PT717047E - Processo para a producao de dissacaridos e novos dissacaridos - Google Patents

Description

86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ DESCRICÃO "Processo para a produção de dissacáridos e novos dissacáridos" A presente invenção refere-se a um processo para a produção de dissacáridos. Os dissacáridos são úteis como componentes de fármacos, alimentos e cosméticos, etc., e como estabilizantes de enzimas em reagentes de diagnóstico, etc.

Antecedentes da invenção

Como processo para a produção de dissacáridos possuindo uma ligação glicosídica a, 1-1, é conhecido um processo para a produção de trealose [glucosiKa, 1-1 )D-glucose] utilizando um microorganismo pertencente ao género Nocardia (Pedido de Patente japonesa publicado não examinado n° 1 54485/75} e um processo para a produção de trealose por tratamento de maltose [glucosiKa, 1-4)D-glucose] com maltose-fosforilase (posteriormente aqui referida como MP) e trealose-fosforilase (posteriormente aqui referida como TP) (Pedido de Patente japonesa publicado examinado n° 60998/88). Como processo para a produção de dissacáridos possuindo uma ligação glicosídica a, 1-4, é conhecido um processo para a produção de derivados de maltose utilizando um extracto derivado de Neisseria perfíava [J. Biol. Chem,, 236. 21 83-2185 (1 961)].

Contudo, no processo que utiliza o microorganismo pertencente ao género Nocardia, apenas é produzida uma pequena quantidade de trealose no meio de cultura, e no processo para a produção de dissacáridos através do tratamento de maltose com MP e TP, não podem ser produzidos outros dissacáridos para além da trealose. No processo que utiliza um extracto derivado de Neisseria perf/ava, o substrato β-glucose-l-fosfato é obtido pela fosforólise de maltose, contudo, o processo requer um passo de remoção da glucose formada como subproduto.

Sabe-se que dissacáridos como a trealose e a maltose melhoram a estabilidade de biopolímeros tais como proteínas enzimáticas [C. Colaço et ai., Bío/Techno/oQV, 10, 1007-1011, (1992)].

Em EP-A-0 423 768 descreve-se um método para a preparação de celobiose: trata-se sacarose com sacarose-fosforilase para obter

86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 2 glucose-1-fosfato e frutose. A frutose é adicionalmente feita reagir com glucose através da actividade da glucose-isomerase. Finalmente, a glucose obtida no passo anterior e a glucose-1-fosfato obtida no primeiro passo são tratadas com celobiose-fosforilase para obter celobiose.

Descricão da invenção: A presente invenção proporciona um processo para a produção de dissacáridos que compreende: a condensação de beta-glucose-1-fosfato num meio aquoso com a) um monossacárido seleccionado de entre o grupo que consiste em D-fucose e D-xilose, na presença de trealose-fosforilase que actua sobre o monossacárido seleccionado, ou b) um monossacárido seleccionado de entre o grupo que consiste em D-manose, D-alose, D-tagatose, D-sorbose e L-fucose, na presença de maltose-fosforilase que actua sobre o monossacárido seleccionado; e a recuperação do dissacárido formado no meio aquoso, em que a referida trealose-fosforilase é derivada de um microorganismo pertencente ao género Cateílatospora e a referida maltose-fosforilase é derivada de um microorganismo pertencente ao género Propionibacterium. A presente invenção proporciona ainda dissacáridos obtidos pelo processo da presente invenção. A presente invenção é descrita em seguida em detalhe. A fonte de enzima empregue na presente invenção inclui uma cultura, células ou células processadas de um microorganismo possuindo actividade de fosforilase de açúcares ou uma enzima possuindo actividade de fosforilase de açúcares.

Os exemplos de microorganismos incluem microorganismos produtores de TP tais como Cateílatospora ferruginea KY2039 e Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 e microorganismos produtores de MP tais como Propionibacterium freudenreichii KY4002 e Enterococcus faecium ATCC 10541.

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As propriedades bacteriológicas das espécies dos microorganismos atrás listados estão descritas em Int. J. Syst. Bacterio/., 36, 512-517 (1986) para a Cate/latospora ferruginea, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.4, 2504-2506 (1989) para a Kineosporia aurantiaca, Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology, Vol.2, 1346-1350 (1986) para a

Propionibacterium freudenreichii e Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2, 1063-1065 (1986) para o Enterococcus faecium. A Catellatospora ferruginea KY2039 e a Propionibacterium freudenreichii KY4002 foram depositadas no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japão, em 11 de Junho, 1993, de acordo com o Tratado de Budapeste, com os números de acesso FERM BP-4329 e FERM BP-4330, respectivamente.

Como meio empregue para obter a fonte de enzima possuindo actividade de fosforilase de açúcares, pode ser empregue quer um meio natural quer sintético, desde que contenha quantidades adequadas de fontes de carbono, fontes de azoto, minerais e outros nutrientes.

Como fonte de carbono, podem-se empregar hidratos de carbono tais como glucose, sacarose, trealose, maltose, amido e melaços, álcoois tais como glicerol, sorbitol e manitol, e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido láctico, ácido pirúvico e ácido cítrico.

Como fonte de azoto, podem-se empregar sais de amónio orgânicos ou inorgânicos, tais como amónia, cloreto de amónio, carbonato de amónio, fosfato de amónio e acetato de amónio, compostos de azoto tais como ureia e aminoácidos, e materiais orgânicos contendo azoto tais como peptona, NZ-amina, extracto de carne, extracto solúvel da maceração do milho e hidrolizado de caseína.

Como minerais, podem-se empregar di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de potássio, cloreto de sódio, fosfato de magnésio e sulfato ferroso. A cultura pode ser conduzida em cultura em repouso ou cultura rotativa com arejamento. A temperatura é mantida na gama de 25 a 37°C e o pH do

86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 4 meio de cultura é mantido na gama de 6,0 a 8,0. A cultura fica completa normalmente em 1 a 7 dias.

Depois de completa a cultura, para a produção dos dissacáridos, podem-se utilizar uma cultura, células ou células processadas do microorganismo obtido, tal e qual, ou pode ser convertido na enzima em bruto ou purificada. São exemplos de células processadas do microorganismo, células secas, células criodessecadas, células tratadas com tensioactivo, células tratadas enzimaticamente, células tratadas com ultra-sons, células trituradas mecanicamente, células pressurizadas mecanicamente, fracções das células contendo proteínas e produtos imobilizados de células ou células processadas.

Como enzima pode-se utilizar quer enzima em bruto quer purificada, e a enzima é obtida submetendo as células processadas do microorganismo a um processo normalmente empregue para a purificação de enzimas, tais como precipitação com sais, sedimentação com solventes orgânicos, diálise, permuta iónica, cromatografia em coluna, filtração em gel e criodessecagem.

Como enzima possuindo a actividade de fosforilase de açúcares, pode-se empregar qualquer enzima, desde que catalise a reacção de condensação de β-glucose-l-fosfato com um monossacárido para obter um dissacárido tal como TP e MP. A fonte de enzima possuindo a actividade de fosforilase de açúcares é empregue num meio aquoso na forma de células molhadas na gama de 1 a 100 g/l, preferivelmente 10 a 50 g/l, ou, em actividade enzimática, na gama de 0,1 a 100 unidades/ml, preferivelmente 1 a 10 unidades/ml. A actividade enzimática da enzima possuindo a actividade de fosforilase de açúcares é representada em unidades, sendo uma unidade definida como a actividade capaz de produzir 1 pmol de glucose quando se utiliza na reacção TP ou MP, por exemplo, em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5) a 37°C durante 1 minuto na presença de trealose e maltose, respectivamente, como substratos.

86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 5 Ο meio aquoso inclui água, tampões tais como fosfato, carbonato, acetato, borato, citrato e tris, álcoois tais como metanol e etanol, ésteres tais como acetato de etilo, cetonas como acetona, amidas tais como acetamida e meio natural ou sintético contendo fontes de carbono, fontes de azoto e sais inorgânicos que possam ser assimilados pelos microorganismos. Se necessário, podem-se adicionar um tensioactivo como cloreto de cetilpiridínio e brometo de cetiitrimetilamónio na concentração de 0,05 a 1,0% (p/v) e pode-se adicionar um solvente orgânico tal como tolueno e xileno até à concentração de 1 a 20% (v/v).

Como monossacárido, podem-se empregar quer materiais em bruto quer purificados. Por exemplo, emprega-se D-glucose, D-fucose, D-xilose, D-manose, D-alose, D-tagatose, D-sorbose, D-glucosamina, 2-desoxi-D-glucose, N-acetil-D-glucosamina ou L-fucose, na gama de 1 a 100 g/l, preferivelmente na gama de 1 0 a 50 g/l.

Emprega-se β-glucose-l-fosfato na gama de 1 a 100 g/l, preferivelmente 10 a 50 g/l. Embora se possa empregar β-glucose-l-fosfato comercialmente disponível, pode-se empregar β-glucose -1-fosfato que é obtida por conversão de maltose em glucose e β-glucose-l-fosfato num meio aquoso na presença de uma fonte de enzima possuindo actividade de MP e uma fonte de enzima possuindo actividade de decomposição de glucose e depois por decomposição da glucose produzida no meio aquoso na presença de uma fonte de enzima possuindo a actividade de decomposição de glucose. A fonte de enzima possuindo actividade de MP pode estar contida no meio aquoso na forma de células molhadas na gama de 10 a 100 g/l, preferivelmente de 20 a 50 g/l, ou, em actividade enzimática, na gama de 1 a 100 unidades/ml, preferivelmente de 10 a 50 unidades/ml, por mol de maltose. A quantidade da fonte de enzima possuindo a actividade de decomposição de glucose contida no meio aquoso é tal que a glucose produzida por conversão de maltose com a fonte de enzima possuindo actividade de MP possa ser completamente decomposta.

86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 6 A fonte de enzima possuindo a actividade de decomposição de glucose inclui um microorganismo possuindo actividade de decomposição de glucose, uma cultura, células ou células processadas desse microorganismo e uma enzima possuindo actividade de decomposição de glucose.

Como microorganismo possuindo actividade de decomposição de glucose, pode-se empregar qualquer microorganismo desde que seja capaz de produzir uma enzima possuindo actividade de decomposição de glucose, e de entre estes emprega-se preferivelmente uma levedura. A enzima possuindo actividade de decomposição de glucose inclui glucose-oxidase, catalase, piranose-oxidase, glucose-desidrogenase, glucoquinase e hexoquinase. De entre estas, emprega-se preferivelmente a glucose-oxidase ou a catalase.

Na produção de β-glucose-l-fosfato, faz-se reagir maltose, num meio aquoso, na presença de uma fonte de enzima possuindo actividade de maltose-fosforilase e de uma fonte de enzima possuindo actividade de decomposição de glucose, usualmente de 20 a 60°C, preferivelmente de 30 a 50°C, e a um pH de 5,0 a 9,0, preferivelmente de 6,0 a 7,5, durante 1 a 72 horas.

Depois de completa a reacção, o β-glucose-l-fosfato formado no meio aquoso é submetido a condensação com um monossacárido na presença de uma fonte de enzima possuindo a actividade de fosforilase de açúcares. Pode-se utilizar para a reacção o β-glucose-l-fosfato depois de ser isolado removendo os precipitados tais como células, do meio aquoso, por meio de centrifugação e submetendo o sobrenadante obtido a um método usual tal como cromatografia em coluna de permuta iónica e concentração. Alternativamente, o β-glucose-l-fosfato pode reagir directamente, tal como dissolvido no meio aquoso.

Na produção do dissacárido, a reacção do β-glucose-l-fosfato com um monossacárido num meio aquoso, na presença de uma fonte de enzima possuindo actividade de fosforilase de açúcares, é usualmente conduzida de 20 a 60°C, preferivelmente de 30 a 50°C, e a um pH de 5,0 a 9,0, preferivelmente de 6,0 a 7,5, durante 1 a 72 horas.

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Depois de completa a reacção, o dissacárido pode ser obtido removendo os precipitados tais como células, do meio aquoso, por meio de centrifugação, e submetendo o sobrenadante a um método usual tal como cromatografia em coluna de permuta iónica e concentração.

Dependendo do monossacárido empregue na reacção, a presente invenção proporciona dissacáridos conhecidos tais como trealose e maltose e novos dissacáridos tais como glucosil(a, 1-1 )D-fucose, glucosil(a,1-4)D-manose, glucosil(a,1-4)D-alose, glucosil(a, 1-4)D-tagatose, glucosil(a, 1-4)L-fucose e glucosiKa, 1 -4)D-sorbose.

De entre os dissacáridos acima referidos, a trealose, a maltose, a glucosiKa, 1-1 )D-fucose e a glucosiKa, 1 -4)L-fucose, foram avaliadas quanto aos seus efeitos sobre a estabilidade de uma enzima tal como a fosfatase alcalina, sob as seguintes condições: (1) armazenadas na forma de solução, (2) armazenadas na forma congelada, (3) congeladas e descongeladas repetidamente e (4) armazenadas na forma de pó seco, nos Exemplos de Teste que se seguem.

Exemplo de Teste 1

Preparou-se uma solução amostra (não suplementada) diluindo fosfatase alcalina (derivada de intestino delgado de vitelo, Boehringer Mannheim Biochemica) com água destilada. Prepararam-se outras soluções amostra adicionando, à solução anterior, trealose, maltose, glucosiKa,1-1 )D-fucose ou glucosiKa, 1-4)L-fucose, até à concentração de 50 mM. Deixaram-se as soluções amostra em repouso à temperatura ambiente (25°C) durante 24 horas, e determinou-se a actividade de fosfatase alcalina em cada uma das soluções amostra. A actividade de fosfatase alcalina foi determinada como se segue.

Incubou-se cada uma das soluções amostra (10 μΙ) a 37°C em 2,0 ml da mistura reaccional que consistia em tampão de dietanolamina 1 M (pH 10,2), cloreto de magnésio 0,2 mM e ácido p-nitrofenilfosfórico 5 mM. Depois, determinou-se a actividade da enzima através da quantidade de p-nitrofenol produzido, que foi calculada com base na alteração da absorvância a 405 nm. A 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 8

actividade de cada uma das soluções amostra imediatamente após a preparação foi definida como 100%, e calculou-se a actividade residual na solução amostra armazenada.

Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

Acúcar (50 mM) Não suplementada Trealose Maltose GlucosiKa, 1-1 )D-fucose GlucosiKa,1 -4)L-fucose

Actividade residual (%) 0 9,4 3,321,8 93,7

Exemolo de Teste 2

Preparou-se uma solução amostra (não suplementada) diluindo fosfatase alcalina com água destilada. Prepararam-se outras soluções amostra adicionando, à solução anterior, trealose, maltose, glucosiKa, 1-1 )D-fucose ou glucosiKa, 1-4)L-fucose, até à concentração de 50 mM. Armazenaram-se as soluções amostra na forma congelada a -20°C durante 6 dias. Depois de descongelar até à temperatura ambiente, determinou-se a actividade de fosfatase alcalina em cada uma das soluções amostra de uma maneira semelhante à empregue no Exemplo de Teste 1. A actividade de cada uma das soluções amostra imediatamente após a preparação foi definida como 100%, e calculou-se a actividade residual na solução amostra armazenada.

Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Acúcar (50 mM) Não suplementada

Trealose

Maltose

GlucosiKa, 1 -1 )D-fucose GlucosiKa, 1 -4)L-fucose

Actividade residual (%) 2,0 26,0 20,0 36,3 76,0

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Exemplo de Teste 3

Preparou-se uma solução amostra (não suplementada) diluindo fosfatase alcalina com água destilada. Prepararam-se outras soluções amostra adicionando, à solução anterior, trealose, maltose, giucosil(cc, 1 -1 )D-fucose ou glucosil(ct,1-4)L-fucose, até à concentração de 50 mM. Congelou-se cada uma das soluções amostra através de gelo seco/etanol e descongelou-se até à temperatura ambiente, repetidamente, um total de 10 vezes. Determinou-se a actividade de fosfatase alcalina em cada uma das soluções amostra de uma maneira semelhante à empregue no Exemplo de Teste 1. A actividade de cada uma das soluções amostra imediatamente após a preparação foi definida como 100%, e calculou-se a actividade residual na solução amostra congelada e descongelada.

Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3

Acúcar (50 mM) Actividade residual (%) Não suplementada 10,3 Trealose 21,6 Maltose 16,3 Glucosil(a,1 -1 )D-fucose 65,0 Glucosilfa, 1 -4)L-fucose 106,0

Exemplo de Teste 4

Preparou-se uma solução amostra (não suplementada) diluindo fosfatase alcalina com água destilada. Prepararam-se outras soluções amostra adicionando, à solução anterior, trealose, maltose, glucosil(a,1-1 )D-fucose ou glucosil(a, 1-4)L-fucose, até à concentração de 50 mM. Evaporou-se cada uma das soluções amostra à temperatura ambiente até à secura utilizando uma bomba de vácuo para obter um pó seco, e armazenou-se o pó seco a 50°C durante 24 horas. Determinou-se a actividade de fosfatase alcalina em cada uma das soluções amostra de uma maneira semelhante à empregue no Exemplo de Teste 1. A actividade de cada uma das soluções amostra imediatamente após a preparação foi definida como 100%, e calculou-se a actividade residual na solução amostra armazenada. 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 10

Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Acúcar (50 mM) Não suplementada Trealose Maltose Glucosil(a,1 -1 )D-fucose Glucosil(a,1 -4)L-fucose

Actividade residual (%) 12,6 55.0 41.0 62,5 83.0

Como é evidente dos resultados acima apresentados, a trealose, a maltose, a glucosil(a, 1-1 )D-fucose e a glucosilfa, 1-4)L-fucose, em especial a glucosil(a,1-1 )D-fucose e a glucosil(a, 1-4)L-fucose, são eficazes como estabilizantes para a fosfatase alcalina.

Melhor modo de aplicar a invenção

Exempio 1

Fez-se reagir, a 30°C durante 4 horas, uma mistura reaccional consistindo em tampão de imidazolo-HCI 50 mM (pH 7,0), β-glucose-l -fosfato 50 mM, monossacárido (D-glucose, D-fucose ou D-xilose) 50 mM e 2 unidades/ml de enzima TP purificada derivada de Cateliatospora ferruginea ou uma mistura reaccional consistindo em tampão de imidazolo-HCI 50 mM (pH 7,0), β-glucose-l-fosfato 50 mM, monossacárido (D-glucose, 2-desoxi-D-glucose, D-glucosamina, N-acetil-D-glucosamina, D-manose, D-alose, D-tagatose, D-sorbose, L-fucose ou D-xilose) 50 mM e 2 unidades/ml de enzima MP purificada derivada de Propionibacterium freudenreichii.

Depois de completa a reacção, centrifugou-se a mistura reaccional para obter o sobrenadante, que se submeteu a HPLC para isolar o dissacárido. Identificou-se então o dissacárido isolado e quantificou-se directamente utilizando os padrões correspondentes no caso de uma substância conhecida. No caso de uma nova substância, submeteu-se o dissacárido isolado a hidrólise ácida por ebulição em ácido sulfúrico 1N a 100°C durante 1 hora ou a decomposição enzimática utilizando α-glucosidase para obter o monossacárido 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 1 1 como constituinte do dissacárido, que foi identificado e quantificado utilizando HPLC. A HPLC foi conduzida sob as condições que se apresentam em seguida. Coluna: Shim-pack CLC-NH2 (6 mm x 1 5 cm) (Shimadzu Corporation)

Fase móvel: Acetonitrilo (80%) - água (20%)

Caudal: 1 ml/min

Detector: Refractómetro diferencial (Shimadzu Corporation)

Os monossacáridos adicionados às misturas reaccionais, os produtos da reacção e os rendimentos são apresentados na Tabela 5.

Monossacárido Enzima Tabela 5 Dissacárido (produto da reaccão) Rendimento (%) D-Glucose TP Glucosil(a,1-1)D-glucose (Trealose) 70,0 D-Fucose TP Glucosilfa, 1 -1 )D-fucose 18,9 D-Xilose TP GlucosiKa, 1-1) D-xilose 35,1 D-Glucose MP Glucosil(a,1 -4)D-glucose (Maltose) 80,0 2-Desoxi-D-glucose MP Glucosilfa, 1 -4) 2-desoxi-D-glucose 62,6 D-Glucosamina MP GlucosiKa, 1 -4) D-glucosamina 39,8 N-Acetil-D-glucosamina MP GlucosiKa, 1 -4)N-acetil-D-glucosamina 54,2 D-Manose MP GlucosiKa, 1 -4)D-manose 50,5 D-Alose MP GlucosiKa, 1 -4)D-alose 13,0 D-Tagatose MP GlucosiKa, 1 -4)D-tagatose 10,9 D-Sorbose MP GlucosiKa, 1 -4)D-sorbose 37,3 L-Fucose MP GlucosiKa, 1 -4)L-fucose 36,0 D-Xilose MP GlucosiKa, 1 -4)D-xilose 85,6

Exemplo 2

Fez-se reagir, a 30°C durante 18 horas, uma mistura reaccional consistindo em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5), maltose 50 mM, 100 mg de células molhadas/ml de Catellatospora ferruginea KY2039, 10 mg de células molhadas/ml de Propionibacterium freudenreichii KY4002 e cloreto de cetilpiridínio a 0,1 %.

Depois de completa a reacção, centrifugou-se a mistura reaccional para obter o sobrenadante, que foi analisado utilizando HPLC, e foi indicado que foi produzida trealose com o rendimento de 52%.

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Exemplo 3

Fez-se reagir, a 30°C durante 18 horas, uma mistura reaccional consistindo em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5), maltose 50 mM, 1 unidade/ml de enzima MP purificada derivada de Propionibacterium freudenreichii KY4002 e 2 unidades/ml de enzima TP purificada derivada de CateIJatospora ferruginea KY2039.

Depois de completa a reacção, centrifugou-se a mistura reaccional para obter o sobrenadante, que foi então analisado utilizando HPLC, e foi indicado que foi produzida trealose com o rendimento de 78%.

Exemplo 4

Fez-se reagir, a 30°C durante 18 horas, uma mistura reaccional consistindo em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5), maltose 50 mM, 1 unidade/ml de enzima MP purificada derivada de Enterococcus faecium ATCC 10541 e 2 unidades/ml de enzima TP purificada derivada de Kineosporia aurantiaca ATCC 29727.

Depois de completa a reacção, centrifugou-se a mistura reaccional para obter o sobrenadante, que foi então analisado utilizando HPLC, e foi indicado que foi produzida trealose com o rendimento de 75%.

Exemplo 5

Fez-se reagir, a 30°C durante 6 horas, uma mistura reaccional consistindo em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5), maltose 50 mM, 1 unidade/ml de enzima MP purificada derivada de Propionibacterium freudenreichii KY4002, 2 unidades/ml de glucose-oxidase (Toyobo Co., Ltd.) e 3000 unidades/ml de catalase (Sigma Chemical Company), produzindo deste modo β-glucose-l- fosfato e glucose a partir da maltose enquanto decompondo a glucose produzida com glucose-oxidase e catalase. Adicionaram-se à mistura reaccional enzima TP purificada derivada de Catellatospora ferruginea KY2039 e D-fucose em concentrações de 2 unidades/ml e 200 mM, respectivamente, e deixou-se reagir mais 18 horas.

Depois de completa a reacção, centrifugou-se a mistura reaccional para obter o sobrenadante, que foi então analisado utilizando HPLC, e foi indicado que foi produzida glucosil(a, 1-1 )D-fucose na concentração de 29 mM.

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Exemplo 6

Fez-se reagir, a 30°C durante 6 horas, uma mistura reaccional consistindo em tampão fosfato 50 mM (pH 6,5), maltose 50 mM, 2 unidades/ml de enzima MP purificada derivada de Propionibacterium freudenreichii KY4002, 2 unidades/ml de glucose-oxidase e 3000 unidades/ml de catalase, produzindo deste modo β-glucose-l-fosfato e glucose a partir da maltose enquanto decompondo a glucose produzida com glucose-oxidase e catalase. Adicionou-se à mistura reaccional L-fucose na concentração 200 mM, e deixou-se reagir mais 1 8 horas.

Depois de completa a reacção, centrifugou-se a mistura reaccional para obter o sobrenadante, que foi então analisado utilizando HPLC, e foi indicado que foi produzida glucosil(a, 1-1 )L-fucose na concentração de 38 mM.

Exemplo 7

Dispersaram-se completamente carbono activado (500 g, Nacalai Tesque, Inc.) e um auxiliar de filtração, HI-FLO Supercell (500 g, Nacalai Tesque, Inc.) em água destilada, e removeram-se as micropartículas por decantação. Depois, introduziu-se a dispersão numa coluna de 50 cm de comprimento e com um diâmetro interno de 5 cm, que depois se lavou com cerca de 3 I de butanol a 3%, e adicionalmente se lavou com 3 I de água. Depois, carregou-se a coluna com 200 ml da solução de glucosil(a, 1-1 )D-fucose obtida no Exemplo 5, que depois se lavou com cerca de 2 I de água destilada e cerca de 2 I de solução de propanol a 0,2%, e subsequentemente se eluiu com propanol a 5% para obter a substância alvo. Após críodessecação do eluente, obtiveram-se cerca de 1 g de glucosil(a,1 -1 )D-fucose na forma de um pó branco.

As propriedades físicas da glucosil(a, 1 -1 )D-fucose são apresentadas em seguida.

Aparência: Pó incolor

Rotação específica: [a]D20=+ 189° (c = 0,309, H20),

Sem tempo de alteração (Sem mutarrotação)

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Espectro de FABMS (Modo negativo, Matriz: glicerol): m/z amu 325 (M-H)

Espectro de FABMS de alta resolução (Modo negativo, Matriz: glicerol): m/z amu

Encontrado: 325,1 121 (M-H)'

Calculado como C12H21O10: 325,1 135

Espectro de IV (KBr): v^cm'1: 3410, 2935, 1653, 1419, 1385, 1080, 1005, 966.

Espectro de 13C RMN (1 25 MHz, D20): δ ppm de TMS 94,40, 94,24, 73,41, 72,95, 72,67, 71,94, 70,54, 69,99, 68,54, 67,94, 61,37, 16,09.

Espectro de ’H RMN (500 MHz, D20): δ ppm de TMS 5,19 (2H, d, J = 3,9 Hz), 4,23 (1H, q, J = 6,5Hz), 4,05 (1H, dd, J = 10,4, 3,4 Hz), 3,91 (1H, dd, J = 10,4, 3,9 Hz), 3,89 (1H, m), 3,88 (2H, m), 3,86 (1H, m), 3,80 (1H, dd, J = 11,6, 4,9 Hz), 3,68 (1H, dd, J = 9,9, 3,9 Hz), 3,48 (1H, t, J = 9,4 Hz), 1,26 (3H, d, J = 6,5 Hz).

Exemplo 8 O processo de purificação foi conduzido de uma maneira semelhante à empregue no Exemplo 7, excepto utilizando glucosil(ct,1 -4)L-fucose obtida no Exemplo 6, em vez da solução de glucosil(a,1-1 )D-fucose obtida no Exemplo 5, para obter cerca de 2 g de glucosil(a, 1-4)L-fucose na forma de um pó branco.

As propriedades físicas da glucosil(a, 1-4)L-fucose são apresentadas em seguida.

Aparência: Pó incolor

Ponto de fusão: 117,0 a 120,5°C

Rotação específica: [a]D20= +39,2° (c = 0,335, H20),

Valor finai (após 24 horas) 15 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ

Espectro de FABMS (Modo negativo, Matriz: glicerol): m/z amu 325 (M-H)'

Espectro de FABMS de alta resolução (Modo negativo, Matriz: glicerol): m/z amu

Encontrado: 325,1 1 1 2 (M-H)'

Calculado como C12H21O10: 325,1 135

Espectro de IV (KBr): vmaxcm'1: 3396, 2931, 1635, 1456, 1417, 1362, 1134, 1080, 1022.

Espectro de 13C RMN (100 MHz, D20): δ ppm de TMS 102,04, 102,00, 97,31, 93,45, 83,17, 82,46, 74,97, 74,15, 73,77, 73,74, 73,34, 73,30, 71,61, 71,37, 70,57, 70,54, 69,85, 67,40, 61,67, 17,45, 17,40.

Espectro de ’H RMN (400 MHz, D20): õ ppm de TMS 5,27 (d, J = 3,9 Hz), 5,26 (d, J = 4,9 Hz), 4,63 (d, J = 7,8 Hz), 4,30 (q, J = 6,6 Hz), 3,99 (m), 3,98 (m), 3,93 (m), 3,93 (m), 3,92 (m), 3,89 (m), 3,88 (q, J = 6,6 Hz), 3,82 (m), 3,81 (dd, J = 1 1,8, 4,5 Hz), 3,75 (dd, J = 10,0, 3,2 Hz), 3,65 (dd, J = 9,9, 3,9 Hz), 3,59 (dd, J = 10,0, 7,8 Hz), 3,46 (t, J = 9,4 Hz), 1,33 (d, J = 6,6 Hz), 1,30 (d, J = 6,6 Hz).

Exemplo de Referência 1 Preparação de enzima em bruto (1) Inoculou-se Catellatospora ferruginea KY2039A em 300 ml do meio (pH 7,0) possuindo a composição de 3 g/dl de sacarose, 0,5 g/dl de NZ-amina, 0,2 g/dl de peptona, 0,1 g/dl de extracto de levedura e 0,1 g/dl de extracto de carne num balão de Erlenmeyer de 2 I e cultivou-se com agitação a 30°C durante 48 horas. Inoculou-se a cultura obtida (600 ml) em 15 1 de meio possuindo a mesma composição que o meio anterior num vaso fermentador de 30 I e incubou-se com agitação e arejamento a 30°C durante 3 dias.

Depois de completa a incubação, centrifugaram-se 15 1 da cultura (12 000xg, 20 minutos) para obter as células, que se suspenderam em 1000mi de tampão fosfato 200 mM (pH 7,0). Trituraram-se as células 16 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ utilizando Dynomill (W.A. Bachofen AB), e obteve-se o sobrenadante na forma de enzima TP em bruto por centrifugação (1 2 000 x g, 20 minutos). A actividade da enzima TP em bruto derivada de Catellatospora ferruginea KY2039 era de 5,0 unidades/g de células molhadas. 0 valor era cerca de 30 vezes superior ao da enzima em bruto derivada de Euglena graci/is (0,17 unidades/g de células molhadas, Pedido de Patente Japonesa Publicado Examinado N° 60998/88). (2) Obteve-se enzima TP em bruto utilizando os métodos de incubação e extracção semelhantes aos empregues na secção (1), excepto utilizando Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 em vez de Catellatospora ferruginea KY2039. A actividade da enzima TP em bruto derivada de Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 era de 5,4 unidades/g de células molhadas. (3) inoculou-se Propionibacterium freudenreichii KY4002 em 600 ml do meio (pH 7,5) possuindo a composição de 2 g/dl de sacarose, 1 g/dl de triptona, 1 g/dl de extracto de levedura, 0,5 g/dl de fosfato dipotássico, 0,04 g/dl de sulfato de magnésio (hepta-hidrato), 0,001 g/dl de sulfato de manganês (tetra-hidrato) e 0,005 g/dl de Vitamina C, num balão cónico, e deixou-se em repouso a 30°C durante 2 dias.

Depois de completa a incubação, reuniram-se as culturas obtidas até 1,2 1 e centrifugou-se (12 000 xg, 20 minutos) para obter as células. Suspenderam-se as células obtidas em 300 ml de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0). Trituraram-se as células utilizando Dynomill, e centrifugou-se (12 000 x g, 20 minutos) para obter o sobrenadante na forma de enzima MP em bruto. A actividade da enzima MP em bruto derivada de

Propionibacterium freudenreichii KY4002 era de 55,0 unidades/g de células molhadas. O valor era cerca de 1,8 vezes superior à da enzima em bruto derivada de Lactobaciilus brevis (29,9 unidades/g de células molhadas, Pedido de Patente Japonesa Publicado Examinado N° 60998/88).

86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ (4) Obteve-se enzima ΜΡ em bruto utilizando os métodos de incubação e extracção semelhantes aos empregues na secção (3) excepto utilizando Enterococcus faecíum ATCC 10541 em vez de Propionibacter/um freudenreichii KY4002. A actividade da enzima MP em bruto derivada de Enterococcus faecium ATCC 10541 era de 50;0 unidades/g de células molhadas.

Exemplo de referência 2: Preparação de enzima purificada (1) À enzima TP em bruto derivada de Catellatospora ferruginea KY2039 obtida na secção (1) do Exemplo de Referência 1, adicionou-se sulfato de amónio até à concentração de 50% da saturação, para recolher o precipitado. Dissolveu-se o precipitado obtido numa pequena quantidade (cerca de 200 ml) de tampão fosfato 200 mM (pH 7,0). Dialisou-se a solução obtida contra 5 I do mesmo tampão durante 24 horas, aqueceu-se a 65°C durante 15 minutos e centrifugou-se (12 000 xg, 20 minutos) para obter o sobrenadante. Carregou-se o sobrenadante obtido na coluna (1 I, diâmetro: 5 cm) cheia com gel filtrante Toyopearl HW65F (Tosoh Corporation) que tinha sido previamente equilibrada com o mesmo tampão. Combinaram-se as fracções activas eluídas, e adicionou-se-lhes sulfato de amónio até à concentração de 50% da saturação. Recolheram-se os precipitados por centrifugação (12 000 xg, 20 minutos) e dissolveram-se em 20 ml de tampão fosfato 200 mM (pH 7,0). Dialisou-se a solução obtida contra 2 I do mesmo tampão durante 24 horas para obter enzima TP purificada (actividade específica: 100 mU/mg). A actividade específica da enzima TP purificada era 102 vezes superior à da enzima em bruto, e o rendimento da actividade enzimática foi de 62%. (2) Obteve-se enzima TP purificada (actividade específica: 90 mU/mg) através de um processo de purificação semelhante ao empregue na secção (1) do exemplo de Referência 2 excepto utilizando enzima TP em bruto derivada de Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 na secção (2) do Exemplo de Referência 1 em vez da enzima TP em bruto derivada de Catellatospora ferruginea KY2039. A actividade específica da enzima TP purificada era 90 vezes superior à da enzima em bruto, e o rendimento da actividade enzimática foi de 50%. 86 553

ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 18 (3) À enzima ΜΡ em bruto derivada de Propionibacteríum freudenreichii KY4002 na secção (3) do Exemplo de Referência 1, adicionou-se sulfato de amónio até à concentração de 80% da saturação para recolher os precipitados. Dissolveram-se os precipitados obtidos numa pequena quantidade (cerca de 20 ml) de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0). Dialisou-se a solução obtida contra 21 do mesmo tampão durante 24 horas, aqueceu-se a 50°C durante 15 minutos, e centrifugou-se (12 000 xg, 20 minutos). Carregou-se o sobrenadante obtido na coluna (1 I, diâmetro: 5 cm) cheia com resina de permuta aniónica DEAE-Sephadex (Pharmacia LKB Biotechnology) que tinha sido previamente equilibrada com o mesmo tampão, para efectuar a adsorção. Removeram-se as proteínas contaminantes por lavagem com o mesmo tampão, e conduziu-se a eluição em gradiente com 0 a 1,0 M de cloreto de sódio (tampão fosfato 10 mM, pH 7,0). Combinaram-se as fracções activas que eluíram a uma concentração de cloreto de sódio de cerca de 0,5 a 0,8 M, e adicionou-se suifato de amónio até à concentração de 80% da saturação para obter os precipitados. Recolheram-se os precipitados obtidos por centrifugação (12 000 x g, 20 minutos) e dissolveram-se em 10 ml de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0). Dialisou-se a solução obtida contra 2 I do mesmo tampão durante 24 horas para obter enzima MP purificada (actividade específica: 50 mU/mg). A actividade específica da enzima MP purificada era 48 vezes superior à da enzima em bruto, e o rendimento da actividade enzimática foi de 79%. (4) Obteve-se enzima MP purificada (actividade específica: 45 mU/mg) através do processo de purificação semelhante ao empregue na secção (3) do exemplo de Referência 2 excepto utilizando enzima MP em bruto derivada de Enterococcus faecium ATCC 10541 na secção (4) do exemplo de Referência 1 em vez da enzima MP em bruto derivada de Propionibacteríum freudenreichii KY4002. A actividade específica da enzima MP purificada era 45 vezes superior à da enzima em bruto, e o rendimento da actividade enzimática foi de 75%. 19 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ

Aplicabilidade Industrial

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se um processo para a produção de dissacáridos, eficientemente, a baixo custo, e os novos dissacáridos através dele obtidos.

Lisboa, L·-. dl ZOuí

Por KYOWA HAKKO KOGYO Co., Ltd. - O AGENTE OFICIAL -

Θ ABORTO

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Qf. Pr, Ind. Rua das Flores, 74--4·.0 1200-195 LISBOA

Claims (13)

1. 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de um dissacárido, que compreende; a condensação de beta-glucose-1-fosfato num meio aquoso com a) um monossacárido seieccionado de entre o grupo que consiste em D-fucose e D-xilose na presença de treaiose-fosforilase que actua sobre o monossacárido seieccionado, ou b) um monossacárido seieccionado de entre o grupo que consiste em D-manose, D-alose, D-tagatose, D-sorbose e L-fucose, na presença de maltose-fosforilase que actua sobre o monossacárido seieccionado; e a recuperação do dissacárido formado no meio aquoso, em que a referida treaiose-fosforilase é derivada de um microorganismo pertencente ao género Catellatospora e a referida maltose-fosforilase é derivada de um microorganismo pertencente ao género Propionibacterium.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido beta-giucose-1-fosfato é obtenível num meio aquoso através da reacção de maltose na presença de maltose-fosforilase e uma enzima possuindo actividade de decomposição de glucose.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido beta-glucose-1-fosfato é obtenível num meio aquoso através da reacção de maltose na presença de maltose-fosforilase que actua sobre o monossacárido seieccionado e uma enzima possuindo actividade de decomposição de glucose, em que a referida maltose-fosforilase é derivada de um microorganismo pertencente ao género Propionibacterium.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que a referida enzima possuindo actividade de decomposição de glucose é glucose-oxidase, catalase, piranose-oxidase, giucose-desidrogenase, glucoquinase ou hexoquinase.
5. 5. Glucosil(alfa,1 -1 )D-fucose. 86 553 ΕΡ Ο 717 047/ΡΤ 2/2
6. 6. Glucosil(alfa, 1 -4)L-fucose.
7. 7. Glucosil(alfa, 1 -1) D-xilose.
8. 8. GlucosiKalfa, 1 -4)D-manose.
9. 9. GlucosiKalfa, 1-4)D-alose.
10. 10. GlucosiKalfa, 1 -4)D-tagatose.
11. 11. GlucosiKalfa, 1-4)D-sorbose.
12. 12. Enzima trealose-fosforilase purificada que actua sobre um monossacárido seleccionado de entre o grupo que consiste em D-fucose e D-xilose, e é obtenível a partir de um microorganismo pertencente ao género Ca tella tospora ferruginea.
13. 13. Enzima maltose-fosforilase purificada que actua sobre um monossacárido seleccionado de entre o grupo que consiste em D-manose, D-alose, D-tagatose, D-sorbose e L-fucose, e é obtenível a partir de um microorganismo pertencente ao género Propionibacterium freudenreichii. Lisboa, £2 2001 Por KYOWA HAKKO KOGYO Co., Ltd.

    Eng.ft ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. In d· Rua das Flores, 74.4.° 1200-195 LISBOA