PT93237B

PT93237B - Processo para a preparacao de novos sais complexos derivados de acido hialuronico desprotonizado e de metais de transicao do 4 periodo da tabela periodica e de composicoes farmaceuticas e/ou cosmeticas que os contem

Info

Publication number: PT93237B
Application number: PT93237A
Authority: PT
Inventors: Geza Takacsi Nagy; Bela Stefko; Istvan Gebhardt; Kalman Burger; Ivan Rethey; Janos Illes; Erzsebet Neszmelyi; Istvan Racz; Gyongyver Kiraly; Viktoria Varkonyi
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1989-02-24
Filing date: 1990-02-22
Publication date: 1996-01-31
Also published as: EP0413016A1; CN1024557C; IE62408B1; NO904584D0; AR243538A1; CA2027596C; PT93237A; ES2061016T3; KR920700231A; DD292263A5; GR1000869B; UA39174C2; JPH03505231A; WO1990010020A1; EP0413016B1; MY105168A; GR900100137A; HU203372B; RU2021304C1; NO301169B1

Description

2L ú dos compostos. ίA presente invenção refere-se a um processo para a preparação ;de novos sais complexos derivados do ácido hialurónico des- | protonizado e de metais de transição do 4S. período da tabela ! :periódica e de composições que contêm estes sais complexos como ingredientes activos.

De acordo com uma forma de realização particularmente prefe-| rida do processo da presente invenção, as soluções aquosas que contêm os novos derivados do ácido hialurónico desproto-

I jnizado com iões de metais de transição do 4-. período da tabela periódica, são directamente preparados a partir de uma solução aquosa de hialuronato de sódio. !j Os novos sais complexos, de acordo com a presente invenção, j, envolvem principalmente, hialuronato de zinco e de cobalto, í As composições que contêm estes últimos sais podem ser compo-|| sições farmacêuticas (terapêuticas) ou cosméticos e, opcional-; mente, outras composições. Os campos de indicação das composições que contêm os novos sais complexos de acordo com a in-I! venção são, por exemplo, a aceleração de epitelização das superfícies do corpo deficientes em epitélio; a cura da úlcera erucal e decúbito (escaras), principalmente feridas não curáveis, queimaduras, feridas provocadas pelo calor ou por radiações não cicatrizáveis, o acne vulgar e acnes globulares, ; embora possam também ser usadas noutras áreas. í ! 0 ácido hialurónico é uma macro-molécula conhecida há mais de | cinquenta anos que foi primeiro descrita por Meyer et al. /7. 3 !i ij ij -/Biol. Chem. 107, 629 (1954); J. Biol. Chem. 114, 689 (19367. A determinação da estrutura foi efectuada por Weissman et al. ,/J. Am. Chem. Soc. 76, 1753 (195427* 0 ácido hialurónico é !jum glucosaminoglicano nativo altamente viscoso contendo agru-

Jpamentos de ácido /3 j^-glucorónico e β ^^-glucosamina alter- ;!nados; o seu peso molecular situa-se entre 50000 e vários mi- jlhões (8 a 13). A recuperação do ácido hialurónico é uma ta- íjrefa antiga, sendo a separação e o uso do ácido hialurónico Í| , !;extra-puro descritos, por exemplo, nas Memórias Descritivas lidas Patentes Norte-Americanas N2s. 4 141 973 e 4 303 676 e no Íi ij pedido da Patente Europeia N2. 0 144 019. Até aos últimos anos ||o ácido hialurónico tem sido empregue como sal de sódio, por exemplo, na terapia principalmente na oftalmologia, cirurgia !;e na cosmética. Os sais do ácido hialurónico formados com j1 ; iões alcalinos, alcalino-terrosos, de magnésio, alumínio, amónio ou amónio substituído, podem servir como agentes veiculares para aumentar a absorção de drogas (veja-se a Memória Des-· 1' j critiva da Patente Belga n2. 904 547). Os sais de metais pesados do ácido hialurónico (em que "metais pesados" significam os elementos dos 52, 62 e 79 períodos da tabela periódica li Dem como os lantanídeos e actinídeos) e dentro destes o sal i1 l· de prata, são utilizados como agentes fungicidas, enquanto que 0 sal de ouro é empregue para 0 tratamento aa artrite (ve-I ja-se a memória da Patente WO 87/05517).

Provou-se, por vários métodos de elucidação da estrutura, que a estrutura secundária, isto é, a configuração do ácido hialurónico é alterada pela ligação de iões de metais Z». *· vVinter and A. Sruther: J. Mol. Biol. 517, 761 (1977); J. K. Sheehan and E.D.T. Atkins:Int. J. Biol. Macromol. jj, 215 (1983); e N. Pigeroa e B. Chakrabarti: Biopolymers 17, 2415 i (197827· Podem ser exercidos efeitos de variação significati-! vos na estrutura molecular mesmo por iões de metais de carác-j ter semelhante, tal como se mostra peles estudos de raio-X ' comparativos de hialurónato de potássio e sódio (A. K. Mitra

I 4

—jjet al.: J. Macromol. Sei., Phys. 824, 1 e 21 (198527* Isto é jtanto mais válido para os compostos de ácido hialurónico for-jmados com iões de metais de vários tipos que contêm cargas |várias. j Não pode ser encontrada na literatura qualquer referência relativa a sais complexos derivados do ácido hialurónico for-jmado com iões de metais de transição do 4g. perído da tabela Iperiódica; com efeito, de acordo com exames de cromatografia por filtração em gel, o ácido hialurónico em oposição à hepa-rina, é incapaz de ligar iões de zinco /R. F. Parish and W. R. Fair.: Biochem. J. 193, 407-410 (198127· Apesar do facto de, de acordo com a literatura, o ácido hialurónico (ou o seu sal de sódio) ser incapaz de ligar iões de zinco, os autores jj da presente invenção comprometaram-se a investigar a química j'de coordenação da interaeção entre o ácido hialurónico e os ! iões dos metais de transição do 42· período da tabela periódica e, dentro destes, principalmente os iões de zinco e de cobalto. Uma vez que o ácido hialurónico á quase exclusivamente comercializado como o seu sal de sódio sendo assim a I substância básica de todos os sistemas que contêm hialuronato :as nossas investigações começaram na interaeção dos iões de sódio e o hialuronato. Para este fim, mediu-se a actividade | dos iões de sódio livres das soluções aquosas de hialuronato I de sódio usando, um eléctrodo de vidro selectivo ao sódio. ; Ficou assente, sem ambiguidade, destas medidas, que não mais : do que 60 % dos iões de sódio introduzidos como equivalentes juntamente com os grupos carboxilato do hialuronato, se encontraram presentes como iões livres nas soluções aquosas, enquanto que os restantes 40 $ se encontram na forma ligada | ao hialuronato. | De acordo com as nossas medições, aumentando a concentração jj de iões de sódio a quantidade dos iões de sódio ligados pode 5

— ^aumentar para 50-55 % calculada para todos os grupos carboxi- i; 'lato disponíveis. Assim, verificou-se que, diferentemente das ;propriedades comuns dos sais, o hialuronato de sódio não está completamente dissociado na solução aquosa. |Na fase seguinte das nossas investigações, tirou-se uma solu-jjção aquosa de hialuronato de sódio com uma solução de cloreto jde zinco, usando um eléctrodo selectivo dos iões de sódio, acima mencionado, para seguir a mudança na actividade dos iões de sódio livres no sistema. Mostra-se na Figura 1 uma [curva característica que reflecte o processo. Percebe-se que os iões de sódio originalmente ligados ao hialuronato são li-jbertados pelo efeito dos iões de zinco. Com base nos resulta-!'dos destas determinações a concentração total de iões de só-iídio é libertada por uma quantidade equivalente de zinco, um j!facto que prova inequivocamente que os iões de zinco estão Imais fortemente ligados ao hialuronato do que os iões de só-' dio. Assim, a afirmação anterior de que o ácido hialurónico <; era incapaz de ligar os iões de zinco /R. F. Parrish e W. R. Fair: Biochem. J. 193, 407 (1981^7 foi experimentalmente refutada. i ! |f Por este meio foi refutado um conhecimento dos peritos na ma-j; téria, que era válida até ao momento. ! Das nossas investigações acima referidas ficou claro que, atra !vés da interacção de quantidades equivamentes de hialuronato de sódio e iões de zinco (cloreto de zinco) se forma na solução aquosa um associado do hialuronato de zinco com uma composição estoiquiométrica. Depois de uma isotonização apropriada, | a solução obtida pode ser directamente usada para fins terapêuticos são tendo o composto de zinco de ser preparado no j estado sólido, num processo separado. Os exames preliminares ' levados a cabo usando um ião de cobalto e outros iões de me- f ij tais de transição levaram a resultados semelhantes.

JjNão obstante, o complexo foi preparado no estado sólido para j:caracterização e o ambiente directo do ião de zinco foi determinado usando o método da "Estrutura Pina de Absorção de Raioí--X Ampliada", (EXAFS). Foi estabelecido que o zinco é circun-|dado por quatro átomos de oxigénio na primeira esfera de coor-jidenação. 0 comprimento das distâncias de união do Zn-0 é de ||199 pm, enquanto que dois átomos de carbono se encontram: pre-jsentes numa distância maior de 241 pm do átomo de zinco. í j jDe acordo com os nossos exames o hialuronato de zinco difere 'de forma significativa do complexo de cobre análogo que con-!'tém por último quatro ligações equatoriais e duas ligações ’!axiais Cu-0 com os valores Ue 194 e 234 pm, respectivamente. |A distância entre o átomo de cobre e os dois átomos de carbo- |no seguintes é de 258 pm. A estrutura do complexo de cobalto !| fé semelhante ao complexo de zinco mas não ao complexo de cobre. jíAssim, a presente invenção refere-se aos sais complexos deri-j vados do ácido hialurónico desprotonizado com iões de metais j'de transição do 4Q. período da tabela periódica. A invenção refere-se ainda a uma composição que contém, como ingrediente activo, ou agente veicular, um associado (comple-ixo) do ácido hialurónico com iões de metais de transição do | 4S. período da tabela periódica, opcionalmente em mistura com | outro ou outros ingredientes activos e/ou aditivos. iDe acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um processo para a preparação dos novos sais comple-;i xos da invenção, que se caracteriza pelo facto de: ji i; a) se adicionar uma solução aquosa contendo a quantidade || equivalente de um sal, de preferência o cloreto de um dos jj iões de metais de transição do 49. período da tabela pe- ,! riódica, a uma solução aquosa de hialuronato de sódio, ou a um outro sal (sal de metal alcalino ou alcalino-terroso, opcionalmente sal de prata) de hialuronato; ou b) se dissolver um associado formado a partir de ácido hilu-rónico com um sal de amónio quaternário, numa suspensão aquosa, no seio de um dissolvente misto contendo a solução aquosa de um ião de metal de transição do 4S. período da Tabela Periódica e um dissolvente que seja parcialmente miscível com água, de preferência, n-butanol; em seguida se precipitar o sal complexo obtido do ácido hialuró-nico com o ião de metal de transição do 42. período da Tabela Periódica por meio de um alcanol ou uma alcano-na, de maneira conhecida, ou - se separar o precipitado da solução e, em seguida, se assim se desejar, se secar em condições suaves. i!

Com base no que se referiu acima, desenvolveu-se um processo para a preparação de soluções aquosas contendo, como ingrediente activo, um sal complexo de hialuronato de zinco ou um associado semelhante de um ião de metal de transição do 42. período da Tabela Periódica, respectivamente. Estas soluções foram em cada saso preparadas pela reacção directa do ião de metal com o componente de hialuronato. Este método de preparação tornou desnecessário separar previamente os ingredientes activos antes mencionados, no estado sólido. Na solução preparada usando o processo da presente invenção, a quantidade de hialuronato livre (metal não ligado) não tem significado mesmo na presença de uma quantidade equivalente de zinco. Pelo efeito de um excesso de iões de zinco a formação do sal complexo de hialuronato de zinco torna-se quantitativa. 8 -:!No decurso da preparação dos associados de metais da forma '!acima discutida, o pH permanece num valor de cerca de 5. No i 'caso de uma solução de hialuronato de 0,2 i~· em peso/volume í(p/v), o pH atinge um valor de 5,4, enquanto que no caso de 0,5 í- em p/v o valor do pH é de 5. Quando necessário, o pH do (último sistema pode ser ajustado para um valor de 5,5 a 5,6 i í adicionando algumas gotas de uma solução isotónica de acetato ;de sódio. j

Foram preparadas soluções de dois tipos contendo hialuronato ide zinco como ingrediente activo, usando o processo acima re-íferido.

I |!l. Solução de hialuronato de zinco tornada isotónica por meio l· --;--r i de um excesso de cloreto de zinco:

Tendo em conta que o cloreto de zinco livre sozinho pode também ser usado, de preferência, na dermatologia, a pressão os-mótica da solução de hialuronato de zinco foi ajustada para o jvalor isotónico, usando um excesso de cloreto de zinco. A solução assim obtida não contém qualquer hialuronato livre (zin-· i co-não ligado), mas encontrava-se presente no sistema um excesso de cloreto de zinco, juntamente com hialuronato de zinco. 2. Solução de hialuronato de zinco tornada isotónica por meio de um monossacárido ou um álcool de açúcar | Para a utilização terapêutica, em que não é indicada a presença de iões de zinco não ligados ao hialuronato, a solução con tendo iões de zinco numa quantidade equivalente ao hialuronato foi tornada isotónica usando um poliálcool (álcool de açúcar, de preferência sorbitol) ou um monossacárido ou dissacá- ,9 -jlrido (de preferência, glucose). 0 teor de iões de zinco li- 'vres e de hialuronato livre destes últimos sistemas não atin-jgiu os 5 $ do total de zinco ou do teor de hialuronato total, jrespectivamente.

No decurso da utilização dos associados de acordo com a invenção, pode ser eventualmente requeridas composições livres de iões. Nomeadamente, os assoicados preparados de acordo com o ||processo da invenção acima referida, contêm usualmente clore-|to de sódio ou um outro sal formado a partir do catião de hialuronato de partida e do anião do sal de metal 3d. |i ijPodem ser usadas duas variantes diferentes para a preparação ide um assoicado do ácido hialurónico livre de sal, formado com um ião de metal 3d. Estas variantes de processo são as se- i; !iguintes: i. ha) Adiciona-se, em porções, uma solução de um sal de amónio ; quaternário a uma solução de um hialuronato conhecido, de preferência, hialuronato de sódio. Depois de uma purifica-j ção satisfatória, dissolve-se o novo associado de hialu-j ronato de amónio quaternário precipitado, soh agitação i'j vigorosa num dissolvente misto consistindo numa solução ii j aquosa de um iao de metal de transiçao do 42. período da | Tabela Periódica e um dissolvente que seja parcialmente miscível com água, de preferência, n-butanol. Deixam-se separar as duas fases e, em seguida, o associado de hialuronato é precipitado adicionando um alcanol ou uma cal-canona à fase aquosa, separa-se o precipitado e lava-se; ou 1 i !j b) Depois de se adicionaram 2,0 a 3 volumes de um alcanol em

: I ! Cj-C^ ou silcanona em C-^-C^, sob agitação, a uma so- | lução de hialuronato de zinco, apropriadamente a uma so- j lução não isotonizada contendo cloreto de zinco numa quan

,ί tidade equivalente ao hialuronato, filtra-se o hialuro-nato de zinco precipitado e lava-se com alcanol ou alca-nona, respectivamente usada para a precipitação. Quando ! necessário, dissolve-se o hialuronato de zinco em água livre de iões e repete-se a precipitação. 1 Quando se necessita um hialuronato de zinco sólido livre de iões, seca-se o precipitado sob pressão reduzida em condições I suaves. No caso de se necessitar uma solução de hialuronato de zinco livre de iões, é preferível dissolver o hialuronato de zinco liberto de dissolvente. De acordo com qualquer uma | das variantes de processo acima, obtém-se um sólido livre de 'iões ou um produto dissolvido, com uma pureza opcional depen-|dendo da qualidade do hialuronato de zinco de partida.

Os resultados da investigação clínico-farmacológica para uma composição (Exemplo 13) contendo como ingrediente activo o | hialuronato de zinco de acordo com a presente invenção, são ; revelados no tratamento da úlcera crural usado pana a aceleração da epitelização de superfícies deficientes em epitélio. |Foi usada como controlo uma composição contendo hialuronato de sódio. de úlcera crural. A distri-grupos de acordo com o sexo, da doença foi a seguinte. I: Este exame foi efectuado em 12 ou 14 úlceras, respectivamente ; de 8 ou 12 pacientes que sofriam i buição dos pacientes de ambos os ; e idade, bem como com a natureza 11

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I :í i í —;l0s tratamentos foram levados a cabo de forma a que, antes do '' início do tratamento se efectuou uma terapia de purificação de acordo com o estado clínico actual da úlcera. 0 tratamento com hialuronato de zinco ou de sódio, respectivamente, foi j iniciado em úlceras quase purificadas ou nos casos em que foi ^observada uma diminuição significativa da crosta "sorbes". 0 tratamento foi levado a cabo uma vez ao dia de maneira a que a composição fosse gotejada sobre a superfície da úlcera pu-I rificada numa quantidade que molhasse a superfície da ferida J com uma camada fina. A composição foi usada durante 4 semanas. No início do tratamento e depois uma vez por semana preencheu-se a folha com os ; dados e as úlceras dos pacientes foram documentadas com foto-i grafias. Recolheu-se uma amostra de descarga para exame bacteriológico.

As características bem como a gravidade das lesões epiteliais I foram marcadas com os seguintes símbolos e sinais.

Características gravidade Área (a) 0 0 i Inferior 1 a 10 cm2 1 Entre 10 2 2 cm e 25 cm 2 Acima de 25 cm2 3 1 Infecção (b) Clinicamente pura 0 I! :i í 13 L/

Características gravidade Infecção (h) Revestida em 50 $ 1 1 Revestida em 100 $ 2 Necrose (c) i (Só no caso de uma úlcera arterial) Negativo 0 i Inferior a 10 f? 1 : Entre 10 % e 15 % 2 100 lo 3 Ausência de necrose 4

Avaliarão Γ ! Para a avaliação, determinaram-se os valores das caracterís- i | ticas em separado e calculou-se a classificação da gravidade |l geral usando a fórmula seguinte: s = \J a x b x c jj j| Os resultados das investigações farmacológicas clínicas en-ij contram-se ilustrados na Figura 2. Os resultados do tratamen-

i I ii to com hialuronato de zinco são revelados na curva marcada l! com uma cruz enquanto que os tratamentos com hialuronato de : sódio é ilustrado na curva ilustrada com um quadrado em funil ção do número de semanas que envolveram o tratamento. 0 va-: lor de classificação delineado na ordenada representa o índice de gravidade geral calculado usando a fórmula acima.

I i 14 .1

Para uma comparação mais correcta do hialuronato de zinco pa-i!ra o hialuronato de sódio usado como controlo ilustram-se na ;Figura 3 os valores relativos correctos em relação com os valores de classificação de partida como 100 f. A alteração nos valores relativos correctos foi estatistica-:mente avaliada em função do número de semanas (1 a 4). No tra-tamento com hialuronato de zinco e de sódio, o número de úl-j[ceras diminuiu para um valor de classificação inferior rela-ijtivo de 90 fc, 80 % e 60 f, respectivamente, depois de 1, 2, l! j|3 e 4 semanas de investigação. ;i0s resultados estão sumarizados na Tahela 1. * 7 '*<**.. i-7ff 3 cd β cd S cu ra ccíi cd β β 0 (D m «1 ro ο cr»

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Pode afirmar-se da Tabela 1 que o tratamento com hialuronato |! de zinco foi em todas as semanas vantajoso, em comparação com os resultados obtidos com hialuronato de sódio, usado como controlo. |A análise estatística da resposta obtida para a hipótese em ] questão, provou que a vantagem da composição de hialuronato : de zinco foi altamente significativa (p 99 %) em comparação ij com o hialuronato de sódio. | Num trabalho estatístico subsequente, investigou-se uma dis-;j tribuição mais detalhada dos valores de classificação relati-Ijvos em função do tempo de tratamento. Os resultados obtidos ;; estão sumarizados na Tabela 2. i ií

Tabela 2

Ingrediente activo de j| composição II 1-. semana jl Hialuronato I f de zinco Número e valor de... das úlceras_ superior a entre entre inferior a 90 % 90 e 70% 70 e 50% 50% 2 7 5 0

Hialuronato de sódio : í í i 2¾. semana | Hialuronato i! de zinco a Hialuronato ! de sódio 8 0 4 3 6 3 0 7 5 1 0 í. iIj 17 3 a b e 1 a 2 - cont. Número e valor de... das úlceras

Ingrediente . activo de superior a entre entre inferior a j composição 90 $ 90 e 70$ 70 e 50$ 50 $ [j 3-. semana i jHialuronato de | zinco 0 !' Hialuronato de !i sódio 2 l 4§. semana I - ---- j :: Hialuronato de i zinco 2 1 51 8 2 5 1 7 3 ,Hialuronato de sódio 1 5 3 3

Os dados da Qabela 2 apoiam de forma semelhante a vantagem do hialuronato de zinco. Oe exames estatísticos mais pormenorizados mostram o significado da diminuição dependente do tempo de tratamento.

Sumarizando: Na avaliação das investigações clínico-farmaco- ! lógicas pôde ser provada a eficácia superior do hialuronato ji de zinco mesmo num baixo número de úlceras; esta vantagem pô-j de ser particularmente sustentada no período inicial do tra-i tamento.

invenção é ilustrada em maior pormenor por meio dos Exemplos ' 1 n ·/ ο

não limitativos seguintes ijo teor de proteínas do hialuronato (HA) foi determinado usan-i do o método de C. H. Lowry /J. Biol. Chem. 193 (195127; a vis-· ; cosidade do hialuronato foi medida num viscómetro de Ostwald numa solução salina fisiológica a 25°C. 0 valor da viscosida-j de intrínsica extrapolado para concentração ”0", isto é, .... é referido ahaixo. 0 teor HA foi determinado | usando o método de Bitter /Inal. Biochem. 4, 330 (196227· I1 EXEMPLO 1 :Preparação de uma solução de hialuronato de zinco | Dissolvem-se 40,18 mg de hialuronato de sódio em 20,0 ml de água destilada duas vezes. Deste modo, a concentração de partida do ácido hialuronico é de 2,009 mg/ml e a concentração equivalente da solução é de 4,241 x 10”^ moles/litro (Na+ ou j| unidade dimérica de ácido hialurónico) . No decurso da medição j'adiciona-se à mistura reaccional uma solução de cloreto de ;i zinco com uma concentração de 0,01554 moles/litro, através de ij uma microbureta. Adiciona-se primeiro a solução em pequenas ;j porções (0,05 ml) e depois em porções maiores (0,1 a 0,2 ml). íj |j A mudança potencial da solução é medida usando um potencióme-i tro de precisão com mostrador digital e eléctrodos de vidro jj selectivos aos iões de sódio e eléctrodos de prata/cloreto de Ij prata. Continua-se a titração até o potencial medido não se !j alterar mais pela adição de uma porção adicional da solução |j de titração. (0 sistema de medição foi calibrado em condições 1' ji análogas à determinação prática). : A selectividade do eléctrodo selectivo aos iões de sódio foi !i também observada na presença de iões de Zn^+, a fim de con- 19 - trolar que a mudança potencial na determinação prática foi '!causada pelos iões de Na+ libertados e não pelos iões de Zn2+ ||introduzidos na solução. Titrou-se uma solução de cloreto de ! _ "5

sódio 2,00 x 10 M usando a solução de titração de cloreto de zinco, em condições semelhantes às referidas acima. Aumentando a concentração de Zn2+ e 0 para 4 x 10” ^ moles/litro, ob-!servou-se um aumento potencial de cerca de 2 mV, enquanto que a determinação prática revelou uma mudança de cerca de 20 mV i ;em condições semelhantes. Assim, a avaliação não teve qualquer obstáculo. No decurso da determinação o aumento na actividade |dos iões de sódio calculado a partir dos dados da determina- tção, verificou-se a formação quantitativa do associado de zin- ,i :co. I j ^Preparação de uma solução de cloreto de zinco j íUma vez que uma solução contendo cloreto de zinco numa concentração precisa não pode ser preparada pela passagem directa, j prepara-se primeiro uma solução com a concentração aproximada-· ||mente desejada. Ao preparar esta solução não deverá ser usado qualquer ácido pelo que pode acontecer que o cloreto de zinco ipesado não esteja completamente dissolvido. Depois da sedimentação do resíduo insolúvel (cerca de 30 minutos) enche-se o balão marcado até à marca e filtra-se a solução através de um papel de filtro.

[A concentração precisa do filtrado é determinada por titração ij ij complexométrica usando um tampão 10 e um indicador de ericró-mio negro-T. Prepara-se a solução de cloreto de zinco com uma concentração precisa de 0,100 mol/litro, por meio da diluição precisa desta solução. |As características do hialuronato de sódio usado para a preparação da solução são as seguintes: 11

ή20 f/ :Ί h

25C »0

Peso molecular Teor de proteínas Atsorsão de UV A257 1 klf‘ 280 Π

Viscosidade /γΓ~J Teor de ' HA x : 18500C0 : 0,07 /í em peso : 0,133 : 0,075 : 13,7 dl/g : 98,12 fo em peso x HA = ácido hialurónico (tal como absorvido aqui) EXEMPLO 2 1'

Preparação de uma solução para uso dermatológico e cosmético 'Adicionam-se 12,5 ml de uma solução de cloreto de zinco com j|uma concentração de 0,100 nd/litro preparada com água isenta ! de iões, a 0,50 g de hialuronato de sódio pesado num balão ίmarcado de 100 ml. (Pode também ser usada uma outra concentra-· j! ção de cloreto de zinco, mas a quantidade de cloreto de zinco '1 deverá ser a mesma). Deixa-se inchar 0 hialuronato de sódio || (12 horas) na solução carregada até à marca com água isenta íj de iões, para se obter uma solução de hialuronato de zinco de j 0,5 em peso/volume.

As características do hialuronato de sódio usado para a preparação da solução acima são as seguintes:

Viscosidade //η_~^25°0 Teor de proteínas : 16,5 dl/g : 0,8 % em peso.

I 21 ο ! EXEMPLO 3 i- [Preparação de uma solução de hialuronato de zinco para uso em | soluções in.jectáveis [IAs operações descritas neste exemplo são efectuadas em condi-[Ições estéreis.

Adicionam-se 5,0 ml de uma solução de cloreto de zinco, com iuma concentração de 0,100 mol/litro preparada com água desti-jlada duas vezes (água para uso nas injecções livre de pirogé-|jnio, estéril), e 0,20 g de hialuronato de sódio( (de qualida- jj [de pura em pó) pesada num balão marcado de 100 ml, em seguida ;;completa-se o volume até 50 ml com água destilada duas vezes. jDeixa-se inchar o hialuronato de sódio durante a noite, de->pois dissolve-se agitando e completa-se a solução até à marca com água destilada duas vezes. Piltra-se a solução obtida ['através de uma membrana de filtro (tamanho dos poros 0,45 yU para dar uma solução de hialuronato de zinco de 0,2 % em pe- i1 j| so/volume. I1 í As características do hialuronato de sódio usado para a pre-! paração da solução acima são as seguintes:

A :! Qualidade

Peso molecular Teor de proteínas Absorção de UV 280

Teor de HA

Viscosidade £7γ\ ^ /<J

^ 25°C : pó puro livre de piro-génio estéril : 1850000 : 0,07 Ío em peso : 0,133 : 0,075 : 98,12 % em peso : 13,7 dl/g

I 22 I 22 4

EXEMPLO j| Preparação de uma solução de hialuronato de Zinco livre de l| : iões

Adicionam-se 600 ml de etanol de grau analítico, sob agitação | a 200 ml de uma solução de hialuronato de zinco de 0,50 $ em ; peso/volume, obtida de acordo com o Exemplo 2, filtra-se o hia |jluronato de zinco precipitado num filtro de vidro, lava-se jduas vezes com 50 ml de etanol, de cada vez, com a mesma qua-llidade e depois seca-se sob pressão reduzida. Leste modo, |i obtêm-se 0,88 g de hialuronato de zinco que é usado para a 11 |preparação de uma solução de hialuronato de zinco de 0-50 # !em peso/volume, da forma descrita no Exemplo 2. A solução de hialuronato de zinco obtida não contém qualquer cloreto de sódio proveniente da reacção entre o hialuronato de sódio e o cloreto de zinco; assim, é praticamente livre de iões. EXEMPLO 5

Preparação de hialuronato de zinco de iões ou da sua solução para uso terapêutico íj 1 As operações descritas neste Exemplo são levadas a cabo em condições estéreis. !Adicionam-se em porções 1500 ml de etanol (qualidade mais pu-j ra), a 500 ml de uma solução de hialuronato de zinco prepara-I da de acordo com o Exemplo 3, sob agitação. Depois da adição, |i jagita-se o sistema durante 30 minutos, filtra-se o precipita-!do de hialuronato de zinco num filtro de vidro, lava-se 3 vezes com 100 ml de etanol (qualidade mais pura) de cada vez e ! seca-se sob pressão reduzida em condições suaves e estéreis. ! 23

/

I EXEMPLO 6 iPreparação de hialuronato de zinco livre de iões

Adicionam-se 200 ml de uma solução de 10 fc em peso de Hyamina (R) 1622 (puríssimo) (cloreto de benzildimetil2(2-27-2-p-(l,l, 3,3-tetra-metilbutil)fenoxi/etoxi/etil/amónio) sob agitação, a uma solução contendo 1 g de hialuronato de sódio em 400 ml de água bi-destilada. 0 precipitado, isto é, o associado de amónio quaternário do ácido hialurónico formado é separado por centrifugação, lavado duas vezes de cada vez, com 100 ml de água bi-destilada e centrifugado novamente. Dissolve-se o precipitado lavado num dissolvente misto consistindo em 400 ml de uma solução aquosa de 2 fo em peso/volume de cloreto de zinco (pH 5,0 a 5,4) e 400 ml de n-butanol. Depois de se deixarem separar as duas fases, filtra-se a camada aquosa contendo o hialuronato de zinco dissolvido, através de um filtro de membrana (tamanho dos poros 0,45 ^u), depois o hialuronato de zinco é precipitado adicionando 3 volumes de etanol, filtra-se num filtro de vidro, lava-se com etanol e seca-se numa atmosfera de azoto em condições suaves, para se obterem 0,82 h g de hialuronato de zinco. j

Quando necessário, prepara-se uma solução de 0,50 i- em peso/ i /volume a partir do hialuronato de zinco obtido que é depois j purificada tal como se descreveu no Exemplo 4. As caracterís-ticas do hialuronato de sódio usado como material de partida ! são as seguintes:

Teor de proteínas : 16,5 dl/g : 018 % em peso/volume 0 hialuronato de zinco pode ser preparado tal como se descreveu acima também a partir de associados formados a partir de outros sais de amónio quaternários. Os sais quaternários úteis para este fim são: a) Cloreto de carbotetradeciloximetil-trimetilamó- nio (veja-se Memória da Patente Húngara ..... 188 537), b) Cloreto de hexadecilpiridínio, c) Cloreto de cetilpiridinio, d) Cioreto de trimetilamónio e semelhantes. 5XEMP10 7 i: jiPreparação de hialuronato de cobalto ;j ii jSegue-se o processo descrito no Exemplo 6, com excepção de se ijdissolver o associado de amónio quaternário do ácido hialuró-inico num dissolvente misto consistindo numa solução aquosa a i í0,2 fc em peso/volume de cloreto de cobalto (11).6^0. e n-bu-itanol. | EXEMPLO 8

Preparação de uma solução aquosa contendo 0,50 ^ em peso/volume de hialuronato de zinco tornado isotónico por meio de cloreto de zinco

Adicionam-se cerca de 50 ml de uma solução de cloreto de zinco com uma concentração de 0,110 moles/litro, a 0,50 g de hialuronato de sódio num balão marcado de 100 ml e depois deixa--se inchar durante a noite. Em seguida, dissolve-se o hialuronato de sódio por agitação e enche-se o balão até à marca com uma solução de cloreto de zinco com uma concentração de 0,110 moles/litro. 25

A pressão osmótica da solução obtida é de 0,1491 moles/litro conforme expressa em concentração equivalente de cloreto de !sódio e o valor do pH é de 5,0. Quando necessário, o valor do pH é ajustado para 5,5 a 5,6, adicionando 2,00 ml de uma solução de acetato de sódio com uma concentração de 0,150 moles/ /litro. Depois de se ajustar o valor do pH, a pressão osmóti-i ca da solução é de 0,1489 conforme expressa em concentração equivalente de cloreto de sódio. ;A solução de hialuronato de zinco é preparada a partir do hia-;luronato de sódio particularmente puro, descrito no Exemplo 3, I com água destilada duas vezes e em condições assépticas, deli pois a solução é filtrada através de um filtro de membrana ' (tamanho dos poros 0,45 yu). i |A solução obtida pode ser também usada em composições injectá- i: veis. ! EXEMPLO 9

Preparação de uma solução aquosa contendo 0,2 % em peso/volu-me de hialuronato de zinco tornada isotónica com cloreto de || zinco | 11 jPara um volume final de 100 ml, pesam-se 0,20 g de hialurona-!to de sódio e dissolvem-se numa solução de cloreto de zinco com uma concentração de 0,120 moles/litro. A dissolução e a preparação da solução de cloreto de zinco con jprecisamente uma concentração de 0,120 moles/litro são leva-i das a cabo de acordo com o Exemplo 1 (de acordo com a sensi-;bilidade alterando a quantidade de cloreto de zinco). !A pressão osmótica da solução é de 0,154 moles/litro conforme i| expressa em concentração equivalente de cloreto de sódio; o

pH mostra um valor de 5,3 a 5,4. 'Teor de HA Viscosidade ;Teor de proteínas Pureza de soluçãox 1,96 mg/ml 15,9 dl/g 0,015 mg/ml . 1 cm L660 = 0,015

Com base na absorvância medida a 660 nm numa cuvete de 1 cm. A solução é preparada usando o hialuronato de sódio com a qualidade caracterizada no Exemplo 2 e usado em primeiro lugar para a preparação de composições dermatológicas e cosméti-

I

cas. I EXEMPLO 10

Preparação de uma solução aquosa contendo 0,50 j* em peso/volu-j-me de hialuronato de zinco tornado isotónica com glucose A solução deste Exemplo contém hialuronato de sódio e a quan-! tidade equivalente calculada de cloreto de zinco.

Adicionam-se 12,50 ml de uma solução de cloreto de zinco com uma concentração de 0,100 moles/litro, a 0,50 g de hialurona-l to de sódio pesado num balão marcado de 100 ml. (Pode também ser usada uma outra concentração de cloreto de zinco mas a quantidade de cloreto de zinco deverá ser a mesma). Deixa-se

I inchar o hialuronato de zinco durante 12 horas na solução de j cloreto de zinco completada até 50 ml de água isenta de iões, depois dissolve-se abanando-se. Em seguida, adicionam-se 24, 50 ml de uma solução de glucose com uma concentração de 1,00 Λ / 27 moles/litro e completa-se até à marca com água livre de iões. A pressão osmótica da solução é de 0,1495 moles/litro conforme expressa em concentração equivalente de cloreto de sódio; o pH revela um valor de 5,4. Concentração total de zinco = = 1,2 x 10"2 moles/litro. A solução é preparada usando o hialuronato de sódio com a qualidade caracterizada no Exemplo 2 e usada primeiro que tudo para a preparação de composições dermatológicas e cosméticas. EXEMPLO 11

Preparação de uma solução aquosa contendo 0.2 % em peso/volu-me de hialuronato de zinco tornada isotónica com glucose A solução deste exemplo contém hialuronato de sódio e a quantidade equivalente calculada de cloreto de zinco.

Adicionam-se 5,0 ml de uma solução de cloreto de zinco com uma concentração de 0,100 moles/litro, a 0,20 g de hialurona-!to de sódio pesado num balão marcado de 100 ml, em seguida completa-se durante a noite, dissolve-se o hialuronato de sódio abanando-se, adicionam-se 27,0 ml de uma solução de glucose com uma concentração de 1,00 moles/litro e completa-se o balão até à marca com água livre de iões. A pressão osmótica da solução é de 0,151 moles/litro conforme expressa na concentração equivalente de cloreto de sódio; o pH revela um valor de 5,6 a 5,7; concentração total de zinco= = 5 x 10"3 moles/litro. 28 EXEMPLO 12

Preparação de uma solução aquosa contendo 0,5 jc em peso/volu-me de hialuronato de zinco tornada isotónica com sorbitol A solução de hialuronato de zinco descrita em seguida é preparada em condições assépticas a partir de hialuronato de sódio com uma pureza particularmente elevada descrita no Exemplo 3 e água destilada. A solução contém cloreto de zinco numa quantidade equivalente calculada para o hialuronato de sódio.

Segue-se o processo descrito no Exemplo 10, com exceptão de, em vez da solução de glucose, se adicionarem à solução de hia-;luronato de zinco, 23,50 ml de uma solução de sorbitol com j uma concentração de 1,00 moles/litro (182,19 g de D-sorbitol em 1 litro). ! jA solução assim preparada é filtrada através de um filtro de jmembrana (tamanho dos poros 0,45 ^u). Esta solução pode ser usada para qualquer finalidade incluindo para composições in- jectáveis. i ;A pressão osmótica da solução é de 0,1520 moles/litro conforme expressa na concentração equivalente de cloreto de sódio; o pH revela um valor de 5,5; concentração total de zinco=l,25 x 10 moles/litro. EXEMPLO 13

Preparação de uma solução aquosa contendo 0,2 # em peso/volu-me de hialuronato de zinco tornada isotónica com sorbitol A solução descrita neste Exemplo contém cloreto de zinco numa quantidade equivalente calculada para o hialuronato de sódio. A solução de hialuronato de zinco descrita em seguida é prepa-· 29 b / / / - rada em condições assépticas a partir de hialuronato de sódio com uma pureza particularmente elevada descrita no Exemplo 3 com água destilada duas vezes.

Segue-se o processo descrito no Exemplo 12, com exceptão de se dissolverem 0,2 g de hialuronato de sódio, 5 ml de uma solução de cloreto de zinco com uma concentração de 0,100 moles/ /litro, depois adicionam-se 26,50 ml de uma solução de sorbi-tol com uma concentração de 1 mole/litro e finalmente comple-ta-se a solução até 100 ml. A solução assim preparada é filtrada através de um filtro de membrana (tamanho dos poros 0,4$ . Esta solução pode ser usada para qualquer fim incluindo para composições injectáveis. A pressão osmótica da solução é de 0,1501 moles/litro conforme expressa em concentração equivalente de cloreto de sódio; o pH revela um valor de 5,6; concentração total de zinco=5 x IO"3 moles/litro.

Concentração total de zinco = 5 x 10~3 mole/litro 2,03 mg/ml 16,1 dl/g 0,016 mg/ml 4ôSm = °’010

Teor de hialuronato Viscosidade Teor de proteínas Pureza de solução x

Com base na absorvância medida a 660 nm numa cuvete de 1 cm EXEMPLOS 14 a 26

Nos Exemplos seguintes os componentes das várias composições (composições farmacêuticas e cosméticas) são dados em relação aos tipos de formulação por nós seleccionadas. A preparação 30 das soluções de hialuronato de zinco tornadas isotónicas são descritas nos Exemplos anteriores. Aqui, "água destilada para fins de injecção" significa água destilada duas vezes, preparada em condições assépticas. I. Solução in.jectáveis

As composições dos Exemplos 14 a 17 são usadas para a administração intracutânea enquanto que a do Exemplo 18 serve para o uso intra-ocular. E empregue nestes Exemplos o ingrediente activo com a qualidade descrita no Exemplo 3.

IeXEMPLO 14 ir1·'·1·........... || 2.0 mg 48,3 mg 1.0 ml 5.0 ml 42,8 mg 1.0 ml jlngrediente activo de hialuronato de zinco i

Sorbitol

Volume final da solução aquosa preparada com água destilada para fins de injecção • I 11

I ΈΧΕΜΡΕΟ 15

Ingrediente activo de hialuronato de zinco Sorbitol í Volume final da solução aquosa preparada com í água destilada para fins de injecção EXEMPLO 16 2,0 mg 0,05 mg 0,5 mg

Ingrediente activo de hialuronato de zinco p-hidroxibenzoato de propilo p-hidroxibenzoato de metilo 31 h i · ' · · Λ· .? Glucose 48,6 mg Volume final da solução aquosa preparada água destilada para fins de injecção com 1,0 ml EXEMPLO 17 Ingrediente activo de hialuronato de zinco 5,0 mg p-hidroxihenzoato de propilo 0,05 mg p-hidroxibenzoato de metilo 0,5 mg Glucose 44,1 mg Volume final da solução aquosa preparada água destilada, para injecção com 1,8 ml EXEMPLO 18 Ingrediente activo de hialuronato de zinco 10,0 mg Sorbato de potássio 1,0 mg Sorbitol 41,0 mg Volume final da solução aquosa preparada com água destilada, para injecção 1,0 ml As composições descritas nos Exemplos 20 mente usadas para fins dermatológicas e a 28 são principal· cosméticas. E empre· gue nestes Exemplos ingrediente activo com a qualidade descrita no Exemplo 2. II. Soluções para uso tópico EXEMPLO 19

Ingrediente activo de hialuronato de zinco 5,0 mg 32

Sorbato de potássio 1,0 mg Acetato de sódio 24,6 mg Volume final da solução aquosa com água destilada preparada 1,0 ml EXEMPLO 20 Ingrediente activo de hialuronato de zinco 2,0 mg Sorbato de potássio 1,0 mg Sorbitol 48,3 mg Volume final da solução aquosa com água destilada preparada 1,0 ml

fIII. GELES PARA USO TOPICO EXEMPLO 21

Ingrediente activo de hialuronato de zinco 20,0 mg Polimerisato de ácido acrílico 200 mg Hidróxido de sódio com concentração de 30 % 50 mg Sorbato de potássio 10 mg Agua destilada até 10,0 mg EXEMPLO 22 Ingrediente activo de hialuronato de zinco 20,0 mg Polimerisato de ácido acrílico 50 mg Hidróxido de sódio com concentração de 30 40 mg 33

, > u 1500 mg 10 mg até 10,0 mg

Propileno-glicol Sorbato de potássio Agua destilada IV. CREMES E UNGUENTOS PARA USO TOPICO EXEMPLO 23

Ingrediente activo de hialuronato de zinco 50 mg Sorbato de potássio 10 mg Cera de abelha branca macia 125 mg Oleato de sorbitano 150 mg Álcool cetil-estearílico 840 mg Monoestearato de glicerilo 1100 mg Propileno-glicol 4750 mg Água destilada (| j até 10 g EXEMPLO 24 Ingrediente activo de hialuronato de cobalto 50 mg Sorbato de potássio 10 mg Cera de abelha branca macia 125 mg Oleato de sorbitano 150 mg Álcool cetil-estearílico 840 mg MTonoestearato de glicerilo 1100 mg Propileno-glicol 4750 mg Água destilada até 10 g

EXEMPLO 25

Ingrediente activo de hialuronato de zinco 50 mg 2-fenoxietanol 100 mg Lauril-sulfato de sódio 100 mg Palmitato de cetilo 400 mg Estearina 400 mg Álcool estearílico 450 mg Álcool cetílico 450 mg Vaselina branca 500 mg Propileno-glicol 550 mg Glicerol 600 mg ] iAgua destilada í até 10,0 g EXEMPLO 26 Ingrediente activo de hialuronato de cobalto 50 mg 2-fenoxietanol 100 mg Lauril-sulfato de sódio 100 mg Palmitato de cetilo 400 mg Estearina 400 mg Álcool estearílico 450 mg Álcool cetílico 450 mg Vaselina branca 500 mg Propileno-glicol 550 mg Glicerol 600 mg Agua destilada até 10 g

Claims

Q 27 EXEMPLO 50,0 mg 250 mg 500 mg 40o mg 500 mg 10 S Ingrediente activo de hialuronato de zinco Cera microcristalina Propileno-glicol Sorbitol Lanolina (acetilada) Vaselina branca até V. COMPOSIÇÕES PARA A PURIFICAÇÃO E CICATRIZAÇÃO de p^rtoAS PURULENTAS E QUEIMADURAS EXEMPLO 28 10 mg 1,0 mg 50 mg 1 g Ingrediente activo de hialuronato de zinco jsorbato de potássio I jDióxido de silício hidrofílico coloidal ;Sorbitol I R|IVINDig4ÇfeS 1§. - Processo para a preparação de novos sais complexos derivados de ácido hialurónico desprotonizado e de iões de metais de transição do 49. período da Tabela Periódica dos Elementos caracterizado pelo facto de a) se adicionar uma solução aquosa contendo a quantidade equivalente de um sal, de preferência, cloreto de um dos iões dos metais de transição do 42. período da Tabela Pe- riódica dos Elementos a uma solução aquosa de hialuronato de sódio ou a um outro hialuronato (sal de metal alcalino ou alcalino-terroso, opcionalmente sal de prata); ou b) se dissolver uma associação formada a partir de ácido hilu-· rónico com um sal de amónio quaternário numa suspensão aquosa no seio de um dissolvente misto contendo a solução aquosa de um ião de um metal de transição do 42· período da Tabela Periódica e um dissolvente que seja parcialmente miscível com água, de preferência, n-butanol; depois, se precipitar o sal complexo derivado do ácido hialuró-· nico desprotonizado e do ião de metal de transição do 43· período da Tabela Periódica dos Elementos por meio de um alcanol ou de uma alcanona; ou se separar o precipitado da solução e então, se assim se desejar - se secar sob condições suaves. 2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se usar ião zinco como ião de metal de transição. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se usar ião cobalto como ião de metal de transição. 4-. - Processp para a preparação directa de uma composição aquosa contendo hialuronato de zinco, caracterizado pelo facto de se adicionar uma solução aquosa contendo cloreto de zin-· 37 « / $y .fs íM* i co numa quantidade equivalente ou numa quantidade que excede a quantidade equivalente necessária para atingir uma solução isotónica. 5-. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado pelo facto de se misturar ou se dissolver, como ingrediente activo, um sal complexo derivado do ácido hialurónico desprotonizado e de iões de metal de transição do 42. período da Tabela Periódica dos Elementos, preparado de jacordo com o processo da reivindicação 1, com agentes veiculares e diluentes normalmente usados e opcionalmente com um agente de isotonização ou outros aditivos e se transformar a mistura numa composição farmacêutica apropriada. 6â. - Processo para a preparação de uma composição cosmética com efeito curativo, caracterizado pelo facto de como ingrediente activo se mistura um sal complexo derivado do ácido hialurónico desprotonizado e de iões de um metal do 42. período da Tabela Periódica dos Elementos, preparada de acordo com o processo da reivindicação 1, com agentes veiculares e diluentes normalmente usados e opcionalmente se misturar ou se dissolver os mesmos conjuntamente com um agente de isotonização e/ou outros aditivos e transformando a mistura numa composição cosmética. 7â. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo facto de se usar um sal complexo de zinco como complexo formado por iões de um metal de transição do 42. período da Tabela Periódica dos Elementos. 8-. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 5 ou 38

A 6, caracterizado pelo facto de se usar um sal complexo de cobalto como complexo formado por iões de metal de transição do 43· período da Tabela Periódica dos Elementos. Lisboa, 22 de Fevereiro de 1990 0 Agente Oficial da Propriedade Industrial

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