UA145577U - Штам bacillus sp. imb b-7883 - продуцент позаклітинної протеїнази з фібриногенолітичною активністю - Google Patents

Abstract

Штам Bacillus sp. - продуцент позаклітинної протеїнази з фібриногенолітичною активністю, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером IMB В-7883.

Description

Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості, а саме до одержання нового штаму, продуцента фібриногенолітичної протеїнази.

Фібриноген - білок плазми крові, попередник фібрину, волокна якого складають основу тромбу. Надмірне тромбоутворення призводить до розвитку тромбоемболічних захворювань з можливим летальним наслідком. Видалення тромбів з судин можливо хірургічно або ферментативно. Фібриногенолітичні протеїнази виявлено у численних біологічних рідинах, серед яких отрута змій та павуків, а також культуральні рідини мікроорганізмів. Зокрема, ензими, які каталізують гідроліз фібриногену, здатні продукувати бігеріососсив руодепев,

Аеготопах Нуагорніїа, Мірпо мипітісив, беїтайа, Васійи5 пайцо, В. атуоїїдиегасепв, Асііпотусеїе5 в5р., ЕРивзагпйшт охуврогит, Мисог о5р. (1). Утворення фібриногенолітичних ензимів мікроорганізмами не пов'язане із їхніми патогенними властивостями, а дія таких ензимів на фібриноген обумовлена насамперед особливостями первинної й вторинної структури ділянок фібриногену як субстрату ензиматичної реакції, які комплементарні активному центру ензиму.

Унікальна специфічність фібриногенолітичних ензимів дозволяє отримувати з їх допомогою нефізіологічні фрагменти молекули фібриногену, які за своїми властивостями відрізняються від фізіологічних продуктів плазмінового гідролізу. Вивчаючи функціонування окремих фрагментів молекули можна зробити висновок щодо значення окремих її ділянок у протеїн-протеїнових та протеїн-клітинних взаємодіях |2, ЗІ.

Протеолітичні ферменти, які мають фібриногенолітичну активність, можуть розглядатися як основа для створення лікарських засобів, спрямованих на зменшення загрози внутрішньосудинного тромбоутворення шляхом обмеженого протеолізу фібриногену, що циркулює у кровотоці пацієнта. У разі адресної доставки фібриногенолітичні ензими можуть бути застосовані для розщеплення внутрішньосудинних тромбів, що перешкоджають кровопостачанню органів за таких патологій як інфаркт міокарда, ішемічний інсульт, тромбоемболія легеневої артерії, тощо (1-41.

Протеази, що характеризуються фібриногенолітичною активністю, входять до складу препаратів, які запобігають згортанню крові та знижують артеріальний тиск |4, 5). Для цього застосовуються протеїнази тваринного, рослинного і мікробного походження з фібриногенолітичною активністю ІбЇ. Перевагу надають ферментним препаратам, які мають

Зо високу фібриногенолітичну активність (7|Ї, зокрема фібролаза, що отримується з отрути змії

Адкізітодоп сопіопгіх сопіопігіх (8) або наттокіназа з ВасПи5 5!,ибійів (91.

Найрозповсюдженішими продуцентами фібриногенолітичних пептидаз є бактерії роду

Васій 5, які виділені із грунту, прісної й морської води, а також із рослин. Більшість з цих ензимів є лужними сериновими пептидазами з найвищою активністю за рН 8,0-10,0 і температурою 30- 60 "С (10). Зацікавленість в дослідженні пептидаз з фібриногенолітичною активністю пов'язана також з їх участю в розвитку різноманітних захворювань запального генезу.

Найбільш близьким до корисної моделі за технічною суттю та результатом, що досягається, є пептидаза 2 Васійи5 ІПигіпдіепвіз ІМВ В-7324 (11), при глибинному культивуванні якого за певних умов можна отримати ензимний препарат з активністю 4,17 од/мг білка. Очищений ензимний препарат, отриманий з даного продуцента, проявляє фібриногенолітичну активність 54 од/мг білка, тоді як ферментний препарат, отриманий 90 95 осадженням сульфатом амонію з

Васійи5 зр. ІМВ В-7883, проявляє фібриногенолітичну активність 630 од/мг білка. В Україні на цей час високоактивні продуценти протеїназ з фібриногенолітичною активністю відсутні.

Запропонований штам Васійй5 5р. ІМВ В-7883 - продуцент позаклітинної протеїнази з фібриногенолітичною активністю 630 од/мг білка, ізольований з грунту, який відібрано у

Київській області. Знаходиться в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.

Заболотного НАН України.

Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості.

Штам Васіїив 5р. ІМВ В-7883 добре росте на природних (картопляний агар, м'ясо-пептонний агар, м'ясо-пептонний бульйон) середовищах та на поживному агарі Миїлепі адаг, Нітевдіа.

Через 24 години росту на картопляному агарі (КА) або м'ясо-пептонному агарі (МПА) утворює непрозорі колонії сіро-білого кольору з хвилястим краєм матовою злегка зморшкуватою поверхнею діаметром 4-5 мм. За культивування на м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) культура росте у вигляді сіро-білої плівки на поверхні середовища. В мазках з колоній, що виросли на

МПА, через 18 год. можна побачити прямі поодинокі паличковидні клітини розміром 0,95-2,84 мкм. Клітини зафарбовуються за Грамом позитивно.

Спори в клітині розташовані центрально, спори не змінюють морфологію клітин. Утворення спор розпочинається на 18-24 год. культивування.

Використовує глюкозу в аеробних умовах без утворення газу, дає позитивну реакцію Фогес- бо Проскауеєра.

Асиміляція вуглеводів: штам не асимілює О-маніт, інозит, О-сорбіт, І -рамнозу, Ю-сахарозу,

О-мелібіозу, амігдалін, І -арабінозу, лактозу, трегалозу, ксилозу, малонат, галактозу, целобіозу.

Як джерело вуглецю культура використовує пептон, глюкозу, мальтозу, дріжджовий автолізат.

Штам росте на МПБ при концентрації хлориду натрію 7 95, не здатний рости при температурі 2 "С, не утворює сірководню, не утворює індол, редукує нітрати до нітритів, гідролізує желатин, ескулін.

Фізіолого-біохімічні властивості

Відношення до вуглецевого живлення: культура Васійи5 вр. ІМВ 8В-7883 синтезує позаклітинну фібриногенолітичну пептидазу на середовищах, що містять мальтозу, глюкозу та дріжджовий екстракт.

Відношення до азотного живлення: із органічних джерел азоту асимілює желатин, дріжджовий екстракт та дріжджовий автолізат, а з неорганічних (МНа)25505. Найбільшу фібриногенолітичну активність забезпечує поєднання желатини, дріжджового автолізату та (МНА2»6505, як джерел азоту в середовищі.

Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте в діапазоні рН від 5,0 до 8,0. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,0.

Штам Васійн5 5р. ІМВ В-7883 зберігається на косяках КА або МПА при температурі ж4 "С.

Пересів культури необхідно здійснювати кожні Є місяців.

Штам Васійшз 5р. ІМВ В-7883 було ізольовано із грунту, який відібрано у Київській області у 2019 р. Ідентифікація штаму проведена за визначником Вегадєу5 Мапиаі! ої Бузієетаїйс

ВасіепіоІоду, Мої. 3: 121.

Згідно з отриманими у гострих дослідах результатами та відповідними нормативними матеріалами, штам Васійй5 5р. ІМВ В-7883 належить до авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи досліджених теплокровних тварин - безпородних білих мишей. Середньолетальні та дієві дози не досягнуті (І До регов » 67109, | Дво вч » 67109, млн. клітин/"мишу). Штам належить до непатогенних мікроорганізмів ІМ класу небезпеки: мало небезпечних, практично без алергенної та загально токсичної дії (13-18). Мікроорганізми цього класу небезпеки дозволені МОЗ України до використання у виробництві (1 3.

Відношення до кисню: облігатний аероб.

Зо Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ензиму з фібриногенолітичною активністю 25-28 "С.

Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте в діапазоні рН від 5,0 до 8,0. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,0, а в процесі росту та ферментації спостерігається зростання рнН до 8,0.

Поживним середовищем для ферментації є середовище наступного складу, (г/л): КНгРО4- 1,0; Мо5Охх7Н2гО-0,75;. 7п5Огх7Н2гО-0,25;. (МНа)2504-0,5; мальтоза - 1,0; желатина - 10,0; дріжджовий автолізат - 0,15; рН 7,0.

Вирощування бактеріальної культури проводять в глибинних умовах у пробірках або колбах

Ерленмейєра (750 мл) на качалці, що робить 244 об/хв. (рівень аерації 16,76 мг Ог/лхгод.) при 28 "С впродовж 72 год. Засів поживного середовища здійснюють 5 95 однодобовим інокулюмом.

Після культивування клітини відділяють центрифугуванням (5000 9, 20 хв.), ензиматичну активність визначають у супернатанті культуральної рідини. Фібриногенолітична активність у супернатанті культуральної рідині штаму-продуцента Васійй5 в5р. ІМВ В-7883 за цих умов складає 7,0 од/мл.

Для визначення активності ензиму як субстрат використовують фібриноген. При вивченні фібриногенолітичної активності в дослідну пробірку додають 1 мг фібриногену, 1,8 мл 0,01 М

Трис-НСІ-буфера (рН 7,5) і 0,2 мл розчину досліджуваного препарату. Реакційну суміш інкубують впродовж 30 хв. при температурі 37 "С. Реакцію зупиняють додаванням 2 мл 10 95-го розчину три хлороцтової кислоти (ТХО). В контрольну пробу ТХО додають відразу ж. Зразки витримують при кімнатній температурі 20 хв., а потім центрифугують 10 хв. при 10000 д для видалення осадженого білка. Оптичну густину вимірюють на спектрофотометрі СФ-26 за поглинанням при 275 нм. За одиницю фібриногенолітичної активності приймали таку кількість ензиму, яка підвищує оптичну густину реакційної суміші на 0,01 за 1 хв. (191.

Перевагою запропонованого продуцента є його здатність синтезувати високоактивну та термостабільну фібриногенолітичну пептидазу, відсутність сезонності та токсичності, що є технологічно ефективно. Ензимний препарат, одержаний з культуральної рідини Васіїи5 5р. ІМВ

В-7883 здатний ефективно деградувати фібриноген при значеннях рН середовища (5,0-9,0) з помітним піком активності при рН 8,0. Фермент стабільний при зазначених значеннях рн.

Використання сульфату амонію в середовищі культивування дозволяє збільшити активність бо позаклітинної фібриногенолітичної активності майже у 100 разів. Препарат протеїнази з фібриногенолітичною активністю, що продукується культурою, активний у широкому діапазоні рН (від 5,0 до 9,0) та температури (4-80 "С), з максимумом активності при рН 8,0 та 50 "С.

Ферментний препарат відзначається високою термостабільністю (термостабільність препарату при 25 "С повністю зберігається впродовж доби; при 50 7-5 год.). Із глибинної культури запропонованого продуцента може бути одержаний фермент, придатний для застосування в медико-технологічних процесах.

Запропонований фермент може знайти використання у медико-технологічних процесах.

Таким чином, виділено новий штам-продуцент фібриногенолітичної пептидази, який, у порівнянні з відомими, має інші культуральні ознаки і є новою культурою зі стійкими біохімічними властивостями.

Джерела інформації: 1. Варбанець Л.Д., Мацелюх Е.В. Пептидазьі микроорганизмов и методь их исследования. -

К.: Наукова думка, 2014. - 161 с. 2. СіпепКо Т.М., КаривзійапепкКо І.С, МаїзепКо Т.А. вї а). Ріазтіподеп Ігадтепів К 1-3 апа К 5

Біпа ю айегепі 5іїтевіп Пбгіп тадтепі 00. ОКу. Віосне т У. - 2016. - 88. - З32-8.

З. боїкип О.М., І йміпом В.І., Мекіїсп М.І., М/еїізеї УМ. Іпіегасіп5 Медіаїед Бу Ше М-Тептіпиво ї

Еібгіподеп'з В ВД СНаїйп. Віоспетівігу. - 2006. - 45. - 14843-52. 4. Маївиї Т., Еціїтига У., Папі К. Зпаке мепот ргоїєазев анесіїпд Нетозіавзів апа Шготбровів // Віоспіт Віорпуз Асіа. - 2000. - 1477. - 1-2. - 146-56. 5. ЗНуп-Ногтту бС., Меп-Знап С. СПагасієггайоп ої їмо таіог Татійєев ої Пргіподепоїуїїс ргоїєазез їот Ше мепот ої Таїмап паби м/йй з5ресіа! гетегепсе (о ІПеїг тедісаї! арріїсайопв // Тохіп

Веміємув. - 2005. - 24. - 1. - 43-61. 6. Стаік С.5., Раде М.)., Мадізоп Е.І... Ргоїєазез аз Шегарешісзв // Віоснет .). - 2011. - 435. - 1. - 1-16. 7. Мем/ Тнегарешіс Адепів іп Гпготбровзіз апа ГТипготбоїувів / Ед. У.Е. Егевдтанп, 9. І озсаї1?2о, 2009, "Іптопта пеайнсаге", МУ Гопаоп, 690 р. 8. Аптей М.К., Садаів В.В., Теппапі К.О., І ас У.Р. Віоіодіса! апа (пготброїуїїс ргорепієв ої

Тіргоїазе-а пему Пргіпоїуїіс ргоївазе тот 5паКе мепот // Наєтозвіавів. - 1990. - 20. - 6. - 3344-40. 9. Хіао Р., Мао 5., Вігмап-ши-тейтап, Капа В., Мапд У. А ПТргіпоїуїйс епгуте ргодисед ру

Коо) Васійив вибійїйв ивіпд СпісКреа (Сісег агієїїпит І.) а5 вирвігаїе // Адмапсе доштпаї ої Роса Зсіепсе апа Тесппоіоду. - 2014. - 6. - 12. - 1294-1300. 10. Ландау Н.С., Кураков А.В., Туликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров

Н.С. Зкстрацеллюларнье протеиназьь микромицетов с о фибринолитическими (и антикоагулянтньіми свойствами // Микробиология. - 1998. - 67. - 2. - 215-220. 11. Нідялкова Н.А., Мацелюх О.В., Варбанець Л.Д. Оптимізація середовища для синтезу фібринолітичної пептидази Васійив ІПигіпдіепвів ІМВ В-7324 // Біотехнологія. - 2012. - Т.5, Мо 4. -

С. 74-81. 12. Вегдеу5 Мапиаї ої Зузіетаїййс Васіегіоіоду, Мої. З: Те Рігтісшіев5, Мов, Р., СЧаптйу, а.,

УдЧопев, 0., Кпед, М.В., І пам/а, М/., Ваїпеу, Р.А., 5спієїйег, К.-Н., апа МУнійтап, МУ.В., Едв»., Мем/

Мої: 5ргіпдег, 2009. 13. Медико-біологічні дослідження виробничих штамів мікроорганізмів і токсико-гігієнічна оцінка мікробних препаратів, визначення їх безпеки та обгрунтування гігієнічних нормативів і регламентів. Методичні вказівки МОЗ України. - К., 2004. 14. Методическиеє рекомендации по вьіделению и идентификации бактерий группь! Васіи5 5МИБій5-тезепіеїтіси5 из организма человека и животньіх. - К.: Наукова думка, 1980. 15. Методические указания по гигиенической оценке микробньїх средств защить! растений от насекомьїх и болезней на основе неспорообразующих микроорганизмов. - К., 1982. 16. Методические указания по зкспериментальному обоснованию ПДК микроорганизмов- продуцентов и содержащих их готовьіх форм препаратов в обьектах производственной и окружающей средь!. - М., 1991. 17. Постановка исследований для обоснования предельно-допустимьїх концентраций производственньїх штаммов микроорганизмов и на их основе готовьіх форм препаратов в воздухе рабочей зоньі. Методическиеє указания. - М., 1983. 18. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие азробнье бактерии - продуценть!ї биологически активньх веществ. - К.: Наукова думка, 1982. 19. Осмоловский А.А. Попова Е.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А. Егоров Н.С.

Фибринолитическая и коллагенолитическая активность внеклеточньїх протеиназ штаммов микромицетов Азрегайи5 оспгасеив 1-1 и Аврегдійиє ивіи5 1 // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16.

Биология, 2016. - 1. - 71-75. (516)

Claims (1)

1. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Штам Васійив р. - продуцент позаклітинної протеїнази з фібриногенолітичною активністю, що зареєстрований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім.

   Д.К.

   Заболотного НАН України під номером ІМВ В-7883.