BG100420A - Ацилиран инсулин - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до производни на човешкияинсулин със забавено действие. В тях аминокиселинните остатъци а21 и в3, независимо един от друг, представляват аминокиселинен остатък, който може дасе кодира от генетичния код, с изключение на lys, аrg и сys, рнев1 може да се делетира, а аминокиселинният остатък в30 е или некодируема, липофилна аминокиселина с 10 до 24 въглеродни атома, като в този случай към -аминогрупата на lysв29 се присъединява ацилна група на карбоксилна киселина, имаща до 5 въглеродни атома, или се делетира, или представлява всеки аминокиселинен остатък, който може дасе кодира от генетичния код, с изключение на lys, аrd и сys. Във всеки от посочените случаи -аминогрупата на lysв29 има липофилен заместител, а когатов 30 е тне или аlа и а21 и в3 са едновременно аsnи присъства рнев1, инсулиновото производно задължително е представено като zn2+-комплекс.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение се отнася до нови производни на човешкия инсулин, които са разтворими и имат забавен про*ил на действие, до метод за получаване на такива производни, до Фармацевтични препарати, които ги съдържат и до използуването на такива инсулинови производни за лечението на диабет.

rf”*·

ПРЕДШЕСТВУВАН» СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Много болни от диабет пациенти се лекуват чрез многократни ежедневни инсулинови инжекции по схема, включваща една или две инжекции дневно на инсулин със забавено действие за покриване на базалните нужди, които се допълват от еднократни инжекции на * бързо действуващ инсулин за покриване на изискванията, свързани с храненето.

Препарати на инсулин със забавено действие са добре известни областта на диабетологията. Така един основен тип препарати на инсулин със забавено действие включва инжекционни торми на водни саспенсии или амороен от инсулинови кристали инсулин. Инсулиновите съединения, използувани обикновено в тези препарати са протаминов инсулин, цинков инсулин или протаминцинков инсулин.

Използуването	на инсулинови снспенсии е свързано с
известни недостатъци.	Така за да се осигури точно дозиране,
инсулиновите частици	трябва да се суспендират хомогенно чрез

внимателно разбъркване преди определен обем да се изтегли със спринцовка от ампулата или да се отлее от Флакона. Освен това,

за съхраняването на инсулиновите снспенсии температурата трябва да се поддържа в по-тесни граници, отколкото за инсулиновите разтвори, за да се избегнат образуването на късчета преципитат или коагулацията.

Докато по-рано се приемаше, че протамините са неимнногенни, то сега се оказа, че протамините могат да бъдат имуногенни за човека и че тяхното използуване за медицински цели може да доведе до образуването на антитела (Samuel et

Studies on the immunogenicity of protamines on humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33, pp. 252-260 (1978))

Намерено Беше също така и доказателство, че протамининсулиновият комплекс сам по себе си е имнногенен ( Kurtz et al .,

Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins. Diabetologics 25, pp. 322-324 (1983)). Поради това при някои пациенти трябва да се избягва използуването на инсулинови препарати със забавено действие, съдържащи протамини ... _

Друг тип инсулинови препарати със забавено действие представляват разтвори, имащи pH-стойности под физилолгичното pH, поради което инсулинът ще преципитира вследствие покачването на pH-стойността след инжектиране на разтвора. Недостатък на тези разтвори е това, че разпределението по големина на частиците в преципитата, Формиран в тъканта след инжекцията, а по този начин и времетраенето на лечебното действие зависи от кръвния ток в мястото на инжекцията и от други параметри по начин, до известна степен непредсказуем. Друг недостатък е това, че твърдите частички от инсулина могат да действуват като локални дразнители, причиняващи възпаление на тъканта в мястото на инжекцията.

N0	91/12817	(Novo Nordisk	А/S) представя	разтворими
ИНСУЛИНОВИ	препарати	със забавено	дейсвие, включващи	ИНСУЛИНОВИ

комплекси на кобалт ( 111). Забавеното действие на тези препарати е само междинно (умерено), а биологичната достъпност редуцирана.

Човешкият инсулин има три първични аминогрупи: N-крайната група на А-веригата и на В-веригата и €-аминогрупата на Lys^Bav. В приоритетен план са известни някои инсулинови производни,

инсулини, в които една, две или три първични аминогрупи на .инсулиновата молекула имат карбоксиароилова група.

Специално

М«вз«»__{заг1естенм} инсулини не са представени.

В съгласие с патент на Великобритания Н! 1.492.997 (Nat.

Res. Dev. Corp.) беше установено, че инсулин с карбамилна субституция при №^вя* има подобрен про*ил на хипогликемичен е*ект. ,

Публично достъпна патентна заявка на Япония № 1-254699 (Kodama Co., Ltd.) представя инсулин, в който към аминогрупата на Phe^BA или към е-аминогрупата на Lys^Ba* или и към двете е присъединена мастна киселина. Заявената цел на тази дериватизация е получаването на Фармацевтично инсулинов препарат

В публично достъпна патентна заявка на (Shionogi) са описани инсулини, които в аминокиселина, която притежава която не е задължително да се на захарен резистентни най-малко пет кодира от диабет, особено при пациенти вследствие образуването на приемлив

Япония Н!

ПОЗИЦИЯ , стабилен

57-067548

ВЗО имат въглеродни атома и нуклеотиден триплет приложими в лечението които говежди са или инсвлинсвински

антитела

Чрез инсулиново производно, както тук, се означава съединение, имащо молекулна структура, подобна на тази на човешкия инсулин, включваща дисулФидните мостове между Cys*⁷ и Cys^BT и между Сув^АЪ и Cys^Aii и която има инсулинова активност

Все още съществува обаче необходимостта от инжекционни инсулинови препарати със забавено действие, които представляват разтвори съдържат инсулини, които състояние след инжектиране и притежават минимани възпалителни и имнногенни свойства

Един предмет на настоящото да обезпечи човешки инсулинови производни със забавен профил на действие, които са разтворими при физиологични рН-стойности

Друг предмет на изобретението е да обезпечи

Фармацевтичен препарат, включващ човешките инсулинови производни, съгласно

Следващ предмет на изобретението е да обезпечи получаване на човешките инсулинови производни на изобретението изобретението

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изненадващо се оказа, че определени човешки инсулинови производни, в които е-аминогрупата на Lys®²’ притежава лиопоФилен заместител, имат забавен профил на действие и са разтворими при физиологични pH-стойности.

съответствие с това, в своя най-широк аспект настоящото изобретение се отнася за инсулиново производно, имащо следната последователност:

A-Верига S‘S

I ⁷I

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr—Ser-Ile-Cys-Ser—

2 3 4 5 Ь I β 9 10 1112

S

I В-ВеригаS

Xaa-Va1-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Va1-

1 2	3 4 5 6	7 8	9 10	11	12
А-Верига	(продължение)
	20
Leu-Tyr—ι	Gln-Leu-Glu-Asn-	-Tyr—Cys·	-Xaa		(SEQ ID N0:1)
13 14	15 16 17 1β	19 1	21
		rs
В-Верига	(продължение)	s 1
Glu-Ala-I	Leu-Tyr-Leu-Val-	-Cys-Gly-	-Glu-Arg-	-Gly	-Phe-
13 14	15 16 17 18	19 20	21 22	23	24

В-Верига (продължение)

Phe-Ту r—Thr—Pro-Lys-Xaa

26 27 2Θ 2930 (SEQ ID N0:2) където:

Xaa в позиции A21 и ВЗ са, независимо един от друг, всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код.с изключение на Lys, Arg и Cysj

Хаа в позиция'Bl е Phe или е делетирана;

Хаа в поиция ВЗО е а) некодируема, липофилна аминокиселина, притежаваща от 10 до 24 въглеродни атома, като в този случай към е-аминогрнпата на Lys®²* се присъединява ацилна група на карбонова киселина, имаща въглеродни атома, b) всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на

Lys, Arg и Cys, в който случай е-аминогрнпата на Lys^: има липо*илен заместител случай е-аминогрнпата на-Lys®²* и всички техни Ип²*-комплекси или

С )	делетирана	, в	който
има	липоФилен	заместител;
при	условието,	че	когато

Хаа в позиция ВЗО е Thr или Ala, Хаа в позиции А21 и ВЗ

са едновременно Asn и Хаа в позиция В1 е

Phe, тогава инсулиновото производно е гп²*-комплекс

В едно предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в което аминокиселинният остатък

ВЗО е делетиран или представлява всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys,

Агд или Cys; аминокиселинните остатъци

А21 и ВЗ са независима един от друг всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys Arg и Cys; Phe®¹ може да се делетира;

β-аминогрнпата на Lys® има липоФилен

заместител, който включва най-малко

Ь въглеродни

Ζπ²*-Λοηη могат да се свържат с всеки инсулинов хексамер при едновременно

Asn и

Phe®¹ не е делетирана, тогава 2-4 Zn²*-ftona се свързват с всеки хексамер на инсулиновото производно

В дрнго предпочетено приложение, изобретението се отнася за производнЬ на човешкия инсулин, в което аминокиселинният остатък

ВЗО е делетиран или представлява всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys,

Arg и

Cys; аминокиселинните остатъци А21 и ВЗ са независимо един от друг всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys, Arg и Cys при асловието, че ако аминокиселинният остатък

ВЗО е Ala или

Thr тогава най-малко един от остатъците А21 и ВЗ е различен от

Asn

Phe»¹ може да се делетира; и €-аминограпата на Lys^B=* има липоФилен заместител, който включва най-малко въглеродни атома.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което аминокиселинният остатък ВЗО е делетиран или представлява всеки аминокиселинен

остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение ·*

на Lys,

Arg и

Cys;

аминокиселинните остатъци А21 и ВЗ са независимо един да се

Phe^BX от драг всеки аминокиселинен остатък, кодира от може да който може

Генетичния код с изключение на Lys, се делетира;

€-аминограпата на липоФилен заместител, който включва най-малко Ь атома; и

2-4 гп⁼*-йона се свързват с всеки инсалинов

В драго предпочетено приложение за производно на човешкия инсалин, в

В драго предпочетено приложение • за производно на човешкия инсалин,

Агд и

1_у_вваФ

Cys;

има въглеродни хексамер изобретението се отнася което аминокиселинният изобретението се отнася което аминокиселинният остатък ВЗО е Asp ,В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което аминокиселинният

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на'човешкия инсалин, в което аминокиселинният остатък ВЗО е Thr остатък ВЗО е Glu.

В драга предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е липоФилна аминокиселина, имаща най-малко 10 въглеродни атома.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е липоФилна α-аминокиселина, имаща от 10 до 24 въглеродни атома.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е липоФилна «-аминокиселина, имаща от 10 до 24 въглеродни атома.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината представлява наситена алиФатна α-аминокиселина с неразклонена верига, имаща от 10 до 24 въглеродни атома.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е D- или 1_-1Ч*^,-додеканРиллизин.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминодеканова киселина.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася *’ за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминоандеканова киселина.

- В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминододеканова киселина.

В дpart) предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминотридеканова киселина.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, е което ВЗО-аминокиселината е а-апинотетрадеканова киселина.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминопентадеканова киселина.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминохексадеканова киселина.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсалин, в което ВЗО-аминокиселината е α-аминокиселина.

В драго	предпочетено	приложение	изобретението се отнася
за производно	на човешкия	инсалин, в	което аминокиселинният
остатьк А21 е	Ala.
В драго	предпочетено	приложение	изобретението се отнася
за производно	на човешкия	инсалин, в	което аминокиселинният
остатък А21 е	Gin.
В драго	предпочетено	приложение	изобретението се отнася
за производно	на човешкия	инсалин, в	което аминокиселинният
остатък А21 е	Gly.
В драго	предпочетено	приложение	изобретението се отнася
за производно	на човешкия	инсалин, в	което аминокиселинният
остатък А21 е	Ser.
В драго	предпочетено	приложение	изобретението се отнася
за производно'	на човешкия	инсалин, в	което апинокиселинният
остатък ВЗ е Asp.	*
В драго	предпочетено	приложение	изобретението се отнася
за производно	на човешкия	инсалин, в	което аминокиселинният

остатък В3‘е Gin.

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в което аминокиселинният остатък ВЗ е Thr.

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в което €-аминогрупата на

Lys®³’ има липо«илен заместител, който представлява ацилна грипа, съответсвтвуваща на карбйнова киселина имаща най-малко 6 въглеродни атома.

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася

за производно на човешкия инсулин, в което е-аминогрупата на

Lys®³’ има липоФилен заместител, който представлява ацилна група, разклонена или неразклонена, която съответствува на карбонова киселина имаща верига от въглеродни атоми, дълга В до атома.

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в което е-аминогрупата на Lys®³’ има липоФилен заместител, който представлява ацилна група, съответствуваща на мастна киселина, имаща най-малко 6 въглеродни атома

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася 'за производно на човешкия инсулин, в което е-аминогрупата на

Lys®³’ има липоФилен заместител, който представлява ацилна група, съответствуваща на линейна, наситена карбонова киселина, имаща от 6 до 24 въглеродни атома.

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно' на човешкия инсулин, в което е-аминогрупата на Lys®³’ има липоФилен заместител, който представлява ацилна група, съответствуваща на линейна, наситена карбонова киселина, имаща от В до 12 въглеродни атома.

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в

Lys® има липоФилен заместител, група, съответстваваща на линейна, имаща от 10 до въглеродни атома

В драго за производно

Lys®²** има което е-аминограпата на който представлява ацилна наситена карбонова предпочетено приложение на човешкия инсулин, в липоФилен заместител, изобретението киселина, се отнася което 6-аминогрнпата на който представлява олигооксиетиленова група, включваща до 10, за предпочитане до 5,

оксиетиленови единици

В драго предпочетено приложение за производно на човешкия имсулин, което е-аминограпата на

Lys’ има липофилвн заместител, който представлява олигооксипропиленва грипа, включваща до

10, за предпочитане до оксипропиленови едцници

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в което всеки

ИНСУЛИНОВ хексамер включва 2 Zn²*-ftOHa.

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася

за производно на човешкия инсулин, е което всеки

ИНСУЛИНОВ хексамер включва 3 Ип^а*-йона

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася за производно на човешкия инсулин, в което всеки

ИНСУЛИНОВ хексамер включва 4 Zn²*-ftOHa

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за използуването на производно на човешкия инсулин, съгласно изобретението, за приготвянето на медикамент за лечение на диабет

В драго предпочетено приложение изобретението се отнася до Фармацевтичен препарат за лечение на диабет при пациент, в случай на необходимост от такова лечение, включващ терапевтично е*ектиено количество от производно на човешкия инсулин, съгласно

Фармацевтично приемлив носител

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася до Фармацевтичен препарат за лечение на диабет при пациент, е случай на необходимост от такова лечение, включващ терапевтично е*ективно количество от производно на човешкия инсулин, съгласно изобретението, в смес с инсулин или инсулинов аналог, който има бързо начално действие, заедно с Фармацевтично приемлив носител

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за

Фармацевтичен препарат, включващ производно на човешкия инсулин, съгласно изобретението, което е разтворимо при

ФИЗИОЛОГИЧНИ рН-стойности

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за Фармацевтичен препарат, включващ производно на човешкия инсулин, съгласно изобретението, което е разтворимо при рМстойности в интервала от 6,5 до 8,5

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за Фармацевтичен препарат със забавено действие, включващ

производно на човешкия инсулин, съгласно изобретението

В друго предпочетено приложение изобретението се отнася за

Фармацевтичен препарат, който представлява разтвор, съдържащ от приблизително 120 нмОл/мл до приблизително 1200 нмол/мл, за предпочитане около 600 нмол/мл производно на човешкия инсулин, съгласно изобретението.

В дрнгб предпочетено приложение изобретението се отнася за метод на лечение на диабет при пациент, в случай на необходимост от такова лечение, включващ въвеждане в пациента на терапевтично ефективно количество от производно на човешкия инсулин, съгласно това изобретение, заедно с Фармацевтично приемлив носител.

друго предпочетено приложение изобретението се отнася за метод на лечение на диабет при пациент, в случай на необходимост от такова лечение, включващ въвеждане в пациента на терапевтично ефективно количество от производно на човешкия инсулин, съгласно това изобретение, в смес с инсулин или инсулинов аналог, който има бързо начално действие, заедно с

Фармацевтично приемлив носител

Примери за предпочетени производни на човешкия инсулин, съгласно настоящото изобретение, с които не са свързани Zn²*йони, са следните:

к1*®²’-тридеканоил des(B30) човешки инсулин,

М*®²’-тетрадеканоил des(030) човешки инсулин,

N^-®²’—деканоил des(B3Q) човешки инсулин,

N*^B2*-gogeka_HoH_A des(B30) човешки инсулин,

М*^в2’-тридеканоил Gly^Aax des(B30) човешки инсулин,

1Ч^вв2’-тетрадеканоил Gly^Aax des(B30) човешки инсулин,

№^В2’-деканоил Gly^Aax des(B30) човешки инсулин,

1Ч*^ва’-додеканоил Gly^A2x des(B30) човешки инсулин,

1Ч^вВ2’-тридеканоил Gly**³¹· Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

1Ч^вВ2’-тетрадеканоил Gly^Aax Gin®³ des(B30) човешки инсулин, №^в=’-деканоил Gly^A2X Gin®³ des(B30) човешки инсулин, (Ч^<В2’-додеканоил Gly^Aax Gin®³ des(B30) човешки инсулин, №^в=’-тридеканоил Ala^Aax des(B30) човешки инсулин, 1Ч^вва’-тетрадеканоил А1а^Аах des(B30) човешки инсулин, 1М*^ва’-деканои л А1а^Аа\ des(B30) човешки инсулин, М^-В2’-додеканоил А1а^А2Х des(B30) човешки инсулин,

1М^в®⁼’^г-тридеканоил А1а^Аах Gin®³ des(B30) човешки инсулин, №^В2’-тетрадеканоил А1а^Аах Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

Ν^β®⁼*—деканоил А1а^АЯХ Gin®³ des(B30) човешки инсулин, №^в=*-додеканоил Ala^Aax Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

N^-®²**—тридеканоил Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

Ν·^Β=’-τβτрадеканоил Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

IM^-®²’’’—деканои л Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

1Ч^вв2*-додеканоил Gin®³ des(B30) човешки инсулин,

М*®^г,г-тридеканоил Gly^A2x човешки инсулин,

М^вВ2*-тетрадеканоил Gly^A2X човешки инсулин, (Ч^вв=*-деканоил Gly^A2x човешки инсулин,

№®²’^г-додеканоил Gly^A2X човешки инсулин,

М^вВ2,,г-тридеканоил Gly^A2x Gin®³ човешки инсулин,

М*®=*»-_Тетрадеканоил Gly^Aax Gin®³ човешки инсулин,

М^,®^а’’-деканоил Gly^A2x Gin®³ човешки инсулин, №^В2’-додеканоил Gly^Aax Gin®³ човешки инсулин,

Г4^-®²*-тридеканоил А1а^А2х човешки инсулин, №®^а’^г-_Тетрадеканоил А1а^АЯХ човешки инсулин,

N*^B2*-gekaHOM_A А1а^Аах човешки инсулин,

М^ввгч“-додеканоил А1а^Аах човешки инсулин,

1М*®^а*’-тридеканоил А1а^АЯХ Б1п®³ човешки инсулин, №^,ва*-тетрадеканоил А1а^АЯХ Gin®³ човешки инсулин,

1Ч^-В2*-деканоил А1а^АЯХ Gin®³ човешки инсулин,

1М^<В2^~додеканоил А1а^АЯХ Gin®³ човешки инсулин,

1^«в2Ф__Тр_Мд_е^_аноил Qin®³ човешки инсулин, <Ч^вВ2*-тетрадеканоил Gin·³ човешки инсулин, (Ч·®²*—деканоил Gin®³-човешки инсулин, №^вя*-додеканЬил Gin®³ човешки инсулин, №^В2Т-тридеканоил Glp®³° човешки инсулин, <Ч^вВ2*-тетрадеканоил Glu®³⁰ човешки инсулин, №^В2’-деканоил Glu®³⁰ човешки инсулин,

1Ч*®^яТ.~додеканоил Glu®³⁰ човешки инсулин, №^вя*-тридеканоил Gly^Aax Glu·³⁰ човешки инсулин,

Ν·^ΒΒ**~τβτρβ )еканоил Gly^Aax Glu®³⁰ човешки инсулин,

N^-BB’-gekaHзил Gly^A2x Glu®³⁰ човешки инсулин,

N*^BB*-gogekзноил Gly^A2X Glu®³⁰ човешки инсулин,

N«B=<r__Tp_Mg_e „аноил Gly^A2x Gin®³ Glu^B3° човешки инсулин, №^ва*-тетрадеканоил Gly^A2x Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин,

1М^ввя*-декангзил Gly^A2X Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин,

1М*^вя*-додек ноил Gly^Aax Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин,

№^в2’-триде аноил А1а^АЯХ Glu®³⁰ човешки инсулин,

М^-вя*-тетранеканоил Ala^A2x Glu®³⁰ човешки инсулин, №^ва,’-декан'>ил Ala^Aax Glu®³⁰ човешки инсулин, '» м

1Ч^вВ2*-додеканоил Ala^A2X Glu®³⁰ човешки инсулин,

N^-®²*—тридеканоил А1а^А2х Gin·³ Glu®³⁰ човешки инсулин,

М‘®^я’-тетрадеканоил Ala^Aax Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин,

N^-®²*—деканоил Ala^A2X Gln^B3 Glu®³⁰ човешки инсулин,

Г4*^в2*-додеканоил А1а^Аах Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин,

1Ч'“®^я'^т-тридеканоил Gln^B3 Glu®³⁰ човешки инсулин, №^,в=*^г-тетрадеканоил Gln^B3 Glu®³° човешки инсулин,

(Ч*^в2*-деканоил Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин, 1Ч*^взч?-додеканоил Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин.

Следващите примери са за предпочетени производни на човешкия инсулин, съгласно настоящото изобретение, в които инсулинов хексамер свързва два Ζη²*-ΛθΗβι (М*яз**-тридеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^вя’-тетрадекан0ил des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^вя*-деканоил des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (1Ч^швя*-додеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 2Ζη²*, (Ν·®²*—тридеканоил Gly^A2x des(B30) човешки инсулин)*, ΣΣη²*,

(№^вя‘*-тетрадеканоил Gly^A2X des(B30) човешки инсулин )*, 2Ζη²*, (№^В2’-деканоил Gly^A2x des(B30) човешки инсулин)., 2Zn^a*, (М-.»з^_дОдеканоил GlyA2i des(B30) човешки инсулин)., 2Zn^a*, (М-ия*__Тр_Ид_{еканомл} GiyA=i Gin·³ des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn=*, (1М*^вя*-тетрадеканоил Gly^Aax Gln^BS des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn=*, (И^-В2*-деканоил Gly^A2x Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Ζπ²*, (М^-В2*-додеканоил Gly^A2x Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn®*, (№^в2’-тридеканомл Ala^Aax des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (М-в2^__теТр_ад_{еканоил} Д1_ал₂1 des(B30) човешки инсулин)*, 2Ζη²*, (М*ва«и_д_ека_НОИл А1а^Аах des(B30) човешки инсулин)., 2Ζη²*, (!Ч^вва<*--додеканоил А1а^А2х des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn^a*, (М«в2ч,__Трид_{еканоил} А1а^А2Х Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*,

2Ζπ=-, (N^-e=’-_Teipageka_Ho_HA Ala^Aax Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*,

2Zn^a*, (№^ва’-деканоил Ala^Aax Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (М«ва^_д_Од_{еканоил} д}_аА2х Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (1М*^ва*-тридеканоил Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Ζη²*, (Ν·^Β2*—тетрадеканоил Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^В2*-декаиоил Gin®³ des(B30) човешки инсулин)*, ΣΖη®···, (№^в=*-додеканоил Gln^B3 des(B30) човешки инсулин)*, 2Zn²*, (М^аг^-тридекщноил човешки инсулин)*, 2Zn²*, (М«^в=*-тетрадеканйил човешки инсулин)*, 2Zn²*, (N*^B=’-gek_aHoM_A човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^,ва'·-додеканоил човешки инсулин)*, 2Zn^a*, (№^В2**-т ридеканоил Gly^A2x човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№ ^В2<?‘—тет pagek анои л Gly^A2x човешки инсалин)*, 2Zn²*, (Ν'*®²**—деканоил Gly^A2x човешки инсалин)*, 2Zn²*, ((Ч^вгФ-додеканоил Gly**²¹ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (М*^вг*-тридеканоил Gly^A2X Gin®³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (|Ч*^В2'*-тетрадеканоил Gly^A21 Gin®³ човешки инсалин)*, 2Ζη²*, (№®²’-деканоил Gly^A2X Gin·³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (N^-B24r-gogekaHOH_A Gly^A=x Gin·³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№^в=’-тридеканоил А1а^А2х човешки инсалин)*, 2Zn²*,

((\1«в2ф—тетрадеканаил А1а^А21 човешки инсалин)*, 2Zn— , (4«вг»-д_ек.аноил А1а^А2Х човешки инсалин)*, 2Zn²*, (М-в^*»-додеканаил А1а^АЯХ човешки инсалин)*, 2Ζη²*, ₍Ν-Β3’-τридеканоил Ala^A2x Gin®³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№®^2Ч,-тетрадеканоил А1а^А2Х Gin·³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№в⁼*-деканоиЛ Ala^A2x Gin“³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (1Ч*^вач*-додеканоил А1а^А2х Gin·³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (Ν·®²’-τридеканоил Gin·³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№^В2’-тетрадеканоил Gln^B3 човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№^в=*-деканоил Gin^B3 човешки инсалин)*, 2Zn²*, (1М^вя*-додеканоил Gin·³ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (Ν'®²*-! ридеканоил Glu®³⁰ човешки инсалин)*, 2Zn²*, • (№^,В2‘^г-тетрадеканоил Glu·³⁰ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (М^-вг*-деканоил Glu^B3° човешки инсалин)*, 2Zn²*, (1Ч*^вг*-додеканоил Glu^B3° човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№^В2*-тридеканоил Gly^A2x Glu®³⁰ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (№^|,В2’-тетрадеканоил. Gly^A2X Glu^B3° човешки инсалин)*, 2Zn²*, ((4*ва^_,д_е|_<аноил Qiy«ax Glu®³⁰ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (N*^,B2*-gogeka_HOM_A Gly^A2X Glu·³⁰ Човешки инсалин)*, 2Zn²*, (Ν'®²*^ ридеканоил Gly^A2x Gin·³ Glu®³⁰ човешки инсалин)*, 2Zn²*, (^«вз^-тетрадеканоил Gly^A2X Gin®³ Glu·³⁰ човешки инсалин)*,

22η²*,

IB (N*^B2’-gekaHana Gly^A=x Gin·³ Glu®³⁰ човешки инсалин)*, 2Zn^a*, (1М^-вг*-додеканоил Gly^A2X Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин)*, 2Ζπ²*, (IM* ^вач’—три деканоил Ala^A2x Glu®³° човешки инсулин)*, 2Zn^a*, (М‘“^В2*-тетрадеканоил Ala^A2X Glu®³⁰ човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^ва'”-деканоил Ala^A2x Glu®³⁰ човешки инсулин)*, 2Ζπ²*, (№^{В2 г}-додеканоил Ala^Aai Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Ζη²*, (1М*^В2*-тридеканоил Ala^A2X Gin®·³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^В2В-тетрадеканоил Ala^A2X Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Zn²*,

(N^e®^a*-gekaHOMA Ala^A2x Gin®³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Zn²*, (N®²’-gogeka_HOMA А1а^А2х Gin®³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Zn²*, (№^вз’-тридеканоил Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Ζπ²*, (М*^В2,*-тетрадеканоил Gin®³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Ζπ²*, (М‘*^В2*-деканоил Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин)*, 2Ζη²*·, (№^ва*-додеканоил Gin®³ Glu^BSO човешки инсулин)*, 2Zn²*.

Следващите примери са за предпочетени производни на човешкия инсулин, съгласно настоящото изобретение, в които инсулинов хексамер свързва три Zn⁼*-ftOHa:

(№®=*-тридеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn²*, (№^В2,т-тетрадеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 3Ζπ²*, (N^eB2*~geka_HOMA des(B30) човешки инсулин)*, 3Ζη²*, (№^{в2 г}-додеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn³*, ((М^^-тридеканоил Gly^Aax des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn²*, (М^-В2’’-тетрад'еканоил Gly^A2x des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn⁼·*·, (№^в=*-деканоил Gly^A2X des(B30) човешки инсулин)*, 3Ζη²*, (N«e»^-gogekaHOHA Gly^A2X des(B30) човешки инсулин)*, 3Ζη²*, (1Ч^вВ2*-тридеканоил Gly^Aax Gin®³ des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn²*, (№^В2Ч,-тетрадеканои л Gly^A2x Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*,

3Ζπ=-, (№*^В2*-деканоил Gly^A2X Gin·³ des(B30) човешки инсулин)*,, ЗИл²*, (№^в=*-додеканои л Gly^A2x Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*,,

3Ζη²*, ((Ч*^в=*-тридеканоил А1а^А2х des(B30) човешки инсулин)*,, 3Zn²*, (М*^В2*-тетрадеканоил А1а^А2х desiB30) човешки инсулин)*,, 3Zn²*, (М*^В2*-деканоил А1а^А2х des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn²*, (1Ч*^В2’^г-додеканоил А1а^А2Х des(B30) човешки инсулин)*,, 3Ζπ²*,

(1М*^в2**-тридеканоил А1а^А2Х Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*,

3Ζπ²*, (Ν*^Β2’-τβτрадеканоил А1а^А2х Bln® dee(B30) човешки инсулин)*,,

3Zn²*, (Ν' ^взч>-деканоил А1а^А2х Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*,, 3Zn²*, (И*^В2Ч,-додеканоил А1а^А2Х Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*, 3Zn²*, (Ν*^Β2*^^-т ридек анои л Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*, 3Ζπ²*, (М*в=^_тетрадеканоил Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*,, 3Zn²*,

(N*^B2*-geka_HOH_A Gln^B® des(B30) човешки инсулин)*,, 3Ζπ²*·, (1Ч*^В2*-додеканоил Gin®·® des(B30) човешки инсулин)*,, 3Zn²*, (№^В2*^г-тридеканоил човешки инсулин)*,3Zn²*, (М«взч,__тетр_ад_е|_<._анамл човешки инсулин)*, 3Zn²*, (М*^В2**-’деканоил човешки инсулин)*, 3Zn²*, (№^В2*-додеканоил човешки инсулин)*, 3Zn⁼*, (М^-В2’-тридеканоил Gly^A2x човешки инсулин)*, 3Ζη²*, (М^вг^-тетрадеканоил Gly^A3X човешки инсулин)*, 3Zn²*, (N^,B2’’-gekaHon_A Gly^A2X човешки инсулин)*, 3Zn²*, (!Ч*^В2*-додеканоил Б1у^А2Х човешки инсулин)*, 3Ζη²*, (М*^в=*-тридеканоил Gly^A2x Gln^B® човешки инсулин)*, 3Zn²*, ((Ч^вг^-тетрадеканоил Gly^A2X Gln^B® човешки инсулин)*, 3Zn²*, ( №^ва*-деканоил Gly^A2X Gin®³ човешки инсулин )*>, 3Zn³*, (Г4'“^вз’-додеканоил Gly^A2X Bin*³ човешки инсалин)*, 3Zn³*, (1У*^вв’-тридеканоил Ala^A2X човешки инсулин)», 3Zn³*, (М^ввг*-тетрадеканоил Ala^A2x човешки инснлмн)*, 3Zn²*, (№^вз*-деканоил Ala^A2X човешки инсалин)*, 3Zn²*, (1М^,®²*-додека_Нои_Л Ala**²¹ човешки инсулин)», 3Zn³*, (№^,вз*-тридеканоил Ala^A2x Gin*³* човешки инсулин)», 3Zn³*, (№^вз*-тетрадеканоил Ala^A2x Gin®³ човешки инсалин)*, 3Zn²*, (№^В2*-деканоил Ala^A2X Gin®³ човешки инсалин)₆, 3Zn³*,

(М^<’®^а*-додеканоил А1а^А2х Gin®³ човешки инсулин)», 3Zn³*, (1Ч‘“^в2*-тридеканоил Gin®³ човешки инсулин)», 3Zn³*, (М^,®³*-тетрадеканоил Gin®³ човешки инсулин)», 3Zn²*, (№^вз*-деканоил Gin®³ човешки инсалин)_6| 3Zn²*, (1Ч*^В2*-додеканоил Gin®³ човешки инсулин)», 3Zn²*, (1М^ввз*-тридеканоил Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn²*·, (1М^вВ®*-тетрадеканоил Glu®³⁰ човешки инсулин)», ЗИл²*, (1Ч^ввз*-деканоил Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn²*, (Г4^вВ2*-додеканоил Glu®³⁰ човешки инсулин).,? 3Zn²*, (М*^вз*-тридеканоил Gly^A2X Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn³*, (1Ч^-вз^-тетрадеканоил Gly^A2x Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn²*, (N«®=*-gekaHOHл Gly^A2X Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn²*, (№^вз*-додеканоил Б1у^АЗХ Glu®³° човешки инсулин)», 3Zn³*, (№®³*-трмдеканоил Gly^A2X Gin®³ Glu®^3<:‘ човешки инсулин)», 3Zn²*, (М*®³*-тетрадеканоил Gly^A3X Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин)»,

3Zn³*, (N‘^,B3’’-gekaHon_A Gly^A3X Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn³*, (N*®³*-gogekaHQHA Gly^A2X Gin®³ Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Zn³*, (N·®³*—гридеканоил Ala^A2x Glu®³° човешки инсулин)», 3Zn²*, (№^в2’-тетрадеканоил Ala^A2X Glu®³⁰ човешки инсулин)», 3Ζη²*, (Н*®³*-деканоил А1а^А2Х Glu®³° човешки инсулин)», 3Zn²*, (^•^-додеканоил Ala^Aax Glu·³⁰ човешки инснлин)*, 3Zn^a*, (1Ч^,вВ2'’^,-тридеканоил Ala^Aax Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 3Ζη⁼·*·, (1Ч«в=**-тетрадеканоил Ala^A=x Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*,

3Zn²*, (№^В2’-деканоил Ala^Aax Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 3Zn²*, (№^В2^-додеканоил Ala^A2X Gin·³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 3Zn²*, (М*^ва**-тридеканоил Gin·³ Glu^B3° -човешки инсулин)*, 3Zn²*, (Ν*^Β2’-τετрадеканоил Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 3Zn²*, (N^,eB2’^r-gekaHOHA Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 3Zn²*,

(№^в2*”-додеканоил Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 3Zn²*.

%

Следващите примери са за предпочетени производни на човешкия инсулин, съгласно настоящото изобретение, в които инсулинов хексамер свързва четири гп²*-йона» (№В2«г__Тр_Идеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 4Ζη²*, (^•^-тетрадеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 4Zn²*, (М^жвач,-деканоил des(B30) човешки инсулин)*, 4Zn²·*·,

(1Ч*в2т_д_Одеканоил des(B30) човешки инсулин)*, 4Ζη²*, (М*^в=’’-тридеканоил Gly^Aax des{B30) човешки инсулин)*, 4Zn²*, • (Ν·“^Β3*-ι етрадеканоил Gly^A2x des(B30) човешки инсулин)*, 4Zn²*, (N·²*”—деканоил Gly^A3X des(B30) човешки инсулин)*, 4Zn²*, (№^в2*-додеканоил Gly^Aax des(B30) човешки инсулин)*, 4Zn^a*, (№^в=*»-тридеканоил Gly^A2X Gin·³ des(B30) човешки инсулин)*,

4Zn²*, (М*^в=чг-тетрадеканоил Gly^A2X Gin·³ des(B30) човешки инсулин)*, 4Zn²*, (1Ч*^В2*-деканоил Gly^Aax Gin·³ des(B30) човешки инсулин)*, 4Ζη²*, (№^В2’-додеканоил Gly^Aax Gin·³ des(B30) човешки инсулин)*,

4Zn² (№^ва*’-тридеканоил Ala^A2X des(ВЗО) човешки инсалин)*, 4Zn²*, (М^-В2*-тетрадеканоил Ala^A2x des(B30) човешки инсалин)*,, 4Zn²*, (1М*^ва*-деканоил Ala^A2x des(ВЗО) човешки инсалин)*,, 4Zn²*·, (М^-В2’-додеканоил Ala^A2x des(ВЗО) човешки инсалин)*, 4Zn²*, (М^-В2*-тридеканоил Ala^Aax Gin·³ des(ВЗО) човешки инсалин)*, 4Zn^a*, (^•ва^-тетрадеканоил Ala^A2x Gin*³ des(ВЗО) човешки инсалин)*,

4Zn²*,

(N«B=*-geka_Hou_A Ala^A2x Gin·³ des(B30) човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^вз*-додеканоил А1а^АЗХ Gin·³ des(B30) човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^В2,г-тридеканоил Gin·³ des(ВЗО) човешки инсалин)*, 4Zn³·*, (1Ч*^В2*-тетрадеканоил Gin·³ des(ВЗО) човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^в=ч'—деканоил Gin·³ des(ВЗО) човешки инсалин)*, 4Zn³*, (№^в=’’'-додеканоил Gin·³ des(B30) човешки инсалин)*, 4Zn²*, (1Ч*^В2*-тридеканоил човешки инсалин)*,4Ζη²*, (М^вВ2*^г-тетрадеканоил човешки инсалин)*, 4Zn³*, (М“ ^в=<*—деканоил човешки инсалин)*, 4Zn²*, (N*^Ba<T-gogekaHOH_A човешки инсалин)*, 4Zn²*, (Ν·^Β2^—ύридеканоил Gly^A3x човешки инсалин)*, 4Zn²*, (М^вВ2*-тетрадеканоил Gly^Aax човешки инсалин)*, 4Zn²*, (М^вВ2**-дек_анОил GlyAax човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^В2*-додеканомл Gly^A2X човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^В2*^г~тридеканоил Gly^A2x Gin·³ човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^В2*-тетрадеканоил-Gly^A2X Gin·³ човешки инсалин)*, 4Zn²*, (1Ч^вв=*-деканойл Gly^A2X Gin·³ човешки инсалин)*, 4Zn²*, (№^В2*-додеканоил Б1у^А2Х Gin·³ човешки инсалин)*, 4Zn²*, (ри дек анои л А1а^А2х човешки инсалин)*, 4Ζη²*, (1Ч^вач’-_Те_Традека_Ноил А1а^А2Х човешки инсалин)*, 4Zn^a*, (М*в=7-деканоил А1а^А2Х човешки инсалин)*, 4Zn³*,

(N-ea-r-gogekaHOMA Ala**“¹ човешки инсулин)*, 4Zn=*, (М-взт_тридеканоил Ala^A2X Gin·³ човешки инсулин)*, 4Zn³*, (М«в2*-теТрадеканоил Ala^A3X Gin·³ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (М.вгФ_д_еканоил Ala^A3X Gin·³ човешки инсулин)*, 4Ζπ=*, (Ш«в2«г_д_Одеканоил Ala^A2x Gin·³ човешки инсулин)*, 4Ζπ=*, (Ν·Β=^—гридеканомл Gin·³ човешки инсулин)*, 4Zn³*, (№·²⁷—тетрадеканоил Gin·³ човешки инсулин)*, 4Zn⁼ , (щаваФ-деканоил Gin·³ човешки инсулин)*, 3Zn²*, (1М«в2Ф_додеканоил Gin·³ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (М-^в=*-тридеканонл Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (№в=Ф__теТр_ад_еканоил Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn-·*, (щ-в=т_д_еканоил Glu®³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (_М.в₌Ф_д_Од_еканоил Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Ζη²*, (Г4-в2-г__трид_еканоил Gly^A2x Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Zn²*,

Ν«Β2’’’—тетрадеканоил Gly^A2X Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn , ^«ва-г-деканоил Gly^A2X Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Zn=*, (М-ваФ-додеканоил Gly^A2X Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Zn²*, (м-^В2*-тридеканоил Gly^A2X Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (М-в=*-_теТрадеканоил Gly^A2X Gin·³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Ζπ²*, ₍М-^в=7-деканоил Gly^A2X Gin·³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Zn²*, ₍М«ва«г_д_Одеканоил Gly^A=x Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (Миваф_ТрИдеканоил Ala^A2X Glu·³⁰ човешки инсулин)*,4Zn²*, ((Ч.в2-г__тетрадеканоил А1а^А2Х Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, <М-в2Ф_д_еканоил Ala^A3X Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (N«ват,додеканоил А1а^А=х Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, _(N-B2«r__Tридеканоил А1а^А2Х Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn³*, ^-ва-г-те-градеканоил А1а^А2Х Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, _(Г4-в2Ф_д_еканоил А1а^А2Х Gin·³ Glu·³⁰ човешки инсулин)*, 4Zn²*, (И^-в=*т-додеканоил Ala^Aai Gin·³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Zn²*, (№^Β3**^—тридеканоил Gin·³ Glu^B3° човешки инсулин)*,, 4Zn²*, (М*^В2’-тетрадеканоил Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Ζη²*, (№^В2’-деканоил Gln^B3 Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Ζπ²*, (М*^В2’-додеканоил Gin·³ Glu^B3° човешки инсулин)*, 4Zn²*.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

По-нататък настоящото изобретение се илюстрира чрез приложените Фигури, където

	Фиг. 1	показва	конст рни райето	на	плазмид	рЕА5.3.2. ;
V	Фиг . 2	показва	конструирането	на	плазмид	ρΕΑΙΟΘ; ί
м	Фиг . 3	показва	конструирането	на	плазмид	рЕАНЗ.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Терминология

Трибуквените кодове и еднобуквените кодове за аминокиселинните остатъци, използувани тук, са тези установени в J. Biol. Chem. 243, р. 3558 (1968).

В ДНК-последователностите А е аденин, С е цитозин, G е гуанин и Т е тимин

Използувани са следните акроними:

DMSO за диметилсулФоксид, DMF за диметилформамид, Вос за терт-бутоксикарбонил. RP-HPLC за обратноФазова високоефективна течна хроматография, X-OSu е N-хидроксисукцинимиден естер, X е ацилна група и TFA за триФЛУороцетна киселина.

»

Получаване на липОфилни производни на инсулина

Иснулиновйте производни, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат получени i. а., както е описано по-доль:

1. Инсулинови производни, характеризиращи се в позиция ВЗО с аминокиселнен остатък , който може да се кодира от генетичния код, напр. треонин (човешки инсулин) или аланин (прасешки инсулин).

1.1. Започване от човешки инсалин.

Човешки инсалин се третира - с Вос-реагент (напр. ди-тертбнтилдикарбонат), за да се образава (Al,В1)-diBoc-човешки инсалин, т. е., човешки инсалин, в който N-терминалните краища

на двете вериги са защитени от Вос-грапа. След асловно пречистване, напр. чрез HPLC, в β-аминограпата на Lys®²* се въвежда ацилна грипа като се създават асловия, продуктът да реагира с N-хидроксиснкцинимиден естер с *ормила X-OSu, където X е ацилната грипа, която трябва да се въведе. В последния етап се използнва TFA за отстраняване на Вос-грапите и се изолира продактът - М*^вг*-Х-човешки инсалин.

1.2. Започване от едноверижен инсулинов предшественик.

Като изходен материал може да се използува едноверижен исилинов предшественик, удължен в позиция В1 с удължение (Ext),

-което се свързва с В1 чрез аргининов остатък, и в който (предшественик) мостът от ВЗО до А1 представлява аргининов остатък, т. е. съединение с обща *ормала Ext-Arg-B(1-30)-АгдА(1-21). Ацилирането на този изходен материал с Nхидроксисакиинимиден_х естер с обща *ормила X-OSu, където X представлява >ацилна грипа, въвежда ацилната грипа X в еаминогрипата на предшественика. 'След третиране на този ацилиран предшественик с кормила (Ν“·²*-Χ),X-Ext-Arg-B(1-30)-Агд-А(1-21) с трипсин в смес от вода и подходящ водоразтворим органичен разтворител, напр. DMF, DMSO или алкохол от началния ред, се получава междинно съединение с Формала (Ν·®²’-Χ), Агд®³¹инсулин. Третирането на това междинно съединение с карбоксипептидаза В дава желания продукт, (Ν·®²’-Χ)-инсалин.

2. Инсулинови производни с липса на апинокиселинен остатък в позиция ВЗО, т. е. с!<&в(ВЗО)-ннснлинн .

2.1. Започване от човешки инсалин или прасешки инсалин

След третиране с карбоксипептидаза А в амониев буФер човешкият инсалин и прасешкият инсалин дават

След асловно пречистване, 0ев(В30)-инсалинът реагент (напр. ди-терт-батилоикарбонат). за да се образува (Al,В1)-diBoc-des(B30)-инсалин, т. е., des<ВЗО)-инсалин, в който

N-терминалният край на двете вериги е защитен от Вос-грапа. След асловно пречистване, напр. чрез HPLC, в β-аминограпата на Lys®²’ се въвежда ацилна грапа като се създават условия, продуктът да реагира с N-хидроксисакцинимиден естер с Формула X-OSu, където X е ацилната група, която трябва да се въведе. В последния етап се използува TFA за отстраняване на Вос-групите и се изолира

продуктът, (N*®^a’-X)-deB(B30)-u_Hca_AHH.

2.2. Започване от едноверижен предшественик на човешкия инсалин.

‘Подходящ изходен материал може да бъде едноверижен предшественик на човешкия инсалин, удължен в позиция В1 с удължение (Ext), което се свързва с В1 чрез аргининов остатък и който предшественик има мост от ВЗО до А1. Предпочита се мостът да е пептид с Формула У_п, където ¥ представлява кодираема аминокиселина с изключение на лизин и аргинин и п е нала или интеграл от 1 до 35. Когато п>1 Y-те могат да обозначават различни аминокиселини. Предпочетени примери за моста от ВЗО до

Al са: AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg и Arg (Европейски патент Ηξ 163592) . Третирането на такъв предшественик с обща

Формула Ext-Arg-B( l-30)-Yr>-Arg-A( 1-21) с лизинова ендопептидаза, напр. с протеаза на Achramobacter lyticus, дава Ext-Arg-B(l-29) Thr-Yr,-Arg-A( 1-21)des(ВЗО)-инсулин. Ацилирането на това междинно съединение е N-хидроксисукцмнимиден естер с обща Формула X-OSu, където X представлява ацилна група, въвежда ацилната група X в 6-аминогрупата на Lys^B=* и в N-терминалната аминогрупа на А-

феригата и на В-веригата за получаване на (N^-B3,r-X) X-Ext-ArgВ(1-29)X-Thr-Y_n-Arg-A(1-21)des(B30)-инсулин. Това междинно съединение след третиране с трипсин в смес от вода и подходящ органичен разтворител, напр. DMF, DMSO или алкохол от началния ред, дава желаното производно, (N-^B3*-X)des(ВЗО)-човешки

ИНСУЛИН.

Данни за №^{вз г}-модифицираните инсулини

Известни експериментални данни за И*^вя*-модиФицираните инсулини са дадени в Таблица 1.

ЛипоФилността на едно инсулиново производно е сравнение с тази на човешкия инсулин, k'_rwl, се измерва върху колона за HPLC LiChrosorb RP1S (5 мкм, 250x4 мм) чрез изократично елуиране при 40°С, използувайки като елеенти смеси от А) 0,1 М натрмевоФОСФат-ен буФер, pH 7,3, съдържащ 107. ацетонитрил и В) 507. ацетонитрил във вода. Елуирането се отчита чрез проследяване на UV-поглъщането на елната при 214 нм. Времето за изтичане на празния обем; се намира чрез инжектиране на 0,1 мМ натриев нитрат. Времето на задържане Аа човешкия инсулин, t human> С® довежда до минммнм 2t_o чрез вариране на отношението межди раз ТВОрИ А И В * к ^я ( v* tsd. ver” to )/( thuman to ) ·

Степента на забавяне в еаекта на понижаване на кръвната гликоза се изследва в зайци. Всяко инсулиново производно се тестира чрез подкожно инжектиране на 12 нмол във всеки от шест зайци в теста по забавяне в рамките на един ден. Вземането на кръвни проби за глюкозен анализ се извършва преди инжектирането и 1, 2, 4, и 6 часа след инжектирането. Намерените стойности за глюкозата се изразяват като процент от началните стойности.

Индексът на Забавяне, който се изчислява от стойностите за кръвната глюкоза, представлява разширеният Индекс на

Забавяне

(удължаване), виж стр. 211 в Markussen et al., Protein Engineering 1 (1987) 205-213. Формулата е разширена, за да се въведе стойност 100 с говежди ултралентен инсулин и стойност 0 с инсулин на Actrapid” (Nowo Nordisk А/S, 2ΘΒ0 Bagsvaerd,

Denmark ).

Инсулиновите производни, изброени е Таблица 1, се прилагат в разтвори, съдържащи 3 Zn^a* на инсулинов хексамер с изключение на тези, за които специално е отбелязано, че не съдържат Zn⁼*.

Моделът, който използува зайци, е неадекватен за аналози със

силно забавено действие, тъй като понижаването в началната стойност на кръвната глюкоза е твърде малко, за да се оцени индексът на забавяне. Забавеното действие на подобни аналози се характеризира по-добре чрез скоростта на изчезването им в прасета. Τ_βοκ е времето, за което 50% от А14 Tyr(^iaeI)-аналога изчезва от мястото на инжектиране, измерено чрез външен гамаброяч (Ritel, U et - al., The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in’ Man. Ini M. serrano-Rios and P.O. Lefebre (Eds): Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress of the International Diabetes Federation, Madrid, Spain, 1985 (Excerpta

Medica, Amsterdam, (1986) 891-96)).

В Таблица 2 са дадени Т_в0н-стойностите за серия инсулинови аналози със силно забавено действие. Аналозите се прилагат разтвори, съдържащи 3 Zn⁼* на инсулинв хексамер.

Таблица 1

Инсулиново производно	Относителна ЛИПОФИЛНОСТ	Кръвна глюкоза	Инсекс на забавяне
7. 1ч	от началната
2ч	4ч	6ч
[ц*в2Ф_5ензоилмнсалин	1,14
№,В2*-Фвнилацетилинснлин (без Zn)	1,28	55,4	58,9	88,8	90,1	10
NВ2’~циклохексил	1,90	53,1	49,6	66,9	81,1	28
ацетилинсалин
1ЧвВ2’-циклохексилпро-	3,29	55,5	47,6	61,5	73,0	39
пионилинсалин
№В2’-циклохекси л валероилинеалин	9,87	65,0	58,3	65,7	71,0	49
(ЧВ2’-октаноилинснлин	3,97	57,1	54,8	69,0	78,9	33
№В2’—деканоил, des(ВЗО)инсалин	11,0	74,3	65,0	60,9	64,1	65
МВ2*-деканоилинсалин	12,3	73,3	59,4	64,9	68,0	60
№в2’-андеканоил, des(ВЗО)инсалин	19,7	88,1	80,0	72,1	72,1	80
№В2’-лаарои л, des (ВЗО)	37,0	91,-	4 90,С	>84,:	2 83,9	78
инсалин
(Чв2*-миристоил-	113	98,5	92,0	83,9	84,5	97
инсалин
14 В2’-холои линеали н	7,64	58,2	53,2	69,0	88,5	20
№В2’-7-деокси холоилинсалин (без Zn)	24,4	76,5	65,2	77,4	87,4	35
№в=’—ли тохолои — инсалин (без Zn)	51,6	98,3	92,3	100,!	5 93,4	115
NB2’~4-бензоил-	2,51	53,9	58,7	74,4	89,0	14
«енилаланилинсалин
Ν·Β2’-3,5-дийодотирозмлинсалин	1,07	53,9	48,3	60,8	82,1	27
МВ2’-к-тирок|Сил-	8,00
инсалин

Таблица 2

	Производно на човешки инсулин	Относителна хидроФобност	Подкожно изчезване в прасета
	600 мкМ, 32п2*/хексамер, Фенол 0,3%, глицерол 1,6%, pH 7,5	k'r.i	Твои, часове
	МвВ2**деканоил des(ВЗО)инсулин	11,0	5,6
	№вз*ундеканоил des(ВЗО)инсулин	19,7	6,9
	(Ч'вВ2*лауроил des(ВЗО)инсулин	37	10,1
М	№В2*тридеканоил des(ВЗО)инсулин	65	12,9
	(Ч-В2*ммристоил des(ВЗО)инсулин	113 *	13,Θ
	Ν·Β=’πβΛΜΗ таил des(ВЗО)инсулин	346	12,4
	(Ч*В2,гсукцинимидомиристинова киселина ИНСУЛИН	10,5	13,6
	№В2*’ми ри стоил ИНСУЛИН	113	11,9
	Човешки NPH		10

Разтворимост

Разтворимостта на всички И*^в2^-модиФицирани инсилини,

изброени в Таблица 1,	които съдържат 3	Zn2*	йони	на инсулинов
хексамер, надвишава 600	нмол/мл	в неутрален	(pH	7,5)	воден
Фармацевтичен препарат,	който	съдържа	още	0,3%	Фенол	като

консервант и 1,6% .глицерол за придобиване на изотничност. 600 нм/мл е концентрацията на човешки инсулин, намерена в клиниката.

препаратите от 100 Е/мл, които обикновено се използуват в е-Аминогрупата може да бъде компонент на амидна връзка, снлФОнаммдна връзка, карбамидна, тиокарбамидна или карбамат.

Липофилният заместител, който се носи от е-В29-аминогрупата може да бъде също алкидна група

Фармацевтични препарати, съдържащи производно на човешкия

ИНСУЛИН в съгласие с настоящото изобретение, могат да се прилагат парентерално на пациенти при необходимост от такова лечение.

Парентералното приложение може да се извърши чрез подкожно интрамускулно или интравенозно инжектиране посредством

спринцовка, примерно с инсулинова спринцовка. Като алтернатива парентералното приложение може да се извърши поередством инФнзионна помпа

Друга възможност представлява препарат, който може да бъде на прах или течен за приложение на производното на човешкия инсулин под Формата на назален спрей

Инжекционните препарати от човешки

ИНСУЛИН на изобретението могат да се приготвят чрез използуване на конвенционалните техники на Фармацевтичната индустрия, които включват разтваряне и смесване на инградиентите по съответен начин за получаване на желания продукт

Така съгласно една процедура производното на човешки я •'инсулин се разтваря в количество вода, което е малко по-малко от крайния обем на препарата, който се приготвя

Прибавят се изотонинен агент, консервант и бнжер съгласно изискванията ако е необходимо, рН-стойността на разтовора се нагласява като в зависимост от случая .се използува киселина, напр. солна киселина или база, напр.

воден разтвор на натриева основа. Накрая обемът на разтвора се довежда с вода', за да се получи желаната концентрация на инградиентите.

Примери за изотонични агенти са натриев хлорид, манитол и глицерол

Примери за хидроксибензоат и

Примери за бензилов алкохол подходящи буфери са натриев ацетат и натриев ♦осоат

Препарат за съгласно както

A/S) назално приложение на производно на настоящото описано в

Инсулиновите инсулина, изобретение, може да се приготви например,

Европейски препарати патент на това

Н? 272097 (по

Novo Nordisk изобретение могат да се

използуват за всеки пациент ефективността лечение на ще зависи диабет. Оптималното ниво на дозата за от разнообразни Фактори, на специфичното производно на човешкия включващи инсулин, което се прилага, възрастта, телесното тегло. Физическата активност, диетата на пациента, възможна комбинация с други

Препоръчва се дневната дозировка от производно на човешкия инсулин на това определя за всеки индивидуален пациент от професионалистите по начин, сходен този за известните

инсулинови препарати

Когато е целесъобразно производните на човешкия инсулин на това изобретение могат да се използуват в смес с други типове

ИНСУЛИН, напр. човешки инсулин, прасешки

ИНСУЛИН или

ИНСУЛИНОВИ аналози по-бързо начално действие

Примери за такива инсулинови аналози са описани напр заявки за

Европейски патент с пнбликационни номера

ЕР 214826 (Novo Nordisk A/S), ЕР

375437 (Novo Nordisk A/S) и ЕР

383472 (Eli Lilly & Co. ) .

По-нататък настоящото изобретение се илюстрира от следните примери, които обаче не трябва да се разглеждат като ограничаващи обхвата на защита. Особеностите, представени в досегашното описание и в следващите примери могат както поотделно, така и във всевъзможни комбинации да представляват материал за реализиране на изобретението в разнообразни Форми

ПРИМЕРИ ЗА

ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Плазмиди и ДНК-материал

Всички експресионни плазмиди са от типа сРОТ. Такива плазмиди са описани в заявка заг Европейски патент № 171 142 и се характеризират с това, че за целите на плазмидна селекция стабилизация съдържат триозоФОСФатизомеразния (РОТ) ген на

Schizosaccharomyces pombe. Плазмид, съдържащ РОТ-гена може да се полачи от депозиран щам Е. coli (ATCC 39685)

Плазмиди те съдържат още трмозоФОСФатизомеразния промотор и терминатор на S.

cerevisiae (Ρ_τ«ι и Т-гмх ) · Те са идентични с рМТ742 (Egel-Mitani,

М. et al., Gene 73 (1988) 113-120) (виж Фиг. 1) c изключение на областта, дефинирана от рестриктазнмте места EcoRI-Xbal, коитоо обхващат областта, кодираща сигнал/лидер/продукт.

Синтетични ДНК-Фрагменти се синтезират на автоматичен

ДНК-синтезатор (Applied Biosystems, модел 3Θ0Α) чрез използуване на ФОСФороамидитната химия и търговски достъпни реагенти

(Beaucage, S.L. and Caruthers, M.H.,.

Tetrahedron Letters 22 * (1981) 1859-1869)

Всички останали методи и материали, които са използнвани, са достояние на специализираното знание (виж, напр. Sambrook,

J ., Fritsch,

E.F. and Maniatis, T., Molecular Clonings A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New

York, 1989). ¹

Аналитични

Молекулните маси на получените инсулини се получават чрез

MS (масспЬктрометрия) - или чрез PDMS (плазма-десорбционна масспектрометрия) използувайки Bio-Ion 20 иструмент (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden) или чрез ESMS (електроспреймасспектрометрия) като се използува API III Biomolecular Mass Analyzer (Prekin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Canada).

ПРИМЕР 1

Синтеза на А1а^АгхАвр^вз-предшественик на човешкия инсулин от дрождения щам уЕА002 чрез използуване на сигнал/лидера

LaC212spx3.

Синтезират се следните олигонуклеотиди:

#98 5'-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCA

CT.TGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAA AGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' Asp³ (SEQ ID N0:3) #128 5'-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTАСАА

AGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTC GTCAGACTTTGG-3' (Ala^Aax) (SEQ ID N0:4) #126 5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3' Asp^B3 (SEQ ID N0:5) #16 5'-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (SEQ ID N0:6)

Провежда се следната Полимеразна верижна реакция (ПВР) чрез.използуване на набора реагенти Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) съгласно указанията на производителя. Във всички случаи ПВР-сместта се надслоява със

100 мкл минерално масло (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0, t

USA). . ’

2,5 мкл олигонуклеотид #98 (2,5 пмол)

2,5 мкл олигонуклеодид #128 (2,5 пмол) мкл 10Х ПВР-бу*ер мкл dNTP-смес

0,5 мкл Taq-ензим

58,5 мкл вода

Провежда се едмн цикъл: 94°С за 45 сек., 49°С за 1 мин, 72°С за 2 мин.

След това се прибавят 5 мкл от олигонуклеотиди #16 и #126 и се провеждат 15 цикъла: 94°С за 45 сек., 45*С за 1 мин, 72°С за 1,5 мин. ПВР-сместа се нанася на 2,57. агарозен гел и се подлага на електрофореза посредством стандартни техники (Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbour

Laboratory Press, 1989), Полученият ДНК-Фрагмент се изрязва от агарозния гел и се изолира чрез използуване на набора реагенти Gene Clean (Bio 101 Inc., P0 BOX 2284, La Jolla, CA 92038, USA) съгласно инструкциите на производителя. Пречистеният ПВР ДНК*

Фрагмент се разтваря в 10 мкл вода и бнФер за рестрикционни ендоннклеази и се срязва с Ncol и Xbal съгласно стандартни техиники, разделя се на 2,5% агарозен гел и се пречиства посредством набора реагенти Gene Clean, както е описано по-горе.

Плазмидът ρΑΚΙββ се състои от 412 нд (нуклеотидни двойки)

ДНК-последователност, съставена от EcoRI/NcoI-Фрагмент, кодиращ гена LaC212spx3 със синтетичен дрожден сигнал/лидер .Пример 3 на W0 89/02463), последван от синтетичен (описан в

Ncol/Xbalфрагмент, кодиращ инсулиновия предшественик MI5, който има

SerAspAspAlaLys-мост, свързващ аминокиселинните остатъци В29 и

А1 (виж SEQ ID, номера 14, 15 и

16). Двата Фрагмента са включени в EcoRI/Xbal-Фрагмента на вектора (Фейзмид) pBLUESCRIPT Ilsk (+/-) (Stratagene, USA). Плазмидът рАК188 е показан на Фиг. 1.

Плазмидът 'рАК188 също -се срязва с рестрикционните ендонуклеази Ncol и Xbal и се изолира векторният Фрагмент от

3139 нд.Двата ДНК-Фрагмента се лигмрат заедно чрез Т4 ДНК-лигаза при стандартни условия (Sambrook et al., Molecular cloning, Cold

Spring Harbour Laboratory Press, 1989).

Аигазната смес се

трансформира в компетентен щам на Е. coJi (R-, М+) последвано от селекция за ампицилинова устойчивост. От получените колонии на Г. coli се изолират плазмиди по стандартната ДНК-минипреп техника (Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) и се проверяват със сответните рестрикционни ендоннклеази, т.е., EcoRI, Xbal, Ncol И Hpal. Чрез ДНК-секвенционен анализ (Sequenase, (J.S. Biochemical Corp.) се показва, че избраният плазмид съдържа правилната последователност на А1а^А2ХА5р^вз-предшественика на човешкия инсулин и плазмидът се нарича рЕАб.З.

Плазмидът pKFN1627 е Е. coii-S. cerevisiae вектор-совалка (шатъл вектор), идентичен с плазмида pKFN1003, описан в

Европейски патент Н? 375718, с изключение на къса ДНКпоследователност пред _v уникалното Xbal-място. В pKFN1003 тази последователност представлява

178-нд Фрагмент, кодиращ

синтетичен апротининов ген, свзрзан в рамка със сигнал-лидерната последователност на дрождения полов Фактор алФа 1. В pKFN1627 съответната 184 нд последователност кодира инсулиновия предшественик MI5 (Glu®¹·, Glu®²®) (т.е. B(l-29, Glu®^A· Glu®²®)SerAspAspAlaLys-A(1-21), свързан врамка с последователността на половия Фактор ал»а 1 (виж SEQ ID, номера 17, 18 и 19). Векторът pKFN1627 е показан на Фиг. 1.

рЕАб.З се срязва с рестрикционните ендоннклеази EcoRI и

Xbal и се изолира полученият ДНК-Фрагмент от 412 нд. Дрожденият експресионен ’вектор pKFN1627 се срязва с рестрикционните ендоннклеази Ncol и Xbal и с Ncol и EcoRI като от първото разграждане се изолира ДНК-Фрагментът от 9273 нд, а от второто ДНК-Фрагментът от 1644 нд. След това чрез използуване на стандартни‘техники EcoRI/XbaI-Фрагментът от 412 нд се лигира с останалите два Фрагмента, т. е. Ncol/Xbal-Фрагмента от 9273 нд и

Ncol/EcoRI-Фрагмента от 1644 нд.

Аигазната смес се трансформира а Е. coli, както е описано по-горе. Чрез използуване на стандартни техники от получената Е. coli се изолира плазмид и се проверява със съответните рестрикиионни ендонуклеази, т. е. EcoRI, Xbal, Ncol, Hpal. Чрез ЙНК-секвениионен анализ (като се използува секвеназния набор реагенти, както е описано от производителя, U.S. Biochemical) се показва, че избраният плазмид съдържа правилната ДНК-

последователност за А1а^АахАвр^вз-прдшественика на човешкия инсулин и че тя е включена след ДНК, кодираща сигнал/лидерната АНК на L_aC212spx3. Плазмидът се нарича рЕА5.3.2 и е показан на

Фиг. 1. АНК-последователността, кодираща комплекса: LaC212spx3 *

сигнал/лидер/А1а^АахАвр^вз—предшественик на човешкия инсулин и съответстващата и амихокиселинна последователност представляват последователности SEQ ID, номера 20, 21 и 22. Плазмидът рЕА5.3.2 се трансформира в S. cerevisiae, щам МТ663 както е описано в заявката за Европейски патент с публикационен номер 214Θ26 и полученият щам се нарича уЕА002.

ПРИМЕР 2 ‘ Синтеза на А1а^АахТЬг^вз-предшественик на човешкия инсулин от дрождения щам уЕАООб чрез използуване н сигнал/лидера на

LaC212spx3

Синтезират се следните олигонуклеотиди:

#101	5'-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTT GGTtGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACA CTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (ThrBS) (SEQ ID N0:7)
#128	5'-CTGCGGGCTGCGTCTAAGCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAA GAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCTTAGCGTCG

TCAGACTTTGG-3' (Ala^ax) (SEQ ID N0:4) #15 #16

5'-GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTA-3'

5'-CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (SEQ ID N0:6) йНК, която кодира А1 а^АЯХТ1->г^в:3-предшественика на човешкия инсулин се конструира по същия начин, както е описано за ДНК, кодираща А1а^АгхА5р^вз-предшественика на човешкия инсулин в Пример кЬдираща комплекса:

LaC212spx3 сигнал/лидер/А1а**^ахТНг^вз предшественик на човешкия инсулин и съответствувашата и аминокиселинна последователност са SEQ ID,

номера 23, 24 и 25. Показва се, че плазмидът рЕАв.1.1 съдържа желаната последователност, трансжормира се в щам МТ663 на cerevisiae, както е описано в Пример 1 и полученият щам се нарича уЕА005

ПРИМЕР 3

Синтеза на 61у^АгхАзр^в;3-предшественик на човешкия инсулин от дрождения щам уЕА007 чрез използуване н сигнал/лидера на

LaC212spx3

Синтезират се следните олигонуклеотиди #98

5'-TGGCTAAGAGATTCGTTGACCAACACTTGTGCGGTTCTCACTTG

GTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCT

ACACTCCAAAGTCTGACGACGCT-3'(Asp®³) (SEQ ID N0:3) #127

5'-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA

AGAACAGATAGAAGTACAACATTGTTCAACGATACCCT

TAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' (Gly^Aax) (SEQ ID N0:9) #126

GTCGCCATGGCTAAGAGATTCGTTG-3' (Asp®*) (SEQ ID N0:5) #16

CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' (SEQ ID N0:6)

ДНК, която кодира 61у^АахАзр^вз-предшественика на човешкия инсулин се' конструира по същия начин, както е описано за ДНК, кодираща Al а^л=1Авр^в:з-предшес твеника на човешкия инсалин в Пример

1. ЙНК-последователността, кодираща комплекса:

LaC212spx3 сигнал/лмдер/61у^лзхА5р^вз-предшественик на човешкия инсалин и съответствнващата и аминокиселинна последователност са SEQ ID,

номера 26, 27 и 28. Показва се, че плазмидът рЕА1.5.6 съдържа желаната последователност, трансформира се в щам МТ663 на S. cerevisiae. както е описано в'Пример 1 и полученият щам се нарича уЕА007.

ПРИМЕР 4

Синтеза на Gly^A2iThr^B3-npegtuecTBeHMk на човешкия инсулин от дрождения щам уЕАООб чрез използуване н сигнал/лидера на

LaC212spx3

Синтезират се следните олигонуклеотиди:

#101 #127 #15 #16

5'-TGGCTAAGAGATTCGTTACTCAACACTTGTGCGGTTCTCACTT

GGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACA

CTCCAAAGTCTGACGACGCT-3' (Thr^BS) (SEQ ID N0:7)

5'-CTGCGGGCTGCGTCTAACCACAGTAGTTTTCCAATTGGTACAA

AGAAC AG AT AGAAGT ACAACAT TGT ТС A ACG АТ АСССТ

TAGCGTCGTCAGACTTTGG-3' (Gly^A2x) (SEQ ID N0:9) (SEQ ID N0:8)

CTGCTCTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCT-3' ( SEQ ID N0:6)

ДНК, която кодира 61у^А21ТЬг^вз-предшественика на човешкия инсулин се конструира по същия начин, както е описано за ДНК, кодираща А1а^А2ХАвр^в;3-предшественика на t

1. ΔΗΚ-последоватеЛността, кодираща човешкия инсулин в Пример комплекса:

LaC212spx3 с игнал/лидер/61у**^а?-ТКг^вз-предшес твеник на човешкия

ИНСУЛИН и съответствуващата и аминокиселинна последователност са SEQ ID, номера 29, 30 и 31. Показва се, че плазмидът рЕА4.4.11 съдържа желаната последователност, трансформира се в щам МТ663 на S.

cerevisiae, както е описано в Пример 1 и полученият шам се нарича уЕАООб.

ПРИМЕР 5

Синтеза на Агд^в“^хАгд^ВЗЛ--едноверижен предшественик на човешкия инсулин с N-крайно удължение (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) от дрожения шам уЕАНЗ чрез използуване на лидера на ал«а-*актора.

А)

Синтезират се следните олигонуклеотиди

#220

5'-ACGTACGTTCTAGAGCCTGCGGGCTGC-3' (SEQ ID N0:10) #263 #307

5'-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTC

TTCTACACTCCAAAGACTAGAGGTATCGTTGAA-3' (SEQ ID N0:11)

5'-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCT

AGATTCGTTAACCAACAC-3' (SEQ ID N0:12)

Провежда се следната полимеразна верижна реакция (ПВР)

чрез използуване на набора реагенти Gene Amp PCR (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT 06859, USA) съгласно инструкциите на производителя. Във всички случаи ПВР-сместа се надслоява със 100 мкл минерално масло (Sigma Chemical Co, St. Louis, M0, USA). Плазмидът pAK220 (който е идентичен c ρΑΚΙΘΘ) се състои от 412 нд ДНК-последователност, кодираща синтетичния дрожден сиг.нал/лидер LaC212spx3 (описан в Пример 3 на N0 89/02463), следвана от инсулиновия предшественик MI5 (виж SEQ ID, номера 14, 15 и 16), включен във вектора (*ейзмид) pBLUESCRIPT Ilsk (+/-) (Stratagene, USA).

мкл олигонуклеотид #220 (100 пмол) мкл олигонуклеотид #263 (100 пмол) мкл 10Х ПВР-бу*ер мкл dNTP-смес

0,5 мкл -Taq-ензим

0,5 мкл плазмид рАК220 (идентичен с ρΑΚΙΘΘ) като матрица (0,2 мкг ДНК) мкл вода

Провеждат се общо 16 цикъла, като всеки цикъл включва 1 сместа се нанася на 27. агарозен гел и се провежда електрофореза като се използуват стандартни техники. Полученият ДНК-Фрагмент се изрязва от агарозния гел и се изолира чрез използуване на набора реагенти Gene Clean (Bio

101 Inc., PC

СА 9203Θ, USA) съгласно инструкциите на производителя

Пречистеният ПВР

ДНК-Фрагмент се разтваря в мкл вода и бувер за рестрикционни ендонуклеази е се срязва рест рикционните ендонуклеази Hindi II и Xbal в съгласие със стандартни техники

Фрагментът HindiΙΙ/XbaI се пречиства като се използува наборът

Gene Clean, както е описано

Плазмидът рАК406 се състои от 520 нд ДНКпоследователност, включваща EcoRI/Hindi 11-Фрагмент , получен от рМТбЗб (описан в W0 90/10075), кодиращ лидера на дрождения алФаФактор и част от инсулиновия предшественик, лигиран към

Hindi 11/Xbal-Фрагмента от	ρΑΚΙββ,	кодираш	останалата	част	от
инсулиновия предшественик	ΜΙ5 (ви	ж SEQ ID,	номера 32,	33 и	34) ,
включен във вектора сРОТ.	Векторът	рАК406 е	показан на	Фиг.	2.
Плазмидът рАК233	се	състои	от 412	нд	ДНК-

кодираща синтетичния последователност, дрожден сигнал/лидер

LaC212spx3 (описан в Пример на W0 89/02463), следван от гена за инсулиновия предшественик

В(1-29)-GluLysArg-A(1-21)(A21-Gly) (виж SEQ ID, номера, „35, 36 и 37), включен във вектора сРОТ.

Плазмидът рАК233 е показан на

ФИг. 2

Плазмидът рАК233 се срязва с рестрикционните ендонуклеази

Ncol -и Xb.al и се изолира векторният Фрагмент от 9273 нд.

Плазмидът рАК406 се срязва с рестрикционните ендонуклеази Ncol и Hindi II и се изолира векторният Фрагмент от 2012 нд. Тези два АНК-Фрагмета се лигират заедно с Hindi 11/ХЬа1-ПВР-фрагмента при стандартни условия с Т4 ДНК-лигаза. След това лигазната смес се трансформира в компетентен щам на Е. coli (R-, М+) с последваща селекция за ампицилинова устойчивост. Плазмидите се изолират от получените колонии на Е. соН чрез стандартна АНК-минипреп техника и се проверяват със съответните рестрикционни

ендонуклеази, т.е. EcoRI, Xbal , Ncol, Hindlll. Чрез АНКсеквенционни анализи се показва, че отбаният плазмид съдържа правилната последователност за АНК на АгдВ^зх-едноверижния предшественик на човешкия инсалин, която е включена след АНК, кодираща алФа-Фактора на S. cerevisiae. Плазмидът се нарича ρΕΑΙΟΘ и е показан на Фиг. 2. АНК, кодираща комплекса: лидер на алФа-Фактора/Агд^в31-едноеерижен предшественик на човешкия инсалин и съответстваващата и аминокиселинна последователност са SEQ ID, номера 38, 39 и 40. Плазмидът рЕА108 се трансформира в щам МТ663 на S. cerevisiae, както е описано в Пример 1 и полаченият щам се нарича уЕА108.

В)

Провежда се следната полимеразна верижна реакция (ПВР) чрез използуване на набора реагенти Gene Amp PCR (Perkin Elmer,

76Ϊ Main Avewalk, CT 06859, USA) съгласно инструкциите на производителя. Във всички случаи ПВР-сместа се надслоява със 100 мкл минерално масло (Sigma Chemical Co, St. Louis, M0, USA).

мкл олигоннклеотид #220 (100 пмол) мкл олигонуклеотид #307*(100 пмол) мкл 10Х ПВР-буФер мкл dNTP-смес

0,5-мкл Taq-ензим

0,2 мкл плазмид ρΕΑΙΟβ като матрица (0,1 мкг ДНК) мкл вода

Провеждат се общо 16 цикъла, като всеки цикъл включва 1

минута на 95°С; 1 мината на 40°С; и 2 минати на 72 °C. След това сместа се нанася на 27. агарозен гел и се провежда електрофореза като се използуват стандартни техники. Полученият ДНК-Фрагмент се изрязва от агарозния гел и - се изолира чрез използуване на набора реагенти Gene Clean (Bio 101 Inc., P0 BOX 22Θ4, La Jolla, CA 92038, USA) съгласно инструкциите на производителя. Пречистеният ПВР ДНК-Фрагмент се разтваря в 10 мкл вода и баФер за рестрикционни ендоннклеази и се срязва с рестрикционните ендонаклеази Ncol и Xbal в съгласие със стандартни техники. Фрагментът Ncol/Xbal се пречиства като се използува наборът Gene

Clean, както е описано.

Плазмидът рАК401 се състои от 523 нд ДНКпоследователност, съставена от EcoRI/Ncol-Фрагмент, получен от рМТбЗб (описан в W0 90/10075) (конструиран чрез въвеждане на Ncol-място в 3'-края на алФа-лидера чрез целенасочена мутагенеза), кодираш лидера на алФа—Фактора, последван от Ncol/Xbal-Фрагмент на ρΑΚΙββ, кодиращ инсулиновия предшественик *’ ΜΙ5 (виж SEQ ID, номера 41, 42 и 43), включен във вектора (Фейзмид) pBLUESCRIPT IIsk(+/-) (Stratagene, USA). Плазмидът pAK401-е показан на Фиг. 3.

Плазмидът рАК401 се срязва с рестрикционните ендонвклеази

Ncol и Xbal, векторният Фрагмент от 3254 нд се изолира и се лигира заедно· с Ncol/XbaI-ПВР-Фрагмента. След това лигазната смес се трансформира в компетентен щам на Е. coli и от получените колонии на Е. coli чрез стандартна ДНК-минипреп техника се изолират плазмиди и се проверяват със съответните рестрикциойни ендонуклеази, т.е. EcoRI, Xbal, Ncol. Избраният плазмид, наречен рИЗА (показан на Фиг. 3) се срязва с EcoRI и

Xbal и се изолира Фрагментът от 535 нд.

Плазмидът рАК233 се срязва с рестрикционните ендоннклеази Ncol и Xbal и с EcoRI/NcoI и се изолират фрагментите от 9273 и 1644 нд. Тези два ДНК-Фрагмета се лигират заедно с EcoRI/XbalФрагмента от рИЗА при стандартни условия с Т4 ДНК-лигаза. След това лигазната смес се трансформира в компетентен шам на Е. coli (R-, М+) с последваща селекция за ампицилинова устойчивост.

Плазмидите се изолират от получените колонии на Е. coli чрез

стандартна ДНК-минипреп техника и се проверяват със съответните рестрикционни ендоннклеази, т.е. EcoRI, Xbal, Ncol, Hindlil. Чрез ДНК-секвенционни анализи се показва, че избаният плазмид съдържа правилната последователност за ДНК на АгдВ³¹ едноверижнмя предшественик на човешкия инсулин с N-крайното удължение GluGluAlaGluAlaGluAlaArg, която е включена след ДНК, кодираща алФа-Фактора на S. cerevisiae. Плазмидът се нарича рЕАНЗ и е показан на Фиг. 3. ДНК, кодираща комплекса лидер на алФа-Фактора/Arg®^-1· Агд^вз1-едноверижен предшественик на човешкия

инсулин, имащ N-крайно удължение (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg) и съответствуващата и аминокиселинна последователност са SEQ ID, номера 44, 45 и 46. Плазмидът рЕАНЗ се трансформира в щам МТ663 на S. cerevisiae, както е описано в Пример 1 и полученият щам се нарича - уЕАНЗ.

ПРИМЕР 6

Синтеза на Агд^в_хАгд^в351--едноверижен предшественик на човешкия инсулин с N-крайно ндлжение (GluGIuAlaGluAlaGluAlaGIuArg) от дрождения щам уЕА136 чре:« използуване на лидера на алФа-Фактора.

Синтезира се следният олигоннклеотид:

#309

5'-GCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCGAAG

CTGAAAGATTCGTTAACCAACAC-3’ (SEQ ID Ν0·.13)

Провежда се следният ПВР чрез използуване на набора

реагенти Gene Amp PCRs мкл олигонуклеотид #220 <100 пмол) мкл олигонуклеотид #389 (100 пмол) мкл 10Х ПВР-бу*ер мил dNTP-смес

0,5 мкл Taq-ензмм мкл плазмид рЕАНЗ като матрица (0,5 мкг АНК) мкл вода

Провеждат се общо 12 цикъла, като всеки цикъл включва 1 минута на 95°С; 1 минута на 37®Cj и 2 минути на 72°С.

ДНК, кодираща лидер на ал*а—♦актора/Агд^в_хАгд^взхедноверижен предшественик на човешкия инсулин с *

удлжение (GluGluAlaGluAlaGluAlaGluArg) се конструира начин, както е описано за АНК, кодираща лидер

N—крайно по същия на ал*а*актора/Агд^в_хАгд^взх—едноверижен предшественик на инсулин с N-крайно удлжение (GluGluAlaGluAlaGluAlaArg)

5. Плазмидът се нарича рЕА136. ДНК-последователността,

човешкия в Пример кодираща човешкия инсулин с N-крайно удлжение (GluGluAlaGluAlaGluAlaGlu

Arg) и съответствуващата и аминокиселинна последователност са

SEG ID, номера 47, 4В и 49. Плазмидът рЕА136 се трансформира в щам МТфбЗ на S. cerevisiae, както е описано в Пример 1 и полученият щам се нарича уЕА136.

ПРИМЕР 7

Синтеза на (Al,В1)-diBoc човешки*инсулин.

г човешки инсулин, несъдържащ цинк, се разтварят в 41,3 мл DMS0. Към рагтвора се добавят 3,090 мл оцетна киселина.

Реакцията*се провежда на стайна температура и се инициира чрез добавяне на 565 мг ои-терт-Бутилов пирокарбонат, разтворен в 5,650 мл DMSO. Реакцията се оставя да протича в продължение на 5iz2 _Часа и след това се спира чрез прибавяне на 250 мкл етаноламин. Продуктът се утаява чрез добавяне на 1500 мл ацетон. Утайката се изолира чрез центрофугиране и се изсушава под вакуум. Получава се добив от 6,85 г.

(Al,В1)-diBoc-инсулинът 'се пречиства чрез обратноФазова високоефективна течна хроматография (HPLC), както следва:

Суровият продукт се разтваря в 100 мл 257. етанол във вода, довежда се go pH 3,0 със НС1 и се нанася върху колона (5 см диаметър, 30 см височина), опакована с октадецилдиметилсилилзаместени силициеви частици (средна големина на частиците 15 мкм, големина на порите 100 и уравновесена с елуиращ бнаер.

А

Елуирането се извършва като се използуват смеси от етанол и 1 мМ воден НС1, 0,3 М КСД при проточна скорост 2 л/ч. Инсулинът се елуира при покачване на етанолното съдържание dt 30% до 45%. Съответната Фракция се разрежда до 20% етанол и се утаява при pH

4,8. Утаеният материал се изолира чрез центрофугиране и се

изсушава под вакуум. Така се получават 1,701 r (Al,В1)-diBoc човешки инсулин с чистота 94,5%.

ПРИМЕР 8

Синтеза на (Ν·^β=τ-5βη3Οηλ човешки инсулин)* 3Zn^a*.

400 мг (Al,В1)-diBoc човешки инсулин се разтварят в 2 мл

DMSO. Към разтворът се добавят 748 мкл смес от N-метилморФОлин и ί

DMSO (1:9, обем/обем). Реакцията се провежда при 15°С и се инициира чрез прибавяне на 14,6 мг N-хидроксисвкцинимиден естер на бензоената киселина, разтворен в 132 мкл DMF. Реакцията се прекратява след 2 часа чрез добавяне на 100 мл ацетон. Утаеният материал се изолира чрез центрофугиране и се изсушава nog вакуум. Събират се 343 мг материал.

Вос-защитните грнпи се отстраняват чрез добавяне на 4 мл TFA. Разтвореният материал се инкнбира 30 минути и след това се утаява чрез добавяне на 50 мл ацетон. Утайката се изолира чрез центрофугиране и се изсушава под вакуум.

N*^B=*—бензоил човешкият- инсулин се пречиства чрез

обратноФазова HPLC, както е описано в Пример 7. Получава се добив от 230 мг. Рекристализация из 15% етанол във вода, съдържаш 6 мМ Zn²* и 50 мМ цитрат при pH 5,5 дава кристали от титулното съединение, които се изолират чрез центрофугиране и се изсушават под вакуум. Добивът е 190 мг.

Молекулна маса, намерена чрез MS (масспектрометрия):

5911, теория: 5911.

ПРИМЕР 9

Синтеза на (1Ч^-в2*-литохолоил човешки инсулин)», 3Zn⁼*.

400 мг (Al,В1)-diBoc човешки инсулин се разтварят в 2 мл

DMSO. Към разтворът се добавят 748 мкл смес от N-метилморФОлин и

QM8Q (1:9, обем7обем). Реакцията се провежда при 15°С и се инициира чрез прибавяне на 31,94 мг N-хидроксисукцинимиден естер на литохоловата киселина, разтворен в 300 мкл DMF. Реакцията се прекратява след 2 часа чрез добавяне на 100 мл ацетон. Утаеният материал се изолира чрез центрофугиране и се изсушава под вакуум. Получават се 331 мг материал.

Вос-защитните групи се отстраняват чрез добавяне на 4 мл

TFA. Разтвореният м'а'териал се инкнбира 30 минути и след това се утаява чрез добавяне на 50 мл ацетон. Утайката се изолира чрез центрофугиране и се изсушава под вакуум. Добивът е 376 мг.

В29-литохолоил инсулинът се пречиства чрез обратноФазова HPLC, както е описано в Пример 7. Получава се краен добив от 67 мг при чистота 94%. Рекристализация из 157. етанол във вода, съдържащ 6 мМ Zn²* и 50 мМ цитрат при pH 5,5 дава кристали от титулното съединение, които се изолират чрез центрофугиране и се изсушават под вакуум. Добивът е 49 мг.

Молекулна маса, намерена'чрез MS: 6160, теория: 6166.

ПРИМЕР 10

Синтеза на (№^и=’-деканоил човешки инсулин)^, 3Zn²*.

400 мг (Al,В1)-diBoc човешки инсулин се разтварят в 2 мл DMS0. Към разтворът, се добавят 74В мкл смес от N-метилморФОлин и DMS0 (1:9, обем/обем). Реакцията се провежда при 15°С и се инициира чрез прибавяне на 1В мг N-хидроксиснкцинимиден естер на декановата киселина, разтворен в 132 мкл DMF. Реакцията се прекратява след 60 минути и продуктът се утаява чрез добавяне на 100 мл ацетон. Утаеният материал се изолира чрез центрофугиране и се изсушава под вакуум. Събират се 420 мг междинен продукт.

Вос-защитните групи се отстраняват чрез добавяне на 4 мл TEA. Разтвореният материал се инкубира 30 минути и след това продуктът се утаява чрез добавяне на 50 мл ацетон. Утайката се изол.ира чрез центрофугиране и се изсушава под вакуум. Добивът на снров продукт е 420 мг.

Суровият продукт се пречиства чрез обратноФвзова HPLC, както е описано в Пример 7. Получава се краен добив 254 мг от »

титулния продукт.. Чистотата е 96,17.. Рекристализация из 157. етанол във вода, съдържащ 6 мМ Zn²* и 50 мМ цитрат при pH 5,5 дава кристали от титулното съединение, които се изолират чрез центрофугиране и се изсушават под вакуум. Добивът е 217 мг.

Молекулна маса, намерена чрез MS: 5962, теория: 5962.

ПРИМЕР 11

Синтеза на des(ВЗО)-човешки инсулин.

Синтезата на des(ВЗО)-човешки инсулин се извършва, както е описано от Markussen (Methods in diabetes research, Vol.I, Laboratory methods, part B, 404-410. Ed. J. Larner and S. Phol, John Wiley & Sons, 1984). 5 r човешки инсулин се разтварят в 500 мл вода като през това време pH-стойност та на разтвора се

поддържа 2,6 чрез прибавяне на 0,5

М сярна киселина.

Впоследствие инсулинът се изсолва чрез прибавяне на 100 г амониев снл*ат и утайката се изолира чрез центрофугиране. Утайката се разтваря в 800 мл 0,1 М кисел амониев карбонат (NH^HC0₃) и pH-стойността на разтвора се довежда до 8,4 с 1 М амон як.

мг говежда 'карбоксипептидаза А се суспендират в 25 мл вода и се изолират чрез центрофугиране. Кристалите се суспендират в 25 мл вода и се добавя 1 М амоняк до получаване на бистър разтвор с крайно pH 10. Разтворът на карбоксипептидазата

се прибавя към инсулиновия разтвор и реакцията се оставя да протича в продължение на 24 часа. Прибавят се няколко капки толуен, действуващи като консервант по време на реакцията.

След 24 часа des(ВЗО)-човешкият инсулин се кристализира чрез постепенно добавяне на 80 г натриев хлорид при разбъркване на разтвора. След това pH-стойността се довежда до 8,3 и кристализацията се оставя да продължи в продължение на 20 часа

I при бавно разбъркване. Кристалите се изолират върху 1,2 мкмФилтър, промиват се'С 250 мл ледено студен 2-пропанол и накрая се изсушават под вакуум.

ПРИМЕР 12

Синтеза на (Al, Bl)-diBoc des(ВЗО)-човешки инсалин.

Това съединение се синтезира чрез метод, подобен на този описан в Пример 7, като за изходен материал се използува des(ВЗО)-прасешки инсулин. Суровият продукт се утаява с ацетон и се изсушава под вакуум. (Al,Bl)-diBoc des(ВЗО)-човешкият инсулин се пречиства чрез обратно*азова HPLC, както е описано в Пример

7.

ПРИМЕР 13 м ' Синтеза на 1Ч*^в=’-деканоил des(ВЗО)-човешки инсулин.

За синтеза на М*^вг’-деканоил des(ВЗО)-човешки инсулин

А като изходен материал се използуват 400 мг (Al, Bl)-diBoc des(ВЗО)-човешки инсулин, следвайки процедурата, описана в Пример 10. Суровият продукт се утаява с ацетон, изсишава се под вакуум и се деблокира с TFA. Полученият продукт се утаява с ацетон и се изсушава под вакуум. След това М^в=’-деканоил

des(ВЗО)-човешкият инсулин се пречиства чрез обратно+азова HPLC, както е описано в Пример 10.

Молекулна маса, намерена чрез MS:5856, теория :5861.

ПРИМЕР 14

Синтеза на 1Ч^ва*-додеканоил Рев(В30)-човешки инсулин.

а. Имобилмзиране на протеаза от A. lyticus мг протеаза на A. lyticus, разтворени в 5 мл воден 0,2 М NaHC0₃ бу*ер, pH 9,4, се смесват с 4 мл утаен гел MiniLeak'⁴ Medium gel, промит със същия бн«ер (MiniLeak представлява дивинилсулФОн-активирана сееароза CL 6В, получена от КетЕпТес, Copenhagen). Гелът се поддържа в' суспенсия чрез внимателно разбъркване в продължение на 24 часа на стайна температура. След това гелът се изолира чреа Филтруване, промива се с вода, суспендира се в 20 мл 1 М етаноламинов бнФвр, pH 9,4 и се поддържа в суспенсии в продължение на 24 часа на стайна температура. Накрая гелът се промива с вода, последвана от 0,1 М оцетна киселина и се съхранява на 4°С. Ензимната активност във Филтрата предствлява 13% от тази в изходния разтвор, което показва, че добивът на имобилизиращата реакция е около 87%.

Ь. Имобилмзмране на прасешкм трипсин

Прасешки трипсин се имобилизира върху MiniLeak” Low go степен на заместване 1 мг на мл гел като се използуват условията, описани по-горе за имоболизация на A. lyticus.

с. Синтеза на Glu(GluAla)₃Arg-B(1-29), ThrArg-A(1-21)инсулин чрез използуване на ^мобилизирана протеаза от A. lyticus

Към 200 мг Glu(AlaGlu)»Arg-B(l-29)-ThrArg-A(l-21)едноверижен предшественик на човешкия исулин, разтворен в 20 мл

0,1 И NaHCO^-буФер, pH 9,0, се прибавят 4 мл от гела, носещ имобилизираната протеаза на A. lyticus. След поддържане на гела •под Формата на снспенсия в реакционната смес в продължение часа на стайна температура хидролизата е пълна и дава

Glu‘(GluAla)s-Arg-B( 1-29) , ThrArg-A(1-21)-човешки инсулин (след реакцията се провежда обратноФвзова HPLC). След хидролизата гелът се отстранява чрез Филтруване. Към Филтрата се прибавят 5 мл етанол и 15 мкл 1 М ZnCl₃ като pH-то се довежда до 5,0 със НС1. Утаяването на продукта е пълно след престой една нощ на 4°С при леко разбъркване. Продуктът се изолира чрез центрофугиране.

След едно промиване с 1 мл ледено студен 20% етанол и изсушаване под вакуум добивът е 190 мг.

d. Синтеза на №·αχ ,№>Βΐ- ,№^β24’—тридодеканои л

Glu(GluAla)₃Arg—Β(1—29), Thr—Arg—A(l—21) човешки инсулин чрез използуване на М-хидроксиснкцинимиден естер на додекановата киселина

190 мг (30 мкмол) Glu(AlaGlu)®Агд-В(1-29), ThrArg-A(1-21)

инсулин се разтварят в 1 мл DMSO и 1,05 мл 0,572 М разтвор на Ν,Ν-диизопропилетиламин в DMF. Разтворът се охлажда до 15°С и се прибавят 36 мг (120 мкмол) N-хидроксисукцинимиден естер на додекановата киселина, разтворени в 0,6 мл DMSO. Реакцията . протича напълно в рамките на 24 часа. Липофилното титулно ч

съединение не се изолира.

е. Синтеза на №^{В2 г}-додеканомл des(ВЗО) инсулин

Продуктът от * предишния етап, d., съдържащ се приблизително в 2,65 мл ВМвО/ОМР/И^-диизопропилетиламин се разрежда с 10,6 мл 50 мМ глицинов буфер, включващ 20 7. етанол и pH-то се довежда до 10 с NaOH. След престой 1 час на стайна

температура се прибавя 1 мл MiniLeak-гел, носещ 1 мг имобилизиран трипсин на мл гел. Реакционната смес се разбърква внимателно 48 часа на стайна температура. За да се изолира желаният продукт, реакционната смес се нанася на колона за обратнОФазова HPLC (5 см в диаметър, 30 см висока), опакована с октадецилдиметилсилил-заместени силициеви частици (средна голиемина на частиците 15 мкм, големина на порите 100 8). За елнирането се използуват 20 мМ Tris/HCl-бнФери, pH 7,7 с нарастваща концентрация на етанбл, от 40*4 до 447. (об/об), при скорост 2000 мл/час. Големият пик, който се елуира при около 4344½ етанол, съдържа титулното съединение. Фракциите, съдържащи големия пик' се обединяват, добавя се вода за редуциране на етанолното съдържание до 207. и pH-то се довежда до 5,5. Разтворът се оставя през нощта на -20°С, при което продуктът се утаява. Утайката се изолира чрез центрофугиране на -в°С е се изсушава под вакуум. Добивът от титулното съединение е 90 мг.

Молекулна маса, намерена чрез MS: 5Θ92, теория: 5890.

ПРИМЕР 15

Синтеза на 1Ч*^ва*-(М-миристоил-а-глнтамил)-човешки инсулин.

500 мг (Al,В1)-diBoc-човешки инсулин се разтварят в 2,5 мл DMSO и се прибавят 428 етилдиизопропиламин, разреден с 2,5 мл DMSO/DMF 1/1 (об/об). Температурата се довежда до 15°С и се прибавят 85 мг М-миристоил-81и(0ВиЬ) N-хидроксиснкцинимиден естер, разтворен в 2,5 мл QMS0/DMF 1/1 (об/об). След 30 мин реакционната смес се излива в 60 мл вода, pH-то се довежда до 5 и утайката се изолира' чрез центрофугиране. Утайката се изсушава под вакуум. Изсушената реакционна смес се разтваря в 25 мл TFA и разтворът се оставя за 30 мин на стайна температура. TFA се отстранява чрез изпаряване под вакуум. Желеобразният остатък се разтваря в 60 мл вода и pH-то се довежда до 11,2 като се използува концентриран амоняк.

Титулното съединение се кристализира из този разтвор чрез довеждане на pH-то до 8,5 чрез използуване на 6 N НС1. Продуктът се изолира чрез центрофугиране, промива се веднъж с 10 мл вода и се изсушава под вакуум. Добив - 356 мг. Чистота, оценена с HPLC - 947..

По този начин продуктът на този пример представлява човешки инсулин, в който β-аминогрупата на Lys^Ba* има заместител със следната структура: СНз(СНа)a.aCONHCH(CHaCHaCOOH)CO-.

Молекулна маса, намерена чрез MS: 6146, теория: 6148.

ПРИМЕР 16 ·

Синтеза на ^^в2*-нндеканоил des(ВЗО)-човешки инсулин.

Това съединение се синтезира по аналогичен начин с Ν·^Β2'*додеканоил des(ВЗО)-човешкия инсулин, описан в Пример 14, като се използува N-хидроксисукцинимиден естер на киселина вместо

N-xидроксисукцинимиден естер на додекановата кеселина

Молекулна маса на продукта, намерена ч рез MS: 5876, теори я:

5876.

ПРИМЕР 17

Синтеза на 1Ч*^в2*-трмдеканоил des(ВЗО)-човешки инсулин.

Това съединение се синтезира по аналогичен начин с N^,B2’_ додеканоил des(ВЗО)-човешкия инсулин, описан в Пример 14, като се използува N-хидроксисукцинимиден естер на тридекановата киселина вместо N-хидроксисукцинимиден естер на додекановата кеселина.

Молекулна маса на продукта, намерена ч рез MS:

5899,

теория: 5904.

‘ ПРИМЕР 18

Синтеза на М^ШВ2*-миристоил des(ВЗО)-човешки инсулин.

додеканоил des(ВЗО)-човешкия инсулин описан в Пример 14, като се използува N-хидроксисукцинимиден естер на мирис типовата » киселина вместо N-хидроксисукцинимиден естер на додекановата кеселина.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 5923, теория: 5918.

ПРИМЕР 19

Синтеза на М’^В2’-палммтоил des(ВЗО)-човешки инсалин.

Това съединение се синтезира по аналогичен начин с N··®*додеканоил des(ВЗО)-човешкия инсулин, описан в Пример 14, като се използува N-хидроксисукцинимиден естер на палмитиновата киселина вместо N-хидроксисукцинимиден естер на додекановата кеселина.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 5944, теория: 5946.

ПРИМЕР 20

Синтеза на М^ввг*-свбероил-0-тироксин-човешки инсулин.

А

а. Получаване на N—(сукцинимидмлсуберомл)-О-тмроксин.

Дисукцинимидилдуберат (1,0 r, Pierce) се разтваря в DMF (50 мл) и се прибавя D-тироксин (2,0 r, Aldrich) при разбъркване на 20°С. Тироксинът се разтваря бавно като след 20 часа разтворителят се отстранява чрез изпаряване под вакуум. Масленият остатък се кристализира из 2-пропанол, за да се получат 0,6 г N-(сукцинимидилсубероил)-D-тироксин, т.т. 128133°С.

Ь. Реакция на (А1,В1)-diBoc—човешки инсулин с N— (сукцинимидилсубероил)—D-тироксин.

(Al,Bl)-diВос-човешки инсулин (200 мг) се разтваря в сух DMF (10 мл) чрез прибавяне на триетиламин (20 мкл) на стайна температура. След трва се прибавя N-(сукцинимидилсубероил)-Dтироксин (80 мг). Реакцията се проследява чрез обратно*азова HPLC и след протичане на реакцията до около 907. разтворителят се отстранява'под вакуум. Към остатъка след изпаряването се прибавя безводна три♦лнороиетна киселина (5 мл) и разтворът се държи 1 час на стайна температура

След отстраняване на триФлнороцетната киселина под вакуум остатъкът се разтваря в смес от 1 М оцетна пречиства се чрез препаративна обратноФазова HPLC и се обезсолява на PD-10 колона.

Добивът на М^-вгчг-субероил-0-тироксин-човешки инсулин е 50 мг.

По този начин продуктът на този пример представлява човешки инсулин, в който 6-аминогрнпата на Lys^B=** има заместител със следната структура: Thyrox-Ca(CH_a)*CO-, където Thyrox е тироксин, който е свързан посредством амидна връзка с ааминогрупата от субединицата на октандионовата киселина.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 6724, теория: 6723.

ПРИМЕР 21

Синтеза на 1Ч*^вг**-(2-сукциниламидо)миристинова киселина-човешки инсулин.

а. Получаване на метилов естер на а-апиномиристиновата киселина, НС1

Към метанол (5 мл, Merck) на

-10°С при енергично разбъркване на капки се прибавя тионилхлорид (0,2 мл,

Aldrich)

След това се добавя а—аминомиристинова киселина (0,7 г , получена от α-Бромкиселината чрез реакция с амоняк). Реакцията се разбърква на стайна температура през нощта и след това се изпарява до сухо. Суровият продукт (0,7 г) се използува директно в етап Ь.

Ь. Получаване на аминомирмстмновата киселина.

метилов естер на N-сукциноил-а58

Метилов естер на α-аминомиристиноаата киселина, НС1 (0,7

г) се разтваря хлороформ (25 мл, Merck). Прибавя се триетиламин (0,35 мл, Fluka), последван от сукцинов анхидрид (0,3 г, Fluka).

Реакционната смес се температура 2 часа, концентрира се до сухо и остатъкът се рекристализира из етилацетат/петролев етер (1/1). Добив: 0,8

с. Получаване на метилов естер на

N— (сукцинммидилсукциноил)-а-аминомиристиновата киселина.

Метилов естер на 1Ч-сукциноил-а-аминомиристиновата киселина (0,8 г) се разтваря в сух DMF (10 мл, Merck, изсушен над 4Й -молекулно сито). Добавят се сух пиридин (80 мкл, Merck) и ди(N-cykцинимидил)карбонат (1,8 г, Fluka) и реакцинонната смес в се разбърква през нощта на стайна температура. Остатъкът след изпаряване се пречиства чрез Флаш-хроматограФия върху силикагел (Merck) и се рекристализира из 2-пропанол/петролев етер (1/1). Добив от метилов естер на М-(сукцинимидилсукциноил)-ааминомиристиновата киселина: 0,13 г, т.т. 64-66°С.

d. Реакция на (Al,В1)—diBoc—човешки инсулин с метилов естер на

N—(сукцинимидилснкциноил)—а—аминомиристиновата киселина.

Реакцията се извършва, както в Пример 20 Ь., но като се използува метилов естер на М-(снкцинимидилсукциноил)-ааминомиристиновата киселина вместо М-(сукцинимидилсвбероил)-Dтироксин. След отстраняване на триФлнороцетната киселина под вакуум остатъкът от, .изпаряването се третира с 0,1 М натриева основа при 0°С, за да се сапунира метиловия естер. След като чрез обратноФазова HPLC се прецени, че сапунирането е протекло докрай, pH-стойността на разтвора се довежда до 3 и разтворът се

Μ··Μ·Η*Ι лиоФилизира. След пречистване чрез препаративна обратноФазова HPLC и обезсоляване на PD-1O колона добивът на Ν·^Β=**-(2снкциниламидо)миристинова киселина-човешки инсулин е 39 мг.

По този начин продуктът на този пример представлява човешки инсулин, в който 6-аминогрнпата на Lys®³* има заместител със следната структура: СН®(СН_Я)_АдСН(СООН)ИНСОСН_гСН₃СО-.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 6130, теория: 6133.

ПРИМЕР 22

Синтеза на И*^В2*-октилоксикарБонил-човешки инсулин.

Синтезата се извършва, както в Пример 20 Ь., но като се използува п-октилоксикарбонил,1Ч-хидроксиснкцинимид (9 мг, получен от п-октилхлорформат (Aldrich) и N-хидроксиснкиинимид), вместо И-(сукцинимидилсубероил)-0-тироксин. Добивът на м^-ватоктилоксикарбонил-човешки инсулин е Θ6 мг.

По този начин продуктът на този пример е човешки инсулин, в който «-аминогрупата на

Lys^Ba* има заместител със следната

структура: СН₃(СН_а)тОСО-.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 5960, теория: 5946.

ПРИМЕР 23

Синтеза на М*в=’-(2-сукциниламидо)палмитинова киселина-човешки инсулин.

а. Получаване на ' метилов естер на N(сукцинимндилснкциноил)-а-аминопалмитиновата киселина.

Това съединение се получава, както е описано в Пример 21

а.-с., като вместо α-аминомиристинова киселина се използува ааминопалмитинова киселина.

Ь. Реакция на (А1,В1 )-<НВос-човешки инсулин с метилов естер на М-(снкцинвмидилсукциноил)-С1-палмитиновата киселина

Реакцията се извършва, както в Пример 21 d., но като се използува метилов естер на N-(сукцинимидилсукциноил)-ааминопалмитиновата киселина, вместо метилов естер на N-

(сукиинимидилсукциноил)-а-аминомиристиновата киселина, за да се

ПОЛУЧИ

Ν·^Β=^~(2-сукциниламидо)палми типова киселина-човешки инсулин.

По този начин продуктът на този пример представлява човешки инсулин, в който с-аминогрупата на Lys^BS,,r има заместител със следната структура: СН»(СНг)х®СН(С00Н)МНС0СН_гСН_гС0-.

ПРИМЕР 24

Синтеза на ν·β=*-(2-сукциниламидоетилокси)палмитинова киселиначовешки инсулин.

а. Получаване на метилов естер на

Ν(сукцинимидилсукцинонл)-2-аминоетилоксипалмитиновата киселина.

Това съединение се получава, както е описано в Пример 21

а.-с., но като се използува 2-аминоетилоксипалмитинова киселина (синтезирана по основната процедура, описана от R. TenBrink, J. Огд. Chem. 52 (19Θ7) 41Θ-422, вместо а-аминомиристинова t

киселина.

Ь. Реакция на (А1,В1)—diBoc-човешки инсулин с метилов естер на М-(смкцинимидилсукциноил)-2-аминоетилоксипалмитиновата киселина.

Реакцията се извършва, както в Пример 21 d., но като се използува метилов естер на N-(сукцинимидилсукциноил)-2— аминоетилоксипалмитиновата киселина, вместо метилов естер на N(сукцинимидилсукциноил)-2-аминомиристиновата киселина, за да се получи №^вз’-(2-снкциниламидоетилокси)палмитинова киселиначовешки инсулин.

По този начин продуктът на този пример представлява човешки инсулин, в който е-аминогрупата на Lys^B3<r има заместител със следната структура: СН₃(СН_а)_i3CH(COOH)NHCH_aCH_aOCOCH_aCH_aCO-.

ПРИМЕР 25

Синтеза на <Ч*^ва*-литохолоил-<х-глутамил-йее(ВЗО)-човешки инсулин.

Синтезата се извършва, както в Пример 13, като се използува α-Ν-хидроксиснкцинимиден естер на N-литохоил-Lглутаминоеата киселина, гама-теот-бутилов естер, вместо Nхидроксисукцинимиден естер на декановата киселина.

По този начин продуктът на този пример представлява

човешки инсулин, в който в-аминогрупата на Lys®³⁴’ има заместител със следната структура: литохолоил-1ЧНСН(СН_аСН_яС00Н)С0-.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 6194, теория: 6193.

ПРИМЕР 26

Синтеза на №^Bav-3,3' , 5,5' -тетрайодотироацетил-човешки инсулин.

Синтезата се, извършва, както в Пример 10, като се използува N-xидроксисукцинимиден естер на 3,3',5,5'тетрайодотирооцетната киселина, вместо N-хидроксисукцинимиден естер на декановата киселина.

Ь2

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 6536, теория: 653S.

ПРИМЕР 27

Синтеза на 1Ч*^ва*-1_-тироксил-човешки инсулин.

Синтезата се извършва, както в Пример 10, като се използува Boc-L-тироксин N-хидроксисукцинимиден естер, вместо Nхидроксиснкцинимиден естер на декановата киселина.

Молекулна маса на продукта, намерена чрез MS: 6572, теория: 6567.

ПРИМЕР 28

Фармацевтичен препарат включваш 600 нмол/мл (Ч^^^-деканомлdes(ВЗО)-човешки инсулин, l/3Zn^a* в разтвор.

(Ч'^в=*-деканоил^е5(ВЗО)-човешки инсулин (1,2 мкмол) се разтваря във вода (0,8 мл) и pH-стойността се довежда до 7,5 чрез добавяне на 0,2 М натриева основа. Прибавят се 0,01 М цинков ацетат (60 мкл) и разтвор, съдържаш 0,757. Фенол и 47.

глицерол (0,8 мл). pH-стойността на разтвора се довежда до 7,5 с вода.

Полученият разтвор се стерилизира чрез Филтруване и се прехвърля асептично в ампула или Флакон.

ПРИМЕР 29

Фармацевтичен препарат включваш 600 нмол/мл М^вва*-деканоилчовешки инсулин, l/2Zn^a* в разтвор.

1,2 мкмол от титулното съединение се разтварят във вода (0,8 мл) и pH-стойността се довежда до 7,5 чрез добавяне на 0,2

Μ натриева основа. Прибавя се разтвор, съдържащ 0,757. Фенол и 1,757. натриев хлорид (0,8 мл). pH-стойността на разтвора се довежда до 7,5 с 0,2 М натриева основа и обемът на разтвора се довежда до 2 мл с вода.

Полученият разтвор се стерилизира чрез Филтруване и се прехвърля асептично в ампула или Флакон.

ПРИМЕР 30

Фармацевтичен препарат включващ 600 нмол/мл М*^в2,г-литохолоилчовешки инсулин в разтвор.

1,2 мкмол от титулното съединение се суспендират във вода (0,8 мл) и се разтварят чрез довеждане на pH-стойността на разтвора до 8,5 като се използува 0,2 М натриева основа. След това към разтвора се прибавят 0,8 мл концентриран (сток) разтвор, съдържащ 0,757 крезол и 47. глицерол във вода. Накрая pH-стойността отново се довежда до 8,5 и обемът на разтвора се довежда до 2 мл с вода.

Полученият разтвор се стерилизира чрез Филтруване и се прехвърля асептично в ампула или Флакон.

ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ (1) ОБША ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ:

(A) ИМЕ: Novo Nordisk A/S (B) УЛИЦА: Novo Alle (C) ГРАД: DK-2880 Bagsvaerd (Е) СТРАНА: Denmark (G) ТЕЛЕФОН: +45 4444Θ8Θ8 (H) ТЕЛЕФАКС: +45 44490555 (I) ТЕЛЕКС: 37173 ΐ xi) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: АЦИЛИРАН ИНСУЛИН (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 49

(iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) АДРЕСАТ: Novo Nordisk A/S

Corporate Patents (B) УЛИЦА: Novo Alle (C) ГРАД: DK-2880 Bagsvaerd (Е) СТРАНАs Denmark (v) ФОРМА ЗА КОМПЮТЪРНО ЧЕТЕНЕ:

(A) ТИП СРЕДА: Дискета (B) КОМПЮТЪР: IBM РС-съвместим (C) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) ПРОГРАМЕН ПРОДУКТ: Patentln Release #1.0,

Версия #1,25 (vi) ТЕКУЩА ИНФОРМАЦИЯ ЗА ЗАЯВКАТА:

(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА:

(B) ДАТА НА ПОДАВАНЕ:

<С) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПРИОРИТЕТНИ ЗАЯВКИ:

(A) НОМЕРА НА ЗАЯВКИТЕ: DK 1044/93 и US 08/190,829 (B) ДАТИ НА ПОДАВАНЕ: 09.IX.1993 и 02.11.1994 (viii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПЪЛНОМОЩНИКА/АГЕНТА (А) ИМЕ: Jorgensen, Dan et al.

(C) НОМЕР HA УКАЗАТЕЛЯ/РЕГИСТЪРА: 3985.204-W0,DJ (ix) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: +45 44448888 (B) ТЕЛЕФАКС: +45 44493256 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:1:

< х) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА;21 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1:

Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin 15 10 15

Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:2:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 30 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:

Хаа

Vai

Xaa

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

1

5

10

15

Туг

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Xaa

20

25

30

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:3:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 110 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3:

TGGCTAAGAG ATTCGTTGAC CAACACTTGT GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA GCTTTGTACT

TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT ТТСТТСТАСА CTCCAAAGTC TGACGACGCT

110 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) 'ДЪЛЖИНА: 100 нуклеотидни двойки (B) ТИП 1 нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна ьь (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4:

(ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: АНК

CTGCGGGCTG CGTCTAAGCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG ATAGAAGTAC

ААСАТТБТТС AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:5:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) АЬЛЖИНА: 25 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

(ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5:

GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTG

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:6:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЬЛЖИНА: 27 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6:

CTGCTCTAGA GCCTGCGGGC TGCGTCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEG ID N0:7:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 110 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7:

TGGCTAAGAG ATTCGTTACT CAACACTTGT' GCGGTTCTCA CTTGGTTGAA GCTTTGTACT

TGGTTTGTGG TGAAAGAGGT TTCTTCTACA CTCCAAAGTC TGACGACGCT

110 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:8:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:8:

GTCGCCATGG CTAAGAGATT CGTTA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:9:

a (i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

Чр (А) ДЪЛЖИНА: 100 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:9:

CTGCGGGCTG CGTCTAACCA CAGTAGTTTT CCAATTGGTA CAAAGAACAG ATAGAAGTAC

AACATTGTTC AACGATACCC TTAGCGTCGT CAGACTTTGG

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:10:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 27 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:10:

ACGTACGTTC TAGAGCCTGC GGGCTGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:11:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА.: 78 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:11:

CACTTGGTTG AAGCTTTGTA CTTGGTTTGT GGTGAAAGAG GTTTCTTCTA CACTCCAAAG

ACTAGAGGTA TCGTTGAA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:12:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 63 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК

(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:12:

GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCTG AAGCTAGATT GCTTAACCAA

CAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:13:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 65 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13:

GCTAACGTCG CCATGGCTAA GAGAGAAGAA GCTGAAGCGA AGCTGAAAGA TTCGTTAACC

AACAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:14:

‘ (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 80..391 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:14:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC AAACTATCAA TTTCATACAC 60

AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT TTC HG GTT KG TCC TTG ATC 112

Het Lys Ala Val Phe Leu Val Leu Ser Leu lie

1

1

5

11

3

GGA

ПС

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

160

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

15

20

25

АП

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

HG

GCT

AAC

208

lie

Pro

Glu

61U

Ser

Leu

lie

He

Ala

G1U

Asn

Thr

Thr

teu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

AGA

ПС

6П

AAC

CAA

CAC

HG

TGC

GGT

TCT

CAC

256

Val

Ala

Het

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

45

50

55

HG

GH

GAA

GCT

HG

TAC

П6

6П

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

ПС

ПС

TAC

304

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

60

65

70

75

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GH

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

352

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

80

85

90

TCT

ATC

TGT

TCT

HG

TAC

CAA

HG

GAA

AAC

TAC

TGT

AAC

TAGACGCAGC

401

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

TyrMJl n

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

100

CCGCAGGCTC TAGA 415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:15:

(1) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 104 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:

Het

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

lie

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

1

5

10

15

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

He

Pro

Glu

Glu

Ser

20

25

30

Leu

lie

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Val

Ala

Het

Ala

Lys

i

35

40

45

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

50

55

60

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp

70 75 80

Asp Ala Lys Gly lie Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 100

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:16:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:16:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GC6GTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACATT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:17;

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 523 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:- (A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: Θ0..499 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:17:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC АААСТАТСАА TTTCATACAC

120

180

240

300

360

415

AATATAAACG ATTAAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 112

Het Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu

5 10

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

160

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

15

20

25

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

208

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

He

Gly

Tyr

Ser

Asp

30

35

*

40

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

256

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

45

50

55

AAT

AAC

GGG

TTA

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

304

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

He

Ala

Ala

60

65

70

75

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCT

TTG

GAT

AAG

AGA

GAA

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

352

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Glu

Val

Asn

Gin

His

Leu

80

85

90

TGC

GGT

TCT

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

400

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Gly

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

95

100

105

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

GAA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

448

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Glu

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

He

Val

Glu

110

115

120

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

496

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

125

130

135

© AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA 523

Asn

140 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:18:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 140 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: Белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:18:

Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Vai

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Vai

lie

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

61 y

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Vai

Ala

Vai

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

Il,e

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Vai

65

70

75

80

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Glu

Vai

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

85

90

95

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

100

105

110

Glu

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

115

120

125

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:19:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА·.

(A) ДЪЛЖИНА: 523 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:19:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGCGTCG120

TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG180

CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA ТСПССССТА AAGCTACAAC GACAAAACGG240

TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA CAAATATTTA TGATGATAAC GGTCGTAACG300

ACGATTTCTT CTJCCCCATA GAAACCTATT CTCTCTTCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG360

AGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC ACCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGACTTTT420

CAGACTGCTG CGATTCCCAT AGCAACTTGT TACAACATGA AGATAGACAA GAAACATGGT480

TAACCTTTTG ATGACATTGA TCTGCGTCGG GCGTCCGAGA TCT523

I73 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:20:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 наклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: Θ0..391 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:20:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT А6ПСАААСА AGAAGAHAC АААСТАТСАА ТПСАТАСАС

112

AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT СП ТТС HG 6П П6 ТСС HG АТС Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu lie

1

1

5

11

3

GGA

ПС

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

6П

GAG

160

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Vai

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai

Glu

15

20

25

АП

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

HG

GCT

AAC

208

lie

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

lie

He

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

AGA

ПС

GH

GAC

CAA

CAC

П6

TGC

GGT

TCT

CAC

256

Vai

Ala

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Vai

Asp

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

45

50

55

HG

6П

GAA

GCT

HG

TAC

П6

6П

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

ПС

ПС

TAC

304

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

60

65

70.

75

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

6TT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

352

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

80

85

90

TCT

ATC

T6T

TCT

TTG

TAC

CAA

П6

GAA

AAC

TAC

TGT

GCT

TAGACGCAGC

401

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

95

100

CCGCAGGCTC TAGA

415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:21:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 104 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: Белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:21:

Met

Lys

Ala

Val

Phe

Leu

Val

Leu

Ser

Leu

He

Gly

Phe

Cys Trp

Ala

1

5

10

15

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Val

Glu

lie

Pro

Glu Glu

Ser

20

25

30

Leu

lie

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

L6u

Ala

Asn

Val

Ala

Met Ala

Lys

35

40

45

Arg

Phe

Val

Asp

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu Ala

Leu

50

55

60

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys Ser

Asp

65

70

75

80

Asp

Ala

Lys

Gly

He

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

He

Cys Ser

Leu

85

90

95

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:22:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:22:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120

GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180

GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT240

GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAG6T TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC360

AAGAAACATG 6ТТААССЩ. TGATGACACG AATCT6C6TC GGGCGTCCGA GATCT415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:23:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 ньклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 80..391 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:23:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC АААСТАТСАА ТТТСАТАСАС 60

AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG 6СТ 6П ТТС П6 6П TTG ТСС TTG АТС 112

Het Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu He

5 10

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

160

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Vai

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai

Glu

15

20

25

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

208

He

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

lie

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

AGT

ТТС

GTT

ACT

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

256

Vai

Ala

Het

Ala

Lys

Arg

Phe

Vai

Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

45

50

55

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

T6T

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

304

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

60

65

70

75

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

352

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

80

85

90

TCT

ATC

T6T

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GCT

TAGACGCAGC

401

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

95

100

CCGCAGGCTC TAGA

415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:24:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 104 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: Белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:24:

Met

Lys

Ala

Vai

Phe

Leu

Vai

Leu

Ser

Leu

lie

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

1

5

10

15

Gin

Pro

Vai

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai

Glu

He

Pro

Glu

Glu

Ser

20

25

30

Leu

lie

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Vai

Ala

Mot

Ala

Lys

35

40

45

Arg

Phe

Vai

Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

H1S

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

50

55

60

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

65

70

75

80

Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

He

Cys

Ser

Leu

85

90

95

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Ala

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:25:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:25:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG THGATAGH AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120

GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180

GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCG6TACCGA TTCTCTAAGC AATGAGTTGT240

GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC360

AAGAAACATG GJTAACCTTT TGAT6ACACG AATCTGCGTC GGGC6TCCGA GATCT415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА-SEQ ID N0:26;

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна

(D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (хх) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: Θ0..391 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:26:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT АбПСАААСА AGAAGATTAC АААСТАТСАА ТПСАТАСАС 60

AATATAAACG ACCAAAAGA АТб AAG 6СТ 6П ИС Пб GTT TTG ТСС Пб АТС 112

Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu lie 1 5 10

GGA

ПС

TGC

TGG GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

6П

GAG

160

61y

Phe

Cys

Trp Ala

Gin

Pro

Vai

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai

Glu

15

20

25

АП

CCG

GAA

GAG TCT

CTG

ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

HG

GCT

AAC

208

lie

Pro

Glu

Glu Ser

Leu

He

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT AAG

AGA

ПС

6П

GAC

CAA

CAC

HG

TGC

GGT

TCT

CAC

256

Vai

Ala

Met

Ala Lys

Arg

Phe

Vai

Asp

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

45

50

55

HG

GH

GAA

GCT HG

TAC*

HG

6П

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

ПС

ПС

TAC

304

Leu

Vai

Glu

Ala Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

60

65

70

75

ACT

CCA

AAG

TCT GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

GH

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

352

Thr

Pro

Lys

Ser Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

80

85

90

401

TCT ATC TGT TCT Пб TAC CAA Пб GAA AAC TAC T6T GGT TAGACGCAGC Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

100

CCGCAGGCTC TAGA

415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:27:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 104 аминокиселини (B) ТИП:' аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: Белтък.

(xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:27:

Met Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Ser Leu lie Gly Phe Cys Trp Ala 15 10 15

Gin Pro Val Thr Gly Asp Glu Ser Ser Val Glu lie Pro Glu Glu Ser 20 2530

Leu lie lie Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Val Ala Met Ala Lys 35 4045

Arg Phe Val Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 50 5560

Tyr Leu Val Cys Gly 61u Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp

70 7580

Asp Ala Lys Gly He Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu 85 9095

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly φ100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:28:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEG ID ΝΟ:2Θ:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120

GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180

GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AACTGGTTGT240

GAACACGCCA AGAGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC360

AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACC AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:29:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: SO..391 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:29:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC АААСТАТСАА ТТТСАТАСАС 60

AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT ТГС П6 GTT TTG TCC TTG АТС 112

Me·

t Ly<

s Ala Vai

1 Phi

9 Lei

J Vai

1 Lei

j Ser Leu lie

1

f

I

5

10

GGA

TTC

TGC

TGG

GCC

CAA

CCA

GTC ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT

GAG

160

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

Pro

Vai Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai

Glu

15

20

25

ATT

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT

AAC

208

lie

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

lie

He Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT ACT

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT

CAC

256

Vai

Ala

Het

Ala

Lys

Ar 9

Phe

Vai Thr

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

45

50

55

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

304

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

60

65 «е

70

75

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

352

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

80

85

90

TCT

ATC

T6T

TCT

TTG

TAC

CAA

HG GAA

AAC

TAC

TGT

GGT

TAGA

(CGCAGC

401

Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

100

CCGCAGGCTC TAGA 415 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:30:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 104 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:30:

Het Lys Ala Vai Phe Leu Vai Leu Sen Leu lie Gly Phe Cys Trp Ala ‘ 5 -· 10 15

Gin Pro Vai Thr Gly Asp Glu Ser Ser Vai Glu lie Pro Glu Glu Ser

25 30

Leu lie lie Ala Glu Asn Thr Thr Leu Ala Asn Vai Ala Met Ala Lys 35 4045

Arg Phe Vai Thr Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu 50 5560

Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Asp

70 7580

Asp Ala Lys Gly lie Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu 85 9095

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:31:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 415 наклеотидии двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:31:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG ⁷ 60

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120

GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180

GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCG6TACCGA TTCTCTAAGC AATGAGTTGT240

GAACACGCCA A6AGTGAACC AACTTCGAAA CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAGGT TTCAGACTGC TGCGATTCCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC350

AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACACC AATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT415 (2) ИНФОРМАЦИЯ SA SEQ ID N0:32:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 523 ннклеотидни двойки (Έ) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРЙЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix).ОСОБЕНОСТ:

(А) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 80..499 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:32:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGHCAAACA AGAAGAHAC АААСТАТСАА TTTCATACAC 60

AATATAAACG AHAAAAGA AT6 AGA TH CCT TCA АП TTT ACT GCA GTT TTA 112

Het Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Vai Leu

5 10

ттс

6CA

GCA

TCC

TCC

GCA

ПА

GCT

GCT

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Vai

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

15

20

25

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

AH

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Vai

lie

Gly

Tyr

Ser

Asp

30

35

40

ПА

GAA

GGG

GAT

ПС

GAT

GH

GCT

GH

HG

CCA

TH

TCC

AAC

AGC

ACA

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

Asp

Vai

Ala

Vai

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

45

50

55

ААТ

AAC

GGG

ПА

HG

TH

ATA

AAT

ACT

ACT

АП

GCC

AGC

AH

GCT

GCT

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

He

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

lie

Ala

Ala

60

65

70

75

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCT

HG

GAT

AAG

AGA

ПС

GTT

AAC

CAA

CAC

HG

Lys

Glu

Glu

Gly

Vai

Ser

Leu

Asp

Lys

Arg

Phe

Vai

Asn

Gin

His

Leu

80

85

90

TGC

GGT

TCT

CAC

П6

GH

GAA

GCT

HG

TAC

HG

βΠ

TGT

GGT

GAA

AGA

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

95

100

105

GGT

ПС

ПС

TAC

ACT

CCA

AAG

TCT

GAC

GAC

GCT

AAG

GGT

ATC

Gn

GAA

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

He

Vai

Glu

110

115

120

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

HG

GAA

AAC

TAC

TGT

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

125

130

135

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

160

208

256

304

352

400

448

496

AAC Asn 140

523

ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:33:

(i)

ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 140 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii)

МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi)

ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:33:

(2)

Met

Arg

Phe

Pro Ser

He

Phe

Thr

Ala

Vai

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala Pro

Vai

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

lie

Pro

Ala

Glu Ala

Vai

He

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Vai

Ala

Vai Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

X

60

Phe

lie

Asn

Thr Thr

He

Ala

Ser

lie

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Vai

65

70

75

80

Ser

Leu

Asp

Lys Arg

Phe

Vai

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

85

90

95

Vai

Glu

Ala

Leu Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

100

105

110

Pro

Lys

Ser

Asp Asp

Ala

Lys

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

115

120

125

lie

Cys

Ser

Leu Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

130

135

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:34:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 523 наклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii} МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:34:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTAT6TG60

TTATATTTGC TAATTTTCTT ACTCTAAA6G AAGTTAAAAA T6AC6TCAAA ATAAGCGTCG120

TA6GAG6C6T AATCGACGA6 GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG180

CCGACTTCGA CAGTAGCCAA- TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG240

TAAAAGGTTG TCGTGTTTAT T6CCCAATAA CAAATATTTA T6AT6ATAAC G6TCGTAACG300

ACGATTTCTT СПССССАТА GAAACCTATT CTCTAAGCAA TTGGTTGTGA ACACGCCAAG360

AGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC ACCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGAGGTTT420

CAGACTGCTG CGATTCCCAT AGCAACTTGT TACAACATGA AGATAGACAA GAAACAT6GT480

TAACCTTTTG ATGACATTGA TCTGCGTC66 GCGTCCGAGA TCT

523

S3 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO:35s (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 409 наклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК

(ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: Θ0..385 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:35:

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC АААСТАТСАА ТТТСАТАСАС 60 AATATAAACG ACCAAAAGA ATG AAG GCT GTT ТТС TTG GTT TTG ТСС П6 АТС 112

Mel

t Ly!

> Ali

a Vai

1 Phi

a Lei

j Va'

1 Lei

u Ser Leu lie

1

1

5

10

GGA

TTC

TGC

TG6

GCC

CAA

CCA

GTC

ACT

GGC

GAT

GAA

TCA

TCT

GTT GAG

160

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

Gin

.Pro

Vai

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai Glu

15

20

25

АТТ

CCG

GAA

GAG

TCT

CTG

ATC

ATC

GCT

GAA

AAC

ACC

ACT

TTG

GCT AAC

208

lie

Pro

Glu

Glu

Ser

Leu

lie

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala Asn

30

35

40

GTC

GCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCT CAC

256

Vai

Ala

Net

Ala

Lys

Arg

Phe

Vai

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser His

45

50

55

ttg

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC TAC

304

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe Tyr

60

65

70

75

ACT

CCT

AAG

GAA

AAG

AGA

GGT

ATC

6Π

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT ATC

352

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

Arg

Gly

lie

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser lie

80,

85

90

TGT

TCT

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGT

GGT

TAG/

iCGCAGC C

:CGCAGGCTC

405

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100

409

TAGA (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:36:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(А) ДЪЛЖИНА: 102 аминокиселини

(В) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:36:

Het

Lys

Ala

Vai

Phe

Leu

Vai

Leu

Ser

Leu

lie

Gly

Phe

Cys

Trp

Ala

1

5

10

15

Gin

Pro

Vai

Thr

Gly

Asp

Glu

Ser

Ser

Vai

Glu

He

Pro

Glu

Glu

Ser

20

25

30

Leu

lie

lie

Ala

Glu

Asn

Thr

Thr

Leu

Ala

Asn

Vai

Ala

Het

Ala

Lys

35

40

45

Arg

Phe

Vai

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

50

55

60

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Glu

Lys

65

70

75

80

Arg

Gly

He

Vai

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

85

90

95

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Gly

100 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:37:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 409 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:37:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60

TTATATTTGC TGGTTTTCTT ACTTCCGACA AAAGAACCAA AACAGGAACT AGCCTAAGAC120

GACCCGGGTT GGTCAGTGAC CGCTACTTAG TAGACAACTC TAAGGCCTTC TCAGAGACTA180

GTAGCGACTT TTGTGGTGAA ACCGATTGCA GCGGTACCGA TTCTCTAAGC AATTGGTTGT240

GAACACGCCA AGAGTGA^CC ААСТГС6ААА CATGAACCAA ACACCACTTT CTCCAAAGAA300

GATGTGAGGA ТТССТТТТСГ CTCCATAGCA АСПбПАСА ACATGAAGAT AGACAAGAAA360

CATGGTTAAC CTTTTGATGA CACCAATCTG CGTCGGGCGT CCGAGATCT409 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:38:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 511 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 77..487 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:38:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA А6АПАСААА CTATCAATTT CATACACAAT 60

ATAAACGAH AAAA6A ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109

Het Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu

S 10

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

ПА

GCT

GCT

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

157

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

15

20

25

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

205

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

lie

Gly

Tyr

Ser

Asp

30

35

40

TTA

GAA

GGG

GAT

ПС

GAT

6Π

GCT

Gn

Π6

CCA

ΠΤ

TCC

AAC

AGC

ACA

253

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

45

50

55

AAT

AAC

GGG

TTA

HG

τπ

ATA

AAT

ACT

ACT

АП

GCC

AGC

АП

GCT

GCT

301

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

He

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

He

Ala

Ala

60

55

70

75

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

TTC

GH

AAC

CAA

CAC

П6

349

Lys

Glu

G1U

Gly

Val

Ser

Het

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

80

85

90

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

6Π

GAA

GCT

Π6

TAC

Π6

Gn

TGT

GGT

GAA

AGA

397

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

95

100

105

GGT TTC TTC TAC ACT CCA AAG ACT AGA GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT 445

Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly lie Val Glu Gin Cys Cys

110 115 120

TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA

511

ACT tCT ATC TGT TCT TTG TAC CAA TTG GAA AAC TAC TGC AAC 487

Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

125 130 135 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:39:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 137 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:39:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

lie

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

He

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

He

Ala

Ser

lie

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

65

70_

75

80

Ser

Net

Ala

Lys

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

85

90

95

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

100

105

110

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

He

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

He

Cys

Ser

115

120

125

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 130 135 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:40;

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА;

(A) ДЪЛЖИНА: 511 никлеотидни двойки (B) ТИП: ннклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ J4A ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:40:

CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTATGTGTTA TATTTGCTAA ТТТТСТТАСТ CTAAAGGAAG TTAAAAATGA CGTCAAAATA AGCGTCGTAG

120

Θ7

GAGGCGTAAT CGACGA6GTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG180

ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAAC6AC AAAACGGTAA240

AAGGTTGTCG TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAAC6AC6300

ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TAAGCAATTG GTTGTGAACA CGCCAAGGGT360

GAACCAACTT C6AAACATGA ACCAAACACC ACTTTCTCCA AAGAAGAT6T GAGGTTTCTG420

ATCTCCATAG CAACTTGTTA CAACAT6AA6 ATAGACAAGA AACATGGTTA ACCTTTTGAT480

GACGTTGATC TGCGTCGGGC GTCCGAGATC T511 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:41:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 523 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ; едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ; линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП; кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: Θ0..499 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:41;

ATCGAATTCC ATTCAAGAAT AGTTCAAACA AGAAGATTAC АААСТАТСАА TTTCATACAC 60

AATATAAACG ATTAAAAGA AT6 AGA TTT CCT TCA ATT ПТ ACT GCA GTT TTA 112

Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu

						1
	TTC	GCA	GCA	TCC	TCC	GCA	TTA
	Phe	Ala	Ala	Ser	Ser	Ala	Leu
				15
	GAT	GAA	ACG	GCA	CAA	ATT	CCG
	Asp	Glu	Thr	Ala	Gin	lie	Pro
		30
	TTA	GAA	GGG	GAT	TTC	GAT	GTT
	Leu	Glu	Gly	Asp	Phe	Asp	Val
		45				50
	AAT	AAC	GGG	TTA	TTG	TTT	ATA
	Asn	Asn	Gly	Leu	Leu	Phe	lie
	60				65
	AAA	GAA	GAA	GGG	GTA	TCC	ATG
	Lys	Glu	Glu	Gly	Val	Ser	Met
				80

		1	a				10
GCT	GCT	CCA	GTC	AAC	ACT	ACA	ACA	GAA	160
Ala	Ala	Pro	Val	Asn	Thr	Thr	Thr	Glu
	20					25
GCT	GAA	GCT	GTC	ATC	GGT	TAC	TCA	GAT	208
Ala	Glu	Ala	Val	lie	Gly	Tyr	Ser	Asp
35					40
GCT	GTT	TTG	CCA	TTT	TCC	AAC	AGC	ACA	255
Ala	Val	Leu	Pro	Phe	Ser	Asn	Ser	Thr
				55
AAT	ACT	ACT	ATT	GCC	AGC	ATT	GCT	GCT	304
Asn	Thr	Thr	He	Ala	Ser	He	Ala	Ala
			70					75
GCT	AAG	AGA	TTC	GTT	AAC	CAA	CAC	TTG	352
Ala	Lys	Arg	Phe	Val	Asn	Gin	His	Leu
		85					90

ιμμμμμμΜιιι βθ

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGC

GGT

GAA

AGA

400

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

Gly

Glu

Arg

95

100

105

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

CCT

AAG

TCT

GAC

GAT

GCT

AAG

GGT

ATT

GTC

GAG

448

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ser

Asp

Asp

Ala

Lys

Gly

He

Vai

Glu

no

115

120

CAA

TGC

TGT

ACC

TCC

ATC

TGC

TCC

TTG

TAC

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

496

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

He

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

125

130

135

523

AAC TAGACGCAGC CCGCAGGCTC TAGA Asn

140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:42:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 140 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА‘ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:42:

Het

Arg

Phe

Pro

Ser

He

Phe

Thr

Ala

Vai

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Vai

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Vai

He

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Vai

Ala

Vai

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

He

Ala

Ser

He

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Vai

65

70

75

80

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Phe

Vai

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

85

90

95

Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr MO 105110

Pro Lys Ser Asp Asp Ala Lys Gly Ile'Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser ‘115 ’ 120125 lie Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

130 135140

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:43:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 523 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:43:

TAGCTTAAGG TAAGTTCTTA TCAAGTTTGT TCTTCTAATG TTTGATAGTT AAAGTATGTG60

HATATHGC TAATTTTCTT ACTCTAAAGG AAGTTAAAAA TGACGTCAAA ATAAGC6TC6120

TAGGAGGCGT AATCGACGAG GTCAGTTGTG ATGTTGTCTT CTACTTTGCC GTGTTTAAGG180

CCGACTTCGA CAGTAGCCAA TGAGTCTAAA TCTTCCCCTA AAGCTACAAC GACAAAACGG240

TAAAAGGHG TCGTGTTTAT TGCCCAATAA САААТАТПА TGATGATAAC GGTCGTAACG300

ACGATTTCTT CTTCCCCATA GGTACCGATT CTCTAAGCAA UGGHGTGA ACAC6CCAAG360

GGTGAACCAA CTTCGAAACA TGAACCAAAC GCCACTTTCT CCAAAGAAGA TGTGAGGAH420

CAGACTGCTA CGATTCCCAT AACAGCTCGT TACGACATGG AGGTAGACGA GGAACATGGT480

TAACCTTTTG ATGACGTTGA TCTGCGTCGG 6CGTCCGAGA TCT523

(2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:44:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 535 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (iii МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 77..511 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:44:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA СТАТСААТТТ САТАСАСААТ 60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT ССТ ТСА АП ТП ACT GCA GH ПА ' Het Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Vai Leu 1 5 10

ПС GCA GCA TCC TCC GCA ПА GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Vai Asn Thr Thr Thr Glu

20 25

109

157 й

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

He

Gly

Tyr

Ser

30

35

40

TTA

GAA

GGG

GAT

TTC

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

45

50

55

AAT

AAC

GGG

TTA

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

He

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

lie

Ala

60

65

70

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

GAA

GAA

GCT

GAA

GCT

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Het

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

80

85

90

GCT

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA

Ala

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

95

100

105

KG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

CCA

AAG

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

110

115

120

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

Arg

Gly

lie

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

lie

Cys

Ser

Leu

Tyr

125

J30

135

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC C

XGCAGGCTC TAGA

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

145

140

ACT Thr

АСА Thr

GAT Asp

CAA

Gin

GCT Ala

GCT Ala 75

GAA

Glu

205

253

301

349

397

445

493

535 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:45:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 145 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА; SEQ ID N0:45:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

lie

Phe

Thr

Ala

Val

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

lie

Pr,o

Ala

Glu

Ala

Val

lie

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

lie Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Vai

65

70

75

80

Ser

Met

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu Ala

Glu

Ala

Arg

Phe

Vai

Asn

85

90

95

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Vai Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

Cys

100

105

110

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro Lys

Thr

Arg

Gly

lie

Vai

Glu

115

120

125

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

lie

Cys

Ser

Leu Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

130 135 140

Asn

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO:46s (i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 535 нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна

CD) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТРП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:46:

CTTAAGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTAT6TGTTA60

TATTTGCTAA TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA CGTCAAAATA AGCGTCGTAG120

GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG180

ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA240

AAGGTTGTCG TGTTTATTGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT CGTAACGACG300 .ATTTCTTCTT CCCCATAGGT ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC GATCTAAGCA360

ATTGGTTGTG AACACGCCAA GGGTGAACCA ACTTCGAAAC ATGAACCAAA CACCACTTTC420

TCCAAAGAAG ATGTGAGGTT TCTGATCTCC ATAGCAACTT GTTACAACAT GAAGATAGAC480

AAGAAACATG GTTAACCTTT TGATGACGTT GATCTGCGTC GGGCGTCCGA GATCT535 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА,SEQ ID N0:47:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 53B нуклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (ix) ОСОБЕНОСТ:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 77..514 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO-.47:

GAATTCCATT CAAGAATAGT TCAAACAAGA AGATTACAAA CTATCAATTT CATACACAAT 60

ATAAACGATT AAAAGA ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT TTA 109

Het Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu

5 10

TTC

GCA

GCA

TCC

TCC

GCA

TTA

GCT

GCT

CCA

GTC

AAC

ACT

ACA

ACA

GAA

157

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Val

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

15

20

25

GAT

GAA

ACG

GCA

CAA

ATT

CCG

GCT

GAA

GCT

GTC

ATC

GGT

TAC

TCA

GAT

205

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Val

lie

Gly

Tyr

Ser

Asp

30

35

40

TTA

GAA

666

GAT

TTC

GAT

GTT

GCT

GTT

TTG

CCA

TTT

TCC

AAC

AGC

ACA

253

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

Asp

Val

Ala

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

45

50

55

AAT

AAC

GGG

TTA

TTG

TTT

ATA

AAT

ACT

ACT

ATT

GCC

AGC

ATT

GCT

GCT

301

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

He

Ala

Ala

60

65

70

75

AAA

GAA

GAA

GGG

GTA

TCC

ATG

GCT

AAG

AGA

GAA

GAA

GCT

GAA

GCT

GAA

349

Lys

Glu

Glu

Gly

Val

Ser

Het

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

80

85

90

GCT

GAA

AGA

TTC

GTT

AAC

CAA

CAC

TTG

TGC

GGT

TCC

CAC

TTG

GTT

GAA

397

Ala

G1U

Arg

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Val

Glu

95

100

105

GCT

TTG

TAC

TTG

GTT

TGT

GGT

GAA

AGA

GGT

TTC

TTC

TAC

ACT

CCA

AAG

445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

110

115

120

ACT

AGA

GGT

ATC

GTT

GAA

CAA

TGT

TGT

ACT

TCT

ATC

TGT

TCT

TTG

TAC

493

Thr

Arg

Gly

He

Val

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

He

Cys

Ser

Leu

Tyr

125

•

130

135

CAA

TTG

GAA

AAC

TAC

TGC

AAC

TAGACGCAGC C

iCGCAGGCl

C TAGA

538

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Asn

140 145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO:4B:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: (А) ДЪЛЖИНА: 146 аминокиселини (В) ТИП: аминокиселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна

(ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: Белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:48:

Met

Arg

Phe

Pro

Ser

He

Phe

Thr

Ala

Vai

Leu

Phe

Ala

Ala

Ser

Ser

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Vai

Asn

Thr

Thr

Thr

Glu

Asp

Glu

Thr

Ala

Gin

20

25

30

lie

Pro

Ala

Glu

Ala

Vai

lie

Gly

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

Gly

Asp

Phe

35

40

45

Asp

Vai

Ala

Vai

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Phe

lie

Asn

Thr

Thr

lie

Ala

Ser

He

Ala

Ala

Lys

Glu

Glu

Gly

Vai

65

70

75

80

Ser

Net

Ala

Lys

Arg

Glu

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Glu

Arg

Phe

Vai

85

90

95

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Gly

Ser

His

Leu

Vai

Glu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Vai

100

105

110

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

Gly

lie

Vai

115

120

125

Glu

Gin

Cys

Cys

Thr

Ser

He

Cys

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Glu

Asn

Tyr

130

135

140

Cys Asn

145 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0:49:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 538 ннклеотидни двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ» едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:49:

CTTtyGGTAA GTTCTTATCA AGTTTGTTCT TCTAATGTTT GATAGTTAAA GTATGTGTTA

ТАПТ6СТАА TTTTCTTACT CTAAAGGAAG TTAAAAATGA CGTCAAAATA A6CGTCGTAG

GAGGCGTAAT CGACGAGGTC AGTTGTGATG TTGTCTTCTA CTTTGCCGTG TTTAAGGCCG

120

180

ACTTCGACAG TAGCCAATGA GTCTAAATCT TCCCCTAAAG CTACAACGAC AAAACGGTAA240

AAGGTTGTCG TGITTAHGC CCAATAACAA ATATTTATGA TGATAACGGT C6TAACGACG300

ATTTCTTCTT CCCCATAG6T ACCGATTCTC TCTTCTTCGA CTTCGACTTC GACTTTCTAA360

GCAAnGGH GT6AACACGC CAAGGGTGAA CCAACTTCGA AACATGAACC AAACACCACT420

TTCTCCAAAG AAGATGT6AG GTTTCTGATC TCCATAGCAA CTTGTTACAA CAT6AAGATA480

GACAAGAAAC ATGGTTAACC THTGATGAC GHGATCTGC GTCGGGCGTC CGAGATCT538

Claims (16)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Инсулиново производно със следната последователност:

   А-Верига S----- ---------------S Г ⁷ | Gly-Ile-Val-Glu-Gln- -Cys-Cys- -Thr-Ser-Ile-Cys-Ser- 11 2 3 4 5 6 1 β 9 10 11 12 S I В-Верига 1 • S

   Xaa-Val-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1234 56789 10 1112 €А-Верига (продължение)

   Leu-Tyr—Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (SEQ ID N0:1)

   - 13 14 15 16 17 18 19 I 21 Μ В-Верига (продължение) r^s S Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val- -Cys-Gly-Giu- -Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 В-Верига (продължение) Phe-Туr-Thr—Pro-Lys-Xaa 25 26 27 28 29 30 (SEQ ID N0:2)

   където:

   Xaa в позиции А21 и ВЗ са, независимо един от друг, всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys, Arg и Cysj

   Хаа в позиция Bl е Phe или е делетирана;

   Хаа в поиция ВЗО е а) некодирнема, липоФилна аминокиселина, притежаваща от 10 до 24 въглеродни атома, като в този случай към е-аминогрупата на Lys®²** се присъединява ацилна група на карбоксилова киселина, имаща до 5 въглеродни атома, Ь) всеки аминокиселиней остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys, Arg и Cys, в който случай еаминогрнпата на Lys·²* има липофилен заместител или с) делетирана, в който случай е-аминогрупата на Lys®²* има липоФилен замести тел$ и всички техни гп²*-комплекси, при условието, че когато Хаа в позиция ВЗО е Thr или Ala, Хаа в позиции А21 и ВЗ са едновременно Asn и Хаа в позиция Bl е Phe, тогава инсулиновото производно е 2п²*-комплекс.
2. 2. Инсулиновото производно, съгласно претенция 1, където и ВЗ са, независимо един от друг, всеки аминокиселинен остатък, който може код с изключение на Lys,

   Агд и Cys;

   Хаа в позиция В1 е Phe или е делетиран;

   Хаа в позиция ВЗО е некодирнема, липоФилна аминокиселина, имаща от 10 до 24 въглеродни атома и ацилна грипа, свързана с аминогрупата на Lys®²*, където ацилната група е ацилна грипа на монокарбонова киселина с до 4 въглеродни *

   дикарбонова киселина с до 5 въглеродни атома.

   атома или на
3. 3. Инсулиновото производно, съгласно претенция 1, където и ВЗ са, независимо един от друг, всеки аминокиселинен остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys,

   Агд и Cys;

   Хаа в позиция Bl е Phe или е делетиран;

   Хаа в позиция ВЗО е делетиран или е всеки аминокиселинен ‘ остатък, който може да се кодира от генетичния код с изключение на Lys,

   Агд и

   Cys и

   6-аминогрупата на Lys®²* има липоФилен заместител, който включва най-малко 6 въглеродни атома
4. 4. Инсулиновото производно, съгласно претенция 2, където

   Хаа в позиция ВЗО се избира от групата, състояща се от аминодеканова’ киселина, α-аминододеканова киселина а
5. 5. Инсулиновото производно, съгласно претенция 2, където ацилната грипа, свързана с е-аминогрупата на Lys®²** се избира от грипата, състояща се от Формил, ацетил, пропионил и п-бутирил аминотетрадеканова киселина и α-Дминохексадеканова киселина

   Ь. Инсулиновото производно, съгласно претенция ацилната група, свързана с
6. 6-аминогрупата на Lys® където ацилна група на янтърната киселина
7. 7. Инсулиновото производно, съгласно претенция където

   Хаа позиция ВЗО е делетиран.
8. 8. Инсулиновото производно, съгласно претенци я където

   Хаа
9. 9. Инсулиновото производно, съгласно претенци я където липофилният заместител, свързан с β-аминогрнпата на Lys^B=* е ацилна група, произлизаща от карбонова киселина, имаща най-малко 6 въглеродни атома.
10. 10. Инсулиновото производно, съгласно претенция ацилната група, която може да бъде разклонена, включва верига от въглеродни атоми, дълга 8-24 атома.

    където основна
11. 11. Инсулиновото производно, съгласно претенция 9 където ацилната група е ацилна група на мастна киселина, имаща наймалко 6 въглеродни атома.
12. 12. Инсулиновото производно, съгласно претенци я

    9, където линейна, наситена карбонова киселина, имаща от 6 до 24 въглеродни атома.

    . Инсулиновото производно, съгласно претенци я

    9, където ацилната група се избира от групата, включваща додеканова киселина, тридеканова киселина и тетрадеканова киселина.

    14. Инсулиновото производно, съгласно претенция 1, където Хаа в позиция А21 е Ala , Gin, Gly или Ser. 15. Инаулиновото производно, съгласно претенция 1, където Хаа в позиция ВЗ е Asp, Gin или Thr 9 16. Инсулиновото производно, съгласно претенция 1, където

    Хаа в позиция Bi е делетиран.
13. 17. Фармацевтичен препарат за лечение на диабет в пациент при необходимост от такова лечение, включващ терапевтично е*ективно количество от инсулиново производно, съгласно претенция 1, заедно с Фармацевтично приемлив носинтел.
14. 18. Фармацевтичен препарат за лечение на диабет в пациент при необходимост от такова лечение, включващ терапевтично ефективно количество от инсулиново производно, съгласно претенция 1, в смес с инсулин или инсулинов аналог който има бързо начално действие заедно с Фармацевтично приемлив носител.
15. 19. Метод за лечение на диабет в пациент при необходимост от такова лечение, включващ въвеждане в пациента на терапевтично ефективно количество от инсулиново производно, съгласно претенция 1 заедно с Фармацевтично приемлив носител.
16. 20. Метод за лечение на диабет в пациент при необходимост от такова лечение, включващ въвеждане в пациента на терапевтично ефективно количество от инсулиново производно, съгласно претенция 1, в смес с инсулин или инсулинов аналог, който има бързо начално действие, заедно е Фармацевтично приемлив носител.