PT97414A - Metodo para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo analogos do factor de libertacao da hormona de crescimento - Google Patents

Description

0 factor de libertação da hormona de crescimento <8RF> foi oriqina 1 mente isolado como utn peptideo de 44 aminoáciQDS a partir de um tumor pancreático humano» Guillemin et al- , Science 21Bs585 Íi982>» BRF é um peptideo útil pois estimula a libertação da hormona de crescimento endógena» Devido ao seu tamanho peque— no, BRF tem sido dificil de produzir em grandes quantidades por filétodos recombinantes»

Tentativas anteriores para expressar BRF em E_»_____coli foram infrutíferas em dois aspectos» A expressão directa resultou na produção de niveis muito baixos de proteína» Patente U»B» 457285όΘ9* Um nível elevado de expressão foi conseguida apenas por fusão c.cm um outro polipeptídso, o que requere a clivagem do polipeptideo de fusão para libertar GRF activo» Villa et al», Eur» J-, Bise hem» 171 s 137 (1988) 5 Pedido de Patente Europeia Ne 0199018» 0 presente invento proporciona polipeptídeos que podem ser expressos em níveis elevados em E» coli, nlo necessitando de qualquer clivagem psra serem activos» São também proporciponados compostos polipeptidicos com actividade BRF que são prolongados no seu ej;tremo amina com um,, dois ou tres aminoácidos» São também proporcionados derivados de GRF com tirosina desaminads. Os cosRpostos são produzidos por quaisquer meios de síntese, incluindo síntese de pepiídeos em fase sólida, síntese de- peptídeos em '^solução, síntese enzimática» métodos semi-sin té ticos e métodos de DWA-recombinante. 0 presente invento proporciona compostos polipeptidicos | com actividade de libertação da hornsons de crescimento (8RF) que são expressos em níveis elevados em E» call,; Os compostos poli-peptídicos também são produzidos por outros meios de síntese de peptídeos5, incluindo os métodos de síntese em fase sólida» São também proporcionados compostos de DMA codificadores destes !

rjolipeptidecs- Os compostos polipeptídicos» qus podem ssr s;-;pt ossos sii n.ívej.5 elevadas em E* cd 1 i são representados pela fórmuia A-A1a-Asp-A1a-11e-Fen-Tre-Asn-R-Ti r-Arg-B-Va1-Leu—C— 5 1@ 15

Sln-Leu-Ser-ftla-Arg-D-Leu-LeuH31n-Asp-íle-E-Asn-Arg-X; 2Θ '-^em que A é Met, Met-Tir, Met-Ala-Tir, Met-Arg-Tir, Met-Asp-Tir, Mei-Bli-Tir, Met-Leu-Tir, Met-Pro-Tir, Met-Ser—Tir, Mefc-Ala-Ala--Tír, Met-Arg-Pro-Tir, Met-Asp-Pro-Tir, Met-61i-Pro-Tir, Met-Fen-—Pro-Tir, Met-Pro-Pro-Tir ou. Met-Ser—Pro-Tir; R é Asn ou Ser; B é Arg ou Lis; C é Bli, Ala, Leu, Vai, Ile ou Tre; D é Arg ou Lis; E é Met, Vai, Leu ou Ser; X é uma cadeia de res.idu.os de aminoàcidas de comprrimento suficiente de tal forma que é conseguido um nível de expressão elevado em £., coli; nenhum, um. ou ma is de um de tais aminoácidos tendo um grupo amina livre ê modificado quimicamente; e- os seus sais de adição de ácidos não tóxicos ou seus sais de ácidos csrboKilicos,

Para fins do presente inventa, "quimicamente modifica— é definido como a derivatisação de um grupo amina livre de um aminoécido com um grupo alquila ou hidroxislquilo,, Nenhum, um ou mais de um dos grupos amina livres pode ser modificado quimicamente» 0 grau de modificação ê controlado pelo comprimento da I reacçSo ou. quantidade de reagente» Prefere-se que todos os aminpécxdos tendo um grupo amina livre sejam modificados quimicamente. é especialmente preferido que todos os aminoácitíos tendo um grupo assina livre na extremidade amina sejam quimicamente modificados,, Tal composto não tem lisinas ou roetioninas, excepto no extremo H* Os compostos contendo iisina s/ou metionina são ϊ

convertidas em compostos com uns yrupa amina livre apenas na extremo N por substituição das lisinas com argininas s meiioninas com isucinss,

As escolhas, preferidas para A são Met—Pro—Tir e Met— Ala-Tir? uma escolha especialmente preferida é mei-AIa-T ir * Os aminoácidos preferidos- no εκ tremo C e E s-3o Tre e leu, respecti— vamente« 8e bem que X possa ser qualquer cadeia de amincácidas de tamanho suficiente para se conseguir um nível de expressão elevado do composto em E» coli, os comprimentos de cadeias preferidos são cerca de 31-1βΘ aminoácidos. Mais preferidos são comprimentos de aproximadamente 4Θ--8Θ aminoácidos? são especial — mente preferidos comprimentos de sproximadamente 45-55 aminoáei-das. Uma escolha especialmente preferida de aminoácidos para X é Gln-Gln-Sli—61u-Arg-Asn-61n—Glu-Gln-Gli-Ala-Lis-Val—Arg-Leu-Gli— Arg-G 1 n—Va 1 — Asp—Ser—Leu—t r p—A1 a-G 1 u—S1 n—Lis—B1 n—Leu—B1 u—Leu—B1 u— Ser-11e—Leu-Va1-A1a-Leu—Leu-S1n—Lis—His-Ser—Arg-Asn-Ser-SIn-Gli , Esta sequência de aminoácidos representa os 48 aminoácidos do extremo C do precursor tíe GRF humano com todas as metioninas substituídas por leucinss» As lisinas na sequência acima são substituídas por argininas para dar uma escolha preferida para X; G1n—G1n—S1i—G1u—Arg—Asn—GIn—G1u—61n—G1i—A1a—Arg—Va1—Arg—Leu—G1i— Arg—Gin—Vai—Asp—Ser—Leu—trp—Ala—Blu—Bln—Arg—Bln—Leu—Blu—Leu—Blu— ' J^Ber—Ile—Leu—Vai—Ala—Leu—Leu—Bln—Arg—His—Ser—Arg—Asn—Ser—Gin—Bli. Esta sequência e preferida pois o composto resultem te tem apenas um grupo amlna livre ss .8 e D forem argininas, facilitando assxma geração de composto quimicamente modificado homoqènio »

Outras sequências de aminoácidos preferidas em X inciussT! peptideos da proteína de superfície do vírus da febre afetosa e uma sequência de aminoácidos que constitui GRF, criando assim o dimero GRF, Sequências adequadas em X incluem Sln-Gln-G1 i—G1 u—Arg—Asn—G1 η—B1 u—Gin—G1 i—A1 a—Lis—Va 1 —Arg—Leu—1

Ala—Ile—Fen—Tre—Asn—Ser—Tir—Arg—Lis—Vai—Leu—Tre—SIn—Leu—Ser—fila— ftrq—Lis—Leu—Bln—Asp— I le—Leu—Asn—ftrg—Bln—Bln—Bli—Giu—Arg—Asn—Bln— G1u—G1n—G1i—A1a—Lis—Va1—Arg—Leu e G ln—Gln—G1i—61u—Arg—Aso—81u—

Olu-Bln-Bli-Ala-Lis-Val-Arg-Leu-Gli-Arg-Bln-Val-Asp-Ser-Het-Trp-A1 a-B lu-81 n-Lis-61 n~Met-B 1 u-Leu-G 1 u-Ser-I1 e-Leu-Va 1 -A 1 a-Leu-Leu-Gln—Lis-His—Ser—Arg—Asn—Ser—Gin—61i«

Oui compostos polipeptídicos do da A-Ala-Asp-ftls-Ile-Fen-Tre-Asn-R-Tir-firg-B-Val-Leu-C-Bln-Leu-ser-5 1© 15

Ala—Arg—D—Leu—Leu—Gin—Asp—Ile—E—Asn—Arg—X; os am que A ê Met, desMH»-—Tir, Ala-Tir, Gin—Tir, Bli—Tir, His—Tir, Met-Tir, Fen—Tir, Pro—Tir, Ser Tir, Ala—Ala—'Tir, Arg—Ala—Tir, Asp-Ala-Tir, Fen—Ala-Tir, Pro—Ala-Tir, Pro-Prc-Tir, Met-Ala-Tir, Met—Arg—Tir, Met—Asp—Tir, Met—Leu—Tir, Met—Pro—Tir, Met—Ser—Tir, Het-Ala-Ala-Tir, Met-Arg-Pra-Tir, Met-Asp-Pro-Tir, Met-Gli-Pro-^-Txr, Met—Fen—Pro—Tir? ou Met—Ser—Pro—Tir; R é Asn— ou Ser; B ê Arg ou Lis5 C ê glicina. Ala, Leu, Vai , Ile ou Tre ; D ώ Arg ou Lis; E é Met, Vai, Leu ou Ser; X á uma cadeia de aminoâcidos com um comprimento superior a 3® aminoâcidos; nenhum, um ou mais de um das anunaácidos tendo um grupo amina livre & quimicamente modificado; e os seus sais de adielo de ácidos nlo tóxicos e TSs uuxliSiT3fe'3ite aueitavexs ou seus sais de ácidos carhoxiiicos* 0 presente invento também proporciona compostos poli peptidicos da fórmula f

A-AI a-Asp-A 1 a— 11 e—Feri — i re—Asn—R—Tir-Arg—B—VaI —Leu—C— 5 1Θ 15 G1n—Leu—Ser—Ai a—Arg—D—Leu—Leu—B1n—Asp—I1ε—E—Asn—Arg—X; 2Θ 25 em queA é Het, Aia-Tir, Bln-Tir, Bli-Tír, His-Tir, Het-Tir, Fen-Tir, Fro-Tir, Ser-Tir, Ala-Ala—Tir, Arg-Ala-Tir, Asp-Ala-Tir, Fen-Ala-Tir, Pro-Ala-Tir, Pro-Ala-Tir, Pro-Pro-Tir, Het-Ala-Tir, Met-ftrg-Tir, Met-Asp-Tir, Het-Leu-Tir, Met-Pro-Tir, Met-Ser-Tir, Het—Ala-AIa-Tir, Hei—Arg—Pro—Tir, Met-Asp-Pro-Tir, liet-Bli-Pro--Tir, Het-Fen-Pra-Tir e Mei-Ber—Pro-Tir; B é Arg ou Lis, C é Gli,

Ala, Leu, Vai 5 Ile ou Trep D é Arg ou Lis, E è Met , Vai , Leu ou Ser ζ X ώ Çyf-S Vm I H 2 . OU. um ou mais am inoácidosp s nenhumH um ou mais de Uín CÍOS amino· ác idos tendo um grupo amina livre é modi f ic ado L.j ‘Λ .2. ÍIllC -ίδ-ΗΙτ^Γί ir.S ;; e seu s saís da · adição de ácidos , não tèsicos e í S Γ O ti t. i C -d.íTi en te aceitáveis e sais de ácidos csrbo κ11i cos &

Ué cu ηρc'cu- toa po 1 i. psotid do Xiivento d a. * «s· em do foGRF natural em vários aspectos. A ssqudnc ia de ansinoécidos do foGRF natural é jTir—Ala—Asp—Ala—Ile—Fen—Tre—Asn—Ser—T ir—Arg—Lis—Vai—Leu—61i—Bln— 5 10 15

Leu-Ser Ala—Arg—Lis—Leu—Leu—Gin—Asp—I1e-Met-Asn-Arg-Sln-Bln-Glu— 20 25 3Θ

Arg-Asn-Gln-Blu-Gln-Gli-Ala-Lis-Val-Arg-Leu. Pelo contrário, o 35 4Θ presente invento proporciona análogos d© 6RF que diferem de bláKi·* natural nos extremos amina s/ou carbonilo. Também estão meiuidos análogos com -a glicina na posição lo substi.tu.iua por trsonina. 0 extremo amina do BRF natural é a tirosina na posição íOs compostos polipeptidicos do inventa3 exceptuando quando H à Mets são prolongados no extremo FL Esta extensão designa—se pela variável A» Quando produzidos em E=___cgl_i5 os compostos do invento em que A começa com metionina seguido de alanina, glicina, prolina ou serina sofrem processamento natural com libertação do iniciador metionina. Este processo dá os compostos do invento onde A começa com aianina, glicina, prolina ou serina, 0 composto em que A ê Mei dá um composto fracamente activo após remoção da. metionina mas o composto resultante é útil como substrato para a criação de compostos com substituiçSes na posição 1, tais como o composto em que a tirosina da posição í é substituída com desNH,.,--tirosina, Qs compostos do invento que nlo começam com metionina slo produzidos através de métodos se síntese, incluindo a sintese ds peptídsos em fase sólida. Como alternativa, os compostos em que A é Gln-Tir, His-Tir, Fen-Tir, Arg-Ala-Tir, Asp-Ala-Tir, Fen—Ala—Tir e E è vaiina, leucina ou serina5 s-So produzidos por técnicas recombinantes seguido de clivagem de um iniciador metionina com brometo de cianogénio» A clivagem com brometo de ^cianogénio pode ser utilizada apenas quando os aminoácidos designados por X não incluem metionina, Os técnicos familiariza— dos com a matéria reconhecerão que podem ser empregues outros métodos para obtenção dos compostos do invento.

Alguns polipeptídeo do invento possuem aminoácidos no extremo carbonilo que são definidos por X, Sabe-se que a fracção activa de BRF nativa reside nos Ξ9 aminoácidos N-terminais, reivier st aiNatíire 3Wz'27é ( í982), Os compostos polipeptídicos do invento em que X é uma cadeia de aminoácidos de comprimento superior a 30 resultam da descoberta de que o composto pode ser prolongado para um comprimento tal que seja conseguido um nivel elevado de expressão em E, call, ainda que seja retida a activi-dade 8RF =

No contexto deste invento, pensa-se que um comprimento total mínimo de sproximadamsnts 60 aminoàcidos seja necessário para se conseguir rendimentos elevados de BRF em E, coli. As extensões C-ierminais definidas por X <quando X á uma cadeia ds aminoàcidos de comprimento superior a 3®) são baseadas na desco-^ berta ds que -qualquer cadeia de aminoàcidos pode ser usada para prolongar a cadeia e reter actividade BRF, No entanto.* um composto SRF bovino com 33 aminoàcidos C-tsrminais do precursor ds GRf humano Co composto polipeptídico preferido do invento) é mais activo em gado e carneiros, Q composto tem alguma actividade em galinhas, porcos e gatos,. U presente invento inclui as formas modificadas quimi- camsnie dos compostos polipeptidicos do invento, Os métodos de alquilaçlo ds peptídeos sao bem conhecidos, Acharya s Manjula, 61 oohem·_- 26s3S24 (19B7)s Brovín e Breenberg, Anal, Lstters 17;

1429 <1984), Os derivadas alquilados são substituídos nos seus orupos amina livres por um grupo alquilo 0.,-0, de cadeia linear X £* ramificada substituído com sero, um ou mais de um grupo hitiraxilo, São grupas preferidos grupos hidroxialquilo ds cadeia linear Bso especial mente preferidas as substituições comi meti lo, 2-hxdroxietilo e 2,3—di—hidroxipropilo. é especialmente | preferido 2,3-di-hidroxipropilo.

Urn composto polipeptídico preferido é

ο

Ala—Tir-Ala—Asp—Ala—Ile—Fen-Tre-Asn-Ser—Tir—Arg—Lis—Vai—Leu-Tre-@ 5 í€* 15 GIn-Leu-Sei—A1 a-Arg-Lis-Leu-Leu.-G ln-Asp-11 e-Met-Asn-Arg-Sln-S In-2Θ 25 3Θ

Gli-Glu-Arg-Asn-61n-61u-8In-Gli-AIa-Lis-Mal-Arg-Leu-Gli-Arg-Gln-35 4Θ 45

Va1-Asρ-Ser-Leu-Trp-Ala-G1u—61n-Lis-0In—Leu-G1u—Leu—G1u-Ser-I1e-50 55 60

Leu—Va1-A1a—Leu—Leu—G1n—Lis—His-Ser-Arg—Asn—Ser—G1n-G1i« 65 70 75 especialmente preferido a derivada da comoosto acima em que Q'3 C|r*t.lpw3 SHI.í.n*3 iXVT*0ís· OS 3 . 1snins π «a posição 0 £ as lisinas nas posiçSfes 12, 21, 41, 56 e 7Θ sMo U. D ‘ir;-1X t U. idas por hidrDxipropilOt. Encontrou-se que sste compost; o possui isaior acfcividade de factor de libertação da hormona de crescimento do qua a molécula nativa 1 n vivo,, Um outro composto preferido deriva do composto acima por substituição das cinco Usinas com

i© -

A1 a-T i r-A1 a-As p-A1 a-11 ε-Fen -T re-ftsn -Ser-T i r-A r g - A r g - Va 1 -Leu-T re— © 5 í© 15 SIn-Leu-Ser—Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln— 2© 25 3©

Gli—Glu-Arg-Asn—Gln-Glu—Gin—Gli—Ala—Arg—vai—Arg—Leu-Gli—Arg-Gln— 35 4© 45

Va1-Asp-Ser-Leu-Trp-A1a-G1u-B1π-Arg-G1π-Leu-B1u-Leu-G1u-Ser-I1e— 5© 55 6©

Leu—Va1-Ala-Leu-Leu-G1n—Arg—His-Ser—Arg—Asn—Ser—G1n—61i«

0 composto resultante tem um grupo aroina livreapenas no seu extremo aminao qual pode ser quimicamente modificado» Um composto polipsptídico especialmente preferido da inventa é desNhLp-Tir—Ala—Asp—Ala—Ile—Fen—Tre—Asn—Ser—Tir—Arg—Lis—Vai—Leu 5 10 T re-G1n-Leu—Ser—A1a—Arg—Lis—Leu—Leu—61n—Asp—11e—Leu—Ser—Arg—G1n— 15 2© 25 3© ^Sln-Gli—Glu—Arg—Asn—Gin—Glu—Bln-Bli—Ala-Arg—Vai—Arg—Leu—SIi—Arg— 35 4© 45 G1n-Va1-Asp-Ser-Leu-Trρ-Α1a-Asp-81n—Arg—G1n-Leu-A1a-Leu-G lu.— 5© 55 6© 7© ^ Ser-Iie-Leu-Ala-Tre-Leu-Leu-Sln-Glu-His-Arg-Asn-Ser-Sln-Gli. 75 65 11 11 inventf

Ainda, um outro composto polipeptídico do iresentado sela -fórmula

Ti r-A1a-Asp-A1a-11e-Fen-Tre-Asn-Ser-Ti r-Arg-B-Va1—Leu—C—B1n—Leu— 5 i® 15 Ser—AIa-

-Arg-D-Leu-Leu-61n-Asp-I1e-E-Asn-Arg-X 2© 25 em qu.e B ê Ara ou Lis5 C é Tre? D é Arg ou Lis? E é Met, Vai, Leu ou Ser? X é ou uma cadeia de resíduos de aminoécidas de qualquer comprimento. As escolhas preferidas para X sgD B1n-Gln-Β1i-B1u-Arg-Asn-S1n-61u-61n-81i-A1a-Lis-Va1-Arg-Leu-Sli— Arg-01n-Val-Aep-Ser-Leu-trp-Ala-Blu-Bln-Lis-61n-Lsu-Glu-Leu.-Blu— Ser-11e-Leu-Va1-A1a-Leu-Leu-G1n-Lis-His-Ser—Arg-Asn-Sei—G1n-G1i e 61n-B1n-B1i-Blu-Arg-Asn-B1u-G1u-G1n-G1i-Ala-Lis-Va1-Arg-Leu-61i— Arg-B 1 n-Va 1 -Asp-Ser-iiet-T r p-A1 a-G 1 u-B 1 n-Lis-G 1 n-liet-G l u-Leu-6 1 u— Ser-11e-Leu—Va1-A1a-Leu—Leu-G1n-Lis-His-Ser—Arg—Asn—Ser-B1n-G1i. A última escolha é particularmente preferida.

Compostos de DMA isolados codificadores dos oolioe-ptí— Isos do xnvento sSo também proporcionados neste casa. Os familia— rice.dos com a matéria sabem quais os codoes que devem ser usados para cada amxneácida» Um composto de DMA preferido do invento codifica um composto polipeptídico especialmente preferido onde A é Ala-Tir, B é Lis, C é Tre, B é Lis, E é Leu e X é Bln-Gln-Gli--Slu-Arg-Asn-Gln-Blu-Bln-Gli-Alâ-Lis-Val-Arg-Leu-Gli-Arg-Bln-Val--Asp-Ser-Leu-Trp-A1a-B1u-Gln-Lis-Β1n-Leu-G1u-Leu-6lu-Ser-Ile-Leu--Val-Ala-Leu-Leu-Bln-Lis-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gli e és ATG GCT TAT GCT GAT 15

GCT ATA TTT ACT GCA CGT AAA CTG CGT AAT CAG GAA

GAT TCT CTG TGG CTG GTT GCT CTG

AAT TCT TAT CGT CTA CAA GAT ATC CAA GGT GCC AAG

GCA GAA CAA AAG CTG CAA AAA CAT

AAA GTA CTT ACT CTG AAC CGT CAA GTA CGC CTG GGT CAA CTT GAA CTG TCT CGT AAC TCC CAG CTG TCT 60 CAG GGT GAA 108 CGT CAG GTA 153 GAA CTG ATC 198 CAG GGT TAA 243 TAG 246

u.m resíduo descxiadenilo, S é um resíduo desoxicitidilo e T ê um r resíduo desox iguan .1-esídup timidilo»

Outros compostos de DMA do invento mcluero roas iií#.o

GCT ATA TTT ACT GCA CGT AAA CTG CGT AAT CAG GAA GAT TCT ATG TGG CTG GTT GCT CTG

AAT TCT TAT CGT CTA CAA GAT ATC CAA GGT GCC AAG GCA GAA CAA AAG CTG CAA AAA CAT

ATG GCT AAA GTA CTT ACT ATG AAC CGT CAA GTA CGC CTG GGT CAA ATG GAA CTG TCT CGT AAC TCC TAT GCT GAT 15 CAG CTG TCT 60 CAG GGT GAA 108 CGT CAG GTA 153 GAA CTG ATC 198 CAG GGT TAA 243 TAG 246;

ATG CCG TAT GCT GAT 15 GCT ATA TTT ACT AAT TCT TAT CGT AAA GTA CTT ACT CAG CTG TCT 60 GCA CGT AAA CTG CTA CAA GAT ATC CTG AAC CGT CAA CAG GGT GAA 108 CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCC AAG GTA CGC CTG GGT CGT CAG GTA 153 GAT TCT CTG TGG GCA GAA CAA AAG CAA CTT GAA CTG GAA CTG GAA 198 TCG ATC GTT GCT CTG CTG CAA AAA CAT TCT CGT AAC TCC CAG GGT 243 TAA TAG 249; s

GCT ATA TTT ACT AAT TCT TAT CGT GCA CGT AAA CTG CTA CAA GAT ATC CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCC AAG GAT TCT ATG TGG GCA GAA CAA AAG CTG GTT GCT CTG CTG CAA AAA CAT ATG CCG TAT GCT GAT 15 AAA GTA CTT. ACT CAG CTG TCT 60 ATG AAC CGT CAA CAG GGT GAA 105 GTA CGC CTG GGT CGT CAG GTA 150 CAA ATG GAA CTG GAA TCG ATC 195 TCT CGT AAC TCC CAG GGT TAA 240 TAG. 243 ) A sscçlo qyp SQ segue proporc io do p i tl© inven to. Para fins d: tuna d esc riç sx isrgiS e coiho nvaxs· ajuda 14 na compreensão do invento.» com fornis divulyado e rsxvxno.içado aqui5 são definidos abaixo os termos e abreviaturas que se seguem *

Definições

bSRF ~ um pcu ipeptideo com actividade de factor de libertação do crescimento bovina·.·. hGRFí 1-78)0H -- um polipeptideo compreendendo os 33 smincácidos do extremo carbonilo do precursor de BRF humano» bSRF Dí.mero ~ um composto polipeptídico tendo dois compostos bSRF ligados cabeça com cauda» pb - um par de basss de DMA de cadeia dupla» cI857 - um gene codificador de um repressor sensível è temperatura do promotor lambda pL,·

Clonagem - g processo de incorporação de um segmento de K51MA num vsctor de clonagem de DMA recombinanta„

Sequência codificadora ·- a sequência de DMA num gene que codifica a sequência de resíduos ds aminoácidos da proteína > expressa pelo gene ou no caso de genes de rRNA ou tRNA, a sequência de RIMA do rRSMA ou tR!MA expresso pelo qens»

Cosmídeo - um vector de clonagem de DMA recombinante que se pode replicar numa célula hospedeira do mesmo modo que um plasmideo mas que pode também utilizar cs mecanismos de empacota— mento de íagos* DHP ~ 2,,3-di-hidrGXÍprapilo,

Gene · um segmento de DMA que compreende um promotor, sequência activadora da transcrição, sequência codificadora e sequências reguladoras 3* colocadas de forma a conduzirem a expressão do produto do gene, quer seja. uma proteína Ce portanto necessariamente um mRNA), tRMA ou rRMA,= BRF -- um polipeptídeo com actividade do factor de libertação da hormona de crescimento» GRFC1 -29>MH.-, - a porção mínima de BRF que é necessária para potência total» Nível de expressão elevada em E. coli - a produção de um análogo de GRF codificado por um gene clonado em níveis tais que o produto do gene á detectável por coloração com azul Coornas--sie» F Composto de DMA isolado — qualquer sequência de DNA5 construída ou sinntetisada, que è distinta do DMA genómico do organismo em que aparece,. pL — o promotor do lado esquerdo do bacteriófaqo lambda»

Promotor ·· uma sequência que dirige ou inicia a transcrição de DMA»

Vedar de clonagem de DNA recombinante - qualquer aqente de replicação autónoma ou de integração, inc Iuindo 5 mas nSo estando limitado a3 plasmideos.. compreendendo uma molécula de DMA a que uma ou mais moléculas de DNA podem ser ou foram adicionadas»

Vector de expressão de DNA recombinante - qualquer agente da replicação autónoma ou de integração5 incluindo» mas não estando limitado a, plasmideoss compreendendo um pronsotor e outras sequências reguladoras colocadas de forma a conduzir a expressão de um segmento de DNA que codifica um polipeptideo ou RIMA *

Sequência de DNA recombinante· - qualquer sequência de DNA excluindo o cromossoma hospedeiro a partir da qual deriva a sequência de DMA, a qual compr.sende uma sequência de DNA que foi isolada;, sintetizada ou parcialmente sintetizada»

Vector de DNA recombinante - qualquer vector de clona-gem ou expressão de DNA recombinante..

Fragmento de restrição - qualquer molécula de DNA linear gerada pela acção de uma ou mais enzimas»

TcR *·· o gene que confere resistência & teiraciclina, também usado para designar o fenótipo ds resistência à tetraci-clina.

Terminador da transcrição - uma sequência da DNA que assinala -s terminação de DNA pela. RNA—polimerase» uma célula hospedeira recipiente que

Transformante ~ sofrsu transformação„

Transformação ~· a introdução de DMA numa célula hospe-deira recipiente pua a1 tara α genótipo s resulta numa aiteraçao na célula recipiente,

Sequência de activação da tradução — um-a sequência de DNA reguladora que quando transcrita para mRNft, promove a tradução de mRNA em proteína. hd longo do documento são usadas abreviaturas de três letras para os aminoácidas.

Os mapas de sítios de restrição e funções apresentados nas desenhos juntos são representações aproximadas dos vsctorss de DNA recomi3inante discutidos aqui, A informação acerca dos sifeios ds restrição não á exaustiva? portanto5 pode haver ma is sítios de restrição de um determinado tipo no vector que não estio apresentados no mapa.

Figura 1, Um mapa de sítios de restrição e funções do plssmideo p!~ISÍ9®,

Figura 2, Um mapa de sítios de restrição e funções do rplasmídeo p-HS451,

Estão incluidos no presente invento polipeptídeos com actividade de libertação da hormona de crescimento CSRF5 que são I expressos em níveis elevados em E_coli_ e que não requerem clivagem in.........yitro para ser acfcivo. Os compostos são também produsidos por qualquer método de síntese,, incluindo síntese de pept.-i.deos ensxmatic-as em solução,, semi—sintática e em fase sólida. Alguns dos compostos polipeptídicos do invento (os que começam com arginina, acida aspártico, glutaffiina5 histidina ou

fsnilalanina.) requerem remoção in.__vitro de uma metianina no inicio se forem produzidos por métodos recomolnantes* 6RF é útil para estimular a libertação da hormona de crescimento» Os compostos do presente invento sSo preferidos para uso veterinário, particular/nente em gado,. porcos, carneiros, galináceos e peixes» Também são prporcionados compostos de DMA que codificam polipeptídeos SRF* Estes compostos estão apresentados no sumário do invento»

Os poiipeptídeos podem ser divididos em várias classes dependendo dos amínoácidos escolhidos para A, Os compostos em que A começa com metionina e X â uma cadeia de aminoácidos com um comprimento de aproximadamente 31 ou mais são produzidos em níveis elevados em E. col1» A metionina inicial foi clivada pela bactéria se o segundo aminoácido for alanina, glicina, prolina ou serins, dando moléculas que rst§'m a.ctividade SRF» Os compostos em que A começa com Met-Pro partilham esta caracteristica» Patente U»S» 4,782,139, publicada em í de Novembro, 1988, descreve compostos tendo a fórmula H-X-Pro-Peptídeo, em que X ê o resíduo de um aminoácido natural5 coma intermediários de peptídeos biologicamente activos» W Compostos em que A não comece com metionina foram feitos por-métodos sintéticos, incluindo síntese de peptídeos em fase sólida ou técnicas recombinantes se a metionina iniciadora for removida» A metionina é removida in vivo por E» çoii se o

1 segundo aminoácido for alanina, glicina, prol iria ou ssrina» A mecxonina miciaQora. pode ser removida in_vitro com brometo de cianogènio quando a metionina na posição 27 è substituída por leucina, serina ou valina»

Os compostos com extensões W—termineis b«m actividade GRF, 3s bem que os compostos onde A é Mel são fracamente estivos, A actividads dos compostos prolongados no extrenso N é surpreendente faes a trabalhos anteriores, os quais descrevem que extensões com aminoácidos na posição & destrói a actividade GRF, Ling et al , , BiDChem,; Biophys, Res, Gommunn 122%3Θ4< 19S4). Os compostos podem ser alquilados ou hidroxialquilados para aumentar mais a actividade BRF,

Uma outra classe de compostos polipeptidicos não tem actividade SRF mas ê útil para criar análogos que a possuam* Quando A é mstionina o composto resultante pode ser expresso em níveis elevados em E, coli.. A metionina é removida para dar compostos destirosina (compostos em que a alanina na posição Ξ é oextremo amina) que podem ser usados como substratos para a criação de compostos com fracçõss diferentes de tirosina na posição L Um exemplo de uma fracção que pode substituir tirosina na posição :i é desNH^-tirosina.

Todos os compostos peptidicos podem ser feitos por síntese peptidica em fase sólida ou por métodos recomhinantes. Ambos os métodos estão descritos na Patente U,8, 4,617,149, aqui incorporados como referência* São preferidos métodos recombinan— hs-3 caso se pretenda um nível elevado. Um método geral para a construção de qualquer sequência de DMA pretendida é proporcionado em Brown et......alHethods in EnsvmQloqv 68si09 (1979), aqui incluido como referência,

Alguns do~- compostos polipeptidicos do invento podem ser produzidos em níveis elevados em E, coli, A expressão em níveis elevados dos compostos do invento podem ser conseguidos quando X e uma cadeia de aminoâcidos de comprimento superior a cerca oe õt), A caractsrística crucial das cadeias definidas por X é q seu comprimento» As cadeias devem ser de um comprimento tal que o composto evite uma degradação significativa por proteases de E_» _ççy,i» Esta degradação é um problema bem conrsecida de trabalhos anteriores» Calcula-se que um comprimento de cadeia suficiente seja de aproximadamente 6Θ aminoácidos <comprimento total do composto expresso)»

Tentativas anteriores na expressão de 8RF em E» coli foram insatisfatórias» 0 primeiro prohlsfiía, encontrado com a expressão directa». foi um rendimento muito baixo de GRF» A ^Patente li»8» 45728=:609 íBhatt et al..) - Bhatt et al» parecem ter produzido 25 nmoles/Iitro de GRF» Os compostos do presente invento em que X é uma cadeia de aminoácidos de comprimento superior a cerca de 3Φ foram expressos direetamente em níveis que vão atê 103 pmoles/litro após remoção in vivo da metionina inicials um acréscimo de aproximadamente 40OT vezes relativamente ao obtido por Bhatt at al» A expressão por outros investigadores de GRF fundido com outros polipeptídeos tem dado grandes· quantidades do composta» Wa entanto5 a clivagem in vítro á necessária para gerar uma molécula activa, devido à fusão com u.ma outra sequência polipeptidica que è necessária para se conseguir níveis de expressão elevados» Villa et al„„ Eur» J» Bíochem» 171s137 ll988)s Sela et a 1 „ Gene» 88κ 129 (1989): Publicação do Pedida Pbe Patente Europeia ©199013» 0 presente invento proporciona compostos polipeptídicos que podem ser direetamente expressos em níveis elevados em E„_ I ESJdLf nã'o requerendo o passo ds clivagem in vitro para ser actxvo» us compostos do xnvento em que A começa com slanirts, glxcina, prol ma ou ssrina são expressos com uma metionina xnxcxaoora ligada, assam como o são todas as proteínas produzidas Eii^çoli» A metionina é removida por metionina-aminopeptidasa endógena da bactéria para dar o composto actxvo»

Um ,ool ipeptídso preferido do invento tem uma cadeia de aminoácidos na posiçlo X derivada da molécula precursora de SRF humana a Bubler et ai „ „ Proc« Nat9i Acad··. Sei» USA 80S43Í1 (1983).. A actividads desta molécula é surpreendente pois os precursores sao qaralmente inactivos5 permitindo assim que a célula regule os níveis do composto activo através do passo de clivagem» Consultar Biraud et aIM 124sl711 (1989)? Fisher and Scheller,. J. Biol-

Chem, 263516515 (1988)s Smith e Funder, Endocr._____Rev 9; 159 (1988)*As referências respeitantes ao precursor de BRF nSo sugeriram que sle seja activo. Hasinier et ah , Na tare 3105413 (1985)h Ilayo et al ,=,, Nature 3Θ6586 C1983) ?t Slayo et aL Proc·: Mat„ Acad·, Sei » USft 8054311 (1983).

Um composto polipeptidico especialmente preferido do invento compreende a íraeção do estremo carbonilo do precursor de SRF humano com leucinss substituídas pelas metioninas* Este composto á AIa—Tir—A1a—Asp—A1a—11e—Fen—Tre—Asn—Ser—Ti r—Arg-Li s—Va1—Leu—Tre— © 5 ΙΘ 15 01n-Leu-Ser-A1a-Arg-L is-Leu-Leu-Blη-Asp-ϊ1e-Met-Asn-Arg-S1n-B1n— 20 25 30

Psii-61u-Arg~A5n~Bln-Giu-Bln-§3ii-Ala-Lis-Vai-Arg-Leu-eii-Arg-ein— 35 40 45 V a1—Asp—Ser—Leu—Trp—A1a—G1u—61n—Lis—B1n—Leu—G1u—Leu—61u—Ser—11e— 50 55 è© | Leu—Vai—Ala—Leu—Leu—Bln—Lis—His—Ser—Arg—Asn—Ser—Bln—BIi« 65 70 75 A alquilaçáo desta molécula de forma a nue ds grupos ism3.ua livres cis alanina na posição 0 e li si nas na posiçSes 12?

e 7@ 21, 41, 56 e 7@ sejam substituídas por ,3-di-hidroKipropi 1 o dá um composto que é ainda ma .is activo & especial mente preferido»

Outras campastas preferidas da inventa sãa A1a—Ti t—A1a-fisp-Aia—Ile-Fen-Tre-Asn—Ser-Tir-Arg-Arg—Val-Leu—Tre-® 5 10 15 G1n—Leu—Ser—ft1a—Arg—Arg-Leu—Leu—S1n—Asp—I1e—Leu—Asn—Arg-G1n—61n-2Θ 25 30

Sli-Blu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gli-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-Bli-Arg-Bln-35 40 45

Va1-Asp-Ser-Leu-Trp-A1a-G1u-G1n-Arg-B1n-Leu-Blu-Leu-G1u-Ser-I1e-50 55 6Ô

Leu—Va1-A1a-Leu-Leu-θIn-Arg-His-Ser-Arg-Asn-Ser—Bln-Bli; 65 70 75

Pra-Tir-Ala-Asp-A1a-I1e-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg-Lis-Va1-Leu-Tre— 0 5 10 15 S1n-Leu-Ser A1a-Arg-Lis-Leu-Leu-B1n-Asp—I1e-Leu—Asn-Arg-61n-61n— 2€» 25 3©

Bli—Slu—Arg—Asn-Gln—Glu-Gln-Bli—Ala—Lis—Vai—Arg—Leu—Gli—Arg-Gln— ' 35 4© 45

Va1-Asp-Ser-Leu-Trp-A1a-B1u-B1π-Lis-G1n-Leu-61u-Leu-G1u-Ser-I1e— 50 55 60

Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Sln-Lis-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Bln-Gli; 65 7Θ 75

Pro-Ti γ-Α1a-Asp-Ala-11e-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg-Lis-Va1-Leu-Tre— 0 5 10 15

Bln-Leu-Ser—Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-Bln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Bln-Gln— 2Θ 25 30

Gli-Slu-Arg-Asn-Gln-Slu-Bln-Bli-Ala-Lis-Val-Arg-Leu-Tir-Ala-Asp— 35 4Θ 45 A1a-I1e-Fen-T re-Asn-Ser-T i r-Arg-L is-Va1-Leu-Tre-G1n-Leu—Ser-Ala— 5Θ 55 60

Arg—Lis—Leu-Leu—Sln—Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Sln-Sln-Sli-Slu-Arg-Asn—

65 70 G1n—G1u—G1n—G1i-A1a—Lis-Va1—Arg—Leu; 75 85 80

Met Ala Tir—Ala—Asp—Ala—Ile—Fen—Tre—Asn—Ser—Tir—Arg—Lis—Vai—Leu— 0 5 10

Tre-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lis-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Bln— 15 20 25 30

Gln-Gli-Blu-Arg-Asn—Gin—Glu—Gln-Gli-Ala-Lis-Val-Arg—Leu—Bli-Arg— ò5 4Θ 45 B1n-Va1-Asp-Ser-Leu-Trp-A1a-Q1u-S1n-Lis-61n-Leu-G1u-Leu-Glu-Ser— 50 55 60 I1e-Leu-Va1—A1a-Leu—Leu—G1π—Lis—His-Ser—Arg—Asn-Ser—B1n—Gli; ) 70

Met—Ala—Τir-Ala-Asp-Ala-ϊ le-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir Arg-Lis-Val-Leu 0 5 10

Tre—Bln—Leu—Ser—Ala—Arg—Lis—Leu—Leu—Sln—Asp—Ile—Met—Asn-Arg-Sln 15 20 25 30 61n-eii-eiu-Arg-Asn-Bln-01u-Sln-01i-Ala-Lis-VaX“Arg-Leu-Gli-Arg— 35 4& 45 81 n—Va1-Asp-Sar-Met-Trp-A1a-S1u-BIn-Lis-Bln-Mei-B1u-Leu-B1u-Ser— 50 55 60 ) 11 e-Leu-Va 1 -A 1 a-Leu.-Leu.-B 1 n-Lis-His-Ser—Arg-Asn-Ser-S ln-Gli i 70 75

Pro-T ir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Ser-Tir-Arg-Lis-Val-Leu-Tre— 0 5 10 15

Gin—Leu—Se r—A1 a.—A rq -L i s—Leu-Leu-G 1 n - As p— 11 e—Me t—Asn—Arg—G1 n—61 π— 20 25 3@

Bli-Glu—Arg—Asn-Gln-Glu—Sln-Gli-Ala-Lís-Val-Arg-Leu-Bli-Ara-Sln— 35 40 45

Va1-Asp-Ser Met-Trp-A1a-Glu-S1n-Lis-B1π-Met~B1u-Leu-G1u-Ser-I1e__ 50 55 ¢50

Leu—Vai—Ala—Leu—Leu—Gin—Lis—His—Ser—Arg—Asn—Ser—Bln—Gli ; #a

65 70 75

desNH^-T ir-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-Asn-Ϊ1r~Arg-Arg-Vai-Leu- 3 1®

Tre-SlnHLeu-Ser—Ala-Arg-Arg-Lsti—Leu—Gin—Asp—I le—Leu—Ser—Arg—Gin— 15 2© 25 3Θ

Gin—Gli—Glu—Arg—Asn—Gin—Glu—Gin—Gli—fila—Arg—Vai—Arg—Leu—Gli—Arg 35 4Θ 45 G1n—Vai —Asp—Ser—Leu—Trρ—A1a—Asp—SIn—Arg—G1n—Leu—A1a—Leu—Glu—Ser 5Θ 55 6Θ I1e—Leu—A1a—Tre—Leu—Leu—S1n—S1u—His—Arg—Asn—Ser—G1η—Bli. ) 65 70 75 SSo também preferidas as versões alquiladas e hidroxi-slquiladas destes compostos, especialnsente sempre que os grupos amiria livres estejam substituídas com 2s3-di~hidro>íiprapiIo!, Estão incluídos nos compostos deste invento sais de adição de ácidas r.Sa tóxicos e farmacsuticamsnte aceitáveise sais de ácidos csrboKílicos não tóxicos e farmaceuticamante aceitáveis. 0 termo "sais de adição de ácidos farmacsuticamente aceitáveis e não tóxicos" engloba sais de adição de ácidos §PorgS'nicos e inorgâ‘nicos"incluindo por exemplo os preparados a partir de ácidos tais como clorídrico, fluorídrico, sulfúrico, sulfónico, ta r tá ri. cafumárica, broroídrica. glicálico, cítrico, maleica, fosfórico, succinico, acético, nítrico, bensóico, I ascórbico, p—to1uenossu1fónico, ben jsncssuIfón ico, naf ta1enossu1-Tónico, propiónico e similares. De preferencia, os sais- de adição de ácidos são os preparados a partir de ácida clorídrico, acético ou sucoinico.tóualquer um dos sais atrás referidos foi preparado por métodos convencionais. 0 termo Ksais de ácido cartaOKs.1 ico" inclui» por exemplo , sais cie amina, amónio, amónio quaternário, metais a leal mos e metais aealinos terrosos tais como cálcio» magnésio, sódio, potássio e li tio e similares.»

0 presente inventa também praparciona uma composição farmactutica compreendendo como agente activo um composto poli-peptidico ou um seu ácida farmaceuticamente aceitável ou sal de rfe adição de ácido carboxílico, em que o referido composto polipspfcidica tem a fórmula A-Ala-Asp-Ala-Ile-Fen-Tre-Asn-R—Tir—Arg-B-Val—Leu-U-5 1Θ 15

Gin—Leu—Ser-Ala—Arg—D—Leu—Leu—Sln—Asp—Ile—E-Asn-Arg-X5 2Θ 25 em que A é Met, Ala-Tir, desNH,, BIn-Tir, Bli-Tir, His-Tir, Met-Tir, Fen-Tir, Pro-Tir, Ser—Tir, Ala-Ala-Tir, Arg-Ala-Tir, Asp-Ala-Tir, Fen-Ala-Tir, Pro—Ala—Tir, Pro-Als-Tir, Pro—Pro—Tir, Met-Ala-Tir, Met-Arg-Tir, Met—Asp—Tir, Met—Leu—'Tir, Met—Pro-Tir, , Met—Ser—Tir, liet—Ala—Ala—Tir, Met—Arg—Pro-Tir, Met—Asp—Pro-Tir, ^Met-Gli-Pro—Tir, Met—Fen—Pro-Tir e Met—Ser—Pro-Tir; B ê Arg ou Lisp C é Gli, Ala, Leu, Vai, Ile ou Tre? D é Arg ou Lis, E é Met, Vai, Leu ou Sers X ê NR-j ou um ou ma is aminoácidosp e nenhum,, um ou. ma is de um dos aminaácidos tendo um grupo -amina livre está I quimicamente modificado e um veiculo sólido ou liquido fanssesu-ticamente aceitável» que se

Nd presente invento também á proporcionado um método para indução da libertação da hormona da crescimento cractsriza pela administração de uma quantidade eficaz de um composto polipeptidico representado pela fórmula A-A1s-Asp—A1a-IΙε-Fen-Tre-Asn—R—Tir—Arg—B—Vai—Leu—C— 5 10 15 61n-Leu-b'er-Ala-Arg-D-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X; 2© 25

Peai que A é Met, Ala-Tir, desNii,, lãln-lir, Sli-Tir, His-Tir, Met—Tir, Fen-Tir, Pro-Tir, Ser-Tir, Ala—Ala-Tir, Arg-AIa-Tir, Asp—Ala-Tir, Fen-Ala—Tir, Pro—Ala—Tir, Pro-Ala-Tir, Pro-Pro-Tir, Met-Ala—Tir, Met-Arg—Tir, Met-Asp-Tir, Met—Leu—Tir, Met—Pro-Tir, Met-Ser-Tir, Met-Ala-Ala-Tir, Met-Arg-Pra-Tir, Met-Asp-Pro-Tir, Met—Gli-Pro—Tir, Met—Fen—Pro-Tir e Met—Ser—Pro—Tir? B é Arg ou Lis; C ê Sii, Ala, Leu, Vai, Ile ou Tre; D é Arg ou Lis, E é Met, Vai, Leu ou Ser; X é NH0 ou um ou mais aminoàcidos; e nenhum, um ou mais de um dos aminoàcidos tendo um grupo amina livre está quimicamante mod.1 fiçado.

Os compostos polipeptidicos do invento podem ser .testados em numerosos sistemas» Um ensaio in vivo é realizado em gratos anestesiados com pentobarbital sádico» Wehrenberg et al-, Bigchem..._..iiophys«_ Res. . Commun. I©9s382 <1982). A libertação da hormona de crescimento é medida in vitro com células da pituitária anterior de rato* Heiman st aL,; Endocrinol. 116s41© (1985). ) Realisaram-se também ensaios em carneiros castrados como descrito nos EKemplos abaiKO,

Os compostos de DMA do presente invento codificam compostos polipeptidicos do invento, έ do conhecimento qeral com (30 construir uma sequincis de DMA que codificará uma

Pará produzir o polipeptí··· a sequência de DNA num de determinada sequência de aminoácidos. dso pretendido devs~Se apenas inserir muitos vectoí· es de expressão de DNA recombinante conhecidos. A ssqiA-ancia cDuificaaora deve ser ligada operacionaimente a um prometa»· e sítio de ligação ao ribossoma que funciona na célula hospedeira. Um vbc uor preferido deriva do plasmídeo pHS19® de E» ÇQjuLs ~ d^l compreende o gene TcR5 o repressor c1857 de lambda e o promotor pL oe lambda. 0 plasmídeo pHS19® foi depositado em Not tbe»n neyxoual Research Laboratories com o número de acesso NRRL B-1S41W (data d» depósito? 9 de Setembro, 1986).

I A sequência ter um sítio Xbal no de DNA pretendida é extremo 55 da cadei instruída de forma a codificadora e um sítio BamHI DNA vector, no extremo pHS i 99 foi 3’ da cadeia codificadora. Par digerida com EcoRI» Os extremou gerar o protubs— rantes sao então preenchidos subsequente com BamHI g Xbal codificadora de GRF construída e o plasmídeo rsligado A digestão dá o plasmídeo vector. A sequência pode ser então inserida, no vector» u plasmídeo r esu11 DNA inserida era a nte foi designado pH3451 quando a sequtnc sequência de DNA preferida do invento. a de Esta

sequência e ATG GCT TAT GCT GAT 15 GCT ATA TTT ACT AAT TCT TAT CGT AAA GTA CTT ACT CAG CTG TCT 60 GCA CGT AAA CTG CTA CAA GAT ATC CTG AAC CGT CAA CAG GGT GAA 108 CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCC AAG GTA CGC CTG GGT CGT CAG GTA 153 GAT TCT CTG TGG GCA GAA CAA AAG CAA CTT GAA CTG GAA CTG ATC 198 CTG GTT GCT CTG CTG CAA AAA CAT TCT CGT AAC TCC CAG GGT TAA 243 TAG. 246

29 I

As outras sequências de DMA c ^í~01,í.;j1i_ljs do invento sao»

rh"íF"j3 ?ras dos compostos ATG GCT TAT GCT GAT 15 GCT ATA TTT ACT AAT TCT TAT CGT AAA GTA CTT ACT CAG CTG TCT 60 GCA CGT AAA CTG CTA CAA GAT ATC ATG AAC CGT CAA CAG GGT GAA 108 CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCC AAG GTA CGC CTG GGT CGT CAG GTA 153 GAT TCT ATG TGG GCA GAA CAA AAG CAA ATG GAA CTG GAA CTG ATC 198 CTG GTT GCT CTG CTG CAA AAA CAT TCT CGT AAC TCC CAG GGT TAA 243 TAG 246 ATG CCG TAT GCT GAT 15 GCT ATA TTT ACT AAT TCT TAT CGT AAA GTA CTT ACT CAG CTG TCT 60 GCA CGT AAA CTG CTA CAA GAT ATC CTG AAC CGT CAA CAG GGT GAA 108 CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCC AAG GTA CGC CTG GGT CGT CAG GTA 153 GAT TCT CTG TGG GCA GAA CAA AAG CAA CTT GAA CTG GAA CTG GAA 198 TCG ATC GTT GCT CTG CTG CAA AAA CAT TCT CGT AAC TCC CAG GGT 243 TAA TAG 249

I

—

ATG CCG TAT GCT GAT 15 GCT ATA TTT ACT AAT TCT TAT CGT AAA GTA CTT ACT CAG CTG TCT 60 GCA CGT AAA CTG CTA CAA GAT ATC ATG AAC CGT CAA CAG GGT GAA 105 CGT AAT CAG GAA CAA GGT GCC AAG GTA CGC CTG GGT CGT CAG GTA 150 GAT TCT ATG TGG GCA GAA CAA AAG CAA ATG GAA CTG GAA TCG ATC 195 CTG GTT GCT CTG CTG CAA AAA CAT TCT CGT AAC TCC CAG GGT TAA 240 TAG. 243

A transformação do plasmídeo ligado numa estirpe de colj resulta numa célula rscoobinants capas de expressar um composto polipeptídico do invento» A célula é cultivada a .32 UC até se pretender expressar o composto polipeptídico do invento, A célula foi cultivada a 32°C até se pretender expressar o composto polipeptídico» 0 repressor c‘ÍS57 torna-se inactivado quando da alteração da temperatura de crescimento para 42°C e o promotor pL for desrsprimido. Uma grande quantidade de polipeptideo tendo actividads 6RF é então produzida em níveis que podem ir até cerca de :15¾. da proteína celular total, D polipeptideo activo pode ser ^purificado por técnicas bem conhecidas dos familiarizados com a matéria e descritas nos Exemplos que se seguem,

Na administração parenteral dos compostos polipsptídi-cos deste invento., as formas farmacêuticas adequadas para injec-ção incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pés estéreis para reconstituição em soluções injectáveís estéreis ou dispersões,, 0 veículo pode ser um solvente ou meio dispersante contendo por exemplo água, etanol, poliol ípor exemplo glicerol, prop.ilenoglicol , polietilenoglicol liquido s similares)9 suas misturas adequadas e óleos vegetais, Uma fluidez adequada pode ser mantida por exemplo através da utilização de um revestimento i tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partículas J^iscessário no caso da dispersão e pela utilização de tsnsioacti-vos, A prevenção da acção de microorganismos pode ser assequrads através de vários agentes antibacterianos e anti-fangicos, por exemplo, parahenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e simila-! res.i muitos casos será desejável incluir agentes isotónieos, por exemplo açúcares, cloreto de sódio e similares, A absorção proiongaoa da forma farmac&utica injectável pode ser conseguida peia utilização de agentes que retardam a absorção, por exemplo manostearato da alumínio e gelatina»

Soluções injectáveis estéreis podam ser preparadas através- da incorporação dos compostos deste invento na quantidade necessária do solente adequada com várias outros outros ingredientes conforme desejável·. Caso se pretenda e para uma distribuição msis eficaz, os compostos podem ser incorporados em sistemas de libertação lenta ou dirigida tais cerne matrizes de polímeros, lipossosnas e mierosferas. Os compostos podem ser libertados através de sistemas de libertação mecânica, bombas osmótiess ou qualquer outro sistema de libertaçlo ou sistema que proporcione que proporcione libertação continua ou pulsátil.

Doses dos compostos deste invento são administradas a um recipiente num período durante o qual se pretende a estimulação da da libertação da hormona de crescimento, 0 peso do recipiente e modo de administração terão influência no tamanho da dose necessária para induzir uma resposta particular, As doses preferidas em carneiros são cerca de 0,1-3,0 mg/dia; uma dose preferida é cerca de 1,# mg/dia, Para gado as doses preferidas são cerca d.e 6,5-12 mg/dia. Uma dose especialmente preferida è 3 mg/dia. é especialmente vantajoso formular os compostos deste .invento numa forma de dosagem unitária para facilidade de admi-™ίistração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem como aqui é usado refere—se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o índividuo a ser tratado, L-ada unidade contem uma quantidade predeterminada do composto ) calculado para produzir o efeito terapêutico pretendido em associação com o veicula fsrmacêuticamente aceitável, A forma de aosaqe® unitária específica é ditada e es-tã directamente dependente de <a) características únicas da composição particular e íb) efeito terapêutico particular a ser conseguido.

Os exemplos que se seguem sSío ilustrativos desce invento,. Eles não pretendem limitar o seu âmbito»

Exemplo i

Construção do Plasmideo PHS451 0 plasmideo pHS451 é um vsctor de expressSc de DMA ^recombinante que produz grandes quantidades do composto poiipep-tidico preferido do invento quando a célula hospedeira & cultivada nas condições adequadas»

Um liofilizado de E» coli k!12 RV308/pH819# pode ser obtido ao Northern Regional Research Laboratories <NRRL>, Pearia,. IL 6-1604, com o número de acesso NRRL B-· 1841.0 (data de depósitos 9 de Setembro, 1988) s usado directamente como a “cultura" no processo abaixo» Na Figura 1 dos desenhos juntos está apresentado um mapa de restrição a funções do plasmideo pHSÍ9£?„ Dez ml da caldo TV í i€>q da triptona, 5 g NaCl e õ g de extracto de levedura por litro) contando 5pg/ml de tatraciclina foi inoculado com a cultura de E. coli K12 RV30S/pHSi90 e incubado com arejamento a *5©°C durante a noite C15-18 horas).. A cultura resultante foi usada como fonte da plasmideo pH8190»

Um litro da caldo TY contendo 5ug/ml de tetraciclina I foi inoculado com uma cultura de E_» coli K12 RV308/pH81?0 e incubado com arejamento a 32°C durante a noite (15-18 horas).. A cultura foi então centrifugada a 52ΘΘ rpm numa Sorvai1 CDupont Co» Instrument Products, Biomedical division, Mewtown, CT 06470} rotor GsA durante 10 minutos a 4°C para sedimentar as células» 0 soorenadante resultante foi rejeitado» 0 sedimento de células foi 34

ressuspenso em 28 ml ds uma soiuçãu cuntwido 'Z'o% de sucross e ov mH ED7A (ácido dietilenodisminatetracético), Cerca de 1 ml de uma solução da 2© mg/ml de lisocima em @s25 Π Tris-HCl (cloreto de trisíhidroximetillaminometano), pH = S,©, e cerca de 1,5 ml de EDTA ©„5H pH - 8,θ» foram adicionados s misturados com a suspensão celular, A mistura resultante foi incubada em «elo durante 15 minutos. Três ml ds solução da lise (preparado pela mistura de 3 ml de 1©% Triton X~i@© (Rohm & Haas)? 75 ml de ©,25 H EDTh, pH -8,©? s 7 ml ds água) foram adicionados ás células tratadas com lisozima com agitação suave, A solução resultante foi incubada em J^galo durante mais 15 minutos, □s detritos celulares foram removidos da solução por centrifugação a 17 ΘΘΘ rpm num rotor Sorvai1 SS34 durante cerca do 45 minutos a 4*C„ Cerca de 28?6g de CsCl e £?i ml de solução de brometo de stidio a 5 mg/ml foram adicionados a ?r;3ô ml de sobre™ naoants. Em seguida o volume foi ajustado a 4& ml com água e a solução decantada para um tubo de ultracentrifuga, 0 tubo foi fechado e a solução foi centrifugada a 49 5ΘΘ rpm num rotor Ti7© (Bsckman, 73è© M. Lincoln Avenue, Lincolnwood, IL 6©64é) durante sití horas, A banda de ρ-Iasmídeo resultante, visualizada com luz ultravj.oista foi isolada, extraída com isoprapanol saturado com UsCl para rempover o brometo de etídio e dialisado contra três "J^mudas de k2© volumes ds tampão TE <10 mH Tris-HCl, pH = 7S5 a 1 mH EiTTAí = 0 dial isado foi colhido? em seguida dois volumes de stanol s ©,@5 volumes de solução ds acetato de sódio 311 foram adicionados» A mistura de stanoi foi arrefecida a —2£j°C e ο DfslA ds pj.asmidso foi sedimentada por centrifugação a 1© ΘΦΦ rpm durante ·..>£ minutos num rotor Sc34 a — 1 ©°C, 0 sedimento resultante tai ressuspenso em ~1 ml ds tampão TE e depois extraído com um volume igual de uma mistura de fenolsclorofórmio (1 s 1, v/v)» 0 DMA na fase aquosa foi recuperado pala adição de ©„1 volume de acetâco o-e sódio 3r-1 e V volumes de etanol, seguido de incubação &

~20°C durante ~3€> minutos e centrifugação a 15 ΦΘ# rpm num rotor SS34 durante 2Θ minutos, 0 sedimento de DMA resultante foi lavado primeiro com etanol a 7Θ% e depois com íΘΘΧ de etanol e seca,

Kl,® mg de DMA do plasmidea pHS190 obtido pelo processo ^ acima foi ressuspenso em 1,5 ml de tampão TE Θ,ΙΧ s guardado a -2®°C. Cerca de 1Θ pg de DMA do plasmidso pHS190 foram digeridos com a encima de restrição EcoRI ("10 unidades) numa reacçSo contendo o DMA em tampão EcoRI (Ιβθ mH Tris-~HC1? pH 7,5, 5 mil HgCI„;! 5© mn NaCl), A rescçlo foi incubada durante 2 horas a ^37 *C,

Para converter os extremos protuberantes 511 em sm extremos csrses adicionou-se dMTP (dATP, dCTP, cISTP sTTP ©,5 mH cada) juntamente com 1-5 unidades do fragmento Klenow (Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castle^ay Dr»« P,0, Box 50816, Intíianapolis, IN 4625Θ), A reacção foi incubada a 3©°C durante 15 minutos, depois a encima foi inactivada por tratamento a 75°C durante 1© minutos, A mistura de reacção foi extraida com fsnol, fsnol/clorofórmio, clorofórmio s depois precipitada com etanol, 0 plasmídeo foi então ressuspenso em 5© μ de uma solução contendo 4Θ mH Tris HC1, pH 7,5, i& mH MgCl,,, 1Θ mH Iditiotrsitol ÍDTT), 0,5 mM de adenosina-trífosfato e í ϋ de DNA-Iigase de T4 (Boehringer-Hannheim Biochemicals, 7941 Castle-way urxvSp Indianapolis, Il'M 46250), A reacção foi. incubada a 14°C durante a noite. A mistura ligada foi usada para transformar E. coli KÍ2 RV308 (podendo ser adquirida à NRRL como NRRL B-15624? data de depósitos 2S de Setembro, 1983) seguindo o processo de Haniatis Molecular Cloninq 250-251 (1992), Cem ml de caldo TY num frasco as ml fai inoculado com um ml de uma cultura crescida

durante a noite de RV308» As células foram cultivadas com agitação forte a 37 °C afcé uma densidade de -5 x 1Φ' células /ml» A cultura foi colocada em gelo durante dez minutos, depois csntri-fugada a 4ΘΘΘ >·; g durante 3 minutos a 4°C» As células foram ressuspeRsssen) 5® ml de CaC 1,_ em 1Θ mM Tris”HCls pH -8?õ? arrefecido em gelo,, As células foram novamsnte incubadas em gelo durante 15 minutas e recentrifugadas» As células foram então ressuspensas em 3?3 ml da solução de cloreto de cálcio» A mistura de ligação foi adicionada foi adicionada a 2®ô μ! das células e incubadas em galo durante 3® minutos» hs células foram então transferidas para um banho maria a 42 °C durante 2 minutos,, Um ml de caldo TY foi então adicionado ao tubo e as células foram incubadas durante í hora a 3©°G* Quantidades de μΐ foram então semeadas em placas de s.qar TY (caldo TY + 155% de agar) contendo 5 pg/mi de tetraciclina e cultivadas durante a noite a 30 °C. 0 plasmideo foi então ressuspenso em i® μΐ de água,, 0 vector foi gerado por digestão do plasmideo com Xbal e BamHI„ Cerca de ΙμΙ de Xbal (si® unidades) foi adicionado a ίθ μΐ de DMA de plasmideo (ísí® pg> e 5 μΐ de tampão Xbal 1©X (5®© mM Tris-HCl, ρΗ = 3W p lu© mM £vigCl.? e 5ΘΘ mM Ma Cl ) „ Após incubação a 37°C ^Surants 9® minutos» adicionou-se ®s5 μΐ de 5M IMaCl s 1 μΐ de .pbamHI í~l€i unidades) e a incubação continuou a 37°C durante mais 9© minutos,, A mistura da reacção foi então sujeita a electrofore-se em gel ds sgaross e o fragmento vector Xbal-BamH I K5S75 foi isolado por electroeluição seguido de precipitação com etanol« )

Sintetxzau-se a. sequência de DMA que se segue num sintetizador Applied Biosystems Model 38ΘΒ usando técnicas bens conhecidas dos f a m i 1 i a y, r i z a d os com a .matéria» A divisão da. sequência síti oligonucleótidos foi feita pelo processo de Brown et si_c» QãMliSDícL_i-0—Ed.2yma 1 oqy 68s 1Θ9 í 1979). A sequência da DMA

codifica um pcilipeptídeo pref©rides da invente em que A é Met-Ala--Tir, B é Lis, C é Tre, D é Lis, E é Leu e X é

Gln-Gln-Bli—61u-Arg-Asn—Sln—Blu-61n-Bii-ftla-Lis-Val”Arg--Leu-Gli— Arg-Sln-Val-Asp-Ser—Leu-1rp-A1a-B1u-GIn-Lis-G1n-Leu-81u-Leu-B Ϊu— Ser-I1e-Leu-Val-A1a-Leu-Leu-S1n-Lis-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gli.

CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCATATGGCTTATG 1868 —+---------+---------+---------+---------+---------+-------

TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTATACCGAATAC

CTGATGCTATATTTACTAATTCTTAXCGTAAAGTACTTACTCAGCTGTCTGCACGTAAAC 1928 —+---------+---------+---------+---------+---------+-------

GACTACGATATAAATGATTAAGAATAGCATTTCATGAATGAGTCGACAGACGTGCATTTG

TGCTACAAGATATCCTGAACCGTCAACAGGGTGAACGTAATCAGGAACAAGGTGCCAAGG 1988 —+---------+---------+---------+---------+---------+-------

ACGATGTTCTATAGGACTTGGCAGTTGTCCCACTTGCATTAGTCCTTGTTCCACGGTTCC

TACGCCTGGGTCGTCAGGTAGATTCTCTGTGGGCAGAACAAAAGCAACTTGAACTGGAAT 2048 --+---------+---------+---------+---------+---------+-------

ATGCGGACCCAGCAGTCCATCTAAGAGACACCCGTCTTGTTTTCGTTGAACTTGACCTTA

CGATCCTGGTTGCTCTGCTGCAAAAACATTCTCGTAACTCCCAGGGTTAATAG 2108 —+---------+---------+---------+---------+---------+

GCTAGGACCAACGAGACGACGTTTTTGTAAGAGCATTGAGGGTCCCAATTATCCTAG

físiS atr RV3 rss 0 DNA compreendendo a sequência codificadora foi então turado e ligado com o fragmento vector Xbal—BamHI construído -âs, A mistura ligada foi então transformada em E« coli Kl2 ©B como descrito atrás» 0 DMA de plasmideo dos transformantes istentes à tetraciclina foi analisada par digestão com enzimas de restriçãto para verificai' que o plasmitieo era pHB451„

Purificação de Análogos de GRF Produzidos em E. coli A» Expressão do Análogo de GhR esti h., coli E. coli KÍ2 RV308/pHS45'l foi cultivado ss caldo TY contendo Spg/ml de tetraciclina a 32°C até as células atingirem a fase logarítmica média» A temperatura da .mistura foi aumentada para 42°C e a incubação continuou durante cerca de 3 horas mais„ 0 rsprsssor sensível á temperatura cI857 do promotor pL de lambda, colocado de forma a conduzir a expressão do análogo de 8RF no plasmídso pHS45í, foi inactivado a 42°C, permitindo assim a expressão do análogo de BRF»

B- Isolamento de Grânulos contendo o análogo de BRF

Os grânulos contendo o análogo de GRF foram isolados» Primeiro, as células totais foram centrifugadas, depois ressus-pensas em água. a Í€>*C» A pasta de células foi homogenizada num ^lomoqenxzador Baulm a ΒΘΦ© psig» A pasta homogenizada foi então diluida em água e agitada dursnte 10 minutos, seguida de ajusta-menco do pH para 8,4-8,6 com hidróxido de sódio a 1©%» A mistura foi então centrifugada» Os sólidos representam os grânulos I contendo o análogo de SRF, os quais sao congelados a —7€*CtC até serem roais tarde usados»

C. Purificação final do análogo de b~RF

Os grânulos preparados no Exemplo 2B foram descongelados a 2~5*C= Qs grânulos foram solubilisados pela adição de dez volumes de ácido acético ureia 7ΤΊ seguido de 'nomogsniz-açSo durante 5-8 minutos» 0 pH foi então ajustado a 2,5-2,6 pela adição da ácido cloritírio a 1Θ%» A mistura foi agitada 12-15 horas a 2-5*0» A solução foi clarificada por filtração através de um filtro Sparkler revestido com um auxiliar de filtração Dicaii-te Spsedsx CSrefco, Torrsncs, CA) = A conductivida.de da solução foi reduzida para menos cie 4Θ0Θ pohms pela diluição com uma solução de ácido acético-ureia.

Preparou-se uma coluna de permuta catiènica usando resina Sepharose 8 (Pharmacia, 8ΘΦ Centennial Ave», F^iscata^ay, MJ Ô8854)» A coluna contem um litro de resina por 5Θ g de material = 0 material foi adicionado è coluna a um fluxo de 0,1 2 Ι/cm Vhr s lavado com 2 volumes de coluna de cloreto de sódio Θ5α!ί na solução de ácido acético-ureia» 0 análogo de SRF foi eluido com um gradiente linear de ©,25M a 1,6M de cloreto de sódio em ácido acético-ureia usando três volumes de coluna de cada sendo colhidas fracçSes de 0,1 volumes de coluna. As frac-PiSas contendo os análogos de SRF foram idsntifiçadas por conduti-vidatíe, O.D,,^·?^, HPI..C e electroforese em gel de poliacrilamida. As fracçSes foram então reunidas» às fracçSes reunidas foi adicionada um volume igual de acido acético-ureia. 0 material foi então aplicado numa coluna contendo resina S Sepharose em ácido acético-ureia com um tamanho suficiente para acomodar 5® g de proteína por litro de resina. 0 tluxo ê de θ,02 l/cav^/hr. As fre.cçSss com análogo de BRF foram eluidas por um gradiente linear de β»25Μ a í,2 M de cloreto sódio e® ácido acético-ureia» Colheram-se fracçSíes de volumes ds coluna» As fracçSes foram analisadas como anteriormente e as fracçSes contenda análoga ds SRF foram reunidas»

Preparou-se uma coluna de BephadeK B—15 (Pharmacia) em Θ„Θ2Μ glicina, pH 2,5 com um volume de coluna cinco vezes o volume das fracçSes reunidas» As fracçSes contendo o pico de D„0,__,foram isoladas» ,£ / £>

Preparou-se então uma coluna contendo a resina SP20SS CSsphaheads, Mitsubishi Chemical., Tóquio) em 10% acetonitrilo-~oso2M glicina, ρΗ 2,5» A solução contendo o análogo de SRF reunido foi ajustada a 1Θ% de acetonitrilo e adicionada à coluna a u=Ti fluxo de 1,5-2 volumes de coluna por hora,. A coluna foi Lavada com 2 volumes de coluna do tampão acetonitrilo-glicina. 0 análogo de GRF foi eluida por um gradiente formado tr'ê's volumes de coluna de 10% acetonitri1ο~Θ,ΘΞΜ glicina. As fracçSes contendo w5l volumes de coluna foram colhidas e testadas quanto ao análoga GRF, £ U material contendo o análogo de SRt- foi então sujeito a croiísatagrafia numa coluna de Sephadex G15 equilibrada em ácido acético Ôj,25M. 0 pico de D.0e^?6 foi então isolado e liofilizado tá ser mais tarde usado»

I

Exemplo 5

Di—hidroKipropiiacSfa do análogo de GRF

Uma fracçâo do análogo ds SRF preparado no Exemplo Ξ foi di-hidroxipropilado por tratamento com gliceraldeído na presença de cianoboro-hidreto de sódio essencialmente ds acordo com o processo de Acharya e Manjula, Biochsmistry 26π3524 (1987).

Cinco gramas do análogo preparado no Exemplo 2 foram dissolvidas em 60 ml de 1-propanol a 25% em ácido fluoroacético a 1% CPiares, Roekíord? IL) à temperatura ambiente com agitação. 0 pH foi ajustado a 8 com sls7 ml de hidróKido de sódio 5N. ft isto adicionou-se Θ,92 g de DL-gliceraldsido (Sigma Chemical Co=5 Box 14508;, St,, LouiSj MD 63178) e 0?B5 g de cianoboro-hidreto de sódio <Aldrich 5 Milwaukee, WI). A mistura foi agitada durante uma hora á temperatura ambiente. Uma coluna de 9k6S cm foi cheia com Ssphadex 8-1Θ (Pharmacia,, 8®€? Centennial Avenue_„ Piscataway, NJ 0íá8o4s em água < 0 material contendo o composto 8RF foi então lavado na jpolu.na com 10 ml ds propanol a 25%,= A coluna foi eluida com cerca de 1500 ml de Η,-,Ο» Colheram-se íracçSes de 24 ml controlando por tluoresc's'ncia com UV a ΞΒ® nanòsetros. Depois de colhida a quinquagésima fraeçao o tampão de eluição foi mudado de j-LjO para J.0A de acido acético,. As fracçBes do pico foram reunidas s 1 iof ilibadas

Exemplo 4

Ensaio do An-ái pqo de SRF e sua Forma Alquilada em Cordeiros Castrados

Dose cordeiros castrados pesando aproximadamente 65 Kg cada foram dotados de uma cârmia subcutânea atrás da omoplata direita s de uma cânula na veia jugular para remoção de sangue no lado esquerdo» 0 material infundido foi administrado na cânula subcutânea através de uma bomba Infu-Check ilVAC Corporation, P.O., Bom 85335, San Disco, CA 92121-1579) a uma velocidade de 2,Θ mi/hr„ A duração da infusão foi de 12® horas» Os psptí.deos foram dissolvidos em 5 ml de 0,®1M H^PQ,, e diluídos para 13®5 ml com NaR-jPQ^ contendo 0,1% de albumina do soro ovina e 5®pg/ml de polimixina B. O material administrado por infusão continha 2®,8 pg/ffil ds peptideo» A dosagem foi de 1,® mg de análogo/cordai-ro/dia. Existiam dois grupos de tratamento» Uss grupo foi tratado cora α composto preferido do invento em que A é Ala, B ê Lis, C é Tre, B é Lis, E ê Leu e X é Gln-Gln-Bli-Blu-Arg-Asn-Gln-Glu-Bln-—BIi—Ala—Lis—Vai-Arg—Leu—B1i—Arg—B1n—Va1—Asp—Ser—Leu—trp—A1a—B1u— -B1n-Lis-61n-Leu-G1u-Leu-B1u-Ser-I1e-Leu-Va1-A1a-Leu-Leu-61n-Lis--His—Ser-Arg-Asn-Ser-Gln—Bli. ► Çi

Lote composto toi designado Ala"" na Tabela 1» 0 segundo grupo de tratamento foi tratado com o mesmo composto exceptc os grupos amena lavres serem monoalguilados para 2,3—di—hidroMipropilo» Este composto foi designado DHP AIna Tabela 1»

Os cordeiros foram sangrados quatro veses diáriamente através da cânula jugular e continuou ao longo do tratamento e durante 24 horas após o tratamento ter terminado» As amostras ds? sangue foram colhidas meia hora antes de dados alimentos e meia quanto á libertação da hormona tíe cr

Aso amostras de pia ífícna. tí-e cres cisTien t.o« :estadas

Gs curdeirus ígí -híb si XirreiítadOs cqíTi 40V* g us uma raçSo θ. 1 tamenhí? energética ès 07_£i@ 0 15,0® horas de cada dia» 0ξ- resultados, como se mostra nas tabelas abaiso indicam que os C O ffi p Q S t O S 1 tt: íb ac ti vi, d ade de libertação d-a hormona de ssb os prsts ridos do inventa5 preparados no Tafft os resu Ifcados apresentados na ia te j. a. i s 0 invento estão apresentados nas tabelas

Outras

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l'"* s te. be 1 a qu. fc? 1 se seg: uem pr 9ΠΒ8. ÍQ~· OS 1i ber t aç ã c d a hormon a de COÍfl V-ár ios aná1egos de SRF da ρ resen t obti das pel o método de Cj. intfcíSS Srfít T Paten ta u.s » 4 » Ò í / 5 49, a qux in c 1 ui. da qos sfeio BRF bovina í~ om di fsrent es sub ts Tisa 95 onforme d 0·’*”Ό ri. to» apare .tonam o c rsse i ffien to a inventa» 0 3S Sõ X J. Cl Cl como re ύ&γϊ! is t í tu i ç Ses d s resultadas das CQCt^ COi~QSÍ. Γ03 0 ir- -¾Π-á IOQG3 T O í*"Sfil qíhq descrito na rtexa» Lís anal o & aminoácidos o

TABELA

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ω 00 CM LO © CM V0 CM © O N H +1 lO CM Ο θ'* lo O 00 Ο Q <! ps Q Q CO 1ΛΝΟ rH CO ID H co Ο Μ1 CM rH Of > C/3 E rH ι—1 M -aj 1 o bO Ό w Cl o *3 C/j P j o . - co CO VO CM OV oo cn c o PS o o o cn i-t rH o <u CQ H a ; PQ co CM s ω co +1 cd w ω α CM co O CM VO r*-. co pi OQ m os j CO in Ο Ϊ-* ON m cn cd < o o CM co OV CM ÍH H o o H p O N < 2 a OQ Q a o a , •d O < o (d H 2 <r CM O Ol CO LO M c, H CO o rH i/ivr h o o P ω <1 < rH ip ►J +1 (tí ω CM cn o vo σι r~-> r> cn υ CM 00 lO O 00 cn cm cr» <J* co o >—> σν σν cm CM I ι ι—* o > H O H D-l <í a -j ω ω η Η OS 2 •H Μ 04 C0 ο ΕΜ D 3 ιο lo σ σ ο ο ο ΜΤ r-4 co ό σι CM οο '-'h JB5 la 1¾ PS PS Ο <TL OV CJ r- CM CM r- C4 li 04 μ-S i—t i—í rfU5 WM·' in iH ftj f*J η η ps g Eh th O O ιΗ μ Γ- Γ» •04 >04 N *« COM m .cm ih tn tn „lr-l PS^4 ,H7 «o < <j i>o <© o Oi - PM C0 O H iH H rí i I I I I KPS22 II II II II H <d«Ofl

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lOLOOOOOOO <fHfHO(31(SCO'í I rH rH CM G »H B ΙΛ p- cti í, (d CL o P CL (D O X (D O α E d) P s. co (ti 0 B P W a cti G rH •i—1 a B. 0) o d CO 1 <ti 1 P (D w o C E VQ cd I 1 Cti 1 o P , G cti. <D B B w cd cti +3 H cd a G p o -v. Ό cd o 03 a cti cd u G P P W to o (d E O cti M 03 O cd G Ό *H ω cti a *H G *0 o 'd) υ a G°R12,21Tl5L27GRI,(l-29)NH2 H°R12 > 21T15L27GRF(1_29)NH2Q°R1z,21T15L27GRF(1-29)NH2

II II II <J « o

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Cd M' to cC o_

MO, CO to ’Φ,σ·' 2 Cd Q o M <J •a! 1 o to cd 2 Cd Cd H co cd α co <a! to «1 to to o o to cd o o O xi < co s to o Cd Cd m Q to H α cd Cd > o Ct Cd Cd 00 H to Cd Q Kj , O m o α O <aj to co >< + to to Cd 2 O Cd o to Cd a! H m CQ o cd s < Cd <í M — H Cd cd 2 to « m to C0 Cd G o «aí a Q o to to o to o <0 o Q Cd O O to Oo G to &!otooo g to

X

00 Μ Οίνο SO £Λ·ί H O lOCftHriinrHr-iN +1 ·5« vO ΰΗΟΟΜ'ίνΟιηιΛ®• O........ 'ί'Γΐιη'ίΌΜΌ^'ίΟ'd oo o m to h CJ r-t<u •to a Ή r* «Ο'ίοΟ'ίΟ'ί'ί • 3...... · · ΟΗ\ΟιΛΟΜΝ·ί HH Ο Η Η H to +i'cn ΟΟΓ^ΝΗίνΙ'ίΟΟ -ί»ο\<ίΗ·ί<ίιη W IO m cl N Η o H O Cd K H Cd O O Cd 2 > to H Cd H Cd Ω Q O M CO l/l 00 to o O o to < < rx o <N IO O cn s to cc • · Cd Cd o o o o o O r-l H cd W 1

O G •H d) •d g O O 00 ZLooo in II d u <u S •H o %αtooto II<uw OO P°bGRF(l-78)OH = 58.0 pg/ cordeiro

I EMempIo 5

Foram sintetizados vários análogos peptidicos de bSRF pelo método da síntese em fase sólida como descrito na Patente U«S» 4,:i617? 149= Os compostos foram testados em células da pituitária da rato pelo método de Heimsn et al,, Endocrinol„ 13. ó s 414 (1985)= Os análogos hasaiam-sa na sequência dos 29 primeiros sminoâcidos do factor de libertação da hormona de crescimento com ^as substituições apresentadas na lista=

Tabela 9

Potência da -secreção de BH mediada por análogos de GRF a partir de células da pituitária de rato, i

Potência F!otê'ncia Relativac

Análogo nM ímédiajn) CXde sdd)

hGRF (1-44)0H

[R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 DHP[R12,T15,R21,L27]hGRF (1-29)NH2 [P°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 DHP[P° R12 T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [A°,R12,Tlè,R2l,L27]hGRF(l-29)NH2 DHP[A°,R12,T15,R21 L27]hGRF(l-29)NH2 [N-Me“A°,R12,T15,R21,L27]hGRI’(l-29)NH2 [N-Ac-A°,R12,T15,R21,L27]hGRI'(l-29)NH2 [Q°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [G°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [H°,R12,T15,R2l,L27]hGRI'(l-29)NH2 [D°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [S°,R12,T15,R2l,L27]hGRF(l-29)NH2 [P“1,P°,Rl2,T15,R21,L27]hGRI’(l-29)NH2 DHP[P 1,P°,R12,T15,R21,L27]hGRi’(l-29)NH2 [P"1,A°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [R 1,A0,R12,T15,R21,L27]hGRT(l-29)NH2 [A 1,A°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [F 1,A°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2 [D"1,A°,R12,T15,R21,L27]hGRF(l-29)NH2

.136; 3 1.0 .136; 10 1.0 .17; 1 .8 .665; 2 .20 1.01; 1 .13 .534; 9 .255 .406; 2 .335 .78; 3 .17 1.40; 2 .10 .712; 2 .191 .337; 2 .36 .528; 1 .26 .56; 2 .24 .51; 2 .27 1.45; 1 .09 .959; 1 .14 1.01; 2 .13 .885; 1 .15 .526; 2 .26 .643; 1 .21 1.55; 1 .09 iando sn tre i T (De Le ans A, s a conc: entraç; &‘b

CEC50 rRi2sTíb? R^1, L2'IhBRFí1~29)NH^ / ECP0 anàlogcr d_. -ER12* Tla. R12, L2/Jh8RF(l-29>NH^n títd . , . ^

Exemplo 6

Preparação de um Análogo de 6 jRF _cpni...dgsNH^-Jir na pqsi_çga_,1

0 análogo do UKr desNH.-j-T ir-Ala-Asp-Al a—I le-Fen-T re-Asn-Asn-T ir-Arg-Arg-Val-Leu- 5 1Θ T re-61n-Leu-Ser-A1a-Arq-Arg-Leu-Leu-B1n-Asp-11e-Leu-Ser-Arg-G1n— 15 2Θ 25 3Θ

Bln—61i—61u—Arg-Asn-Gln-Glu—Gln-GIi-Ala-Arg—19ai—Arg—Leu—Sli-Arg— 35 40 45 6 In.-Va 1 -Asp-Ser-Leu-T rp-A 1 a—Asp—6 1 n-Arg-S 1 n-Leu-Al a—Leu-S 1 u-Ser— 5Θ 55 6Θ I1e-Leu-A1a-Tre—Leu—Leu-81n—61u-His—Arg—ftsn-Ser-G1n-01i, 65 70 75 ^oi preparado coma descrito abaixo, Um intermediário com a alanxna na posição dois do extremo ensina foi gerada par meios rscaffibinsntes por exemplo coma nos Exemplos 1 e 2.5 excepiuanda ser substituída a sequtncia de DMA codificadora do intermediário com a sequfncias CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAAT· - ------+---------+---------+---------+---------+

TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTA

CATATGGCTGATGCTATTTTTACTAATAATTATCGACGCGTTCTGACTCAGCTGTCTGCT ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GTATAC C GACTAC GATAAAAATGATTATTAATAGCTGC GCAAGACTGAGTC GACAGAC GA CGTCGTCTGCTGCAGGATATTCTGTCTCGTCAGCAGGGTGAACGTAACCAGGAACAAGGA ' ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

GCAGCAGACGACGTCCTATAAGACAGAGCAGTCGTCCCACTTGCATTGGTCCTTGTTCCT

GCTCGTGTTCGTCTTGGTCGTCAGGTTGATTCTCTGTGGGCTGATCAACGTCAGCTTGCT ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

CGAGCACAAGCAGAACCAGCAGTCCAACTAAGAGACACCCGACTAGTTGCAGTCGAACGA

GTCGAGTCTATCCTGGCTACTCTGCTGCAGGAACATCGTAATTCTCAGGGTTAATAG ---------+---------+---------+---------+---------+-------

GAGCTCAGATAGGACCGATGAGACGACGTCCTTGTAGCATTAAGAGTCCCAATTATCCTAG

Dezoito mg í2 pmoles) do sa :s ®m 2 ml de ô,2M Tris (pH 7 te mperatur a ambiente. ftd i c i on ou—se ce :u alguma : turbidez. Adicionou-se i 5U 1fossucc inimitíi1—3- í 4—h i d r ο κ i f en ao xtada a temperatura ambien te. Ap· e di1u i u—s e para 4*36 p 1 com ácido ··»*

Ui:? · ------ trifluoroacêtico ΠΤΑ) a 6,,1% e φ>ΎμΙ rog/mi) fox injectado era Pharmacia Pep RPCHR5/5 <ôs5 mm k d cm) para análise e comparação com o substrato, em de 6,1 ml foram

Após uma hora, a mistura de reacçâo foi acidificada com •>™4 gotas de ácido acético glacial e aplicado a uma coluna de 2,5 2,y cm ds Sephadex 6--16 s eiuido com ácida acético a 16%, Colheram-se fracçSes de 8 ml ao mesmo tempo se controlava com um comprimento de onda de 280 nm. As fracçSes 7-9 foram combinadas, congeladas e liofiUzadas para dar 12 mg. 0 produto foi dissolvi-u° ds 0,1/, íhA, sm seguida amostras

.3 em 10 f ra*r iil-Q'- = A amos ti W a í μς /μΐ e tes ,t ada de íressn tou uma pG tãri iC .1 a ci e y ^ scoroo com o exemplo dissoivida em ácida 0

Claims (2)

1. REIVINDICftCfflES lã. Método para a preparação de uma composição íarm&cfutics, caracterisado por compreender a mistura de um composto polipeptidico em. que d referido composto tem a fórmula A-AIa-Asρ-Α1a-I1e~Fen-Tre—Asn-R-Tir- 5 1© J Arg-B-Va1-Leu-C-G1n-Leu-Ser-Aia-Arg-D-Leu-Lsu- 15 2Θ S1n-Asp—I1e-E-Asn-Arg-Xs 25

   Sin que A é desNH^-Tir5 Ala—Tir, Gin—Tir, Gli—Tir, His—Tir, Met—Tir, Fen—Tir, Pro-Tir, 8er-Tir, Ala—Ala-Tir, Arg-Ala—Tir, Asp-Ala-Tir, Fen-Ala~Tir, Pro-ftla-Tir, Pro-Ala-Tir, Pro-Pra-Tir, Met-Ala—Tir, Met-Arg—Tir, Met—ftsp—Tir, Met—Leu—Tir, Met-Pro-Tir, Met-Ser-Tir, Met-Ala-Ala-Tir, Met-Arg-Pro-Tir, Mei-Asp-Pro-Tir, Met-Gli-Pra-Tir, Met-Fen-Pro—Tir s siet-Ser-Pro—Tir; B é Arg ou Lis? C é Sli, Ala, Leu., Vai, Ile ou Tre; D é Arg ou Lis, E é Met, Vai, Leu ou Ser; X é NH2 ou um ou mais aminoácidosj e nenhum, um mais de um dos aminoácidos tendo um grupa «mina livre é ificado quimicamente? com um ou mais SKCipientes farmaceuti·*· camente aceitáveis para esse fim» 2s« - Método de acordo ccm a Reivindicação i, caracte-' rizado por A ser ftla-Tir* 3â« - Método de acordo com a Reivindicação 1, csracte-rizado por A ser Pro-Tir»

   4ã, - Método de acordo com a Reivindicação i? csracte··· risada por h ser desNH^--Tir» 5sL ·- Método de acordo com a Reivindicação 1, caracte-ris&do por C ser Tre. 6â= “ Método de acordo com a Reivindicação '1 ? caracts— risatío por X ser J Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val- Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln- Lys-Gln-Leii-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu- Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly. 7ã. Método de acordo com a Reivindicação lv ri£&Qo por o composto ρο 1 ipso fc i α I co ser > Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser^Tyr-Arg-Lys-Val-o 5 ίο Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25 Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40 r Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55 Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65 Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly. 70 75 Si sdo por α — Método de acordo ec?.o a Rsϊyindi.ca.c3o í , o ín posto poiipeptidico ser ac te~ desNH2 -Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Asn-Tyr-Arg-Arg-Val- 5 10 Leu-Thr-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Arg-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25 Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-30 35 40 Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Asp-Gln-45 50 55 Arg-Gln-Leu-Ala-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Ala-Thr-Leu-Leu-Gln-60 65 Glu-Hís-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly, 70 e por se incluir um veiculo sólida ou liquido farmacsuiicamsnts aceitável ·., 9§L - Método da acordo com a Reivindicação 1P csracts- risado por pelo menos um dos aminoácidos tendo um grupo amina livra estar substituída em tal grupo amina par um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada C,~G, substituído com ξβγο, um ou 1 a mais ds um grupo hidronilo. 10â„ - Método ds acordo com a Reivindicação 9, carscts-'ricado por pelo menos um dos grupos hldroKialquilo ser 2?3~di~ -hidroKipropila. llé» - Método para a indução da libertação da hormona da crescimento5 caracterisado per compreender a administração de uma quantidade efiess de um composto polipsptidico representado pala fórmula A-A1a-Asp-A1a-11e-Fen-Tre-Asn-R-Ti r-5 10 Arg-B-Va1-Leu-C—S1n—Leu—Ser-Ala-Arg-D—Leu-Leu-Í5 20 P^ln-Asp-Ile-E-Asn-Arg-X; em que A é desNH2-Tir, Ala-Tir? Bln-Tir, Bli-Tir, His-Tír, Met-Tír? Fen-Tir, Pro-Tir, Ser-Tir, Ala-Ala-Tir, Arg-Ala-Tir, Asp-AIa—Tir, Fen—Ala—Tirs Pro-Ala-Tir, Pro-Ala-Tir, Pro-Pro-Tir, Met-Ala—Tir, Met-Arg-Tir, Met-Asp-Tir. Met-Leu-Tir, Met-Pro-Tir, Met-Ser—Tir, Met-Ala-AIa-Tir, Met-Arg-Pro-Tir, Met-Asp-Pro-Tir, Met—Sli-Pro—Tir, Met—Fen—Pro—'Tir e Met—Ser—Pro—Tir; B é Arq ou

   Lis; C é Sli, Ala, Leu, Vai, Xle ou Tre; D é Arg ou Lis, E é Met, Vai, Leu ou Ser; X é NrL, ou um ou mais aminoácidos; e nenhum, um ou mais de um dos aminoécidos tendo um grupo amina livre é moditacado quimicamente? e um veiculo sólido ou liquido farmaeeu-ticamenfce aceitável» 12ã» ·· Método de acordo com a Reivindicação 11, csrac-tensado por A ser Ala—Tir« Í3â« - Método de acordo com a Reivindicação 11, carac-r ,i, a d o por A ser Rro—Tir« 14ã» ~ Método de acordo com a Reivindicação 11, carac-terisado por A ser desNH^-Tir,, 15â« --· Método de acordo com a Reivindicação 11, carácter isado por C ser Tre» 16-' - Métudo de acordo com a Reivindicação 11, carac-teri zado nor X ser

   Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val- Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln- Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu- Gln-Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly. 17ã» Método de acordo com a Reivindicação 12, carác ter i 2 ado por o composto polioeotidico ser

   Ala-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-0 5 10 Leu-Thr-Gln-Leu-Ser--Ala-Arg-Lys-Leu-Leu--Gln-Asp-Ile-Leu-15 20 25 Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-30 35 40 Val-Arg-Leu-Gly-Arg-Gln-Val-Asp-Ser-Leu-Trp-Ala-Glu-Gln-45 50 55 » Lys-Gln-Leu-Glu-Leu-Glu-Ser-Ile-Leu-Val-Ala-Leu-Leu-Gln-60 65 Lys-His-Ser-Arg-Asn-Ser-Gln-Gly. 70 75

   19â, -- Método de acorda com do por pelo menos um dos grupos s Reivindicação 18, 'lidroKialquilo ser carac--P3—di— 181» ~ Método de acordo coin a Rei vindicacâj o il, carac- ter í zí sdo por pe lo menos um dos amirtoécidos tendo um grupo ώΠΙΙΓίδ 1 ívrs estar subis ti tuido ne sse grupo amina por um grupo alquilo uí de cadeia linear i :iu r am .i f í c ad a su bst i tuido com
2. 2 P1*"* Q jj um ou. ma is í is um grupi □ hidroK: ilo» —hid rcxipropilo» Ll5ho=?-s 19 de Abril de 1991

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