JPH0440898A - α―ヒドロキシ―４―メチルチオ酪酸の生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の生物学
的製造法に関する。α−ヒドロキノ−４メチル千オ醋酸
は、家畜、特に家禽の飼料に含硫アミノ酸類の不足を補
う目的で添加される飼料添加物である。

〔従来の技術と問題点〕

α−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の工業的製法とし
てはα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルの
硫酸による加水分解法が知られている。しかし、硫酸を
用い方法は多量の硫安がＩＩ　生しα−ヒドロキシ−４
−メチルチオ酪酸の回収と精製工程も複雑となる。

一方、最近、ニトリル化合物を微生物の作用により加水
分解し対応する酸に変換するいくつかの方法が提案され
ており、α−ヒドロキシニトリルからのα−ヒドロキシ
酸の製造方法に関しては、例えば、バチルス属、バクテ
リウム属、ミクロコツカス属またはブレビバクテリウム
属の微生物によるラクトニトリルおよびヒドロキシアセ
トニトリルからの対応する酸の生産〔特公昭５８４５１
２０号公報参照〕、トルロプシス属酵母による対応する
α−ヒドロキシニトリルからの光学活性なＬα−ヒドロ
キンバレリアン酸およびＬ−α−ヒドロキシイソカプロ
ン酸の生産ＣＦｕｋｕｄａ　Ｙ、、ｅｔ　ａｌ。

Ｊ、　Ｆｅｒｓ＋ｅｎｔ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　　５１
３９３　（１９７３）参照］、コリネバクテリウム属の
微生物を用いたグリコロニトリル、ラクトニトリルおよ
びアセトンシアンヒドリンの加水分解による対応するα
−ヒドロキシ酸の生産〔特開昭６１−５６０８６号公報
参照〕およびアルカリ土類金属、ンユードモナス属、ロ
ドシュードモナス属、コリネバクテリウム属、アシネト
バクタ−属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ロド
コッカス属またはキャンデイダ属に属する微生物による
α−ヒドロキソニトリルからの光学活性すα−ヒドロキ
シ酸の生産〔特開平２−８４１９８号公報参照〕などが
示されている。

しかし、微生物を用いたラセミ体のα−ヒドロキソ−４
−メチルチオ酪酸の製法に関する報告は未だない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはこのよう従来の製造方法に対し、硫安の生
成がなく、エネルギー的にも工業的に有利なα−ヒドロ
キシ−４−メチルチオ酪酸の製造方法の開発を目的とし
て、α−ヒドロキシ−４メチルチオブチロニトリルを生
物学的に加水分解し、α−ヒドロキシ−４−メチルチオ
醋酸を生産する能力を有する微生物の探索を行った結果
、カセオバクター属、シュードモナス属、アルカリゲネ
ス属、コリネバクテリウム属・ブレビバクテリウム属、
ノカルジア属、ロドコッカス属またはアースロバフタ−
属に属する微生物に目的とする加水分解活性を見出し本
発明を完成した。

すなわち、本発明は、α−ヒドロキシ−４−メチルチオ
ブチロニトリルを微生物の作用による加水分解反応によ
りα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸に変換させるこ
とを特徴とするα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の
生物学的製造法−である。

本発明で使用する微生物は、カセオノ＼クタ（Ｃａｓｅ
ｏｂａｃｔｅｒ）　ｔｉＫ　、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄｏ糟ｏｎａｓｌ属、アルカソゲ２ス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃ　ｔｅｒ　ｉｕ＋＋）属・ブレビバクテリウム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｓ＋）　］ｉＫ、ノカルジア
（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属またはアースロハクター（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物等であり、具体的には
、カセオバクターｓｐ、　ＢＣ２３（微工研菌寄第１１
２６１号）、シュードモナスｓｐ、　ＢＣｌ３−２　（
微工研菌寄第１１２６６号）、アルカリゲネスｓｐ、　
ＢＣ３５−２（微工研菌寄第１１２６５号）、コリ矛バ
クテリウム　ニトリロフィラス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｎ１ｔｒｉｌｏｐｈｉｌｕｓ）　ＡＴＣＣ
２１４１９、ブレピノ１クテリウム　アセチリカム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｓａｃｅｔｙｌｉｃｕｓ）ｔ
ＡＭ　１７９０　、ノカルジアｓｐ、　Ｎ−７７５（微
工研菌寄第４４４７号）、ロドコッカスＳρ、　５Ｋ９
２（微工研菌寄第１１３０５号）およびアースロハクタ
ーｓｐ、　）ＩＲ４（微工研菌寄第１１３０２号）を挙
げることができる。また、これらの変異株を用いること
もできる。

これらの微生物のうちコリネバクテリウム　ニトリロフ
ィラスＡＴＣＣ２１４１９ブレビバクテリウム　アセチ
リカムＪＡＭ　１７９０およびノカルジアｓｐ、　Ｎ−
７７５は公知の微生物であり、それぞれアメリカンタイ
プカルチャー　コレクシボン（ＡＴＣＣ）、東京大学応
用微生物研究所（ＩＡＭ）および工業技術院　微生物工
業技術研究所から容易に入手することができる。その他
の微生物は本発明者らにより自然界から新たに分離され
たものであり、各々上記寄託番号にて工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されており、その菌学的性質は以
下に示す通りである。

ＢＣ２３およびＢＣｌ３−２菌株 ＮＴ：試験せず（以下、同じ） 以上の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ、　１９８６に従って分類するとＢＣ２３はカセオバ
クター（Ｃａｓｅｏｂａｃ　ｔｅｒ）属、ＢＣｌ３−２
はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎａｓ）属、ＢＣ
３５−２はアルカリゲネス（Ａ　ｌｅａ　ｌ　ｉｇｅｎ
ｅｓ）属、５Ｋ９２はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属および１ｌＲ４はアースロハクタ−（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌とそれぞれ同定さ
れた。

次に本発明の一射的実施Ｂ様について説明する。

本発明に使用される微生物の培地としては、各々の微生
物に適したイソブチロニトリル、ベンゾニトリルなどの
ニトリル化合物、またはアセトアミド、プロピオアミド
などのアミド化合物を酵素誘導物質として用い、通常資
化し得るグルコース、グリセロールなどの炭素源、硫酸
アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素源、塩化マ
グネシウム、塩化第二鉄などの無機栄養素を含有する培
地か、これらの培地に酵母エキス、肉エキスなどの天然
培地を添加したものを用いることができる。

培養条件は、好気性条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜
５０℃の範囲で選べばよく、培養日数は１〜１０日の範
囲で活性が最大となるまで培養すればよい。

加水分解反応は、液体培地または平板培地上にて培養し
た菌体を採取し、必要に応し固定化菌体、粗酵素、固定
化酵素などの菌体処理物を調製し、ｎ−ヘキサン、酢酸
エチルなどの適当な溶媒に溶かしたα−ヒドロキシ−４
−メチルチオブチロニトリルと水、緩衝液などとの二相
系による反応、またはα−ヒドロキシ−４−メチルチオ
ブチロニトリルを直接、菌体または菌体処理物の懸濁液
中に混合して行うことができる。

反応条件としては、菌体使用量０．０１〜５０重量％、
α＝ヒドロキシー４−メチル子オブチロニトリル濃度０
．１〜７０重量％で基質は反応媒体中で完全に溶解しな
くてもよい０反応塩度は５〜６０°Ｃ１好ましくは１０
〜４０°Ｃ１反応ｐＨは４〜１１、好ましくは６〜１０
で、０．５〜１００時間反応させればよい。

かくしてα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリ
ルは対応する酸とアンモニアに直接、もしくは対応する
アミドを経由して転換、蓄積される。

生成物の単離は濃縮、イオン交換、電気透析、抽出、晶
析などの公知の方法を利用して行うことができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチ
ロニトリルの加水分解活性を有する微生物を用いること
により、常温、常圧という温和な条件下で反応を進行さ
せ、副生物として硫安を生成しないα−ヒドロキシ−４
−メチルチオ酪酸の工業的に有利な製法を提供すること
ができる。

〔実験例〕

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）　　　培　　養 表１に示す菌体を下記により培養した。

Ｉ）培　地〔単位：　　Ｗ／Ｖ） グリセロール　　　　　　２％ 酵母エキス　　　　　　　０．３％ りん酸−カリウム　　　　０．６８％ りん酸二ナトリウム　　　０．７１％ 硫酸ナトリウム　　　　　０．２８％ 塩化マグネシウム　　　　０．０４％ 塩化カルシウム　　　　　０．００４％硫酸マンガン　
　　　　　４Ｘ１０−’％塩化鉄　　　　　　　　　６
×１０弓％硫酸亜鉛　　　　　　　　３Ｘ１０−’％寒
天　　　　　　　　　　１．８％ ｐＨ７，５ さらに、誘導剤としてイソブチロニトリル（ＩＢＮ）０
．２％、α−クロルプロピオニトリル（ＣＰＮ）０．０
５％またはベンゾニトリル（ＢＮ）０．０２％を添加し
た。

１１）培養条件 斜面培地から１白金耳の菌体を採り、上記平板培地上に
塗布し、３０°Ｃで４８時間好気条件下に培養した。

（２）　　加水分解反応 平板培地から菌体を採取し遠心分離により各々の菌体を
０．０５　Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗浄し
た。沈殿菌体を１．５　ｄの同様の緩衝液に再懸濁し終
濃度１００腸阿のα−ヒドロキシ４−メチルチオブチロ
ニトリルを添加し、２５°Ｃで２０時間、振盪しながら
反応を行った。

反応終了後、各々の反応液を遠心分離し菌体を除去し、
遠心上清中のα−ヒドロキシ酸は液体クロマトグラフィ
ー（カラム；　５）ＩＯＤＥＸ　００ＳＦ５１１Ａ　　
キャリアｉ０．２Ｍ　Ｈ，ＰＯ，，３０℃、モニター；
２０８ｎｍ）により定量した。

結果を表１に示した。

＼ 表　　１ ２００ｍＭのα−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニ
トリルを添加し、２５℃で２０時間振盪しながら反応さ
せた後、再び２００ｓ＋Ｈの基質を加えさらに２０時間
反応を継続した０反応後、遠心分離により菌体を除去し
反応液中に生成したα−ヒドロキシ−４−メチルチオブ
チルアミドおよびα−ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸
を実施例１と同様の方法で定量した。

結果を表２に示した。

表　　２ 実施例２ （１）　　　培　　養 カセオバクターｓｐ、　ＢＣ２３株を実施例１と同様な
方法で培養した。

（２）加水分解反応 実施例１と同様にして調製した菌体懸濁液に実施例３ （１）　　　培　　養 ロドコフカスｓｐ、　５Ｋ９２株を実施例Ｉと同様な方
法で培養した。

（２）　　加水分解反応 実施例１と同様にして調製した菌体懸濁液（００６３０
ｎｍ　＝　２３　）に１００＋ｗＭのα−ヒドロキシ−
４−メチルチオブチロニトリルを添加し、２５°Ｃで４
０時間反応させた。反応開始２０時間および４０時間後
に０．５　ｄづつ反応液を採り遠心分離による除菌後、
実施例１と同様に液体クロマトグラフィーにより酸とア
ミドの定量を行い、結果を表３に示した。

表　　３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α−ヒドロキシ−４−メチルチオブチロニトリルを
   微生物の作用による加水分解反応によりα−ヒドロキシ
   −４−メチルチオ酪酸に変換させることを特徴とするα
   −ヒドロキシ−４−メチルチオ酪酸の生物学的製造法。 ２、微生物がカセオバクター（Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ
   ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、
   アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネ
   バクテリウム（Ｃｏｒｙ−ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
   ・ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ−ｔｅｒｉｕ
   ｍ）属、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ロドコッ
   カス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属またはアースロバク
   ター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属するものであ
   る請求項１記載の製造法。