JP2798711B2 - ポリペプチド系抗ウィルス剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、ポリペプチドを有効成分として含有する抗
ウィルス剤に関するものである。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、リポ多糖（以下「LPS」という。）に
親和性を示す新規物質を見出すべく鋭意研究を重ねた結
果、カブトガニ血球から新規ポリペプチドを抽出・単離
するとともに該ポリペプチドの固相合成法による合成に
成功し、更に、該ポリペプチドがLPSに強い親和性を示
すことを見出し、WO89/01492として国際公開を行ってい
る。

本発明者らは、更に、本ポリペプチドの薬理活性につ
いて鋭意研究を重ねた結果、本ポリペプチドが抗ウィル
ス作用を有することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明は、 次式（Ｉ）： （式中、Lysはリジンを、Trpはトリプトファンを、Cys
はシステインを、Pheはフェニルアラニンを、Argはアル
ギニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Glyはグ
リシンを、Ileはイソロイシンを表し;Xは水酸基又はア
ミノ基を表す。） で示されるポリペプチド又はその類縁体を有効成分とし
て含有することを特徴とする抗ウィルス剤に関するもの
である。

本発明に用いる化合物は、アミノ酸17個からなるポリ
ペプチドであり、抽出・単離された状態ではＣ末端アミ
ノ酸であるアルギニンのカルボキシル基はアミド化され
ているが、加水分解により酸となっても、抗ウィルス作
用には特に影響は生じない。

本発明に用いるポリペプチドは、例えば、以下のよう
にしてカブトガニ血球（Tachypleus tridentatus及びTa
chypleus gigas）から抽出・単離することができる。

即ち、カブトガニ血球を低張抽出し、残渣として得ら
れる不溶性画分を酸性条件下、例えば希塩酸、希硝酸、
希硫酸等の鉱産の希酸；酢酸等の低級脂肪酸の存在によ
る強酸性条件下で抽出して、得られた抽出液を常法、例
えばゲルろ過、クロマトグラフィー等の精製手段により
精製することにより、単離することができる。

本発明に用いるポリペプチドは、固相合成法によって
も製造することができる。

即ち、Ｎ−保護アルギニンを、場合によりカルボキシ
ル基と結合しうる官能基とカルボキシル基とを有するス
ペーサーを介して、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合
させた後、 次式： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドの16位から１位までの保護アミ
ノ酸を固相合成法に従って順次結合し、次いで、該不溶
性樹脂及びアミノ酸の保護基を脱離させて、 次式（II）： （式中の記号は前記と同義である。） で示されるポリペプチドを得、その３位と16位、及び７
位と12位のシステインをそれぞれのメルカプト基を介し
て結合させ、ジスルフィド結合を形成させることにより
製造することができる。

前述のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、そのア
ミノ基を介してＮ−保護アルギニンのカルボキシル基又
は場合によりこれに結合しているスペーサーのカルボキ
シル基と結合可能であり、かつ、その後脱離可能なもの
であれば如何なるものでもよい。

かかる不溶性樹脂としては、例えば、アミノメチル樹
脂（アミノメチル化（スチレン−−ジビニルベンゼン共
重合体、ベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベンズヒド
リルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フェノキシメチ
ル樹脂等が挙げられる。ベンズヒドリルアミン樹脂、メ
チルベンズヒドリルアミン樹脂、４−（アミノメチル）
フェノキシメチル樹脂を用いれば開裂によって直接アミ
ドを与えるが、収率の点からはアミノメチル樹脂が好ま
しい。

前述の場合により存在するカルボキシル基と結合しう
る官能基とカルボキシル基とを有するスペーサーとして
は、例えばアルギニンのカルボキシル基をｐ−カルボキ
シメチルベンジルエステルに変換しうるものが挙げられ
るが特に制限はない。

かかるスペーサーと保護アルギニンとが結合した４−
（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニ
ルオキシメチル）フェニル酢酸はJ.P.Tamら（Synthesis
（1979）p.955−957）の方法により調製することができ
る。

保護アミノ酸とは、官能基を公知の方法により保護基
で保護したアミノ酸であり、各種の保護アミノ酸が市販
されている。本発明のポリペプチドを合成する場合に
は、以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好まし
い。まず、アミノ酸のα−アミノ酸の保護基はBoc（ｔ
−ブチルオキシカルボニル）又はFmoc（９−フルオレニ
ルメチルオキシカルボニル）である。Argのグアニジノ
基の保護基は、Tos（トシル）、NO₂（ニトロ）、Mtr
（４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニ
ル）である。Cysのメルカプト基の保護基としてはBzl
（ベンジル）、Ｍ・Bzl（４−メトキシベンジル）、４
−MeBzl（４−メチルベンジル）、Acm（アセトアミドメ
チル）、Trt（トリチル）、Npys（３−ニトロピリジン
スルフェニル）、ｔ−Bu（ｔ−ブチル）、ｔ−BuS（ｔ
−ブチルメルカプト）が挙げられるが、４−MeBzl、Ac
m、Npysが好ましい。Tryの水酸基の保護基は、Bzl、Cl₂
・Bzl（2,6−ジクロロベンジル）、ｔ−Buであるか、あ
るいは保護しなくてもよい。Lysのε−アミノ基の保護
基は、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、Cl・Ｚ（２−
クロロベンジルオキシカルボニル）、Boc、Npysであ
る。各保護基は、ペプチドの合成条件に応じ適切なもの
を選択する必要がある。

保護アミノ酸の結合は、通常の縮合法、例えば、DCC
（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、活性エステル
法、混合あるいは対称酸無水物法、カルボニルジイミダ
ゾール法、DCC−HOBt（１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール）法、ジフェニルホスホリルアジド法等に従って行
なうことができるが、DCC法、DCC−HOBt法、対称酸無水
物法が好ましい。これらの縮合反応は、通常、ジクロロ
メタン、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒又はそれら
の混合溶媒中で行なわれる。α−アミノ基の保護基の脱
離試薬としては、トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、
HCl/ジオキサン、ピペリジン／ジメチルホルムアミド等
が用いられ、該保護基の種類により適宜選択する。ま
た、合成の各段階における縮合反応の信号の程度はE.カ
イザーらの方法［Anal.Biochem.,34,595（1970）］（ニ
ンヒドリン反応法）によって検査される。

以上のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護
ペプチド樹脂を得ることができる。

不溶性樹脂としてアミノメチル樹脂を用いた場合に
は、例えば適当な溶媒中においてアンモニアで処理する
ことにより該樹脂を脱離させることができる。次いでフ
ッ化水素で処理することにより、前記式（II）で示され
る、全ての保護基が脱離したポリペプチドが得られる。
不溶性樹脂としてベンズヒドリルアミン樹脂、メチルベ
ンズヒドリルアミン樹脂、４−（アミノメチル）フェノ
キシメチル樹脂を用いた場合には、フッ化水素で処理す
ることにより、該樹脂及び保護基を同時に脱離させるこ
とができる。

次いで、好ましくは、２−メルカプトエタノール等で
還元することによりシステインのメルカプト基が還元型
となっていることを確実ならしめた後、酸化処理するこ
とにより目的とする環状ポリペプチド（Ｉ）をアミドと
して得ることができる。

この際の酸化処理は、公知の方法を用いることがで
き、通常、大気中の酸素やフェリシアン酸塩（例えば、
フェリシアン化カリウム）のような酸化剤を用いる。

かくして得られたポリペプチドは、ポリペプチドの常
套的手段、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフ
ィー（ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着、逆相）、電
気泳動、向流分配等により単離精製することができる
が、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が最も
効果的である。

このようにして得られる前記式（Ｉ）で示されるポリ
ペプチドは、水疱性口内炎ウィルス（Vesicular Stomat
itis Virus）、インフルエンザウィルス、ヒト免疫不全
ウィスル（humanimmunodeficiency virus;HIV）等の種
々のウィルスに体し、不活化作用を示し、抗ウィルス剤
として広く適用することができる。

（発明の実施例） 以下、調製例及び実施例により本発明を更に詳細に説
明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するもので
はない。

調製例１ A.ポリペプチドの抽出・精製 カブトガニ（Tachypleus tridentatus）血球約50gに2
0mMトリス塩酸/50mM塩化ナトリウム/pH8.0緩衝液150ml
を加え、高速ホモナイザー（ヒスコトロン ；日本精密
工業（株）製）で３分間ホモゲナイズした後、遠心（80
00rpm,30分間,4℃）により上清と沈澱物に分画した。沈
澱画分について、前記操作を２回繰り返し、血球内の可
溶性成分を充分に抽出した後、不溶性画分（沈澱物）を
得た。

不溶性画物に20mM塩酸150mlを加え、高速ホモゲナイ
ザーで３分間ホモゲナイズし、遠心後、塩酸抽出液の上
清を得た。この操作を計３回繰り返し、全量約400mlの
抽出液を得た。この上清画分を凍結乾燥により濃縮乾固
した。

濃縮乾固した塩酸抽出物は20mM塩酸で再溶解した後、
セファデックスＧ−50（3.0×90.0cm）カラム（20mM塩
酸で予め平衡化）に添加してゲルろ過を行った。LPS
（E.coli 0111:B4株由来のものを使用）によるＣ因子
（カブトガニ血液凝固セリンプロテアーゼ前駆体；本発
明者らが名付けたLPS感受性因子,Nakamura,et al.,Eur.
J.Biochem.,154,511（1986））の活性化を阻害する溶出
画分を集め、プールした画分のpHを水酸化ナトリウム水
溶液で6.0に合わせた。

サンプルを予め20mM酢酸緩衝液（pH6.0）で平衡化し
たCM−セファロースCL−6Bカラムにかけ、溶出を０〜0.
3M塩化ナトリウムを含む20mM酢酸緩衝液（pH6.0）のグ
ラジエントで行った。Ｃ因子活性化阻害画分を集め、LP
S結合物質の最終精製標品（本発明に用いるポリペプチ
ド）とした。収量は、血球約50gから約30mgであった。

B.純度検定 （１）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法 LPS結合ポリペプチドを還元剤（β−メルカプトエタ
ノール）の不存在下又は存在下に、8M尿素を含む12％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（Weber−Osborn系）を
行い、クーマシーブリリアントブルー（Coomassie Bril
liant Blue）Ｒ−250で染色したところ、共に分子量約2
000の単一バンドを示した。結果を第１図に示す。第１
図において、左側のバンドは、還元剤の不存在下におけ
るバンドを、中央のバンドは、還元剤の存在下における
バンドを、右側のバンドは、標準蛋白質［SDS・PAGE Ma
rker III,Fluka AG（スイス）］によるミオグロビン（1
6.9kDa）、ミオグロビンＩ＋II（14.4kDa）、ミオグロ
ビンＩ（8.2kDa）、ミオグロビンII（6.2kDa）、ミオグ
ロビンIII（2.5kDa）のバンドを示す。

（２）逆相高速液体クロマトグラフィー 本発明に用いるポリペプチドを逆相高速液体クロマト
グラフィー（カラムはCosmosil 5C₁₈P、ペプチドの溶出
は0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル０〜98％の
グラジエント系を使用）で分析したところ、単一ピーク
を示した。

C.アミノ酸組成値 サンプルを110℃で24、48、72時間5.7M塩酸で加水分
解した後、日立835自動アミノ酸分析計で分析した。半
シスチンについては、サンプルを過ギ酸酸化後、110℃
で24時間5.7M塩酸で加水分解し、またトリプトファンに
ついては、サンプルを3Mメルカプトエタンスルホン酸で
110℃で24時間加水分解した後、それぞれアミノ酸分析
計で分析した。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で得た分子量から、このペプチドは17個のアミノ酸から
構成される単純塩基性ポリペプチドであることが判明し
た。アミノ酸分析の結果を表１に示す。

D.アミノ酸配列の決定とＣ端末アルギニンアミドの同定 アミノ酸配列は、インタクトな標品約23μｇを用い、
アミノ末端よりベックマン（Beckman）890Dシークエン
サーを用いて、15残基（半シスチンを除く）まで同定で
きた。また、還元アルキル化したサンプル（本発明に用
いるポリペプチドをM.A.Hermodson,et al.,Biochemistr
y,12,3146（1973）の方法によりＳ−ピリジルエチル化
したもの）約36μｇを用い、16残基（半シスチンを含め
て）まで同定できた。残る17番目のアミノ酸残基（Ｃ末
端残基）はアミノ酸分析値よりアルギニンであると推定
できた。しかし、Ｃ末端アルギニンは、インタクトな標
品、ピリジルエチル化した標品を用い、カルボキシペプ
チダーゼ（以下「CPase」という）Ｙ及びＢで消化して
も全く検出できなかった。そこで、一旦、サンプルを30
mM塩酸で110℃で10時間緩和な条件で加水分解した後、
再度CPaseBで処理した。その結果、本発明のポリペプチ
ド１モル当りアルギニン約0.5モルの遊離が認められ、
Ｃ末端アルギニンのカルボキシル基は、アミド化されて
いる可能性が強いものと判断した。このアミド化合物の
理論分子量（計算値MW＝2264）と質量分析による実測値
とが完全に一致したことにより、Ｃ末端アルギニンのカ
ルボキシル基はアミド化されていることが確認された。

E.ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の同定 本発明に用いるポリペプチド内に４個の半シスチンが
同定されたが、これらは全てジスルフィド結合している
ことが、還元剤（ジチオスライトール）の存在下又は不
存在下におけるＳ−ピリジルエチル化の比較実験より明
らかになった。そこで、ジスルフィド結合の位置を同定
するため、インタクトな標品をジスルフィド結合の交換
反応が起こらない条件下（酸性条件下、pH6.5）でトリ
プシン消化を行い、消化物を前述の逆相高速液体クロマ
トグラフィー（カラムはCosmosil5C₁₈P、ペプチドの溶
出は0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル系を使
用）にて分離した。得られたペプチドのアミノ酸組成を
調べたところ、アミノ末端から３番目と16番目、７番目
と12番目がジスルフィド結合していることが判明した。

F.ポリペプチドのLPS結合活性 本発明に用いるポリペプチドは、0.1μg/mlのLPS（E.
coli 0111:B4株由来のものを使用）によるＣ因子の活性
化（「因子」と表す）を0.05μＭ（0.12μg/ml）で50
％、１μＭ（2.3μg/ml）で完全に阻害した。また、本
発明に用いるポリペプチドは、１％アガロースゲルを用
いた二重拡散テストにおいて、LPSと高分子複合体を形
成し、沈降線を形成することが観察された。

LPSによるＣ因子の活性化に対する本発明に用いるポ
リペプチドの阻害効果についての試験結果を第２図及び
第３図に示す。第２図及び第３図は、それぞれ塩化、ナ
トリウム不存在下及び存在下（1M）における結果を示
す。対照として、本発明者らにより始めて明らかになっ
たLPSと電気的に結合する性質を示す高分子量塩基性物
質、ポリリジンを用いた。第２図及び第３図において、
（○）印及び（●）印は、それぞれ本発明に用いるポリ
ペプチド及びポリリジンの結果を表す。

これらの結果より、本発明に用いるポリペプチドは、
LPSと単なる電気的な結合ではなく、塩濃度に影響を受
けない強い親和性を有することが判る。

G.吸光度の測定 本発明に用いるポリペプチド99.2μg/ml水溶液の紫外
部吸収スペクトルを第４図に示す。276nmに吸収ピーク
をもつ。280nmにおける吸光度は0.3842であるので、１
％水溶液の280nmにおける吸光度は、38.7と算出され
る。

調製例２ A.アミノメチル樹脂へのアルギニンの導入 （１）４−（ブロモメチル）フェニル酢酸フェナシルエ
ステルの合成 室温下、アセトニトリル75ml中にα−ブロモアセトフ
ェノン3.98g（20mmol）及びフッ化カリウム3.49g（60mm
ol）を懸濁させ、撹拌下、４−（ブロモメチル）フェニ
ル酢酸4.58g（20mmol）を６等分し30分間隔で添加し、
２時間撹拌を継続した。反応終了後、不溶物をろ別し、
ろ液から溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルに再溶解し、
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、蒸留水、クエン
酸、蒸留水で各１回洗浄し、硫酸ナトリウムを乾燥し
た。酢酸エチルを留去し、石油エーテルから結晶化し、
5.5gの目的物（融点84〜85℃）を得た。これを再結晶し
て融点85〜86℃の結晶5.2g（収率75％）を得た。

（２）４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ
−アルギニルオキシメチル）フェニル酢酸の合成 ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニ
ン4.71g（11mmol）、４−（ブロモメチル）フェニル酢
酸フェナシルエステル3.47g（10mmol）、フッ化カリウ
ム1.28g（22mmol）、水0.8ml（44mmol）、アセトニトリ
ル50ml及びジメチルホルムアミド10mlの混合物を室温下
24時間激しく撹拌した。生成する不溶物を自然ろ過し、
ろ液をエバポレートにより15〜20mlまで濃縮した。酢酸
エチル80mlを添加した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液で２回、蒸留水で１回、飽和クエン酸水溶液で２回、
蒸留水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒
を留去し、残渣を石油エーテルで処理して、半固形状の
４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アル
ギニルオキシメチル）フェニル酢酸フェナシルエステル
を得た。

これを酢酸105mlに溶解し、水19ml及び亜鉛13.1gを加
え、室温下5.5時間激しく撹拌した。亜鉛をハイフロス
ーパーセル及び酢酸エチルを用いてろ別し、ろ液に酢酸
エチル400ml及び水300mlを加え、酢酸エチル層を分離
し、10回水洗し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去
し、残渣を石油エーテル中で摩細し、４−（ｔ−ブトキ
シカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−アルギニルオキシメチ
ル）フェニル酢酸4.77gを得た。本物質は薄層クロマト
グラフィーにより１スポットのほぼ純品として得られ
た。

（３）４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ
−アルギニルオキシメチル）フェニルアセトアミドメチ
ル樹脂の合成 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−ア
ルギニルオキシメチル）フェニル酢酸577mg（1.0mmo
l）、アミノメチル樹脂（株式会社ペプチド研究所販
売、１％架橋）2.00g及びDCC206mg（1.0mmol）をジクロ
ロメタン中で常法によりカップリングさせ、樹脂1g当り
0.284mmolのカップリングが確認された。

B.16位システインの導入 ４−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｇ−トシル−Ｌ−ア
ルギニルオキシメチル）フェニルアセトアミドメチル樹
脂1.0g（0.284mmol Arg（Tos）/g樹脂）をジクロロメタ
ン25mlで４回、各１分洗浄し、ろ過した。この樹脂に30
％トリフルオロ酢酸溶液（溶媒：ジクロロメタン）25ml
を添加し、30分撹拌し、Boc基を脱離させた。得られた
樹脂を下記の溶媒各25mlで順次処理し、各々の処理 後にろ過した。

ジクロロメタン （１回、１分） ジオキサン （１回、１分） ジクロロメタン （１回、１分） ジオキサン （１回、１分） ジクロロメタン （２回、各２分） 10％トリエチルアミン（ジクロロメタン溶液） （１
回、２分）、（１回、５分） ジクロロメタン （４回、各１分） 次いで、前記樹脂をジクロロメタン25ml、及び総アル
ギニン量に対して3.5当量の保護アミノ酸、即ち、Boc−
Cys（４−MeBzl）310mg（0.994mmol）とともに１分撹拌
した。DCC205mg（0.994mmol）のジクロロメタン溶液25m
lを加え、２時間撹拌した。得られた樹脂を下記の溶媒
各25mlで順次処理し、各々の処理後にろ過した。

ジクロロメタン （１回、１分） イソプロパノール （１回、１分） ジクロロメタン （１回、１分） イソプロパノール （１回、１分） ジクロロメタン （３回、各１分） C.15〜１位のアミノ酸の導入 Ｂと同様にして、先に得られた樹脂に、前記式（II）
で示されるポリペプチドの15位から１位までの各構成ア
ミノ酸に対応する保護アミノ酸を順次カップリングし
た。表２に各反応段階で用いた保護アミノ酸を示す。保
護アミノ酸の使用量は全て総アルギニン量に対して3.5
当量である。

なお、Boc−Arg（Tos）のカップリングはDCC−HOBt法
によりDCCに対しHOBtを２倍モル使用で行った。

１位アミノ酸の導入後、樹脂ペプチドをジクロロメタ
ンを用いてグラスフィルターに回収し、減圧乾燥して、
乾燥樹脂ペプチド1.781gを得た。

D.樹脂の脱離 Ｃで得られた乾燥樹脂ペプチドをメタノール及びジメ
チルホルムアミド中においてアンモニア（無水）で処理
することにより樹脂を脱離させて、 次式： で示される保護ポリペプチド0.765g（0.196mmol）を得
た。

分子量:3904 e.保護基の脱離 Ｄで得られた保護ポリペプチドをアニソール中におい
てエタンジチオールの存在下フッ化水素で処理し、次い
で塩酸で処理することにより、 次式： で示されるポリペプチド塩酸塩470mg（0.186mmol）を得
た。

分子量:2523 F.ポリペプチドの環化 Ｅで得られたポリペプチド塩酸塩30mgを、200倍モル
過剰の２−メルカプトエタノールを含む0.1M Tris−HCl
（pH8.5）中において一夜室温で放置した。次いで、１
％酢酸で平衡化したセファデックスＧ−10カラムで処理
してポリペプチド含有画分を得た。水で10倍に希釈し
（0.1mg/ml）、0.5MNaOHでpHを8.5に調整し、室温で30
時間放置した後、凍結乾燥した。次いで、１％酢酸で平
衡化したセファデックスＧ−10カラムで処理して酸化型
ポリペプチド8.5mgを得た。

これを逆相高速液体クロマトグラフィー（カラムはTS
K−ゲル ODS−120T（0.46×25cm）、ペプチドの溶出は
0.01Mギ酸−トリエチルアミン（pH4.5）（Ａ）−A20％
含有アセトニトリル（Ｂ）を使用）で分析したところ、
調整例１で得られた天然のポリペプチドのピークと一致
し、更に両者を混合したものは該ピークが２倍になり、
両者は同一物と認められた。

実施例 １ 水疱性口内炎ウィルス及びインフルエンザウィルスに
対する抗ウィルス作用 1.材料及び方法 （１）ウィルス及び使用細胞 水疱性口内炎ウィルス（Vesicular Stomatitis Viru
s）（New Jersey株）（以下「VSV」という。）は、サル
腎由来のVero細胞で増殖させた。インフルエンザウィル
ス（A/Yamagata/120/86,H1N1）は、イヌ腎由来のMadin
−Darby caninekidney細胞で増殖させた後、培養液中の
トリプシン（10μg/ml）を除去するために２回超遠心
（24,000rpm,90分）して洗浄し使用した。

（２）ポリペプチドとウィルスとの反応 リン酸緩衝食塩水（以下「PBS」という。）で希釈し
た一定濃度の調製例１で得られたポリペプチド（以下
「LBP」という。）（20μｌ）とウィルス液（20μｌ）
とを混合し、37℃、５％CO₂孵卵機にて60分又は120分反
応させた後、ウィルスを定量した。対照としてLBPの代
わりにPBSを使用した。LBPとトリプシンとの反応ではそ
れぞれ最終濃度が125μg/ml、10μg/mlとなるように調
整した。

（３）ウィルスの定量 LBPとウィルスを反応させた後のウィルスの定量は、
混合液を量少必須培地（minimumessential medium）
（以下「MEM」という。）で10段階希釈した後、50％tis
sue culture infective dose（以下「TCID₅₀」とい
う。）又はプラーク形成単位（plaque−forming unit）
（以下「PFU」という。）にて測定した。

まず、TCID₅₀法では10段階希釈したウィルス液の0.1m
lずつを、予め96穴マイクロプレートに培養していた単
層細胞の４穴に接種して、２〜３日培養した後、細胞変
性効果（CPE）の有無を顕微鏡下にて調べ、Reed＆Muenc
hの方法にて計算した。PFU法では直径60mmのプラスチッ
クシャーレの単層培養した細胞に10段階希釈したウィル
ス液を0.1ml接種し、ウィルスを細胞に吸着させるため
に37℃、CO₂孵卵機にて60分静置し、0.6％寒天を含んだ
MEM培地5mlを細胞に重層した後、37℃、CO₂孵卵機にて
培養した。プラーク数の計算はウィルスの種類によって
１〜３日培養後に行った、インフルエンザウィルス定量
の赤血球疑集素（Hemagglutinin）（以下「HA」とい
う。）の測定は、ウィルス−LBP反応液を２段階希釈
し、その50μｌと0.5％ニワトリ赤血球の50μｌを96穴
Ｕ型マイクロプレートに入れ、混合した後、４℃、60分
の後、最高希釈倍数の凝集によりウィルス数を調べた。

2.結果 （１）高濃度VSVの不活化 VSV約２×10⁶PFU/0.1mlのもの15μｌとLBP（０〜250
μg/ml）15μｌを37℃、60分保温後、10^-2〜10^-8まで段
階希釈し、その0.1mlをVero細胞に接種し、４日目にTCI
D₅₀、PFUを測定した結果を第５図に示す。

第５図から、LBPは濃度依存的にVSVを不活化すること
がわかる。

（２）表３に本発明の抗ウィルス剤のVSV及びインフル
エンザウィルスに対する効果を検討した結果を示す。

表３から、LBPはVSV及びインフルエンザウィルスを不
活化することがわかる。

実施例 ２ ヒト免疫不全ウィルス（HIV）に対する抗ウィルス作用 1.材料及び方法 （１）ウィルス及び使用細胞 Ｔ細胞株で継代培養されているHIV株としてLAV株（大
阪府立公衆衛生研究所）を用い、LAV株に特続感染して
いるTALL−1/LAVあるいはMOLT−4/LAV細胞が培養液中に
産生するウィルスを原液として使用した。

尚、株化されたＴ細胞系は、成人Ｔ細胞白血病（adul
t T cell leukemia,ATL）の原因ウィルスである、HTLV
−１に持続感染しているMT−４細胞の他に、Ｔ細胞性の
白血病細胞由来の細胞株であるTALL−1,MOLT−４細胞と
それぞれのHIV持続感染細胞であるTALL−1/HIV,MOLT−4
/HIV及びMOLT−4/HTLV−IIIを用いた。それら細胞は、1
0％の牛胎児血清（FCS）とペニシリン（100μ/ml）とス
レトプトマイシン（100μg/ml）を含むRPMI−1640培養
液（Flow社、英国）を用いて５％の炭酸ガスの存在下37
℃で培養した。

（２）HIV増殖抑制効果 本ペプチドのHIVに対する増殖抑制作用を次の（イ）
原理に基づき（ロ）の方法に従い実施判定した。

（イ）原理 ヒトＴ細胞白血病の原因ウィルスであるHTLV−１（AT
LV）が持続感染しているＴ細胞株であるMT−４細胞に、
HIVを感染させると急速にHIVが増殖し、MT−４細胞は細
胞障害の為に５〜６日で死滅することが知られている。
従って、MT−４細胞の細胞障害をマーカーとして薬剤の
抗HIV効果を判定することが出来る。

（ロ）方法 MT−４細胞にHIV（LAV株）を0.001TCID₅₀/cellとなる
ように37℃で１時間感染させた後洗浄し、種々の濃度の
薬剤（調製例２で得られた本発明のポリペプチドをRPMI
−1640培養液に無菌的に溶解準備した）を含むRPMI−16
40メジウム（牛胎児血清を10％含む）に１×10⁵cell/ml
の濃度で浮遊させた。この細胞浮遊液を24穴のカルチャ
ープレートに1ml/ウェル量入れ、37℃、５％CO₂存在下
で５日間培養した。またHIV非感染MT−４細胞も同様に
薬剤と共に培養した。培養後、ウィルス増殖による細胞
障害効果（CPE）の観察を行ない、MT−４細胞の生存数
をトリパンブルー染色法によりカウントした。検体のHI
V増殖抑制作用は下の式から算出される細胞障害抑制率
（％）を指標として評価した。

（３）巨細胞形成抑制効果 本ペプチドの巨細胞形成抑制作用を次の（イ）原理に
基づき（ロ）の方法に従い実施し、その抗HIV作用を判
定した。

（イ）原理 MOLT−４細胞とHIVに持続感染しているMOLT−4/HIV細
胞を混合すると１〜２日間で巨細胞が形成される。この
現象は、MOLT−４細胞表面のCD4レセプターとMOLT−4/H
IV細胞表面に発現されているHIVのエンベロープ蛋白で
あるgp120が結合して起こるものと考えられている。こ
の実験では薬剤がHIVとCD4分子の結合（HIVのリンパ球
への吸着）を抑制する効果を見ることができる。

（ロ）方法 MOLT−４細胞とHIVに持続感染しているMOLT−4/HTLV
−III細胞を種々の濃度の薬剤（調製例２で得られた本
発明のポリペプチドをRPMI−1640培養液に無菌的に溶解
準備した）を含むRPM−1640メジウム（牛胎児血清を10
％含む）中で1:1の割合で混合し（細胞濃度は５×10⁵ce
ll/ml）、24穴のカルチャープレートにウェルに1mlづつ
入れ24時間培養した。培養後鏡検にて巨細胞形成の有無
を観察した。

2.結果 （１）本化合物のHIV増殖抑制作用 本化合物の各濃度における細胞障害抑制率を表４に示
す。

表４から判るとおり、本化合物は7.5μg/ml〜15μg/m
l濃度で80％以上の細胞障害抑制率を示し、HIVの増殖を
強く抑制した。

（２）本化合物の巨細胞形成抑制作用 本化合物は7.5μg/ml以上の濃度で巨細胞形成を100％
抑制し、HIVのリンパ球への吸着（結合）を抑制する効
果を持つことが示唆される。

［発明の効果］ 本発明によれば、新規なポリペプチド系抗ウィルス剤
を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、LBPのSDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動
の結果を示す図である。第２図及び第３図は、LPSによ
るＣ因子の活性化に対するLBPの阻害効果についての試
験結果を示す図である。第４図は、LBPの紫外部吸収ス
ペクトルである。第５図は、LBPによるVSVの不活化を示
す図である。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/00,38/10 C07K 7/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式： （式中、Lysはリジンを、Trpはトリプトファンを、Cys
   はシステインを、Pheはフェニルアラニンを、Argはアル
   ギニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Glyはグ
   リシンを、Ileはイソロイシンを表し;Xは水酸基又はア
   ミノ基を表す。） で示されるポリペプチドを有効成分として含有すること
   を特徴とする抗ウィルス剤。