BG60621B1

BG60621B1 - Нов полипептид и анти-hiv лекарство, получено от него

Info

Publication number: BG60621B1
Application number: BG96323A
Authority: BG
Inventors: Nobutaka Fujii; Naoki Yamamoto
Original assignee: Seikagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1992-05-11
Publication date: 1995-10-31
Also published as: EP0502198A1; FI922044A; DE69115878T2; EP0502198B1; BG96323A; NO921829L; JP3178835B2; CA2068327A1; DK0502198T3; DE69115878D1; HUT61579A; ATE132163T1; HU9201540D0; CZ280870B6; RO109653B1; WO1992004374A1; CS139492A3; GR3018879T3; FI922044A0; US5571892A

Abstract

Изобретението се отнася до полипептид с обща формула A1-Trp-Cys-A2-A3-Lys-A4-A2-A3-Gly-A4-A4-A2-A3-AJ-Cys-Arg-AJ или негова сол и до анти HIV вещество, съдържащо го като активен компонент. Полипептидът е с антивирусна активност срещу вируса на имунната недостатъчност (HIV), неговата сол е подходяща за фармацевтични цели, а анти HIV веществото го съдържа като активен компонент.

Description

Изобретението се отнася до нов полипептид или негова сол и по-специално, до полипептид, проявяващ силен афинитет към липополизахариди, като ендотоксини, имащ повишени антибактериална и антивирусна активност, до фармацевтично приемлива негова сол и анти-HIV (HIV “ човешки имунодефицитен вирус) вещество, съдържащо полипептида като ефективна съставка.

НИВО НА ТЕХНИКАТА

Известни са полипептиди [1,8] (тахиплезин и полифемузин), проявяващи афинитет към ендотоксини и получени от раци от сем. Xiphosura.

Известно е също, че полипептидите с афинитет към ендотоксини, изолирани от раци от сем .Xiphosura (род Tachypleus, род Lumulus u rog Carcinoscorpius) имат 5 структурни аналога според последните познания на изследователите, и всеки от тях е полипептид с циклична структура, която обхваща 17 или 18 естествени аминокиселини. Освен това полипептидите взаимно проявяват аналогични свойст10 ва и са интересни като ключови веще-ства, чрез които подковообразният рак се адаптира към промените в жизнената му среда и запазва вида си от древни времена до днешно време като живеещ фосил.

С оглед поддържане състоянието на болните са необходими лекарства с профилактичен или терапевтичен ефект спрямо синдрома на придобитата имунна недостатъчност (СПИН), причиняван от вируса на човешка имунна недостатъчност (HIV).

Изобретението се отнася към описаните по-горе ендотоксин-афинитетни полипептиди, за които се предполага, че имат отношение към силната защита на видовете раци от сем.Х1phosura. Направено е проучване на зависимостта между структурни промени на тези вещества и антивирусната активност на HIV. В резултат са установени нови полипептиди с основни различия от общата структура на известните ендотоксин-афинитетни полипептиди на подковообразните раци, които имат отличен ефект, като степента на тяхната анти-HIV активност е 10 пъти по-голяма от тази на известния ендотоксин-афинитетен полипептид.

Изобретението се отнася до нови полипептиди, представени с формулата:

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

А, - Trp - Cys - А₂ - Aj - Lys - А₄ - Aj - А₃ - Gly -А₄-А₄-А₂-А₃-А₃ - Cys - Arg - A_r...I където Aj означава водороден атом или един или два амино киселинни остатъка, избрани от лизин и аргинин; А₂ е независимо тирозинов, фенилаланинов, или триптофанов остатък; Aj е аргининов или лизинов остатък; А₄ е независимо аланинов, валинов, левцинов, изолевцинов, серинов цистеинов или метионинов остатък; А₅ е ОН (произхождащо от карбоксил ната група) или NH₂ (произхождащо от киселинно-амидната група); Cys е цистеинов остатък; Gly е глицинов остатък; Lys е лизинов остатък; Arg е аргининов остатък и Тгр означава триптофанов остатък и цистеиновите остатъци в позициите 3-та и 16-та може да са свързани с дисулфидна връзка (-S-S-), а когато 7-ма и 12-та позиции са и двете цистеинови остатъците, може да бъдат свързани чрез дисулфидна връзка (-S-S-) или нейна сол.

Новият полипептид съгласно изобрете нието произхожда от раци от сем. Xiphosura, аминокиселинният му остатък в 6-та позиция най-общо е валин (val), 6-та позиция е лизинов (Lys), основният аминокиселинен остатък е с различни от валиновия остатък свойства.

Новият полипептид съгласно изобретението може да се получи по известния твърдофазов синтетичен метод.

Полипептидът с права верига с формула (I) може да се получи чрез свързване на карбоксилната група на N-защитен аргинин към неразтворима смола с аминогрупи, директно или в някои случаи чрез разделител, с функционална група, способна да се свърже към карбоксилна група и една карбоксилна група, успешно свързваща се според твърдофазовия синтетичен метод. Съответните защитени аминокиселини от 16-та позиция до 1-ва позиция на аминокиселинната последователност, пред2 ставена чрез следната формула (1):

2 3 4 5 6 7 8

А₍- Trp - Cys - Aj - А₃ - Lys - А₄ - А₂ където А_р Aj, А₃, А₄, Cys, Gly, Lys, Arg и Trp са както е посочено в горната формула I. Следва елиминиране (отстраняване) на неразтворената смола и защитните групи от аминокиселини. В този случай, карбокси краят на аминокиселинния - остатък в 17-та позиция може да е или свободен (А₅ отговаря на ОН), или превърнат в кисел амид (А₃ отговаря на -NH₂). Полученият полипептид, двата цистеина в 3та и 16-та позиция може да оформят дисулфидна връзка (-S-S-) чрез меркаптогрупата.

Когато 7-ма и 12-та позиция са цистеинови остатъци, те може да оформят по подобен начин дисулфидна връзка.

И двете двойки цистеинови групи може да се превърнат в дисулфидна връзка, например чрез окисляване на въздуха, или всяка дисулфидна връзка може да се оформи според метода, описан в /9/, а именно чрез етапи на предварителна селективна защита на меркаптогрупите на всяка двойка цистеини в 3-та и 17-та позиция, и 7-та и 12-та позиция със защитна група, t-Bus (t-бутилтио) и меркаптогрупите на другата двойка цистеини със защитна група, АСш (ацетамидометил); премахване защитата t-Bus, частично окисляване на меркаптогрупите, и следващо премахване защитата Аст.

Аминокиселините, използвани в твърдофазния синтетичен метод, са общоизвестните L-форми или D-форми.

Неразтворимите смоли с аминогрупа, необходими при синтезирането на новия полипептид, трябва да се свързват чрез аминогрупите си към карбоксилната група на N-защитения аргинин в С-края или в някои случай към карбоксилната група на разделителя, свързан към това и след това елиминиран (отстранен) . Примери за такива неразтворими смоли са аминометил (аминометилирани стирен-дивинилбензол кополимери), бензхидриламин, метилбензхидриламин и аминометилфеноксиметил и техните производни и други. Когато се използва бензхидриламинова, метилбензихидриламинова, диметоксибензихидриламинова (ДМВНА) или аминометилфеноксиметилова

11 12 13 14 15 16 17 18

Gly - А₄ - А₄ - А₂ - А₃ - А₃ - Cys - Arg - Α_ρ...(Ι) смола, се получава директно чрез разцепване на един амид. С оглед на добива, се предпочита метилова смола.

Като разделител с функционална група, способен да се свързва към карбоксилна група и към една карбоксилна група, тогава може, например, да се спомене една такава пригодна да превърне карбоксилната група на аргинин в р-карбоксиметилбензилов естер, обаче няма специални ограничения за разделителя.

Защитената аминокиселина има функционални групи, защитени със защитна група по познат метод, а на пазара се продават различни такива защитени аминокиселини.

При синтезиране на полипептида съгласно изобретението, за предпочитане да се избере една от следващите защитни групи. Една защитна група за α-аминогрупа на аминокиселина е В ос (t-бутилоксикарбонил) или Ртос (9-флуоренилметилоксикарбонил). Една защитна група за гуанидиногрупата на аргинин (Arg) е Tos (тосил), N0₂ (нитрол, Mtz (4-метокси-2,3,6-триметил бензолсулфонил) или Ртс (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сулфонил). Като защитна група за меркаптогрупата на цистеин (Cys) може да се използва Bzl (бензил), MBzl (4-метоксибензил), 4-MeBzl (4-метилбензил), Аст (ацетамидометил), Trt (тритил), Npys (З-нитро-2-пиридин-сулфенил), t-Bu(tбутил) или t-BuS (t-бутилтио) и MBzl, 4-MeBzl, Trt, Аст и Npys. Защитна група за тирозина (Tyr) е Bzl, C_QBzl (2,6-дихлоробензил) или tBu, обаче групата може да не бъде защитена. Защитна група за ε -аминогрупа на лизин (Lys) е Z (бензоилоксикарбонил, Clz (2-хлоробензилоксикарбонил), Вос или Npys. За предпочитане е да се подбира за всяка защитна група една собствена и една известна, подходяща за синтетичните условия за пептида.

Защитните аминокиселини се свързват чрез кондензационния метод, например съгласно DCC (дициклохексилкарбодиимидния), DIPCDI (диизопропилкарбодиимид) /10/, метода с активен естер, смесения или симетричния кисел анхидриден метод, карбонилдиимидозолния метод. DCC-HOBt (1-хидроксибен3 зотриазолния метод /11/ или дифенилфосфорил киселия метод. Предпочитат се DCC-HOBt, DI PCDI-HOBt и симетричният кисело-анхидриден метод. Реакциите на кондензация се извършват обикновено в органичен разтворител като дихлорметан или диметилформамид или смес разтворител от тях. Като деблокиращо вещество за защитната група за а -аминогрупата се използва трифлуорооцетна киселина, солна киселина/ диоксан, пиперидин-диметилформамид или подобни, които се избират според вида на защитната им група. Освен това степента на напредване на кондензирането при всеки етап на реакцията за синтез се следи по нинхидриновата реакция.

Според описаните начини, може да се получи защитна пептидна смола с желаната аминокиселинна последователност.

Когато производно на амонометилова смола се използва като неразтворима, последната може да се отстрани, например чрез третиране на защитната пептидна смола с амоняк в подходящ разтворител. Полученият защитен пептид се обработва с флуороводород за получаване на полипептиден амид, представен чрез горната формула, и освобождаване от всички защитни групи. Когато неразтворимата смола е бензхидриламинова, метилбензихидриламинова, аминометилфеноксиметилова или DMBHA смола /13/ и защитните групи могат едновременно да се отстранят чрез обработване на защитената пептидна смола с флуороводород, TFMSA (трифлуорометансулфонова киселина) /14/, TMSOTf (триметилсилил трифлат) /15/ или TMSBr (триметилсилил бромид) /16/.

По желание, полученият полипептид се редуцира с 2-меркаптоетанол, DTT (дитиотреитол) или подобни за сигурно превръщане 5 на меркаптогрупите на цистеина в редуцирана форма.

Следва окисляване до получаването на цикличен полипептид съгласно изобретението.

Окисляването може да се извърши по 10 известен метод. Обикновено се използва окисляващо вещество като кислорода във въздуха или ферицианит, например калиев.

Полученият полипептид може да се изолира и пречисти чрез, известни начини като екстрахиране, рекристализиране, различни хроматографирания (гелно филтриране, йонен обмен, разделяне, абсорбиране, обратна - фазова високоскоростна течна хроматография), електрофореза, разпределение в противоток и т.н. Предпочита се обратно-фазовата високоскоростна течна хроматография.

Спец ифични примери за полипептиди съгласно изобретението, са посочени в следващата таблица.

Във формулите от (1) до (22) всеки символ означава съответния аминокиселинен остатък чрез международно приетото трибуквено означение. Всеки символ означава остатъкът от следните аминокиселини: Arg - Аргинин Cys Цистеин; Lys Лизин; Phe Фенилаланин; Ser Серин; Met Метионин; Ala Аланин; Тгр Триптофан; Туг Тирозин; Gly Глицин; lie Изолевцин; Leu Левцин и Vai Валин.

15 16 1?

HN“8-^Tv-sXo-s.'i'^, ₁-2JV-^jXl--^I®S-9TI“^T3-^s^T-’iXx-sX3-sX'i-3JY-iX;-sX3-ciJi-8iv-8^JV (33)

	X**»	Z^X	/~х	z^s	Z~X
to	tO	4	1—*	»-*	В—²
i-A	O	<O	00		CD
K-Z	4-Z			s^·

ч	Ч	Ч	ч
*0	0	0	0
в	J	1	1
О	о	о	О
*<	*<	*<	х;
СА	to	to	to
1	1	1	1
ч			ч
*<	аг	аг	ч
ч	ф	ф	0
в	1	1	1
>-	ч	ч	>-
ч	че	41	н
го	to	to	го
1	в	1	1
ч	ч	ч	ч
*<	*<	·<	*<:
to	to	СА	С»
1	в	1	В
>-	о	о	О
» ·	*<	·<	•-А
Р0	to	W	W
1	1	1	1
ч		0	ч
че	сг	сг	че
ч	с>	СР	0
1	1	I	В
ч	ч	ч	ч
м	*<	м	4·
to	СД	из	to
1	1	1	1
о	о	о	о
	ч	ч	ч
ч*	Ч*	*<
1	в	в	в
ч	co	co	ч
ф	ф	о	ф
С	ч	ч	0
в	1	в	1
>-	о	о	о
в—»	ч*	*-е	че
ф	и	-ω	to
1	в	1	в
Ч	ч	0	ч
ч-	*< -	S3*	ч;
Ч	ч	ф	Ч
В	1	в	В
3*·	ч	ч	>-
ч	ч:	Ч-	*1
го	и	сд I	го \|
ч	ч	ч	ч
ч*	4*	че	че
to	СЯ	СА	СА
1	в	1	В
О	Г>	о	о
ч;	че	4-	че
to	to	сд	to
1	1	1	1
		5».
►ч		ч	-t
оо	го	го	го
t	1	1	в
3!	3!	з:	3*.
33		33	33
го	►3	•0	Ν»

►ч	*ч	Ч	»4	ч	ч	ч	ч	Ч
и	ч	ч	ч	ч	ч	ч	н	Ч
•с	•о	•0	*0	*0	0	»0	Ό	*0
1	1	1	1	1	1	в	1	В
о	о	О	О	о	о	о	о	О
ч:	ч;	X	*<	Ч-	ч:	ч:	ч:	че
СА	V»	СА	СД	СА	to	ся	to	to
1	1	1	\|	1	1	в	в	в
•Ч	—>	Ч	Ч	ч	ч	ч	ч	ч
И	ч:	ч:	ч*	че		ч·	ч-	че
Ό	ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч
1	!	1	1	1	t	1	1	I
>-	>“	>-	>-	>-	>	>-	>-	>-
м	н	ч	ч	ч	и	к	ч	ч
м	го	го	го	го	го	го	го	го
)	I	1	t	\|	1	I	1	в
г-·	г-	г*	t-	t-	г*	ч	ч	ч
<	ч;	ч;	*<	*<	*<	*<	че	41
СА	СА	СА	СД	to	0»	to	to	to
в	в	1	1	1	1	1	1	1
О	о	о	о	Ο	о	о	о	О
·<	'<	·<	'<	*«	*<	*<	45	че
W	ω	to	ф	to	to	to	£0	to
1	1	1	1	в	1	1	1	1
*ч	*ч	•ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч
м	ч*	«<	*<	*<	ч*	ч*	ч:	че
•0	ч	ч	ч	ч	Ч	ч	ч	ч
1	1	в	в	в	1	1	1	1
г*		>·	Р-	>·	>	ч	ч	ч
*<	ч	ч	ч	ч	ч	ч:	4S	’<
W	0Q	го	го	го	00	to	СД	to
в	1	В‘	1	1	t	I	1	В
о	о	о	о	о	о	О	о	о
В-*	н*	>-*	ч	ч	ч	ч	ч	ч
ч:	ч:	ч;	*rl	W*	ч*	Ч*	Ч-	ч*
>	j	1	1	1	1	В	1	В
г*	>-	co	ч	ч	ч		ч	в в
ф	V-1	о	ч	ч	ч	Ф	ф	ч
0		ч	ф	ф	ф	Ч	0	ф
1	1	)	в	1	1	1	в	1
о	о	о	г>	о	о	О	о	о
·<	м		«:	ч;	Ч-	*<	«<	*<
W	U*	ω		ω	ф	W	W	СА
1	1	1	1	1	в	8	8	1
• »-ч	>ч	ч	ч	ч	ч	Ч	ч	ч
4ί	ч-	м:	ч:	*<	Ч-	ч;	45	*<
ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч
1	а	в	в	1	1	в	в	1
>►	Р*	>-	>-	>·	>·	>·	>-	>-
w	ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч	ч
W	го	го	го	го	го	го	го	го
1	1	1	1.	1	1	в	1	1
г-			>1	>-		ч	ч	ч
4ί	м	ч	м	ч	ч	Ч-	че	Ч-
СА	го	го	го	го	го	to	to	СА
1	1		)	1	1	в	в	1
о	о	о	о	о	г>	г>	О	о
ч-	*<	ч;	ч:	*<	ч*	че	ч:	*<
CA	03	СА	to	to	СА	to	СА	to
1		1	1	1	1	в	1	i
	>-	г*·	>-	>*	>·		>-	>*-
ч	ч	ч	ч	п	ч	»1	ч	ч
го	ОП	го	го	го	го	ОП	го	го
1	в	1	1	J	1	1	1	1
	*аг	tz:	ак	ZX.	гж	аг	з:	з:
W	РС	ж	30	U4	ас	UU	а?	PU
	го	л»	м	»	м	м	м	к»

4	4	Ч	Ч	ч	ч
4	►5	ч	η	•η	ч
0	0	0	0	0	0
1	1	в	1	1	1
o	Ο	о	о	ο	О
ч:	χ:	*<	ч:	ч:	ч:
CA	09	СД	<л	СД	03
1	1	т	1	I	1
4	Ч	—9	—9	4	ч
ч:	*<	ЧХ	*<	ч·	Ч!
4	Ч	ч	>1	> в	м
B	1	1	В	1	I
>-	>·	>-	р-	>-	>·
H	Μ	м	н	ч	Ч
ГО	ГО	ГО	го	0«	го
\|	1	1	в	1	1
r*	ч	ч	ч	ч	Ч
4:	*<	*<	·<	чх	ч*
CA	ω	се	СА	сд	СД
I	1	1	1	1	в
O	ο	г>	о	о	о
4*	че	ч:	45	че	ч;
ω	СА	са	0>	т	СА
1	1	1	1	I	1
4	ч	ч	Ч	Ч	ч
^fc<	*<	·<	·<	М	чс
4	ч	ч	н	м	ч
r	1	1	1	}	в
ч		>-	>-	>	>·
4J	ч	ч	ч	ч	ч
Ш	ГО	го	ГО	го	ос
1	1	1	1	I	1
o	о	о	о	о	о
4	ь-·	·—	1—·	ч	>-·
M	Ч*		ч*	Ч*	*<
i	1	i	1	1	1
w	Ч	Si	в—в	ч	J-4
>—·	О>	ф	1—»	Ι-»	ь-»
φ	е	г>	ф	ф	ф
I	1	I	1	в	1
o	о	о	О	о	О
*<	«<	ч*	·<	·<	ч-
и	сп	09	(0	СД	сл
\|	1	1	\|	1	1
>4	ч	ч	Ч	Ч	•ч
4	4ί		·<	*<	*<
4	Ч	ч	Ч	и	ч
1	1	1	1	1	1
>-			:>-	>-	>>
4	ч	ч	η	ч‘	»1
ГО	ГО	го	0Q	го	оо
1	1	1	1	1	1
ч	ч	ч	Ч	ч	г-
4{	«е	*<	·<	*<	·<
CA	<а	03	ся	сл	V»
1	1	1	в	а	1
o	О	г>	о	о	о
43	че	*<	41 ’	41	*<
CA	сл	0»	ся	Co	co
1	1	В	I	1	1
>*	>-	>-	>-	>	>-
4	-в	»-€		п	м
PQ	хз	ГО	ГО	ГО	0Q
1	1	1	1	В	1
Ж	з:		31	з:	1«2»
зз	ЕС	ас	РЗ	ас	□С
·»	►*	м	►*	*»

Получените съгласно изобретението полипептиди с формула (I) имат подобно на известните полипептиди, получени от подковообразни раци от сем Xiphosura, способността да свързват ендотоксини, антибактериална активност и способност да хемолизират сензибилизирани с еднотоксин хемоцити. Те имат добра антивирусна активност срещу вируса на имунната недостатъчност у човека (HIV). Тези полипептиди проявяват десет или повече пъти по-висока анти-HIV активност, отколкото Тахиплезин I, като някои от полипептидите проявяват няколко хиляди пъти по-голяма анти-HIV активност.

В известните полипептиди, получени от раци от сем. Xiphosura структурата се характеризира с 4 цистеинови остатъка в 3-, 7-, 12-, и 16-та позиция, при което те приемат β -слоеста структура, така че частта при 9- и 10-та позиция е β -въртяща, като пептидната част от 3-та до 8-ма позиция и пептидната част от 11-та до 16-та позиция са обърнати една към друга, а 4 цистеинови остатъка в 3-та и 16-та позиция и в 7-ма и 12-та позиция се свързват чрез съответните две дисулфидни връзки (-S-S-). Като структурни белези за манифестиране на антивирусна активност на полипептидите, чиято 6-позиция е превърната в Lys, съединения от изобретението, съществуването на структурни части на които определят изключителното сходство помежду им като се вижда при ³Cys ⁴А^ ⁵А3 ⁶Lys,обръщането ’’A, ^,4Aj ⁱ⁵A^ ¹⁶Cys по същество е необходимо, а при ^гТгр ”Arg е наложително. Установено е също, че след това чрез свързване на базична аминокиселина, предписана в Ар при тези структурни части в 1 -позиция се проявява структура, чиято анти-HIV активност е проявена извънредно силно.

Полипептидът съгласно изобретението представен с формула (I), проявява основното си свойство поради характеристиката на конституивните аминокиселини и така оформя сол чрез добавяне на киселина с неорганична киселина (солна, бромоводородна, фосфорна, азотна, сярна киселина или други) или с органична карбоксилна киселина (оцетна, пропионова, малеинова, сукцинова, малеинова, лимонена, винена, салицилова киселина или други) или с органична сулфонова киселина (метансулфонова, р-толуолсулфонова киселина или други). Полипептидът от изобретението представен чрез формула (I), може да се използва катотакава фармацевтично приемлива сол.

Лекарството от изобретението се приготвя като фармацевтичен състав обхващащ полипептид, представен чрез формулата (I) или негова сол като ефективна съставка, и фармацевтично приемлив носител, избран в съответствие с метода на прилагане и на формата на прилагане на лекарството. Лекарството съгласно изобретението може да се прилага орално или парентерално в съответствие с обекта на третиране или за дезинфектиране на ин виво вирусно заболяване или на вирусна инфекция ин витро и може да се получи като препарат във форма на прах, гранули, разтвор за инжектиране или за орално приемане, таблети, супозитории, песарии, мехлеми, кремове или аерозоли, при използване на подходящи фармацевтични носители в зависимост от метода на приложение.

Когато лекарството от изобретението се прилага директно като инжекция в живо тяло, полипептидът или неговата сал могат да се прилагат непрекъснато или с прекъсвания в количеството от 10 до 5 000 mg/kg телесно тегло и за един ден и чрез интравенозно накапване като разтвор във физиологичен разтвор.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигурите показват онагледени схематично схеми на етапи за синтезиране на новия полипептид от изобретението.

Най-добър начин за провеждане на изобретението

Изобретението е илюстрирано от следващите примери, които не го ограничават.

Използваните апарати и реактиви при следващите примери са както следва: HPLC апарат: Ватерс Ко (САЩ) модел 600; Колона за апарата: Асахипак ODS-90 (Асахи химическа индустрия Ко,Лтд); Ртос аминокиселина: произведена от Кокусан Кагаку Ко, Лтд.; Аминосмола и кондензиращо вещество: произвеждано от Пептид Кенкиушо Ко, Лтд.; FABМ FAB-тегловен спектрограф; VG Ко (САЩ) модел ZAB-SE.

Пример 1.

Синтеза на полипептида (А) със следната формула

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Arg Trp - Cys - Tyr - Arg - Tyr - Cys - Tyr - Arg - Gly He - Cys - Tyr - Arg - Lys - Cys - Arg - NH₂ (А)

Във формулата (A) Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, Gly и lie означават посочените по-горе аминокиселинни остатъци, и Cys в 3-та, 16-та и в 7-ма и 12-та позиция са свързани съответно чрез дисулфидна връзка.

(1) Въвеждане в една аминометилна смола на Pmoc-DMBHA-CH₂CH₂COOH /(3-(αPmoc амино-4-метоксибензил) -4-метоксифенил пропионова киселина/.

270 mg (0,2 mmol) от аминометилна смола (0,74 meq/g) и 268,5 mg (05 mmol 2,5 eq) от Pmoc-DMBHA (СН₃СН₂СООН, мол.тегло 537) се поставят в твърдофазна синтезираща колона и кондензационната реакция се осъществява за 2 h по метода на DIPCDI(HOBt в DMF (диметилформамид) според метода от /17/.

След завършване на реакцията за кондензиране, се извършва съединяване за защита на свободните аминогрупи, използвайки оцетен анхидрид (DMBHА смола).

(2) Въвеждане на аргинин в 17-тата позиция в DMBHA смолата.

След отстраняване на Ртос групите от DMBHA смолата, получена в (1) с 20% пиперидин/DMF, се добавя 2,5 eq от Pmoc-Arg(Mtr)ОН базирана върху DMBHA смолата, и реакцията за кондензиране се извършва в диметилформамид според DIPCDI-HOBt метода.

Степента на напредък на реакцията за кондензиране се преценява чрез измерване според нинхидриновата проба на /18/.

(3) Въвеждане на цистеини на 16-тата позиция.

След отстраняване на Ртос групите от DMBHA смолата, получена в (2), в която се въвежда аргинин с 20% пиперидин/DMF, се добавят 2,5 еквивалента Pmoc-Cys (MBzl)-OH на база на DMBHA смола, и реакцията за кондензиране се извършва в диметилформамид според DIPCDI-HOBt метода. Степента на напредък на реакцията на кондензиране се преценява подобно на (2) чрез измерване според нинхидриновата проба.

(4) Въвеждане на аминокиселини от 15до 1- позиции

Подобно на описанието по-горе, в ДМВНА смолата се въвеждат последователност Lys (Вос), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys (MBzl), lie, Gly, Arg(Mtz), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Lys, Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl) Try и Arg(Mtr) остатъци според последователността c крайната аминокиселина за получаване на защитна групово-защитена пептидна (А) смола.

Всяка аминокиселинна кондензационна реакция при твърдофазната синтеза се извършва според работните условия от следващата таблица.

Таблица 1

Операция	Реактив	Разтворител	Време по брой повторки
Отстраняване на	20% пиперидин/DMF	DMF	5 min х 3
Ртос група Промиване	-	DMF	1 min х 6
Реакция за кон-	Ртос аминокиселина	DMF	2 h х 1
дензиране	2,5 еквив.+ DIPCDI+ HOBt
Промиване	-	MF	1 min x 4
’DMF - ДМФ “ диметилформамид

5. Получаване на пептид (А) чрез отстраняване на защитните групи и операция за отстраняване на смолата и частично пречистване.

Защитената със защитна група пептид (А) пептидна смола, получена чрез операции от (1) до (4), се обработва с 20% пиперидин/DMF за отстраняване на Ртос групата и тогава реагира при 25°С за 24 в 1 mol TMSOTf-тиоанизол/ТРА система (10 ml трифлуороцетна киселина в присъствие на т-крезол (100 еквивалента) и етентиол (300 еквивалента) на 100 mg от смолата. Последната се отфилтрува от реакционната смес и се промива двукратно в 1 ml трифлуороцетна киселина, добавя се 100 ml охладен на лед сух етер към сместа от филтрат и промиване. Образуваната утайка се центрофугира и остатъкът се сепарира от повърхностната течност чрез декантиране. Полученият остатък се промива със студен етер, разтваря се в 10 ml 4 η АсОН, 830 mg 80 еквивалента дитиотреитол се добавя и сместа се разбърква едно денонощие при стайна температура.

Реакционният разтвор се центрофугира, супернатантата се обработва със “Сефадекс G10” (3,7 х 50 cm), подлага се на гел.филтрация с 4 N АсОН, и фракцията, която преминава през “Сефадекс” без спиране се събира като главен елюат и се лиофилизира за получаване на прах от частично пречистен нециклизиран полипептид (А).

(6) Получаване на полипептид (А) чрез окисляване на въздуха. Половината количество от фракцията, която е преминала през “Сефадекс” без спиране при гелното филтриране се довежда до pH 7,5 с концентриран воден амоняк, и се подлага на окисляване чрез аериране за извършване на реакцията за циклизиране. След завършване на окисляването на въздух, циклизираният пептид (А) се адсорбира върху 10 g ДИАИОН НР-20 смола и се десорбира и елюира с 60% CH₃CN (в 1 N АсОН), елуатът се концентрира при стайна температура при понижено налягане за отстраняване на CH₃CN и тогава се лиофилизира до получаване на прах. Прахът се разтваря в малко количество вода и разтворът се излива върху “Асахипак” и се пречиства чрез високоскоростна течна хроматография (HPLC-Модел 600 произвеждан от Waters Co), при използване на градиентно елуиране с CH₃CN за получаване на пептида (А) от отделен пик при добив от 27% (стойност, изчислена въз основа пептид- (А) смолата със защитени групи).

(7) Анализ на полипептида

Стойността на аминокиселинния състав при разграждане на пептида с левцин аминопептидаза, пречистен както по-горе в (6), съвпада добре с изчислената стойност на състава въз основа на аминокиселинната последователност от формула (А).

Освен това, в молекулното тегло FABMS, изчислената стойност на (М+Н⁺) е 2309,786 и установената стойност е 2310.048.

Специфичното въртене (a)_D ^M на получения полипептид е +14.2° (С - 0.3, IN НС1).

Пример 2 и сравнителни примери 1 и 2.

Антивирусна активност срещу вируса на човешки имунодефицит (HIV).

Антивирусната активност срещу HIV на полипептида (А), синтезиран в пример 1, се изпитва и преценява съгласно следният метод:

Инфектирани с HIV МТ-4 клетки (2,5 х 10“* клетки/кладенче, многократност на инфекцията (MOI) : 0.001) непосредствено след инфектирането се добавят заедно с изпитвано вещество с различни промени в концентрацията, към микротитрационна плочка с 96 кладенчета. След инкубиране при 7°С за 5 дни в инкубатор с СО₂, броят на преживелите клетки се определят по МТТ метода /19/.

Антивирусната активност се изразява като концентрация, при която клетъчното инфектиране с HIV е инхибирано 50% (ЕС 50 : 50% ефективна концентрация). С цел да се изследва цитотоксичността на опитното вещество върху МТ-4 клетките, се инкубират неинфектирани с вирус клетки както по-горе, заедно с опитното вещество при различни промени в концентрацията. Цитотоксичността се изразява като 50% цитотоксична концентрация (СС 50), дължаща се на опитното вещество. Освен това активността на СС 50 към ЕС 50 (СС 50/ЕС50) се изразява като ефективно отношение (SI).

Таблица 2 показва ЕС 50, СС 50 и SI стойностите на полипептида (А) и на известния Тахиплезин I, който е с афинитет към ендотоксини, и азидотимидин, известен антиHIV агент, и двата използвани за сравнение.

Таблица 2

Изпитвано лекарство		СС 50 (pg/ml)	ЕС 50 gg/ml	SI
Пример 1	Полипептид (А)	39	0,33	110
Сравнителен	Тахиплезин I	49	18,1	3
пример 1 Сравнителен пример 2	Ацидотимидин (AZT)	0,80	0.00048	1700

Както се вижда от горната таблица, полипептидът съгласно изобретението има малко по-силна цитотоксичност, отколкото Тахиплезин I, чиято анти-HIV активност е открита по-рано, но проявява антивирусна активност при концентрация от 1/50. В сравнение с ацидотимидин, полипептид (А) има ЕС 50 стойност при по-висока концентрация, обаче има 60 пъти по-висока СС 50, показващо слаба цитотоксичност.

Пример 3. Таблица 3 показва структурните формули и физическите свойства на различни полипептиди от изобретението, получени по същия начин както в пример 1 и тяхната антивирусна активност срещу HIV, изпитан и оценен както в пример 2. 30

В съединенията от настоящия пример в горната таблица, Cys-остатъците в 3-, 7-, 12-и 16-позиция са свързани чрез дисулфидна връзка между 3-та и 16-та позиция и между 7-ма и 12-та позиция, освен ако е посочено друго.

В горната таблица “AZT” означава ацидотимидин (тривиално наименование Цивудин).

ПРОМИШЛЕНА ПРИЛОЖИМОСТ

Съгласно изобретението, може да се предложи един нов полипептид или негова сал, който има антивирусна активност срещу вируса човешки имунодефицит (HIV) и един анти-HIV агент, съдържащ същия като ефективна съставка.

co

(ЗН) е редуцирана форма на (з)

Таблица

Claims

Патентни претенции

1. Един нов полипептид, представен чрез следващата формула (I):

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Aj - Trp - Cys - А₂ - А₃ - Lys - А₄ - \ - А₃ - Gly - А₄ - А₄ - А₂ - Aj - А₃ - Cys - Arg - А₃... (I) в която А₁ означава водороден атом или един или два аминокиселинни остатъка от 1θ аминокиселини, избрани от лизин и аргинин; А₂ е независимо тирозин, фенилаланин или триптофанов остатък; А₃ е независимо аргининов или лизинов остатък; А₄ е независимо аланинов, валинов, левцинов, изолецинов, серинов, цистеинов или метионинов остатък; А₃ е -ОН произхождащо от карбоксилната група) или -NH₂ (произхождащо от ацид-амидната група); Cys означава цистеинов остатък; Gly

- глицинов остатък; Lys - лизинов остатък; Arg

- аргининов остатък и Тгр означава триптофанов остатък; и цистеиновите остатъци в 3и 16-позиция може да бъдат свързани чрез дисулфидна връзка (-S-S-), а когато 7-ма и 12позиция са и двете цистеинови остатъци, те може да са свързани чрез дисулфидна връзка (-S-S-) или сол на същата.
2. Едно анти-HIV вещество, съдържащо нов полипептид като ефективна съставка, представено със следната формула (I).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

А, - Trp - Cys - Aj- А₃- Lys - А₄- А₂- А,- Gly -А₄-А₄-А₂-А₃-А₃- Cys - Arg - A,...(I) в която A_t означава водороден атом или един или два аминокиселинни остатъци на аминокиселини, избрани от левцин и аргинин; А, е независимо тирозин, фенилаланин или триптофанов остатък; Аз е независимо аргининов или лизинов остатък, А₄ е независимо 30 аланинов, валинов, левцинов, изолевцинов, серинов, цистеинов или метионинов остатък, А₃ е - ОН (произхождащо от карбоксилната група) или - NH₂ (произхождащо от ацидамидната група); Cys означава цистеинов 35 остатък; Gly - глицинов остатък; Lys - лизинов остатък; Arg - аргининов остатък и Тгр означава триптофанов остатък; и цистеиновите остатъци в 3-та и 16-позиция може да бъдат свързани чрез дисулфидна връзка (-S-S-), а когато 40 7-ма и 12-та позиция са и двете цистеинов остатък, те може да са свързани с дисулфидна връзка (-S-S-) или сол на същата.