JPH0759584A

JPH0759584A - 二糖類の製造法および新規二糖類

Info

Publication number: JPH0759584A
Application number: JP12848394A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Aisaka; 和夫相阪; Yutaka Saito; 裕斎藤; Yoichi Uosaki; 洋一宇於崎
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1993-06-14
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 1995-03-07

Abstract

(57)【要約】【目的】医薬品、食品、化粧品または酵素の安定化剤
などに有用な二糖類を工業的に製造する方法および該方
法で得られる新規の二糖類を提供する。【構成】カテラトスポラ属、キネオスポリア属、プロ
ピオニバクテリウム属またはエンテロコッカス属に属す
る微生物に由来しかつ糖質加リン酸分解活性を有する酵
素源の存在下、水性媒体中でβ−グルコース−１−リン
酸と単糖類とを縮合反応させ、水性媒体中に生成した二
糖類を採取することを特徴とする二糖類の製造法および
該方法で得られる新規の二糖類。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、二糖類の製造方法に関
する。二糖類は、医薬品、食品または化粧品などの合成
原料あるいは臨床検査試薬などにおける酵素の安定化剤
として有用な物質である。

【０００２】

【従来の技術】α,1-1グリコシド結合を有する二糖類の
製造法として、ノカルディア(Nocardia)属に属する微生
物を用いてトレハロース〔グルコシル (α,1-1)D- グル
コース〕を製造する方法（特開昭50-154485 号公報）、
マルトース〔グルコシル (α,1-4)D- グルコース〕をマ
ルトースホスホリラーゼ（以下、ＭＰと略記する。）お
よびトレハロースホスホリラーゼ（以下、ＴＰと略記す
る。）で処理してトレハロースを製造する方法（特公昭
63-60998号公報）などが知られている。またα,1-4グリ
コシド結合を有する二糖類の製造法として、ナイセリア
・パーフラバ(Neisseria perflava)の抽出物を用いてマ
ルトース誘導体などを製造する方法〔ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)236,
2183-2185(1961)〕などが知られている。

【０００３】しかし、ノルカディア属に属する微生物を
用いる方法では、培養液中に生産されるトレハロースの
量が微量であり、マルトースをＭＰおよびＴＰで処理す
る方法では、トレハロース以外の他の二糖類が製造でき
ない。また、ナイセリア・パーフラバの抽出物を用いる
方法において、基質であるβ−グルコース−１−リン酸
はマルトースを加リン酸分解することにより得ている
が、この場合に副産物として生じるグルコースを分離す
る操作が必要となる。

【０００４】トレハロースまたはマルトースなどの二糖
類は、酵素タンパク質などの生体高分子の安定性を増大
させることが知られている [バイオ／テクノロジー(C.
Colaco et al., Bio/Technology) ,10, 1007-1011,(19
92)]。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、工業
的に二糖類を製造する方法および該方法で得られる新規
の二糖類を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、カテラ
トスポラ属、キネオスポリア属、プロピオニバクテリウ
ム属またはエンテロコッカス属に属する微生物に由来し
かつ糖質加リン酸分解活性を有する酵素源の存在下、水
性媒体中でβ−グルコース−１−リン酸と単糖類とを縮
合反応させ、水性媒体中に生成した二糖類を採取するこ
とを特徴とする二糖類の製造法および該方法で得られる
新規の二糖類を提供することができる。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
用いる酵素源としては糖質加リン酸分解活性を有する微
生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物または糖質加リ
ン酸分解活性を有する酵素があげられる。糖質加リン酸
分解活性を有する微生物としては、カテラトスポラ属、
キネオスポリア属、プロピオニバクテリウム属またはエ
ンテロコッカス属に属しかつ糖質加リン酸分解活性を有
する酵素を生産する能力を有する微生物であればいずれ
の微生物でも用いることができるが、たとえばＴＰ生産
菌としてカテラトスポラ・フェルギネア (Catellatospo
ra ferruginea) KY2039 およびキネオスポリア・オウラ
ンチアカ (Kineosporia aurantiaca) ATCC 29727を、Ｍ
Ｐ生産菌としてプロピオニバクテリウム・フロイデンラ
イヒ (Propionibacterium freudenreichii)KY4002およ
びエンテロコッカス・フェシウム (Enterococcus faeci
um) ATCC 10541をそれぞれ例示することができる。

【０００８】これらの菌株の属する種の菌学的性質は、
カテラトスポラ・フェルギネアについてはインターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー（K. Asano and I. Kawamoto, Int. J. Sys
t. Bacteriol. ）,36, 512-517 (1986) に、キネオスポ
リア・オウランチアカについてはバージーズ・マニュア
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Berg
ey's Manual of Systematic Bacteriology）, Vol.4, 2
504-2506(1989)に、プロピオニバクテリウム・フロイデ
ンライヒについてはバージーズ・マニュアル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual
of Systematic Bacteriology）, Vol.2,1346-1350(198
6) に、エンテロコッカス・フェシウムについてはバー
ジーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacterio
logy）, Vol.2,1063-1065(1986) にそれぞれ記載されて
いる。

【０００９】なお、カテラトスポラ・フェルギネアKY20
39およびプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒKY
4002は、ブダペスト条約に基づいて平成５年６月１１日
付で工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥ
ＲＭＢＰ−４３２９およびＦＥＲＭＢＰ−４３３０
として寄託されている。糖質加リン酸分解活性を有する
酵素源を得るために用いる培地としては、炭素源、窒素
源、無機物またはその他の栄養素を適当に含有するもの
であれば、天然培地または合成培地のいずれも用いるこ
とができる。

【００１０】炭素源としては、グルコース、シュクロー
ス、トレハロース、マルトース、澱粉もしくは糖蜜など
の各種炭水化物、グリセロール、ソルビトールもしくは
マニトールなどの各種アルコールまたは酢酸、乳酸、ピ
ルビン酸もしくはクエン酸などの各種有機酸などが用い
られる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、燐酸アンモニウムもしくは酢酸
アンモニウムなどの各種無機もしくは有機アンモニウム
塩、尿素、アミノ酸、その他の窒素化合物またはペプト
ン、NZ−アミン、肉エキス、コーンスチープリカーもし
くはカゼイン加水分解物などの窒素含有有機物質などが
用いられる。

【００１１】無機物としては、燐酸第一カリウム、燐酸
第二カリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マ
グネシウムまたは硫酸第一鉄などが用いられる。培養
は、静置培養または通気撹拌培養などで行われる。温度
は25〜37℃、培地のｐＨは 6.0〜 8.0に保持され、培養
は通常１〜７日間で終了する。培養終了後、得られた微
生物の培養物、菌体または菌体処理物をそのまま二糖類
の生成反応に用いてもよいが、粗酵素または精製酵素と
して用いることも可能である。

【００１２】菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結
乾燥物、界面活性化処理物、酵素処理物、超音波破砕
物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタン
パク質画分、菌体または菌体処理物の固定化物などがあ
げられる。酵素としては粗酵素または精製酵素のいずれ
も用いられ、菌体処理物を通常酵素精製に用いられる方
法、たとえば塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、ゲル濾過または凍結乾燥など
の方法を用いることにより得られる。

【００１３】糖質加リン酸分解活性を有する酵素として
は、β−グルコース−１−リン酸と単糖類とを縮合して
二糖類を生成する反応を触媒する酵素であればいずれで
もよく、たとえばＴＰおよびＭＰなどがあげられる。糖
質加リン酸分解活性を有する酵素源は、水性媒体中に湿
菌体量として 1〜100g/l、好適には10〜50g/l あるいは
酵素活性として 0.1〜 100単位/ml 、好適には 1〜10単
位/ml で用いられる。

【００１４】糖質加リン酸分解活性を有する酵素の酵素
活性は、たとえばＴＰおよびＭＰの場合、それぞれトレ
ハロースおよびマルトースを基質として50mMリン酸緩衝
液(pH6.5) 中で、37℃で1 分間反応を行った場合に1 μ
mol のグルコースを生成する酵素活性を1 単位として表
示する。水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢
酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩もしくはトリスなどの緩衝
液、メタノールもしくはエタノールなどのアルコール
類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケト
ン類、アセトアミドなどのアミド類または微生物が資化
しうる炭素源、窒素源もしくは無機塩類などを含有する
天然培地もしくは合成培地などがあげられる。また、必
要に応じてセチルピリジウムクロライドもしくはセチル
トリメチルアンモニウムブロマイドなどの界面活性剤を
0.05〜1.0%(w/v) またはトルエンもしくはキシレンなど
の有機溶剤を1〜20%(v/v)となるように添加してもよ
い。

【００１５】単糖類としては、精製品でも粗精製品でも
よく、たとえばD-グルコース、D-フコース、D-キシロー
ス、D-マンノース、D-アロース、D-タガトース、D-ソル
ボース、D-グルコサミン、2-デオキシ-D- グルコース、
N-アセチル-D- グルコサミンまたはL-フコースなどが 1
〜100g/l、好適には10〜50g/l で用いられる。β−グル
コース−１−リン酸は、 1〜100g/l、好適には10〜50g/
l で用いられる。β−グルコース−１−リン酸として
は、公知の市販品を用いてもよいが、ＭＰ活性を有する
酵素源およびグルコース分解活性を有する酵素源の存在
下、マルトースを水性媒体中でグルコースおよびβ−グ
ルコース−１−リン酸に変換させ、かつグルコース分解
活性を有する酵素源の存在下、水性媒体中に生成するグ
ルコースを分解させて得られるものを用いてもよい。

【００１６】ＭＰ活性を有する酵素源は、マルトース１
モルに対して湿菌体量として10〜 100g/l 、好適には20
〜50g/l あるいは酵素量として 1〜 100単位/ml 、好適
には10〜50単位/ml で水性媒体中に存在させればよい。
グルコース分解活性を有する酵素源は、ＭＰ活性を有す
る酵素源によってマルトースが変換されて生じたグルコ
ースを完全に分解できる量だけ水性媒体中に存在させれ
ばよい。

【００１７】グルコース分解活性を有する酵素源として
は、グルコース分解活性を有する微生物、微生物の培養
物、菌体もしくは菌体処理物またはグルコース分解活性
を有する酵素があげられる。グルコース分解活性を有す
る微生物としては、グルコース分解活性を有する酵素を
生産する能力を有する微生物であればいずれの微生物で
も用いることができるが、好適には酵母が用いられる。

【００１８】グルコース分解活性を有する酵素として
は、たとえばグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、ピ
ラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、
グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼなどいずれも用い
ることができるが、好適にはグルコースオキシダーゼま
たはカタラーゼが用いられる。β−グルコース−１−リ
ン酸の製造において、水性媒体中におけるマルトースホ
スホリラーゼ活性を有する酵素源およびグルコース分解
活性を有する酵素源の存在下でのマルトースの反応は通
常温度20〜60℃、好適には30〜50℃およびpH5.0 〜9.0
、好適にはpH6.0 〜7.5 で 1〜72時間行う。

【００１９】反応終了後、水性媒体中に生成したβ−グ
ルコース−１−リン酸は糖質加リン酸分解活性を有する
酵素源の存在下、単糖類との縮合反応に用いられる。β
−グルコース−１−リン酸は、水性媒体中から菌体など
の沈澱物を遠心分離などの手段により除去し、得られる
上清を通常の方法、たとえばイオン交換カラムクロマト
グラフィーまたは濃縮などの方法によって採取したもの
を反応に用いてもよいし、水性媒体中に溶解した状態で
そのまま反応に用いてもよい。

【００２０】二糖類の製造において、水性媒体中におけ
る糖質加リン酸分解活性を有する酵素源の存在下でのβ
−グルコース−１−リン酸と単糖類との反応は通常温度
20〜60℃、好適には30〜50℃およびpH5.0 〜9.0 、好適
にはpH6.0 〜7.5 で 1〜72時間行う。反応終了後、水性
媒体中から菌体などの沈澱物を遠心分離などの手段によ
り除去し、得られる上清を通常の方法、たとえばイオン
交換カラムクロマトグラフィーまたは濃縮などの方法を
用いることによって二糖類を採取することができる。

【００２１】本発明によれば、反応に用いる単糖類の種
類を代えることにより、トレハロースもしくはマルトー
スなどの公知の二糖類またはグリコシル (α,1-1) D-フ
コース(Glucosyl(α,1-1)D-fucose)、グリコシル (α,1
-4) D-マンノース(Glucosyl(α,1-4)D-mannose) 、グリ
コシル (α,1-4) D-アロース(Glucosyl(α,1-4)D-allos
e)、グリコシル (α,1-4) D-タガトース(Glucosyl(α,1
-4)D-tagatose)、グリコシル (α,1-4) L-フコース(Glu
cosyl(α,1-4)L-fucose)もしくはグリコシル (α,1-4)
D-ソルボース(Glucosyl(α,1-4)D-sorbose) などの新規
の二糖類が得られる。

【００２２】上記の二糖類のうち、トレハロース、マル
トース、グリコシル (α,1-1) D-フコースまたはグリコ
シル (α,1-4) L-フコースが、酵素、たとえばアルカリ
性ホスファターゼの (1)溶液状態での保存時の安定性、
(2) 凍結状態での保存時の安定性、(3) 繰り返し凍結融
解時の安定性、(4) 乾燥粉末状態での保存時の安定性に
及ぼす効果について検討した試験例を以下に示す。試験例１アルカリ性ホスファターゼ（小牛小腸由来、ベーリンガ
ー社製）を蒸留水で希釈して得られた溶液からなる（無
添加）試験液、あるいは該溶液にトレハロース、マルト
ース、グリコシル (α,1-1) D-フコースまたはグリコシ
ル (α,1-4) L-フコースをそれぞれ50mMとなるように添
加した試験液を調製し、室温(25 ℃) で24時間放置した
後に、試験液のアルカリ性ホスファターゼの活性を測定
した。

【００２３】アルカリ性ホスファターゼの活性は、酵素
溶液10μl 、1Mジエタノールアミン緩衝液(pH10.2)、0.
2mM 塩化マグネシウムおよび5mM パラニトロフェニルリ
ン酸からなる反応液2.0ml 中で37℃でインキュベート
し、生成するパラニトロフェノールの量を405nm におけ
る吸光度変化から求めて算出した。得られた酵素活性の
測定値から、試験液の調製直後の活性を100%として残存
活性を算出した。

【００２４】その結果を第１表に示す。

【００２５】

【表１】

【００２６】試験例２アルカリ性ホスファターゼを蒸留水で希釈して得られた
溶液からなる試験液（無添加）、あるいは該溶液にトレ
ハロース、マルトース、グリコシル (α,1-1)D-フコー
スまたはグリコシル (α,1-4) L-フコースをそれぞれ50
mMとなるように添加した試験液を調製し、試験液を-20
℃で 6日間凍結保存した。次に室温にて解凍後、試験例
１と同様な方法で試験液のアルカリ性ホスファターゼの
活性を測定し、試験液の調製直後の活性を100%として残
存活性を算出した。

【００２７】その結果を第２表に示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】試験例３アルカリ性ホスファターゼを蒸留水で希釈して得られた
溶液からなる試験液（無添加）、あるいは該溶液にトレ
ハロース、マルトース、グリコシル (α,1-1)D-フコー
スまたはグリコシル (α,1-4) L-フコースをそれぞれ50
mMとなるように添加した試験液を調製し、試験液をドラ
イアイス−エタノールでの凍結と室温での解凍を計10回
繰り返した後、試験例１と同様な方法で試験液のアルカ
リ性ホスファターゼの活性を測定し、試験液の調製直後
の活性を100%として残存活性を算出した。

【００３０】その結果を第３表に示す。

【００３１】

【表３】

【００３２】試験例４アルカリ性ホスファターゼを蒸留水で希釈して得られた
溶液からなる試験液（無添加）、あるいは該溶液にトレ
ハロース、マルトース、グリコシル (α,1-1)D-フコー
スまたはグリコシル (α,1-4) L-フコースをそれぞれ50
mMとなるように添加した試験液を調製し、試験液を真空
ポンプを用いて室温で完全に水分を蒸発させ乾燥粉末と
した。得られた乾燥粉末を50℃で24時間保存後、試験例
１と同様な方法で試験液のアルカリ性ホスファターゼの
活性を測定し、試験液の調製直後の活性を100%として残
存活性を算出した。

【００３３】その結果を表４に示す。

【００３４】

【表４】

【００３５】以上のように、トレハロース、マルトー
ス、グリコシル (α,1-1) D-フコースおよびグリコシル
(α,1-4) L-フコース、特にグリコシル (α,1-1) D-フ
コースおよびグリコシル (α,1-4) L-フコースは、アル
カリ性ホスファターゼの安定化剤として効果を有する。
以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

【００３６】

【実施例】

実施例１ 50mMイミダゾール−塩酸緩衝液(pH7.0）中にβ−グルコ
ース−１−リン酸を50mM、単糖類（D-グルコース、D-フ
コースまたはD-キシロース）を50mMおよびカテラトスポ
ラ・フェルギネア由来のＴＰ酵素標品を2 単位/ml 、あ
るいはβ−グルコース−１−リン酸を50mM、単糖類（D-
グルコース、2-デオキシ-D- グルコース、D-グルコサミ
ン、N-アセチル-D- グルコサミン、D-マンノース、D-ア
ロース、D-タガトース、D-ソルボース、L-フコースまた
はD-キシロース）を50mMおよびプロピオニバクテリウム
・フロイデンライヒ由来のＭＰ酵素標品を2 単位/ml と
なるように反応液を調製し、30℃で4 時間反応させた。

【００３７】反応終了後、反応液を遠心分離して上清を
採取後、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーを
用いて二糖類を分離、定量後、既知物質はそのまま同定
し、新規物質は１Ｎ硫酸中で100 ℃、1 時間煮沸して酸
加水分解あるいはα−グルコシダーゼで酵素分解し、二
糖類を構成する単糖類を高速液体クロマトグラフィーを
用いて同定した。高速液体クロマトグラフィーの分析条
件は以下のとおりである。

【００３８】カラム：Shim-pack CLC-NH₂ (6mm×15cm)
（島津社製）移動相：80％アセトニトリル−20％水流速：1ml/分検出器：示差屈折計（島津社製）反応液中に添加する単糖類、反応生成物、および収率を
第５表に示す。

【００３９】

【表５】

【００４０】実施例２ 50mMリン酸緩衝液(pH6.5) 中にマルトースを50mM、カテ
ラトスポラ・フェルギネアKY2039を100mg 湿菌体/ml 、
プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒKY4002を10
mg湿菌体/ml およびセチルピリジウムクロライドを0.1%
となるように添加した反応液を調製し、30℃で18時間反
応させた。

【００４１】反応終了後、反応液を遠心分離して上清を
採取し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析したところ、収率52% でトレハロースが生成
していた。

【００４２】実施例３ 50mMリン酸緩衝液(pH6.5) 中にマルトースを50mM、プロ
ピオニバクテリウム・フロイデンライヒKY4002由来のＭ
Ｐ酵素標品を1 単位/ml およびカテラトスポラ・フェル
ギネアKY2039由来のＴＰ酵素標品を2 単位/ml となるよ
うに添加した反応液を調製し、30℃で18時間反応させ
た。

【００４３】反応終了後、反応液を遠心分離して上清を
採取し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析した結果、収率78% でトレハロースが生成し
ていた。

【００４４】実施例４ 50mMリン酸緩衝液(pH6.5) 中にマルトースを50mM、エン
テロコッカス・フェシウムATCC 10541由来のＭＰ酵素標
品を1 単位/ml およびキネオスポリア・オウランチアカ
ATCC 29727由来のＴＰ酵素標品を2 単位/ml となるよう
に添加した反応液を調製し、30℃で18時間反応させた。

【００４５】反応終了後、反応液を遠心分離して上清を
採取し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析した結果、収率75% でトレハロースが生成し
ていた。

【００４６】実施例５ 50mMリン酸緩衝液(pH6.5) 中にマルトースを50mM、プロ
ピオニバクテリウム・フロイデンライヒKY4002由来のＭ
Ｐ酵素標品を1 単位/ml 、グルコースオキシダーゼ（東
洋紡社製）を2 単位/ml およびカタラーゼ（シグマ社
製）を3000単位/ml となるように添加した反応液を調製
し、30℃で6 時間反応させ、マルトースからβ−グルコ
ース−１−リン酸とグルコースを生成させるとともに、
生成したグルコースをグルコースオキシダーゼとカタラ
ーゼを用いて分解した。該反応液にカテラトスポラ・フ
ェルギネアKY2039由来のＴＰ酵素標品を2 単位/ml およ
びD-フコースを200mM になるように添加し、さらに18時
間反応させた。

【００４７】反応終了後、反応液を遠心分離して上清を
採取し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析した結果、グリコシル (α,1-1) D-フコース
が29mM生成していた。

【００４８】実施例６ 50mMリン酸緩衝液(pH6.5) 中にマルトースを50mM、プロ
ピオニバクテリウム・フロイデンライヒKY4002由来のＭ
Ｐ酵素標品を2 単位/ml 、グルコースオキシダーゼを2
単位/ml およびカタラーゼを3000単位/ml となるように
添加した反応液を調製し、30℃で6 時間反応させ、マル
トースからβ−グルコース−１−リン酸とグルコースを
生成させるとともに、その生成したグルコースをグルコ
ースオキシダーゼおよびカタラーゼを用いて分解した。
その反応液にL-フコースを200mMになるように添加し、
さらに18時間反応させた。

【００４９】反応終了後、反応液を遠心分離して上清を
採取し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーを
用いて分析した結果、グリコシル (α,1-4) L-フコース
が38mM生成していた。

【００５０】実施例７活性炭500g（ナカライ製）と濾過助剤ハイフロスーパー
セル500g（ナカライ製）を蒸留水中によく分散させ、微
粒子をデカンテーションにて除いたのち、口径5cm、高
さ50cmのカラムにつめ、約 3リットルの3%ブタノールで
洗浄後、さらに約 3リットルの水でカラムを洗浄した。
次に実施例５で得られたグルコシル (α,1-1) D-フコー
ス溶液200ml を通塔し、約 2リットルの蒸留水および約
2リットルの0.2 % プロパノール溶液で洗浄した後、5%
プロパノールで目的物を溶出した。溶出液を凍結乾燥し
た結果、グルコシル (α,1-1) D-フコースが白色粉末と
して約1g得られた。

【００５１】グリコシル (α,1-1) D-フコースの理化学
的性質を以下に示す。性状：無色粉末比旋光度：［α］_D ²⁰ = +189 °（c = 0.309, H₂O）、
経時変化（変旋光）なし FABMS スペクトル (Negative mode,Matrix:glycerol)：
m/z amu 325(M-H)^- 高分解能FABMS スペクトル (Negative mode, Matrix :
glycerol) : m/z amu 測定値 325.1121(M-H) ^- C₁₂H₂₁0₁₀としての計算値 325.1135 IRスペクトル(KBr) ：ν_maxcm^-1 3410,2935,1653,141
9,1385,1080,1005,966¹³ C NMR スペクトル (125MHz,D₂O) ：σppm from TMS9
4.40,94.24,73.41,72.95,72.67,71.94,70.54,69.99,68.
54,67.94,61.37,16.09¹ H NMRスペクトル (500MHz,D₂O) ：σppm from TMS5.19
(2H,d,J=3.9 Hz),4.23(1H,q,J=6.5Hz),4.05(1H,dd,J=1
0.4,3.4Hz),3.91(1H,dd,J=10.4,3.9Hz),3.89 (1H,m),3.
88 (2H,m),3.86(1H,m),3.80(1H,dd,J=11.6,4.8Hz),3.68
(1H,dd,J=9.9,3.9Hz),3.48 (1H,t,J=9.4Hz),1.26(3H,
d,J=6.5Hz)

【００５２】実施例８実施例５で得られたグルコシル (α,1-1) D-フコース溶
液を実施例６で得られたグリコシル (α,1-4) L-フコー
スに代える以外は実施例７と同様な方法で精製すること
により、グルコシル (α,1-4) L-フコースが白色粉末と
して約2g得られた。

【００５３】グリコシル (α,1-4) L-フコースの理化学
的性質を以下に示す。性状：無色粉末融点：117.0 〜120.5 ℃ 比旋光度：［α］_D ²⁰ = + 39.2 °（c=0.335,H₂O ）、
最終値（24時間後） FABMS スペクトル (Negative mode,Matrix:glycerol)：
m/z amu 325(M-H)^- 高分解能FABMS スペクトル (Negative mode,Matrix:gly
cerol)：m/z amu 測定値 325.1112(M-H) ^- C₁₂H₂₁O₁₀としての計算値 325.1135 IRスペクトル (KBr)：ν_maxcm^- 3396,2931,1635,145
6,1417,1362, 1134, 1080,1022¹³ C NMR スペクトル (100MHz,D₂O) ：σppm from TMS10
2.04,102.00,97.31,93.45,83.17,82.46,74.97,74.15,7
3.77,73.74,73.34,73.30,71.61,71.37,70.57,70.54,69.
85,67.40,61.67,17.45,17.40¹ H NMR スペクトル (400MHz,D₂O) ：σppm from TMS5.
27(d,J=3.9 Hz),5.26(d,J=4.9Hz),4.63(d,J=7.8Hz),4.3
0(q,J=6.6 Hz),3.99(m),3.98(m),3.93(m),3.93(m),3.92
(m),3.89(m),3.88(q,J=6.6Hz),3.82(m),3.81(dd,J=11.
8,4.5Hz),3.75 (dd,J=10.0,3.2Hz),3.65(dd,J=9.9,3.9H
z),3.59(dd,J=10.0,7.8Hz),3.46(t,J=9.4Hz),1.33(d,J=
6.6 Hz),1.30(d,J=6.6Hz)

【００５４】参考例１粗酵素液の調製（１）カテラトスポラ・フェルギネアKY2039をシュクロ
ース3g/dl 、NZ−アミン0.5g/dl 、ペプトン0.2g/dl 、
酵母エキス0.1g/dl 、肉エキス0.1g/dl を含有する培地
（pH7.0 ）300ml の入った２Ｌエルレンマイヤーフラス
コに植菌し、30℃で48時間、振とう培養を行った。得ら
れた培養液600ml を上記培地と同じ組成の培地15L を含
む30L ジャーファーメンターに植菌し、30℃で3 日間、
通気撹拌培養を行った。

【００５５】培養終了後、培養液15L を遠心分離（12,0
00xg, 20分）して得られた菌体を200mM リン酸緩衝液(p
H7.0)1,000mlに懸濁し、ダイノミル (W. A. Bachofen社
製）にて菌体を破砕後、遠心分離(12,000xg, 20 分）し
て上清を採取し、これをＴＰ粗酵素液とした。カテラト
スポラ・フェルギネアKY2039のＴＰ粗酵素液においてＴ
Ｐの生産性は5.0 単位/g・湿菌体であった。これはユー
グレナ・グラチリスの粗酵素液によるＴＰの生産性0.17
単位/g湿菌体（特公昭63-60998号公報) の約30倍であ
る。

【００５６】（２）カテラトスポラ・フェルギネアKY20
39の代わりにキネオスポリア・オウランチアカATCC 297
27を用いる以外は、（１）と同様の培養および抽出方法
を用いてＴＰ粗酵素液を得た。

【００５７】キネオスポリア・オウランチアカATCC 297
27のＴＰ粗酵素液においてＴＰの生産性は5.4 単位/g湿
菌体であった。

【００５８】（３）プロピオニバクテリウム・フロイデ
ンライヒKY4002をシュクロース2g/dl、トリプトン1g/dl
、酵母エキス1g/dl 、リン酸二カリウム0.5g/dl 、硫
酸マグネシウム（7 水塩）0.04g/dl、硫酸第二鉄（7 水
塩）0.001g/dl 、硫酸マンガン（4 水塩）0.001g/dl 、
ビタミンC 0.005g/dl を含有する培地(pH7.5)600mlを含
む三角フラスコに植菌し、30℃で2 日間、静置培養を行
った。

【００５９】培養終了後、得られた培養液をあわせて1.
2Lとし、これを遠心分離(12,000xg,20 分）して得られ
た菌体を10mMリン酸緩衝液(pH7.0)300mlに懸濁し、ダイ
ノミルにて菌体を破砕後、遠心分離(12,000xg, 20 分）
して上清を採取し、これをＭＰ粗酵素液とした。プロピ
オニバクテリウム・フロイデンライヒKY4002のＭＰ粗酵
素液においてＭＰの生産性は55.0単位/g湿菌体であっ
た。これはラクトバチルス・ブレビスの粗酵素液による
ＭＰの生産性29.9単位/g湿菌体（特公昭63-60998号公
報) の約1.8倍である。

【００６０】（４）プロピオニバクテリウム・フロイデ
ンライヒKY4002の代わりにエンテロコッカス・フェシウ
ムATCC 10541を用いる以外は、（３）と同様の培養およ
び抽出方法を用いてＭＰ粗酵素液を得た。

【００６１】エンテロコッカス・フェシウムATCC 10541
のＭＰ粗酵素液においてＭＰの生産性は50.0単位/g湿菌
体であった。

【００６２】参考例２酵素標品の調製（１）参考例１（１）でカテラトスポラ・フェルギネア
KY2039から得られたＴＰ粗酵素液に硫安を50% 飽和にな
るように加え、沈殿物を採取した。得られた沈殿物を少
量（約200ml)の200mM リン酸緩衝液(pH7.0) に溶解し、
得られた溶液を同緩衝液5Lで24時間透析後、65℃で15分
間加熱処理し、遠心分離(12,000xg, 20 分) して得られ
た上清を同緩衝液で平衡化したゲル濾過剤トヨパールHW
65F （東ソー社製）のカラム(1L 、口径5cm)に通塔し
た。溶出した活性画分をあわせ、これに硫安を50% 飽和
になるように加え、沈殿物を遠心分離(12,000rpm, 20
分) で採取し、200mM リン酸緩衝液(pH7.0)20ml に溶解
した。得られた溶液を同緩衝液2Lで24時間透析し、ＴＰ
酵素標品（比活性100mU/mg) を得た。酵素標品は粗酵素
液と比べて比活性は102 倍であり、酵素活性の収率は62
% であった。

【００６３】（２）カテラトスポラ・フェルギネアKY20
39から得られたＴＰ粗酵素液の代わりに、参考例１
（２）でキネオスポリア・オウランチアカATCC 29727か
ら得られたＴＰ粗酵素液を用いる以外は、参考例２
（１）と同様の精製方法を用いてＴＰ酵素標品（比活性
90mU/mg)を得た。酵素標品は粗酵素液と比べて比活性は
90倍であり、酵素活性の収率は50% であった。

【００６４】（３）参考例１（３）でプロピオニバクテ
リウム・フロイデンライヒKY4002から得られたＭＰ粗酵
素液に硫安を80% 飽和になるように加えて沈殿物を採取
し、これを少量（約20ml）の10mMリン酸緩衝液(pH7.0)
に溶解した。得られた溶液を同緩衝液2Lで24時間透析
後、50℃で15分間加熱し、遠心分離(12,000xg, 20 分）
して得られた上清を、同緩衝液で平衡化した陰イオン交
換樹脂DEAE−セファデックス（ファルマシア-LKB社製）
のカラム（1L、口径5cm ）に通塔して吸着させた。同緩
衝液で不純蛋白質を洗い流した後、0 〜1.0Mの食塩〔10
mMリン酸緩衝液(pH7.0) 〕の濃度勾配で溶出させた。約
0.5 〜0.8M食塩濃度で溶出してくる活性画分をあわせ
て、これに硫安を80% 飽和となるように加え、得られた
沈殿物を遠心分離(12,000xg, 20 分）で採取し、10mMリ
ン酸緩衝液(pH7.0)10ml に溶解した。得られた溶液を同
緩衝液2Lで24時間透析し、ＭＰ酵素標品（比活性50mU/m
g ）を得た。酵素標品は粗酵素液と比べて比活性は48倍
であり、酵素活性の収率は79% であった。

【００６５】（４）プロピオニバクテリウム・フロイデ
ンライヒKY4002から得られたＭＰ粗酵素液の代わりに、
参考例１（４）でエンテロコッカス・フェシウムATCC 1
0541から得られたＭＰ粗酵素液を用いる以外は、参考例
２（３）と同様の精製方法を用いてＭＰ酵素標品（比活
性45mU/mg)を得た。酵素標品は粗酵素液と比べて比活性
は45倍であり、酵素活性の収率は75% であった。

【００６６】

【発明の効果】本発明によれば、安価で効率よく二糖類
を製造する方法および該方法で得られる新規の二糖類を
提供することが可能となる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カテラトスポラ属、キネオスポリア属、
プロピオニバクテリウム属またはエンテロコッカス属に
属する微生物に由来しかつ糖質加リン酸分解活性を有す
る酵素源の存在下、水性媒体中でβ−グルコース−１−
リン酸と単糖類とを縮合反応させ、水性媒体中に生成し
た二糖類を採取することを特徴とする二糖類の製造法。
【請求項２】糖質加リン酸分解活性を有する酵素が、
トレハロースホスホリラーゼまたはマルトースホスホリ
ラーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】酵素源が、微生物の培養物、菌体、菌体
処理物、粗酵素または精製酵素である請求項１または２
記載の方法。
【請求項４】 β−グルコース−１−リン酸が、マルト
ースホスホリラーゼ活性を有する酵素源およびグルコー
ス分解活性を有する酵素源の存在下、マルトースを水性
媒体中で反応させて得られるものである請求項１〜３記
載の方法。
【請求項５】グルコース分解活性を有する酵素が、グ
ルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、ピラノースオキシ
ダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼ
またはヘキソキナーゼである請求項４記載の方法。
【請求項６】酵素源が、微生物の培養物、菌体、菌体
処理物、粗酵素または精製酵素である請求項４または５
記載の方法。
【請求項７】単糖類が、D-グルコース、D-フコース、
D-キシロース、D-マンノース、D-アロース、D-タガトー
ス、D-ソルボース、D-グルコサミン、2-デオキシ-D- グ
ルコース、N-アセチル-D- グルコサミンまたはL-フコー
スである請求項１〜６記載の方法。
【請求項８】グルコシル (α,1-1)D- フコース。
【請求項９】グルコシル (α,1-4)L- フコース。