RO109653B1

RO109653B1 - Polipeptide

Info

Publication number: RO109653B1
Application number: RO92-200638A
Authority: RO
Inventors: Nobutaka Fujii; Naoki Yamamoto
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1991-09-10
Publication date: 1995-04-28
Also published as: EP0502198A1; FI922044A; DE69115878T2; EP0502198B1; BG96323A; NO921829L; JP3178835B2; CA2068327A1; DK0502198T3; DE69115878D1; HUT61579A; ATE132163T1; HU9201540D0; CZ280870B6; WO1992004374A1; CS139492A3; GR3018879T3; FI922044A0; US5571892A; CA2068327C

Description

Prezenta invenție se referă la polipeptide și săruri ale acestora care prezintă o puternică afinitate pentru lipopolizaharide, îri mod particular endotoxine și activitate antibacterială și antivirală superioară și se utilizează 5 ca ingredienți activi pentru anti-HIV.

Sunt cunoscute polipeptide cu afinitate pentru endotoxine, derivate de la racii de ’’ Moluce (genul Tachypleus, genul Lumulus și genul Căreinoscorpius). Astfel există 5 analogi 10 structurali și fiecare dintre aceștia este o polipeptidă având o strtuctură ciclică conținând 17 sau 18 aminoacizi naturali. în plus, prezintă în comun proprietăți extrem de analoage și o astfel de polipeptidă este foarte 15 interesantă ca una dintre substanțele cheie prin care racii de Moluce au fost capabili să se adapteze la schimbările mediului lor înconjurător și să-și păstreze specia, din cele mai vechi timpuri până în prezent, ca fosile vii (J.Biol.Chem., 263, (1988) p. 16709-16713; Chem.Pharm.Bull., 37, (1989), p.2661-2664; J.Biochem„ 106, (1989), p. 663-668; Taisha (Metabolism), 26, (1989), p. 301-311).

Afinitatea pentru endotoxină a polipeptidelor de mai sus presupune a avea legătură cu puternica conservabilitate a speciilor de raci de Moluce și în acest sens s-au studiat corelațiile între modificările structurale și activitatea antivirus al imunodeficienței umane (HIV).

Prezenta invenție lărgește gama polipeptidelor cu afinitate pentru endotoxine, cu noi compuși, polipeptide cu formula generală I;

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

A_]-Trp-Cys-A₂-A₃-Lys-A4-A₂-A₃-Gly-A4-A4-A₂-A₃-A₃-Cys-Arg-A5 (I) în care A, reprezintă un atom de hidrogen sau 20 unul sau două resturi de aminoacid, ales dintre lizină și arginină; A₂ reprezintă independent un rest de tirozină, fenilalanină sau triptofan; A₃reprezintă independent un rest de lizină sau arginină; A₄ reprezintă independent un rest de 25 alanină, valină, leucină, izoleucină, serină, cisteină sau metionină; A₅ reprezintă -OH (derivat de la gruparea carboxil) sau -NH₂(derivat de la gruparea amidică de acid); Cyz reprezintă un rest de cisteină; Gly reprezintă un 30 rest de glicină; Lys reprezintă un rest de lizină; Arg reprezintă un rest de arginină; Τηρ reprezintă un rest de triptofan și resturile de cisteină din pozițiile 3 și 16 pot fi legate prin intermediul unei legături disulfurice -S-S- și 35 când pozițiile 7 și 12 sunt ambele resturi de cisteină acestea este posibil să fie legate prin intermediul unei legături disulfurice -S-S- sau săruri ale acestora.

Invenția prezintă avantajul obținerii 40 unor polipeptide a căror activitate anti-HIV este de 10 ori mai mare decât ale unei polipeptide cu afinitate pentru endotoxine cunoscute.

Polipeptidele, conform invenției, au o caracteristică fundamentală importantă prin aceea că, deși în polipeptidele cunoscute derivate de la racii de Moluce, restul de aminoacid din poziția 6 este în mod obișnuit un reziduu de valină (Val), poziția sa 6 este un rest de lizină (Lys), un rest de aminoacid bazic având proprietăți complet diferite de cele ale restului de valină.

Polipeptidele, conform invenției, pot fi preparate prin metode în sine cunoscute, de exemplu printr-o metodă de sinteză în fază solidă.

în special, o polipeptidă cu catenă lineară, conform invenției, poate fi obținută prin legarea grupării carboxil a unei arginine N-protejate la o rășină insolubilă.având grupări amino legate direct sau în unele cazuri,prin intermediul unei unități de distanțare,având o grupare funcțională capabilă să se lege la o grupare carboxil și o grupare carboxil, legânduse succesiv, conform metodei de sinteză în fază solidă, respectivii aminoacizi protejați de la poziția 16 până la poziția 1 a secvenței de aminoacid reprezentată cu formula generală I:

4

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

A₁-Tip-Cys-A₂-A₃-Lys-A₄-A₂ -A₃- Gly- A₄-A₄-A₂-A₃-A₃-Cys-Arg-A₅ (I) în care A_b A₂A₃, A₄, A₅, Cys, Gly, Lys, Arg și Trp au semnificațiile sus-menționate și apoi îndepărtând rășina insolubilă și grupările 5 protectoare ale aminoacizilor. în acest caz, carboxilul terminal al reziduului de aminoacid ’ de la poziția 17 poate fi, fie liber (A₅corespunde lui OH), fie convertit la o amidă a unui acid (A_s corespunde lui -NHJ. în plus, îh 10 polipeptida obținută, cele două cisterne de la pozițiile 3 și 16 pot forma o legătură disulfurică -S-S- prin intermediul grupărilor mercapto.

Mai mult, când poziția 7 și poziția 12 15 sunt ambele resturi de cisteină, aceste cisteine pot forma de asemenea o legătură disulfură.

Cât despre formarea acestor legături disulfurice, amândouă perechile de grupări cisteinice pot fi convertite la o legătură 20 disulfurică, de exemplu prin oxidare cu aer, sau legătura disulfurică se poate forma printr-o metodă cunoscută (Atherton E. ș.a., J.Chem.Soc., Pewrkin Trans.1, 1985, 2065). Aceasta se realizează în special prin inter- 25 mediul treptelor de protecție prealabilă, selectivă, a grupărilor mercapto, a fiecărei perechi de cisteine de la pozițiile 3 și 16 și de la pozițiile 7 și 12 cu o grupare protectoare, tBUS (i-butiltio) și grupările mercapto ale 30 celeilalte perechi de cisteine cu o grupare protectoare Acm (acetilamidometil); deprotejînd t-BUS, oxidând parțial grupările mercapto și apoi deprotejând Acm, conform unei metode cunoscute. 35

Respectivii aminoacizi care se utilizează în metoda de sinteză în fază solidă pot fi în formele obișnuite L sau în formele obișnuite D.

Cât despre rășinile insolubile având 40 grupare amino, care se utilizează în sintetizarea noilor polipeptide, conform invenției, oricare dintre rășini poate fi utilizată atât timp cât poate lega, prin grupările sale amino, grupările carboxil ale argininei N-protejate la atomul de 45 carbon terminal sau, în unele cazuri, grupările carboxil ale radicalului de distanțare legat la aceasta și apoi poate fi îhdepărtată.

Exemple de astfel de rășini insolubile sunt rășinile aminometilice (copolimeri stirendivinilbenzen aminometilați), rășini benzhidrilaminice, rășini metilbenhidrilaminice și rășini aminometilfenoximetil și derivații lor etc. Când se utilizează o rășină benzhidrilaminică, o rășină metilbenzhidrilaminică, o rășină dimetoxibenzhidrilamină (DMBHA) sau o rășină aminometilfenoximetilică, se obține direct o amidă prin scindare, dar îh vederea randamentului este preferată o rășină aminometilică.

Ca unitate de separare având o grupare funcțională capabilă de a lega gruparea carboxil și o grupare carboxil, pot fi, de exemplu, menționate unele capabile de a converti gruparea carboxil a argininei la ester pcarboximetilbenzil, dar nu există nici o limitare particulară.

Aminoacidul protejat este un aminoacid ale cărui grupări funcționale sunt protejate cu grupări protectoare, prin metode cunoscute, și diverși aminoacizi protejați se găsesc în comerț.

în sinteza polipeptidelor, conform invenției, este de preferat să se aleagă oricare dintre următoarele grupări protectoare. O grupare protectoare pentru gruparea a-aminică a unui aminoacid este Boc (t-butiloxicarbonil) sau Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil). O grupare protectoare pentru gruparea guanidino a argininei (Arg) este Tos (tosil), NO₂ (nitro), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil) sau Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil). Drept grupare protectoare pentru gruparea mercapto a cisteinei (Cys) sus-menționate Bzl (benzii), MBzl (4-metoxibenzil), 4-MeBzl (4metilbenzil), Acm (acetamidometil), Trt (tritil), Npys (3-nitro-2-piridinsulfenil), r-Bu (r-butil) sau t-BuS (t-butiltio și MBzl, 4-MeBzl, Trt, Acm și Npys sunt grupările preferate.

O grupare protectoare pentru gruparea hidroxil a tirozinei (Tyr) este Bzl, Cl₂Bzl (2,6diclorbenzil) sau r-Bu, dar este posibil ca grupările să nu fie protejate.

O grupare protectoare pentru gruparea g-amino a lizinei este 2(benziloxicarbonil), C1Z (2-clorbenziloxicarbonil), Boc sau Npys. Este preferabil să fie selectată drept grupare protectoare, una potrivită din cele cunoscute în sine, în funcție de condițiile de sinteză ale peptidei.

Cuplarea aminoacizilor protejați poate fi condusă conform metodelor uzuale de condensare, cum ar fi, de exemplu, metoda cu DCC (diciclohexilcarbodiimidă), metoda cu DIPCDI (diizopropilcarbodiimidă) (Tartar A. et. al., J.Org.Chem., 44,(1979), p.5000), metoda cu ester activ, metoda cu anhidridă acidă mixtă sau simetrică, metoda cu carbonildiimidazol, metoda cu DCC=HOBt (1hidroxibenzotriazol) (Konig W. et. al., Chem.Ber., 103, (1970), 788, 2024, 2034) sau metoda cu difenilfosforil azidă, dar sunt preferate: metoda DCC, metoda DCC-HOBt, metoda DIPCDI-HOBt și metoda anhidridei mixte simetrice. Această reacție de condensare este condusă, de obicei, într-un solvent organic, cum ar fi diclormetan sau dimetilformamidă sau într-un solvent format din amestec al acestora. Drept reactiv de deblocare pentru gruparea protectoare a unei grupări aminice se utilizează acid trifluoracetic/diclormetan, HCl/dioxan, piperidină/dimetilformamidă sau alții asemenea și se face o selecție corespunzătoare conform tipului de grupare protectoare. în plus, gradul de avansare al reacției de condensare, în fiecare etapă a sintezei este urmărit prin metoda reacției cu nihidrină (Kaiser E. et. al., Anal. Biochem., 34, (1970), p. 595).

Conform metodelor precedente, poate fi obținută o rășină cu peptidă, protejată, având o secvență de aminoacid dorită.

Când drept rășină insolubilă s-a utilizat o rășină aminometilică, rășina poate fi îndepărtată, de exemplu, tratând rășina cu peptidă protejată, cu amoniac, într-un solvent adecvat. Peptidă proptejată rezultată este apoi tratată cu acid fluorhidric, amida polipepditică reprezentată cu formula de mai sus, obținânduse eliberată de toate grupările protectoare. Când s-a utilizat ca rășină insolubilă o rășină benzhidrilaminică, o rășină metilbenzhidrilaminica, o rășină aminometilfenoximetilică sau o rășină DMBHA (Funakoshi

S.et al., J.Chem.Soc., Chem. Commun., 1988, 382), rășina și grupările protectoare pot fi îndepărtate simultan prin tratarea rășinii cu peptidă protejate cu acid fluorhidric, TFMSA (acid trifluor- metansulfonic) (The peptides, Yajima H., et al., vol.5(1983), pag.65, Academic Press), TMSOTf (trimetilsililtriflat) (Fuji N. et al., J.Chem.Soc.,Chem.Commun., 1987, 274) sau TMSBr (trimetilsilil bromură) (Fuji N. et. al., Chem.Pharm.Bull)., 35, 3880, (1987) sau alții asemănători.

Apoi, dacă se dorește, polipeptida rezultată este redusă cu 2-mercaptoetanol, DTT (ditiotreitol) sau alții pentru a obține cu siguranță grupările mercapto ale cisteinei în formă redusă și apoi oxidată pentru a se obține polipeptide ciclice, conform invenției.

Procesul de oxidare poate fi condus printr-o metodă cunoscută. De obicei, se utilizează un agent de oxidare, cum ar fi oxigen, în aer sau un fericianat (de exemplu fericianură de potasiu).

Polipeptida astfel obținută poate fi izolată și purificată prin metode în sine cunoscute pentru polipeptide, de exemplu, extracție, recristalizare, diverse tipuri de cromatografie (filtrare pe gel, schimbare de ioni, pertiție, adsorbție, reversare de fază), electroforeză, distribuție în contracurent etc. și cromatografie lichidă de înaltă performanță cu reversare de fază, care este cea mai eficientă.

Ca exemple specifice de polipeptide, conform invenției, reprezentate prin formula I, pot fi menționate cele cu următoarele formule de la (Q la (22), date în continuare:

în următoarele formule (1) până la (22), fiecare simbol definește prin prescurtarea de trei litere, admisă internațional, restul de aminoacid corespunzător. Adică fiecare simbol definește restul următorilor aminoacizi:

Arg: Arginină	Trp:	Triptofan
Cys: Cisteină	Tyr:	Tirozină
Lys: Lizină	Gly:	Glicină
Phe: Fenilalanină	Ile:	Izoleucină
Ser: Serină	Leu:	Leucină
Met: Metionină	Val:	Valină
Ala: Alanină

tQ

bJ

b3 S

\©

oo

/—s

O\

<-h

£

<A>

z«“S bJ

o

*3

oo

3

Z-*K Oj

z«^. LG

z·^ -U

3

s

»—»

>

►

>

►

3

<3

03

o3

3

era

3

<£2

w!

>

►

>

H-

3

03

3

era

3

03

3

era

H

>

H

►4

H

N)

3

>3

3

03

Ή

3

t3

3

*β

2

$

£

-2

2

•2

$

&

-2

$

>2

o X

£

n X

>2

2

-2

U4

Vi

ce

M

ce

CA

Vi

ce

Vi

ce

CA

Vi

ce

H

15

a

H

4^

X

SC

3

Λ

X

*<

X

*1

1

g

G

1

»

>

ΛΤ

>

►

>

►

>

►

>

t-Λ

<3

era

03

Vi

3

era

3

r-

r

t-¹

r

r·

r

O\

x

X

x

X

x

*<

X

Vi

ce

a

<n

>

Ci

r>

n

o

n

O

r>

o

Ω

a

o

r>

o

n

i?

o

n

-4

X

&¹

X

v>

ce

ca

tA

ce

Vi

CA

H

Ό

u

H

00

X

x

X

x

X

*<

X

G

13

n

Vi

r

r-

r

>

r

X

r

>

o

<A

ce

X CA

o3

<3

3

X Vi

*-< Vi

’C ce

’xi ce

3

σ3

3

O

Ω

O

Q

o

Q

o

O

Ω

a

O

a

O

»—1

X

x*

X

x*

*5*

X

X*

*<r

X

x

X*

x

<3*

x

<<r

gT

Val

Leu

Ser

Leu

Ala

Sert

s=

X G

£

Val

Leu

g“

eT

g“

c= G

Met

£

ts G

S²

-

ez>

n

>

n

ΓΊ

n

o

n

t—-

X

*<

X

to

*

£

$

15

£

G0

X G

1

*1

-n

n

-n

n

“î

n

>

r

r·

>

►

>

63

era

σ3

era

03

era

3

cr3

3

era

3

ei3

3

σ3

3

era

o3

3

-U

£

r

•C

£

>

£·

¢-

r

£

r

£

H-

ce

o3

era

σ3

era

X

ce

n

o

n

o

n

(Ί

n

c

o

n

o

a

n

Ci

n

Ό

Π

r>

Ci

X

x

X

<

X

Ch

ce

>

>.

>

►

>

►

>

1—*

era

σο

σ3

era

QQ

ei3

era

3

erS

OQ

ei3

era

3

era

3

-sj

z

Z

z

t—‘

x

X

»T<

X

00

-J

Polipeptidele, confonn invenției, prezintă o proprietate fundamentală datorită caracteristicilor aminoacizilor constitutivi și formând o sare prin adăugare de acid. De exemplu, polipeptida formează o sare cu un acid anorganic (acid clorhidric, acid bromhidric, acid fosforic, acid azotic, acid sulfuric sau alții asemenea) sau cu un acid anorganic carboxilic (acid acetic, acid propionic, acid maleic, acid succinic, acid malic, acid citric, acid tartric, acid salicilic sau alții asemenea) sau cu un acid

123456789

Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg în formula A de mai sus, Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, Gly și Ile definesc resturile de aminoacid menționate mai înainte și resturile Cys de la pozițiile 3 și 16 și de la pozițiile 7 și 12 sunt legate respectiv prin intermediul legăturii disulfurice.

(1) Introducerea într-o rășină aminometilică a Fmoc-DMBHA-CH₂CH₂COOH {acid/3a-Fmoc-amino-4-metoxibenzil)-4metoxifenil/propionic} într-o coloană pentru sinteză în fază solidă se introduc 270 mg (0,2 mmoli) dintr-o rășină aminometilică (0,74 mechiv/g) și 268,5 mg (0,5 mmoli, 2,5 eciv) de Fmoc-DMBHACH₂-CH₂-COOH (GM 537) și reacția de condensare este condusă timp de 2 H prin metoda cu DIPCDI-HOBt în DMF (Guc L. et al CHem.PHarm.Bull., 36 (1988) 4989).

După efectuarea reacției de condensare, are cuplarea pentru protecția grupărilor amino libere, utilizând anhidridă acetică DMBHA rășină).

(2) Introducerea argininei la poziția 17 în rășina DMBHA

După îndepărtarea grupărilor Fmoc ale rășinii DMBHA, preparate mai sus, cu piperidină/DMF 20%, se adaugă 2,5 echiv de Fmoc-Arg-(Mtr)-OH bazat pe rășina DMBHA și reacția de condensare este realizată în DMF, sulfonic organic (acid metansulfonic, acid ptoluensulfonic sau alții asemenea). Polipeptida, conform invenției, reprezentată de formula I, poate fi utilizată sub forma unei astfel de sare, acceptabilă farmaceutic.

Se dau în continuare exemple de preparare a polipeptidelor confonn invenției, în legătură și cu figura, în care sunt prezentate fazele de sintetizare.

Exemplul 1. Sinteza polipeptidei cu formula A:

12 13 14 15 16 17 18 -Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂ (A) conform metodei DIPCDI-HOBt.

Gradul de progresare a reacției de condensare este urmărit prin măsurători confonn testului cu ninhidrină al lui Kaiser E. et. al. (And.BiocHem., 34, (1970), 595).

(3) Introducerea cisteinei Ia poziția 16 După îndepărtarea grupărilor Fmoc ale rășinii DMBHA, preparate mai sus, în care a fost introdusă arginina, cu piperidină/ DMF 20%, se adaugă 2,5 echiv de Fmoc-Cys(MBzl)OH bazat pe rășina DMBHA și reacția de condensare este condusă în DMF prin metoda DIPCDI-HOBt. Gradul de progresare a reacției de condensare este urmărit ca la faza (2), prin măsurători confonn testului cu ninhidrină.

(4) Introducerea de aminoacizi la pozițiile 15 până la 1

La fel ca mai sus, resturi de aminoacid Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(i-Bu). Cys(MBzl), Ile, Gly, Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Lys(Boc), Arg(Mtr), ca secvențe de la Cterminal de aminoacid sunt introduse succesiv în rășina DMBHA pentru a se obține o rășină peptidă protejată (A) cu grupare protectoare.

Reacția de condensare a fiecărui aminoacid în sinteza în fază solidă a fost condusă conform condițiilor de lucru din tabelul 1 următor.

Tabelul 1

Operație	Reactiv	Solvent	Timp x Număr
			de repetări
îndepărtarea	Piperidină/DMF 20%	DMF	5 min x 3
grupărilor Fmoc
Spălare	-	DMF	1 min x 6
Reacția de	Fmoc aminoacid (2,5	DMF	2Hx 1
condensare	echiv)+DIPCDr+HOBt
Spălare	-	DMF	1 min x 4

(5) Prepararea peptidei (A) prin îndepărtarea grupărilor protectoare și operația pentru îndepărtarea rășinii și purificarea parțială.

Rășina - peptidă protejată (A) cu grupări protectoare preparată prin operațiile de la (1) la (4) este supusă tratamentului cu piperidină/DMF 20% pentru a îndepărta gruparea Fmoc și apoi este supusă reacției la 25°C, timp de 2 h, într-un sistem IM de TMSOTf-tioanisol/TFA (10 ml acid trifluoracetic în prezență de 100 echiv m-crezol și 300 echiv etandiol) pentru 100 mg rășină. Rășina este filtrată pentru îndepărtarea din amestecul de reacție și se spală de 2 ori cu 1 ml de acid trifluoracetic, apoi 100 ml este anhidru răcit la gheață se adaugă la filtrat și soluțiile de filtrare, precipitatul format este centrifugat și reziduul se separă de supematant prin decantare. Reziduul rezultat se spală cu eter rece, se dizolvă în 10 ml acid acetic 4N, se adaugă 830mg (80 echiv) ditiotreitol și amestecul se agită la temperatura camerei peste noapte.

Soluția de reacție se centrifughează , supernatantul se tratează cu Sephadex G-10 (3,7 x 50 cm), se filtrează pe gel cu acid acetic 4N și fracțiunile care trec prin Sephadex fără a fi reținute sunt colectate ca parte principală de eluat și sunt liofilizate pentru a se obține sub formă de pulbere o polipeptidă parțial purificată, neciclizată (A).

(6) Prepararea polipeptidei prin oxidare cu aer

Pe de altă parte, o jumătate dincantitatea de fracțiune, care trece prin Sephadex fără a fi reținută prin filtrarea pe gel, se aduce la pH 7,5 cu soluție apoasă concentrată de amoniac și se supune oxidării cu aer, prin aerare, pentru a realiza reacția de ciclizare. După desăvârșirea oxidării cu aer, peptida (A) oxidată este adsorbită pe 10 g rășină Diaion HP-20 și desorbită și eluată cu CH₃CN 60% (în acid acetic IN); eluatul este concentrat la temperatura camerei, sub presiune redusă, pentru a îndepărta CH₃CN și apoi este liofilizat pentru a da o pulbere. Pulberea se dizolvă într-o mică cantitate de apă și soluția se toarnă într-o coloană cromatografică și se purifică prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), utilizând eluție cu gradient cu CH₃CN pentru a se obține peptida (A) cu un singur pic, cu un randament de 27% (valoare calculată pe baza rășinii-peptidă (A) cu grupări protectoare).

(7)Analiza polipeptidei

Valoarea compoziției de aminoacid cu digestie de leucină aminopeptidază a polipeptidei purificate în operația (6) de mai sus concordă cu valorile calculate ale compoziției pe baza secvențelor de aminoacid din formula I.

Suplimentar, în valoarea greutății moleculare cu FAB-MS, valoarea calculată a (M+H⁺) a fost 2309,786 și pe de altă parte valoarea găsită a fost 2310, 048.

Rotația specifică |a |— a polipeptidei obținute a fost +14,2° (C = 0,3 acid acetic IN).

Rășină aminometilică (1)

Fmoc - DMBHA Acid propionic

Rășină DMBHA

Condensarea aminoacizilor protejați în ordinea cerută în peptidă (2) Fmoc’¹⁷ Arg (mtr) - Rășină DMBHA (3) Fmac¹⁷ Cys (Mbz)'¹⁷ Arg (Mtr) Rășină DMBHA (4) Rășină în care sunt condensați aminoacizii protejați la pozițiile 15 - până la 1 -

Grupări protectoare polipetidă (I) - rășină DMBHA (5) îndepărtarea grupărilor protectoare și a rășinii, și reducere

Polipeptidă - forma redusă (A)

SH SH SH SH i i ii

Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH₂ (6) Ciclizare oxidativă purificatoare (absorbție HP pe rășină, desorbție, cromatografie HPLC)

Polipeptidă (A)

Polipeptidele, conform invenției, reprezentate prin formula generală I, au, asemănător polipeptidelor derivate din racii de Moluce, o capacitate de a se lega la endotoxine, o activitate antibacterială, o capacitate de a hemoliza hemocitele endotoxinsensibilizate și o activitate antivirală și, în mod deosebit, au o bună activitate antivirală împotriva virusurilor imunodeficienței umane (HIV). îndeosebi, aceste polipeptide prezintă o activitate anti-HIV de 10 ori sau mai mare decât aceea a Tachyplesin I, o polipeptidă cunoscută, și unele dintre polipeptide prezintă o activitate de mai multe mii de ori mai mare decât aceea prezentată de Tachyplesin I.

în polipeptidele cunoscute, derivate din racii de Moluce, s-a descoperit, drept caracteristică structurală, că, datorită existenței a 4 resturi Cys la pozițiile 3, 7, 12, acestea iau o structură în formă de fâșie β astfel că părțile din pozițiile 9 și 10 formează o porțiune care se răsucește prin rotire β și partea de peptidă de la poziția 3 la poziția 8 și partea de peptidă de la poziția 11 la poziția 16 se orientează față în față și 4 resturi Cys la pozițiile 3 și 16 și de la pozițiile 7 și 12 se leagă prin cele două legături disulfurice (-S-S-), respective. Drept caracteristici structurale pentru manifestarea unei activități antivirale a polipeptidelor a căror poziție 6 este schimbată cu Lys, pentru compușii din invenție, este absolut necesară existența părților structurale a căror secvențe constitutive de aminoacid sunt extrem de asemănătoare unele cu altele, cum se vede în ³Cys ⁴A2 ⁵A3 ⁶Lys, față în față cu ¹³A2¹⁴A3¹⁵A3 ¹⁶Cys și sunt indispensabile Trp și¹⁷Arg. Este semnificativ că apoi prin legarea unui aminoacid de bază stabilit în At la aceste părți structurale la poziția 1, este realizată o structură astfel încât activitatea anti-HIV manifestată este extrem de înaltă.

Se prepară medicamente sub formă de compoziții farmaceutice conținând polipeptidă reprezentată de formula I sau o sare a acesteia ca ingredient activ și un material de suport acceptabil farmaceutic, selectat în funcție de metoda de administrare a medicamentului. Medicamentul conform invenției este administrat în special oral sau parenteral, în funcție de obiectul tratamentului sau dezinfectarea întro boală virală in vivo sau unei porțiuni de infectare virală in vitro și poate fi preparat sub formă de pulbere, granule, soluție pentru injecție sau pentru administrare orală, tablete, supozitoare, unguente, creme sau aerosoli, utilizând purtători farmaceutici adecvați, funcție de metoda de administrare.

Când medicamentul este administrat direct sub formă de injecție unei ființe, polipeptidă sau sarea sa din prezenta invenție pot fi administrate continuu sau intermitent într-o cantitate de la 5000 mg pe kg greutate corp uman sau pe o zi și prin perfuzie intravenoasă, sub formă de soluție în ser fiziologic.

Activitatea antivirală împotriva virusului imunodeficienței umane

HIV

Activitatea antivirală împotriva HIV, a polipeptidei (A) sintetizată în exemplul 1 a fost testată și evaluată conform următoarei metode.

Celule MT-4 infectate cu HIV (2,5 x 10⁴ celule/eprubetă, multiplicitatea infecției (MOI) : 0,001) sunt adăugate imediat după infectare, împreună cu o substanță test cu diferite schimbări de concentrație la o plăcuță de testare. După incubare la 7°C timp de 5 zile, într-un incubator cu CO₂, este măsurat numărul de celule care supraviețuiesc prin metoda MTT (Pawels et al., J.Virol. Methods,20,(1988),309-321). Activitatea antivirală este exprimată drept concentrație la care afecțiunea celulară datorată infectării cu HIV este inhibată în proporție de 50% (EC 50 : 50% concentrație eficientă). Pe de altă parte, pentru a cunoaște citotoxicitatea substanței de testat asupra celulelor MT:%, sunt incubate celulele neinfectate cu virus, în același mod ca mai sus, împreună cu compusul de testat, cu diferite modificări de concentrație. Citotoxicitatea este exprimată ca concentrație 50%

50, CC 50 și SI pentru polipeptidă A, pentru

Tachyplesin I, o polipeptidă cunoscută având afinitate la endotoxine și pentru azidotimidină, agent anti-HIV, amândouă folosite pentru comparație.

citotoxică (CC 50) în substanța de testat. Suplimentar, raportul brut al Cc 50 față de EC (CC5O/EC5O) este exprimat ca un raport efectiv (SI)/.

în tabelul 2 se prezintă valorile EC 5

Tabelul 2

	Medicament testat	CC 50 (pg/ml)	EC 50 (pg/ml)	SI
Exemplul 1	Polipeptidă (A)	39	0,35	110
Exemplul
comparativ 1	Tachyplesin I	49	18,1	3
Exemplul
comparativ 2	Azidotimidină (AZT)	0,80	0,00048	1700

Așa cum reiese din tabelul de mai sus, 45 polipeptidă A, conform invenției, are o toxicitate întrucâtva mai puternică decât a Tachyplesinei I a cărei activitate anti-HIV a fost prezentată mai înainte, dar prezintă o activitate antivirală la o concentrație de 1/50. 50 în comparație ca azidotimidina, polipeptidă A are o valoare EC 50 de concentrație mai înaltă,dar are CC 50 de 60 ori mai înaltă, indicând citotoxicitate scăzută.

în tabelul 3 se prezintă formulele structurale și proprietățile fizice ale diferitelor polipeptide, conform invenției, preparate în aceleași condiții ca în exemplul 1 și activitatea lor antivirală împotriva HIV, testată și evaluată în același mod ca mai sus.

ο κ> ο

în compușii din exemplul de mai sus, resturile Cys la pozițiile 3, 7, 12 și 16 simt legate prin legături disul- furice între pozițiile 3 și 16 și 5 între pozițiile 7 și 12, cu excepția cazului în care este notat altfel.

în plus, în tabelul 3 AZT desem mnează azidotimidine (nume obișnuit zidovudină,,).

Claims

1. Polipeptidă, caracterizată prin aceea că prezintă formula generală I:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

A₁-Trp-Cys-A₂-A₃-Lys-A₄-A₂-A₃-Gly-A₄-A₄-A₂-A₃-A³-Cys-Arg-A₅ (I) în care A₂ reprezintă un atom de hidrogen sau 10 unul sau două resturi de aminoacid selectat dintre lizină și arginină; A₂ reprezintă, independent, un rest de tirozină, fenilalanină sau sau triptofan; A₃ reprezintă independent un rest de lizină sau arginină; A₄ reprezintă 15 independent un rest de alanină, valină, leucină, izoleucină, serină, cisteină sau metionină; A_sreprezintă -OH (derivat de la gruparea carboxil) sau -NH₂ (derivat de la gruparea amidică a acidului); Cys reprezintă un rest de 20 cisteină, Gly reprezintă un rest de glicină; Lys reprezintă un rest de lizină; Arg reprezintă un rest de arginină și Trp reprezintă un rest de triptofan și resturile de cisteină din pozițiile 3 și 16 pot fi legate prin intermediul unei legături disulfurice -S-S- și când pozițiile 7 și 12 sunt ambele resturi de cisteină, acestea, este posibil să fie legate prin intermediul unei legături disulfurice -S-S- sau o sare a acestora.

2. Polipeptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, împreună cu un material de suport acceptabil farmaceutic formează un agent anti-HIV.