RU2340371C1 - Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" - Google Patents
Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" Download PDFInfo
- Publication number
- RU2340371C1 RU2340371C1 RU2007122707/13A RU2007122707A RU2340371C1 RU 2340371 C1 RU2340371 C1 RU 2340371C1 RU 2007122707/13 A RU2007122707/13 A RU 2007122707/13A RU 2007122707 A RU2007122707 A RU 2007122707A RU 2340371 C1 RU2340371 C1 RU 2340371C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- substance
- collagenase
- activity
- ultrafiltrate
- collagenolytic
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения представляет собой ультрафильтрат, выделенный из культуральной жидкости штамма Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 с коллагенолитической активностью 1800-2500 КЕА/мл и протеолитической активностью 120-200 ПЕ/мл. Изобретение обеспечивает получение биологически активного ультрафильтрата с высокой коллагенолитической и протеолитической активностью, предназначенного для эффективного использования в составе различных ранозаживляющих препаратов и дерматологии.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию на основе коллагеназы микробного происхождения субстанции для лекарственных средств.
Известна группа микробных коллагеназ, которая широко используется в биотехнологии и для лабораторных целей, например, коллагеназы, синтезируемые бактерией Clostridium histolyticum. Продуцентами коллагеназ являются также насекомые Hypoderma lineatum и камчатские крабы [1].
Известными аналогами предлагаемого изобретения могут быть препараты, полученные из бактерий Clostridium histolyticum и крабовая коллагеназа [1]. Бактерия Clostridium histolyticum является возбудителем газовой гангрены, строгим анаэробом, требующим особых условий выращивания. Технология получения препарата из этой бактерии сложная и дорогостоящая. Крабовая коллагеназа уступает по свойствам бактериальной, так как неполностью нейтрализует коллаген. Кроме того, присущий препарату фибренолитические и тромболитические свойства могут вызывать нежелательное воздействие при нанесении на кожу.
Наиболее близким прототипом предлагаемого биологически активного ультрафильтрата является коллагеназа, выделенная из культуральной жидкости штамма Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 [2].
Недостатком указанного изобретения является низкая коллагенолитическая активность, более сложный и дорогостоящий способ получения названного фермента, а также ограниченная область использования в медицинской биотехнологии.
Технической задачей данного изобретения является получение высокоэффективного биологически активного ультрафильтрата, содержащего коллагеназу и протеазу микробного происхождения, предназначенного для использования в качестве субстанции для лекарственных средств в различных ранозаживляющих препаратах, препаратах для лизиса послеоперационного или посттравматического гемоторакса, для лизиса послеоперационных спаек, в косметологии.
Техническая задача решается тем, что заявленная биологически активная субстанция содержит коллагеназу и протеазу из Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 при следующих ферментативных активностях:
- коллагенолитическая активность 1800-2500 КЕА/мл,
- протеолитическая активность 120-200 ПЕ/мл.
Для получения заявленной субстанции-ультрафильтрата используют штамм Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910, который выращивают на плотной питательной среде - на картофельном агаре, а затем на ферментационной питательной среде следующего состава (г/л): кукурузная мука - 20; пептон - 0,5; сухие кормовые дрожжи - 0,05; MgSO4·7H2O - 0,4; желатин - 0,5; вода водопроводная рН 6,4-6,8. Выращивание проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на качалке (200 об/мин) при температуре 28 градусов Цельсия в течение 72-96 часов. Мицелий отделяют центрифугованием. Процедуру получения биологически активного ультрафильтрата из фильтрата культуральной жидкости начинают с ее концентрирования при одновременном отделении низкомолекулярных веществ и белковых фракций при температуре 15-20 градусов Цельсия и давлении 760-800 мм рт.ст. Фильтрат культуральной жидкости помещают в ультрафильтрационную лабораторную установку с рабочей поверхностью 2 квадратных дециметра. Приемная емкость заполняется фильтратом. Ультрафильтрацию нативного раствора проводят под давлением 0,4±0,02 МПа. Для получения биологически активного ультрафильтрата в работе используют мембрану с низкой проницаемостью по протеазе. Полученный биологически активный ультрафильтрат хранят при температуре+1-+20 градусов Цельсия в присутствии стабилизатора.
Субстанция для дерматологических лекарственных средств «Ультрализин» соответствует требованиям разработанных технических условий ТУ 9336-001-11684510-03, введенных в действие с 01.07.2003 года, с соблюдением санитарных норм и правил, действующих на предприятиях микробиологической промышленности Российской Федерации.
По своим физико-химическим характеристикам «Ультрализин» соответствует следующим показателям:
- раствор имеет цвета от светло-коричневого до темно-коричневого;
- обладает специфическим запахом;
- растворяется в воде, 95-процентном спирте, хлороформе;
- рН водного раствора составляет 5,0-7,0;
- коллагенолитическая активность составляет от 1800 до 2500 коллагенолитических единиц активности на 1 мл;
- общая протеалитическая активность составляет от 150 до 200 протеолитических единиц на 1 мл;
- нетоксичен, неаллергенен;
- по микробиологической чистоте соответствует требованиям Га XI, вып.2, стр.193.
Коллагенолитическая активность определяется по методу Розена [4]. Протеолитическая активность определялась по Кунитцу [3].
Определение коллагенолитической активности.
За единицу коллагенолитической активности (КЕА) принимается такое количество фермента, при воздействии которого на коллаген выделяются продукты гидролиза, равноценные 1 мкг L-лицина в стандартных условиях опыта.
В 5 пробирок вместимостью по 20 мл вносят пипеткой по 2 мл суспензии коллагена в фосфатном буфере рН 7,4. В 1, 2 и 3 пробирки (опытные) прибавляют по 2 мл испытуемого раствора ультрализина (перед анализом содержимое ампулы или флакона осторожно взболтать). В пробирки 4 и 5 (контрольные) прибавляют по 2 мл воды. Все пробирки закрывают пробками и помещают в термостат при 37±0,5 градусов Цельсия на 18 часов. Охлаждают.
Из каждой опытной и контрольной пробирки отбирают по 1 мл раствора, вносят в 5 конических пробирок вместимостью 10 мл и прибавляют по 1 мл двухпроцентного раствора нингедрина в ацетоне. Пробирки помещают на 10 минут в водяную баню при 50 градусах Цельсия. Охлаждают и после испарения ацетона (определяют по отсутствию запаха ацетона), доводят объем раствора водой до 10 мл.
Определяют величины оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 600 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют воду. По калибровочному графику находят значения концентрации L-лицина в опытных и контрольных пробирках, вычисляют средние арифметические величины. Из величины опытной концентрации вычитают величину контрольной. Эту величину используют для расчета активности ультрализина. Активность субстанции (Ак) в коллагенолитических единицах (КЕА) вычисляют по формуле:
где а - количество L-лицина в мг, найденное по графику.
Определение протеолитической активности по Кунитцу
Приготовление двухпроцентного раствора казеина: реактив А 0,2 М Na·H2PO4·H2O-27,8 г/л.
Реактив Б: 0,2 М Na2HPO4·7H2О - 53,65 г/л. Взять 81 мл реактива Б.
К 4 г казеина прилить 81 мл реактива Б, выдержать 5 минут при комнатной температуре, перенести в кипящую водяную баню, остудить. Добавить 19 мл реактива А и 100 мл дистиллированной воды.
Опытные и контрольные пробирки, содержащие по 2 мл двухпроцентного казеина термостатируют 10 минут при температуре 30 градусов Цельсия. В контроль вносят по 2,5 мл трихлоруксусной кислоты (ТХУ). В опытные и контрольные пробирки вносят по 0,5 мл ультрафильтрата. Инкубируют 10 минут. Затем в опыт вносят по 2,5 мл ТХУ, через 30 секунд в каждую пробирку. Определяют оптическую плотность (ОП) ультрафильтрата при 280 нм. Полученный показатель умножают на разведение.
Ферментативная активность ультраконцентрата варьировала в следующих диапазонах:
Пример 1
Ультраконцентрат имел следующие характеристики:
Коллагенолитическая активность - 1800 КЕА/мл
Протеалитическая активность - 120 ПЕ/мл.
Пример 2
Коллагенолитическая активность - 2000 КЕА/мл,
протеолитическая активность - 150 ПЕ/мл.
Пример 3
Коллагенолитическая активность - 2500 КЕА/мл,
протеолитическая активность - 200 ПЕ/мл.
Изучение острой токсичности субстанции проводилось на белых мышах (самцы и самки с массой тела 19-21 г).
Эксперименты выполнены в соответствии с "Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств", 1997 [5].
«Ультрализин» вводили мышам внутривенно, однократно, в объеме 0,2-0,5 мл, со скоростью 0,1 мл/с.
Длительность наблюдения за мышами составляла 10-15 дней. В ходе эксперимента следили за поведением, внешним видом, двигательной активностью, реакцией животных на внешние раздражители. В случаях летального исхода фиксировались клиническая картина и проводилось вскрытие погибших мышей.
При внутривенном введении препарата мышам в дозах до 3500-4000 ЕД/кг признаков интоксикации не наблюдалось. Животные оставались подвижными, нормально реагировали на окружающую среду. При дальнейшем увеличении дозы введенного вещества отмечалась гибель отдельных животных. Были установлены среднесмертельные дозы (LD50) для мышей при однократном внутривенном введении субстанции: LD50=12400±2500 ЕД/кг.
Максимально переносимая доза вещества при внутривенном введении мышам составляла ≈4500 ЕД/кг. В этих случаях при наблюдении за животными в течение 2 недель гибели не отмечено.
Были также проведены исследования на микробиологическую чистоту и пирогенность заявленной композиции.
Были проведены исследования на наличие пирогенных примесей в препарате. Испытание проводили на кроликах породы Шиншилла, содержащихся на стандартном рационе вивария.
Так как данный препарат применяется только наружно в качестве мази, установить четкую терапевтическую дозу сложно. Поэтому для подбора тест-дозы для испытания на пирогенность мы использовали дозу на коллагеназный препарат - от 50 ЕД/кг.
Установлено, что этот препарат тест-доза выше 5000 ЕД на кг массы животного - пирогенен.
Отмечена тенденция снижения пирогенной реакции с уменьшением вводимого объема.
Установление четкой терапевтической дозы позволит более надежно подобрать тест-дозу на пирогенность. Проведение дополнительных испытаний с новыми образцами билогически активного ультрафильтрата, в минимальном объеме разбавителя, в обоснованной тест-дозе, возможно, позволит получить результаты, свидетельствующие об отсутствии пирогенности.
Таким образом, биологически активный ультрафильтрат на основе коллагеназы, выделенного из штамма Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 с коллагенолитической активностью 1800-2500 КЕА/мл и протеалитической активностью 120-200 ПЕ/мл, является высокоэффективным, нетоксичным, неаллергенным средством. Имея в своем составе коллагеназу и усиливающую ее действие протеазу, предлагаемый биологически активный ультрафильтрат может быть использован в составе различных ранозаживляющих препаратов и дерматологии.
Источники информации
1. Демина Н.С., Лысенко С.В. Коллагенолитические ферменты, синтезируемые микроорганизмами. Журнал «Микробиология», 1996 год, том 65, №3, стр.293-304.
2. Демина Н.С., Лысенко С.В. Фармацевтическая композиция на основе коллагеназы микробного происхождения. Патент РФ №2075219, публ. 03.10.1997 г.
3. Kunits J./ The method of defection proteolytic enzyme. J. Gen. Physiol, 1947, v.30, №4 р.291-310.
4. Rozen H. Amodified ninhydryn colorimetric analysis for amino acids. Arch. Biohem. Biophys., 1957, v.67, p 10-15.
5. "Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств", 1997 год.
Claims (1)
- Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения, характеризующая собой ультрафильтрат, выделенный из культуральной жидкости штамма Streptomyces lavendulae ВКПМ S-910 с коллагенолитической активностью 1800-2500 КЕА/мл и протеолитической активностью 120-200 ПЕ/мл.
Priority Applications (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007122707/13A RU2340371C1 (ru) | 2007-06-19 | 2007-06-19 | Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" |
PCT/RU2007/000581 WO2009002209A1 (en) | 2007-06-19 | 2007-10-22 | Substance for dermatological medicinal agents based on microbiotic collagenase 'ultra-lisin' |
BRPI0813442A BRPI0813442A8 (pt) | 2007-06-19 | 2008-05-15 | Método para produção de silício policristalino a partir de uma solução de ácido hidrosilicofluorídrico, e instalação para produção de silício policristalino a partir de uma solução de ácido fluorosilícico na forma de um pó com partículas de formato esférico |
US12/665,689 US20100221171A1 (en) | 2007-06-19 | 2008-08-15 | Method for producing polycrystalline silicon |
CA002684973A CA2684973A1 (en) | 2007-06-19 | 2008-08-15 | Method for producing polycrystalline silicon |
EA201000036A EA015477B1 (ru) | 2007-06-19 | 2008-08-15 | Способ получения поликристаллического кремния из раствора кремнефтористо-водородной кислоты и установка для получения поликристаллического кремния |
PCT/RU2008/000523 WO2009005412A2 (en) | 2007-06-19 | 2008-08-15 | Method for producing polycrystalline silicon |
TNP2009000523A TN2009000523A1 (en) | 2007-06-19 | 2009-12-11 | Method for producing polycrystalline silicon from hudrosiliconfluoric acid solution and a plant for the producing silicon tetrafluoride and polycrystalline silicon |
IL202815A IL202815A0 (en) | 2007-06-19 | 2009-12-17 | Method for producing polycrystalline silicon from hudrosiliconfluoric acid solution and a plant for the producing silicon tetrafluoride and polycrystalline silicon |
MA32492A MA31511B1 (fr) | 2007-06-19 | 2010-01-07 | Procédé de fabrication de silicium polycristallin à partir d'une solution d'acide fluorosilicique et installation de fabrication de tétrafluorure de silicium et de silicium polycristallin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007122707/13A RU2340371C1 (ru) | 2007-06-19 | 2007-06-19 | Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2340371C1 true RU2340371C1 (ru) | 2008-12-10 |
Family
ID=40185854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007122707/13A RU2340371C1 (ru) | 2007-06-19 | 2007-06-19 | Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2340371C1 (ru) |
WO (1) | WO2009002209A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2484811C2 (ru) * | 2011-08-15 | 2013-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Межотраслевая компания по науке и технологиям ООО "МКНТ" | Ферментный ранозаживляющий препарат |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005107863A2 (en) | 2004-05-04 | 2005-11-17 | University Of Rochester | Implantable bio-electro-physiologic interface matrix |
WO2005107852A1 (en) | 2004-05-04 | 2005-11-17 | University Of Rochester | Leadless implantable intravascular electrophysiologic device for neurologic/cardiovascular sensing and stimulation |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2075219C1 (ru) * | 1995-03-23 | 1997-03-10 | Нина Сергеевна Демина | Коллагеназа |
US5989888A (en) * | 1996-01-24 | 1999-11-23 | Roche Diagnostics Corporation | Purified mixture of collagenase I, collagenase II and two other proteases |
RU2180002C2 (ru) * | 1999-08-16 | 2002-02-27 | Пермское научно-производственное объединение "Биомед" | Способ получения коллагеназы |
RU2166950C1 (ru) * | 2000-06-30 | 2001-05-20 | Демина Нина Сергеевна | Фармацевтическая композиция на основе коллагеназы микробного происхождения |
RU2005128329A (ru) * | 2005-09-13 | 2007-03-27 | Открытое акционерное общество "Система-Венчур" (RU) | Ферментная композиция "ультрализин" |
-
2007
- 2007-06-19 RU RU2007122707/13A patent/RU2340371C1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-10-22 WO PCT/RU2007/000581 patent/WO2009002209A1/ru active Application Filing
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2484811C2 (ru) * | 2011-08-15 | 2013-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Межотраслевая компания по науке и технологиям ООО "МКНТ" | Ферментный ранозаживляющий препарат |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009002209A1 (en) | 2008-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dobell et al. | On the cultivation of Entamoeba histolytica and some other entozoic amoebae | |
Wadström et al. | Studies on extracellular proteins from Staphylococcus aureus: VII. Studies on β-haemolysin | |
RU2663136C2 (ru) | Способ получения высокочистого нейротоксического компонента ботулотоксина и его применения | |
US10499655B2 (en) | Reagents and methods for inhibiting or disrupting biofilm | |
RU2340371C1 (ru) | Субстанция для дерматологических лекарственных средств на основе коллагеназы микробного происхождения "ультрализин" | |
Zerda et al. | Schistosoma mansoni: expression and role of cysteine proteinases in developing schistosomula | |
Goes et al. | Interaction of myxobacteria-derived outer membrane vesicles with biofilms: Antiadhesive and antibacterial effects | |
KR20070024718A (ko) | 용균효소의 여드름 치료 약물으로의 활용 및 상기 치료에사용되는 약물 | |
Johnson et al. | Isolation of Trichomonas vaginalis with penicillin | |
Dienst et al. | Cultural studies on the" Donovan bodies" of granuloma inguinale | |
RU2129375C1 (ru) | Биопрепарат фитоспорин жидкий для защиты растений от болезней | |
US20200215169A1 (en) | Antibacterial methods and related kits | |
RU2403283C2 (ru) | Штамм staphylococcus epidermidis bvm-1987 - продуцент стафилолитического ферментного комплекса | |
Bamburg et al. | Progress in Molecular and Subcellular Biology | |
US2601350A (en) | Hydrolysis of beta lactam linkage by penicillinase | |
Smith | Bacteria with their coats off: spheroplasts, protoplasts and L-forms | |
RU2285038C2 (ru) | Способ получения протеолитического ферментного препарата и протеолитический ферментный препарат | |
Todosiichuk et al. | BIOTECHNOLOGICAL ASPECTS OF THE DEVELOPMENT OF A LIQUID FORMULATION OF MULTIFUNCTIONAL ENZYBIOTIC ANTISEPTIC | |
Ryazanova et al. | Effect of the proteolytic enzymes of Bacillus licheniformis and the lysoamidase of Lysobacter sp. XL1 on Proteus vulgaris and Proteus mirabilis cells | |
Dziekońska-Rynko et al. | Activity of selected hydrolases in excretion-secretion products and homogenates from L 3 and L 4 larvae of Anisakis simplex (Nematoda: Anisakidae) parasitising herring | |
Wilson et al. | Structure and variability of mammalian peroxisomal membrane proteins | |
RU2117046C1 (ru) | Питательная среда для ускоренного выделения возбудителя туберкулеза из очагов внелегочной локализации на основе среды финна-ii | |
UA145577U (uk) | Штам bacillus sp. imb b-7883 - продуцент позаклітинної протеїнази з фібриногенолітичною активністю | |
EP4060021A1 (fr) | Milieu mimetique de culture microbiologique et utilisations de celui-ci | |
Al-Ameri et al. | INVESTIGATION OF THE MELANIN INSTAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATED FROM PATIENTS WITH URINARY TRACT INFECTIONS. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20090216 |
|
RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20100715 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20090620 |