Vero (106 células) con 0.1 MOI (multiplicidad de la infección) del virus de expresión de lacZ D1701 -VrV y, 2 horas después, se transfeccionó con 2 µg de ADN del plásmido pdV-RabG mediante nucleofección, de acuerdo con la recomendación del fabricante (Amaxa Nucleofector, Lonza; Alemania). Los lisados víricos se recolectaron 3-4 días después y se usaron para titulación en células Vero en placas de 6 pocilios (Fisher Scientific; Alemania). Cuando se comenzaron a visualizar placas, se recubrió con Bluo-Gal con agarosa tal como se ha descrito (Fischer y col., 2003). Se escogieron las placas de virus que tenían un aspecto blanco y los eluatos de una sola placa (durante la noche a 4°C en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) se usaron para la infección simultánea de células Vero (1 X 105 células) en pocilios únicos de una placa de 58 pocilios.

Selección de recombinantes mediante PCR de placas.

El aislamiento del ADN de cada aislamiento de placas víricas se realizó en una modificación de Pasamontes y col. (J. Virol. Methods 35:137 -141 ; 1991). El lisado vírico (0.2 mi) se congeló (-70°C) y se descongeló (37°C) tres veces y se sometió a ultrasonidos 3 veces durante 20-30 segundos (baño de agua sónico). Tras la extracción en fenol y cloroformo, se añadieron 10 pg de ARNt de levadura o 3 pg de GlycoBlue (Ambion, Alemania) antes de la precipitación en etanol. El sedimento de ADN se lavó dos veces con etanol al 70% (v/v) y se disolvió después de secar en 14 µ? de agua bidestilada.

Para la PCR especifica de RabG, se mezclaron 4 µ? del ADN en hielo con 1 pl de la mezcla de cebadores que consiste en 4.0 pmol de RabG-F SEQ ID NO: 6) y 4.0 pmol de RabG-R SEQ ID NO: 7) y 5 pl de ReddyMix 2X PCR (Abgene, Thermo Fisher Scientific; Alemania). La PCR se realizó en un Trio Thermoblock (Biometra; Alemania) incubando durante 2 min a 98°C, seguido de 40 ciclos durante 1 minuto a 96°C, 30 segundos a 60°C, 30 segundos a 72°C, y una etapa de extensión final durante 2 minutos a 72°C. Los productos de la PCR se separaron en geles horizontales de agarosa 1 % (p/v)-bromuro de etidio (0.3 microgramos por mi). Los lisados víricos de los aislamientos de las placas que revelaban el fragmento de la PCR específica del gen G de tamaño de 433 pb se diluyeron y, además, se purificaron en placa al menos 3 veces, usando recubrimiento con Bluo-Gal agarosa tal como se ha descrito con anterioridad. Por último, el ADN de los aislamientos de placas víricas recombinantes positivos pata el gen G se analizaron en una PCR específica del gen LacZ usando 4 µ? de ADN, 3.95 pmol del cebador lacZ SEQ ID NO: 8; S'-CGATACTGTCGTCGTCCCCTCAA-S'), y 4.13 pmol del cebador lacZ-R SEQ ID NO: 9; 5'-CAACTCGCCGCACATCTGAACT-3'). Después de añadir 5 µ? AccuPrime SuperMix II (Invitrogen, Fisher Scientific; Alemania), la PCR se realizó calentando durante 2 minutos a 98°C, seguido de 40 ciclos durante 1 minuto a 96°C, 30 segundos a 62°C y 90 segundos a 68°C, con una etapa de extensión final durante 2 minutos a 68°C. La separación de los productos de PCR se realizó como se ha descrito con anterioridad. La ausencia del fragmento específico del gen LacZ de 508 pb de tamaño demostró que lo correspondientes aislamientos de las placas del virus recombinante no presentaban el virus parental de expresión de lacZ D1701-VrV tras tres ciclos de purificación de placas. Después de preparar reservas con títulos elevados del virus D1701-V-RabG se preparó el ADN viral como se describe a continuación y se usó para los ensayos de RabG-PCR y LacZ-PCR.

Tinción inmunohistoquímica de las placas del virus recombinante (IPMA) Primero se analizó mediante IPMA, que implica tinción inmunohistoquímica de las placas de virus recombinante tituladas en las células Vero en placas de 24 pocilios, el éxito de la expresión del gen extraño insertado, Después de la aparición de las placas de virus, se aspiró el medio de cada pocilio y las células se secaron dejando la placa abierta durante aproximadamente 10 minutos en una campana de flujo laminar. Después, las células se fijaron con metanol absoluto helado a -20°C durante 15-20 minutos. Después de lavar con suero bovino fetal (FCS) al 1 % (v/v) helado en PBS, las célula se bloquearon con PBS que contiene 10% de FCS (VA/) durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA). Tras la incubación durante 60 minutos a TA con el anticuerpo monoclonal de ratón específico de la proteína G559, se diluyó a 1 :200 en 1 % de FCS en PBS (FLI-Tuebingen; Alemania). Tras 3 lavados con PBS-T (PBS que contiene Tween-20 0.05% (v/v)), se añadió un anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a peroxidasa (Jackson-ImmunoRes., DIANOVA; Alemania), diluido a 1 :2000, y se incubó durante 60 minutos a TA. Después de un exhaustivo lavado con PBS-T y PBS, se añadió el sustrato (Vector Nova Red, Axxora; Alemania) según las instrucciones recomendadas por el fabricante, hasta que se visualizó una tinción positiva de color rojo-marrón. Como controles negativos se incluyeron células no infectadas y células infectadas con D-1701-VrV o D-1701-V. Se descubrió que las placas de virus y las células infectadas presentaban una fuerte positividad para la proteína G del virus de la rabia.

EJEMPLO 2 Caracterización de of D1701-V-RabG Preparación de reservas de virus Para obtener reservas de virus recombinantes con títulos altos, 10-20 matraces de cultivo T150 (Greiner, Alemania) se infectaron de forma simultánea con una MOI de 0.5. Después de 3 días se observó aproximadamente un 80% de efecto citopatogénico (ECP) y las células y el sobrenadante de todos los matraces se cosecharon y recogieron mediante centrifugación (2 h a 13,000 rpm, 4°C). El sobrenadante se retiró cuidadosamente y el sedimento vírico se disolvió durante la noche a 4°C en 1-2 mi de PBS. La suspensión del virus se dispersó completamente mediante ultrasonidos (Sonic cell disruptor, Branson; Alemania) en hielo usando 3 pulsos (100 W) de 10 segundos (descanso de 10 s entre cada pulso), seguido de centrifugación (500-700 x g, 10 min, 4°C) para eliminar los residuos celulares. El sobrenadante se almacenó en hielo, mientras que el sedimento celular se resuspendió en 1.0 mi de PBS y se sometió a ultrasonidos en hielo (2 veces durante 20 s, con un descanso de 10 s entremedias, después, una vez durante 30 s). Después de una centrifugación a velocidad lenta, el sobrenadante se combinó con el primero sobrenadante, se dividió en alícuotas, se tituló y se almacenó a -70°C.

Caracterización del ADN viral Células Vero se infectaron con MOI 0.5 y se recogieron tras 2-3 días (ECP de aproximadamente 80%) mediante digestión con tripsina y una centrifugación breve a velocidad lenta a 4°C. El ADN se aisló usando el kit Master Puré DNA Isolation Kit (Epicentre Biotechnology, Biozym Scientific, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para verificar la inserción del gen G en el locus correcto, 2 µg de ADN se digirieron con enzimas de restricción, se separaron en geles de agarosa al 0.8% (p/v) y se transfirieron a una membrana de nylon (GE Healthcare; Alemania) para hibridación en transferencia de tipo Southern de acuerdo con los procedimientos estándar. Una sonda específica del gen G de la rabia (el producto de la PCR de Rabg-F/-R) se aisló en gel, se marcó radiactivamente (32P-dCTP, MP Biomedicals; Alemania) usando RediPrime (GE Healthcare; Alemania). Después, esto se usó para hibridación en transferencia de tipo Southern, realizada en condiciones de 50°C en 4 X SSPE (1X = NaCI 0.18 M, PP 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4) que contiene 0.5 % (p/v) de polvo de leche desnatada, 1 .0% (p/v) de dodecilsulfato sódico (SDS) y 0.5 mg/ml de ADN de timo bovino desnaturalizado (KT-DNA, Sigma; Alemania). Tras exposición a rayos X (Kodak X-Omat; Alemania), se retiró la sonda del filtro mediante incubación en NaOH 0.4N a 45°C durante 30-60 minutos, seguido de una breve incubación a 100°C en 0.1 X SSC, 0.5 % SDS, Tris-HCI 0.2 M (pH 7.4). Para la segunda hibridación, se usó el fragmento H de Hind W D1701 -V que contiene el locus vegF-E, tal como se ha descrito (Cottone y col., 1998. Virus Res. 56, 53-67). Los resultados del análisis de transferencia de tipo Southern confirmaron la correcta inserción del gen G en el genoma de D1701-VrV.

Detección de ARN específico del gen G Las células Vero se infectaron con una MOI de 3-5, y se aisló el ARN total a tiempos diferentes tras la infección (p.i) usando el kit urePrep Total RNA Extraction Kit (Fisher Scientific; Alemania). Adicionalmente, se extrajo el ARN de las células infectadas en presencia de arabinósido citosina (AraC; 0.04 mg/ml, Sigma; Alemania) o cicloheximida (CHX, 0.1 mg/ml, Serva; Alemania) para detectar la expresión prematura del gen G insertado. Como control, se aisló el ARN de las células no infectadas. Los ARN se separaron en un gel de agarosa al 1 % desnaturalizante que contiene formaldehído y se transfirieron a una membrana de nylon tal como se ha descrito (Kroczek, R.A. & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990). El fragmento G PCR (RabG-F/-R) de la rabia marcado radiactivamente se usó como sonda de hibridación en solución UltraHyb (Ambion; Alemania) a 42°C. Los resultados demostraron claramente la inmediata expresión temprana del gen G de la rabia, debido a su regulación bajo el control del promotor temprano vegF-E de ORFV (Rziha y col. 1999, J. Biotechnol., 73, 235-242).

Detección de la proteína G mediante inmunofluorescencia.

Para inmunofluorescencia, células Vero (1 X 105 células/ml) se infectaron en portas de 4 cámaras (BD Falcon; Alemania) con una MOI de 0.1 o 3.0. A diferentes tiempos, p.i., las células se lavaron con medio y se fijaron con 3.7% (v/v) de formaldehído sin metanol (Pierce, Thermo Fisher Scientific; Alemania) durante 15 minutos a 37°C. Tras 3 lavados con PBS, las células se permeabilizaron mediante tratamiento con 0.2% (v/v) de Tritón X-100 durante 5 minutos a 37°C. Tras lavado con PBS, las células se bloquearon con 5% FCS en PBS durante 30-40 minutos a 37°C. Para la detección de la proteína G, las células se incubaron durante 1 hora a 37°C con el anticuerpo monoclonal de ratón G559 (FLI; Tuebingen, Alemania) diluido a 1 :1000 en PBS que contiene 1 % de FCS. Después de 5 lavados en PBS, los portas se incubaron en oscuridad a 37°C durante 30 minutos con el anticuerpo secundario anti-ratón Alexa-555, diluido a 1:1000 en PBS (Molecular Probes; Alemania).

La detección de células en tiempos tardíos tras la infección con ORFV se llevó a cabo mediante el uso de antisuero de conejo específico de ORFV PAS2274, proporcionado por el Dr. Rudiger Raue, (Pfizer, Reino Unido). El suero se diluyó a 1 :1000 en PBS con 1% de FCS y el anticuerpo secundario, Alexo-488 anti-conejo se usó a una dilución de 1:1000.

La tinción con actina se realizó con Phalloidin-647, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biotium; Alemania), seguido mediante tinción del núcleo con 0.04 µ9/??? de DAPI (4',6-Diamidin-2'- fenilindoldihidroclorida; Roche Molecular Biochemicals; Alemania), durante 20-30 min a TA en oscuridad. Después de un exhaustivo lavado en PBS, los portas se embebieron en Mowiol-DABCO y se realizaron análisis de imagen con fluorescencia con un ApoTome, usando el software Axiovision.

Los resultados demostraron claramente una fuerte expresión temprana de la proteína G de la rabia (4 h p.i.), así como tardía (24 h p.i.) tras la infección con D1701-V-RabG. Las células infectadas más tarde pudieron identificarse adicionalmente mediante tinción específica con el antisuero PAS2274. Además, la tinción con fluorescencia demostró la expresión en superficie de la proteína G. La especificidad de la tinción se analizó mediante el uso de células no infectadas.

Detección de la proteina G mediante transferencia de tipo Western.

Células Vero (3 X 105 células) se infectaron simultáneamente con un MOI de 1.0 y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%. A diferentes tiempos p.i., las células más el sobrenadante se recogieron, se centrifugaron (8,900 X g, 10 min, 4°C), y el sedimento celular se lavó 3 veces con 1.0 mi de PBS y se resuspendieron en 0.15 mi de PBS que contiene Tritón X-100 1 % (v/v). Tras 30 minutos en hielo, el lisado se centrifugó durante 15 minutos a 15,000 X g, 4°C, y el sobrenadante se guardó para SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida). Con este fin, se mezclaron 3 partes del lisado con una parte de tampón de carga de proteína 4X DualColor (Fermentas, Alemania), se hirvió durante 5 minutos, se sometió a ultrasonidos y aproximadamente 10 µ9 de proteína se separaron mediante SDS-PAGE usando 8% (p/v) de gel ProSieve50 con tampón de carrera Tris-Tricine-SDS según las recomendaciones (FMC Bioproducts, Biozym; Alemania) Se usó Prestained Protein Ladder (Fermentas, Alemania) como marcadores del peso molecular. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana DE PVDF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce, Thermo Fisher Scientific; Alemania). Después del bloqueo en membrana en 3X Rotiblock (Roth; Alemania) durante 3 horas a temperatura ambiente, se usó un antisuero antipéptido de conejo específico del extremo C de la proteina G del virus de la rabia (amablemente suministrado por el Dr. K.-K. Conzelmann, Max-von-Pettenkofer Institute; Munich, Alemania) diluido a 1 :10,000 en 1X RotiBlock. Después de incubar durante la noche a 4°C, la membrana se lavó exhaustivamente 5 veces en TBS-T (solución salina tamponada con Tris con 0.05% v/v de Tween-20) y se incubó con anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa (1 :20,000, Jackson-lmmunoRes., Dianova; Alemania) durante 1 hora a TA. Después de lavar con TBS-T, el sustrato ECL se usó según las recomendaciones (Immobilon Western, Millipore; Alemania). Las proteínas que reaccionaron se detectaron medíante el uso de una película de rayos x de químioluminíscencia (CL-XPosure, Pierce, Thermo Fisher Scientific; Alemania).

La expresión de la proteína G del virus de la rabia del peso molecular previsto (58-60 kDa) se confirmó a los diferentes tiempos tras la infección.

EJEMPLO 3 Inducción de respuesta inmunolóqica específica tras la inmunización de los ratones con D1701-V-RabG Inducción dependiente de la dosis de anticuerpos séricos anti-G La proteína G puede considerarse como el antígeno más importante para una respuesta inmunitaria protectora y la extensión de los anticuerpos séricos neutralizantes inducidos por el virus (SNT) se puede correlacionar con la protección contra la infección por exposición al virus de la rabia. De acuerdo con la OMSA (Organización Mundial de Salud Animal) y la OMS (Organización Mundial de la Salud), la presencia de títulos de anticuerpos superiores a 0.5 a 1.0 Ul/ml (unidades internacionales) de SNT se consideran protectores. Por tanto, la indicción de anticuerpos SNT específicos de la proteína G se determinó durante del día 1 al día 14 tras la inmunización primaria de ratones con D1701-V-RabG.

Ratones C57/BL6 de 68 semanas de edad (n= 6 o 7 por grupo), criados en el FLI (Friedrich-Loeffler-Institute, Federal Research Institute of Animal Health, Institute of Immunology; Tuebingen, Alemania) fueron inmunizados intramuscularmente con 0.1 mi de UFP (unidades formadoras de placas) indicadas de D1701-V-RabG (0.05 mi para el muslo de cada pata trasera). Se tomaron muestras de suero individuales a diario y se usaron para la determinación de SNT en un ensayo de inhibición de foco de fluorescencia rápida (RFFIT) tal como se ha descrito. (OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animáis. 2007. Parte 2, Sección 2.2, Capítulo 2.2.5 Rabies, que también se encuentra en el siguiente sitio web de internet: www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm; Cox, J.H. y G. Schneider, 1976, J. Clin. Microbiol. 3, 96-101.) En breve, se prepararon diluciones en serie por cinco en medio RPMI y 0.05 mi de cada dilución se mezclaron (por duplicado) en los pocilios de una placa de 96 pocilios con 0.05 mi del virus de la rabia, cepa CVS 11 (n° de lote 47, 1.7 X 105 UFP/ml). Tras 90 minutos de incubación a 37°C y 5% C02, se añadieron 0.1 mi de una suspensión de células BHK21 (1 X 106 células mi) en cada pocilio, se mezclaron y se incubaron 24 horas a 37°C en 5% C02- Después de lavar los pocilios de la placa de cultivo con PBS y acetona al 80% (v/v) pre-refrigerada, las células se fijaron en acetona al 80% (v/v) fresca durante 30 minutos adicionales a 4°C. Después de extraer el acetona y secar al aire, se añadieron 0.05 mi de globulina monoclonal antirabia teñida con FITC (Centocor, EE.UU.) durante 30 minutos a 37°C para teñir las células infectadas con el virus de la rabia. Después de lavar dos veces con PBS y una vez con agua bidestilada, la infección por el virus se monitorizó mediante microscopía de fluorescencia. Las diluciones en serie que redujeron el número de células infectadas al 50% se leyeron como positivas. Los títulos de los sueros se expresaron como Ul/ml y se compararon con el suero de referencia positivo de la OMS.

Las Figuras 2A-2D demuestran el desarrollo de SNT tras una única inmunización intramuscular de los ratones con las UFP indicadas del virus recombinante D1701-V-RabG. Los sueros se analizaron los días (d) indicados tras la inmunización mediante FFIT. Como se puede observar en la Figura 2D, incluso dosis bajas (104 UFP) de inmunización dieron lugar, hacia el día 8, a una SNT media de 5.5 Ul/ml, incrementándose hasta el día 14 tras la inmunización a aproximadamente 13 Ul/ml. Usando 106 o 107 UFP para inmunización (Figura 2A y 2B), una semana después se indujo una SNT de aproximadamente 10-20 Ul/ml, respectivamente, que aumentó hasta aproximadamente 50 Ul/ml 14 días después de la inyección. Usando 107 UFP de D1701 -V-RabG, hacia el día 4 después de la inmunización se detectaron títulos de anticuerpos (0.6-3.0 Ul/ml), que no era el caso cuando se usaron las dosis menores de inmunización analizadas (Figuras 2A-2D).

Otro experimento con ratones (datos no mostrados) demostró que una inmunización de refuerzo usando 106 o 107 UFP del virus recombinante condujo sólo a un incremento marginal en la SNT 14 días después de la inmunización primaria (con 106 o 107 UFP).

En conjunto, estos resultados demuestran la inducción satisfactoria de títulos de anticuerpos SNT protectores durante la primera semana tras la inmunización de ratones con varias dosis de D1701-V-RabG.

EJEMPLO 4 Respuesta inmunitaria protectora en ratones mediada por D1701 -V-RabG Se realizó una evaluación de la capacidad protectora de D1701-V-RabG mediante infección por exposición de diferentes ratones inmunizados (C57/BL6) de acuerdo con las recomendaciones de la OIE (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animáis. 2007. Parte 2, Sección 2.2, Capítulo 2.2.5 Rabies. También se encuentra en www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm.). A una edad de 6-8 semanas, se inmunizó a los ratones (n=1 1 o 12 por grupo) con las UFP inducidas de D170 -V-RabG como se ha descrito anteriormente. A los ratones control no inmunizados (n=15) se les inyectó PBS. Tres semanas después de la inmunización, todos los animales fueron expuestos intracranealmente a la cepa virulenta del virus de la rabia CVS (0.3 mi que contiene 4.8 X 105 UFP). Se observó diariamente a los animales hasta 21 días después de la infección por exposición. Los animales moribundos que sufrían varios síntomas neurológicos fueron sacrificados.

Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, se aplicó una única inmunización intramuscular con 107 de UFP de D1701 -V-RabG protegieron completamente a los ratones (1 1/1 1) frente a una dosis alta de virus de exposición aplicada intracranealmente. Un animal inmunizado de dicho grupo murió el día 12, pero esto no se debió a la infección por exposición al virus de la rabia- Por tanto, dicho animal se excluyó del análisis de los datos. La aplicación de una dosis que contiene una cantidad 10 veces menor (106 UFP) de D1701-V-RabG todavía consiguió una protección del 73% (8/11 supervivientes). Otra disminución de la dosis de inmunización redujo la tasa de protección al 58% (105 UFP; 7/12), o al 27% (104 UFA; 3/11), mientras que todos los ratones inmunizados control (n=15) murieron durante el día 6 y el 9 tras la infección por exposición (Figuras 3A y 3B).

EJEMPLO 5 Papel de los linfáticos T en la inmunidad protectora Los experimentos siguientes investigaron la contribución de los linfocitos T (células positivas a CD4-, CD8-, o CD4/8) para la inducción de inmunidad protectora mediante D1701-V-RabG recombinante en ratones. Como se indica en la Figura 5A, justo antes y después de la inmunización del día 0 con 107 UFP de D1701-V-RabG (es decir, los días -1 , 0, +1 y +5), se administraron antisueros específicos de lingotitos T CD4- o CD8-intraperitonealmente a grupos de ratones (número (n) de animales mostrado en la Figura) para reducir cada población de linfocitos T in vivo.

Después, el día 15, todos los animales fueron expuestos intracerebralmente a una dosis de 500 DL50 de la cepa virulenta del VR CVS.

Como se muestra en la figura 5A, los animales con disminución de linfocitos T positivos para CD4 no estaba protegidos, en general, como se puede ver por la respuesta similar a los animales control no inmunizados.

Como se ve en la Figura 5B, grupos de animales se inmunizaron el día 0 con D1701-V-RabG y, después, se produjo in vivo disminución de linfocitos T CD4- y/o CD8 justo antes y después de la infección por exposición del día -15 con la cepa virulenta del VR CVS, es decir los días 13 (2 días antes de la infección por exposición), 15.19 y 23. Los resultados demuestran que, tras la inducción con éxito de la respuesta inmunitaria contra el virus de la rabia mediante D1701-V-RabG, la disminución de linfocitos T 14 días después no afectó adversamente a la protección, en cuanto un 75-90 por ciento de los animales con disminución in vivo de las poblaciones de linfocitos T sobrevivieron a la exposición.

En conclusión, los resultados muestran que los linfocitos T positivos para CD4 (más probablemente, las células T colaboradoras necesarias para la producción de anticuerpos anti-G) son el principal determinante de la inmunidad protectora inducida por D1701-V-RabG recombinante.

EJEMPLO 6 Vacunación postexposición La eficacia de D1701-V-RabG recombinante para la vacunación terapéutica se analizó en ratones. Con este fin, grupos de animales fueron vacunados intramuscularmente (i.m.) con 107 UFP de D1701-V-RabG los días 0, 1 , y4. Los ratones se expusieron a 1 X 106 UFP de la cepa del VR virulenta CVS el día 0. Como se muestra en la Figura 6, todos los ratones del grupo inmunizado, excepto uno, quedaron protegidos contra la rabia.

Se realizaron experimentos adicionales con ratones para analizar varios regímenes de inmunización postexposición a la cepa del VR virulenta CVS. En la Figura 7, los cuadros de color gris indican los días en los que los ratones fueron vacunados con D1701-V-RabG. Los resultados (supervivientes) se resumen en la Figura.

Los resultados demuestran la capacidad de D1701-V-RabG para la vacunación terapéutica de los ratones. Como se ve en la Figura 7, una vacunación doble, administrada el día de la exposición y al día siguiente, medió un 805 de protección y al menos un 60% de los animales quedaron protegidos por 4 inmunizaciones diarias comenzando 3 días después de la infección por exposición periférica con el VR.

EJEMPLO 7 Respuesta inmunitaria inducida por diferentes vías de inmunización Los ratones se inmunizaron con 1 X 106 UFP de D1701-V-RabG mediante las siguientes vías de aplicación: intravaginal (i.vag ), escarificación, intraperitoneal (i.p.), intradérmica (i.d.), intranasal (i.n.), subcutánea (s.c), intramuscular (i.m.) e intravenosa (i.v.). La respuesta inducida de anticuerpos en suero (determinada como anticuerpos de neutralización en suero, o SNT) 6 días (barras de color gris) y 13 días (barras de color negro) tras la inmunización se representa en la Figura 8. Catorce días después de la inmunización se infectó a los ratones intracerebralmente con 100 DL50 de la cepa virulenta del VR CV y se calculó el porcentaje de supervivientes.

Los resultados muestran que los títulos de SNT mayores (proporcionados en Ul por mi) se indujeron mediante vacunación i.v., i.p., e i.m., que tuvo como resultado las mejores tasas de protección del 86%, 100%, y 78 %, respectivamente.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un parapoxvirus recombinante que comprende un parapoxvirus y ADN heterólogo derivados de un virus de la rabia.

2.- El parapoxvirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el parapoxvirus es un virus Parapoxvirus ovis (ORFV).

3.- El parapoxvirus recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el parapoxvirus es un virus Parapoxvirus, cepa D1701.

4 - El parapoxvirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ADN heterólogo comprende el gen que codifica la proteina G del virus de la rabia, o fragmentos de la misma.

5. - El parapoxvirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ADN heterólogo comprende la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 98% con la SEQ ID NO: 4.

6. - El parapoxvirus recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ADN heterólogo se inserta dentro del fragmento H/H digerido con HindIII de la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis.

7. - El parapoxvirus recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el ADN heterólogo se inserta dentro de la secuencia codificadora de VEGF o secuencias no codificadoras adyacentes dentro del fragmento H/H digerido con Hindlll de la cepa D1701 de Parapoxvirus ovis.

8. - El parapoxvirus de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el parapoxvirus es Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

9.- Una procedimiento de preparación del parapoxvirus recombinante de la reivindicación 1 , que comprende insertar el ADN heterólogo en el genoma del parapoxvirus.

10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el parapoxvirus es Parapoxvirus ovis.

1 1.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el parapoxvirus es la cepa D 1701 de Parapoxvirus ovis.

12. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el ADN heterólogo comprende el gen que codifica la proteína G del virus de la rabia, o fragmentos de la misma.

13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el ADN heterólogo comprende la SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene una identidad de al menos aproximadamente el 98% con la SEQ ID NO: 4.

14.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el parapoxvirus recombinante es Parapoxvirus ovis D1701-V-RabG.

15.- Una composición inmunogénica que comprende el parapoxvirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un vehículo.

16. - Un procedimiento de preparación de la composición inmunogénica de la reivindicación 15, que comprende combinar el parapoxvirus recombinante con un vehículo.

17. - El uso de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición inmunogénica como la que se reclama en la reivindicación 15, en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria contra el virus de la rabia en un animal.

18.- El uso como se reclama en la reivindicación 17, caracterizado además porque la respuesta inmunitaria es la inducción de anticuerpos séricos anti-Proteína G.

19. - El uso como se reclama en la reivindicación 17, caracterizado además porque se induce la respuesta inmunitaria protectora específica anti-proteína G.

20. - El uso como se reclama en la reivindicación 19, caracterizado además porque la inducción tiene como resultado títulos de anticuerpos superiores a 0.5 unidades internacionales por mi.

21.- El uso del parapoxvirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un ensayo para diferenciar entre animales infectados y vacunados.